Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
В работе были использованы штаммы Magnetospirillum magnetotacticum MS-1 и Staphylococcus aureus, из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), штаммы Escherichia coli XL-1 Blue «Stratаgene» (США) и BL21(DE3) «Novagene» (СШA). Для генно-инженерных работ использовали вектор pET-23a(+) «Novagene» (СШA).
Бактериальные клетки E. coli выращивали в питательных средах LB (Luria-Bertani) и TB (Terrific Broth) в зависимости от поставленной задачи. Для трансформации использовали питательную среду SOB. Для выделения плазмидной ДНК биомассу клеток наращивали в питательной среде. На заключительном этапе экспрессию рекомбинантных белков осуществляли в питательной среде TB. Твердую среду для выращивания одиночных клонов E. coli на чашках Петри получали добавлением к LB 2% (масса/объем) агара. При селективном выращивании в среду добавляли ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл.
Для выделения ДНК применяли методику, основанную на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли (Birnboim a. Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы «Promega» (США). Очищенную ДНК хранили в холодильнике при -18оС. Концентрация ДНК в получаемых препаратах составляла 10-100 мкг/мл. РНК в препаратах присутствовала в следовых количествах – менее 1%, согласно данным электрофоретического анализа.
Получение генетических конструкций
Генетические конструкции получали методом ПЦР. Амплификацию проводили с использованием разработанных праймеров (Табл. 1).
Таблица 1. Праймеры используемые в ПЦР
|
Название |
5' |
Нуклеотидная последовательность |
3' |
Длина пн |
|
2MGSr |
5' |
TCCACTTCCACTTCCGGCCAGTTCGTCCCGCAAGATGT |
3' |
37 |
|
3BR |
5' |
TTTTGGTGCTTGTGCATCATTTAGC |
3' |
25 |
|
1BF |
5' |
GATAACAAATTCAACAAAGA |
3' |
20 |
|
2MSF |
5' |
GGGCATATGCCCTTTCACCTTGCCCC |
3' |
26 |
|
2SpR |
5' |
GGGCATATGCCCTTTCACCTTGCCCC |
3' |
26 |
|
GSBf |
5' |
GGAAGTGGAAGTGGAGATAACAAATTCAACAAAGAAC |
3' |
36 |
|
T7F |
5' |
TAATACGACTCACTATAGG |
3' |
19 |
|
T7R |
5' |
GCTAGTTATTGCTCAGCGG |
3' |
19 |
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1% агарозном геле, при напряженности поля 6 В/см и документировали с помощью системы BioDoc Analyze (Biometra, Германия) по свечению бромистого этидия. Очистка ПЦР-фрагментов.
Реакцию рестрикции проводили, используя эндонуклеазы рестрикции Xho и Nde I (Fermentas, Литва). Реакцию лигирования проводили, используя ДНК лигазу фага Т4. Реакцию фосфорилирования проводили, используя ДНК- полинуклеотидкиназу фага Т4 (Fermentas, Литва). Плазмидную ДНК выделяли из культуры клеток E. coli XL-1 Blue, BL21(DE3), выращенной в жидкой среде LB в течение ночи при 37С. Выделение плазмидной ДНК проводили с применением набора реактивов «Wizard MiniPreps» (Promega, США).
Секвенирование ДНК проводили с использованием набора реактивов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматических секвенаторах ABI 3730 (Applied Biosystems, США). Плазмиды со вставкой секвенировали с применением плазмидных праймеров T7F , T7R .
Экспрессию гибридных белков проводили методом автоиндукции (Studier 2005). Концентрацию белков в растворе определяли по методу, предложенному Бредфордом. Концентрации высчитывались исходя из калибровочной кривой для бычьего сывороточного альбумина.
Центрифугировали 1 мл культуральной среды при 12000g в течение 3 минут. Суспендировали клетки в 100 мкл TES-буфера (10мМ Tris-HCl, pH 6.8; 1 мМ ЭДТА, 1% SDS). Лизировали клетки нагреванием при 100 С в течение 5 минут. Нерастворимые частицы осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 12000g.
Центрифугировали 1 мл культуральной среды при 12000g в течение 3 минут. Клетки суспендировали в 50 мкл сферопластного буфера (100 мМ Трис-НСl, рН 8.0, 0.5 М сахароза, 0.5 мМ ЕDТА). Добавляли PMSF до конечной концентрации 0.1 мМ и 2,5 мкл лизоцима (2мг/мл), растворенного в том же буфере. Инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут, после чего добавляли 100 мкл сферопластного буфера и 100 мкл воды, перемешивали и инкубировали 10 минут. Добавляли равный объем водного раствора тритон Х-100 (0.2%) и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Клеточную суспензию трижды замораживали при -20 С и размораживали при комнатной температуре. Центрифугировали при 12000g в течение 3 минут. Супернатант представлял собой фракцию растворимых белков, а осадок — фрацию нерастворимых белков. Осадок ресуспендировали в 100 мкл сферопластного буфера с добавлением тритона Х-100 до конечной концентрации 0,1%.
Центрифугировали 20 мл культуральной среды при 12000g в течение 10 минут. Клетки суспендировать в 2 мл сферопластного буфера, добавляли 400 мкл лизоцима (2мг/мл), растворенного в том же буфере. Суспензию инкубировали при комнатной температуре 30 минут, после чего добавляли 18 мл сферопластного буфера, 20 мкл 0.1 М PMSF, 40 мкл 0.5 М ЕDТА. Обрабатывали образец ультразвуком (30 kHz) в течение 20 минут. Клеточный дебрис отделяли центрифугированием в течение 30 минут при 6000g. Мембранную фракцию осаждали центрифугированием при 100000g в течение 2 часов.
Анализ белковых препаратов на всех этапах очистки, проверки чистоты препаратов осуществляли с помошью электрофореза в 14% трис-глициновом полиакриламидном геле по Лэммли.
Мембранная фракция была использована для металл-хелат аффинной хроматографии (МХАХ). Регенерированную смолу наносили (Sepharose helating Ni) наносили на колонки (объем колонки 10 мл, смолы 2 мл). Колонки промывали 6 мл воды и 6 мл буера А (Табл. 4). Пропускали солюбилизированную мембранную фракцию через колонки. Колонки промывали 4 мл буфера А. Элюат собирали в отдельные пробирки. Последовательно промывали и собирали элюат 6 мл буфера В, 6 мл буфера и 3 мл буфера С. Для солюбилизации белков а также поддержания белков в растворимом виде использовали ионный детергент лаурилсаркозил.
Таблица 2. Состав буферов, исполизуемые в МХАХ.
|
Компоненты |
Буфер А |
Буфер В |
Буфер С |
|
Tris-HCl, pH 8.0 |
20 мМ |
20 мМ |
0 |
|
Tris-HCl, pH 7.5 |
0 |
0 |
50 мМ |
|
Глицерин |
5% |
5% |
5% |
|
NaCl |
0,5 М |
1 М |
130 мМ |
|
β-меркаптоэтанол |
10 мМ |
5 мМ |
10 мМ |
|
Имидазол |
10 мМ |
50 мМ |
500 мМ |
|
PMSF |
2 мМ |
2 мМ |
2 мМ |
|
Лаурилсаркозин |
1,5% |
1% |
0,5% |
Способность связывания модифицированных белков с антителами определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Для ориентации первичных антител на поверхность плашки наносили инсулин. Остаточную сорбцию блокировали 1,5%-ным раствором БСА в PBST буфере. После забивки поверхности добавляли мышиные моноклональные антитела против инсулина челвека. Белки суспендировали в буфере (20 мM Трис-HCl, pH=8,0), содержащем БСА (1 мг/мл), наносили на сорбционную поверхность с заданными разведениями. Количество связавшегося лиганда определяли моноклональными антителами против гистидина, система детекции пероксид водорода – пероксидаза хрена. В качестве положительного контроля и калибровочной кривой использовали АКТГ-V5 с максимальной концентрацией 200 нг. Отрицательными контролями служили мембранные фракции исходного штамма.