ВВЕДЕНИЕ Формирование научных основ охраны природы включает создание новой отрасли микробиологии микроб.
Работа добавлена на сайт samzan.net:
ВВЕДЕНИЕ
Формирование научных основ охраны природы включает создание новой отрасли микробиологии — микробиологии промышленных сточных вод. Ее состав ной частью является изучение микробной деструкции син тетических органических соединений, а также веществ естественного происхождения, разложение которых в обычных условиях осуществляется очень медленно.
Микробные превращения природных органических веществ изучаются на протяжении всей истории микро биологии и рассматриваются в литературе, касающейся различных ее разделов: медицинской, почвенной, пище вой, технической, водной и общей. Это естественно, так как за исключением литотрофных организмов (хемосин-тетиков и фотосинтетиков) все микробы существуют за счет потребления готовых органических веществ. Сведе ния о путях биохимических превращений и конечных продуктах этих процессов, либо о характере разложения природных органических соединений, т. е. о химической деятельности микроорганизмов на естественных субстра тах, можно почерпнуть из многочисленных монографий, руководств и обзоров отечественной и зарубежной лите ратуры.
Иначе обстоит дело с синтетическими соединениями. Количество и число веществ, создаваемых промышлен ностью органического синтеза, растет очень быстро, и из года в год их все больше поступает в окружающую сре ду. Научно-технический прогресс в области химических исследований и химических производств оказывает ог ромное влияние на природу. Человек широко использует множество химикатов в промышленности, сельском хо зяйстве и в быту, загрязняя ими внешнюю среду. В почве и водоемах, в промышленных сточных водах эти новые для природы соединения вступают в контакт с микроор ганизмами и другими живыми существами. Как правило, для всего органического мира — для фауны и флоры —новые химические вещества выступают в роли токсичес-- ки действующих агентов, подавляющих или уничтожаю щих жизнь. Исключением являются лишь микроорганиз мы с их поразительной, безграничной пластичностью, из менчивостью и приспособляемостью к внешним условиям, к изменяющейся среде. Под влиянием новых синтетичес ких соединений и в результате адаптивной изменчивости перестраивается ферментативный аппарат микробов. Де струкция или трансформация этих веществ в природе в основном осуществляются микроорганизмами.
До последних лет судьба синтетических соединений в окружающей среде не привлекала должного внимания исследователей. В отечественной литературе отсутствуют сведения, касающиеся биохимической сущности микроб ных превращений наиболее часто встречающихся синте тических органических соединений. Однако без ясного представления о путях и направлениях химических реак ций, лежащих в основе микробной деструкции веществ-загрязнителей, нельзя думать о построении научных основ биологической очистки промышленных сточных вод, одного из основных источников загрязнения при роды.
Работая в области охраны водных бассейнов от за грязнения промышленными стоками, и в первую очередь синтетическими органическими соединениями, авторы по ставили перед собой задачу изложить данные литерату ры, а также результаты собственных исследований мик робной деструкции синтетических соединений. Однако а связи с тем, что разрушение синтетических ароматиче ских веществ включает в себя разрушение фенолов, было решено ввести главу о разложении микроорганизмами фенольных соединений (глава IV), тем более что в СССР был разработан микробный метод очистки про мышленных стоков от фенолов и процесс осуществлялся на комплексе селекционированных высокоактивных чис тых культур. Основанием для написания такой главы по служило также существование наряду с природными син тетических фенолов, например фенолформальдегидных смол.
Представлялось целесообразным привести описание основных групп микроорганизмов, способных вызывать разложение органических веществ природного и синте тического происхождения. Это сделано в главе I и частично в главе II. Во второй главе излагаются основные мредставления о систематике и таксономии микроорга низмов, выполняющих роль деструкторов органических веществ, накопляющихся в естественных субстратах, а также кратко описаны некоторые новые формы микроор ганизмов, отдельные представители которых, например Bdellovibrio, могут быть использованы в целях освобо ждения водоемов от нежелательных видов бактерий.
Рассматривается и обсуждается вопрос о том, как микроорганизмы, никогда в процессе эволюции не встре чавшиеся с синтетическим соединением, приспосаблива ются к использованию его в качестве энергетического либо пластического вещества (глава III). В остальных главах (VI—VIII) сведены литературные данные и экс периментальные работы, выполненные в отделе биологи ческой очистки промышленных сточных вод Института коллоидной химии и химии воды АН УССР. Глава IV, касающаяся микробной деструкции фенолов, представ ляет собой только литературную сводку. Глава I. МИКРОФЛОРА, УЧАСТВУЮЩАЯ
В ОЧИСТКЕ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ
Разрушение и превращение органических ве ществ в природе происходит в основном под воздействием микроорганизмов. В незначительной степени деструк ция любых сложных веществ и индивидуальных химиче ских соединений возможна под влиянием физико-хими ческих реакций — окисления, фотолиза, гидролиза. В процессах трансформации и разложения органических веществ прямо или косвенно участвуют и представители животного и растительного мира. Способность усваивать некоторые органические соединения, например водораст воримые углеводы либо аминокислоты, присуща почти всем живым существам — животным и растениям, как высоко организованным, так и стоящим на низших сту пенях филогенетического развития. Однако углеводы и аминокислоты относятся к нормальным метаболитам лю бой живой клетки. Этим и объясняется их легкая усвоя емость и вовлечение в обмен веществ различных орга низмов, даже таких безусловных автотрофов, как зеле ные растения и некоторые литотрофные микроорганизмы (водородные бактерии, железобактерии).
Такого рода природные органические соединения, как углеводы, белки, аминокислоты, липоиды и жирные кислоты, а также многие другие органические вещества животного и растительного происхождения, сравнитель но легко разрушаются микроорганизмами. Исключение представляют лигнифицированная целлюлоза, лигнин, хитин, кератины — протеиноиды волос, шерсти, рогов, копыт, а также фиброин шелка. Эти последние трудно поддаются разложению микроорганизмами.
Иначе обстоит дело, если органическое вещество пред ставляет собой соединение синтетическое, несвойствен ное органическому миру и ранее —• до развития органи ческого синтеза — в природе не встречавшееся. Такие соединения, как поверхностно-активные вещества (ПАВ), пестициды, различные органические соединения, содер-
жащие нитрогруппу, галоидорганические соединения, фосфорорганические соединения, пластмассы, синтетиче ские смолы и некоторые другие продукты промышленно сти органического синтеза, разрушаются в природе мед ленно и с большим трудом, они отличаются высокой устойчивостью (персистентностью) к действию микроор ганизмов. Такие синтетические вещества кумулируются в водоемах и почве, загрязняют окружающую человека среду и причиняют большой ущерб природе. В нашу за дачу входит рассмотреть биологические процессы, спо собствующие освобождению окружающей среды от вред ных органических соединений и загрязнителей, дать по дробную характеристику тех организмов, которые вызы вают эти процессы и выступают в роли санитаров — по мощников человека в охране природы. Для того чтобы разрушать вредоносные органические соединения, микро организм должен либо поглощать и усваивать их в ка честве источника питания, либо вызывать ферментатив ную деструкцию, утилизируя химическую энергию, осво бождающуюся при упрощении органического соединения. Такие процессы могут вызываться микроорганизмами и в очень ограниченной степени макроорганизмами.
Чем сложнее и выше организация живого существа, тем более узкой специализацией в питании оно характе ризуется и тем меньше у него возможностей использо вать различные реакции в качестве экзоэнергетических; У сложного многоклеточного организма поэтому нет при способительных реакций для утилизации органических веществ, далеких по своему химическому строению от природных соединений. Чем проще строение организма, чем ближе он к одноклеточным бактериям, тем совер шеннее его биохимическая лаборатория, тем выше его изменчивость и приспособляемость к использованию син тетических органических соединений для удовлетворения нужд организма в пластических веществах, пригодных для построения компонентов живой клетки, для кон структивного метаболизма — анаболизма и для снабже ния клетки энергией, необходимой для жизненных про цессов, для энергетического метаболизма — катаболизма В связи со способностью микробов изменять условия микросреды под влиянием ферментативных реакций при менительно к собственным потребностям И. Л. Работ-нова (1966) вводит понятие о приспособительном обмене. Поскольку представление о приспособительном мета болизме микробов не является общеизвестным, остано вимся на нем более подробно. И. Л. Работновой прове дены наблюдения над почвенным актиномицетом — Act. venezuelae. На среде с крахмалом или сахаром и нитратами в качестве источника азота при достаточной аэрации и нейтральной реакции углеводы используются только для дыхания и синтеза ингредиентов, необходи мых при построении клетки. В сильно щелочной среде и тех же условиях аэрации накопляется уксусная кис лота — продукт неполного окисления углеводов. Анало гичные явления наблюдались еще у шести изучавшихся культур различных актиномицентов. В результате под-кисления щелочная реакция сдвигается к нейтральной, после чего образование уксусной кислоты прекращается. Кислые среды подщелачиваются актиномицетами, таким путем регулируется рН среды. Образование мочевины в среде споровыми бактериями в условиях излишнего под-щелачивания среды аммиаком также служит примером приспособительного обмена, ибо мочевина нейтральна, а ее аминогруппы представляют собой обезвреженную форму аммиака.
Понижение окислительно-восстановительного потен циала аэробами в стадии интенсивного размножения также служит примером приспособительного метаболиз ма, так как и для аэробов излишне окисленная среда неблагоприятна для роста. Снижение ОКВ-потенциала обусловливается выделением клетками редуцирующих веществ.
Образование адаптивных ферментов также относится к приспособительному обмену. Наличие в среде нераство римых или неатакуемых микробами органических суб стратов представляет собой неблагоприятные условия. Их преодоление и может служить примером приспособи тельного метаболизма, ибо появление адаптивных фер ментов нельзя отнести ни к энергетическому, ни к кон структивному обмену. Это пример приспособления среды к физиологическим потребностям микроорганизма.
Роль главных деструкторов на земле принадлежит микроорганизмам. Это они при естественном ходе собы тий вызывают разложение природных органических ве ществ растительного, животного и микробного происхо ждения. Процессы микробиального разрушения этих со-
единений в почве настолько четко выражены, что в пе риод становления микробиологии как науки и при фор мировании почвоведения превращение природных азот содержащих органических соединений — белков и их производных — и превращение углеродсодержащих без азотистых соединений — углеводов весьма интенсивно исследовались. В результате они оказались хорошо изу ченными и под названием круговоротов азота и углеро да фигурируют во всех курсах общей и почвенной микро биологии, а также введены в руководства по медицин ской и технической микробиологии.
В разложении природных органических веществ активно участвуют бактерии, грибы, актиномицеты и во доросли. В природе деструкция осуществляется сложны ми биоценозами; в лабораторных условиях или специаль ных промышленных биоинженерных сооружениях многие природные и синтетические соединения эффективно раз рушаются монокультурами микроорганизмов.
П. А. Костычев еще в 1889 г. обнаружил, что в обра зованиях почвенного перегноя участвуют грибы. В на стоящее время известно, что представители всех клас сов грибов способны разрушать различные природные органические вещества. Это обусловлено частично тем, что в природе существует огромное количество видов грибов, приспособленных к разнообразным экологиче ским условиям и субстратам (известно более 70 000 ви дов грибов). Важную роль играет также повсеместная их распространенность и неприхотливость к условиям суще ствования. Фостер (1950) указывает также на присущую грибам адаптивную изменчивость, позволяющую им в специфических условиях лабораторного культивирования активно утилизировать субстрат, весьма слабо фермен тируемый исходными культурами (субкультурами). По-видимому, эта способность грибов—легко адаптирова ться к разнообразным, в том числе и новым синтетиче ским, источникам углерода и азота — в естественных условиях существования еще более выражена, чем в ла бораторной культуре. По способу питания грибы отно сятся к миксотрофным организмам, способным усваивать как органические, так и неорганические компоненты среды. Многие грибы ведут исключительно паразитиче ский образ жизни, некоторые паразиты способны также к сапрофитному питанию, а множество являются са-ирофитами, иногда переходящими на паразитический образ жизни. Такие организмы называют политрофами. А. А. Ячевский (1933), обсуждая вопрос о субстра тах, пригодных для развития грибов, разделяет их, по Весстендорпу, на шесть групп и добавляет седьмую. Это следующие группы:
1. Фитофильные, паразитирующие или ведущие са профитный образ жизни на растительных тканях.
2. Зоофильные, ведущие паразитический или сапро фитный образ жизни на животных тканях.
3. Гидрофильные, обитающие в воде. Грибов, сео6од-ноживущих в воде, подобно водорослям, нет. Многие виды Saprolegniales, питиевых, хитридиевых растут в качестве паразитов или сапрофитов на водных растени ях либо на животных, а также на различных находящих ся в воде предметах. Эти грибы хорошо приспособле ны к водному образу жизни и не способны к сухопут ному.
4. Геофильные грибы, постоянно живущие в почве. Фактически они используют перегной растительного про исхождения, но их не относят к фитофильным, поскольку почвенный перегной содержит настолько разложившиеся ткани, что их невозможно дифференцировать. К этой группе принадлежат представители Fungi imperfecti, Mucorales, Agaricaceae и Hydnaceae.
5. Литофильные, развивающиеся на камнях, стенах, штукатурке. На камнях развиваются главным образом симбиотрофные грибы, образующие совместно с водоро слями лишайники. На стенах растут Aspergillus, Penicil-lium, Rhizopus, Mucor, Stachybotrys, Cunninghamella, Mortierella.
6. Демофильные грибы, связанные с жильем и хо зяйственной деятельностью человека. Это прежде всего домовой гриб Merulius lacrimans, грибы, встречающиеся при высокой влажности на тканях и одежде, на обуви, на предметах хозяйственного обихода, на таре, на про дуктах. Это грибы порядка Mucorales семейства аспер-гиллиевых, некоторые несовершенные, как Cladosporium, Fusarium, Trichoderma и др.
7. Копрофильные грибы, развивающиеся на навозе, экскрементах животных и человека. К этой биологиче ской группе принадлежат организмы в систематическом отношении разрозненные. Некоторые относятся к фико-
12
мицетам: Mucor, Thamnidiutn, Chaetosiytum, Lichthemia (Absidia), Mortierella, Pilobolus, другие — к аскомиие-там: Ascophanus, Ascobolus, Bombardia coprophila, De-litschia, Lasiobolus, Rhyparobius, Sordaria, Sporormia и один вид из базидиомицетов — Coprinus. Разумеется, на таком богатом органическими веществами субстрате, как навоз, могут встречаться и многие другие грибы.
Многочисленные исследования по физиологии грибов, выполненные после предложения свести грибы в эти семь групп, свидетельствуют о том, что для такого распреде ления по субстратам мет убедительной аргументации. Мы должны были бы прибавить восьмую группу грибов, вызывающих деструкцию синтетических органических ве ществ. Данные, приведенные в этой книге, указывают на то, что среди грибов — деструкторов синтетических органических соединений много представителей семейст ва аспергиллиевых, есть несовершенные грибы, мукоро-вые, дрожжеподобные, истинные дрожжи — сахаромице ты и нет лишь сведений о роли архимицетов и базидио мицетов в разрушении или трансформации синтетических органических соединений.
Широко известное в настоящее время явление ми кробной коррозии различных материалов и промышлен ных изделий не может рассматриваться иначе, как ча стичное их разрушение. Основными возбудителями ми кробиологической коррозии промышленных материалов и изделий являются плесневые грибы или грибы, прояв ляющие свое действие совместно с бактериями.
Р. Благник и В. Занова (1965) приводят список гри бов, вызывающих порчу текстиля. В этом списке перечис лено 35 родов грибов, но далее авторы указывают, что из этих 35 лишь два рода — Aspergillus и Fusarium спо собны разрушать целлюлозу, остальные развиваются только на тканях и портят их пигментацией. Учитывая, однако, широкие адаптивные возможности грибов, авто ры допускают возможность разрушения целлюлозы и другими грибами. Ферменты из комплекса целлюлаз обнаружили и изучали И. В. Улезло (1973) у Trichoder ma viride, Л. С. Салманова, Л. А. Жданова и Т. Н. Со болевская (1973) —у Trichothecium roseum. Эти два ро да — Trichoderma и Trichothecium, имея необходимые ферменты, разлагают целлюлозу. Даже пластмассы и изделия из них повреждаются грибами, хотя и в меньшеймере, чем изделия из природных органических веществ. Коррозия под влиянием грибов наблюдается у поливи-нилацетата, полистирола, поливинилхлорида, нитратцел-люлозы, этилцеллюлозы, бакелита, меламино-формаль-дегидной смолы, феноло-формальдегидной смолы. Эти пластмассы разрушаются представителями семейства аспергиллиевых.
Большим разнообразием ферментативных свойств характеризуются также актиномицеты. Они разрушают множество различных химических соединений, природ ных и синтетических. В разложении преобладающего большинства веществ растительного и животного проис хождения участвуют актиномицеты, вызывая превраще ния азотистых веществ от сложных — белков, коллаге на, шелка, кератина — до простейших аминокислот. Они обусловливают нитрификацию и денитрификацию (Агре, цит. по Красильникову, 1970), разлагают гемицеллюло-зы, целлюлозу, лигнин, древесину, хитин, липиды, угле водороды, каучук, воска, битумы, асфальт. Актиномицет-ная деструкция растительных и животных остатков на блюдается в почве, навозе, лесной подстилке, компостах и в сточных водах. Лучистые грибы способны вызывать трансформацию стероидов. Их участие в преобразовании или разложении синтетических соединений рассматрива ется в последующих главах.
У актиномицетов описано большое количество раз личных ферментов: протеиназы, кератиназа, хитиназа, амилазы, целлюлаза, инвертаза и др. Наиболее активное участие в разрушении и трансформации органических соединений, загрязняющих окружающую среду, прини мают бактерии, деструктивной деятельности которых от ведена значительная часть книги.
Одним из основных источников загрязнения природы являются сточные воды, содержащие огромное количест во органических веществ по сравнению с природными местами обитания микроорганизмов. Такие воды обра батываются биологическим способом в специальных очистных сооружениях — аэротенках с помощью активно го ила, на биологических фильтрах — с помощью био пленки и в метантенках — путем анаэробного сбра живания.
При смешивании хозяйственно-бытовых стоков с про мышленными, содержащими трудно разрушаемые или
токсичные синтетические и природные вещества, проис ходит дальнейшая селекция микроорганизмов, способ ных выжить в этих условиях, осуществлять процессы жизнедеятельности и размножаться за счет компонентов сточных вод. В связи с этим мы приводим данные о ми крофлоре, принимающей участие в процессах биологиче ской очистки хозяйственно-бытовых сточных вод от ор ганических загрязнений.
Поскольку микробное население активного ила, био пленки и микрофлора метантенков различаются по свое му составу, нам представляется целесообразным рассмо треть указанные биоценозы отдельно. В активном иле, используемом для очистки сточных вод, содержатся бак терии, грибы, актиномицеты, а также некоторые другие микроскопические организмы, не принимающие непо средственного участия в разложении органических ве ществ.
Первые исследователи микрофлоры активного ила решающую роль в процессах очистки стока отводили бактериям, образующим зооглеи. Считалось, что такие бактерии преобладают в активном иле и отвечают как за разрушение органических веществ, так и за образо вание хлопьев, обусловливающих оседание и отделение ила от очищенной воды. Как сообщает Хаукес (Haw-kes, 1963), впервые на участие бактерий, образующих зооглеи, в процессе очистки загрязненных вод указал в 1914 г. Джонсон. Басвелл и Лонг в 1923 г. (цит. по Hawkes, 1963) опубликовали результаты микроскопиче ских исследований, свидетельствующие о том, что актив ный ил состоит из массы зооглейных организмов, между которыми находятся нитчатые бактерии. Баттерфилд .*, (Butterfield, 1935) выделил из активного ила чистую #0 культуру бактерий, образующих зооглеи, и определил ее как Zoogloea ramigera. Это были грамотрицательные, неспоровые, капсулообразующие палочки с закруглен ными концами длиной до 3 мк, имеющие один поляр ный жгутик. Оптимальная для роста температура 28 — 30° С, рН 7,4—7,6. Аэробы. Для выделения чистой куль туры бактерий автор использовал жидкую синтетиче скую питательную среду и стерильную сточную воду. Чистые культуры Z. ramigera на этих средах образовы вали хлопья, напоминающие активный ил. При аэрации бактерии, составляющие хлопья, окисляли 41—84%органического вещества загрязненной воды. В последую щих работах Баттерфилд с сотрудниками (Butterfield, 1937, 1937а) подтвердил свою первоначальную точку зрения о значительной роли Z. ramigera в очистке сточ ных вод. И хотя авторы отмечали, что наряду с описан ным могут существовать и другие микроорганизмы, при нимающие активное участие в разрушении органиче ских компонентов стоков, в литературе довольно долго господствовало мнение о важной роли Z. ramigera в процессах биологической очистки сточных вод активным илом. Хьюкелекьен и другие (Heukelekian, Schulhoff, 1938; Heukelekian, Littman, 1939) выделили из различ ных илов зооглееобразующие бактерии и показали, что эти штаммы идентичны Z. ramigera, изолированной Баттерфилдом. В опытах чистые культуры бактерий образовывали хлопья, напоминающие натуральный активный ил, и были способны окислять углеводы, бел ки, жиры и мыла. c'j
Некоторые работы последних лет (Ueda, Earle, 1972) также свидетельствуют о том, что штаммы Z. ramigera являются, если не единственными, то наиболее важными хлопьеобразователями в активном иле. Эти бактерии способны формировать хлопья и на искусственных сре дах, содержащих некоторые ароматические соединения (Unz, Farrah, 1972). Унц и Фэррах рекомендуют среду с ж-толуолом в качестве элективной для выделения штаммов Z. ramigera из загрязненных вод. Зооглейные бактерии обнаружены также в слизистой пене, образую щейся на поверхности сточной жидкости через 24—48 ч после отстаивания (Ganapati, Amin, 1972).
Особый интерес вызывает синтез внеклеточного по лимера культурами Z. ramigera. По мнению Фридмена и соавторов (Friedman et al., 1968), капсульный полимер напоминает целлюлозу. Тезука Ясухико (Tezuka Ya-suhiko, 1969) считает его мукополисахаридом, состоя щим из двух аминосахаров: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилфукозамина (в соотношении соответственно 1:2). Возможно, различные данные получены автора ми в результате изучения неодинаковых бактериальных культур. Капсульное вещество Z. ramigera играет, по-видимому, значительную роль в очистке, адсорбируя неорганические ионы, включая радиоактивные, а также органические соединения (Parsons, Dugan, 1971). Геле-
образный капсульный полимер адсорбирует также не-хлопьеобразующие бактерии активного ила, способные разлагать органические загрязнения (Anderson, 1969). Клетки Z. ramigera могут накапливать в большом количестве гранулы волютина, состоящие из длинноце- ^ почечных полифосфатов (Roinestad, Jail, 1970). Эта :-' особенность бактерий интересна в связи с необходимо стью очистки воды, загрязненной фосфорсодержащими органическими веществами — пестицидами, детергента ми и т. д.
Как полагают Крэбтри и Маккой (Crabtree, McCoy, 1967), Z. ramigera является самостоятельным видом, а не формой роста других микроорганизмов в хлопке (Hawkes, 1963). В настоящее время эту бактерию мно гие авторы относят к псевдомонадам (Friedman et al., ^ 1968), поскольку, кроме способности образовывать зоо глейные колонии, таксономические критерии, отличаю щие Z. ramigera от нефлуоресцирующих видов рода Pseudomonas, не установлены (Friedman, Dugan, 1968; Tezuka Yasuhiko, 1969).
Помимо Z. ramigera способностью разрушать орга нические соединения в сточных водах и образовывать . хлопья обладают также другие бактерии. В начале '' 50-х годов Мак-Кинней с соавторами (McKinney, Ног- Q wood, 1952; McKinney, Weichlein, 1953) изолировал из активного ила 72 штамма различных видов бактерий, которые образовывали хлопья и разлагали органиче ские вещества в питательной среде при аэрации. Кроме Z. ramigera были выделены представители родов Pseu domonas, Bacillus, Alcaligenes, Escherichia и др. Данные Мак-Киннея и сотрудников нашли полное эксперимен тальное подтверждение в более поздних работах. Так, Киучи и другие (Kiuchi et al., 1968) изолировали из активного ила ряд бактерий, относящихся к различным таксонам и разделили их на три группы по способности к хлопьеобразованию: 1) бактерии, образующие хлопья в чистой культуре; 2) бактерии, образующие хлопья при совместном культивировании со штаммом, не относя щимся к первой группе, и 3) бактерии, подавляющие хлопьеобразование при совместном выращивании с пред ставителем второй группы. Образование бактериями хлопьев в значительной степени зависит от характера питательных веществ среды (Kato Ikinori et al., 1971;
I-----------—---------------------Unz, Farrali, 1972). В то же время из 207 штаммов бак терий, выделенных из активного ила Андерсоном (Ander- ; son, 1969), только 11 были способны к хлопьеобразова-нию. Из них 9 принадлежали к роду Zoogloea, по одно му — к родам Mycobacterium и Nocardia.
Механизм флокуляции не выяснен окончательно. В настоящее время считают, что соединение бактерий в хлопья является физико-химическим процессом (McKinney, 1952, 1956; Tezuka Yasuhiko, 1969; Peter, Wuhrmann, 1971; Kato Ikinori et al., 1971). При образо вании хлопьев, по мнению Тезука Ясухико, отрицательно заряженные поверхности смежных клеток штаммов рода Flauobacterium соединяются ионными мостиками через катионы. В то же время Като Икинори с сотрудниками полагает, что клетки Flavobacterium dormistator склеи ваются полимером преимущественно полипептидной при роды, а клетки представителей остальных родов — ге-терополисахаридными полимерами. Некоторые авторы связывают флокуляцию с накоплением внутри клеток поли-р-оксимасляной кислоты (ПОМ) (Crabtree et al., 1965, 1966). Однако другие исследователи считают, что это не единственный механизм хлопьеобразования (Pain ter, Hopwood, 1969), а Дейнема (Deinema, 1972) вообще отрицает наличие такой связи и предполагает, что соеди нение бактерий в хлопья обусловливается образованием целлюлозных фибрилл. Внутриклеточный синтез ПОМ Z. ramigera связывают с продукцией внеклеточного ге-леобразного полимера бактериальных капсул (Parsons, Dugan, 1971). По мнению Фридмена и Дыогена (Fried man, Dugan, 1968), образование хлопьев бактериями и выделение капсульного полимера — явления, не связан ные между собой, поскольку флокуляция происходит из-за слипания клеток в результате сил притяжения кле точной поверхности.
Сведения о видовом и родовом составе бактерий активного ила, сообщаемые разными авторами, несколь ко противоречивы. Возможно, это объясняется использо ванием различных питательных сред, из которых ни одна не может обеспечить рост обитателей активного ила (Pi ke, Curds, 1971). В этой связи делались попытки изучить пищевые потребности бактерий активного ила. Дайэс и Бхэт (Dias, Bhat, 1964) нашли, что только 24% от ПО изолятов, полученных из необработанных сточных
вод, и 8% от 150 штаммов, выделенных нз активного ила, не нуждаются ни в витаминах, ни в аминокислотах при росте на среде, содержащей глицерин, сукцинат и нитрат аммония. Прекесэм и Дондеро (Prakasam, Dondero, 1967, 1967а) показали, что на агаризованной среде с экстрактом активного ила в качестве единственного источника питания общее число изолированных бактерий выше, чем на других питательных средах. Эффективность экстракта зависит от источника и образца активного ила. Более половины нз 127 штаммов, выделенных на среде с экстрактом активного ила, не росли на синтетических средах с глюкозой, аминокислотами, витаминами, дрож жевым экстрактом и минеральными солями.
Большинство бактерий, принимающих участие в очи стке,— гетеротрофы. Это в основном представители вод ной флоры, а также обитатели кишечного тракта чело века и животных. Не удивительно, что во многих, осо бенно ранних работах сообщается о выделении из сточных вод и активного ила большого количества бактерий кишечной группы (Gaub, цит. по Porges, 1960; McKinney, Wiechlein, 1953; Yall et al., 1971). Однако уже Аллен (Allen, 1944), используя метод предварительной гомоге низации хлопьев ила, показал, что относительное число кишечных бактерий незначительно, а доминирующими родами в активном иле являются Achromobacterium, Chromobacterium (Flavobacterium) и Pseudomonas. Бак терии кишечной группы составляют только малую часть популяции сточных вод, поскольку температура, при ко торой ведется процесс очистки, больше подходит для вод ной микрофлоры, чем для кишечных бактерий (Hawkes,^ 1963). Интересно, что Аллен вообще не включает в чис ло доминирующих таксонов Z. ramigera. В опытах Ости на и Форстера (Austin, Forster, 1969) в активном иле аэротенка доминировали роды Achromobacter, Flavoba cterium, Alcaligenes. На преобладание в сточных водах Pseudomonas указывают Канска (Kanska, 1966) и Йэлл с сотрудниками (Yall et al., 1971). В опытах Йэлла и дру- * гих из 85 чистых культур бактерий, выделенных из го родских стоков, 78 штаммов были грамотрицательные палочки. 38% общего числа грамотрицательных бакте? рий составляли представители группы Pseudomonas — Xanthomonas, 17%—Escherichia — Aerobacter, 12% — Flavobacterium и 12%—Achromobacter. К основнымродам, приведенным Алленом в качестве преобладающих по численности в активном иле, другие авторы причисля ют Bacillus, Corynebacterium, Comamonas (Kato Ikinori et al., 1971; Ganapati, Amin, 1972). В активном иле обна руживаются нитрифицирующие бактерии. Виноградская (Winogradsky, 1935) выделила из активного ила обра зующие зооглен нитрифицирующие бактерии рода Nitro-socystis, присутствовавшие там в значительном количе стве. Лавлесс и Пейнтер (Loveless, Painter, 1968) ме тодом обогащения изолировали из активного ила Nitrosomonas sp. Нитрифицирующие бактерии развива ются в иле после удаления легкоусвояемых органических ■загрязнителей (Рубан, 1961). Наличие этих организмов легко устанавливается химическим путем, чем и объяс няется то, что лишь немногие исследователи выделяли эти бактерии.
Из активного ила изолированы также нитчатые орга низмы. Преобладание нитчатых форм связывают с явле нием так называемого «вспухания» активного ила, про являющемся в том, что ил не оседает и не отделяется от очищенной им воды. Главным виновником вспухания большинство исследователей считают бактерию Sphaero-tilus natans (Ruchhoft, Watkins, 1928; Lackey, Wattie, 1940; Ruchhoft, Kachmar, 1941; Phaup, 1968; Curtis,.. ^969). Лэки и Уотти наряду с 5. natans выделили из активного ила нитчатую форму Вас. mycoides, которая, по мнению авторов, также может быть причиной вспу хания. К такому же результату приводит развитие в иле нитчатых грибов Geotrichum (Pipes, Jones, 1963; Scho-field, 1971), а также хищных грибов Zoophagus insidians (Cooke, Ludzack, 1958), Arthrobotrys (Pipes, 1966). Раз множение в активном иле филаментнрующих микроорга низмов, ведущее к его вспуханию, объясняют измене нием концентрации растворенного кислорода в сточной жидкости (Rao, Washington, 1968), наличием в очищае мом стоке углеводов, особенно гексоз (Engelbrecht, McKinney, 1957). Сообщения о находках грибов в актиз-ном иле немногочисленны. Серьезное изучение мицели-альных грибов предпринял Кук (Cooke, 1956), который продемонстрировал наличие в активном иле и загрязнен ных водах Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicilllum, Fu-sarium, Myrothecium, Gliocladium, Phialophora, Cladospo-rium, Margarinomyces, Aureobasidium, Geotrichum, Trh
choderma. Представители первых восьми родов присут ствовали в незначительном количестве, что позволило автору считать их случайными. Члены последних пяти родов обнаруживались в большом числе, что может сви детельствовать об их участии в процессах разложения органического вещества. Кук и другие (Cooke et al., 1960) ! изолировали из активного ила 136 штаммов 30 видов дрожжей и дрожжеподобных грибов, среди которых до минировали Trichosporon cutaneum, Rhodotorula glutinis, R. mucilaginosa, Candida parapsilosis, С tropicalis. Источниками попадания этих организмов в сточную во ду исследователи считают воздух, почву, бытовые стоки. Наличие большого числа дрожжевых клеток свидетель ствует, по мнению авторов, о том, что, по крайней мере, некоторые дрожжевые грибы используют питательные вещества в сточных водах и таким образом принимают участие в очистке. В то же время Пайк и Кэрдс (Pike, Curds, 1971) утверждают, что грибы нельзя считать нор мальной флорой активного ила.
Роль актнномнцетов в сточных водах и активном иле, к сожалению, практически не изучена. Из активного ила выделены проактнномицеты Nocardia actinomorpha (McKinney, Horwood, 1952) и Nocardia sp. (Anderson, 1969). О развитии в некоторых активных илах актино-мицетов сообщает Ц. И. Роговская (1967).
Таблица 1
Основные роды и группы микроорганизмов активного ила, о которых сообщается в таксономических исследованиях
Таким образом, как видно из табл. 1 и приведенных литературных данных, большинство бактерий, выделен ных из активного ила, очищающего бытовые стоки, это грамотрицательные палочки, среди которых доминирую щим родом является Pseudomonas. Часты выделения представителей родов Flavobacterium, Achromobacter, Zoogloea. Из грамположительных бактерий ведущее место занимает род Bacillus. Некоторыми авторами изо лированы в значительном количестве коринеформные бактерии. Относительное число и роль грибов в актив ном иле оценивается разными авторами противоречиво. Тем не менее учитывая данные, полученные Куком с сотрудниками (Cooke et al., 1956; Cooke et al., 1960), можно предположить, что эти организмы также в какой-то мере участвуют в процессах очистки сточ ных вод.
Другим распространенным способом аэробной био логической очистки сточных вод является биофильтра ция. Изучению микробного населения биопленки биоло гических фильтров, особенно бактериальной флоры, уде лялось сравнительно мало внимания. Так, Калабина и Мудрецова — Висе сообщили о наличии в биопленке зооглейных скоплений бактерий, нитчатых бактерий и грибов. Состав микроорганизмов зависел от количества поступающей на фильтр сточной воды. Баттерфилд и Уотти (Butterfield, Wattie, 1941; Wattie, 1943) также обнаружили в биопленке зооглейные организмы, близ кие к бактериям активного ила. В опытах авторов чи стые культуры этих бактерий развивались на загрузоч ных камнях биофильтра и дали такую же степень очисти ки, как производственная установка. Смесь девяти? чистых культур зооглееобразующих бактерий оказалась более эффективной, чем каждый штамм в отдельности. Все изолированные бактерии при культивировании в жидкой среде в условиях аэрации образовывали хло пья, напоминающие активный ил. Таким образом, авторы установили тождественность зооглейных бак терий биопленки биологических фильтров и активно го ила.
Кейлевей с соавторами (Calaway et al., 1952) пока зал, что состав микрофлоры биопленки изменяется в за висимости от глубины фильтра. На глубине 30 см наблю далось наибольшее количество и разнообразие видов.
Автором изолированы 14 видов гетеротрофных бактерий, среди которых доминировали представители родов Fla-vobacterium и Bacillus. Зооглееобразующие бактерий преобладали в верхней части биофильтра. ; Интересные результаты приведены в опубликованной недавно работе Холлса и Боарда (Halls, Board, 1973). Авторы выделили из биопленки биологических фильтров 8 групп бактерий: Acinetobacter, Alcaligenes, Pseudomo-nas, Bacillus, энтеробактерии, микрококки, коринеформ-ные бактерии и желтые грамотрицательные палочки. Число клеток представителей каждой группы было не одинаковым в молодой (2-дневной) и зрелой (21-днев-ибй) пленке. В зрелой пленке преобладали бактерии рода Acinetobacter и желтые грамотрицательные палоч ки, которые, по мнению исследователей, скорее всего яв ляются флавобактериями. Анализируя литературу по микрофлоре активного ила и биопленки, Холле и Боард приходят к заключению о существовании двух типов мик робных ассоциаций, принимающих участие в аэробных процессах обработки отходов; в первом типе доминируют псевдомонады, во втором — Acinetobacter, ранее опреде ляемый как Achromobacter или Alcaligenes, и флаво-бактерии.
Значительно больше данных о грибах, обитающих в биопленке. Развитию грибов на биофильтрах способ ствуют, очевидно, более благоприятные физико-химиче ские условия по сравнению с аэротенком и постоянная подача новых порций органического материала к поверх ности пленки (Hawkes, 1963). Как сообщают Томлинсон и Холл (Tomlinson, Hall, 1950), около 30% пленки на биофильтре грибного происхождения. Преобладающими формами являются Fusarium aauaeductuumL Geotrichum (Oospora), Sepedonium sp., Ascoidea rubescens, Subbaro-myces splendens, Sporotrichum sp., PenkUlium sp., Dl-ctyuchus sp., Pythium sp. (Cooke, Hirsch, 1958; Hawkes, 1963). Фелдмэн (Feldman, 1957) кроме приведенных родов и видов изолировал также представителей Сер/га-losporium, Epicoccum, Cladosporium, Trichoderma, As per-gillus, Phoma, Rhodotorula. Фузарии, выделяемые из очи стных систем, потенциально патогенны для растений и, вероятно, (Cooke, 1962) могут вызывать их заболевания при использовании стоков для удобрения почвы. Л. И. Логвиненко (1970) на всех этапах очистки хозяйст-
венных и промышленных стоков на биофильтрах изоли рованы водные фикомицеты из порядков Saprolegniales, Leptomytales, Peronosporales. Наиболее разнообразной была группа сапролегниевых грибов, которые включали 14 видов из 5 родов. Количественно преобладали виды рода Pythium, которые составляли почти половину всех изолятов. По данным Бекера и Шоу (Becker, Shaw, 1955), при сравнительном изучении микофлоры сточных вод, очищаемых на биофильтрах, преобладающей груп пой грибов оказались дрожжи.
Родовой состав грибов в биофильтре зависит от ме ста отбора исследуемого образца. Томлинсон (Tomlin son, 1942) нашел, что Fusarium доминирует в поверхно стной части биофильтра, a Geotrichum — в глубине. Возможно, это связано с тем, что Fusarium хорошо со существует с водорослями —• такими как Stigeoclonium, Chlorella, a Geotrichum к такому сосуществованию не способен.
В развитии микроорганизмов на биофильтрах наблю дается сезонность: летом преобладают зооглейные бакте рии, которые осенью частично вытесняются фузариями, позже развивается Geotrichum и, наконец, Sepedonium (Hawkes, 1963). В холодное время и зимой встречается Leptomitus lacteus (Cooke, Hirsch, 1958).
Видовой состав грибов в биопленке зависит также от скорости протока очищаемой воды (Cooke, Hirsch, 1958). В обычных условиях доминируют Coniothyrium fuckelii, Fus. aquaeductuum, Geotrichum candidum, при повышен ной скорости — Fus. aquaeductuum, G. candidum, Pullu-laria pullulans. Кук с соавторами (Cooke et al., 1956) изучал роль грибов в процессе очистки загрязненных вод. С этой целью автором были отобраны 8 общерас пространенных видов, а именно: Fus. aquaeductuum, Fus. oxysporum, G. candidum, Margarinomyces heteromorphum. Pen. lilacinum, Pen. nr. melinii, Pen. ochrochloron, Trich. viride. В сточную воду вносили указанные культуры и наблюдали динамику БПК. Было установлено, что изу чаемые грибы могут успешно соперничать с другими микроорганизмами за органические вещества и кисло род. Более активно процесс очистки происходил при кис лой реакции среды.
При чрезмерном развитии грибов в биофильтрах от верстия между загрузочными камнями могут забиваться, ухудшая условия аэрации и прохождения через фильтр сточной воды. С целью возможного регулирования ро ста грибов в биопленке Пэйнтер (Painter, 1954) изучал пищевые потребности четырех обычных ее обитателей. Автор показал, что эта грибы нуждаются в различных источниках азота: Sepedonium n. sp. может использо вать азот только из органических его соединений, в то время как Fus. aquaeductuum, Geotrichum sp. и Т. cuia-пеит способны утилизировать аммонийный азот, a Fus. aquaeductuum — также азот нитратов. Все исследован ные штаммы нуждались в витаминах. Оптимальное зна чение рН для Sepedonium n. sp. было 7—8,5, для осталь ных грибов интервал рН, при которых они хорошо развивались, б*..1л значительно шире — от 3 до 9. Интерес ные результаты получены автором при воздействии на грибы различными ионами. Показано, что Zn2+ подав ляет развитие грибов при использовании концентрации, превышающей оптимальную. Очевидно, растворы, содер жащие ионы цинка, могут применяться для ингибирова-ння роста грибов при слишком бурном их развитии в биопленке. Таким образом, приведенные данные позволя ют сделать вывод, что видовой состав биоценозов, со ставляющих пленку биологических фильтров, отличается от состава ценозов активного ила. Основным отличием является развитие в биофильтрах очень большого коли чества грибов, которые принимают активное участие в процессе очистки сточной жидкости от органического ве щества.
Наряду с аэробной очисткой применяется анаэроб ное сбраживание отходов в специальных сооружениях — метантенках. Анаэробное разложение органических от-1 ходов имеет преимущества по сравнению с другими мето дами. При анаэробном сбраживании достигается значи тельная минерализация органических веществ и образу ется сравнительно небольшая биомасса микроорганизмов. Процесс происходит в отсутствие кислорода. Конечным продуктом ферментации является метан, который в силу очень низкой растворимости быстро выделяется из си стемы, может быть собран и использован. К недостаткам метода относится необходимость поддерживания высо кой температуры в метантенках — часто до 55° С. Про цесс очень чувствителен к внезапным изменениям кон центрации и состава питательных веществ, колебаниям
температуры и рН. Кроме того, установлено, что ана эробные бактерии не способны разлагать целый ряд органических соединений, что делает невозможным ис пользование метода для очистки стоков многих отраслей химической промышленности.
Анаэробная ферментация органического материала широко применяется при обработке как бытовых, так и промышленных стоков, не содержащих токсичных для микроорганизмов соединений (Kirsch, Sykes, 1971). Ана эробному разложению подвергают обычно избыток ак тивного ила, образующийся в аэротенках, однако метод может использоваться и для непосредственной фер ментации органических отходов. Хотя анаэробное сбра живание органического материала в метантенках исполь зуется уже давно, сравнительно мало известно о бакте риологии и биохимии этого процесса. Как полагают Хоб-сон и Шоу (Hobson, Shaw, 1971), одной из причин недос таточного уровня знаний в этом вопросе являются труд ности, с которыми встречаются исследователи при культивировании анаэробных бактерий.
Процесс анаэробного разложения органического ве щества протекает в две стадии. На первой стадии (не-метаногенной) происходит сбраживание субстрата. Во время этой стадии белки, углеводы й липиды путем гн-дролиза и ферментации превращаются главным образом в жирные кислоты. В процессах превращения принимают участие различные физиологические группы микроорга низмов — целлюлозные, протеолитические и другие. ВтО-рая стадия носит название метаногенной. На этой ста дии специфические метановые бактерии разлагают ко нечные продукты первой стадии до метана и углекислоты (Toerien, Hattingh, 1969).
Несмотря на то что первые исследования микрофло ры метантенков датируются началом столетня (цит. по Toerien, Hattingh, 1969), о микроорганизмах неметано-генной фазы известно сравнительно немного. В ряде работ (Buck et al., 1954; Toerien et al., 1967; Kirsch, Sy kes, 1971) приводятся сведения о численности и составе главным образом аэробных и факультативно анаэроб ных бактерий. Количество этих бактерий, по данным боль шинства авторов, составляет около 2-Ю6 клеток в 1 мл. Посредством анаэробной техники, используемой прикультивировании организмов рубца жвачных, установле но, что число облигатно анаэробных бактерий в разлагаю щемся иле на 1—3 порядка выше, чем аэробных и фа культативно анаэробных (Toerien et al., 1967; Thiel et al., 1968). Торьен с соавторами (Toerien et al., 1967) прове ли сравнительный подсчет и показали, что в неметано-генной фазе число облигатных анаэробов составляет 3,9-108 — 1,5-1010 клеток/мл, аэробов и факультативных анаэробов — 8-105— 1 • 108 клеток/мл.
Интересны попытки ряда исследователей качественно и количественно охарактеризовать различные физиоло гические типы бактерий, которые участвуют в неметано-генной ферментации. При этом авторы использовали ме тод селективных питательных сред, содержащих в ка честве единственного источника углерода и энергии определенные органические субстраты. Слабой стороной данного метода является то, что на таких средах при подсчете могут быть пропущены бактерии, способные раз лагать и использовать внесенный в среду субстрат в конструктивном обмене, но неспособные получать из не га энергию, и наоборот. Тем не менее таким образом были получены сведения о физиологических группах бак терий, обладающих целлюлолитической, протеолитиче-окой, липолитической активностью, а также о сульфат-редуцирующих и денитрифицирующих бактериях. К сожалению, большая часть этих работ выполнена без применения анаэробной техники культивирования и ка сается аэробных и факультативно анаэробных бактерий, роль которых в процессах ферментации органических ве ществ, очевидно, менее значительна, чем анаэробных организмов.
Лишь в работах последних лет появились некоторые данные о физиологических типах анаэробных обитате лей метантенков. Авторы изолировали физиологические группы бактерий, а также определили соответствующие гидролитические ферменты в разлагающихся отходах при различных условиях (Agardy et al., 1963; Siebert, Toerien, 1969). Особенно интересна тщательно выполнен ная работа Зиберта и Торьена (Siebert, Toerien, 1969), которые на среде, содержащей снятое молоко, мясной бульон, супернатант содержимого метантенка, витами ны, соли и следы органических кислот, изучили флору
28
анаэробного разложения, обладающую протеолитической активностью. Общее число бактерий составляло 6,5-107 клеток/мл. Всего было выделено 43 штамма бактерий. 28 штаммов относились к роду Clostridium, a именно: Cl. bifermentans, Cl. lituseburense, Cl. mangeno-tii, Cl. perfringens, Cl. sphenoides, Cl. filiforme. Кроме то го, были изолированы 8 штаммов Peptococcus anaerobi-cu's, 3 штамма грамотрицательных неспорообразующих бактерий родов Bacteroides и Eubacterium, 3 штамма, близких к Bifidobacterium, и один факультативный ана эроб Staphylococcus aureus.
В разлагающихся отходах обнаружены способные разрушать целлюлозу анаэробные бактерии в количе стве 0,8—2,0 • 103 клеток/мл (Hungate, 1950) и 1,6 ■ 104-~ —9,7-Ю5 клеток/мл (Maki, 1954). По мнению Кирша и Сайкса (Kirsch, Sykes, 1971), число их невелико, еслис учесть, что около 10% сухого вещества разлагающегося; ила составляют целлюлоза и гемицеллюлоза.
Из содержимого метантенков изолированы сульфат-редуцирующие бактерии, в частности Desulfovibrio desul-furicans, в количестве 3—5-Ю4 клеток/мл (Toerien et al., 1968). При добавлении в метантенк кислых шахтных вод с большой концентрацией сульфатов число сульфат-редуциругощих бактерий возросло до 6,6 -105 — 9,5 X X 107 клеток/мл.
Таксономии неметаногенных бактерий, выделенных из разлагающегося ила, уделялось мало внимания. Бак с со авторами (Buck et al., 1953) изолировал из разлагающе гося ила возбудителя анаэробного брожения и назвал его Streptococcus diploidus. Этот микроорганизм превращал спирт (при концентрации не больше 8%), жиры и угле воды в кислоты. Оптимальная температура процесса была 35° С, рН 7,6. При инокуляции ила данной культу рой процесс первичной деструкции органических веществ происходит быстрее, чем в контроле (Keefer et al., 1953, 1953а). Суссмэн (Sussman, 1969) выделены 3 штамма бактерий, идентифицированных как Bacteroides rutnint-cola подгруппа brevis или близкородственный вид. Эти штаммы обладали значительной сахаролитической и не которой протеолитической активностью. Выделенные культуры образовывали из глюкозы янтарную, уксусную и муравьиную кислоты и требовали для роста неизвест ный дополнительный фактор. Кирш (Kirsch, 1969) выде-лил из разлагающегося ила около 75 культур, которые он разделил на две группы — способные и неспособные образовывать водород при выращивании на органиче ских субстратах. Водородобразующие бактерии состав ляли 30% изолятов. Это были подвижные клетки, кото рые сбраживали органические вещества с образованием низших жирных кислот. Таксономическое положение изо лятов не определялось. Торьен (Toerien et al., 1968) изо лировал и охарактеризовал 92 культуры из содержимого различных метантенков. Все выделенные бактерии были анаэробами или микроаэрофилами. Около 50% изоля тов были спорообразугощими. Выделенные палочковид ные организмы напоминали по морфологии Corynebacte-riutn, Lactobacillus, Ramibacterium, Actlnomyces и Bifidobacterium. Автор считает, что классическое опреде ление до вида бактерий, осуществляющих анаэробное разложение органических отходов, дает меньше для ха рактеристики бактериологии процесса, чем выделение крупных микробных групп на основании морфологиче ского и биохимического сходства.
Приведенные результаты позволяют считать, что ве дущую роль в процессах анаэробного разложения орга нического материала играют облигатно анаэробные бак терии. Однако систематическое выявление в содержимом метантенков аэробов и факультативных анаэробов сви детельствует о том, что эти организмы также участвуют в деструкции органических веществ. Более того, при определенных условиях численность их может существен но возрастать. Так, при добавлении к ферментируемой жидкости глюкозы количество аэробных и факультатив но анаэробных бактерий повышается от 1-Ю6 до 3,2-109 клеток/мл (Mah, 1969). В этой связи полагают, что субстратом, из которого в неметаногенной фазе бро жения образуется ацетат (ацетогенным субстратом), яв ляются не углеводы, а, возможно, липиды (Mah, Chy-noweth, 1969).
Наряду с бактериями в содержимом метантенков обнаруживаются грибы. В табл. 2 приведены роды гри бов, наиболее часто встречающихся в разлагающемся иле (цит. по Toerien, Hattingh, 1969).
Кук (Cooke, 1965) добавлял к разлагающемуся содер жимому лабораторных моделей метантенков мицелиаль-
Таблица 2
Роды грибов, которые обнаруживаются в разлагающемся иле (по Toerien, Hatti'ngh, I969)
ные и дрожжевые грибы и обнаружил, что внесенные клетки не гибнут, а у отдельных видов увеличивается даже их число. Автор приходит к заключению, что гри бы принимают участие в процессах разложения органи ческого материала в метаитенках, а не присутствуют там в виде покоящихся клеток. Котце с сотрудниками (Kot-ze et al., 1968) изолировал из метантенка, в который до бавляли различные субстраты, представителей Actinomy-cetes. Однако роль их в процессах разложения органи ческих веществ не ясна. Вторая стадия анаэробного разложения органических отходов осуществляется ме-танообразующими бактериями. Эти организмы довольно широко распространены в природе и обнаруживаются п почве, органических осадках озер и прудов, рубце тра воядных животных, сточных водах и содержимом метан тенков.
Биохимии метаногенной фазы уделялось много вни мания, однако имеется сравнительно мало сведений о бактериях, ее осуществляющих. Изучение метанообра-зующих бактерий затруднено из-за высокой чувствитель ности их к кислороду, а также очень незначительной ско рости роста. Морфологически метаногенные бактерии очень разнообразны. Баркер (Barker, 1956) разделил их
ла следующие группы в зависимости от формы клеток и указал субстраты, из которых вероятнее всего обра зуется метан:
А. Палочковидные клетки Неспорообразующие: Methanobacterium Methanobact. formicicum: муравьиная к-та, СО, Hi Methanobact. propionicum: пропионовая к-та Methanobact. sohngenii: уксусная и масляная к-ты Спорообразующие: Methanobacillus Methanobac. omelianskii: первичные и вторичные спирты, Нг
Б. Сферические клетки
Клетки, не имеющие расположения сарцин: Methanococcus Methanococ. mazei: уксусная и масляная к-ты Methanococ. vannielii: муравьиная к-та, Н2 Клетки, расположенные как сардины: Methanosarcina Methanosarc. barkerii: метиловый спирт, уксусная к-та, СО, Нг Methanosarc. methanica: уксусная к-та
Смис и Хангейт (Smith, Hungate, 1958) изолировали из рубца животных не описанный ранее организм, кото рый был назван Methanobact. ruminantiutn. Культура окисляла Н2 или муравьиную кислоту с одновременным восстановлением СОг до метана.
Число метаногенных бактерий в разлагающемся иле довольно значительно. Хьюкелекьен и Хэйнемэн (Неи-kelekian, Heineman, 1939) выделили из 1 мл содержимо го метантенков 25• 102 — 25-Ю6 бактерий, способных фер ментировать уксусную кислоту, 6-Ю2 — 25-Ю6 бактерий, ферментирующих масляную кислоту, и 25-102 — 25-108 бактерий, ферментирующих этиловый спирт. Близкие ре зультаты (105—108 клеток/мл) получены другими авто рами (Mylroie, Hungate, 1954). Смис (цит. по Toerien, Hattingh, 1969) из разлагающегося ила бытовых сточ-бых вод выделил чистые культуры метанобразующих бактерий: Methanobact. formicicum—1 • 107, Methano bact. sp.— Ь108, Methanobact. ruminantiutn—1 • 107, Methanococ sp.— MO6, Methanosarc. barkerii — I • W6. Автор показал, что ацетатферментирующие метаноген-
ные бактерии обнаруживаются в меньшем количестве, чем водородокисляющие, хотя еще недавно считалось, что 70% метана выделяется при ферментации ацетата.
Многие авторы (Siebert, Hattingh, 1967; Kirsch, Sy-kes, 1971) указывают на зависимость результатов ко личественной и качественной оценки метаногенных бактерий от состава использованной питательной среды и методики культивирования. Солевая среда, содержа щая 1 % муравьинокислого натрия, а также цистеин и тиогликолят в качестве восстанавливающих агентов, позволила за 8—10 дней получить рост максимального числа метанообразующих бактерий (Siebert, Hattingh, 1967). По мнению Зиберта и Хэттинга, муравьинокислый натрий обеспечивает рост бактерий, ферментирующих уксусную, пропионовую и масляную кислоты.
При сравнительном подсчете метаногенных бактерий показано, что в жидкой среде вырастает в 10 раз больше клеток, чем на твердой (Smith, 1966). Наиболее много численными были водородокисляющие бактерии. Число бактерий, ферментирующих уксусную кислоту, всегда было на 1—3 порядка меньшим.
Зиберт с сотрудниками (Siebert et al., 1968) также изучали влияние состава питательной среды на резуль таты определения числа клеток метаногенных бактерий. Были испытаны 22 варианта среды и подобран оптималь ный состав питательных веществ. На предложенной авто рами среде обнаружено МО8—1,9-1010 клеток/мл. Однако эти данные получены для экспериментальной установки, перерабатывающей «синтетический» сток. Аналогичных данных с использованием этой среды для исследования бактерий в производственных установ ках нет.
Механизм образования метана до настоящего време ни полностью не выяснен. Брайент с сотрудниками (Bry ant et al., 1967) сокращает перечень метаногенных субстратов до Нг, СОг, СО, метанола, муравьиной и ук сусной кислот. Анализируя данные о ферментации ме-танообразующими бактериями жирных кислот, содержа щих в цепочке до 6 атомов углерода, автор подвергает сомнению чистоту бактериальных культур, использован ных другими исследователями.
Учитывая различные точки зрения, Баркер (Barker, 1956 а, Ь) предложил следующую унифицированную кон-цепцию продукции метана, которая включает как теорию восстановления СОг, так и теорию прямого восстановле ния субстрата:
В этой схеме СОг соединяется с неидентифицирован-ным носителем хН и образуется карбоксильное произ водное вещества х. Далее следует восстановление этого карбоксильного производного с освобождением метана и регенерацией вещества х. хН может также соединяться с метанолом, в результате чего после дегидрирования образуется хСН3, из которого затем выделяется метан. После соединения уксусной кислоты с хН также в ко нечном итоге получается дгСН3, а затем образуется метан.
Таким образом, как можно сделать заключение из приведенной литературы, биохимия и микробиология процессов анаэробного разложения изучены до настоя щего времени недостаточно. Превращение органическо го вещества в метантенках происходит в две стадии: сбраживание субстрата до жирных кислот (неметаноген-кая) и образование из жирных кислот СН4 и СОг (ме-таногенная). Во время первой стадии большую роль играют анаэробные бактерии родов Clostridium, Bacte-roides и др. Вторую стадию осуществляет уникальная группа облигатных анаэробов — метановые бактерии родов Methanobacterium, Methanobacillus, Methanococ-cus, Methanosarcina.
Распространен также метод очистки воды от органи-
ческих соединений в открытых искусственных водоемах различной глубины — лагунах. Интерес к таким гидро техническим очистным бассейнам особенно возрос в кон це 40-х годов, когда было показано, что в лагунах мож но очищать воды с высокими концентрациями загрязне ний, и стоимость такой очистки значительно ниже, чем при использовании других методов (Bouthillier, Brown, 1971 а, Ь). Перегрузка некоторых лагун концентрирован ными сточными водами приводила к тому, что раство ренного кислорода в них было мало, условия приближа лись к анаэробным, тем не менее очистка сточных вод происходила удовлетворительно. Со временем анаэ робным, глубоким лагунам стали отдавать пред почтение.
Интересной особенностью анаэробных лагун является то, что жидкость во многих из них приобретает красную пигментацию. Это явление обусловливается развитием фотосинтезирующих серобактерий, относящихся к семей ству Thiorhodaceae, которые развиваются при наличии в воде сероводорода и, по-видимому, только в анаэроб ных условиях, но при освещении. Очевидная польза этих организмов состоит в том, что они потребляют серово дород и в результате этого уменьшается неприятный за пах лагун.
Купер (цит. по Sletten, Singer, 1971) относил крас ную окраску воды в лагунах за счет Thiopedia rosea и в меньшей степени — за счет бактерий рода Chromatium. Последние описаны как одноклеточные, сферические или палочковидные со жгутиками, способные образовывать капсулы, но не зооглеи; имеют характерный красный пигмент. В отличие от других представителей семейства Thiorhodaceae они достаточно легко культивируются. Бактерии рода Chromatiutn были найдены Купером в пруду близ Ричмонда (Калифорния), куда сбрасывают ся воды нефтеперерабатывающего завода. Характерно, что там не наблюдается обычного для анаэробных лагун газовыделения. Внесение в анаэробную лагуну, прини мающую сточные воды шерстомойки, метановых бак терий и Thiopedia rosea вскоре привело к ярко-ро зовой окраске воды (Cooper, цит. по Sletten, Singer,
1У / 1} ,
Слеттен и Зингер (Sletten, Singer, 1971) впервые обнаружили в красноватой воде анаэробной лагуны, очи-
щающей сточные воды сельскохозяйственной фермы, бактерии рода Rhodothece (сем. Thiorhodaceae) — одно клеточные, пигментированные, шарообразные организмы диаметром около 3,5 ж/с, без жгутиков, часто объединен ные в пары или короткие цепочки. Пигмент клеток пред ставляет собой в основном бактериальные хлорофиллы и ксантофиллы; обнаружены только следы каротиноидов. Пигмент в воду не выделяется, а окраска лагун дости гается благодаря очень высокой — до полумиллиарда клеток в 1 мл — концентрации бактерий в воде. Авторы считают фотосинтезирующие серобактерии полезными для очистки сточных вод организмами, разрушающими восстановленные соединения серы и предотвращающими, таким образом, отвратительный запах анаэробных лагун. Рекомендуется вносить эти бактерии в большом количе стве в те лагуны, где их нет.
Из окислительного пруда были выделены пурпурные серобактерии Chromatium vinosum и Thiocapsa floridana, интенсивно размножающиеся в естественных условиях при температуре около 16° и рН 7,7—8,2 (Holm, Vennes, 1970). Известно, что пурпурные серобактерии могут ис пользовать некоторые органические вещества в качестве источников углерода или доноров электронов (Шапош ников и др., 1960а, б). Эту свою способность они прояв ляют и в случае очистки сточных вод: наряду с сульфи дами серобактерии разрушают некоторые углеводы, аминокислоты, соли летучих органических кислот, в частности ацетаты, и другие вещества, способствуя сни жению загрязненности воды (Holm, Vennes, 1970). Thio capsa floridana интенсивно потребляет биотин, синтези руемый в лагунах Aerobacter aerogenes и другими бак териями (Fillipi, Vennes, 1971).
f Важную роль в очистке сточных вод в лагунах игра ют метановые бактерии. Так, Methanobacterium formici-сит встречается и развивается в лагунах при температу ре 15° и выше и рН 7,0—8,0 (Holm, Vennes, 1970). Мета новые бактерии используют для роста муравьиную кис лоту, метанол и другие вещества, имеющиеся в лагунах. -■ Анализ работ, посвященных исследованию микрофло ры, участвующей в процессах аэробного и анаэробного разложения органических отходов, показывает, что даже при очистке хозяйственно-бытовых сточных вод преиму щество получают и более интенсивно развиваются оп-
ределенные таксоны микроорганизмов. В условиях аэротенков —■ это грамотрицательные палочковидные бактерии, среди которых преобладают псевдомонады, в биофильтрах— это бактерии и грибы, в метантенках — анаэробные гетеротрофные и метановые бактерии. Такая зависимость тем более должна проявляться при очистке промышленных сточных вод, содержащих специфические, зачастую токсичные для большинства микроорганизмов вещества. Именно эти вещества могут определять состав микробного ценоза, способного к их разложению. Глава II. СИСТЕМАТИКА, СТРОЕНИЕ
И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ
В деструкции трудно разрушаемых органиче ских соединений принимают участие различные система тические группы микроорганизмов. По совокупности по стоянных признаков все организмы группируются на основании родственных связей с соблюдением известного соподчинения меньших систематических единиц большим. Этот принцип используется догматически в классифика ции всех живых существ, в том числе и микроорганиз мов. Чем ниже стоит систематическая единица — таксон, например вид, тем меньше у нее общих признаков, на основании которых организмы объединяются в более крупные таксоны. И, наоборот, чем выше систематиче ская категория — род, семейство — тем больше общих признаков принадлежит той группе организмов, которую она охватывает. Без построения систематики микроор ганизмов изучение микробного мира в настоящее время было бы невозможным. Новое направление в микробио логии—■ изучение микробов — деструкторов синтетичес ких соединений — должно включать классификацию воз будителей деструктивных процессов.
Изучая деструкцию нитроанилина чистыми культура ми бактерий, мы отметили, что на синтетической среде с нитроанилином в качестве источника азота клетки отли чались по морфологии от субкультур, пассированных на универсальных средах. На синтетических средах — жид ких и агаризованных —■ наблюдалось измельчание кле ток. Это затрудняло идентификацию бактерий. Особенно усложнялось определение до вида споровых бактерий. На средах с синтетическими органическими соединения ми в качестве источников углерода и азота изменялась также морфология иокардий и грибов. Все это и указан ные в предисловии соображения побуждали кратко изло жить систематику и строение грибов, бактерий и актино-мицетов.
В микологии все грибы (Fungi) разделяют по ряду
морфолого-биологических признаков на низшие и выс шие. К низшим принадлежат два класса — архимицеты, не имеющие мицелия и живущие в водной среде, и фико-мицеты, часть из которых еще ведет водный образ жиз ни и часть в процессе филогенеза уже перешла к сухо путному существованию. Размножаются фикомицеты спорами бесполым и половым путем. При бесполом раз множении споры образуются в специальных шарообраз ных органах — спорангиях, расположенных на длинных отростках мицелия — спорангиеносцах, имеющих длину от десятков до сотен микрон. Каждый спорангий содер жит от нескольких десятков до 300—500 спор. Фикоми цеты обладают типичным нитчатым мицелием, но он не имеет клеточного строения, не септированный.
К высшим грибам относят класс сумчатых грибов и базидмальных. Их вегетативное тело представляет собой хорошо развитый нитчатый многоклеточный мицелий, они обладают морфологически четко дифференцирован ными органами размножения. Сумчатые грибы имеют бесполое — вегетативное — и половое размножение; на званы они так за то, что при половом размножении спо ры образуются в небольших овальной или продолгова той формы органах, названных сумками. Вегетативные споры, или конидии, формируются на дифференцирован ных отростках мицелия — конидиеносцах. Базидиальные грибы также размножаются половым и бесполым, или вегетативным, путем. В результате полового процесса образуются специальные органы — базидии, каждая из которых несет на себе 4 споры. Отсюда и название — базидиальные.
К базидиальным принадлежат грибы, плодовые тела которых общеизвестны как съедобные и ядовитые. Они, как и другие базидпомицеты и архимицеты, не входят в сферу интересов микробиологии. Высшие грибы имеют гаплоидную и диплоидную стадии. Наконец, существует большая группа грибов, у которых не выявлено половое размножение. Они названы несовершенными грибами, или Fungi imperfecti. Эта группа имеет многоклеточный мицелий и образует вегетативные споры, или конидии, либо на дифференцированных отростках мицелия ■— ко нидиеносцах, либо непосредственно на боковых ответ влениях мицелия. Эта группа несовершенных грибов тя-,готеет по всем признакам к высшим грибам. Приводим схему классификации грибов:
Ферментативная активность микроскопических грибов достигает вершин метаболических возможностей живого организма. В опытах Костычева у Aspergillus niger при культивировании на среде с хинной кислотой выделялось за двое суток количество СОг, составлявшее 350% веса мицелия. Продуктивность дыхания в этом случае состав ляет 2,3 кг углерода на 1 кг мицелия в сутки. По образ ному выражению проф. Л. И. Кирсанова, человеку для поддержания такой интенсивности дыхания потребова лось бы съесть 115 кг сахара в сутки (Беккер, 1963). Черный аспергилл кроме образования органических кис лот способен вызывать множество биохимических реак ций, в том числе и восстановление нитратной (ЫОз) и нитритной (NO2) групп (Фостер, 1950). Уоллен, Стодола и Джексон (1962) приводят 66 различных изученных фер ментативных реакций, которые осуществляет Aspergil lus niger. К сожалению, в монографии Уоллена и других, как и в обобщающих монографиях по физиологии гри бов Фостера, Беккер, рассматриваются лишь реакции метаболизма природных органических веществ. Однако ферментативные возможности грибов оказались еще бо лее широкими. Aspergillum niger способен производить р-окисление боковой цепи и гидроксилирование фенокси-масляной и феноксивалерионовой кислот, представляю щих собой синтетические гербициды (Boocks et al., цнт, по Лус, 1971).
Фендерберк с сотрудниками (Funderburk et al., цит. по Пробсту и Типу, 1971) показали, что Aspergillus ni ger трансформирует селективный гербицид трифлоралин (2,6-динитро-4-трифторметил-Ы,Ы-дипропиланилин), от носящийся к группе замещенных динитроанилинов, в среде обнаружен 2,6-динитро-4-трифторметил-Ы-пропил-
анилин. Ферментными препаратами из Aspergillus niger Бестерфилд с сотрудниками (Westerfield et al., 1957) восстанавливали нитрогруппы д-нитробензолсульфон-амида и 2,4-динитрофенола.
Penicillium piscarium и другие, до вида не опреде ленные пенициллы, гидролизуют 3,4-дихлоранилиды сс-ме-тилвалериановой кислоты (Карсил), представляющие со бой также гербициды (гл. V, стр. 132).
Trichoderma viride может разрушать стойкий хлор-органический пестицид дильдрин (гл. V, стр. 124).
По данным Беляшчик с сотрудниками (Bielaszczyk et al., 1967), Trichoderma viride и Fusarium aquaeductum разрушают я-нитрохлорбензол и динитрохлорбензол. Другой вид фузария — Fusarium oxysporum восстанав ливает нитрогруппы 2,4-динитрофенола в аминогруппы (гл. VI, стр. 147). Интересно, что этот вид фузария спо собен окислять аминогруппы в нитрогруппы в кольце аминофенола.
Джонсон и Ноулз (Johnson, Knowles, 1970) показа ли, что Fusarium moniliforme и Rhizopus nigricans рас щепляют акарицид галекрон (Ы-(4-хлоро-о-толил)-М, N-диметилформамидина) до 4-формил-4-хлоро-о-толуи-дина.
В литературе есть указания на способность дрожже-подобных грибов и истинных (споровых) дрожжей раз лагать синтетические органические соединения. Так, дрожжеподобный гриб Pullularia pullulans гидролизует 3,4-дихлоранилид а-метилвалериановой кислоты. Истин ные дрожжи — сахаромицеты — обладают свойством вос станавливать NO2-rpynny в аминогруппу. Имеются дан ные о разрушении алкилбензолсульфонатов дрожжами Hansenula и дрожжеподобными грибами Candida (Stan dard, Ahearn, 1970).
Л. И. Логвиненко (1970) исследована микофлора биофильтров харьковских очистных сооружений в Без-людовке. Промышленные стоки г. Харькова в смеси с бытовыми подаются на биофильтры. Автором изучались только фикомицеты из проб биопленки, проб отстойни ков и у выхода воды из сооружений. Выделено 27 видов фикомицетов. Преобладали сапролегниевые грибы. Пер вое место по количеству занимают виды рода Pyihium, ■ Pythium debaryanum и Pythium monospermum выделя лись в течение всего года. В работе дано морфоло-
го-систематическое описание грибов, но не изучалась роль фикомицетов в деструкции органических соеди нений.
Приведенные нами примеры разрушения синтетиче ских органических соединений определенными родами и видами грибов, принадлежащих к классам фикомицетов, сумчатых и группе несовершенных, позволяют надеяться, что после дальнейшей литературной и эксперименталь ной проработки вопроса определенные виды, а может быть, и штаммы грибов могут быть рекомендованы для обезвреживания токсических синтетических органических соединений. Форма использования грибов, по-видимому, может быть различна.
В сооружениях биологической очистки сточных вод, особенно в биопленке биологических фильтров, постоян но присутствуют водоросли. Среди многочисленных так сонов водорослей пресноводных бассейнов важнейшая роль в очистке воды принадлежит протококковым, кото рые выделяются большинством альгологов в порядок Protococcales. A. M. Матвиенко (1968) возводит прото кокковые водоросли в ранг класса, присвоив им назва ние Protococcophyceae.
В последние годы обострение проблемы чистой воды привлекло внимание технологов, занятых вопросами очи стки промышленных стоков, и альгологов, изучающих водоросли, метаболизм которых может быть поставлен на службу охраны природы. Водоросли в последнее вре мя стали широко использоваться для очистки промыш ленных сточных вод.
Первые указания на возможность усвоения раство ренных в воде органических веществ водорослями, т. е. па способность их к миксотрофному питанию, появились в начале нашего столетия (Артари, 1903; Бейеринк, Рих тер, цит. по Я. Я. Никитинскому «Микробиология воды», часть III в «Сельскохозяйственной микробиологии» Н. Н. Худякова, 1926). Давно уже известно и другое свойство водорослей — подавлять кишечную группу бак терий в результате антагонистического воздействия (Во рошилова, Дианова, 1937) или проявлять антагонизм к бактериям вообще (Waksman et al., 1936—1937). При совместном культивировании протококковых водорослей и бактерий происходит взаимная интенсификация жиз недеятельности, что и приводит к более энергичному
окислению органических веществ бактериями. Эта осо бенность водорослей широко используется в практике очистки сточных вод в биологических прудах на естест венной альгофлоре (Винберг и др., 1966). Более подроб ное рассмотрение вопроса о роли естественных биоце нозов в самоочищении водоемов не входит в нашу задачу.
Остановимся кратко лишь на применении протокок ковых водорослей с целью интенсификации очистки про мышленных стоков. Г. М. Паламар-Мордвинцева с со авторами (1966) брала сточные воды Киевского комби ната искусственного и синтетического волокна после прохождения ими очистных сооружений. На этих про мышленных стоках, содержащих 3,1 мг/л сероуглерода, 2,5 мг/л сероводорода и 7,6 мг/л цинка, культивирова лись Chlorella pyrenoidesa и Ankistrodesmus braunii. Сточные воды этого комбината очищались от Zn, S, HaS, CS2 и Fe на 100%. БПК снижалась на 90%.
Г. М. Паламар-Мордвинцева с соавторами (1969) со общает также об очистке стоков Черниговской фабрики первичной обработки шерсти теми же двумя видами во дорослей. При длительности опыта 15 суток получены хо рошие результаты. Это позволило провести опыты в био логических непроточных прудах замкнутого типа в летние месяцы. Культура водоросли анкистродесма вы ращивалась в «лотках» и затем вносилась в опытный пруд. На 35-й день в опытном пруду БПКб снижалась на 72%, в контрольном — на 39%; на 55-й день в опыт ном пруду БПКб снижалась на 82%, в контрольном — на 61%. Из этих данных видно, что обогащение прудов чистыми культурами водорослей значительно повышает их очистительную способность.
К. П. Гончарова и 3. Д. Журавлева (1971), применяя водоросли Chlorella и Scenedesmus для обогащения прудов, наблюдали за очисткой сточных вод Отраднин-ского сахарного завода. Хлореллу и сценедесмус постав ляла Барская лаборатория протококковых водорослей. В работе использовалась суспензия либо паста из водо рослей. Применение суспензии давало лучшие резуль таты, чем использование пасты. Авторы говорят о воз можности выращивания водорослей на заводе. В статье приводятся данные о соотношении объемов сточных вод и количества применяющейся пасты из водорослей. В течение лета 1969 г. на этом заводе посредством водорослей Chlorella и Scenedesmus очмцено 2 млн. мг промышленных сточных вод.
Е. А. Зайченко, В. Н. Юзвенко, В. И. Гриценко (1971) пишут об использовании протококковых водорослей для очистки сточных вод крахмальных и крахмало-паточных заводов. По данным этих авторов, интенсификация очист ки промышленных сточных вод сахарных заводов на по лях фильтрации путем введения протококковых водорос лей, поставляемых Барской базовой производственно-экспериментальной лабораторией, достигла больших масштабов. В 1970 г. объем промышленных сточных вод сахарных заводов, очищенных с помощью водорослей, составил 65 млн. м3 в год. С применением хлореллы очищались сточные воды крахмального и крахмало-па-точного заводов, богатые органическими веществами — БПК5 1210 и 1337 мг/л. БПК снижалась на 78— 91%.
Наибольший интерес представляет возможность ис пользования протококковых водорослей для очистки сточных вод химической промышленности. В. В. Ступи на и В. М. Багнюк (1973) применяли культуры водорос лей Chlorella pyrenoidosa, Scenedesmus quadricauda и Ankistrodesmus braunii. Эти штаммы водорослей выде лены из коллектора и прудов, содержащих сточные воды химических производств и завода искусственного волок на. Авторов интересовала возможность потребления во дорослями в сообществе с сопутствующей бактериаль ной микрофлорой значительного количества фенолов, циклогексана, капролактама. Фенол и пирокатехин в кон центрации 125—500 мг/л не подавляли развития водорос лей и бактерий. Культуры водорослей без бактерий по требляли всего 13% фенолов. Незначительным было и потребление водорослями капролактама.
Харьковскими альгологами Догадиной и Чухлебовой |дит. по А. М. Матвиенко, 1973) изучен видовой со став водорослей очистных сооружений при биологической очистке промышленных стоков некоторых отраслей про мышленности. Выявлено свыше 500 видовых и внутриви довых таксонов из 7 отделов водорослей, среди них зе леных— около 55%, протококковые в их составе зани мают первое место (95%). С применением водорослей изучалась очистка сточных вод содового производства,
коксохимических заводов, стоков, содержащих нефть, фе нол и дифенилпропан. БПК этих стоков под влиянием водорослей снижалась на 80—90%.
Гем (Gehm, 1963) получил хорошие результаты при выращивании водорослей на сточных водах бумажной и химической промышленности. А. И. Рудзрога (1968) проводились опыты по очистке стоков целлюлозно-бу мажного комбината с помощью водорослей, выделенных из реки Лиелупе (Латвийская ССР),— Chlorella vulga-ris, Chi. ellipsoidea, Scenedesmus bijugatus, Sc. quadricau da, Ankistrodesmus acicularia. Исследования проводились со смесью этих водорослей и активного ила. Контролем служили опыты с активным илом без водорослей. Сни жение БПК5 от применения смеси ила и водорослей до стигало 98% начального; превышение контроля в опыт ных сосудах в среднем составляло 10%.
Сущность биохимических процессов разрушения орга нических веществ водорослями пока не изучена. О сте пени деструкции загрязнителей судят лишь по снижению БПКб или по растущему содержанию растворенного кис лорода в воде. Однако и этого достаточно, чтобы про тококковые водоросли причислить к организмам, прини мающим активное участие в биологической очистке про мышленных сточных вод.
Бактериальная клетка среди всех известных макро-и микроорганизмов выделяется самым универсальным набором ферментативных систем, способных охватить множество разнообразных химических реакций, часто полезных для народного хозяйства и столь необходимых человечеству для охраны природы, для того чтобы огра дить окружающую человека среду от угрозы гибели или частичного отравления химическими веществами, на копляющимися в результате интенсивного развития про мышленности.
Длительное время бактерий считали безъядерными организмами либо полагали, что ядерное вещество про кариотов не имеет постоянной локализации и находится в диффузном состоянии, хотя у представителей миксобак-терий морфологически обособленные нуклеоиды — экви валенты ядра — известны давно (Имшенецкий, 1940). За последние десятилетия у многих бактерий описаны нуклеоиды, цитологические структуры, выполняющие функцию ядра (Пешков, 1955). Таким образом, по мере глубокого изучения цитоло гии бактерий выясняется, что строение бактериальной клетки приближается к строению клетки других живых существ. Большинство бактерий относится к одноклеточ ным организмам. Следовательно, возможности у бакте рий для морфологического разнообразия очень ограни чены, особенно если учесть, что размер их часто меньше одного микрона. И в самом деле, преобладающее боль шинство бактерий, описанных до начала второй поло вины XX ст., т. е. до применения электронных микроско пов, почти укладывается в три геометрические фигуры — шар, цилиндр, и спираль. Разумеется, живые бактерии не могут точно отражать геометрические фигуры и есть немало отклонений от этих форм. Существуют бактерии, представляющие собой переход от одной фигуры к дру гой либо комбинации из сцепленных между собой шаро видных или цилиндрических клеток.
Бактерии шаровидные или иногда не совсем пра вильной формы — сферические, это кокки. Если после деления они распадаются на одиночные клетки, то их называют микрококками. Оставшиеся после деления объединенными попарно — диплококки. При делении в одном направлении кокки могут оставаться соединен ными в длинные цепочки, они называются стрептокок ками. Это определенный род бактерий — Streptococcus, один из видов которого хорошо известен всем как воз будитель стрептококковой ангины. При делении в двух взаимно перпендикулярных направлениях образуются фигуры из четырех клеток, именуемые тетракокками. Видовым признаком некоторых кокков является их спо собность размножаться делением в трех взаимно перпен дикулярных направлениях, в результате чего образуют ся пакеты, или тюки, состоящие из множества соединен ных слизью тетракокков; они называются сарцинами от латинского sarcina — связка, тюк. Сарцины встречаются повсеместно в воздухе, воде и почве. Группы кокков, напоминающие виноградные грозди, называются стафи лококками; эти бактерии всегда находятся на коже чело века и животных. Диаметр клетки кокков — 0,5—1,0 мк.
Бактерии, имеющие палочковидную или цилиндриче скую форму клетки, бывают разной длины: от совсем коротких, почти кокков, до длинных, иногда прямых, а иногда изогнутых или искривленных палочек и даже
нитей. Палочковидные формы бактерий очень распро странены в природе. Их примерно в три раза больше, чем сферических. Это объясняется более выгодным соотно шением массы и поверхности у цилиндра, чем у шара.
Среди палочкообразных форм бактерий встречается довольно много видов, способных к образованию спор. Споры всегда образуются внутри клетки — эндоспоры. Спорообразующие палочковидные аэробные формы на зываются бациллами и объединяются в род Bacillus. Споровые анаэробные формы, живущие без воздуха, объе диняются в род Clostridium. Бесспоровые палочковид ные формы называются бактериями и составляют род Bacterium.
Бактерии с цилиндрической формой клетки, как и кокки, могут оставаться после деления объединенными попарно — диплобактерии и диплобациллы — и могут оставаться объединенными в длинные цепочки — стреп-тобактерии, или стрептобациллы, напоминающие елочные бусы. Длина палочковидных бактерий от 1—2 до 10-*-20 мк, а стрептоформы достигают сотен и даже тысяч микрон при толщине 0,5—1,0 мк.
Палочковидная форма клетки бактерий, бацилл и клостридиум обусловливает большое разнообразие мор фологии: у одних видов клетка имеет равномерную тол щину по всей длине, у других она имеет утолщение в центре, напоминая стекло керосиновой лампы, у третьих перед образованием спор появляется утолщение на кон це палочки, и клетка напоминает барабанную палочку или ракетку для игры в теннис. Наконец, клетки могут напоминать ткацкий челнок, будучи заостренными на концах. У палочкообразных бактерий, стоящих близко к лучистым грибам-актиномицетам — микобактерии и коринебактерии — форма клетки бывает настолько не правильна из-за утолщений, изгибов и искривлений, что даже определение «палочкообразная форма» к ним уже почти неприменимо. То же можно сказать о некоторых молочнокислых бактериях, например Lactobacterium del-brilcki и маслянокислых, особенно в жидких средах с бродящими углеводами.
Нитчатые бактерии, по Красильникову, относятся к классу истинных бактерий (Eubacteriae), но объединя ются в самостоятельный порядок Chlamidobacteriales. Этот порядок составляют многоклеточные бактерии ни-тевидной формы. Место обитания их — водоемы. Лучше изучены нитчатые бактерии пресноводных водоемов, сре ди них есть свободноплавающие и прикрепленные к суб стратам, подвижные и неподвижные. У подвижных форм жгутики отсутствуют и движение осуществляется реак тивно. Размеры нитчатых форм трудно установить, так как нити при самом малом увеличении не помещаются в поле зрения микроскопа. Во всяком случае, длина неко торых видов нитчатых бактерий измеряется миллиметра ми, т. е. составляет тысячи микрон при толщине нити 1,5 —9,0 мк. Нити многоклеточны. Размножаются путем распада нити на отдельные клетки или путем образова ния на концах нитей многочисленных гонидий, мелких репродуктивных телец, которые, расплываясь в воде, да ют начало новым организмам. У некоторых видов нитча тых бактерий гонидий обладают жгутиками, посредством которых интенсивно передвигаются.
Одни виды этих бактерий питаются готовыми органи ческими веществами — гетеротрофы, другие способны са мостоятельно строить органические вещества из неорга нических за счет использования энергии окислительных реакций — автотрофы.
Примером нитчатых бактерий может служить желе зобактерия Crenothrix polispora (Cohn). Нити толстые, от 2 до 9 мк в диаметре, длина достигает нескольких миллиметров, неподвижно прикрепленные. Размножают ся неподвижными конидиями или отдельными клетками. Нити окружены толстой слизистой капсулой, насыщенной окисью железа, благодаря чему нити в нижней части имеют желто-охряный цвет или цвет ржавого железа. Иногда отдельные клетки нити как бы соскальзывают в сторону от главной нити, образуя подобие боковых ветвей, однако это псевдоветвление (Холодный, 1953).
Примером нитчатых бактерий может также служить и серобактерия Beggiatoa mirabilis (Cohn). Нити очень толстые, 16—45 мк в поперечнике и до 1000 мк и более в длину. Бактерии подвижны, не прикрепляются к суб страту, состоят из множества цилиндрических клеток, внутри которых отлагаются капельки серы. Снаружи нить покрыта бесцветной слизистой капсулой. Распро странена в пресных и соленых водоемах, содержащих сероводород.
При обработке сточных вод гидролизной промышлен* ности биологическим методом типичным представителем бактериальной микрофлоры аэротенков является нит чатая бактерия Sphaerotilus dichotomus или Cladothrix dichoioma (Разумов, 1957; Ткаченко и Друблянец, 1959). Еще Мигула (Migula, 1900) объединил эти два рода Cladothrix и Sphaerotilus в один — Sphaerotilus. Одно время считалось, что существует два вида этого рода: Sphaerotilus natans и Sphaerotilus dichotomus. Затем ис следователи пришли к заключению об идентичности этих видов. А. С. Разумов (1957) в результате сравнительно го изучения более чем десяти культур, выделенных из разных водоемов и очистных сооружений, пришел к вы воду, что Sphaerotilus natans и Sphaerotilus dichotomus являются лишь экологическими вариантами одного ви да. Н. И. Ткаченко и Э. Э. Друблянец (1959) показали, что чем больше в среде пентозных Сахаров, тем интенсив нее развивается сферотилюс. Так, при содержании в сточных водах гидролизного завода загрязнений до БПК5, равному 500 мг О2/л, развитие Sphaerotilus было особенно интенсивным.
Этот вид нитчатых бактерий вызывает вспухание активного ила и тем самым ухудшает очистку стоков; рН 5,5—6,0 является оптимальным для Sphaerotilus и ухудшает очистку. При рН 7,0—7,5 нитчатые бактерии развиваются хуже, а зооглейные, наоборот, лучше. Это способствует развитию также простейших и осаждению активного ила.
На агаризованной сточной воде Sphaerotilus обра зует коричневые войлокообразные колонии 1—1,5 мм в диаметре. На сусло-агаре, МПА и МПЖ бактерия также растет, желатин не разжижает. На агаризованных сре дах рост медленный — колонии появляются на 10—12-й день. Молодые нити имеют диаметр 3 мк и в длину — сотни микрон, они не септированы, плазма гомогенна. Перегородки появляются на 5—6-е сутки и нить стано вится многоклеточной. Размножается Sphaerotilus гони-диями — мелкими образованиями на поверхности кле ток, различимыми при электронной микроскопии, кроме того, размножение возможно обрывками нитей. Нити Sphaerotilus прикрепляются к субстрату, снаружи они покрыты слизистыми чехлами. В этих чехлах возможно отложение железа. Разумов сообщает, что в его опытах по изучению Sphaerotitus при наличии соединений железа в среде и изобилии органических веществ, в частности Сахаров, происходит пропитывание чехлов железом, но только после снижения содержания органических веществ до ка кого-то минимума наступает охряное побурение чехлов за счет отложения гидрата окиси железа. Тогда нити Sphaerotilus приобретают вид, характерный для Leptot-rix из железистых водоемов. По А. С. Разумову, этот микроорганизм находится в пределах различавшихся трех родов: Sphaerotilus, Cladothrix и Leptotrix. Причем существующие в природе варианты различаются по био химическим свойствам — отношению к источникам азота и углерода, желатине, температуре и т. п. Неорганиче ские источники азота — нитрат калия и сульфат аммо ния — хорошо усваиваются, из органических — потребля ют пептон, хуже мочевину и аспарагин. В качестве источ ников углерода хорошо усваивают глюкозу, мальтозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, не усваивают арабинозу, лактозу, крахмал.
Н. И. Ткаченко и Э. Э. Друблянец выращивали Sphae rotilus dichotomus в сточной воде, содержащей 0,001%' FeSO4, и в чехлах некоторых нитей качественной реакци ей обнаруживали окисное железо. Эти бактерии при надлежат к гетеротрофным железобактериям.
Спиралевидные, или извитые, бактерии весьма много образны, они отличаются по длине, толщине, числу за витков, диаметру завитков, наконец, по волнообразному и штопорообразному движению в жидкой среде. В за висимости от формы клетки различают вибрионы, тело которых не превышает ]U оборота спирали (от латинско го vibrare — трепетать). К вибрионам относится Vibrio desulfuricans, культуры которого восстанавливают суль фаты с образованием черного осадка сернистого железа в жидких средах и вызывают почернение агаризованных питательных сред вокруг колоний. Этот вибрион выде ляется из воды рек, озер, болот, морей, встречается в грязях лиманов, в торфах, в почвах, сапропелях, на рисовых полях. Это типичный водный организм. Возбу дитель азиатской холеры Vibrio cholerae также водный организм. Во время эпидемий холеры холерный вибрион выделяется из рек и экскрементов больных холерой. Во обще в литературе описано много вибрионов. В опреде-
лителе Н. А. Красильникова их приведено более 140 ви дов Большинство из них болезнетворны для животных (теплокровных, рыб, насекомых).
Когда клетка бактерии имеет один полный оборот спирали или несколько оборотов, она называется спи риллой. Примером может служить постоянно обитаю щая в воде Spirillum volutans — крупная бактерия тол щиной 1,5—2 мк при длине 30—70 мк. Спириллы и ви брионы объединяются в семейство Spirillaceae.
Наиболее яркими и типичными представителями спи ралеобразных форм можно считать спирохеты. Они на поминают спираль с небольшим диаметром оборотов, однако они характеризуются большим числом мелких за витков, а у некоторых форм крупными искривлениями всей клетки, идущими как бы вокруг более плотной осе вой нити. Название бактерий этого класса происходит от латинских корней spira — изгиб и chaete —грива.
Спирохеты выделены Н. А. Красильниковым в само стоятельный класс, поскольку по совокупности признаков они резко отличаются от других бактерий. Подобно то му как термин «бактерия» помимо обозначения рода бак терий, т. е. бесспоровых палочек, применяется для обо значения бактерии как микроорганизмов вообще, так и термин «спирохета» применяется к определенному роду спирохет и в более широком понимании для обозначения всего класса бактерий, характеризующихся длинным те-. лом, состоящим из множества спиральных завитков, и способных сокращаться и изгибаться.
Спирохеты имеют черты сходства с бактериями и с простейшими зоологического мира. Размеры спирохет варьируют в широких пределах — от нескольких микрон до 500 мк при толщине 0,25—1,5 мк. Содержание клеток однородно, они не содержат отчетливо видимого ядра. Оболочки, типичной для бактерий, у спирохет нет, а если она и есть, то чрезвычайно тонка, эластична и гибка подобно оболочкам животных клеток; она скорее при ближается к цитоплазматическим мембранам, чем к кле точным стенкам. Поэтому ее называют перипластом. V многих спирохет оболочка не окрашивается. Сами спирохеты при употреблении обычных анилиновых кра сок, применяемых для бактерий, обычно окрашиваются плохо. Однако их можно окрасить но методу, применяе мому для окрашивания мазков крови (по Романовско-му — Гимза), или наблюдать по методу негативного окрашивания в черной туши (белые спирохеты будут видны на темном фоне).
Спирохеты не образуют спор. Наличие органов дви жения— жгутиков — находится под сомнением, так как для передвижения они не нужны вследствие гибкости и сокращаемости клеток. Характерными чертами спиро хет является наличие осевой эластической нити, прохо дящей вдоль клетки и выполняющей функцию скелета. Вокруг осевой нити спирально завивается цитоплазма, образуя первичные завитки. В клетках спирохет с по мощью электронной микроскопии выявлены фибрилляр ные структуры. Клетка как бы содержит тонкие нити фибрилл, сплетенные в пучки. У сапрофитного рода Cris-tispira по поверхности клетки тянется кнлевидная мем брана— криста, имеющая фибриллярную структуру.
Итак, какие же признаки сближают спирохет с бак териями и какие с Protozoa? У спирохет нет морфологи чески обособленного ядра, нет спор, они одноклеточны, не ветвятся, половой процесс отсутствует. Этим они сход ны с бактериями.
У спирохет нет жесткой клеточной оболочки, они спо собны активно сокращать свое тело, патогенные спиро хеты вызывают инфекции, протекающие циклично (во звратный тиф), спирохеты обнаруживают чувствитель ность к тем же химиотерапевтическим веществам, что и простейшие; болезни, вызываемые некоторыми спирохе тами, передаются через кровососущих насекомых. Все эти признаки сближают спирохет с Protozoa. Спирохет разделяют на несколько родов: Spirochaeta, Cristispira, Borrelia, Treponema, Leptospira. Примером может слу жить сапрофитный вид, который встречается в морях Spirochaeta marina. Спирохеты плохо растут на питатель ных средах.
Характерная группа бактерий, образующая на раз личных субстратах слизь, отнесена Н. А. Красильниковым в отдельный класс Myxobacteriae (микса —■ по-гречески слизь). Миксобактерий имеют более сложную организа цию, чем Eubacteriae или Spirochaetae.
Первый исследователь, открывший миксобактерий — Такстер — обратил внимание на своеобразные черты этих бактерий. При интенсивном росте миксобактерий нако пляют много слизи подобно грибам миксомицетам, обра-
52
зуя так называемый псевдоплазмодий. На слизистом скоплении бактерий формируются выросты различного вида «плодовые тела». Работами Кржеменевских (Krzemieniewska H., Krzemieniewski S., 1937), А. А. Им: шенецкого и Л. И. Солнцевой (1937), А. А. Имшенецкого (1940) миксобактерий изучены всесторонне. Исследована морфология, цитология, культуральные свойства и пред ложена систематика этого класса бактерий.
Клетки миксобактерий по форме бывают палочко видные, веретенообразные, эллипсоидальные или шаро видные, причем в пределах одного вида встречаются все эти формы клеток на разных стадиях развития. Приме ром может служить Myxococcus hutchinsoni, у которого в молодой культуре вегетативные клетки удлиненные с заостренными концами, часто имеют S-образную форму. Со временем эта форма клеток изменяется в палочко видную. Палочки уже не имеют заостренных концов, у них концы округлые. Постепенно палочки укорачивают ся, уплотняются, превращаясь в шарообразные формы, которые называются цистами. У Myxococcus hutchinsoni цисты одноклеточные, однако у других миксобактерий встречаются цисты, состоящие из нескольких вегетатив ных клеток.
Цисты миксобактерий объединяются в довольно круп ные «плодовые тела» овальной или грушевидной формы. А иногда плодовые тела миксобактерий приобретают настолько причудливую форму, что напоминают скорее маленькое растение, чем бактерию. Так, плодовое тело Synangium thaxteri совсем не похоже на бактерии. Ци-стофор, имеющий вид стебелька, достигает 750 мк в дли ну. Отдельные бактериальные клетки 3—6 X 0,5 мк. Размер цист 140 мк. Эта бактерия выделена из оленьего навоза. Однако встречаются и такие миксобактерий, ко торые не образуют плодовых тел. Их принадлежность к миксобактериям устанавливается по другим признакам.
Характерные признаки миксобактерий: 1) клетки не имеют плотной оболочки, характерной для всех видов и родов класса Eubacteriae; оболочка эластичная нери гидная, благодаря чему форма клеток меняется при дви жении; 2) миксобактерий подвижны, но у них нет орга нов движения — жгутиков, подвижность осуществляется реактивно, путем выделения слизи в окружающее пространство и путем изгибания клетки; движениемедленное — фронтальное, в жидкой среде иногда неза метное. На плотных агаризованных средах с большой влажностью образуют вследствие движения пленку; 3) миксобактерии имеют четко видное при окраске мор фологически обособленное ядро; плазма однородна; спор не образуют; вся клетка при образовании цист может рассматриваться как спора; 4) миксобактерии не раз множаются простым делением; они размножаются пере тяжкой, без образования поперечной перегородки.
Миксобактерии хорошо растут на искусственных пи тательных средах — агаризованном картофельном и на возном отваре, на синтетических средах пз минеральных солей с фильтровальной бумагой. В естественных усло виях существования источником углерода для них служит целлюлоза. Поэтому они хорошо растут в лабо раторных условиях на фильтровальной бумаге, погружен ной в синтетическую среду. Образуют на бумаге слизи стые желтые или розовые колонии. Желтого цвета коло нии образует вид Sorangium cetlulosum.
В природе миксобактерии довольно широко распро странены — они встречаются во многих почвах, особен но в лесных, богатых растительными остатками. Миксо бактерии есть всегда в навозных кучах и в фекалиях травоядных животных.
Актиномицеты по строению напоминают грибы. Одна ко мицелий актиномицетов имеет и свои характерные особенности. Вследствие высокого содержания РНК ми целий хорошо окрашивается всеми основными краска ми. Гифы очень тонки — толщиной 0,3—0,8 мк, а иног да 0,1 мк и тоньше. При этом ядерные элементы или нуклеоиды актиномицетов отличаются от ядер грибов. Молодые гифы актиномицетов красятся по Граму резко положительно. Все это позволяет считать актиномицеты самостоятельной группой микроорганизмов, близкород ственной грамположительным бактериям.
Актиномицеты широко распространены в природе: они встречаются в почве, воде и воздухе Много актино мицетов находится на поверхности растений и на различ ных отмерших растениях. Поэтому их много в лесной подстилке и на пожнивных остатках растений. Но осо бенно изобилуют актиномицетами богатые перегноем почвы. Почвы служат главным источником их выделе ния.
Выделяют актиномицеты на специальных синтетиче ских средах, состоящих из минеральных солей и крахма ла или сахара в качестве источника углерода. Среды эти уплотняют добавлением 3% агара. Можно для культиви рования актнномицетов применять и мясопептонный агар (МПА), применяемый для бактерий, но он для актино мицетов является слишком богатой средой и морфоло гия актиномицетов при выделении на МПА не типична. Актиномицеты образуют настоящее ветвление и этим рез ко отличаются от нитчатых бактерий, у которых иногда наблюдается ложное ветвление. Мицелий актиномицетов некислотоустойчивый и всегда неподвижный, как в виде нитей, так и после распада на палочковидные бактерие-подобные фрагменты. Клетки актиномицетов имеют оболочку, протоплазму и ядерные элементы — нукле оиды.
По вопросу наличия или отсутствия полового процес са у актиномицетов в литературе высказываются про тиворечивые взгляды. Однако убедительных эксперимен тальных доказательств наличия полового процесса у актиномицетов нет. Размножение всех изученных до сих пор видов актиномицетов происходит бесполым путем посредством специальных органов размножения — спор, подобных конидиям грибов, а также ветками или обрыв ками мицелия и почками. Следовательно, в эволюцион ном отношении актиномицеты стоят ниже грибов, у ко торых есть половой процесс и у которых размножение происходит посредством более дифференцированных органов. Споры актнномицетов образуются на воздуш ных ветках — конидиеносцах или спороносцах путем фрагментации или сегментации. Спороносцы бывают прямые, искривленные или волнистые и спиральные.
По ферментации желатины, молока, Сахаров, гидро лизу целлюлозы и крахмала актиномицеты слабо разли чаются, ибо большинство из них располагает обширным набором ферментов. В жидких субстратах при погру женном росте или глубинном культивировании развитие актиномицетов имеет специфические черты. Гифы обра зуют поперечные перегородки, по которым идет расчле нение мицелия на палочки и кокки. Спороносцев и спор при глубинном росте актиномицеты не образуют.
При росте актиномицетов на плотных агаризованных средах у них различают три типа мицелия: субстратный,
55надсубстратный (или собственно колонии) и воздушный. Субстратный мицелий проникает в глубь агара и как бы служит для всасывания питательных веществ; надсуб стратный составляет плотную часть колонии, а на воздушном мицелии расположены органы размноже ния — конидиеносцы со спорами. Консистенция колоний плотная, кожистая, хрящеобразная или сухая крохкая; платиновой петлей не снимается с агара. По этому при знаку актиномицеты резко отличаются от бактерий, име ющих тестообразную или маслообразную консистенцию колоний.
В мицелии и спорах актиномицетов под оболочкой находится тонкая цитоплазматическая мембрана, не от личимая от мембраны грамположительных бактерий. Клетки лучистых грибов не отличаются от клеток бак терий и по строению цитоплазмы. В молодых клетках содержимое гомогенно и есть мелкие зернышки хрома тина — нуклеоиды. Со временем появляются вакуоли. У актиномицетов нет морфологически обособленного ядра. По мере старения мицелия в нем появляется гру бая зернистость.
Цитологическое изучение актиномицетов особенно тщательно проведено А. А. Прокофьевой-Бельговской (1963). В частности ее исследованиями окончательно установлено наличие поперечных перегородок в гифах актиномицетов. Автор подтвердила точку зрения Н. А. Краеильникова, что ядерные элементы у актино мицетов идентичны таковым у бактерий. «Сходство структуры и поведения ядерных элементов актиномице тов и бактерий — одно из важнейших доказательств общей природы этих двух групп организмов».
От истинных бактерий актиномицеты отличаются большим разнообразием пигментов: от светло-желтых, коричневых, бурых до черного и затем зеленых, голубых, синих и красных с большим числом оттенков. Пигменты есть как содержащиеся в мицелии — эндопигменты, так и выделяющиеся наружу — экзопигменты. Н. А. Кра-сильников указывает, что, по Г. А. Надсону и А. А. Им-шенецкому, пигменты микробов играют защитную роль, но в своей работе с актиномицетами он не получил этому подтверждения. Пигментацию воздушного и субстратно го мицелия широко используют в качестве важного диаг ностического признака для классификации актиномице-
тов (Крисе, 1937; Красильников, 1938, 1970; Гаузе, 1957; Балдачи, 1959). Между родом и видом ставят «серии» или группы на основании пигментации мицелия. Гаузе все виды рода Actinomyces сгруппировал в 15 серий по цвету и оттенку пигмента.
Накопившиеся в литературе данные по физиологии актиномицетов весьма обширны; ферментативные воз можности их велики. Об этом свидетельствует и повсе местное распространение представителей этого класеа микроорганизмов. Высокая биохимическая активность обеспечивает актиномицетам легкую приспособляемость к разнообразным условиям среды обитания. По своим возможностям адаптироваться к различным источникам питания эти микробы являются универсалами; и в отно шении углеродного и в отношении азотного питания они могут выступать как автотрофы и как гетеротрофы. [То мимо способности усваивать все органические соедине ния, поставляемые животным и растительным миром, мно гие актиномицеты усваивают углеводороды, а также спо собны вызывать трансформации или полное р-азрушение некоторых синтетических органических соединений.
Так, М. Лус (1971), изучая возможность обезврежи вания гербицидов микробами, нашел, что Streptomyces vlridochromogenes разрушает 2, 4, 5-трихлорфеноксиук-сусную кислоту, a Nocardia opaca вызывает окисление 2-метилфеноксимасляной кислоты и 3- или 4-хлорфенок-симасляной кислоты.
Белящчик с соавторами (Bielaszczyk et al., 1967) вы делила из почвы актиномицет Streptomyces coelicolor, который восстанавливал /г-нитрохлорбензол и динитро-хлорбензол.
Джонсон и Новльс (Johnson, Knowls, 1970) иссле довали способность Streptomyces griseus и других ми кробов расщеплять Ы-(4-хлор-о-толил)-ЫЫ-диметилфор-малидин (галекрон). Актиномицет утилизировал 70% галекрона, трансформируя его в 4-хлор-о-толуиднн. Кейн (Cain, 1958) выделил проактиномицет Nocaridd erythropolis, разрушающий п- и о-нитробензойные кис лоты (см. гл. VI).
Из приведенных данных видно, что актиномицеты способны разрушать органические синтетические соеди нения. К. сожалению, в литера-туре нам не удалось найти сведений о видовом составе актиномицетов, выделяв-мых из промышленных сточных вод, либо данных о функциях актиномицетов в сооружениях по биологиче ской очистке промышленных стоков.
Не только в кратких, но и в полных современных курсах общей микробиологии (Фробишер, 1965; Шле-гель, 1972), в почвенной микробиологии (Пошон и Бар-жак, I960) не нашла отражения богатая физиология и биохимия актиномицетов. Лишь в общей микробиоло гии Станиера и других (Stanier et al., 1971) упоминается (гл. 21), что истинные актиномицеты (Streptomyces) способны продуцировать экстрацеллюлярные гидроли тические ферменты, атакующие каучук, а также мура-мовую кислоту, входящую в состав клеточных стенок бактерий. Последнее свойство позволяет некоторым ви дам лучистых грибов развиваться на агаризованных средах, покрытых суспензией бактерий. Актиномицеты характеризуются большими биосинтетическими возмож ностями— служат продуцентами многих антибиотиков, витаминов и других биологически активных веществ.
За последние два-три десятилетия, когда в микро биологических учреждениях появились электронные ми кроскопы, а также были разработаны Б. В. Перфилье вым и Д. Р. Габе (1961) капилярные методы изучения микроорганизмов, описан ряд новых микроорганизмов. Б. В. Перфильев, применяя пелоскоп, нашел в иле пру дов и озер новый микроорганизм — Dictiobacter тарах п. g. n. sp., что в переводе означает «хищная бактериаль ная сетка». Это бактерия, образующая колонии в воде за счет связывания плазмодесмами палочковидных бес цветных клеток с закругленными концами. Длина кле ток 2—6 мк, ширина — 0,7—1,2 мк. Клетки погружены в гомогенную прозрачную слизь, образующую стенки колонии, которая напоминает мешочек, заполненный слизью. Колония состоит из 100—200 клеток, располо женных в один слой в стенке вместилища, имеющего смыкающееся отверстие. Колония захватывает добычу — железо- и серобактерии, одноклеточные протококковые водоросли и переваривает их. Колонии, подобно организ му, размножаются делением с образованием перетяжки. Размеры колоний 10—40X20—60 мк.
Другая бактерия, изученная посредством пелоскопа, это палочковидная бактерия, образующая подвижные замкнутые кольца, содержащие от 3—4 до 30 колец.
Клетки в кольце соединены плазмодесмами, благодаря чему кольца могут вытягиваться либо складываться в восьмерки. Бактерия названа Б. В. Перфильевым Cyclo-barter. Вид имеет три стадии развития: 1) членистая нить с сапрофитным питанием; 2) сетчато-арканная, имеющая сапрофитное и хищное питание; 3) кольцевая стадия со смешанным питанием. Во всех стадиях клетки по движны, цилиндрической формы с закругленными кон цами. Размеры клеток 6Х 1,4— 1,6 мк. Подобно арка ну или лассо организм набрасывает кольца на нитча тые формы бактерий и затем, образуя нечто вроде закукливания, переваривает свою жертву.
К группе хищных относится также иловый микроор ганизм. Teratobader, представляющий собой подобие циклобактера, но затягивающиеся петли образуются не из цепочки клеток, а из частей колонии, состоящей из тысяч палочковидных клеток, расположенных в виде лент, колец, восьмерок и тому подобных фигур. Бакте рия хищная, питается нитчатыми серобактериями и дру гими микроорганизмами.
Одним из наиболее интересных новых микроорганиз мов является вибрион, ведущий хищнический парази тический образ жизни — Bdellouibrio bacteriovorus (S t о 1 р et Petzold). Бактерия открыта в 1962 г. (Stolp, Petzold, 1962) в опытах по выявлению бактерио фагов, возбудителей бактериозов растений, и подробно описана Штольпом (Stolp, 1968). Название бактерий происходит от греческого Bdello—пьявка и латинского voro — пожирать. Bdellovibrio bacteriovorus в переводе означает вибрион-пьявка, пожиратель бактерий. Форма клетки — типичный вибрион, размерами меньше обыч ных ранее известных вибрионов. Длина его 1 мк, ширина 0,3 мк, на полюсе один толстый жгутик — 28 ммк (ши рина), который по длине многократно превышает длину клетки. Мощный жгутик обусловливает большую по движность вибриона-паразита. Он относится к новому типу бактерий с паразитическим хищническим образом жизни, подобно бактериофагу, вирусу бактерий. Однако по природе ядерного вещества, химическому составу клеточной оболочки, строению жгутика и другим при знакам он является бактерией. По способу питания Bdellovibrio облигатный паразит, на питательных средах в отсутствие живых бактерий не растет, онразвивается только внутри клеток бактерий-хозяев, т. е. поражаемых им бактерий.
Если чувствительных к вибриону бактерий поместить в жидкую среду вместе с Bdellovibrio, то через несколь ко секунд хищник атакует бактерии, наносит удар в стенку и после этого быстро вращается вокруг своей продольной оси с помощью жгутика. В результате свер лящего вращения он проникает внутрь клетки и вызы вает лизис содержимого. Внутри пораженных бактерий вибрионы размножаются и после литического распада клеток хозяина Bdellovibrio выходит в среду и начина ет новую атаку.
Вибрион-хищник может быть отделен от клеток бак терии-хозяина путем фильтрации через фарфоровые све чи (Пастера — Шамберлена) с величиной пор 0,2— 0,45 мк. Посевы фильтрата —• чистой культуры Bdello vibrio на плотные среды в чашки Петри вместе с бакте рией-хозяином дает рост паразита на газоне бактерий в виде прозрачных пятен лизиса. Посевы на жидкую сре ду, где уже размножились бактерии-хозяева, дают про светление жидкости в результате полной гибели клеток хозяина. У паразита-хищника отсутствует узкая специа лизация: штамм вибриона, поражающий один из видов кишечной группы бактерий, может поражать и другие виды энтеробактерий или легко к ним адаптируется. Чувствительны к вибриону-хищнику фитопатогенные бак терии Pseudomonas и Xanthomonas, представители родов Salmonella, Aerobacter, Proteus, Sertatia, Erwinia и Escherichia. Выделенные и изученные штаммы Bdellovib rio различаются по спектру хозяев и бактериолитической активности: некоторые действуют только на определен ные штаммы одного вида, другие — на виды одного рода; большинство штаммов охватывает широкий спектр хозяев.
В настоящее время многочисленными исследования ми показано повсеместное распространение вибриона-паразита в пресных и соленых водоемах, в почве и осо бенно в сточных водах; он оказался интегральным ком понентом природной микрофлоры ряда европейских стран, Южной и Средней Америки, Африки, Австралии, Японии, Индии и Шри Ланка.
Если бактериальную культуру заражать большим количеством клеток вибриона-паразита, то лизис насту-
пает быстро — через несколько часов он может быть за вершен. Учитывая, что Bdellovibrio консервируется лио-филизацией и поддается адаптивной изменчивости, можно предполагать возможность использования этого агента при микробной очистке промышленных сточных вод в качестве средства освобождения от бактериальных клеток производственной культуры путем лизиса кле ток. Разумеется, это лишь перспективный путь исследо вания для практического использования хищника—па разита бактерий.
В 1937 г. Б. В. Перфильевым описан и после разра ботки капиллярных методов изучен новый микроорга низм Metallogenium personaium n. g. n. sp. (Perf.), имеющий геологическое значение, так как он относится к рудообразователям. Несколько микроорганизмов, спо собных к образованию и отложению марганца и желе за, объеденены Б. В. Перфильевым в семейство Metallo-geniaceae, в которое включены бактерии с очень не большим размером клеток (0,7—1,5 мк в диаметре), образующие микроколонии — Metallogenium, Caulococ-cus и Kusnezovia.
Г. А. Заварзин (1961) выделил и изучил культуру Metallogenium symbioticum. В присутствии марганца ко лонии бактерий покрываются отложениями окислов мар ганца и напоминают маленького паучка. Тонкие нити расходятся радиально от центра. При этом бесцветная вначале среда приобретает коричневый цвет. По мере дальнейшего отложения окислов марганца колонии ста новятся бесформенными. На таких колониях образуются железо-марганцевые конкреции, сохраняющие в извест ной мере радиально-концентрическую форму бактери альных колоний, послуживших основой для отложения металлов.
Т. В. Аристовской (1961) описан почкующийся микро организм — Pedomicrobium, состоящий из вытянутых эллипсовидных или булавовидных клеток, соединенных тонкими гифами. Внутри гиф находятся нуклеоиды, передвигающиеся к концам гиф при образовании до черних клеток. Размножается этот организм почковани ем. Он выделен из тех горизонтов почв, где скопляется железо и марганец.
При прямом электронномикроскопическом анализе почвенных суспензий Д. И. Никитин с соавторами
61(1966) обнаружил и описал много новых форм микро организмов. Выявленные в почвах различных типов но вые формы микробов имеют самую причудливую мор фологию — округлые, звездообразные, стебельковые, поч ти шаровидные, продолговатые и испещренные порами или покрытые бугорками,— что делает их сходными с початками кукурузы. Многие субмикроскопические ор ганизмы снабжены разнообразнейшими придатками.
Авторы различают пять разновидностей необычных придатков: жгутикоподобные, четковидные, лентовидные, фагоподобные и корневидные. Эти новые формы отно сятся к типичной автохтонной микрофлоре почв, уча ствующей в превращениях гумусовых веществ, некото рых органических кислот и простых фенолов. Многие из этих новых форм микроорганизмов развиваются на агаризованных почвенных средах. Однако в чистых культурах они не поддерживались и физиолого-биохими-ческие свойства их не изучены. Разумеется, привести в этой небольшой по объему книге все новые формы микроорганизмов, еще не вошедшие в курс общей мик робиологии, нет возможности. Все изученные до настоя щего времени формы микроорганизмов составляют лишь часть микробного мира Земли. Несомненно, большое число видов и родов микроорганизмов еще не исследо вано и не описано.
Микроскопические размеры и ограниченность разно образия форм, а также широкая изменчивость морфоло гических и биохимических признаков в зависимости от экологических условий, от действия внешних факторов, а при лабораторном культивировании — от состава сре ды, особенно источников азота, углерода и дополнитель ных факторов роста, а также рН и гН2 среды — приво дит к затруднениям в построении научной систематики бактерий. По-видимому, указанные причины могли яв ляться поводом для возникновения двух разных прин ципов классификации бактерий: номенклатурной или искусственной систематики и естественной или филоге нетической. При построении искусственной систематики авторы исходили из удобства расположения материала и произвольно размещали таксоны, независимо от воз можного филогенетического родства. Так составлены оп ределители бактерий Горовиц-Власовой (1933) и Цио-ном (1948). По номенклатурному принципу составлен и
| наиболее распространенный определитель Бердже (Берд же, 1936; Smith et al., 1957). На принципе филогенети ческих связей построены «Определитель бактерий и акти-номицетов» Н. А. Красильникова (1949) и «Систематика дрожжей» В. И. Кудрявцева (1954). Авторы максималь но использовали сродство между таксонами для построе- ния естественной эволюционной классификации.
В классификации бактерий Н. А. Красильникова есть свои недостатки, затрудняющие пользование определи телем. За 25 лет, истекшие со времени составления им определителя, в печати появились описания новых ро дов и семейств бактерий, расширен видовой состав не которых семейств. Несмотря на это мы придерживаемся систематики Н. А. Красильникова.
Кон разделил бактерии на четыре группы. В основу их классификации был положен морфологический прин цип. И в настоящее время наиболее крупные система тические категории бактерий — классы (Красильников) или порядки (Бердже) — выделяются по морфологиче ским признакам.
Для характеристики низших таксонов — видов и ро дов — привлекаются морфологические, культуральные и биохимические признаки: характер роста на плотных агаризованных питательных средах, размер и форма ко лоний, цвет и поверхность колоний, форма края коло нии, степень ее прозрачности, рост на средах, уплотнен ных добавлением желатина. Среды, уплотненные агар-агаром, при культивировании бактерий не изменяют своей консистенции; очень мало есть бактерий, разру шающих агар-агар. Среды с желатином очень многие бактерии разжижают. Разжижение желатиновых сред вызывают бактерии с резко выраженными протеолити-ческими свойствами. Определяется гидролиз крахмала.. По характеру роста на жидких питательных средах также составляется суждение о некоторых свойствах изучаемой культуры: образование пленки или кольца на стенках пробирки в жидких средах, равномерное по мутнение среды; выпадение хлопьевидных или пылевид ных осадков составляет дополнительную характеристи ку вида. Учитываются физиологические и биохимические признаки — окислительно-восстановительные функции, в частности редукция метиленовой сини и нитратов, об разование индола, сероводорода, аммиака, свертываниемолока, пептонизация казеинового сгустка, сбраживание Сахаров с образованием кислот и газов либо с образо ванием только кислот. Чем подробнее будет дана харак теристика, тем надежнее результаты идентификации определяемой культуры до вида. Определение вида бак терий остается в микробиологии трудной, а для непод готовленного микробиолога иногда и непосильной за дачей, тем более что в общих курсах микробиологии си стематике бактерий уделяется мало внимания.
В микробиологических латинских названиях микро бов принята бинарная, двойная, номенклатура — пра вило, введенное в науку шведским натуралистом Кар лом Линнеем (1707—1773).
Видовое название бактерий часто происходит от фи-зиологического или биохимического признака. Многие роды бактерий получили названия также не по морфо логическим признакам, особенно если они резко выде лялись по характеру метаболизма или же конечные продукты вызываемых ими реакций были важны для природы или ценны в хозяйственном отношении. По предложению Виноградского и Бейеринка важная био химическая функция может быть отражена в родовом названии. Так появились роды Azotobacter (аэробный фиксатор азота), Nitrosomonas (нитрификатор).
Другими примерами родов, у которых физиологиче ские или биохимические свойства послужили основани ем для родового названия, могут служить молочнокис лые бактерии — род Lactobacterlum; окисляющие сер нистые соединения, сульфиты, гипосульфиты или эле ментарную серу — род Sulfotnonas; бактерии, окисляю щие этиловый спирт в уксусную кислоту,— род Aceto-bacter и др.
Такая таксономическая единица, как род бактерий, в большинстве случаев четко очерчена, но наиболее низ кая единица — вид — иногда очень трудно различима даже при учете множества биохимических свойств и при самом тщательном изучении и анализе всех особен ностей бактериальной популяции определяемой куль туры.
Вид бактерий не только трудно определить, но труд но также и сформулировать понятие «вид». Расхожде ния во взглядах микробиологов-исследователей по это му вопросу велики и они находят отражение в их под-
ходе к систематике бактерий и к представлению о виде, а иногда и к отрицанию потребности уточнять вид ис пользуемой в работе культуры бактерий.
Остановимся сначала на нигилизме в отношении си стематики бактерий, проявляемом некоторыми исследо вателями деструкции синтетических соединений бакте риями, и на последствиях забвения вида. Значение опре деления изучаемой или используемой для практических потребностей культур бактерий видно из такого при мера. Чтобы построить научные микробиологические основы биологической очистки промышленных сточных вод, необходимо обобщить все накопившиеся литератур ные данные о том, какие виды микроорганизмов способ ны вызывать определенные биохимические реакции, не обходимые для разрушения и обезвреживания синтети ческих соединений. Только знание конкретных видов микробов и оптимального режима для проявления их вы сокой деструктивной активности позволит давать реко мендации промышленности по интенсификации биологи ческой очистки путем введения селекционированных высокоактивных культур в состав биоценоза активно го ила.
Отвечают ли таким требованиям накопившиеся лите ратурные данные? В большинстве случаев — нет. Одна треть или даже больше статей по деструкции синтетиче ских соединений микробами представляют собой рабо ты, проведенные на микробах, не определенных до вида. Например, в главе V цитируются работы Фохта и Александра (Focht, Alexander, 1970, 1971), показавшие возможность превращения некоторых соединений, близ ких к пестициду ДДТ, культурой бактерий Hydrogeno-tnonas sp. Можно ли воспроизвести эту работу — нет. Хорват и Александер (Horvath, Alexander, 1970, 1970а) описывают возможность трансформации .м-хлорбензой-ной кислоты посредством Arthrobacter sp. и 2,3,6-три-хлорбензойной кислоты посредством Brevibacterium sp. Обе бактерии в работе цитированных авторов не опреде лены до вида. Воспроизвести эту работу также невоз можно.
В обезвреживании галоидорганических соединений в почве и в сточных водах большую роль играет дегалоге-нирование. Феноксиалкилкарбоновые кислоты — 2,4-ди-хлорфеноксиуксусная, 4-хлор-2-метилфеноксиуксусная, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота представляют со бой группу широко применяемых на практике гербици дов. После того как гербицид выполнил роль средства, подавляющего сорную растительность, его пребывание в почве или водоемах вредно, поскольку он обладает био-цидными свойствами. Отщепление хлора от хлорфено-ксиуксусной кислоты обезвреживает соединение, так как феноксиуксусная кислота даже добавляется в пи тательную среду в качестве предшественника при биосинтезе пенициллина. Возможность дегалогенирова-ния бактериями хлорфеноксиуксусных кислот доказана. Йенсен (Jensen, 1960) показал, что эту функцию вы полняют Agrobacterium sp., Arthrobacter sp. и Pseudo-monas dehalogenans n. sp. Первая и вторая бактерии не могут быть использованы другими микробиологами для аналогичных целей, поскольку виды их не известны. С представителем этого рода микобактерий Arthrobac ter sp. авторами в ряде работ (Loos et ai., 1967; Bollag et al., 1968; Tiedje, Alexander, 1969) исследован метабо лизм 2,4-дихлорфеноксиуксусной и га-хлорфеноксиуксус-ной кислот. Ценность полученных интересных данных снижена тем, что эта бактерия не была определена до вида.
Виллетс и Кэйн (Willetts, Cain, 1970) изучили раз рушение ПАВ (1-фенил-ундецил)-бензол-га-сульфоната и проследили биохимический путь поэтапной деструкции соединения. Однако воспользоваться на практике резуль татами их работы невозможно, так как она выполнена на чистой культуре одного из представителей обширно го рода Bacillus, вид которой не определялся.
Хорват и Кофт (Horvath, Koft, 1972) изучили де струкцию ПАВ алкилбензолсульфоната посредством чистой культуры Pseudomonas sp. с указанием ряда промежуточных продуктов превращения этого ПАВ. Работа представляет большой интерес, но воспроизведе на быть не может, поскольку авторы не определили до вида эту культуру.
Можно было бы привести и другие примеры, иллю стрирующие те затруднения в микробиологических ис следованиях, которые возникают на почве игнорирова ния систематики. Однако приведенных здесь примеров достаточно, чтобы иллюстрировать снижение ценности таких работ, в которых авторы пренебрегли видом бак-
терий. Разумеется, отрицание роли систематики в мик робиологии, как и отрицание важности определения микробов до вида,— это пройденный этап в науке и на нем не следовало бы останавливаться, если бы в очистке промышленных сточных вод не утвердилось та кое довлеющее положение технологии, при котором микробиология стала настолько «технологической», что в вузовском учебнике «Химия и микробиология воды» (1971) не упоминается ни единого вида микроорганизмов, хотя часть II книги (автор Л. Б. Доливо-Доброволь-ский) называется «Микробиологические процессы обра ботки природных и сточных вод». Это дань традиции — рассматривать технологические процессы очистки сточ ных вод лишь в инженерном аспекте. И в этом отноше нии книга отвечает уровню требований, предъявляемых к руководству для технических вузов.
Почти то же можно сказать и о книге «Микробио логия сточных вод» Митчелла (Mitchell, 1972), изданной в США и написанной большим коллективом авторов. Кроме нескольких видов хемоавтотрофных бактерий и трех или четырех видов микроорганизмов, разрушаю щих пестициды, никаких микробов — деструкторов орга нических веществ — загрязнителей стоков — в книге нет. Однако развиваться дальше микробиология сточных вод без изучения определенных видов микроорганизмов не может, как не может развиваться ботаника или зоология без изучения отдельных видов растений или животных.
Зарубежные микробиологи вопросу о виде не уде ляют должного внимания. Берджи в издании 4-м опре делителя (русский перевод сделан в 1936 г.) критерии вида ставит в зависимость от того, насколько удобно ис следователю то или иное решение. Отечественные иссле дователи-флористы, наоборот, озабочены поисками объ ективного подхода. В. И. Кудрявцев (1952) пишет: «Объективной меры вида до сих пор нет». Заканчивая обсуждение вопроса о виде, он предлагает определять виды микроорганизмов: 1) «по общим для всех особей морфологическим признакам рода, к которому принад лежит вид; 2) по общему для всех особей месту в эко номии природы; 3) по общим для всех особей приспо собительным свойствам, отличным от других видов то го же рода». Разумеется, вид бактерий — это ззеио в цепи эво люции, это таксономическая единица с очень широкой амплитудой изменчивости. О большом значении изуче ния изменчивости бактерий при определении вида Н. А. Красильников говорит в нескольких своих статьях и в определителе (1949). Видовая изменчивость, несом ненно, может служить материалом для образования но вых таксономических единиц — подвидов и видов. И тем не менее нельзя незначительные физиологические и био химические отличия изучаемого штамма бактерий от уже описанных в определителях видов считать доста точным основанием для описания нового вида.
Промышленные сточные воды как среда обитания бактерий, содержащая много синтетических соединений, изучена пока недостаточно. Изучение микрофлоры этой новой для микробиологии среды показывает, что не толь ко физиология, но и морфология бактерий при значи тельном содержании различных токсичных для бактерий веществ довольно резко изменяется. Многие синтетиче ские соединения, в том числе и новые, могут индуциро вать эту изменчивость. Но как ни обширен диапазон изменчивости бактерий, приводящий часто к затушева нию границ между видами, а у споровых бактерий даже между родами,— вид в микробиологии как низшая так сономическая единица имеет большое значение для си стематики и важен для всех отраслей микробиологии. Систематику бактерий необходимо всемерно развивать, руководствуясь указанием Энгельса, что современная систематика не разделяет, а ищет мостов и соединяет часто мало сходные на первый взгляд организмы. С уче том этого принципа разработана «Систематика дрож жей» В. И. Кудрявцева. Автором создана более совер шенная систематика, чем принятая прежде систематика споровых дрожжей Штеллинг-Деккер.
Такой подход чужд большинству западноевропейских ученых, имеющих тенденцию описывать новый вид мик роорганизма на основании всего лишь единственного биохимического признака, по которому изучаемая куль-' тура отличается от уже известных микробов.
В цитированной нами работе Иенсена (Jensen, 1960) культура Psetidomonas описана как новый вид Pseudo-monas dehalogenans n. sp. только на основании одного биохимического признака — способности дегалогениро-
вать хлорфеноксиуксусную кислоту. С нашей точки зре ния, описание культуры в качестве нового вида только по одному биохимическому свойству неправомерно. .
Приводим определение вида по Н. А. Красильникову: «Вид — совокупность родственных организмов, имею щих общий корень происхождения, которые на данном этапе эволюционного развития характеризуются опреде ленными общими морфо-физиологическими признаками и которые обособлены отбором и приспособлены к опре деленной среде и внешним условиям существования».
Многолетняя исследовательская работа одного из ав торов по изменчивости споровых бактерий, стафилокок ков, бактерий семейства Pseudomonadaceae позволяет сделать заключение, что лишь при музейном хранении и строгом соблюдении стандартных условий в отноше нии состава рН и гН2 среды, температуры инкубации, а при культивировании на плотных агаризованных сре дах — и состава газообразной среды можно говорить о существовании монотипных видов бактерий.
При нарушении стандартных условий, отклонении от оптимума, пусть даже условного, культуры приобрета ют новые признаки, чаще неустойчивые — типа модифи каций, а иногда стойко сохраняемые при культивирова нии их в этих других измененных условиях — типа му таций.
Известно, что В. Н. Шапошников (1944) придавал очень большое значение физиологическим признакам в систематике... «физиологическими признаками не толь ко не следует пренебрегать, но, наоборот, им следует приписывать еще большее значение, чем морфологиче ским» ', считая при этом, что энергетические процессы наиболее изучены. Шапошников полагал, что для гетеро трофных бактерий... «они должны быть в первую оче редь для групповой и частной характеристики отдель ных представителей бактерий». Наряду с этим он под черкивал, что все физиологические признаки типичны в строго определенных условиях и указывал на резкое изменение состава продуктов брожения в зависимости от исходного субстрата.
Из наших наблюдений следует, что морфологические признаки более стабильны, чем физиологические, и там, где это возможно, за ними должно быть сохранено ве дущее положение.
С 1949 г., когда была дана формулировка вида Н. А. Красильниковым, накопилось много данных, по буждающих дополнить прежнюю формулировку. На про тяжении последних десятилетий появились в литературе предложения использовать для классификации бакте рий достижения биохимии и молекулярной биологии, а именно —■ соотношение нуклеотидов в составе дезокси-рибонуклеиновой кислоты (ДНК) отдельных видов бактерий (Белозерский, Спирин, 1960, и др.).
Выяснено, что иуклеотидный состав ДНК. настолько типичен для каждого вида бактерий, что при изменчи вости бактерий по типу диссоциации S- и R-варианты имеют идентичный состав ДНК. Установлено также, что бактерии, относящиеся к разным систематическим груп пам, имеют сходный нуклеотидный состав ДНК (кишеч ная палочка и некоторые коринебактерии содержат 50—■ 52% гуанина и цитозина (ГЦ); псевдомонасы и микро бактерии — 57—70% ГЦ).
Штаммы бактерий с одинаковым составом ДНК не обязательно родственны. Есть известная корреляцион ная связь между нуклеотидным составом и антигенной структурой (Спирин, Белозерский, 1956). Не удалось пока установить связь между составом ДНК и принад лежностью бактерий к грамположительной или грам-отрицательной группе. Близкородственные бактерии патогенного и сапрофитического видов, гемолитические и негемолитические оказались со сходными показателя ми специфичности ДНК.
Однако есть в литературе данные о видовой специ фичности ДНК в пределах рода (Зайцева, Белозерский, 1957). В обзорной статье И. Н. Блохиной и Г. Ф. Лева-новой (1972) приведено более 600 таксонов, у которых определялось содержание ГЦ.
Авторы приводят значительное число исследований, в которых определение соотношения нуклеотидов по зволило уточнить или изменить систематическое поло жение отдельных видов бактерий. Резюмируя критиче ский анализ литературы, авторы приходят к заключе нию, что данные о составе ДНК широко и с успехом применяются для выяснения таксономического положе ния родов и видов бактерий.
Наряду с этим Н. А. Красильников (1970) считает, что накопившиеся в литературе данные пока недоста точны для того, чтобы, опираясь на них, можно было бы строить систематику бактерий уже теперь. Организмы разных видов и далеко отстоящие имеют идентичные по казатели ГЦ/AT (гуанин цитозин: аденин тимин).
В настоящее время формулировку вида можно пред ставить следующим образом: вид есть совокупность близко родственных организмов, имеющих общее про исхождение, обособленных отбором и на данном этапе эволюции в идентичных условиях среды характеризую щихся общими морфо-физиологическими и генетически ми (нуклеотидный состав) признаками, а также имею щие сходные черты наследственной изменчивости.
Систематика бактерий Н. А. Красильникова построе на на эволюционной основе с максимальным учетом принципа филогенетического сродства.
Ряд простейших растений Protophyta состоит из двух групп: Schizophyceae — низшие хлорофиллоносные и Schizomyceae — низшие бесхлорофильные. Все бактерии сгруппированы в четыре класса: Actinomycetes, Eubac-teriae, Myxobacteriae, Spirochaetae и отнесены к группе Schizomyceae.
Применительно к задаче этой книги значение имеют преимущественно актиномицеты и эубактерии, посколь ку роль миксобактерий в разрушении синтетических ор ганических соединений пока не выяснена, а класс Spiro chaetae, как известно, состоит в основном из парази тических форм, требующих для своего развития живо го белка. Поэтому предполагать участие спирохет в трансформации или деструкции синтетических веществ невозможно.
Увлеченность многих исследователей метаболизмом бактерий приводит часто к забвению систематики. Од нако известно, что такой подход ошибочен. Практиче ская важность и народнохозяйственная полезность мик робных метаболических реакций делают исследования по систематике неизбежными. Так было в 40-х и 50-х годах XX ст., когда выяснилось, что основными проду центами антибиотиков являются актиномицеты. Разра ботка систематики актиномицетов потребовалась для того, чтобы поиски активных продуцентов ускорить, об легчить и сделать более результативными. Нельзя со-мневаться в том, что изучение микрофлоры промышлен ных сточных вод в систематическом аспекте необходимо для создания научных микробиолого-биохимических ос нов биологической очистки промышленных стоков.
Систематика бактерий Бердже значительно отлича ется от систематики Красильникова, особенно в более крупных таксонах. В 7-м издании «Определителя бакте рий» Бердже все низшие представители растительного мира Protophita были разделены на 3 класса: 1) Schi-zophyceae — синезеленые водоросли, 2) Schizomycetes — бактерии, 3) Microtatobiotes — риккетсии и вирусы. Первый и третий классы не рассматриваются. Класс Schizomycetes разделен на 10 порядков, 47 семейств, 190 родов и 1464 вида бактерий. 8-е издание «Определите ля бактерий» Бердже значительно отличается от 7-го. Все организмы, не имеющие настоящего ядра — прокариоты, разделены в нем на два отдела — цианобактерии и бак терии. Цианобактерии в «Определитель» не включены. Множество бактерий сгруппировано в 19 частей. Часть — самая крупная таксонометрическая категория. Одни час ти разделены на порядки, порядки — на семейства, се мейства — на роды; другие части делятся на семейства и далее на роды. Некоторые части розделены непосредст венно только на роды. Однако перечисление всех частей, порядков, 48 семейств и 247 родов в этом издании «Опре делителя» все же не могло бы дать представления о клас сификации.
Класс актиномицетов, по Н. А. Красильникову, раз деляется на две большие группы — высшие и низшие формы. В группу высших форм включены мицелиальные организмы, образующие спороносцы со спорами. К низ шим относятся не образующие мицелия палочковидные и кокковидные формы, не дающие спороносцев. Все представители класса актиномицетов грамположитель-ны. Н. А. Красильников и в своих монографиях и в мно гочисленных статьях подчеркивает, что лучистые грибы занимают промежуточное положение между бактериями и грибами. Многие зарубежные ученые безоговорочно считают актиномицеты ветвящимися бактериями.
Характеристика клеток этого класса, приведенная Н. А. Красильниковым в определителе бактерий и акти номицетов (1949) и в определителе лучистых грибов (1941), где указывалось, что клетки актиномицетов не-
подвижны, должна быть изменена, поскольку за эти годы описаны актиномицеты, обладающие подвижно стью— Actinoplanes (Красильников, 1970), клетки ко торых имеют жгутики, как и у подвижных бактерий. Точно так же должна быть изменена и характеристика размножения. В упомянутых определителях приведены описания лишь экзоспор, образующихся на спороносцах или на мицелии; за это время описано целое семейство Streptosporangiaceae, представители которого формиру ют мешкообразные вместилища эндоспор — спорангии.
Будучи продуцентами многих антибиотиков, актино мицеты играют важную роль как антагонисты, регулируя состав почвенных биоценозов и освобождая их от пато генных бактерий. Вызывая деструкцию ряда синтетиче ских органических соединений, актиномицеты оказыва ют человеку действенную помощь в очистке окружаю щей среды от накопляющихся вредных веществ. Санитарная роль актиномицетов, безусловно, недооцени валась, а их значение в природе гораздо значительнее, чем считалось до недавнего времени.
Класс Eubacteriae. Клетки чаще палочковидные, ре же кокковидные, нитевидные или изогнутые, извитые;и спиралевидные; одиночные и собранные в цепочки. Обо лочки не эластичны, ригидны, вследствие чего форма клетки постоянна. Морфологически обособленных ядер нет, но есть нуклеоиды. Клетки не ветвящиеся, непо движные и подвижные, движение осуществляется по средством жгутиков; грамположительные и грамотрица-тельные спорообразующие и безспоровые; безспоровые почти всегда грамотрицательны.
Размножаются простым делением клетки пополам. Часто наблюдается гетероморфное деление с образова нием неравновеликих клеток, реже размножение идет пе решнуровыванием или почкованием. При почковании или в результате лизиса возможно образование суб микроскопических гранул, проходящих сквозь бактерио логические фильтры (образование фильтрующейся ста дии клеточных бактерий). Нитчатые бактерии могут об разовывать репродуктивные тельца (органеллы) — го-нидии.
Клетки бесцветны или содержат пигменты. Пигменты бактерий по цвету характеризуются меньшим разнооб разием, чем пигменты актиномицетов. У бактерий чащевстречаются пигменты желтых оттенков, реже красных, очень редко синих. Бактерии семейства Chlorobacteriaceae характеризуются наличием зеленого пигмента. Род Chlorobium содержит пигмент бактериовиридин, или хлоробиумхлорофилл, а пурпурные бактерии содержат пигмент бактериохлорофилл, близкий к хлорофил-лу а растений. Желтые пигменты бактерий каротиноиды изу чены недостаточно.
По физиологическим признакам эубактерии очень разнообразны; есть среди них с автотрофным типом пи тания, но большинство гетеротрофы. Преобладающее большинство их сапрофиты, но многие виды болезне творны. В природе они широко распространены. В во доемах и в очистных сооружениях эубактерии состав ляют преобладающую массу микроорганизмов.
Практическое значение для разрушения синтетиче ских соединений в очистных сооружениях имеют пред ставители трех семейств порядка эубактерии: Pseudo-monadaceae, Bacillaceae, Bacteriaceae и семейства Chla-mydobacteriac.eae порядка хламидобактерий.
Что касается видового состава биохимических высо коактивных бактерий — деструкторов синтетических со единений, то в литературе, приведенной в этой книге, а также имеющейся в нашем распоряжении, первое место по частоте встречаемости, числу видов и количеству раз рушаемых соединений занимают виды рода Pseudomonas. Всего в книге упоминается 26 видов рода Pseudomo nas, разрушающих синтетические соединения.
Различные виды рода Pseudomonas способны вызы вать трансформации хлорорганических пестицидов и дегалогенировать другие галогенорганические соедине ния. Бактерии рода Pseudomonas способны восстанавли вать нитрогруппу нитроароматических соединений с по следующим разрывом бензольного кольца и использова нием образовавшихся веществ в качестве единственного источника углерода и азота. По Р. П. Наумовой (1969), Pseudomonas dacunhae может использовать капролак-там в качестве единственного источника углерода и азо та. Такаши (Takashi, 1966) обнаружил это же свойство у Ps. aeruginosa и Ps. desmolytica. Несколько видов ро да Pseudomonas способны разрушать серусодержащие соединения, в частности ПАВ — эфиры серной кислоты и алкилсульфонаты.
Из видов Pseudomonas, не указанных в этой книге, в качестве деструкторов синтетических галоидорганйче-ских, нитроорганических и серусодержащик органиче ских соединений, по данным Ц. И. Роговской (1967), в деструкции синтетических соединений кроме описанных в главах VI, VII и VIII участвуют при разрушении ви-нилаиетата Ps. sinuosa, Ps. caudatus, Ps. coadunata, Ps. liquida; при очистке сточных вод производства три-метилолпропана (этриола)—Ps. liquefaciens, а в сточ ных водах, содержащих ацетальдегид,— Ps. mycophaga, в сточных водах, содержащих ацетат кальция, формаль дегид, масляный альдегид, метиловый и бутиловый спир ты,— Ps. radiatus и в сточных водах, образующихся при синтезе жирных кислот,— Ps. oleovorus.
В статье Энгельгарта и Груна (Engelhardt, Grun, 1969) указывается на разложение полиакрилата Pseu domonas aeruginosa. Эта культура была способна ис пользовать синтетический полиакрилат в качестве един ственного источника углерода.
Чтобы составить полное представление о широчай ших ферментативных возможностях в области деструк ции органических соединений представителями рода Pseudomonas, нельзя не упомянуть хотя бы кратко о некоторых классах природных органических соединений, непригодных для использования животным и раститель ным миром. Некоторые из этих природных соединений даже могут служить антисептиками или дезифектанта-ми для болезнетворных микроорганизмов. Так, штамм Pseudomonas putida, выращенный на среде с толуолом (Koch, Kallio, 1968) в качестве единственного источника углерода, окислял бензол, толуол и этилбензол. Е. И. Квасников с соавторами (1970) из почв западно-украинских нефтяных промыслов выделили несколько культур рода Pseudomonas, активно окисляющих наф талин. Г. П. Славина (1970) выделила нафталинокис-ляющие Pseudomonas centrifugans и Ps. boreopolis из подземных вод нефтегазоносных районов Урало-Повол-жья, Северного Предкавказья, Грузии, Литвы и Украи ны. Л. Д: Штурм приводит данные (1958) об окислении метана Ps. ftuorescens, об усвоении гептана — шестью видами Pseudomonas, нафтенов — Ps. aeruginosa. Есть данные о разрушении представителями рода Pseudomo nas каучука, резины, смазочных масел (Бобкова и др., 1971). Из сказанного видно, что на Земле, по-видимому, нет органических соединений — синтетических и природ ных, не разлагаемых каким-либо из видов бактерий рода Pscudomonas (табл. 3).
Из семейства Pseudomonadaceae способен к расщеп лению ароматических соединений еще один вид — Rho-dopseudomonas palustris. Культура использует в каче стве источника углерода и-оксибензойную и протокате-хиновую кислоты (Dutton, Evans, 1969). Другой вид этого же рода — Rhodopseudomonas capsulatus, относя щийся к фотосинтезирующим бактериям, развивается в установках биологической очистки сточных вод птице ферм. Добавление этих бактерий в рыборазводные пру ды ускоряет прирост мальков рыбы. Клетки Rh. capsu latus содержат 58% белка и 200 мкг% витамина В12 (Kobojasi et al., 1969).
На втором месте по числу видов среди бактерий-де структоров стоят представители рода Bacillus (22 вида их перечислены в главах I, VI и VII). Представители рода Bacillus принимают участие в метаболизме гало ид-, нитро- и серусодержащих органических соедине ний, полученных путем органического синтеза. Однако наибольшее число споровых бактерий известно как де структоры нитроанилина и капролактама. Изучены они
77
в отделе биологической очистки промышленных стоков ИКХХВ АН УССР.
Ц. И. Роговской (1967) приводится один вид — Вас. verrucosus, выделенный из активного ила при очистке стоков производства винилацетата, и три вида, выделен ных из активного ила при очистке стоков производства триметилолпропана (Вас. nitrificans, Вас. amylozyma, Вас. valinovorus).
Из семейства Bacteriaceae описаны деструкторы син тетических соединений родов Bacterium, Achromobacter, Aerobacter (H. А. Красильников считает представителей родов Aerobacter, Escherichia синонимами рода Bacte rium). Представители кишечной флоры животных Esche richia (Bacterium) coli и Aerobacter aerogenes осуще ствляют восстановительное дехлорирование пестицида ДДТ. Оба эти вида и еще Escherichia freundi, а также Alcaligenes faecalis и Alcaligenes metalcaligenes утили зируют алкилбензолсульфонаты (см. гл. VII). Кроме того, Aerobacter aerogenes разлагает акарицид галекрон (4-хлоро-о-толил) N.N-диметилформамидина (Mendel, Walton, 1966; Wedemeyer, 1967). Bad. globiforme разру шает 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Bad. fluo-rescens и Bad. prodigiosum используют тринитротолуол в качестве источника азота. Bad. agile использует в ка честве источника азота капролактам.
Некоторые виды и роды порядка Actinomycetales от носящиеся к низшим формам, способны разлагать син-I тетические органические соединения. Например, Arthro-1 bacter globiforme разлагает 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту; Arthrobacter simplex разрушает я-нитрохлор-бензол и динитрохлорбензол. Коринебактерии использу ют динитрофенол и динитро-о-крезол в качестве источ ников азота и углерода.
Примеры бактериальной деструкции веществ, приве денные в настоящей главе этой книги, свидетель ствуют о том, что микробы из классов Achinomycetes и Eubacteriae активно участвуют в защите природы от химического загрязнения.
Глава III. ПРИ< ПОГОБИТЕЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИИ
Многие годы общая и промышленная микробио логия ограничивалась изучением превращений различных природных веществ и соединений как органических, так и неорганических. В те годы синтетических веществ было мало, они нигде не скоплялись и первоначально не причиняли никакого ущерба природе или хозяйствен ной деятельности человека. Но по мере развития про мышленности число новых химических соединений, применяемых в быту, в промышленной и сельскохозяй ственной деятельности человека, резко увеличилось. Мно жество химических соединений различных классов само го разнообразного назначения или просто представляю щих собой отбросы и побочные продукты химических производств попадают в сточные воды, в почву, а за тем уносятся в естественные водоемы. К таким соеди нениям относятся альдегиды, кетоны, эфиры, органиче ские кислоты, спирты, как алифатические, так и арома тические, нитро- и галоидпроизводные ароматических соединений и множество различных по строению по верхностно-активных веществ.
Среди продуктов органического синтеза выявляется все больше соединений, обладающих резко выражен ным ингибирующим, цитотоксическим и биоцидным дей ствием на клетки многих живых организмов. Такие со единения все шире применяются для борьбы с разными вредоносными организмами. Планомерно ведутся изыска ния дезинфицирующих средств, инсектицидов, фунгици дов, дефолиантов, средств дератизации и прочих хими ческих веществ, применяемых для девастации (истреб ление возбудителей инфекционных и инвазионных забо леваний человека, животных и растений). Химизация народного хозяйства и, в частности, сельского хозяй ства привела к тому, что множество галоидорганических и фосфорорганических и других соединений, объединяе мых в понятие пестициды, производятся в огромномколичестве, а в процессе практического применения эти соединения попадают в почву, а затем в водоемы.
Нельзя не упомянуть о том, что многочисленные, от носительно безвредные для живой природы синтетиче ские соединения в виде разного рода упаковочных мате риалов и пластмасс бытового и промышленного назна чения также накопляются в почве, в свалочных местах и на дне водоемов. Известно, что многие химические вещества, получаемые путем органического синтеза, раз рушаются микроорганизмами в почве и водоемах или очистных сооружениях, т. е. в природе нашлись микро организмы, способные адаптироваться к этим соедине ниям. Некоторые синтетические вещества, возможно, подвержены микробному разложению, но пока не по пали в поле зрения микробиологов и биохимиков. Не может быть сомнения в том, что уже создано и продол жает создаваться химической промышленностью много таких веществ, которые трудно разрушаются микроорга низмами, причем это зависит либо от химического строе ния вещества, либо от того, что они имеют трудно ата куемую микробами форму в результате вторичной про мышленной обработки — прессование под большим давлением, полировка поверхности и покрытие ее анти коррозионными материалами.
Вопрос об устойчивости к воздействию микроорганиз мов таких вторично измененных промышленной обработ кой веществ представляет собой самостоятельный инте рес и нами не рассматривается.
Остановимся кратко на анализе причин и условий проявления физиологической или, в данном случае точ нее сказать, биохимической активности микроорганизмов в естественных условиях обитания.
Трансформация органических веществ или их микроб ная деструкция, используемая человеком в процессе на роднохозяйственной деятельности, становится возмож ной потому, что многие микроорганизмы способны удо влетворять свои пищевые потребности за счет углерода и азота разнообразнейших органических соединений, в том числе и синтетических, а энергетические за счет утилизации химической энергии, освобождаемой при трансформации либо расщеплении этих органических ве ществ на более простые.
Немецкий ученый Пфеффер разделил все микробы по типу питания на автотрофы и гетеротрофы. Ака демик Н. Д. Иерусалимский (1949) считает, что сущ ность различий между автотрофами и гетеротрофами кроется не в том, что питательные вещества поступают в форме минеральных или органических веществ, а в том, способна ли клетка самостоятельно конструировать все сложные биополимеры или ей необходимы готовые, синтезированные другим живым организмом «детали» для сбора биополимеров и, в конечном итоге,—• сложно го здания клетки.
Такую конструктивную биосинтетическую деятель ность клетки Н. Д. Иерусалимский предложил называть, в случае ее полной автономности, автотрофным биосинте зом и при потреблении уже имеющихся в природе орга нических веществ — гетеротрофным биосинтезом.
В книге рассматривается то преобладающее в при роде большинство микроорганизмов, которое способно к гетеротрофному биосинтезу, ибо только они могут раз рушать органические вещества. Известно, что гетеротро фы в процессе эволюции приспособились к использова нию в природе тех естественных органических веществ, с которыми они встречаются в нормальных экологиче ских условиях,— это вещества растительного и живот ного происхождения разной сложности: углеводы от гек-соз и пентоз до целлюлозы и пентозанов; азотистые ве щества от аминокислот до полипептидов, нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды; липиды и их компоненты от глицерина и жирных кислот до сложных растительных и животных масел, жиров и жироподобных веществ — фосфолипидов, липопротеидов и т. д.
У значительно меньшего числа микроорганизмов су ществует приспособленность к потреблению углеводоро дов нефти, озокерита, битуминозных сланцев, сапропе-литов, фенолов. Они в течение длительного периода вре мени, охватывающего жизнь многочисленных поколений микробов, в нормальных экологических условиях всту пали в контакт с этими веществами, совершенно непри годными для всего органического мира ни в качестве источников питания, ни в качестве энергетического ма териала. Микробы же в процессе эволюции приспособи лись утилизировать и эти инертные в биохимическом отношении вещества. Наиболее широко распространенные в природе ор ганические вещества и предопределяли направление эволюции биохимических процессов в микробном мире. Но здесь необходимо сделать оговорку, что отнюдь не все приспособительные реакции микроорганизмов, а осо бенно бактерий, наследственно закреплены и являются следствием эволюции. Многочисленные изменения био химических свойств и даже некоторых физиологических особенностей являются обратимыми и, по-видимому, представляют собой модификации. Адаптивная измен чивость микрофлоры, так широко известная при очист ке промышленных сточных вод, представляется явле нием сложным, где безусловно приходится сталкиваться с проявлением различных категорий изменчивости мик роорганизмов. Те формы адаптации, где приобретенное свойство закреплено наследственно, образуются в ре зультате мутационной изменчивости и отбора мутантов средой (Райан, 1958). Часто встречаемая легко обрати мая изменчивость представляет собой модификации.
Хотя среди микроорганизмов промышленных стоков постоянно встречаются бактерии и низшие формы акти-номицетов и микроскопические грибы, или микромице-ты, в трансформации и деструкции большинства органи ческих веществ и особенно синтетических соединений ведущая роль принадлежит бактериям. Они занимают первое место в ценозах активного ила и биопленки по численности таксонов и штаммов, а возможно, и по ско рости размножения в специфической водной среде, изо билующей различными токсически действующими хи мическими соединениями или ингбиторами роста микро организмов. Актиномицетам и микромицетам достается подчиненное положение. Но в почвах, особенно луговых и в лесной подстилке, в компостах и на свалках актино-мицеты и грибы-микромицеты выступают в роли веду щих микробов — деструкторов органических, в том числе и синтетических соединений.
В этой книге обсуждение вопроса о природе и ха рактере изменчивости микроорганизмов, выполняющих роль санитаров в борьбе с загрязнением природы, от носится только к бактериям.
Преобладающее большинство бактерий располагает замкнутой генетической системой. Кроме того, в онто генезе бактерий нет диплоидной фазы. Иначе говоря,
формы изменчивости бактерий, связанные со скрещива нием и обогащением наследственного материала, у пре обладающего большинства гетеротрофных бактерий от сутствуют. Исключение составляет кишечная палочка, у которой известна копуляция или пара-сексуальный процесс, ведущий к необычному скрещиванию с реком бинацией генетического материала — меромиксису '. Сле довательно, все рассуждения об изменчивости бактерий относятся к организмам, пребывающим в гаплоидной фазе. Им присуща адаптивная изменчивость — физиоло-го-биохимические модификации и мутационная измен чивость.
Адаптивную изменчивость бактерий большинство ис следователей рассматривают как фенотипическую, не затрагивающую генома, а мутационную — как бесспор но генотипическую.
Мутации различают спонтанные и индуцированные. Индуцированными считают мутации, полученные в экс перименте в лабораторной культуре микроорганизма под влиянием специфически действующих факторов — мутагенов. К мутагенам относятся некоторые химиче ские соединения, ионизирующие излучения, температу ра и другие факторы внешней среды, способные оказы вать повреждающее действие на живой организм. Ес тественные мутации в природных условиях называют спонтанными. Разумеется, в отношении бактерий спон танные мутации можно рассматривать и как индуциро ванные неучитываемым фактором. Ибо в условиях мик росреды обитания бактерий клетки могут подвергаться мутагенному воздействию различных химических соеди нений, пока еще не зачисленных официально в разряд химических мутагенов. Количество известных химических мутагенов уже сейчас исчисляется сотнями. Вероятно, со временем свойство индуцировать мутации у бактерий будет изучено и у многих других соединений.
Приспособительная изменчивость, независимо от то го, будет ли она чисто физиологической, фенотипиче-ской аккомодацией или индуцированной генотипической мутацией, может быть направлена на субстрат, служа щий источником углерода либо азота для строительного
1 Ф. Ж а к о б и Э. В о л ь м а н. Пол и генетика бактерий. М., ИЛ, 1962. обмена (анаболизм), или расщепляемый с целью полу чения энергии (катаболизм). Противопоставлять в на стоящее время анаболизм катаболизму невозможно, так как продукты энергетического обмена бактерий могут служить пластическими веществами для построения не обходимых микроорганизму сложных органических ве ществ.
Что же касается механизма адаптации микробной популяции или целого биоценоза, как это имеет место на очистных сооружениях, то здесь прежде всего сле дует подчеркнуть принципиальное различие между адаптацией эволюционной, протекающей на протяжении многих тысячелетий или миллионов лет, и адаптацией экспериментальной, или производственной, наблюдаемой на промышленных сооружениях, где адаптация длится дни, недели или в крайнем случае несколько месяцев. Наиболее существенным элементом, определяющим ме ханизм адаптации, является субстрат. Фактором, инду цирующим и направляющим изменение метаболических функций в определенное русло, служат на очистных со оружениях часто совершенно новые синтетические хими ческие соединения, получаемые путем органического синтеза. С этими соединениями ни один микроорганизм никогда не встречался, их не было прежде на Земле и они не могли оказывать влияния на эволюцию биохими ческих процессов в микробном мире. И тем не менее те перь все эти новые соединения способны вызывать адап тивную изменчивость микроорганизмов адекватно дей ствующему фактору. Лишь в отдельных исключительных случаях можно говорить о существовании в природе ана логов некоторых соединений с подобной или идентичной конфигурацией углеродного скелета, что могло, безу словно, сказаться на биосинтезе фермента весьма близ кого по структуре к уже имеющемуся в богатом энзи-матическом арсенале микробной клетки гетеротрофных бактерий, антиномицетов и грибов микромицетов.
Анализируя вопрос об адаптивной изменчивости мик роорганизмов, участвующих в разрушении органических веществ промышленных стоков, нельзя не упомянуть области, где исследования адаптивной изменчивости приобрели наиболее широкий размах — это развитие устойчивости бактерий к лекарственным веществам. В связи с широким внедрением в практику здравоохра-
нения синтетических антимикробных средств и антибио тиков устойчивость микроорганизмов к лекарственным химиотерапевтическим препаратам приобрела огромное практическое значение. Развитие устойчивости микроор ганизмов к лекарственным веществам некоторыми ав торами рассматривается как одна из форм адаптивной изменчивости, развивающейся in vitro очень скоро. Ино гда в пределах одного месяца при последовательных, пассажах на средах с постепенно повышающейся кон центрацией антибиотика устойчивость микроорганизма резко возрастает.
Исследователям, занимавшимся вопросами привы кания микроорганизмов к различным химическим аген там, находящимся в питательной среде, известна зако номерность возникновения устойчивых форм к химиче скому агенту. При этом по мере удлинения времени адаптации либо при продолжительном культивирова нии, поддержании уже адаптированной микробной по пуляции на среде, содержащей агент-индуктор устойчи вости, все более затрудняется возможность возврата к исходным формам при пассировании на универсальных питательных средах, не содержащих вещества-индук тора.
Истолковать эту адаптивную изменчивость можно по-разному. Многие авторы считают, что стабильность приобретенной устойчивости во времени (например, к антибиотикам) объясняется мутационной изменчиво стью.
Литература по развитию устойчивости микроорга низмов к химическим агентам, в том числе и к антибиог тикам, обширна. Еще в прошлом веке Косяков показал, что споровые бактерии — сенная палочка и возбудитель сибирской язвы — приспосабливаются к постепенно воз растающим концентрациям бората натрия, борной кис лоты и сулемы и развиваются при таком содержании их в среде, при котором исходные культуры не росли.
Вопрос о том, какие формы изменчивости бактерий как трактовать, обсуждается в исследованиях, выпол ненных в начале XX ст. Айзенберг, получив измененные формы холерного вибриона, считал их наследственными модификациями. Бертлайн, напротив, наследственную' изменчивость бактерий рассматривал как мутационную. Этот вопрос дискутируется и в наше время (Bryson, Zrybalski, 1955; Jakob, Monod, 1961). Интересную трак товку индуцированной изменчивости микобактерий под влиянием гидразида изоникотиновой кислоты дают Ю. К. Вейсфейлер и В. Т. Карасева (1963).
Литература по развитию лекарственной устойчиво сти микроорганизмов огромна и разбор ее увел бы нас в сторону от основного русла изложения материала. Ин тересующимся изменчивостью микроорганизмов под влиянием антибиотиков и синтетических микробных пре паратов можно рекомендовать обзор П. Н. Кашкина (1958), раздел «Изменчивость микробов под влиянием лекарственных веществ» в книге Д. Г. Кудлай (1954), монографии М. Н. Лебедевой и С. Д. Воропаевой (I960), Р. Шнитцер и Э. Грунберг (1960).
Адаптация микроорганизмов к различным химиче ским соединениям, отбросам промышленности и отхо дам бытовой химии приобретает с каждым годом все большее значение, не уступая по важности для настоя щего и будущего всего человечества вопросу об адап тации патогенных бактерий к лекарственным веществам. Принципиальное различие состоит в том, что привыка ние микробов к лекарственным веществам — явление отрицательное, принуждающее затрачивать большие средства и много труда ученых на поиски путей борьбы с резистентными формами, на исследование новых анти микробных агентов и их производство для лечения болезней, возбуждаемых резистентными формами болез нетворных микробов. В то время как адаптация гетеро трофных сапрофитных микробов к разложению органи ческих химических соединений, загрязняющих сточные и природные воды, а также почву, является феноменом, огромную пользу которого для народного хозяйства трудно даже представить и по достоинству оценить.
Адаптивные изменения микроорганизмов, происходя щие в активном иле или биопленке на очистных соору жениях, нельзя рассматривать с позиций теории эволю ции как этап эволюционного процесса Лишь при взгля де из настоящего в будущее можно допустить, что по отношению к некоторым уже синтезированным в настоя щее время соединениям, могущим получить впослед ствии широкое распространение на Земле, адаптивная изменчивость в самом широком понимании, включая му тационную изменчивость и отбор, может выступать как
элемент микроэволюцни. Но такая ситуация пред ставляется исключением. Заинтересованный в охране природы человек создает искусственно условия, в кото рых вынуждены жить и отправлять свои физиологиче ские функции микроорганизмы биоценозов, используе мых в промышленности. Для сохранения вида в есте ственных условиях обитания — в природе—-микробу в преобладающем большинстве случаев нет надобности в такой приспособительной изменчивости, которая проис ходит при адаптации биоценоза очистного сооружения. Следовательно, микроорганизм, прирученный человеком к выполнению биохимической функции по деструкции синтетического органического вещества, представляет собой биологический артефакт.
Адаптация в естественных условиях существования к ферментации арабинозы или ксилозы в дополнение к глюкозе и фруктозе является ценным приобретением штамма, расширяющим его экологическую приспособ ленность. Это позволяет виду увеличивать ареал его распространения. Точно так же для вида, способного гидролизовать крахмал, декстрин и целлюлозу в эво люционном или, вернее, микроэволюционном аспекте, дополнительно приобретенная способность гидролизовать полисахариды — арабан и ксилан — была бы биологи чески полезным свойством вида. Такого рода адаптивная изменчивость повышала бы его жизнеспособность.
Но если, например, один из видов рода Pseudomo nas либо отдельные расы или популяции широко рас пространенного в природе вида Pseudomonas fluo-rescens в процессе промышленной адаптации приобре тает способность разрушать хлорорганическое аромати ческое соединение, то такое обогащение биохимического арсенала этого вида для его экологической приспособ ленности почти не имеет значения. Взятый нами произ вольно в качестве примера организм Pseudomonas fluo-rescens в природе не сможет воспользоваться своей вновь приобретенной ферментативной системой. Как только бактериальная популяция выйдет за пределы очистного сооружения и затем выйдет из зоны поступ ления данного хлорорганического соединения в среду обитания, способность к биосинтезу фермента, вновь при обретенного в процессе адаптации, будет утрачена. Эта мысль высказывается на основании экспериментальныхматериалов, полученных в нашей работе. Некото рые чистые культуры бактерий, адаптированные к син тетическому органическому соединению, сохраняют спо собность восстанавливать или окислять некоторые ради калы только на минеральной среде с добавлением этого соединения. При посевах этих культур на стандартные универсальные питательные среды, не содержащие изу чаемого вещества, они утрачивают новое свойство, полученное при адаптации. Разумеется, в тех случаях, когда адаптация сопровождается мутационной изменчи востью, приобретенное свойство сохраняется и на уни версальных средах.
При попытке разобрать механизм адаптации бак терий необходимо остановиться на тех изменениях эн-зиматического аппарата, которые претерпевает микроб ная популяция в процессе приспособительной изменчи вости.
Как известно, уже около 40 лет назад финский мик робиолог Карстрем ввел представление об адаптивных и конститутивных ферментах. Он изучил зависимость образования карбогидраз молочнокислыми бактериями от наличия в среде тех или иных Сахаров. Ферменты, об разующиеся в клетке бактерий независимо от состава среды, используемой для культивирования бактерий, он назвал конститутивными, а ферменты, синтезируемые бактериальной клеткой в зависимости от приспособле ния культуры к определенного состава питательной сре де,— адаптивными.
Так, по данным Карстрема, у Betabacterium arabi-nosaceus (О. Jensen) ферменты, сбраживающие глю козу, фруктозу, маннозу, сахарозу, являются конститу тивными; ферменты, сбраживающие арабинозу, галак тозу, мальтозу, мальтозу и лактозу,— адаптивными. Для другой культуры молочнокислых бактерий Lactobacil-lus pentoaceticus ферменты, сбраживающие пентозы — арабинозу и ксилозу,— конститутивны. Карстрем па основании исследований пришел к заключению, что об разование чуждого для данной культуры фермента не удается вызвать адаптивным путем. Так, у одной расы Bad. coil, несмотря на длительное культивирование на среде с сахарозой, не удалось вызвать биосинтез фер мента сахаразы. Обычно для начала биосинтеза адап тивного фермента микробной культурой требуется из-
вестный промежуток времени, иногда достаточно продол жительный. Однако после появления свойства выраба тывать новый фермент синтез его протекает легко и чем дольше культура пассируется на средах, содержащих углевод, индуцировавший образование этого фермента, тем прочнее закрепляется наследственно это вновь при обретенное свойство.
Один из опытов Карстрема, демонстрирующий разли чие между адаптивной и конститутивной карбогидразой, состоял в следующем. На кровяной сыворотке культи вировался штамм Bacterium aerogenes, затем отмытую суспензию бактерий вносили в водный раствор ксилозы; брожения не наблюдалось в течение 15 ч. Если в про бирки добавляли источник азота в форме (NH4)2SO4 или дрожжевой воды, брожение начиналось спустя 2 ч. При культивировании этого же штамма на бульоне с кси лозой брожение ксилозы при тех же условиях опыта отмытая культура вызывала тотчас же. В. отличие от ксилозы глюкоза сбраживалась вне зависимости от усло вий жизни субкультуры. Отсюда сделан вывод, что фер менты, участвующие в сбраживании глюкозы, принад лежат к конститутивным. Представление о наличии в ми ре микробов адаптивных ферментов было поддержано, а затем подкреплено в исследованиях многочисленных мик робиологов. Однако и сам Карстрем и другие исследо ватели не считают возможным проводить резкую грань между конститутивными и адаптивными ферментами. Так, фермент глюкозимаза, сбраживающий глюкозу, от носится к конститутивным, но образуется его в субстра те, где есть глюкоза, больше, чем в средах без глюкозы.
Для представления о механизме образования адап тивного или индуцированного фермента микроорганиз мом большой интерес представляют исследования фран цузского микробиолога Моно и его учеников (цит. по Клюйверу, 1959). Речь идет о биосинтезе фермента р-га-лактозидазы нормальной культурой Bacterium coli, т. е. сбраживающей лактозу. Этот штамм начинает сбражи вать лактозу только по исходе некоторого латентного периода после посева в среду с лактозой. Моно доказал экспериментально, что бактерии, выращенные без лакто зы, не содержат фермента р-галактозидазы, но спустя несколько часов после инкубации в среде, содержащей лактозу, клетки уже содержат этот фермент. В этихопытах доказывается, что лактоза служит специфиче ским индуктором синтеза р-галактозидазы; синтез про текает только до тех пор, пока в среде есть лактоза. Продолжительность каждого опыта была так мала и прирост клеточной популяции так незначителен, что не льзя предположить спонтанного возникновения мутанта, обладающего р-галактозидазной активностью, кото рый бы вследствие отбора под действием среды обогнал в росте исходную популяцию. Было доказано также, что индуцированный синтез р-галактозидазы протекает во всех клетках с почти одинаковой скоростью.
Чрезвычайно интересным представляется результат исследования Моно, в котором он показал, что индуци рующей способностью в отношении фермента р-галакто зидазы обладают не только лактоза, но и другие со единения с галактозидоподобнои конфигурацией, в част ности метил-р-й-галактозид, хотя использованный в этих опытах штамм не расщеплял ни галактозы ни метано ла. Позже было установлено, что a-d-галактозидмели-биоза является также индуктором образования того же фермента. Важно подчеркнуть, что сахар мелибиоза не ферментируется р-галактозидазой. Из этого следует вы вод, что, по-видимому, для индукции биосинтеза фермен та нет надобности в том, чтобы субстрат-индуктор по треблялся микроорганизмом. Было также доказано, что скорость образования галактозидазы находится в со ответствии с концентрацией индуктора, а минимальная концентрация метил-р-с/-галактозида очень мала — 10-6М, около 200 мкг/л.
В работах Моно показано, что для образования га лактозидазы кроме лактозы необходимо наличие в сре де благоприятных источников азота и углерода для по строения белка. Добавление 2,4-динитрофенола, специфи ческого ингибитора ассимиляции, репрессировало синтез галактозидазы.
Адаптивная изменчивость ферментов, как и адап тивная изменчивость микроорганизмов, признавалась и признается всеми микробиологами и особенно биохими ческого профиля. Заключительная глава книги «Мета болизм бактерий» М. Стефенсон (1951) посвящена энзиматической изменчивости и адаптации. Кстати, М. Стефенсон считала, что все ферменты бактерий, вы зывающие гидролиз полисахаридов, в том числе и
целлюлаза, адаптивны. Г. Д. Роджерс считает (1963), что целлюлаза, амилаза, гиалуронидаза и хитиназа принадле жат к индуцируемым ферментам бактерий. Н. Д. Иеруса лимский (1963) в «Основах физиологии микробов» ввел раздел «Адаптивно-физиологическая изменчивость и адаптивные ферменты». В монографии «Физиология бак терий» Месробяну и Пэунеску (1963) есть также раздел: «Энзиматическая адаптация у бактерий». Половину сво ей увлекательной книги «Вклад микробов в биологию» Клюйвер и Ван-Ниль (1959) посвятили адаптивной и мутационной изменчивости микроорганизмов. Третий те матический симпозиум английского общества общей микробиологии «Адаптация у микроорганизмов» (1956) в значительной мере посвящен адаптивной изменчиво сти ферментов или их индуцированному биосинтезу. А. А. Имшенецкий в предисловии к русскому изданию этой книги очень хорошо сказал: «Начальные стадии адаптации бесспорно связаны с изменением метаболиз ма, и поэтому, естественно, что в исследованиях в этом направлении принимают участие микробиологи и био химики, углубленно изучающие адаптивные ферменты».
Следует отметить, что на V Международном конгрес се биохимиков (Москва, 1961) принято решение приме нять название «индуктивный энзим» вместо «адаптив ный энзим», ибо основой биосинтеза ферментов служит механизм индукции. Несмотря на это решение, многие микробиологи придерживаются укоренившегося термина «адаптивный энзим».
Отношение наших отечественных микробиологов к этому вопросу было различным. В. И. Кудрявцев (1954) занял в оценке представления Карстрема непримири мую позицию. В монографии «Систематика дрожжей» читаем: «Мы не будем пока касаться разбора глубоко антинаучной теории Карстрема» (стр. 96). Нам такое отношение к этой теории представляется неоправдан ным. И вот почему. Вопрос об адаптивности, т. е. инду-цируемости ферментов, обсуждается преимущественно в такой плоскости, как будто бы у микроорганизмов весь набор ферментов ограничивается гидролазами. Ес ли решается вопрос о сбраживаемости того или иного углевода или о его доступности для конкретного вида, тогда легко можно представить себе ферменты, необ ходимые штамму или культуре как адаптивные илииндуцированные в том смысле, что клетки микробной популяции на основании имеющихся генетических потен ций способны продуцировать фермент, соответствующий внешней среде (индуктору).
Способность к использованию того или иного саха ра, сформировавшаяся в процессе эволюции у дрожжей и бактерий, может находиться в латентном состоянии. При наличии индуктора в среде эта потенциальная воз можность, заложенная в генетической информации мик робной клетки, может реализоваться. В этом смысле все гидролизы дрожжей или бактерий адаптивны. Ок-сиредуктазы и трансферазы, напротив, всегда конститу тивны. Энергетические процессы гетеротрофов незави симо от субстрата, служащего источником энергии, все гда необходимы. Без них существование микробной клетки немыслимо. Детерминированность неизменного наличия в клетках оксидоредуктаз, как и некоторых других ферментов, не вызывает сомнения.
В своих экспериментальных работах В. И. Кудряв цев (1938, 1939, 1952) получил у диких дрожжей Saccha-romyces paradoxus, неспособных сбраживать мальтозу, индуцированную мальтазу. У винных дрожжей получе на индуцированная галактозимаза и затем, при много кратных пересевах в молоке были получены винные дрожжи с наследственно закрепленной галактозимазной активностью.
На сходстве и различии индуцированных и консти тутивных ферментов не было бы надобности так по дробно останавливаться, если бы в решении стоящей перед нами задачи ведущая роль не принадлежала ин дуцированным ферментам. Многочисленные химические соединения, создаваемые промышленностью органиче ского синтеза, впервые предстают перед микробным ми ром Земли. У какого микроорганизма и по какому резону могли существовать конститутивные ферменты, позволяющие ему в сточных водах или в почве атаковать новое соединение, синтезированное человеком впервые в прошлом либо в этом году или планируемое к произ водству на будущий год? Ответить на такой вопрос чрез вычайно трудно.
Специалисты по технологии биохимической очистки промышленных стоков при пуске очистных сооружений говорят, что для начала их работы необходимо иметь
адаптированный активный ил или биопленку. С точки зрения микробиолога, а также в аспекте объяснения ме ханизма этого процесса, понятие «адаптированный ил» почти не содержит информации. Ни на вопрос, что там претерпевает адаптацию (какой компонент биоценоза?), ни на вопрос, как происходит адаптация, в чем состоит ее механизм,— окончательного ответа не могут дать не только технологи, но и микробиологи. В отечественной литературе, касающейся очистки промышленных сточ ных вод, ответа на этот вопрос найти нельзя. Лишь по отношению к некоторым отраслям химической промыш ленности у нас в СССР разработаны микробные методы, в которых используются чистые культуры или обога щенные либо смешанные культуры бактерий, способные вызывать более интенсивную деструкцию основных хи мических загрязнителей. Чистые культуры или смеси чистых культур в состоянии разрушать более высокие концентрации, чем активный ил либо биопленка. Это работы Н. Т. Путилиной (1961, 1964), Ц. И. Роговской (1967), Е. М. Юровской (1968, 1971) и нашей лабора тории (1972). В этих исследованиях указывается, что при незначительных изменениях условий культивирова ния у бактерий-деструкторов резко снижается биохими ческая активность и часть из них в значительной степе ни утрачивает способность разрушать те соединения, к которым они были адаптированы, особенно при пас сажах на универсальных питательных средах. В лите ратуре данных о ферментах микроорганизмов — деструк торах синтетических соединений — нет. В связи с этим нами обсуждается вопрос об адаптивных или индуцированных ферментах микроорганизмов, участвую щих в метаболизме природных органических соединений.
Интересную интерпретацию индукции биосинтеза ферментов дают Кон и Моно. Моно опубликовал серию исследований по адаптивной изменчивости ферментов у микроорганизмов, а также один из первых в 1947 г. об наружил явление глюкозного эффекта у некоторых бак терий.
Среди индуцированных ферментов многие являют ся частично конститутивными, т. е. клетки бактерий син тезируют их и без индукторов, но в ничтожно малых количествах. У некоторых видов бактерий один и тот же фермент бывает частично индуцированным и частичноконститутивным. Для подтверждения этого дается ссыл ка на изучение пенициллиназы Bacillus subtilis. Был изучен ряд свойств конститутивной пенициллиназы без индуктора, после чего они сравнивались со свойствами фермента, выделяемого в присутствии пенициллина. Они оказались идентичными — никаких различий не обнару жено. На этом основании авторы предполагают, что «конститутивная» и «индуктивная» пенициллиназы — один и тот же фермент.
В пределах микробного вида один и тот же фермент у одних штаммов может быть конститутивным, у дру гих — индуктивным. В эксперименте у некоторых микро организмов получены индуцируемые ферменты, а затем у культур с индуцированными ферментами найдены му танты, где новый фермент становился конститутивным. При этом наблюдалось изменение одного гена. Разли чие между конститутивным ферментом мутанта и адап тивным исходной культуры установить не удалось. До казуемое единство конститутивных и индуктивных эн зимов у бактерий Кон и Моно называют «унитарной теорией». Превращение адаптивного фермента в консти тутивный в результате наблюдаемых мутаций авторы считают подтверждением унитарной теории. Ей проти вопоставляется дуалистическая гипотеза, согласно кото рой механизм синтеза конститутивных ферментов отли чается принципиально от механизма синтеза индуцируе мых адаптивных ферментов.
Авторы предположили, что индукция может рассмат риваться как универсальное явление и что при консти тутивных системах она только замаскирована (гипотеза генерализованной индукции).
Сущность гипотезы генерализованной индукции со стоит в том, что в конститутивных системах роль ин дуктора играют нормальные, спонтанно синтезируемые продукты обмена веществ в клетке. Это может быть субстрат фермента либо вещество по конфигурации идентичное или близкое субстрату (аналог субстрата). Предполагается, что индуцированный фермент возник под влиянием внешнего индуктора, а конститутивный фермент синтезируется под влиянием внутренней ин дукции.
Мы здесь не касаемся вопроса об адаптации микро бов к тем закономерным, но медленным изменениям
среды, которые длительно протекают в одном направле нии и связаны с геохимической эволюцией. Р. Станиер (1956) назвал такие изменения системными. Изменения не закономерные, кратковременные и внезапные, а ино гда для организма случайные, называют флуктуирую щими.
В природе для сохранения вида микроорганизма мо гут быть полезны изменения обеих категорий. Адапта ция к системным изменениям названа Стачиером эво люционной, а приспособление к флуктуирующим измене ниям — физиологической адаптацией. Генотип микроба формируется в процессе эволюционной адаптации. В случае первичного контакта микробной популяции с новым химическим веществом, будет ли это в почве или очистном сооружении,— в начальной стадии приспособ ления, по-видимому, идет физиологическая адаптация как бы к случайному флуктуирующему изменению сре ды. Это прямая фенотипическая аккомодация. В каком положении она находится к генетической изменчивости? Мы располагаем пока весьма ограниченной информаци ей о бактериях—деструкторах синтетических органичес ких веществ — загрязнителей промышленных стоков. Можно лишь предполагать, что в последующем феноти-тическая аккомодация заменяется мутационной изменчи востью и благоприобретенное свойство становится на следственным.
Явление изменчивости бактерий, потенциально спо собных к разрушению синтетических органических соеди нений, можно сравнивать с наиболее близко стоящей аналогичной адаптивной изменчивостью бактерий к хи-миотерапевтическим лекарственным препаратам — анти биотикам и синтетическим антимикробным лекарствен*, ным веществам. Однако же аналогия здесь состоит лишь в том, что антимикробные лекарственные вещества и некоторые химические отбросы или загрязняющие сточ ные воды промышленности синтетические вещества яв ляются химически индивидуальными соединениями, с которыми микроорганизмам приходится вступать в са мый тесный контакт.
Ван-Ниль (1959) считает, что «адаптации обычно не рассматриваются как наследственные изменения; на следоваться может только способность к адаптации». Станиер (1956) также приходит к выводу о том, чтоАдаптация физиологическая протекает на фоне одного неизменного генома. Он подчеркивает, что изменений в ядре при этом не происходит. К весьма сходному за ключению с цитированными авторами приходят также Дин и Хиншельвуд (1956). По их мнению, адаптивные изменения характеризуются развитием наличных, но латентных свойств, а не появлением вновь образующих ся качеств. Адаптивные признаки они не причисляют к приобретенным. Кроме того, Дин и Хиншельвуд сомне ваются в том, чтобы адаптивный физиологический при знак мог бы сохраняться в отсутствие индуктора.
Это сомнение Дина и Хиншельвуда не подтвержда ется нашей текущей работой по селекции бактерий, вы зывающих трансформацию и деструкцию я-нитроанили-на. Из активного ила, адаптированного к разрушению n-нитроанилина, на лабораторной установке были вы делены чистые культуры бактерий рода Pseudomonas и Bacillus. Две из них — Pseudomonas fluorescens и Ba cillus valinovorus var. nitroanilini обладали наиболее высокой биохимической активностью при разрушении n-нитроанилина. Они более года пересевались на агари-зозанной синтетической питательной среде с п-нитроани-лином в качестве единственного источника углерода и азота. Биохимическая активность этих культур при та ком музейном культивировании сохранялась.
Пара-нитроаиилин относится к типичным продуктам органического синтеза. Как и все синтетические соеди нения, он не имеет в животном и растительном мире потребителей. Но, как и для большинства синтетиче ских органических соединений, для нитроанилина в ми кробном мире находятся потребители. Они появляются среди микробных компонентов активного ила в резуль тате адаптивно-модификационной или же мутационной изменчивости.
Представляло интерес решить вопрос: какого харак тера изменчивость бактерий наблюдается в данном слу чае у бактерий, разрушающих нитроанилин? Что это — модификации или мутационная изменчивость и после дующий отбор? С этой целью были проведены следую щие опыты. Обе культуры пассировались на мясопеп-тонном агаре три месяца. За это время сделано 15 пас сажей. После трехмесячного пребывания на МПА обе культуры возвращены на синтетическую среду с нитро-
анилином. В течение 15 пассажей за три месяца сме нились тысячи поколений, и, несмотря на это, по возвра щении их на синтетическую среду бактерии проявляли способность разрушать 200 мг/л rt-нитроанилина. В по следующих пассажах они разрушали 500 мг/л. Это сви детельствует о том, что Bacillus valinovorus и Pseudo monas fluorescens способны разрушать п-нитроанилин, по-видимому, вследствие образования мутантов.
По мнению Ю. Н. Карасевича (1971), приспособи тельная перестройка клеточной организации возможна двумя путями: 1) использование микробной клеткой имеющейся генетической информации, позволяющей це лесообразно перестроиться микробной клетке адекватно окружающим условиям с сохранением наследственности в стабильном состоянии; 2) целесообразная реакция микробной клетки на окружающие условия в результа те стойкого изменения наследственности. Нам представ ляется, что во взглядах на изменчивость бактерий Н. Д. Иерусалимский был прав, считая возможным по степенное закрепление физиологических адаптации у микроорганизмов. Из приведенных литературных данных следует, что многие микробиологи-исследователи счита ют стартовым пунктом ферментативной изменчивости метаболические процессы. При этом следует допустить, что, по-видимому, вновь появляющийся фермент не все гда включается в геном бактериальной клетки. В про тивном случае трудно дать объяснение легкой потере таких новых свойств. Разумеется, современные пред ставления об адаптации микроорганизмов как о приспо собительной изменчивости в самом широком понимании включает и мутационную изменчивость и последующий отбор.
Начиная с классических опытов Массини (Massini, 1907) с кишечной палочкой и наблюдений Бейе-ринка над появлением вторичных колоний папилл на по верхности первичных колоний у разных микроорганиз мов (цит. по Ван-Нилю, 1959) вопрос о возможности появления мутаций у бактерий решен положительно. Первоначально наблюдения касались морфологии микро организмов и культуральных свойств, а затем внимание исследователей было сосредоточено на физиологических и биохимических особенностях, как практически гораздо более важных. После того как Луриа и Дельбрюк (1943) разрабо тали методику «флуктуационного теста» для того, чтобы отличать адаптивные изменения культуры в резуль тате индуцированного биосинтеза ферментов от образо вания мутантов, были проведены многочисленные иссле дования, показавшие, что мутационная изменчивость в микробном мире широко распространена и представляет собой обычное явление.
Результатом генотипической изменчивости считаются все варианты бактерий, резистентных к антибиотикам — пенициллину, стрептомицину, тетрациклинам, а также формы, устойчивые к синтетическим лекарственным ве ществам— сульфаниламидам, нитрофуранам, салицил-аиилидам. Возникающая резистентность сохраняется во многих пересевах, следовательно, она генетически за крепляется в сотнях и тысячах поколений. Пассажи на средах, лишенных химиопрепарата-индуктора, не приво дят к потере микроорганизмами антибиотикоустойчи-вости. Информация резистентности закладывается в ге нотипе штамма, в ДНК клетки.
В настоящее время известно, что устойчивость бак терий к лекарственным веществам обусловливается так же эписомной, внехромосомной наследственностью. На большое значение в изменчивости и наследственности для бактерий эписомного фактора указывал в свое вре мя академик В. Д. Тимаков (1963). Этот вопрос исчер пывающе изложен в монографии Д. Г. Кудлай (1969).
Описано много мутантов, способных сбраживать до полнительные углеводы. У многочисленных видов бак терий под влиянием мутагенных факторов — радиации и химических мутагенов — получены мутанты с дефектом синтеза необходимых аминокислот — ауксотрофные му танты.
Биохимия микроорганизмов представляет собой об ласть знания, в которую использование мутагенеза вне сло наиболее весомый вклад. Производство органических кислот посредством грибов рода Aspergillus — лимон ной, глюконовой, итаконовой — ведется сейчас на му тантах, полученных радиационным и химическим мута генезом (Карклиньш, Пробок, 1972). Амилолитические и протеолитические ферменты микробиологическая про мышленность выпускает, используя в качестве проду центов только биохимически высокоактивные штаммы
Aspergillus oryzae, полученные путем воздействия ком бинаций химических и радиационных мутагенов (Тата-ренко, 1970). В производстве витаминов и аминокислот также используются мутанты микроорганизмов (Скрябин и др., 1966). Все высокоактивные продуценты антибио тиков— актино.мицеты и грибы — селекционированы с помощью комбинированного химического и радиационно го мутагенеза и непрерывного отбора по хозяйственно ценным признакам. Промышленность антибиотиков бур но прогрессировала с такой, поистине головокружитель ной, быстротой, какой не знала ни одна из отраслей промышленности, в основе технологии которой лежит жизнедеятельность микроорганизмов.
Все сказанное об использовании мутантов в различ ных отраслях микробиологической промышленности сви детельствует о широком применении в народном хозяй стве достижений генетики.
По существующим представлениям, качество мутаций определяется в значительной мере качеством применяе мого мутагена (Дубинин, 1970). Под влиянием мутагенов у микроорганизмов могут возникать формы, не встре чавшиеся в природе (Алиханян, 1963). Это позволяет на деяться, что у индуцированных мутантов можно получать штаммы микроорганизмов, которые были бы способны разрушать новые соединения.
Вопрос о применении химических мутагенов для об работки микроорганизмов, используемых для очистки промышленных сточных вод, поднял в литературе И. А. Рапопорт (1970). Автор предлагает использовать мутагенную селекцию для очистки сточных вод химиче ской промышленности. Решение этой задачи упрощается, если есть штаммы микроорганизмов, уже обладающие способностью разрушать химические соединения, входя щие в состав сточных вод, и усложняется, если необхо димо впервые селекционировать микроб для деструкции нового органического вещества.
И. А. Рапопорт предлагает несколько моделей ис пользования химических мутагенов в селекции микроор ганизмов для очистки промышленных стоков: 1) выделе ние микроорганизма из очистных сооружений и повы шение уже присущей ему деструктивной функции; 2) сообщение определенному виду или штамму микроба способности разрушать химическое соединение в отдель-ности или совместно с природными аналогами; 3) повы шение биохимической очистительной продуктивности смешанной популяции, состоящей из двух-трех видов. В случае повышения продуктивности на какую-то замет ную величину культура или популяция должна обяза тельно проверяться на очистном сооружении.
Еще одна рекомендованная модель — сочетание хи мического мутагенеза со своеобразным вариантом ес тественного отбора. Для крупных химических предприя тий автор не считает возможным применение отдельных мутантов и размножение их в виде чистых линий. Пред лагается обрабатывать химическими мутагенами непо средственно активный ил в объеме от 0,1 до 0,01 всего количества ила. Предполагается, что естественный отбор в смешанном биоценозе может сохранить селективно те микроорганизмы, которые в результате мутаций при обрели повышенную биохимическую активность разру шать основные или наиболее вредоносные химические загрязнители.
И. А. Рапопорт высказывает еще одну хорошую мысль, рекомендуя получать индуцированные полиму тации из активного ила. При значительном спектре му таций от обработки мутагеном разношерстной много видовой популяции есть шанс получить мутанты, разру шающие вещества, до того недоступные адаптированно му к промышленному стоку активному илу. Обработки мутагенами должны повторяться несколько или много раз, а промежутки между последовательными обработ ками должны быть установлены экспериментально.
При использовании для очистки стоков каскада пру дов И. А. Рапопорт предлагает также применять хими ческий мутагенез, но преимущественно для последнего звена в каскаде, где априорно должны бы скопляться со единения, наиболее устойчивые к микробной деструкции.
Разумеется, в настоящее время рекомендации, опи санные выше, должны рассматриваться как перспектив ная схема реализации химического мутагенеза в борьбе за интенсификацию биохимической или биологической очистки промышленных стоков химических производств. На пути к осуществлению любой из этих моделей лежит множество технических трудностей. Напрашивается про верка схемы на пилотных установках или на лабора торных очистных сооружениях укрупненного образца.
Глава IT. МИКРОБНОЕ РАЗРУШЕНИЕ ФЕНОЛОВ
Несмотря на то, что различные фенольные со единения всегда обнаруживаются в почве и водоемах, попадая туда с растительными и животными остатками, большие концентрации этих веществ губительны для живых организмов. Именно поэтому микробное разру шение фенолов и очистка от них различных отходов и сточных вод является серьезной научной и практической проблемой.
Особую важность имеет разработка биологических методов обесфеноливания промышленных сточных вод. Так называемые «фенольные» сточные воды образуются главным образом на коксохимических заводах и газо генераторных станциях. Эти воды содержат от 0,2 до 6,0 г\л фенолов (Костовецький, 1959; Путилина и др., 1964). Фенолы находятся также в сточных водах некото рых отраслей химической промышленности, в том числе производства пластмасс (Kjrchgessner, 1958). I Даже незначительные концентрации фенолов оказы-[ вают токсическое действие на водные организмы, в ре зультате чего выпуск фенолсодержащих вод в открытые водоемы наносит большой ущерб рыбному хозяйству. В концентрациях, которые с трудом определяются с по мощью существующих химических методов (0,01— 0,005 мг/л), фенолы придают воде после хлорирования специфический аптечный запах и делают ее непригод ной для питья. Фаулер еще в 1904 г. (цит. по Ба-зякиной, Столяровой, 1956) предложил очищать содер жащие фенолы стоки газовых заводов биологическим. методом. -
В дальнейшем метод очистки и доочистки фенольных сточных вод активным илом приобрел широкое распро странение. Как показали М. М. Калабина и Ц. И. Рогов-ская (1934), интенсивность распада фенолов в аэротенке зависит от их концентрации. Оптимальным количеством является 200—500 мг фенола на литр. В то же время, по данным Л. Ф. Кабаковой с сотрудниками (1934), при биологической очистке газогенераторных торфяных вод наиболее устойчивый эффект достигается при концентра ции фенола не более 40 мг/л. Многие авторы (Кабако ва и др., 1934; Базякина, 1940; Grossman et al., 1965; Кириченко, Хват, 1970) рекомендуют фенольные стоки смешивать с хозяйственно-бытовыми сточными водами. Другие исследователи показали возможность адаптации к использованию фенолов активного ила как в экспери ментальных условиях (Калабина, Шнеерсон, 1962; Наг-mann, Singrun, 1968; Prakasam, Dondero, 1970), так и на производственных установках. Хмелевски и соавторы (Chmielowski et al., 1967) установили, что фенолы могут разлагаться также анаэробно в метантенках сме шанными популяциями метанообразующих микроорга низмов, адаптированными к использованию этих соеди нений.
Наряду с управляемыми технологическими процесса ми очистки загрязненных вод от фенолов большое вни мание привлекает самоочищение водоемов, в которые по ступают феполсодержащие стоки. А. К- Столбунов и дру гие (Столбунов, Багнюк, Прядкина, 1972; Столбунов, 1973) изучали роль гетеротрофных микроорганизмов в разрушении фенолов в водохранилищах. Показано, что фенолразрушающие бактерии постоянно присутствуют в воде. Устойчивость фенолов к биоразложению в водое мах, по мнению авторов, связана с тем, что гетеротроф ные микроорганизмы не являются облигатными по от ношению к фенолу как источнику углерода и используют в первую очередь более легко усвояемые вещества. Большая численность гетеротрофных бактерий наблю дается в местах поступления фенолов. Об этом сообщает Д. 3. Гак (1967), которая даже предлагает устанавли вать степень загрязнения воды фенолами, определяя количество фенолразрушающих бактерий в 1 мл. Микобактерии, утилизирующие фенолы, выделены из проб воды и ила Рыбинского водохранилища (Лопатик, J964). Изолированные культуры отнесены к пяти видам: Mycobact. vadosum, M. brevicole, M. lacticolum, M. fla-vum, M. hyalinum.
Микроорганизмы, способные использовать фенолы в качестве источника углерода, обнаружены в илистых и песчаных участках озер (Strzelczyk et a!., 1972), в водах
н отложениях Балтийского и Северного морей (Iturria-ga, Rheinheimer, 1972).
Интенсивность процессов самоочищения водоемов от фенолов зависит от многих факторов (Zdybiewska, 1968; Столбунов и др., 1972). На ход самоочищения влияют начальная концентрация фенолов, быстрота их поступ ления, насыщенность воды кислородом, рН, температу ра, гидробиологические характеристики водоема и дру гие факторы. После впуска фенольных стоков в реку происходит гибель определенных форм микроорганиз мов. Одновременно начинают размножаться другие мик роорганизмы, которые могут развиваться в присутствии фенолов, а также сопутствующих им роданндов. На про тяжении 3,5 км водного пути процесс самоочищения реки еще не заканчивается. Только через 9 км появля ются некоторые растения и животные; первые рыбы бы ли обнаружены лишь на 15-м километре, а их большее разнообразие — на 21-м километре.
Таким образом, разложение фенолов в природе, а также на очистных установках, созданных человеком, происходит в результате воздействия на них различных микроорганизмов. Бактерии, принимающие участие в биодеградации фенолов, принадлежат к различным ро дам и видам и встречаются в воде, почве, воздухе, хо зяйственно-бытовых стоках. _
Фаулер с сотрудниками (Fowler et al., 1911), впер-1 вые использовавшие для очистки фенольных стоков био логический метод, выделили из биопленки культуру Bad. helveticum, способную разлагать фенол в присут ствии цианидов и роданидов. Вагнер (цит. по Таусону, 1932) изолировал ряд бактерий — деструкторов фенолов, которые он назвал Bad. phenoli, Bad. benzoli. B. brenz-katechini, В. phloroglucini.' Ни одна из бактерий не раз-, лагала гидрохинон или пирогаллол. М. М. Калабина и Ц. И. Роговская (1934) наблюдали развитие в экспери ментальном фенольном стоке зорглейных бактерий, нитт чатых бактерий и гифомицетов. После инокуляции раст вора фенола свежей сточной жидкостью и осадком из метантенка авторами были выделены чистые культу ры фенолразрушающих микроорганизмов — Micrococcus piltonensis, Achromobact. jophagum и Actynotnyces con-voluta. А. А. Егорова (1942, 1946) изучала процесс окисле> ния фенолов термофильными бактериями, источник вы деления которых автором, к сожалению, не указан. Культуры были определены как новый вид Вас. thermo-phenolicus. Эти бактерии окисляли до 1 000 мг/л фенола в экспериментальной установке, моделирующей био фильтр. А. А. Егорова считает, что изолированная бак терия отличается высокой специфичностью к фенолу как источнику углерода, поэтому нельзя ожидать полной очистки этой культурой подсмольных вод коксохимиче ских заводов, содержащих помимо фенолов другие орга нические соединения. Майсснер (Meissner, 1955) обнару жил высокую фенолрасщепляющую активность у Bad. ftuorescens liquefaciens. По его мнению, нет специаль ных фенольных бактерий; к разложению этих веществ могут приспособиться различные микроорганизмы, ис пользующие простые углеродсодержащие соединения — сахара, органические кислоты, спирты и др.
" Линн и Пауэре (Lynn, Powers, 1955) показали, что среди выделенных ими фенолразрушающих бактерий представители рода Bacillus составляют 15,6%, Achro-mobacter — 31,3%, Flavobacter — 3,1%. A Icaligenes — 3,1%, Pseudomonas — 25,0%, Micrococcus — 18,7%, Strep tococcus— 3,1%. Бактерии кишечной группы также спо собны к биодеградации фенолов. Ланда (Landa, 1959) сообщает об изоляции из речной воды штамма Е. coli, который разлагал 50—100 мг/л фенолов, а при дальней шем культивировании — даже до 2000 мг/л. Крезолы и ксиленолы разрушаются значительно медленнее/. В актив ном иле аэротенка разнообразную микрофлору, способ ную разлагать фенолы, обнаружили Ц. И. Роговская и М. Ф. Лазарева (1959). Это были Bad. aliphaticum li quefaciens, Вас. alboladis, Вас. cereus, Вас. natans, Ps. caudatus, Ps. dacunhae, Ps. desmolyticutn, Ps. fluorescens, Ps. rathonis, Sarc. albida, Sarc. subflava, а также грибы. Среди изолированных культур доминировали Pseudomo nas— 50—83% общего числа выделенных микроорга низмов. Представители рода Bacillus составляли 8—33%, Sarcina, Bacterium и Micrococcus — до 16,6%. Общее число фенолразрушающих микроорганизмов в изучаемых илах колебалось от 45 до 90%. При адаптации к фено лам оно еще увеличивалось. Интересно, что только 41 штамм бактерий из 71 был определен до вида, осталь-
ные— ДО рода. Определить эти культуры до вида не удалось из-за значительных отклонений от характеристи ки видов данного рода. Авторы предполагают, что в усло виях очистного сооружения могли произойти изменения некоторых физиологических свойств бактерий, благодаря чему появились новые варианты вида.
'А. С. Лабинская и И. Р. Пономарева (1960) из уста новок для очистки стоков коксохимического завода вы делили Bad. chromoaromaticum, Ps. fluorescens capsula-ia, Ps. fluorescens liquefaciens, Bad. jophagum, Bad. cel-loseum, Bad. bibulum, Bad. alcalescens. Vibrio neocistes и четыре неидентифицированных бактерии. В активном иле аэротенка преобладали виды рода Pseudomonas, которые составляли около 55% всех бактерий и отлича лись высокой фенолразрушающей активностью. Поль ские исследователи (Petrycka, Kluczycki, 1962) изоли ровали из активного ила, очищающего фенольные стоки коксохимического завода, четыре культуры рода Pseudomonas и один микрококк. Эти культу ры в эксперименте за 2—10 дней разлагали 243 — 1490 мг/л фенола. При разрушении фенолов в натураль ных стоках процесс происходил медленнее. Из биопленки биофильтров были выделены (Zdybiewska, 1963) 144 культуры микроорганизмов, из которых 33 (22,9%) активно использовали фенолы как единственный источ ник углерода. Бактерии составляли в этой группе 75,9%, из них было больше всего представителей рода Bacte rium— 27,3%, затем шли Pseudomonas—15,3%, Micro-coccus— 12,3%, Bacillus — 9,1%. Из грибов активно раз рушали фенолы Oospora (18%) и Penicillium (6,1%).
Среди бактерий, изолированных из сточных вод неф теперерабатывающих предприятий (Иерусалимский и др., 1965) большая часть была представлена грамотри-цательными неспоровыми палочками и прежде всего штаммами Pseudomonas и Achromobader. Выделены так же микобактерии, характеризующиеся сравнительно вы сокой удельной скоростью роста на среде с фенолом. В то же время другие представители коринеформных бакте рий, а именно почвенные артробактеры практически не способны утилизировать фенолы. Из 130 полученных штаммов только четыре росли на среде с фенолом в каче стве единственного источника углерода (Stevenson, 1967). , В опытах японских исследователей (Sunaga Takashi, Arai Taketoshi, 1972) Ps. aeruginosa и Ps. fluorescens при температуре 25° С за 24 ч разлагали целый ряд фе-мольных соединений. Такой способностью обладали так же представители родов Enterobacter В и Klebsiella. Использовать фенол в качестве источника углерода мо гут штаммы широко распространенной в очистных сооружениях Zoogloea ramigera (Unz, Farrah, 1972)^J
Микроорганизмы, приспособившиеся к использованию фенолов, обнаружил в фенольных стоках Ключицкий (KJuczycki, 1959). Автор называет этот экологический комплекс «своеобразным биоценозом» и предлагает ис пользовать его при очистке сточных вод, загрязненных фенолами. Применение таких биоценозов вместо чистых культур обеспечивает полное разложение всех состав ных частей фенольных сточных вод и делает их очистку независимой от наличия хозяйственно-бытовых стоков. Метод дает возможность очищать сточные воды с содер жанием фенолов до 1000 мг/л в две ступени, а с 35— 200 мг/л— в одну ступень. Микроскопический контроль показал, что вначале в биоценозах преобладают дипло-бактерии и подвижные короткие палочки. На частично очищенных стоках развиваются дрожжи и плесени.
Значительный интерес представляет изучение поведе ния микробных ассоциаций, развивающихся в сточных водах от коксования угля (Jones, Carrington, 1972). Из лабораторной установки были выделены способные расти на феноле штаммы бактерии, один из которых был отне сен к Moraxella-Acinetobacter, второй — к Comamonas, третий — к Achromobacter. Для успешного разрушения фенолов смешанной культурой Comamonas и Achromo bacter оказалось важным исходное соотношение между концентрацией клеток каждой культуры. Это связано, по мнению авторов, с тем, что подавляющее действие фенола проявляется на разных стадиях метаболизма изу чаемых бактерий.
Некоторые авторы (Chambers et al., 1963) адаптиро вали к фенолу естественные микробные биоценозы поч вы. Адаптацию проводили на минеральной среде с ви тамином Bi2, содержащей фенол в качестве единственно го источника углерода. В результате последовательных пересевов исчезли все микроорганизмы, кроме бактерий. В полученной смешанной культуре преобладали виды
рода Pseudotnonas. Адаптированная смесь бактерий раз рушала 300 мг/л фенола за 24—48 ч на 99% и была спо собна окислять простые фенолы, бензол и их произ водные.
Показана также возможность адаптации к использо ванию фенола чистых культур бактерий (Pawlaczyk, 1965; Pawlaczyk-Szpilowa, 1965). Из 15 бактериальных культур, выделенных из речной воды, быстрее всего к фенолу адаптировался Ps. fluorescens ох. Добавление в среду глюкозы тормозило процесс использования фено ла. Путем многократного пассирования этой культуры в среде с фенолом в качестве единственного источника углерода был выделен вариант Ps. fluorescens \x, кото рый разрушал фенол в присутствии глюкозы. Как пола гает автор, этот «фенольный» штамм является мутан том, полученным в результате селекции. |" Активно окисляют фенолы дрожжи и мицелиальпые |грибы.'Мартине и Дрюс (Martins, Drews, 1966) опреде ляли влияние условий культивирования на расщепление дрожжами фенола. ^Авторы изучали следующие культу ры: Sacch. cerevisiae, раса НЕ, Cand. utilis, Rhodotorula glutinis. Наиболее активной была последняя культурна] Интенсивность распада фенола зависела от степени аэрации, рН среды, исходной концентрации вещества, количества внесенных дрожжевых клеток и концентрации в среде глюкозы. По мнению Н. Б. Градовой и сотруд ников (1966), перспективными являются исследования по подбору и селекции дрожжей, активно усваивающих фенол и жирные кислоты в стоках коксохимических за водов, с целью получения кормового белка.; Авторами продемонстрирована фенолразрушающая активность культур Candida (6 штаммов), Rhodotorula (\ штамм), Trichosporon (1 штамм), Oldium (6 штаммовК.При этом отмечены штаммовые отличия. В опытах Лоренца (Lo-renz, 1963) для выращивания дрожжеподобных грибов использовались необесфеноленные от коксования угля стоки, содержащие смесь жирных кислот, и было показа но, что в условиях непрерывного культивирования можно получать большое количество биомассы. При этом клет ки микроорганизмов были более крупными, чем при вы ращивании на мелассе. Дальнейшими опытами (Rieche et al., 1962) установлено, что Torulopsls utilis хорошо использует находящиеся в среде жирные кислоты ифенолы, в том числе полифенолы. Способность к дегра дации фенолов как интактными клетками, так и бескле точными препаратами обнаружена у Trichosporon cuta neum (Neujahr, Varga, 1970).
Миллс с сотрудниками (Mills et al., 1971) изолирова ли из сточных вод 98 штаммов дрожжей, принадлежа щих к шести родам, и испытали их способность исполь зовать в качестве источника углерода 15 производных фенола и бензойной кислоты. На среде с фенолом рос ли все восемь штаммов Cryptococcus terreus, один из трех выделенных штаммов Rhodotorula glutinis, 10 из 14 Trichosporon cutaneum. Лучше других использовались ре зорцин и флороглюцин. Представители родов Hansenu-la, Pichia и Saccharomyces на средах с ароматическими соединениями давали слабый рост или вовсе не росли. Авторы приходят к выводу, что аспорогенные дрожжи, по-видимому, являются нормальными обитателями за грязненных вод и участниками популяций, разлагающих специфические органические вещества. Не обнаружена связь между родовой принадлежностью дрожжей и хи мической структурой утилизируемых соединений.
Рао и Бхэт (Rao, Bhat, 1972) сообщают, что при дли тельной адаптации к фенолам активный ил селективно обогащается Candida tropicalis и Trichosporon cutaneum. В опытах авторов адаптированный активный ил с боль шой скоростью очищал сточные воды, содержащие фе нолы. Неадаптированный активный ил при добавлении этих микроорганизмов приобретал способность к их бы строму окислению. Для обеспечения высокой активности процесса необходимо добавлять в сточную жидкость мо чевину и КН2РО4 в качестве источников азота и фосфо ра. Авторы полагают, что С. tropicalis и Т. cutaneum мо гут быть использованы для очистки от фенолов промыш ленных сточных вод. На высокую активность окисления фенола С. tropicalis указывает также Ней Нисабуро (Nei Nisaburo, 1972), который показал, что лучшим ис точником азота для культуры С. tropicalis на среде с фе нолом является мочевина. При добавлении сахара отме чается репрессия фенолокисляющих ферментов. Автор считает, что наличие в среде источника азота увеличи вает силу индукции фенолом соответствующих фермен тов, хотя более вероятно, что добавление источника азо та обеспечивает потребность микробных клеток в этом
1ПЯ
элементе. Наибольшая скорость окисления фенола С. tropicalis отмечена в растворах, содержащих 300 мг вещества в 1 л.
По данным Фридриха (Friedrich, 1956), использован ный им Aspergillus niger вызывал разложение пирогал лола, резорцина и гидрохинона. Фенолразрушающими свойствами обладают также Penicillium и Oospora (Lan-da, 1959). Представители рода Oospora разлагают поли фенолы, в том числе пирокатехин. Как показал Палати (Palaty, 1958), Oospora при биологической очистке сто ков газогенераторных станций способна разрушать 132 мг/л фенола в сутки при исходной его концентрации 140 мг/л. В других опытах (Kustka, 1968) штаммы Oospora, изолированные из различных фенольных суб стратов и почвы, при рН 3,8—4,4 разлагали в течение суток 155—2000 мг/л фенола, 34—57 мг/л о-крезола, 47—64 мг/л л-крезола, 56—72 мг/л я-крезола, 185— 225 мг/л пирокатехина, 100—220 мг/л резорцина, 135— 150 мг/л гидрохинона, 114 мг/л пирогаллола, 135— 150 мг/л флороглюцина.
Цирус и Сладка (Cyrus, Sladka, 1970) выделили фи-ламентирующий организм Saprochaete saccharophila, ко торый одни исследователи относят к водорослям, дру гие — к грибам. Авторы отмечают, что этот организм, по-видимому, отличается специфичностью к углеродсо-держащим субстратам и обнаруживается именно в фе нольных промышленных стоках.
Биологическое разрушение фенола могут осуществ лять" также актиномицеты. Брингманн и соавторы (Bringmann et al., 1959, 1959а, 1960) использовали е этой целью Nocardia rubra. Организм оказался высоко устойчив к большим количествам фенола и переносил до 10 г/л этого соединения. Очистка в установке с по мощью указанной культуры происходила на 99,2%.
Стрептомицеты могут адаптироваться к концентра циям фенола, составляющим 200—1500 мг/л (Munjko, 1972). Максимальный рост отмечался при концентрации 200 мг/л. При высоких концентрациях вещества наблю дались изменения окраски воздушного и вегетативного мицелия стрептомицетов. Окраска восстанавливалась после пересева на среду Чапека.
Приведенные данные литературы свидетельствуют о том, что фенолы разлагаются различными группамимикроорганизмов, однако наиболее известны как де структоры фенолов бактерии. По всей вероятности, фе-нолразрушающие бактерии неспецнфичны по отношению к этому соединению как источнику углерода, что делает сомнительной необходимость выделения таких бактерий в отдельные виды. Бактерии в природных субстратах и производственных очистных сооружениях в первую оче редь используют легкодоступные углеродсодержащие вещества и лишь после их исчерпания начинают окислять фенолы. Довольно широкое распространение способно сти к деструкции фенолов среди различных таксонов можно объяснить тем, что микроорганизмы постоянно контактируют в природных условиях обитания с этими соединениями, обнаруживающимися в животных и расти тельных остатках. Наиболее активными деструкторами фенолов являются представители родов Pseudomonas, Achromobacter и Bacillus. ;
Высокая адаптационная способность бактерий была использована при разработке так называемого «микроб ного» метода обесфеноливания сточных вод, предложен ного впервые в Украинском научно-исследовательском институте общей и коммунальной гигиены Н. Т. Путили-ной (Путилина, 1952; Путилина и др., 1964). Метод осно ван на использовании комплекса изолированных из поч вы высокоактивных фенолразрушающих микроорганиз мов. Выделение культур проводили на жидкой солевой среде следующего состава: КН2РО4 — 0,5 г; К2НРО4 — 0,5 г; (NH4)2SO4 —0,5 г; MgSO4 — 0,5 г; FeSO4 — сле ды; водопроводная вода — 1000 мл. Единственным источ ником углерода в среде служил фенол в концентрации 0,1—0,3 г/л. Колбы со средой засевали почвой и инкуби ровали при температуре 25—30° до тех пор, пока кон центрация фенола не снижалась до 20—40 мг/л. После этого добавляли раствор фенола до первоначальной кон центрации, повторяли так несколько раз, а затем перено сили 10—20% содержимого в колбы с такой же сте рильной средой. По мере развития микроорганизмов сно ва делали пересев. Всего таким способом было получено более 100 активных комплексов, которые послужили источником выделения фенолразрушающих микробов.
Было изолировано более 1000 микробных культур, среди которых присутствовали грибы, актиномицеты и бактерии — споровые и бесспоровые, грамположительные
и грамотрицательные, палочковидные, нитевидные, кок ки. Из всех культур было отобрано 10 наиболее актив ных штаммов бактерий, которые в дальнейшем и адапти ровали к повышенным концентрациям фенола. После адаптации путем пересева на средах с возрастающим со держанием фенола бактерии стали разрушать 1000 мг/л этого соединения.
Девять выделенных культур были определены как Bact. cycloclastis, одна культура как Chromobacteriitm sauremali. Культуры сохранялись в жидкой среде с со держанием фенола 500—600 мг/л и пересевались раз в два месяца. Большой интерес представляет наблюдение автора за изменчивостью бактериальных штаммов в процессе пересевов на фенолсодержащих средах. Утра чивалась подвижность, способность окрашиваться по Граму, образовывать споры. Некоторые штаммы при обретали новые свойства — разжижали МПЖ, подщела чивали и пептонизировали молоко, выделяли пигменты.. Такая изменчивость микробных культур, вероятно, мо жет происходить и под влиянием других токсических компонентов сточных вод, что безусловно затрудняет работу микробиологов по идентификации выделенных штаммов микробов-деструкторов. Три штамма из 10 ока зались способны окислять также роданистые и циани стые соединения, после того как был разрушен фенол. Смесь 10 культур фенолразрушающих бактерий при ис пользовании в аэротенках была устойчива к неблаго приятным условиям среды — колебаниям температуры,, недостатку кислорода, повышенному содержанию смол, масел и других веществ, загрязняющих сточную воду.
Несмотря на то, что некоторые советские исследова тели (Клюнков и др., 1954; Жуков и др., 1957) ставили под сомнение возможность использования микробного метода Н. Т. Путилиной в практике, проведенная кол лективом сотрудником КНИИОКГ работа (Ган, Юров-ська, Теплицька, 1959; Путилина, 1959; Ненич и др.„ 1960; Юровская, 1961; Юровская и др., 1968) позволила ввести в действие установки для обесфеноливания сточ ных вод этим методом на коксохимических заводах и: газогенераторных станциях Донбасса, Урала и Сибири. Очистка фенольных сточных вод осуществляется в две ступени. В первой — комплексы адаптированных бакте рий окисляют фенол, цианистые и роданистые соединения.. Для этого аэротенки-смесители перед пуском в работу засеваются (обогащаются) «фенольными» бакте риями, исходное количество которых в 1 мл жидкости агротенка должно быть не меньше десятков — сотен мил лионов клеток. Бактерии предварительно выращивают вначале в лаборатории, а затем в специальном «питом нике». Аналогичным образом поступают с роданразру-шающими бактериями. Во второй ступени вода, прошед шая первую ступень, дополнительно очищается за счет окисления остаточных органических веществ обычной гетеротрофной микрофлорой.
Преимуществом метода является то, что он не нужда ется в хозяйственно-бытовых сточных водах и может быть использован на предприятиях, удаленных от чело веческого жилья. Более того, данный метод не допуска ет смешивания производственных сточных вод с хозяй ственно-бытовыми, поскольку это значительно ухудшает очистку.
В аэротенки, работающие на бактериальных комплек сах, можно без разбавления подавать фенольные сточ ные воды с намного более высоким содержанием фено ла, чем в случае использования активного ила, т. е. от 500 до 3000 мг/л. При использовании данного метода удаление фенолов достигает 99% и конечное их содер жание в 1 л воды не превышает 5 мг.
Микробный метод Н. Т. Путилиной иногда называ ют методом «чистых культур». Однако это название не является точным, так как согласно данному методу ре комендуется использование микробных ассоциаций, адап тированных к высоким концентрациям фенолов и спо собных интенсивно разлагать эти соединения.
Таким образом, полезную работу в установках, где очищаются фенольные стоки, осуществляют смешанные культуры бактерий. Нам представляется обоснованным использование в таких случаях управляемых ассоциа ций, в которых каждая культура играет определенную роль в развитии и процессах метаболизма других членов ассоциации, в свою очередь обеспечивающих ее нормаль ный рост. Применение таких высокоактивных микробных ассоциаций для очистки промышленных сточных вод, загрязненных специфическими высокотоксичными веще ствами, очевидно, весьма перспективно, особенно если учесть, что активные илы и биопленки неспособны пере-
рабатывать концентрированные стоки, и если принять во внимание чувствительность к внешним условиям организ мов, составляющих биоценозы этих илов и пленок. В ассо циациях может быть установлена роль каждой бактери альной культуры, что позволит управлять процессом очи стки путем создания наиболее благоприятных условий.
Много исследований посвящено изучению путей ми кробного разложения фенолов. Эванс (Evans, 1947) и Станиер (Stanier, 1950) экспериментально установили, что главным промежуточным продуктом при микробном окислении фенолов является пирокатехин.
Еще В. О. Таусон (1932) указывал на то, что предпо лагаемым путем разрыва бензольного ядра является его окисление до пирокатехина, который в свою очередь окисляется до муконовой кислоты, представляющей со бой уже соединение с открытой цепью.
На важную роль пирокатехина в окислении арома тических соединений микроорганизмами указывали Фэйст и Хиджмэн (Feist, Hegeman, 1969):
|В дальнейшем пирокатехин расщепляется по орто-пу-ти (Hayaishi, Hashimoto, 1950; Evans et al., 1951) или мета-пути (Dagley et al., 1960): ,
Мета-расщспленне пирокатехина ;
Как показали Фэйст и Хиджмэн (Feist, Hegeman, 1969), регуляция метаболизма пирокатехина осуществля ется его предшественниками. Если предшественником пирокатехина является фенол, имеет место мета-расщеп ление, если бензойная кислота — орто-расщепление.
Из анализа приведенной литературы видно, что основ ными деструкторами фенолов, как в естественных водое мах, так и в производственных очистных установках, яв ляются гетеротрофные бактерии, не обладающие специ фичностью к этим веществам как источнику углерода и энергии. Наиболее интенсивно разрушают фенолы пред ставители родов Pseudomonas, Achromobacter и Bacillus. Показана возможность значительного повышения де структивной активности бактерий путем их адаптации к этим соединениям. Особую роль при очистке воды от фенолов могут играть адаптированные бактериальные комплексы. Доказана возможность практического ис пользования таких комплексов для разрушения фенолов в промышленных сточных водах.
114
Глава V. РАЗРУШЕНИЕ ГАЛОИДОРГАНИЧЕС КИХ СОЕДИНЕНИЙ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Галоидпроизводные алифатических, алицикли-ческих и ароматических углеводородов нашли широкое применение в качестве самых разнообразных пестицидов (Мельников, 1968). Обладая повышенной стойкостью к различного рода воздействиям, они все больше на капливаются в почве и воде.
Одним из наиболее трудноразрушаемых синтетиче ских органических соединений является ДДТ [4,4'-ди-хлордифенилтрихлорметилметан, (С1СбН4)2СНС13]. На чиная с 1943 г. и до недавнего времени производство ДДТ и применение его в сельском хозяйстве и медицине значительно превышало использование всех других пе стицидов. Достаточно сказать, что США, например, вы рабатывали около 100 тыс. т ДДТ в год.
ДДТ и его аналоги встречаются сейчас повсемест но — от Южного до Северного полюса в самых разнооб разных почвах, снегах и ледниках, в поверхностных во доемах и родниках, ирригационных каналах, прудах и озерах, ручьях и реках, в эстуариях, морях и океанах. ДДТ имеет свойство аккумулироваться в тканях расте ний и животных. Опыты показывают, что концентрация ДДТ в рыбе в 90 000 раз может превышать концентра цию его в воде, в которой живет эта рыба (Kapoor et al., 1970). Стойкость ДДТ во внешней среде связывается с его резистентностью к воздействию микроорганизмов (Lichtenstein, 1957; Martin, 1966; Миносян, Паниян, 1969).
ДДТ и его аналоги обладают высокой токсичностью не только по отношению к высшим животным и расте ниям. ДДТ в ничтожных концентрациях существенно ин-гибирует фотосинтез различных водорослей (Wurster, 1968), тормозит рост и развитие некоторых грибов (Ri chardson, Miller, 1966) и бактерий (Collins, Langlois, 1968; Ко, Lockwood, 1968), угнетает биохимическую активность дрожжей (Timonin, 1946). Тем не менее основную работу по детоксикации ДДТ, его разрушению
в природе выполняют, по-видимому, именно микроорга низмы.
В 1964 г. Баркер и Моррисон (Barker, Morrison, 1964) сообщили о превращении ДДТ в ДДД (4,4'-дихлордифе-нилдихлорметилметан) в тканях .мыши. Более тщательно проведенные опыты тех же авторов показали, что истин ной причиной этой реакции была не ткань животного, а населяющий его кишечник Proteus vulgaris (Barker et al., 1965). Дальнейшие исследования подтвердили важную роль кишечной флоры в метаболизме ДДТ, скармливае мого крысам (Mendel, Walton, 1966). Как видно из табл. 4, выделенные из фекалий крыс Escherichia coll
и особенно Aerobacter aerogenes не только осуществляют восстановительное дехлорирование ДДТ до ДДД, но и разрушают его дальше до высокополярных, хорошо рас творимых в воде продуктов, которые не извлекаются из водной среды органическими растворителями, в частнос ти этиловым эфиром.
Кишечная флора рыб тоже разрушает ДДТ (Malone, 1970). И бактерии и грибы, населяющие кишечник се верного анчоуса (Engraulls mordax), трансформируют ДДТ в анаэробных условиях при 15° С до ДДД, ДДА и дальше — до водорастворимых продуктов. При подав лении бактериальной и грибной активности пеницилли ном, стрептомицином и микостатином ДДТ не претерпе вает изменений.
Разрушение ДДТ в почве также связано с деятельно стью микроорганизмов (Ко, Lockwood, 1968; Друй и др., 1971; Castro, Yoshida, 1971), причем оказывается, что в анаэробных условиях процесс детоксикации происходит
интенсивнее, чем в аэробных условиях и через ДДД, в то время как при аэрации ДДТ превращается в ддЕ — 4,4'-дихлордифенилдихлорэтилен (Друй и др., 1971) Однако выделить микроорганизмы, способные использовать ДДТ в качестве единственного источника углерода и энергии, не удается. По мнению Александера и сотрудников (Focht, Alexander, 1971), поиски таких микроорганизмов с помощью классического микробиоло гического метода элективных культур — это основная методологическая ошибка и непреодолимая трудность в решении проблемы деструкции пестицидов и других син тетических органических веществ. Оказывается, многие бактерии обладают способностью трансформировать органические соединения, но не использовать их при этом. Такое явление было названо Иенсеном (Jensen; 1963) «cometabolism». Кометаболизм сродни открытому Фостером процессу «соокисления», заключающемуся в том, что микроорганизмы, неспособные расти при нали чии в среде в качестве единственного источника углеро да определенных органических соединений, окисляют их, если они находятся вместе с каким-то другим питатель ным веществом.
Например, Pseudomonas methanlca не может расти на солевой среде с этаном, пропаном или н-бутаном, зато в присутствии метана он окисляет эти вещества до соот ветствующих кислот, альдегидов и кетонов (Leadbetter, Foster, 1959). Соокислительные микробиологические ре акции широко используются сейчас при трансформации различных органических соединений (Скрябин, Гоговле-ва, 1970). Кометаболизм и соокисление напоминают так же известное в микробиологии «брожение увлечением».
Фохт и Александер (Focht, Alexander, 1970) исполь зовали дифенилметан — нехлорированный аналог ДДТ — для получения накопительной культуры и выде лили из нее грамотрицательную подвижную автотроф-ную палочкообразную бактерию из рода Hydrogenomo-nas, способную расти в атмосфере Н2, СО2 и О2 и осуще ствлять по типу кометаболизма (табл. 5) некоторые реакции с ближайшими аналогами ДДТ — вероятными продуктами его биологического разрушения. Hydrogeno-monas sp. растет только на трех из десяти изучаемых соединений, а кометаболизирует восемь. Не осуществля ется трансформация 4,4'-дихлорбензофенона и ДДТ.
117
С помощью современных методов исследования авто ры показали, что выросшая на синтетической питатель ной среде с дифенилметаном в качестве источника угле рода культура Hydrogenomonas sp. в аэробных условиях превращает дифенилметан (I), ДДМ (II) и ДТЕ (III) соответственно в фенилуксусную (IV), л-хлорфенилук-сусную (V) и 2-фенил-3,3,3-трихлорпроп1юновую (VI) кислоты (Focht, Williams, 1970; Focht, Alexander, 1970,
пя
1971), что свидетельствует о разрыве одного из бензоль ных колец.
Предполагается, что метаболизм этих веществ (Focht, Alexander, 1971) происходит по следующей схеме:
где дифенилметан (R — бензил; X —Н); ДДМ (R — п-хлорбензил; X —С1); ДТЕ (R — ч1-фенил-2,2,2-трихлор-этил; X —Н).
Первые стадии процесса включают дигидроксилиро-вание одного из бензольных колец с последующим раз рывом кольца по метамеханизму (Dagley et al., I960; Gibson et al., 1968). Hydrogenomonas sp. не обладает ферментативными системами, способными катализиро вать реакцию дегалогенироваиня (отщепление хлора от органического соединения).
Ведемейер (Wedemeyer, 1967 а, Ь) обнаружил у Аего-bacter aerogenes ряд ферментативных реакций, дехлори рующих и окисляющих ДДТ (I) через ДДА (дихлорди-
фенилуксусную кислоту) (II), дихлордифенилметан (III) и дихлорбензгидрол (IV) до дихлорбензофенона (V)
где R — п-хлорфенил.
Плэпп и другие (Plapp et al., 1965) предполагают, что из ДДТ образуется n-хлорбензойная кислота, хотя точ ных доказательств этого не приводят. Однако основной путь метаболизма ДДТ микроорганизмами лежит, по-Ьидимому, через восстановительное дехлорирование до
ддд.
Так, при выращивании пекарских дрожжей Saccharo-myces cerevisie на богатой (9% сахарозы) питательной среде с добавлением ДДТ (8 мг в 1 мл ацетона на 1 л среды) последний превращается в ДДД после 50 ч вы ращивания на 54%, а спустя 187 ч — на 71%. При этом образуется еще около 20% неидентифицированного высо комолекулярного вещества. ДДЕ (днхлордифенилдихлор-этилен) не является промежуточным продуктом превра щения дрожжами ДДТ в ДДД (Kallman, Andrews, 1963).
Аналогичные результаты получены с культурами бак терий Escherlchia coli, Klebsiella pneumoniae и Aeroba-cter aerogenes, особенно в анаэробных условиях (We-demeyer, 1966). Опыты с бесклеточным препаратом из лучшей дехлорирующей культуры A. aerogenes показали, что цианид, нитрит, феррицианид, малонат и антими-Цин А угнетают образование ДДД. Ингибирование анти-мицином А частично снимается добавлением аскорбата и полностью — совместным присутствием аскорбата и ци-тохрома С. Применение одного цитохрома С неэффектив но. По-видимому, ответственной за реакцию восстанови тельного дехлорирования ДДТ до ДДД является восста новленная форма цитохромоксидазы.
френч и Хупингернер (French, Hoopingarner, 1970) на основании опытов с различными фракциями бескле точных препаратов из Е. coll пришли к выводу, что вос становительное дехлорирование ДДТ происходит в мем бране бактериальной клетки только при наличии ФАД-Н2. ДДТ не может воспользоваться электронами непосредственно из цитохромной системы, окисляющей продукты цикла Кребса.
Выделенные из почвы актиномицеты (Streptomyces albus, Str. aureofaciens, Str. cinnamoneus, Str. antibioti-cus, Str. viridochromogenes и Nocardla sp.) в фазе ак тивного роста на богатой питательной среде (5 г глюко зы, 5 г пептона, 1 г дрожжевого автолизата на 1 л воды) также превращают ДДТ в ДДД (Chacko et al., 1966). Такую же реакцию осуществляют почвенные микроорга низмы родов Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Tricho-derma, Micrococcus, Aerobacter (Johnson et al., 1967; Sethunathan et al., 1969; Patil et al., 1970).
Мацумура и сотрудники (Matsumura et al., 1971) были, по-видимому, первыми, кто изучал метаболизм ДДТ чистыми культурами микроорганизмов, выделенны ми из воды. Указанные авторы обследовали более 300 культур. Около 80% из них превращали ДДТ в ДДД, примерно 50%—в дихлордифенилметилметан [ДДЫБ, 1,1-бис-(я-хлорфенил)-этан] и только 25% — в ДДЕ. Обнаружение среди продуктов биологической ре акции дихлордифенилметилметана свидетельствует о том, что реакция восстановительного дехлорирования ДДТ не прекращается с образованием ДДД, а протекает дальше до полного отщепления всех связанных с метиль-ной группой атомов хлора и замещения их водородом: Таким образом, микроорганизмы способны осу ществлять все пять основных реакций, приводящих к детоксикации ДДТ в живых организмах, а именно: 1) восстановительное дехлорирование до дихлордифенил-дихлорэтана (ДДД); 2) дегидрохлорирование до дихлор-дифеннлдихлорэтилена (ДДЕ); 3) окисление до дихлор-дифенилтрихлорметилкарбинола (кельтана); 4) окисле ние до дихлордифенилуксусной кислоты (ДДА); 5) окисление до дихлорбензофенона.
Кроме того, микроорганизмы дехлорируют ДДД до дихлордифенилметилметана (ДДЫБ) и, судя по нахожде нию в среде ряда неидентифицированных продуктов, осу ществляют н другие реакции с ДДТ. Полная деструкция ДДТ, видимо, идет через гидроксилирование и разрыв бензольных колец промежуточных продуктов.
Разрушение других хлорорганических пестицидов в природе также тесно связано с деятельностью микроор ганизмов (Westlake, Gunther, 1966). Известно (Raghu, MacRae, 1966), что гексахлорбензол разрушается в не стерильной почве значительно быстрее, чем в сте рильной.
Стерилизация почвы паром, азидом натрия, нитра том серебра пли хлористой ртутью полностью подавляет деструкцию дихлорана — 2,6-дихлор-4-нитроанилина (Groves, Chough, 1970). В стерильной почве в отличие от нестерильной не наблюдается гидролиза 3,4-дихлор-пропионаннлида (Bartha, Pramer, 1967).
Чацко с сотрудниками (Chacko et al., 1966) выделил из почвы ряд грибов и актиномицетов, способных транс формировать пентахлорнитробензол (табл. 6).
Деструкция пестицидов происходит только при актив ном росте культур на богатой питательной среде (5 г глюкозы, 5 г пептона и 1 г дрожжевого экстракта в 1 л дестиллированной воды, содержащей 5—10 мг хлорор-ганического соединения) и полностью приостанавливает ся с прекращением роста микроорганизмов или при по пытке использовать пестицид в качестве единственного источника углерода. На основании УФ- и ИК-спектро-скопии, масс-спектрофотометрии, времени удерживания при ГЖХ, температуры плавления и смешанной пробы установлено, что пентахлорнитробензол превращается в пентахлоранилин. Аналогичную реакцию осуществляют некоторые фитопатогенные грибы.
Хорват и Александер (Horvath, Alexander, 1970) вы делили из почвы 20 культур бактерий девяти родов, спо собных трансформировать производные бензойной кис лоты (по типу кометаболизма). Одна из этих культур — Arthrobacter sp. кометаболирует л-хлорбензойную кисло ту до 4-хлоркатехола. Brevibacterium sp. превращает 2,3,6-трихлорбензойную кислоту (I) через 2,3,6-трихлор-4-оксибензойную кислоту (II) и 2,3,5-трихлорфенол (III) до 3,5-дихлоркатехола (IV) (Horvath, 1971):
Механизм микробной деструкции фторбензойной кис лоты детально исследован Харпером и Блэкли (Harper, Blakley, 1971). Методом накопительной культуры на сре де с n-фторфенилуксусной кислотой в качестве един ственного источника углерода авторы выделили из ила реки бактерию Pseudomonas sp., способную разрушать фторорганические соединения с минерализацией фтора. Современные методы исследования (ЯМР, ИКС, масс-спектроскопия, ТСХ и др.) позволили установить струк туру промежуточных продуктов метаболизма м-фторбен-зойной кислоты и предложить схему ее расщепления до продуктов цикла трикарбоновых кислот культурой Pseu domonas sp. (стр. 125).
В лаборатории Мацумуры (США) изучались микро биологические трансформации чрезвычайно стойких по-лихлорциклодненовых пестицидов — альдрина (1,2,3,4,10, 10-гексахлор-1,4-эндо-5,8-экзодиметилен- 1,4,4а,5,8,8а-гек-сагидронафталина), дильдрина (1,2,3,4,1 б, 10-гексахлор-1,4-эндо-"5,8-экзометилен-6,7-эпокси-1,4,4а,5,8,8а-гексагид-ронафталина) и эндрина (1,2,3,4,10,10-гексахлор-1,4-эндо-6,6-эндометилен-6,7- эпокси-1,4,4а,5,8,8а-гексагидро-нафталина). Были выделены и испытаны на превращение дильдрина 577 культур микроорганизмов, но только не сколько из них способны разрушать дильдрин: два штам ма Trichoderma viride, шесть различных видов рода Pseudomonas и два — Bacillus (Matsumura, Boush, 1967).
Чацко с сотрудниками (Chacko et al., 1966) сообщи ли о неспособности Trichoderma viride метаболизировать дильдрин (см. табл. 6). Однако это различие в наблюде ниях может быть результатом неодинаковых методов по иска, выделения и исследования микроорганизмов, а учитывая склонность этого вида к изменчивости, можно предположить, что исследователи работали со слегка отличающимися друг от друга вариантами 7У. viride (Matsumura, Boush, 1967, 1968). Pseudomonas sp., выде ленный из почвы на территории завода, производящегодильдрин, превращает дильдрин в ряд промежуточных продуктов. Благодаря применению современных методов исследования (тонкослойной и газожидкостной хромато графии, инфракрасной и масс-спектроскопии) удалось установить химическое строение некоторых из них (Mat-sumura et al., 1968):
Некоторые микроорганизмы, выделенные из почвы, воды, желудочно-кишечного тракта крыс и рубца жвач ных животных, способны трансформировать дильдрин в фотодильдрин (Matsumura et al., 1970):
Из 150 культур, выделенных с целью превращения эндрина, только 25 (в их числе — три из рода Pseudomo nas, по одной Micrococcus, Bacillus и дрожжи, осталь-
ные — неидентифицированные) проявили способность ме-таболизировать этот пестицид (Matsumura et al., 1971). Pseudomonas sp. № 103 разрушает эндрин до не скольких продуктов, среди них есть и кето-эндрин:
Мацумура и сотрудники изучали трансформирующую способность по отношению к эндрину, альдрину, ДДТ, гексахлорбензолу и Байгону (2-изопропоксифенил-Ы-ме-тилкарбамату) 20 культур микроорганизмов различных видов, выделенных из почвы и разрушающих дильдрин: Pseudomonas sp.— 9 культур, Bacillus sp.— 3, два пред ставителя Trichoderma viride, по одному Micrococcus и Arthrobacter и остальные четыре — неидентифицирован ные культуры (Patil et al., 1970). Интересно отметить, что все культуры, трансформирующие дильдрин, способ ны разрушать ДДТ и эндрин — эндо-эндоизомер диль-дрина. Альдрин превращали 13 культур (не изменяли 4 штамма Pseudomonas, два — Bacillus и один — Arthro bacter). Ни одна культура не смогла хоть как-нибудь изменить Байгон или гексахлорбензол (у-ГХБ). На осно вании своих опытов Мацумура и другие авторы склонны считать, что разрушение -у-ГХБ (Raghu, 1966; Yule et al., 1967) осуществляется специфическими ферментами, от личными от ферментов, трансформирующих дильдрин, эндрин и ДДТ.
Из приведенных авторами хроматограмм продуктов деструкции пестицидов видно, что все метаболиты, обра зовавшиеся в результате микробиологических превраще ний альдрина (Patil et al., 1970) и эндрина (Patil et al., 1970; Matsumura, et al., 1971), менее подвижны в орга нических фазах, т. е. более полярны, чем исходные про дукты. Один из семи обнаруженных метаболитов эндри на оказался кето-эндринон, а метаболитом альдрина — 6,7-диоксидигидроальдринон, что свидетельствует о ми кробиологическом гидроксилировании этих пестицидов.
Методика проведения опытов по разрушению пестици-
дов в лаборатории Мацумуры заключалась в следую щем. Поиск подходящих микроорганизмов осуществляли в почве, обработанной инсектицидами, в том числе на территории производящего их завода. Один грамм такой почвы вносили в 99 мл стерильной воды, взбалтывали 3 мин и делали несколько разведений (10~2—10~3), ко торые смешивали с агаризованной почвенной вытяжкой в стерильных чашках Петри. Инкубировали 4 дня при 30° С. Отдельные колонии пересевали дважды на та кую же среду для получения более чистого материала.
К 2—3-суточной культуре микроорганизма в 10 мл среды с дрожжевым экстрактом и маннитом добавляли раствор 10 6—10~5 М пестицида с радиоактивной меткой 14С в 10 мл ацетона или этанола и оставляли на 30 су ток при 30° С без перемешивания. Реакцию прекращали добавлением 0,1 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты и дважды экстрагировали хлороформом. После высуши вания сульфатом натрия хлороформ упаривали струей воздуха до остаточного объема 0,1 мл и 10 мкл этого раствора наносили на тонкослойно-хроматографическую .плитку с силикагелем.
Хроматограммы проявляли в системе, где подвижной фазой служили для ДДТ и продуктов его метаболизма н-гептан : этилацетат (15 : 1); ацетон : гексан (1 : 4); гек-сан : этанол : уксусная кислота (10:2:1) и циклогек-сан. Для остальных инсектицидов — «-гексан : этиловый эфир (1:9; 1:2; 1:1); ацетон : гексан (1:4); бензол: : этилацетат (3 : 1); циклогексанол : ацетон (3 : 1); хло ристый метилен : четыреххлористый углерод (1:1) и чи стый четыреххлористый углерод. После того как фронт растворителя проходил 15 см, хроматограммы оставляли на месяц с высокочувствительной к Х-лучам фотолентой. Затем пленку проявляли и те порции силикагеля, про тив которых на ней были пятна, снимали и определяли в них радиоактивность. Для изучения химической природы продуктов метаболизма использовали ЯМР, масс-спек-троскопию.
Таким образом, при изучении микробиологических превращений пестицидов Мацумура, Александер и дру гие не применяли их в качестве единственного источника углерода и энергии, а выращивали микроорганизмы на богатых питательных средах, куда вносили небольшое количество хлорорганических веществ, т. е. использовали
явление «кометаболизма». Однако чрезмерное обогаще ние среды питательными веществами иногда приводит к резкому торможению деструкции синтетических органи ческих соединений.
Так, в умеренной питательной среде (trypticase soy bean broth) культуры Bacillus cereus, Вас. coagulans, Вас. subtilis, Escherichia coli и Enterobacter aerogenes в аэробных и анаэробных условиях превращают ДДТ с образованием от двух до восьми метаболитов. Прибавле ние к этой среде 4,5%-ной лактозы или индивидуальных фракций а-, |3- или -у-казеина очень снижает скорость разрушения этого инсектицида, а при выращивании на молоке указанные культуры совершенно теряют способ ность к трансформации ДДТ (Langlois et a!., 1970). Ослабляется также ингибирующее действие хлорорга нических пестицидов (ДДТ, гептахлора, дильдрина) на рост некоторых бактерий (Pseudotnonas fluorescens, Staphylococcus aureus) в таких богатых питательными веществами средах (Langlois, Collins, 1970). При росте Bacillus sphaericus на богатой питательной среде с пеп тоном или солодовым экстрактом не происходит индуци рования ферментов, разрушающих галоидированные пе стициды— производные мочевины (Wallnofer, Bader, 1970).
Некоторые хлорорганические пестициды могут слу жить единственным источником углерода и энергии в конструктивном и энергетическом обмене микроорганиз мов. К ним относятся, например, хлорпроизводные фени-ламидов—пропапид (пропанил, Ы-/3,4-дихлорфенил/ пропиопамид), Дикрил (Ы-/3,4-дихлорфенил/метакрил-амид), Карсил (Ы-/3,4-дихлорфенил/-2-метилпентанамид) и пр.
Пропанил находит широкое применение в основном для борьбы с сорняками рисовых полей. Показано, что микроорганизмы почвы разрушают этот гербицид (Ваг-tha et al., 1967), затем из накопительной культуры, вы ращиваемой на минеральной среде с пропанилом в каче стве единственного источника органического углерода, был выделен гриб Fusarium solani (Martius) Sac-car d о, способный разрушать пропанил даже после пассажей на среде Чапека — Докса без гербицида (Lan-zilotta, Pramer, 1970). Из культуральной жидкости изо лирован в кристаллическом виде продукт метаболизма
9 4-2886 j2g
проманила, идентифицированный по температуре плавле ния, инфракрасной спектроскопии и ауторадиохромато-графии с 3,4-дихлоранилином. Таким образом, происхо дит микробиологический гидролиз пропанила до дихлор-аиилина (ДХА) и иропионовой кислоты. Последняя как раз и служит источником углерода, тогда как ДХА на капливается в среде. ДХА токсичен для Fus. solani, при концентрации 40 мг в 1 л он замедляет скорость роста, а 100 мг/л полностью ингибирует развитие гриба. По-ви димому, именно накопление 3,4-дихлоранилина в среде приводит к изменениям культуры, наблюдаемым под микроскопом,— вакуолизированию клеток и лизису ми целия. В конечном счете разрушение пропанила прекра щается. Гриб Fus. solani не может, по-видимому, дальше превращать ДХА, хотя известны реакции микробиологи ческого превращения хлоранилидов в азобензолы (Bart-ha, Pramer, 1967, 1970; Bartha et al., 1968), разрушения ароматических хлорпроизводных путем гидроксилирова-ния ароматического кольца и его разрыва (Byrde, Wood cock, 1957; Gaunt, Evans, 1961; McRae et al., 1963), мик робного дегалогенирования (Kaufman, Kearney, 1965).
Бесклеточные экстракты гриба Fus. solani, выросше го в отсутствие пропанила в среде, не проявляли пропа-нилгидролизующей активности. Индуцирование ацил-амидазы вызывают ацетанилид или пропанил, и макси мальная активность этого фермента достигается к 6—■ 7 ч роста Fus. solani на среде с указанными вещества ми. Для получения ферментного препарата (Lanzi-lotta, Pramer, 1970b) мицелий гриба дезинтегрировали, центрифугировали, из надосадочной жидкости осаждали фермент сульфатом аммония (28—42% вес. об.), центри фугировали и хранили при —20° без потери активности в течение двух месяцев. Оптимум действия — рН 7,5— 9,0, что соответствует оптимальной реакции среды для фермента, вырабатываемого Pseudomonas striata и гн-дролизующего фенилкарбамат, пропанил и его уксусно кислый гомолог (Kearney, 1965). Оптимальная темпе ратура— 38° С, инактивация фермента при 50° С насту пает в течение 10 мин.
Изучение субстратной специфичности ациламидазы показало, чго заметное влияние на скорость фермента тивной реакции оказывает природа заместителя в «-по ложении (табл. 7). Ланзилотта и Прамер отмечают пря-
мую связь ннгибирующего эффекта заместителя с его молекулярным весом (размером) и относят его за счет стерического фактора.
Значительно большую роль играет длина алифатиче ской цепи: анилиды муравьиной и масляной кислоты не могли служить субстратом. Скорость гидролиза ацета-нилида в 42 раза превышает скорость гидролиза пропио-нанилида, а 3,4-днхлорацетанилид гндролизуется в 17 раз быстрее, чем 3,4-дихлорпропионанилид (табл. 8).
Расщепление 3,4-дихлоранилидов а-метилвалерпано-вой кислоты (Карсил) и метакриловой кислоты (Ди-крил) не происходит вовсе, по-видимому, из-за высокой специфичности ацнламидазы Fus. solani к алифатической цепи определенной длины. Fus. solani и полученный из него ферментный препарат не способны гидролизо-вать гербициды — производные мочевины; N-фенил-М', N'-диметилмочевину (фенурон) и ее хлорпроизводное — >\-4-хлорфенил-Ы/, N'-диметилмочевину (монурои), а также фенилкарбаматный пестицид — изопропил-М-фе-нилкарбамат (ИФК).
На среде с Карсилом в качестве единственного источ ника углерода были выделены другие грибы — Penicil-Нит piscarium, Penicilliutn sp., дрожжеподобный орга низм Pullularia pullulans, способные гидролизовать этот ациланилидный гербицид до 3,4-дихлоранилина и а-метил-валериановой кислоты (Sharabi, Bordeleau, 1969).
Изучаемые культуры, как и Fus. solani, не обладают ни дегалогеназами, освобождающими ион хлора, ни эн-зиматическими системами, гидролизующими и разрываю щими ароматическое кольцо, ни ферментами, конденси рующими дихлоранилин в азосоединение, и 3,4-дихлор-■анилин накапливается в среде.
а-Метилвалериановая кислота подвергается дальней шей трансформации и, очевидно, именно при ее метабо лизме организм получает необходимую энергию и угле род для конструктивного обмена:
Грибная ациламидаза (КФ 3. 5. 1а — арилациламин амидогидролаза) из Penic. piscarium — индуктивный фермент с периодом индукции около 7—9 ч. В отличие от гидролазы из Fus. solani он проявляет активность по отношению к Дикрилу и Карсилу. Анализ приведенных
авторами (Sharabi, Bordeleau, 1969) данных по скорости гидролиза различных аналогов Карсила ациламидазой из P. piscarium (табл. 9) позволил сделать некоторые заключения о субстратной специфичности этого фер мента.
Природа и положение заместителя в фенильном коль це существенно влияют на процесс деацилирования. Мо-нохлораналоги (см. 14, 15 в табл. 9) гидролнзуются бы стрее Карсила (1), а 2,5-дихлор- и 2,4,5-трихлорпроизвод-ные (12, 13) не вступают в реакцию, по-видимому, из-за стерических помех, создаваемых орто-хлором. Замеще ние хлора метилом (ср. 1 и 16; 9 и 18) тормозит фермен тативную реакцию, а диметил-аналоги (17, 19) не под даются расщеплению. Активность лишенных хлора ами дов (22, 23) меньше активности соответствующих 3,4-дихлорпроизводных (9, 11). Замещение водорода при С-4 бромом (ср. 20 и 22) снижает скорость гидролиза.
С увеличением н-алифатической боковой цепи суб страта (ср. 23, 22 и 21; 11 и 9) активность фермента из P. piscarium возрастает, а не падает, как у ациламидазы Fusarium solani (Lanzilotta, Pramer, 1970b). Ветвление ацильной части молекулы, особенно вблизи разрываемой N — С-связи сильно тормозит гидролиз (ср. 2 и 1; 6 и 7). Замещение водорода при С-2 хлором (ср. 9 и 10) почти вдвое снижает активность, а замена группы СН3 гидроксилом (ср. 1 и 3) резко повышает способ ность к гидролизу. Диурон (24) и хлор — ИФК. (25) не расщепляются грибами.
Микробиологический гидролиз Карсила, Дикрила, пропанила и других пестицидов такого рода с освобожде нием 3,4-дихлоранилина может вызвать другую биохими ческую реакцию — конденсацию анилинов и образова ние 3,3',4,4'-азобензолов (Bartha, 1968). Привнесении анилина и его хлорпроизводных в почву оказалось (Bar tha et al., 1968), что все (2-, 3-, и 4-) моыохлоранилины и некоторые (2,3-; 2,4-; 3,4-; и 3,5-) дихлоранилины пре вращаются там в соответствующие дихлор- и тетрахлора-зобензолы. Интересно отметить, что аналогичную конден сацию осуществляет в присутствии Н2Ог чистая перокси-даза из хрена, что дает возможность предполагать участие в такой реакции и пероксидазы почвенных мик роорганизмов. Перекись водорода в отсутствие фермен та, а также стерильная почва не приводят к образованию азобензолов.
Описанная микробиологическая конденсация хлор-апилинов заслуживает внимания в связи с высокой рези-стентностыо образующихся продуктов к биохимическому разрушению и канцерогенностыо некоторых азосоеди-нений.
Не имеет ферментов, способных освобождать галоген в виде иона, культура Pseudomonas fluorescens и поэто му не может использовать фтор-, хлор-, бром- и нодбен-зоаты в качестве единственных источников углерода, хо-. тя и окисляет частично эти соединения (Hughes, 1964).
Nocardia eryihropolis расщепляет 2-фторбензойную и 2-фтор-4-нитробензойную кислоты, разрывая бензольное кольцо и образуя фторацетат. Последний конденсирует ся через фторацетат-коэнзим А со щавелевоуксусной кислотой до фторцитрата (Tranter, Cain, 1967). Однако N. erythropolis также не в состоянии отщепить фтор отгалоидорганических соединений, а фторацетат н фторци-трат сильно ингибмруют реакции цикла трикарбоновых кислот, что влечет за собой угнетение роста клеток. Культура попадает как бы в приготовленную самой себе «метаболическую ловушку», доводя превращение исход ного вещества до ядовитых конечных продуктов. Таким образом, отсутствие галогенотщепляющих ферментов у микроорганизмов в лучшем случае лишает их возмож ности развиваться на среде с галоидорганическими со единениями, а зачастую приводит к весьма нежелатель ным последствиям.
Многие микроорганизмы обладают способностью де-галогенировать органические соединения. В частности ряд бактерий — Pseudomonas dehalogenans n. sp., Arth-robacter sp. и Agrobacterium sp.— разрушает моно-, ди-и трихлорацетаты, моно- и дихлорпропионаты с выделе нием хлора в ионной форме (Jensen, I960). Дегалогена-зы этих бактерий неспецифичны по отношению к хлору, и клетки, адаптированные к монохлорацетату, без лаг-фазы трансформируют монобромацетат.
Интерес вызывает разрушение 2,4-дихлорфеноксиук-сусной кислоты (2,4-Д)—одного из наиболее распро страненных и широко используемых сейчас гербицидов. Детоксикация его в почве издавна приписывалась раз личным микроорганизмам — Bacterium globiforme, Fla-vobacterium aquatile, Corynebacterium sp., хотя они не растут на минеральных средах с этим пестицидом (Audus, 1950; Jensen, Peterson, 1952).
Эванс и Смит (Evans, Smith, 1954) выделили методом элективных культур два микроорганизма, представляю щие собой грамотрицательные мелкие подвижные палоч ки, которые растут в аэробных условиях на солевой пи тательной среде с очень высоким (до 1000 мг/л) содер жанием в ней 2,4-Д и я-хлорфеноксиуксусной кислоты, выделяя в культуральную жидкость хлор-ион. Авторы предполагают, что вначале происходит гидрокснлирова-ние ароматического кольца при С-б, затем разрыв его и только после этого дегалогенирование.
Обстоятельные исследования Александера с сотруд никами (Loos et al., 1967; Bollag et al., 1968; Tiedje, Alexander, 1969; Tiedje et al., 1969; Duxbury et al., 1970)* проведенные с культурой Arthrobacter sp., растущей на минеральной питательной среде с 2000 мг 2,4-Д в 1 л, и
с ферментными препаратами из нее, позволили ис следователям предложить достаточно обоснованную схе му метаболизма 2,4-Д и я-хлорфеноксиуксусной кислоты:
Для восстановления малеил- и хлормалеилуксусной кислоты необходимы НАДН или НАДФН. Расщепление кетоадипиновой кислоты с образованием янтарной кис лоты не нуждается в этих кофакторах и проходит с уча стием коэнзима А. Окончательное делалогенирование осуществляется на стадии превращения хлорянтарной кислоты в янтарную, что подтверждается наличием спе циального фермента, ответственного за указанную реак цию.
Работами Кастро с сотрудниками (Castro, Bartnicki, 1965; Bartnicki, Castro, 1969; Belser, Castro, 1971) пока зано, как происходит разрушение хлорорганических немато- и фунгицидов — цис- и транс-3-хлораллилового спиртов, а также 3-бромпропанола. Деструкцию этих соединений осуществляли выделенные из почвы
грамотрицательные бесцветные палочки с полярными жгутиками — бактерии рода Pseudotnonas.
С помощью меченого углерода (С14), газо-жидкост: ной хроматографии и ИК-спектроскопии установлено, что 3-хлораллиловые спирты под воздействием Pseudomo-nas sp. сначала превращаются в 3-хлоракриловые кисло ты, которые дегалогенизируются путем прямого гидрок-силирования до формилуксусной кислоты с последующим быстрым декарбоксилированием.
Разрушение 3-бромпропанола происходит по сле дующей схеме (Castro, Bartnicki, 1965):
Micrococcus denitrificans дегалогенирует трех-четы-рехатомные (5-хлорзамещенные органические кислоты (Bollag, Alexander, 1971). Лучше всего разрушается 3-хлорпропионовая кислота, причем в качестве промежу точного продукта образуется, видимо, акриловая, а не 3-оксипропионовая кислота, как в случае микробиологи ческого дегалогенирования 3-бромпропанола, т. е. про исходит не гидролитическая реакция, а дегидродегалоге-нирование.
Моно-, ди- и трихлоруксусная кислоты, 2-хлор-, 2,2-дихлор- и 2,2,3-трихлорпропионовая, 2-хлор- и 2,2-ди-хлормасляная кислоты не могут служить субстратом де-
галогеназы Micrococcus denitrificans. Фермент активен только в аэробных условиях, оптимальная реакция сре ды — рН 8,0.
Дихлорпропионовая, ди- и трихлоруксусная кислоты разрушаются бактериями рода Arthrobacter (Lode, 1967). Для роста бактерий необходимы метионин и вита мин Bi2; оптимальная температура — 25—28° С; рН 6,5—8,0. Аэрация стимулирует процесс разрушения хлор-органических кислот. Трихлоруксусная кислота разру шается в почве плохо, но если эту почву обсеменить Arthrobacter sp., скорость деструкции значительно возра стает.
Галоидорганические соединения вырабатываются хи мической промышленностью в очень больших количест вах. Хлорзамещенные алифатические углеводороды с ко роткой цепью — четыреххлористый углерод, хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан, моно-, ди-, трихлорук сусная кислоты и другие — используются как раствори тели и промежуточные продукты органического синтеза. Все они попадают в промышленные сточные воды. Раз личные галоидорганические соединения находят широкое применение в качестве пестицидов, вносятся в почву, вы мываются в водоемы, накапливаются в тканях растений п животных, причиняя существенный ущерб полезной флоре и фауне и даже угрожая здоровью человека. По этому изучение их деструкции, минерализации заслужи вает самого пристального внимания, поощрения и сти мулирования.
Анализ литературы показывает, что только по ис чезновению исходного галоидоргакического соединения из среды нельзя судить о его обезвреживании. Только отщепление галоида, освобождение его в виде неоргани ческого иона может считаться удачным решением вопро са. Реакцию дегалогенирования эффективнее всего осуществляют бактерии. Выделение таких бактерий, се лекция, изучение их физиологии и биохимии с целью определения оптимальных условий развития должно по служить основой к использованию наиболее активных жизнеспособных штаммов на сооружениях биологической очистки сточных вод, в перегруженных почвах и водое мах — везде, где в этом возникает необходимость. Глава Т1. ДЕСТРУКЦИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА
Органические нитросоеднненпя находят все бо лее широкое применение как сами по себе, так и в ка честве промежуточных продуктов органического синтеза. Они используются как взрывчатые вещества и окислите ли в реактивном топливе, как растворители для смол, кра сителей, каучуков, в качестве инсектицидов, гербицидов и фунгицидов, для получения аминов, являющихся ис ходными веществами в производстве разнообразных кра сителей, для синтеза кетонов, карбоновых кислот, аль дегидов, полимеров и т. д.
Удельное значение этих веществ в общем балансе за грязнителей окружающей человека среды очень велико, и, учитывая масштабность и важность очистки стоков от нитросоединений, польские исследователи (Kucharski, Sterninski, 1960) еще в 1960 г. предложили рассматри вать очистку вод от содержащих NO2-rpynny органиче ских соединений как самостоятельную, отдельную проблему, аналогичную очистке фенольных стоков. Пра вильность такого подхода подтверждается исследования ми токсичности и стойкости к деструкции в естественных условиях органических нитросоединений. Различные авторы на основании экспериментальных данных относят нитросоединения к наиболее устойчивым во внешней сре де (Роговская, 1951; Heukelekian, Rand, 1955; Анша, 1959; Malaney, 1960; Alexander, Lustigman, 1966; Bie-laszczyk et al., 1967). Крамер (Kramer, 1965) отмечает, что концентрация о-нитрохлорбензола практически не изменяется на протяжении 900 миль реки Миссисипи от Сент-Луиса до Нового Орлеана. Нитроанилины уже в концентрации 5—8 мг/л оказывают неблагоприятное влияние на процессы самоочищения водоемов, задержи вая нитрификацию и угнетая разложение других орга нических веществ (Stasiak, 1967). Более сильное тормо жение биохимических процессов самоочищения воды вы зывает тринитротолуол, допустимая концентрация кото-
рого в водоеме не должна превышать 1 мг/л, а в пода ваемых на очистку сточных водах — 10 мг/л (Роговская, 1951).
Резистентиость нитросоединений во внешней среде связывают с тем, что в природе органические нитросо-единення встречаются крайне редко. Действительно, известно несколько природных веществ, содержащих нитрогруппу: хлоромицетин (хлорамфеникол, левомице-тин), р-нитропропионовая кислота, производные 9-нитро-фенантрена и некоторые другие. Возникновение интереса к микробному разрушению нитросоединений в значитель ной мере было связано с тем, что в молекуле одного из первых, активных и достаточно хорошо изученных антибиотиков — хлоромицетина содержится нитрогруппа, которая предопределяет его физиологическую актив ность (Smith, Worrel, 1949, 1950b). Установлено, что бактерии восстанавливают нитрогруппу хлоромицетина и его бактериостатический эффект исчезает, что дает возможность микроорганизмам преодолевать действие антибиотика и возобновить нормальный рост и развитие:
Впоследствии оказалось (Smith, Worrel, 1953), что наличие ннтрогруппы является обязательным, но не до статочным условием антибактериальной активности; важную роль играет также алифатический остаток мо лекулы. Изучение поведения синтетических производных хлоромицетина показало, что все они с той или иной скоростью восстанавливаются с образованием соответ ствующих аминов. Наличие двух асимметрических угле родных атомов в молекуле хлоромицетина влечет за со бой возможность существования четырех оптически активных изомеров, образующих две рацемические сме си. Из этих четырех изомеров только d(—)трео-форма обладает бактериостатической активностью. Восстанов-
ление же нитрогруппы d(—)трео, /( + )трео-изомеров и dl трео-, dl эритро-рацемических смесей с помощью Bacterium coli мало чем отличается, что указывает на не значительное влияние конфигурации молекулы на этот процесс.
Существенные различия в скорости микробного вос становления нитрогруппы наблюдаются при количествен ном и качественном изменении состава галогенов в мо лекуле производных хлоромицетина (табл. 10). Стабиль-
ность производных повышается с увеличением атомного веса галогена-заместителя. Определенную роль играет и число атомов галогена, присоединенных к остатку уксусной кислоты молекулы. Модификация алифатиче ской цепи молекулы также сказывается на процессе восстановления (табл. 11).
Большой интерес к исследованиям по метаболизму органических нитросоединений вызвало все увеличиваю щееся производство этих веществ и интенсивное загряз нение ими окружающей человека среды. При изучении влияния нитросоединений на организм животных и окру жающую природу, выяснении их судьбы в почве и водое мах оказалось, что восстановление органически связан ной нитрогруппы—довольно распространенная биологи ческая реакция.
Нитроредуктазы встречаются в самых различных организмах — от млекопитающих до насекомых, не говоря
уже о микроорганизмах. При добавлении в пищу кроли ков ж-динитробензола последний подвергается различ ным превращениям, среди которых основное место зани мает восстановление нитрогруппы (Parke, 1961): Среди других продуктов метаболизма ж-динитробен-зола, количество которых не превышало 1%, был обнару жен также л-нитрофеннлгидроксиламнн, образующийся при неполном восстановлении одной нитрогруппы нитро бензола. Такого же типа продукт —динитрогидроксил-аминотолуол выводится из организма кролика при скарм ливании тринитротолуола (Channon et al., 1944).
Динитрофенол восстанавливается различными орга нами крысы — печенью, селезенкой, почками, мышцами, мозгом (Parker, 1952). Шаргель и сотрудники (Shargel et al., 1972) установили, что микросомы, выделенные из органов некоторых млекопитающих и насекомых, способ ны восстанавливать л-нптробензойную кислоту (I) до п-аминобензойной (II):
Следует отметить, что восстанавливающий нитрогруп-пу фермент нитроредуктаза постоянно присутствует в указанных микросомах, ее образование не нуждается в инициировании предварительной обработкой организмов ароматическими нитросоединениями, что позволяет авто рам высказать предположение о широком распростране нии такого рода ферментативных систем у различных видов животных.
Восстановление органических нитросоединений фер ментами организма животных ингибируется окисью угле рода, иногда ауреомицином, и стимулируется флавинами, в частности флавинмононуклеотидом (ФМН) (Parke, 1961; Shargel et al., 1972).
Активный ил после определенного периода адаптации может разрушать органические соединения окисленного азота (Роговская, 1951; Kucharski, Sterniriski, 1960; Malaney, 1960; Wuhrmann, 1964a; Janicke, 1968). Однако процесс разрушения этих соединений активным илом протекает довольно медленно. Кроме того, есть указания на затруднения, возникающие при дальнейшей перера ботке (сбраживании) активного ила, очищающего воду от нитросоединений (Kucharski, Sterninski, 1960). Это не находит объяснения в работе авторов и, возможно, связано с адсорбцией и переносом в метантенки нитро-
соедннений и продуктов их частичной деструкции хлоп ком ила. Некоторые исследователи (Bringmann, Kuhn, 1971) считают активный ил непригодным для очистки стоков от органических нитропроизводных. Авторы ука зывают на то, что процесс деструкции нитросоединений даже с помощью специализированных микроорганизмов неосуществим в присутствии нитратов. Весьма вероятно, что в работе Александера и Люстигмена (Alexander, Lustigmann, 1966) разложение ароматических нитросо единений происходило очень медленно (на 64-е сутки) из-за наличия в среде большого количества азотнокисло го аммония, который, с одной стороны, служил достаточ но хорошим источником азота, освобождая микроорга низмы от необходимости добывать себе азот из органи ческих нитросоединений, с другой стороны, мог существенно ингибировать нитроредуктазу (Egarni et al., 1951; Bringmann, Kuhn, 1971). Исключение из среды ни трата аммония, возможно, дало бы более обнадеживаю щие результаты. Ц. И. Роговская еще в 1951 г. отмечала, «что развитие бактерий идет более интенсивно в средах, где нитротолуол является источником азота», чем в сре дах, где это нитросоединение представлено как источник углерода. «Заметное развитие бактерий (Bacterium coli, Bacterium prodigiosum, Bacterium fluorescens) наблюда лось на чашках, где тринитротолуол давался как источ ник азота; на чашках, где тринитротолуол давался как источник углерода, развитие бактерий было значительно слабее» (Роговская, 1951).
Состав питательной среды имеет существенное зна чение при получении накопительных и выделении чистых культур микроорганизмов, способных разрушать нитро-соедипсния. Кэйн (Cain, 1958) применял среду, в кото рой органическое нитропромзводное было единственным источником углерода, азота и энергии: К2НРО4 — 0,4; КН2РО4 —0,1; MgSO4-7H2O —0,01; раствор микроэле ментов—10 мл/л, ароматические нитросоединеиия— 1 г/л.
В наших исследованиях (Гвоздяк и др., 1970; Удод и др., 1972) использовалась среда такого же типа. По следующие опыты, особенно по разрушению пикриновой кислоты, показали целесообразность применения более богатых сред с дрожжевым экстрактом.
Польские авторы (Bielaszczyk et al., 1967) предпочли минеральную среду с сахарозой в качестве источника углерода и сульфатом аммония как источником азота: КН2РО4 —1; СаСОз —0,1; (NH4)2 SO4— 1; сахароза — 1 и я-нитрохлорбензол— 0,1 или диннтрохлорбензол — 0,02 г/л. На такой среде очень хорошо росли Arthrobuc-ter simplex, Fusarium aquaeduduum, Trichoderma viride и Streptomyces coelicolor.
Нитрохлорароматические соединения могут утилизи роваться только при наличии в среде подходящих пита тельных веществ, пригодных для активного роста микро организмов (Madhosingh, 1961; Wuhrmann, 1964 a, b). Для выделения чистых культур микроорганизмов, разру шающих органические нитросоединения, используют, как правило, естественный или искусственный биоценоз, об рабатывают его раствором изучаемого вещества подхо дящей концентрации и из обогащенной таким образом культуры выделяют микроорганизмы высевом на твердые питательные среды, содержащие это же нитросоединение. Обработка смеси микроорганизмов (активного ила) нитро- и динитрофенолами приводит к селекционирова нию бактерий родов Achromobacter, Alcaligenes, Flavo-bacterium и некоторых групп Pseudomonas (Kader, 1967).
Ковалик с сотрудниками (Bielaszczyk et al., 1967) выделил из огородной и лесной почвы, а также из про мышленных сточных вод, содержащих нитрохлороргани-ческие соединения, ряд микроорганизмов, относящихся к различным классам — бактерии, грибы, актиномицеты: Arihrobacter simplex, Fusarium sp. (возможно, aquaedu-ctuum), Trichoderma viride, Streptomyces coelicolor. Bee эти культуры в той или иной мере разрушали я-нитро-хлорбензол и динитрохлорбензол. Особенно интенсивно этот процесс протекал при использовании смеси всех культур. При воздействии одной культуры Arthrobacter simplex снижение содержания нитросоединения в воде составляет 61—70% (через 12 дней), а смесь культур доводит разрушение нитросоединений до 89,5—91% в те чение 10 дней. С помощью хроматографии на бумаге в тонком слое и полярографического анализа установлено образование 7—8 промежуточных продуктов микробио логической деструкции я-нитрохлорбензола, в том числе я-хлоранилин и два различных нитрохлоранилина. В на шей лаборатории для выделения культур бактерий, раз-
рушающих я-нитроанилин, использовались адаптирован ные биопленка и активный ил лабораторных очистных сооружений (Гвоздяк и др., 1970; Удод и др., 1972).
Превращение синтетических органических нитросоеди-непий могут осуществлять различные микроорганизмы — прообразующие грибы, дрожжи, актиномицеты и осо бенно бактерии. Еще в первой четверти нашего века Нойберг, проводя широкие, систематические исследова ния химической активности дрожжей, обнаружил па-ряду с другими многочисленными реакциями, осуществ ляемыми этими организмами, способность дрожжей пре вращать ароматические и алифатические органические нитросоединения в соответствующие аминопроизводные (Neuberg, Welde, 1914 a, b; Neuberg, Reinfurth, 1923; Уоллен и др., 1962):
У грибов ннтроредуктазная активность по отношению к органическим соединениям проявляется у Fusarium oxysporum, который превращает 2,4-диннтрофенол (I) в 4-амино-2-нитрофенол (IV) через ряд промежуточных продуктов — 4-нитрозо-2-нитрофенол (II) и 4-гидроксил-амино-2-нитрофенол (III) (Madhosingh, 1961): Восстановление /z-нитробензолсульфонамида осуще ствляется ферментным препаратом из Aspergillus niger (Westerfield et al., 1957).
Восстанавливают органические нптросоединения и актпномгшеты, в частности рода Nocardia. Из почвы и сточных вод выделены культуры Nocardia eryihropolis, N. ораса, разрушающие п- и о-нитробензойную кислоту, но не действующие на ж-изомер (Cain, 1958; Cartwright, Cain, 1959). Кэйн (Cain, 1958) обращает внимание на роль рН среды в микробиологической деструкции этих соединений: в слабощелочной среде они разрушаются значительно лучше, чем в кислой, что связано, по-види мому, с большей диссоциацией молекул нитробензойных кислот при более высоких значениях рН (рК о- и п-нп-тробензойных кислот соответственно равны 4,23 и 5,62). Ферментативные нитроредуктазные системы, получен ные из других источников (ткани животных, бактерии, грибы), также наиболее активно восстанавливают аро матические нитросоединенпя в нейтральной или слабо щелочной среде (Smith, Worrel, 1949; Parker, 1952; Westerfield et al., 1957; Fouts, Brodie, 1957; Madhosingh, 1961).
Восстановление органической нитрогруппы с помощью Nocardia протекает через стадии образования соответ ствующих нитрозо- и гидроксиламинопроизводных (Cart-wright, Cain, 1959). Актиномицеты рода Nocardia и их изолированные ферментативные системы редуцируют также м- и л-динитробензолы до нитроанилинов (Villa-nueva, 1959, 1964). Однако лучше всего разложение ор ганических нитросоединений осуществляется, по-видимо му, бактериями.
Бактерии кишечного тракта кролика интенсивно вос станавливают n-нитробензойную кислоту, 2,3,4,5-тетра-хлорбензол, нитробензол, ^-нитрофенол, о-, м- и /г-нитро-бензойные кислоты до соответствующих аминов (Bray et al., 1953). Нитрофен (2,4-дихлор-4/-нитродифениловый эфир) быстро превращается в аминопроизводное в руб це дойных коров (Gutenmann, Lisk, 1967).
Нитрогруппа хлоромицетина восстанавливается отмы тыми клетками и бесклеточными ферментными пре паратами Streptococcus haemolyticus (Egami et al., 1951) и Escherichia coli (Smith, Worrel, 1950a, 1953). Кишечная палочка и экстракты из нее осуществляют
также восстановление других нитрососдиненпй (табл. 12) (Saz, Slie, 1954b; Saz, Marlines, 1956).
Почвенные бактерии активно разрушают различные гербициды п фунгициды, содержащие нптрогруппу. Так, под влиянием Lachnospira multiparus, Bacteroides rumi-nicola subsp. brevis и других неидентифицированных мик роорганизмов трифлоралин (2,6-динитро-4-трнфторметил-Ы.Ы-дипропнланилин) (I) в результате реакций гидроли за и восстановления превращается через ряд промежу точных продуктов (II, III) в 1,2,6-триамино-4-трифторме-тилбензол (IV), а затем и в более полярные соединения (Williams, 1967; Probst et al., 1967; Пробст, Тип 1971):
2,6-Дихлор-4-ннтроанилин и другие галогенпропзвод-ные нитробензола тоже разрушаются почвенными бак териями (Tentenberg, 1964; Groves, Chough, 1970). До статочно интенсивно восстанавливает нитросоединения в аэробных условиях Azotobacter agitis, выделенный из почвы методом накопительной культуры (Bringmann, Kiihn, 1971). Значительную активность по восстанови тельному разрушению органических нитросоединений проявляют бактерии родов Pseudomonas и Bacillus. Ps. fluorescens превращает нитробензойные кислоты в соответствующие аминопроизводные (Cartwright, Cain, 1959). Путь восстановления о-нитробензойной кислоты лежит через о-нитрозо- и гидроксиламинобензойную кис лоту (Yamashina et al., 1954). Восстановительная де струкция нитросоединений с помощью бактерий родов Pseudomonas и Bacillus была констатирована нами на примере га-нитроанилина (Гвоздяк и др., 1970; Удод и др., 1972; Гвоздяк и др., 1972; Гвоздяк, 1972). Из био пленки, расположенной на месте ввода исходного раст вора нитроанилина на предложенное нами (Гвоздяк, Удод, Ротмистров, 1972) сооружение по биологической очистке промышленных сточных вод, были выделены чистые культуры Pseudomonas и Bacillus, способные использовать п-нитроанилин в качестве единственного источника углерода и азота (табл. 13).
При изучении способности этих культур разрушать n-нитроанилин было отмечено, что не все они осуществ ляют деструкцию исследуемого вещества с одинаковой скоростью. В течение 24 ч 100 мг/л n-нитроанилина раз рушают полностью следующие культуры: Ps. desmolyti-сит, Ps. dacunche, Ps. fluorescens, Вас. aurantius. Осталь ные менее активны: в течение суток исходная концен трация уменьшается лишь на 70—75%. Увеличение концентрации га-нитроанилина до 500 мг/л задерживает его деструкцию до двух недель.
Смешанные культуры микроорганизмов способны разрушать га-нитроаннлин даже в пересыщенных раство рах (при содержании его в среде до 2 г/л) в течение 48 ч. Были испытаны следующие комплексы микроорга низмов: смесь всех выделенных микроорганизмов, ком плекс бактерий, относящихся к роду Pseudomonas, и комплекс микроорганизмов, относящихся к родуBacillus. Деструктивная активность была наиболее высо кой у комплекса, образованного всеми бактериями, за тем у Pseudomonas и, наконец, у Bacillus (табл. 14).
С помощью цветных реакций и хроматографичеекого анализа установлено, что биохимическое разрушение и-нитроанилина происходит с образованием в качестве одного из первоначальных промежуточных продуктов «-фепилендиамина, а затем гс-аминофенола:
Попытки интенсифицировать процесс микробной де струкции н-нитроанилина путем усиления аэрации или увеличения окислительно-восстановительного потенциала гН2 до 30 не улучшает очистки, а. наоборот, даже ухуд шает ее. При понижении гН2 до 5 процесс распада уско ряется (табл. 14).
Экспериментально установлено, что микроорганизмы, выделенные из биопленки очистного сооружения, способ ны без адаптации разрушать кроме нитроанили'на с та-
кой же скоростью и продукты его распада — я-фенилен-диамин, я-аминофенол в концентрации 100 мг/л.
Выделенные культуры оказались способными к истин ной денитрификации — восстановлению солей азотной кислоты. В то же время музейные шта'ммы бактерий-де-нитрификаторов, полученные из Института микробиоло гии и вирусологии АН УССР и других учреждений, превращали /?-нитроанилин в я-аминофенол (Гвоздяк и-др., 1970).
В нашей лаборатории проводятся исследования по-деструкции пикриновой кислоты (2,4,6-тринитрофенола) денитрифицирующими бактериями рода Pseudomonasr Ps. denitrificans, Ps. fluorescens, Ps. aeruginosa, Ps.. aurantiaca, Ps. stutzeri. Все изучаемые культуры хорош» растут на богатых питательных средах, например МПА, содержащих 0.15—0,5% пикриновой кислоты, но могут расти и на средах, где нитросоединение служит един ственным источником углерода и азота. Пикриновая кис лота (I) под влиянием денитрификаторов восстанавли вается до различных продуктов, один из которых на* основании хроматографичеекого и УФ-спектрофотометри-ческого анализа идентифицирован с 4,6-динитро-2-амнно-фенолом (II):
Кроме того, в среде обнаруживается еще по крайней мере два более полярных, пока не идентифицированных соединения.
Процесс восстановления пикриновой кислоты дени-трнфикаторами лучше всего протекает в анаэробных, условиях на сравнительно богатых питательных средах при значениях рН, близких к 6,0; добавление в среду НАД-Н2 стимулирует реакцию.
Механизм восстановления органических нитросоеди-нений в живых организмах изучен недостаточно. Эти-вещества сравнительно легко восстанавливаются как
химическими, так и органическими восстановителями. Джексон и Уотерс (Jackson, Waters, 1960) описали вос становление ароматических нитросоединений с помощью бензильных радикалов. При этом тринитробензол превра щается в динитрофенилгидроксиламин, л-динитробен-зол — в л<-нитрофенилгидроксиламин и .и-нитроанилин, а нитробензол — в анилин. Возможно, что и биологиче ское восстановление нитрогруппы осуществляется по ана логичному радикальному механизму с использованием флавинов. Нитроредуктазы, по-видимому, представляют собой флавопротеиды, которые можно заменить флавин-мононуклеотидом (ФМН), флавинадениндинуклеотидом (ФАД) и даже рибофлавином (Parke, 1961).
Уолкер с сотрудниками (Walker et al., 1971; Gingell, Walker, 1971) наблюдали неферментативное восстанов ление азокрасителей («красный» 2£-двунатриевая соль 2-фенилазо-8-ацетиламино-1-нафтол-3,6-дисульфо-кислоты) восстановленными флавинами и никотинамид-адениндинуклеотидфосфатом (НАДФ • Н2).
Предположение о неферментативном или неспецифи ческом восстановлении органических нитросоединеннй позволяет объяснить многие факты включения этих ве ществ в метаболизм разнообразных организмов и обна ружения способности различных тканей и органов осу ществлять эту реакцию без предварительной адаптации. Заслуживает внимания проведение аналогии между процессами восстановления органических нитросоедине ний и восстановления неорганических солей азотной и азотистой кислот — нитратов и нитритов.
Использование нитратов — очень важный метаболи ческий процесс, поскольку, во-первых, нитраты являются основным источником азота для высших растений и лег ко включаются в метаболизм микроорганизмов, во-вто рых, все животные усваивают азот только в виде его вос становленных органических соединений, образующихся в результате жизнедеятельности растений и автотрофных микроорганизмов, способных к ассимиляции нитратов и нитритов.
Восстановление нитратов может происходить с целью передачи на них избыточных электронов — это так на зываемое дыхательное восстановление и с целью превра щения восстановленного азота в органические соедине ния клетки — асиммиляцнонное восстановление. Есте-
ственно, что эти два типа биохимических реакций нахо дятся в тесной взаимосвязи, и аммиак, образовавшийся в процессе дыхательного восстановления нитратов, мо жет быть ассимилирован. Если же аммиака образуется больше, чем это необходимо клетке, то его избыток вы деляется в окружающую среду, что можно наблюдать, например, при выращивании кишечной палочки в ана эробных условиях на нитратах в качестве единственно го акцептора электронов. Общепринято, что нитраты вое-, станавливаются до аммиака по следующей схеме:
Природа промежуточного продукта между нитритом и гидроксиламином неизвестна. Предполагается, что это может быть закись азота (N2O), нитроксил (HNO) или' нитрамин (NO2-NH2). Несомненно только, что восстанов ление азота от его наиболее окисленного (N+5) до на именее окисленного (наиболее восстановленного) (N~3) состояния протекает через ряд промежуточных этапов с присоединением на каждом из них двух электронов:
Для осуществления этого процесса требуется четыре редуктазные системы. Их изучение сталкивается с рядом трудностей, связанных как с неизвестностью промежуточ ного продукта, содержащего N+1, так и с лабильностью и склонностью к неферментативному восстановлению практически всех возможных промежуточных соедине ний такими широко распространенными веществами био логического происхождения, как НАДФ, аскорбиновая кислота, цитохромы и др.
Наиболее изучены нитратредуктазы, катализирующие восстановление нитратов в нитриты. Известна нитратре-дуктаза, представляющая собой молибденсодержащнй флавопротеид, имеющий сульфгидрильные группы и ис пользующий в качестве донора водорода НАДФ-Hi. Схема процесса переноса электронов этой ферментатив ной системой следующая: При отделении от фермента ФА.Д или молибдена ка талитические свойства системы теряются и специфически восстанавливаются (реактивируются) при их добавле нии, что указывает на их важную роль в нитратредуктаз-ной системе.
Есть нитратредуктазьг, связанные с цнтохромами и осуществляющие дыхательное восстановление нитратов за счет переноса электронов от субстрата на нитрат. Этот процесс напоминает обычное окисление, только в результате реакции образуется нитрит, а не вода, как при использовании кислорода в качестве акцептора элек тронов. Такая типичная дыхательная нитратредуктаза была обнаружена у Bacterium coll (Itagaki et al., 1963). .Она катализирует перенос электронов согласно схеме:
Эта ферментативная система в анаэробных условиях действует как истинная дыхательная редуктаза, а в аэробных — как цитохромоксидаза. Свободный кислород репрессирует биосинтез индуцированной нитратредукта-зы у факультативных анаэробных бактерий (Providencia atcallfaciens, Edwardslella tarda, Aeromonas hydrophila и др.) и почти полностью ингибирует конститутивную нитратредуктазу, например у Mlcrococcus denitrificans, хотя и не влияет на уровень ее синтеза в клетке (Pichi-noty, 1970).
Нитритредуктаза из Achromobacter gutlatus-92\ акти вируется НАДФ-Н2 и ФАД и дезактивируется цианистым калием и хлористой ртутью, что указывает на возмож ную ее принадлежность к металлофлавопротеидам (Со ловьев, Прокошева, 1970). Микробная денитрификация используется даже при анаэробной биологической очист ке промышленных сточных вод (Schroeder, Bush, 1968; Mudrack, 1971).
Обширную литературу по вопросу усвоения неоргани ческих форм азота микроорганизмами можно найти в опубликованном недавно обзоре Пейнтера (Painter 1970).
Пейтмен с сотрудниками (Pateman et al., 1967) уста новил, что ннтратредуктаза Aspergillus nidulans способ-
на передавать электроны кроме нитрата еще целому ря ду акцепторов: цитохрому С, бензилвнологену, 2-(«-иодо-. фенил) -3- (я-нитрофенил) -5-феннлтетразолий хлориду. Восстановление органических нитрссоединений и рань ше рассматривалось как неспецифический процесс, вы зываемый различными дегидрогеназами кишечной па лочки и дрожжей (Granville, Stem, 1935; Westfall, 1943") и связанный с флавонротеинами (Bueding, Yolliffe, 1946). Из дрожжей был выделен ферментный препарат, восстанавливающий органическое питросоедннение — хе-мотерапевтическое средство фурацилии (нитрофуран)-2-нитро-2-фуральдегидсемикарбазон (Brodie, Gots, 1952). Авторы приводят следующую схему восстановления фурацилина:
На схеме, в принципе аналогичной приведенным вы ше для нитратов, АН2 представляет собой подходящий донор водорода, который в присутствии дегндрогеназы и НАД может восстанавливать кофермент. Восстановлен ный НАД затем снова окисляется флавопротеиновым ферментом, который в свою очередь восстанавливает цитохром С. При наличии в среде фурацилина происхо дит угнетение восстановления такого обыкновенного акцептора водорода, как кислород (а также метилеиово-го синего и 2,3,5-трифенилтетразолия), и этот флавопро-теин восстанавливает нитрофуран, стягивая на себя элек троны с их нормального метаболитного пути.
Опыты Кэйна с сотрудниками (Cartwright, Cain, 1959) по восстановлению нитробеизойной кислоты расту^ щими культурами, отмытыми клетками и бесклеточны ми экстрактами Nocardia sp. и Pseudomonas fluorescens, показали, что нитроредуктаза этих культур не является строго специфичной, нуждается в восстановленном НАД как доноре водорода и активируется ФАД и двухвалент ными металлами — Мп2+, Mg2+ и особенно Fe2+.
Подобные результаты получены при восстановле нии п-ннтробензолсульфонамида и 2,4-динитрофенола
препаратами из Aspergillus niger (Westerfield et al., 1957). О необходимости наличия в среде Мп2+ иНАД-Н2для образования ариламинов из хлоромицетина, «-нитробен зола и других нитросоединеннй при воздействии бескле точных экстрактов Е. coll сообщают Саз и Слай (Saz, Slie, 1954 a, b). Авторы приводят следующую предполо жительную схему восстановления н-нитробензоата и пу ти водорода для обеспечения этого процесса:
Нитроредуктаза, обнаруженная у выделенной из поч вы культуры Nocardia sp. и очищенная более чем в 200 раз, при восстановлении м- н и-динитробензолов до соответствующих моноаминов использует в качестве до нора водорода НАД-Иг и стимулируется флавиновымн нуклеотидами (ФМН, ФАД) (Villanueva, 1959, 1964). НАДФ-Нг, рибофлавин, ФМН, ФАД заметно стимули руют также восстановление азокрасителей до аминов бес клеточными экстрактами Streptococcus faecalis в анаэроб ных условиях (Scheline et al., 1970).
Из работы де ла Хаба (de la Haba, 1950), доклада Мак-Элроя (McElroy, Spenser, 1956) на симпозиуме но метаболизму неорганического азота и дискуссии в ходе этого симпозиума, а также других исследований следует, что процесс денитрификации in vivo сопровождается образованием органических соединений азота различной степени окисленности. Поскольку промежуточные про дукты восстановления нитратов (нитрит, закись азота, нитрокснл, нитрамид, гидроксиламин) нестабильны, ле тучи и ядовиты, то вполне правдоподобно, что они свя зываются в процессе метаболизма какими-то органиче скими структурами клеток и в таком связанном виде про-
ходят все восстановительные этапы обмена. Такое оче^ видное и на первый взгляд не очень существенное пред положение позволяет рассматривать превращения орга нических нитросоединений в тесной связи с процессов денитрификации и до некоторой степени объясняет обра зование у высших растений, грибов и бактерий, не нахо дившихся в контакте с синтетическими органическими нитросоединениями, ферментативных систем, способных метаболизировать эти вещества (Bush et al., 1951; Ra-istrick, Stossl, 1958).
Органические соединения частично восстановленного азота, нитрозо- и гидроксиламинопроизводные можно об наружить при метаболизме органических нитросоедине ний различными микроорганизмами и органами живот ных (Channon et al., 1944; Bueding, Jolliffe, 1946; Saz, Slie, 1954a, b; Saz, Martinez, 1956; Yamashina et al., 1954; Nason, 1956; Cartwright, Cain, 1959a, b; Parke, 1961).
Нашими исследованиями (Гвоздяк и др., 1970; Удод и др., 1972) показано, что разрушающие п-нитроанилин микроорганизмы родов Pseudomonas и Bacillus способны к реакции денитрификации и, наоборот, музейные дени трифицирующие бактерии рода Pseudomonas восстанав ливают нитрогруппы нитроанилина, а также пикриновой кислоты до аминогрупп.
Руководствуясь аналогичными соображениями о взаи мосвязи процессов восстановления неорганических щ органических соединений азота, немецкие авторы (Bring-mann, Kiihn, 1971) остановились в выборе микроорганиз мов, способных к разрушению нитропроизводных бензо ла, на культуре азотобактера, который, как известно, интенсивно восстанавливает молекулярный азот до-аммиака. Оказалось, что эта культура в аэробных усло виях достаточно хорошо восстанавливает и органические нитросоединения: 2,4,6-тринитротолуол, 2,4- и 2,6-динп-тротолуолы, 2- и 4-нитротолуолы, 1,3,5-тринитробензоЛг л-динитробензол и нитробензол в концентрациях 11-^ 145 мг/л. Наличие в среде (сточных водах) неорганиче ских ЫОз-ионов приводило к нарушению восстановления органических нитросоединений. Полученные данные близ ки к результатам Эгами (Egami et al., 1951) по ингиби-рованию ферментативного восстановления нитрогруп пы хлоромицетина нитритом и наоборот. Приведенные выше данные свидетельствуют о некоторой общностимеханизмов биохимического восстановления неорганиче ских и органических соединений окисленного азота.
Интересно отметить, что некоторые грибы и актино-мнцеты способны и к обратной реакции — окислению аминов до нитросоединений. Так, Fusariurn oxysporum образует 2,4-динитрофенол (II) из синтетического 2-ами-но-4-нитрофенола (Madhosingh, 1961):
На основании многолетних, тщательных, тонких ис следований Вестлейк с сотрудниками пришли к выводу, что на длинном пути биосинтеза хлоромицетина из ши-кимовой кислоты культура Streptomyces sp. 3022a толь ко в заключительной стадии окисляет аминогруппу и образует физиологически активное вещество:
Эта реакция, по мнению авторов, осуществляется специ фической ароматической фенилоксидазой, вероятно ассо циированной с мембраной. Окисление не обладающего антибактериальной активностью соединения с NHj-rpyn-пой происходит на выходе из клетки и поэтому хлоро-мицетин не обнаруживается в ней, но выделяется в куль-туральную жидкость (Siddiquellah et al, 1967; Westlake et al., 1968; Westlake, Vining, 1969).
Вполне возможно, что и другие природные органиче ские нитросоединения (р-нитропропионовая кислота, ни-
трофенантрен и др.) синтезируются из соответствующих аминов в результате аналогичных превращений. Микро биологическое окисление аминогруппы до нитрогруппы, по-видимому, не связано с деструкцией азотсодержащих органических веществ в клетке. Восстановительный путь разрушения органических нитросоединенпй — наиболее обоснованный, экспериментально доказанный, но отнюдь не единственный.
Ц. И. Роговская (1951) предположила, что процесс распада тринитротолуола начинается с отщепления ни трогруппы. Впоследствии из почвы были выделены бак терии, принадлежащие к родам Pseudomonas и Согупе-bacterium, использующие динитрофенол и динитро-о-кре-зол в качестве единственного источника азота и углерода и выделяющие в среду неорганический нитрит (Simpson, Evans, 1953; Jensen, Gundersen, 1955; Gundersen, Jensen, 1956). Освобождение нитрита осуществляется также из динитрокрезола, 2,4-динитрофенола и пикриновой кисло ты бактериями, относящимися, по-видимому, к роду Arthrobacter, и из «-нитрофенола, 2-метил-4-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, пикриновой кислоты и динитро-о-кре-зола бактериями, которые можно отнести к роду Agroba-cterium (Jensen, Lautrup-Larsen, 1967). Тентеберг (Ten-teberg, 1964) описал разрушение неидентифицированны-ми почвенными микроорганизмами 2,4-динитрофенола и 4,6-динитрокрезола с образованием нитрита, в то время как в среде со всеми тремя изомерами нитрофенола, 2,5- и 2,6-динитрофенолами, 4,6-динитро-2 -бутилфено-лом, 2,4-динптротиофенолом, а также хлорированными нитросоединениями (1,3,4-трихлор-2,6-динитробензолом и 1,3,5-трихлор-2,4,6-тринитробензолом) не удалось обнару жить нитрита в течение 30—40 дней проведения опытов. Деструкция органических нитросоединений путем прямо го гидролитического отщепления нитрогруппы известна также у актиномицетов и грибов.
В результате длительной (двухгодичной) селекции была получена культура Nocardia Ml, разлагающая лг-нитробензойную кислоту с выделением в среду нитри та (Cartwright, Cain, 1959). Отмытые клетки N. ораса и N. erythropolis разрушают о- и n-нитробензоаты, осво бождая азот в виде аммония. Появление следов нитри тов в растущих на среде с этими соединениями культу рах авторы относят за счет артефактов — окисления
первоначально образовавшегося аммиака. И восстанови тельный, и окислительный пути разрушения нитробен-зойных кислот актиномицетами рода Nocardia различа ются только в начальной стадии (Cartwright, Cain, 1959): из п- и и<-оксибензойных кислот (III и V) обра зуется протокатеховая кислота (VI), которая в результа те окислительного разрыва бензольного кольца превра щается в р-карбоксимуконовую (VII), а затем в р-оксо-адипиновую (VIII), янтарную (IX) кислоты и, наконец, в конечные продукты окисления:,
Нитрит и нитрат образуются из 3-нитропропионовой кислоты под влиянием экстрактов из гриба Aspergillus flavus, отличающегося своей способностью окислять аммиак (Molina, Alexander, 1971).
Таким образом, известно два пути микробного разру шения органических нитросоединений: 1) восстановление нитрогруппы до аминогруппы с последующим переами нированием или дезаминированием образовавшегося ве-
щества; 2) прямое гидролитическое (окислительное) отч щепление нитрогруппы с образованием нитритов (нитра тов). Первый путь не только значительно лучше изучен, чем второй, но, по-видимому, и более распространен в природе.
Синтетические органические соединения, содержащие более восстановленный азот, чем нитропроизводные, по лучили широкое распространение и применяются как в старых, традиционных химических производствах — кра сителей, фармацевтических препаратов, так и в новых отраслях промышленности — главным образом в синтезе гербицидов, синтетических смол, полимеров.
В качестве пестицидов используются самые разно образные азотсодержащие соединения: метил-, фенил- и тиокарбаматы, амиды, нитрилы, производные триазола, триазина, мочевины, дипиридила и др. Все пестициды, прежде чем найти практическое применение в сельском хозяйстве и в быту, исследуются на персистентность, спо собность разлагаться в почве, водоемах, не кумулирова-ться в растительных и животных тканях. Современное состояние вопроса о судьбе пестицидов, в том числе и содержащих восстановленный азот, в природе достаточ но полно освещено в коллективном труде под редак цией П. Керни и Д. Кауфмана «Разложение гербицидов» (1971) и монографии Л. П. Брагинского «Пестициды и жизнь водоемов» (1972). Из литературы видно, что та кие гербициды, как правило, теряют свою физиологиче скую активность значительно раньше, чем дело доходит до вовлечения в биохимические реакции атома азота. Поэтому трудно пока судить о путях превращения и ис пользования азота пестицидов микроорганизмами.
Отметим, однако, что разрушение пестицидов — про изводных мочевины, карбаматов, ациланилидов — проис ходит в почве под влиянием бактерий и грибов с образо ванием соответствующих аминов и аммиака (Керни, Кауфман, 1971). Получены ферментные препараты из Pseudomonas striata (Kearney, 1965), разрушающие фенилкарбаматы и ациланилиды, из Penicillium sp. (Sha-rabi, Bordeleau, 1969) и Fusarium solani (Lanzilotta, Pramer, 1970), активные по отношению к ациланилидам.
Немецкие исследователи (Wallnofer, 1969; Wallnofer, Bader, 1970; Engelhardt et al., 1971, 1972) изучали деструкцию фениламидов различными штаммамиспорообразующих бактерий Bacillus sphaericus. Было установлено, что выделенный из почвы дикий штамм Вас. sphaericus разлагает линурон и другие производные фенилмочевины до соответствующих аминов (Wallnofer, 1969). Эту же реакцию осуществляет ряд музейных культур — Вас. sphaericus ATCC 12123, штаммы 7054 и 7055. В то же время Вас. sphaericus ATCC 14577, 12300 и 10208 не проявляли никакой трансформирующей актив ности по отношению к исследуемым гербицидам (Wall* nofer, Bader, 1970). Из культуры Вас. sphaericus ATCC 12133, выращенной на среде с линуроиом, был получен бесклеточный экстракт, способный гидролизовать многие другие ациланилиды.
На основании экспериментальных данных, получен ных с применением хроматографии на бумаге, в тонком слое, ГЖХ и спектрофотометрии, предложена общая схе ма расщепления фениламидов культурой Вас. sphaericus:
где R, — Н или Cl; R2 — Н, С1, Вг, NO2; R3 — ацильный,
аминоацильный или алкиламинный радикал.
В случае, например, линурона реакция протекает сле дующим образом (Engelhardt et al., 1972):
В связи с тем, что Вас. sphaericus не обладает уре-азной активностью и ни один из исследуемых гербици дов — производных мочевины не разрушается уреазой из сои, авторы высказали предположение об участии в ре акции гидролиза этих веществ фермента, который благо даря своему наибольшему сродству к аминоациланили-дам может быть отнесен к группе ациламидаз (КФ 3.5.1). Фермент этот разрывает, по-видимому, N — С-связь между аминогруппой анилиновой части мо лекулы и карбонильной группой.
При выращивании Bacillus sphaericus на среде с ли-нуроном и известным ингибитором белкового синтеза хлоромицетином образования фермента не наблюдается. Хлоромицетин, однако, не влияет на биохимический гидролиз линурона бесклеточным экстрактом, получен ным из культуры, выращенной на среде с линуроном без антибиотика. Это подтверждает индуктивный характер биосинтеза фермента. Кроме линурона образование это го фермента вызывает также 2,5-диметил-фуран-З-кар-боксианилид.
Разрушение пестицидов с помощью микроорганизмов интенсивно исследуется во многих странах мира. Извест1-но, что пути деструкции азотсодержащих пестицидов лежат через образование аминов и аммиака.
Нельзя представить себе современную жизнь без син тетических полимеров. Эти не встречавшиеся ранее в природе органические соединения и изделия из них проч но вошли в наш быт, технику, строительство, сельское хозяйство. Производство пластмасс, волокон и других полимеров неуклонно возрастает. Эти соединения, как и прочие искусственные органические вещества, включа ются в метаболизм микроорганизмов.
Отношение к взаимодействию между микроорганиз мами и синтетическими полимерами может быть различ ным. С одной стороны, адаптация микроорганизмов к разрушению этих веществ рассматривается как крайне нежелательное, вредное явление, которое приводит к пор че изделий из синтетических полимеров, приносит гро мадный экономический ущерб. В связи с необходимо стью защиты различных материалов от воздействия микроорганизмов возникла новая область знания — «микробиологическая коррозия» (Благник, Заиова, 1965; Бобкова и др., 1971), созываются национальные,
региональные и интернациональные симпозиумы по это му вопросу, выпускаются специальные издания. С другой стороны, наблюдающееся в последнее время захламление окружающей среды использованной упаковкой, тарой, пришедшими в негодность предметами и материалами, изготовленными из синтетических полимеров, настолько угрожающе, что природа взывает к микроорганизмам о помощи в разрушении такого рода отходов. Проблема «синтетических полимерных свалок» в некоторых густо населенных, экономически развитых странах так велика, что изыскиваются методы обсеменения полимеров адап тированными к ним микроорганизмами в процессе про изводства соответствующих изделий. При попадании та кого изделия во влажную почву или другие подходящие условия микроорганизмы интенсивно размножаются и минерализуют полимер.
Проводимые в отделе биологической очистки промыш ленных стоков Института коллоидной химии и химии воды АН УССР исследования показывают, что широко распространенный полиамид капрон может служить единственным источником углерода, азота и энергии для спорообразующих бактерий группы Bacillus subtilis-me-sentericus. При этом разрушение капрона идет через об разование капролактама, затем аминокапроновой кисло ты и других более полярных аминов.
Основным сырьем для получения разнообразных полиамидов являются синтетические органические соеди нения азота, в частности лактамы. Промышленное про изводство лактамов и их переработка связаны с образо ванием большого количества сточных вод. Лактамы к тому же достаточно ядовиты, раньше в природе не встре чались, и распад их под действием микроорганизмов вы зывает определенный интерес.
Возможность биологической очистки промышленных сточных вод производства капролактама в аэрируемых сооружениях и метантенках доказана рядом авторов (Наумова, цит. по Наумовой, 1969в; Ковалева, 1970; Ко-лесов, 1971; Winter et al., 1971). Капролактам усваивает ся дрожжами, относящимися к родам Rhodotorula и Trichosporon (Шевцова, 1969). Предприняты попытки использовать отходы производства капролактама в ка честве питательной среды для выращивания дрожжей и
орошения почвы (Шевцова и др., 1969; Левина и др.,
1971).
Р. П. Наумова выделила из активного ила аэротен-ков в которых очищались сточные воды производства капролактама, сначала четыре (Наумова, 1966а), а за тем еще три штамма бактерий, которые использовали его как единственный источник азота, углерода и энер гии (Наумова, 19696). Культуры Pseudomonas dacunhae и Bacterium agile штаммы 1 и 2 росли на среде, содер-^ жащей до 5 г/л капролактама.
Характерная особенность разрушающих капролактам бактерий состоит в том, что они теряют способность ис пользовать капролактам в качестве питания после не скольких пассажей на богатых, мясопептонных средах. Если же в этих средах лактам присутствует постоянно, то деструктивная активность бактерий не ослабляется (Ка-to, Fukumura, 1962; Наумова, 19696). Японские исследо ватели (Уемура и др., 1966) нашли, что коллекционная культура Pseudomonas alcaligenes ATCC 12815 способ на усваивать d- и Z-пиролидонкарбоновые кислоты, но не использовала бутир- и капролактамы. Выделенный из почвы Micrococcus varians трансформировал любой лак там, образуя в качестве основного продукта соответст вующую аминокарбоновую кислоту.
Учитывая некоторые теоретические предпосылки о путях подбора микроорганизмов, способных разрушать те или иные синтетические органические соединения, бы ли взяты споровые бактерии как вероятные активные деструкторы капролактама и капрона. Группа бакте рий Вас. subtilis — Вас. mesentericus обладает мощными протеолитическими ферментами, расщепляющими связь между атомами углерода и азота амидной группы — СО — NH •— в молекуле белков. Амидная группировка играет также основную роль в построении синтетических полиамидов (капрона, найлона и др.). Аналогия в строе нии той части молекулы белка и синтетических амидов, которая подвергается ферментативной атаке в самом на чале их микробного разрушения, позволила надеяться на успех при использовании для деструкции искусствен ных соединений — капролактама и его полимеров — тех бактерий, которые осуществляют интенсивное разложе ние естественных полипептидов — белков. Действитель но, из сточных вод производства капрона выделены три
споровые культуры, ассимилирующие капролактам; одна из них — Bacillus sp., относящаяся к группе сенной — картофельной палочки, использует в качестве единствен ного источника углерода, азота и энергии капролактам в концентрации 15 г/л. Без предварительной адаптации растут на минеральных средах с капролактамом в до статочно высокой концентрации (3—5 г/л) все имеющие ся в нашем распоряжении музейные культуры Вас. sub-tilis-mesentericus, полученные из различных учреждений Советского Союза и ЧССР (табл. 15). Капролактам в
концентрации до 10 г/л совершенно не оказывает угне тающего действия на рост музейных и выделенных куль тур на универсальной питательной среде — МПА + СА
(1 : И-
Изучение метаболизма лактамов (Tosa, Chibata, 1965;
Наумова, 1966, 1969а, б, в; Уемура и др., 1966; Наумова, Белов, 1968) показало, что бактерии превращают их в соответствующие аминокарбоновые кислоты, например е-капролактам (I) в аминокапроновую кислоту (II):
Р. П. Наумова (1966) отмечала, что, хотя «е-амино-капроновая кислота, как и капролактам, далека от нормальных метаболитов клетки, тем не менее ее после дующее превращение идет по пути, свойственному при родным аминокислотам: она вступает в реакцию пере-аминирования с а-кетоглутаровой кислотой. В результате этой реакции имеет место образование глутаминовой кис лоты». По мнению Р. П. Наумовой (1969в), гидролиз капролактама до е-аминокапроновой кислоты осущест вляется под контролем фермента, содержащего, по-види мому, в своей молекуле металл, поскольку распад капро лактама избирательно тормозится ингибиторами о-фе-нантролином и 8-оксихинолином, образующими хелат-, ные комплексы с металлами.
Современная наука и практика нуждаются в даль нейшем более детальном исследовании микробной де струкции синтетических мономеров и полимеров. Все во зрастающее применение находят органические нитрилы, используемые в качестве растворителей, промежуточных продуктов синтеза бутадиеннитрильного каучука, диви-нил-нитрильных латексов, полиакрилонитрила и других важных технических продуктов. С увеличением их про изводства возрастает вероятность и опасность загрязне ния ими окружающей человека среды. Наибольшее рас пространение получает синтез на основе акрилонитрнла. Используются и другие органические цианиды (ацето-нитрил, пропионитрил и др.). Изучение деструкции али фатических и ароматических мононитрилов и динитрилов активным илом различного происхождения показало (Lulin, 1970), что наличие в молекуле цианидной группыв очень сильной степени тормозит биологическое разру шение органических соединений. Особенно большую ре-зистентность и токсичность проявляют ароматические ни трилы и динитрилы. Увеличение длины алифатической цепи мононитрилов уменьшает их сопротивляемость био логическому воздействию. Неадаптированный активный ил не в состоянии справиться с органическими цианида ми в концентрации 500 мг/л. К сожалению, мы не встре чали сведений о путях биохимической деструкции орга нических нитрилов.
Благодаря деятельности человека, связанной с искус ственным синтезом разнообразнейших азотсодержащих органических соединений, микроорганизмы получают новые, дополнительные, возможно, не всегда желанные, источники азота. В связи с этим появляются и новые пути использования этого необычного азотного питания.
Академик Н. Д. Иерусалимский (1949, 1963) деталь но проанализировал способы ассимиляции азота микро организмами. Он считал, что «потребление органических источников азота сводится к отщеплению от них аммиака и поглощению его клеткой. Таким образом, аммиак явля ется узловым пунктом, куда ведут все пути азотного пи тания» (Иерусалимский, 1963, стр. 109). Кроме этого «аминоавтотрофного» способа питания существует еще «аминогетеротрофный» способ, когда микроорганизм строит белки своей протоплазмы из готовых аминокислот без разложения их до аммиака. На основании этих соображений Н. Д. Иерусалимский привел простую и в то же время полную схему усвоения азота микроорга низмами:
Сейчас синтетические органические соединения азота попадают в природу в таких количествах, которые не только позволяют, но и заставляют расценивать их как определенный экологический фактор и как источник азота. Возникают дополнительные варианты азотного пи-
тания микроорганизмов — питание за счет синтетических органических азотсодержащих веществ. Органические нитросоединения могут либо восстанавливаться до ами-носоединений, либо расщепляться с образованием не органических форм окисленного азота. Через аминосо-единения происходит микробное разрушение полимеров и составляющих их мономеров. Вероятно, и другие азот содержащие органические синтетические вещества транс формируются микробами до аминов, хотя не исключен путь восстановительного расщепления некоторых из этих соединений с выделением аммиака.
Органические аминосоединения могут в результате реакции переаминирования передавать свою аминогруп пу карбоновым кислотам, в результате чего образуются аминокислоты. Прямое дезаминирование аминосоедине-ний приводит все к тому же «узловому пункту» — аммиа ку. Следовательно, приведенную выше схему можно до полнить новыми данными об азотном питании микробов и тогда она примет такой вид:
Приходится несколько расширить и предложенную Н. Д. Иерусалимским (1963, стр. 111) классификацию источников азота, которая представлена в табл. 16.
Вполне понятно, что и эта схема азотного питания ми кробов и классификация источников азота не оконча тельны и будут совершенствоваться и уточняться по мере накопления наших знаний о метаболизме азотсодержа щих соединений.
Взаимодействие микроорганизмов с органическими синтетическими веществами не одностороннее: подвер гающиеся деструкции соединения могут значительно ме нять различные свойства микробов. Известно, что неко торые азотсодержащие органические вещества — произ водные мочевины и другие — занимают почетное место среди химических мутагенов.
Вещества с явно выраженными мутагенными свойст вами синтезируются в небольших количествах, необхо димых для проведения научно-исследовательских работ, и пока не представляют реальной опасности с точки зрения загрязнения ими окружающей человека среды. В то же время нет оснований полагать, что органические вещества, ранее в природе не встречавшиеся, а в настоя щее время синтезируемые химической промышленностью и тем или иным путем попадающие в биосферу, не ока зывают генетического влияния на животные и раститель ные организмы. Более того, расширяющиеся в этом на правлении исследования, проводимые с целью предупре-
ждения распространения в природе такого рода веществ, обогащают нас данными о мутагенном действии многих «ценных» пестицидов, моющих средств и т. д.
К сожалению, в литературе мы практически не встре чали работ, посвященных именно изменчивости ми кроорганизмов под влиянием азотсодержащих синтети ческих веществ, обильно загрязняющих почву и водоемы. В то же время известны случаи, когда исследователи сталкиваются с трудностями в определении видового и даже родового положений микроорганизмов, выделен ных из почвы, обрабатываемой продолжительное время синтетическими органическими веществами. Йенсен и сотрудники (Jensen, Lautrup-Larsen, 1967) не исключают возможности образования мутантов у бактерий под влия нием ароматических нитросоединений и поэтому остере гаются отнести некоторые выделенные ими бактерии к вполне определенному виду.
Гербициды — производные мочевины и особенно афа-лон в концентрациях более 25 мг/л сильно влияют на рост и морфологию колоний культур стрептомицетов (Krgzel, Kosinkiewicz, 1972). При этом наблюдается из менение цвета колоний, образование воздушного, припод нятого над питательной средой мицелия, отсутствие ро ста в центральной части и измельчание колоний. Кроме того, резко колеблется образование антибиотиков. Су щественное значение при этом имеют состав питательной среды, тип и концентрация гербицидов. Исследования, проведенные в нашем институте, показали, что музейные культуры споровых бактерий Bacillus mesentericus fuscus F 1 й g g e изменяют некоторые свои культуральные и биохимические свойства под влиянием таких достаточно широко распространенных загрязнителей, как л-нитро-аиилин и капролактам. У Вас. mesentericus fuscus, по лученного из Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института микробиологии Академии наук Армянской ССР, в результате действия «-нитроанклина образуются R, S и ризоидные типы колоний, отличающиеся разме рами и пигментацией. Показано, что морфологические свойства R- и S-вариантов картофельной палочки закреп ляются наследственно. Клетки Вас. mesentericus, полу ченные в результате воздействия л-нитроанилина, в два-три раза короче исходных. Изменяются и некоторые био химические свойства, в частности S-вариант не образуеткислоты на среде Гисса с глюкозой и маннитом, растет на мясопептонном бульоне в виде мути, а не пленки; культура, образующая шероховатые колонии, приобре тает свойство расти на голодном агаре с 500 мг/л п-нн-троанилина в качестве единственного источника углеро да и азота. Музейные штаммы Вас. mesentericus fuscus, Вас. mesentericus Т г е v i s a n, Вас. subtilis 3108 меня ют свои морфолого-культуральные и биохимические свой ства под влиянием капролактама.
Нет сомнения, что этот важный и интересный раздел микробиологии — изменчивость микроорганизмов под влиянием новых синтетических веществ — получит в са мом недалеком будущем интенсивное развитие.
Глава VII. МИКРОБНОЕ РАЗРУШЕНИЕ СЕРУСОДЕРЖАШИТ СОЕДИНЕНИЙ
В особую группу загрязнителей окружающей человека среды следует выделить синтетические органи ческие соединения, содержащие в своей молекуле серу.
При сульфитной варке целлюлозы в значительных количествах образуются сульфированные органические соединения — лигносульфонаты. Серусодержащие орга нические вещества широко используются в синтезе лекар ственных препаратов, красителей, пестицидов, дезинфек-тантов, поверхностно-активных веществ (ПАВ) и др. Наибольший интерес представляет проблема биологиче ской деструкции синтетических ПАВ, которые находят самое разнообразное применение в промышленности, сельском хозяйстве, строительстве, в быту, медицине в основном благодаря прекрасным моющим свойствам. Производство ПАВ во всем мире быстро растет. Только в СССР выпуск моющих средств превысил 500 тыс. т в год, а к концу 9-й пятилетки достигнет 900 тыс. т в год.
Производство ПАВ характеризуется одной важной с точки зрения охраны природы особенностью: практиче ски все вырабатываемое промышленностью количеств© моющих средств (а не только то, что содержится в сточ ных водах этого производства) попадает в водоемы, поч ву, вообще биосферу. Путем органического синтеза по лучают многочисленные соединения с отличными поверх ностно-активными свойствами, однако далеко не все они находят практическое применение из-за резистентное™ во внешней среде. Способность разрушаться под воздей ствием активного ила и вообще водных микроорганиз мов предопределяет выпуск и широкое использование ПАВ. В СССР, ФРГ и других странах запрещено про изводство так называемых «жестких», биологически трудно разрушаемых детергентов.
Сравнительно легко разрушаются в природе и по этому наиболее распространены «мягкие» ПАВ — это в основном алкилсульфаты, алкил- и алкг.лбензолсульфо-«аты, особенно изготовляемые на основе нормальных парафинов. Строение их в общем виде можно предста вить соответственно следующими формулами: R — SO4Na, R — SO3Na, R(Ar)—SO3Na. Алкильная группа (R) представлена неразветвленной или разветвленной углеводородной цепью из 10—18 углеродных атомов.
Если бы к серусодержащим синтетическим веществам относились только детергенты, то и этого было бы впол не достаточно, чтобы усиленно изучать их микробиоло гический распад — настолько важную роль играют эти вещества в загрязнении окружающей среды.
Биологическому разложению детергентов уделяется огромное внимание. Все ПАВ, прежде чем найти практи ческое применение, исследуются на способность разру шаться на очистных сооружениях и в естественных усло виях. Необоснованное производство и применение ПАВ, сброс их со сточными водами может привести к непри ятным последствиям: замедлению процессов биологиче ского самоочищения водоемов, образованию пены, ухуд шению качества воды, предназначенной для потребле ния. Многие синтетические детергенты токсичны по отношению к бактериям, водорослям, рыбам и другим ги-дробионтам. В связи с этим очень много исследований посвящено вопросу разрушения ПАВ активным илом, биопленкой или естественным биоценозом водоемов. Та кой подход к проблеме определяется помимо практиче ских соображений еще и трудностями, связанными с по лучением серусодержащих ПАВ в чистом индивидуаль ном состоянии. Зачастую исследователям приходится работать с многокомпонентными смесями, содержащими до 100 и более веществ (Horvath, Koft, 1972), а это от нюдь не способствует выяснению путей метаболизма одного из веществ этой смеси. Предпринимаются попыт ки исследовать процесс микробиологической деструкции серусодержащих ПАВ. Для этого используются в опы тах доступные индивидуальные, более простые «модель ные» соединения — аналоги детергентов, такие как бен зол- или толуолсульфонаты (Farr, Cain, 1968; Cain, Farr, 1968; Ripin et al., 1971). Такой подход дает более точные и определенные результаты, которые, однако, вряд ли могут быть экстраполированы на соединения, содержа щие более длинные, даже не разветвленные алкильные заместители в бензольном кольце.
176
Основная роль в деструкции синтетических детерген тов в водоемах принадлежит бактериям. Водоросли прак тически не расщепляют алкилбензолсульфонатов (Davis, Gloyna, 1969). В природе широко распространены микро организмы, способные расти на средах с органическими производными серной кислоты. Андерсон (Anderson, 1966) выделил из различных источников (из пены и жид кости аэротенков и биофильтров, из свежей и содержа щей детергенты воды) целый ряд бактерий, утилизирую щих алкилбензолсульфонаты: Alcaligenes faecalis, A. me-talcaligenes, Aerobader aerogenes, Escherichia coli, E. freundii, Pseudomonas sp. и две культуры, относящие ся к семейству Achromobacteriaceae. В сточных водах об наружены бактерии родов Klebsiella, Achromobacter, Fla-vobacterium, Micrococcus, способные окислять синтетиче ские детергенты (Cook, 1968). Из обработанной доде-цилбензолсульфонатом почвы выделены бактерии рода Staphylococcus (Annicchiarico et al., 1971). Из почвы, сточных вод и активного ила Мак-Кннней и Саймоне (McKinney, Symons, 1959) выделили на твердой пита тельной среде, содержащей разветвленный алкилбензол-сульфонат, 10 штаммов бактерий рода Alcaligenes, по три рода Aerobacter и Paracolobactrum, по одному пред ставителю Flavobacterium, Bacillus и Escherichia coli и 15 штаммов рода Pseudomonas. Бактерии рода Pseu domonas чаще всего выделяются из естественной смеси культур, обрабатываемой серусодержащпми детергента ми. Среди них Ps. arvilla, Ps. cruciviae, Ps. dacunhae, Ps. effusa, Ps. fluorescens, Ps. membranoformis, Ps. pavo-nacea, Ps. putida, Ps. rathonis, Ps. teslosteroni, Ps. stria-ta (Cardini et al., 1966; Rogers, Kaplan, 1970; Ripin et al., 1971).
Чистые культуры таких широко распространенных бактерий, как Escherichia coli, Serratia marcescens, Pro teus vulgaris, Pseudomonas fluorescens, после некоторой предварительной адаптации проявляют способность ата ковать алкилсульфонаты (Huddleston, Allred, 1963; Cook, 1968). Некоторые ПАВ — эфиры серной кислоты — ис пользуются в качестве единственного источника углеро да бактериями Pseudomonas aeruginosa, Serratia marces-cens, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella enteritidis и Paracolobacterium aerogenoides (Riesen, 1955). Микробиологическое разрушение алкилбензолсульфо-натов обычно начинается с метального конца алифатиче ской цепи путем широко распространенных со- и р-окис-ления, отщепления двух углеродных атомов и прибли жения таким образом к ароматическому ядру. Механизм этой деструкции аналогичен, по-видимому, механизму разрушения алифатических углеводородов и жирных кис лот. Алкилбензолсульфонаты с прямой неразветвленной алкильной цепью разрушаются довольно быстро. По ме ре ветвления алкильной цепи скорость деструкции ПАВ падает, а соединения с четвертичным углеродным ато мом, особенно находящимся в конце цепи, уже относят ся к «жестким» детергентам (Сотникова, 1972).
Существенное значение для биологического разруше ния алкилбензолсульфоиатов имеет взаимное располо жение сульфонатной группы и алкильной цепи в бен зольном кольце: пара-соединения разрушаются быстрее, чем орто- и мета-производные. Место присоединения бен зольного кольца к алифатической цепи не оказывает осо бого влияния на биологическую деструкцию алкилбен-золсульфонатов.
Гидролиз С—S-связи наступает, по-видимому, после частичного или полного отщепления боковой алкильной цепи. Известно, что наличие БОзН-заместителя в бен зольном кольце заметно повышает устойчивость арома тических соединений к биологическому воздействию (Ale xander, Lustigman, 1966). Микробное расщепление не связанного с серой освободившегося бензольного коль ца происходит по достаточно хорошо изученному мета-или орто-механизму.
Хейман и Молоф (Heyman, Molof, 1968) исследовали бактериальное разрушение алкилбензолсульфонатов с неразветвленной углеводородной цепочкой, содержащей от 1 до 12 углеродных атомов: я-толуолсульфонат, «-этил-, л-пентил- и л-додецилбензолсульфонаты, смесь изомеров а-Сц-алкилбензолсульфонатов — я-(1-метилде-цил)-, п-(1-этилнонил)-, «-(1-пропнлоктил)-, «-(1-бутил-гептил)- и 'г-(1-пентилгексил)-бензолсульфонатов и изо меров а-С^-алкилбензолсульфонатов — л-(1-метилунде-цил)-, /г-(1-этилдецил)-, д-(1-пропилнонил)-, л-(1-бу-тилоктил)- и п-(1-пентилгексил)-бензолсульфонатов. В опытах использовалась культура Pseudomonas C12B, идентичная выделенной Пейном (Payne, Feisal, 1963).
На основании полученных данных авторы пришли г; выводу, что разрушение линейных алкилбензолсульфо натов включает целый ряд биохимических реакций: сй-окисленне, р-окисление, вторичное м-окисление, а-окис-ление или неполное р-окисление, декарбоксилнрование. Эти реакции приводят к образованию бензойной или фе-нилуксусной кислот, деструкция которых происходит уже с разрывом бензольного кольца.
Если предположить, что бактерии осуществляют по следовательный ряд со- и р-окислений с отщеплением двух углеродных атомов, то из а-Сц-производных, у которых n-сульфофенильный радикал (R) присоединен к 2-, 4-или 6-углеродному атому алкильной части молекулы (I), образуется л-сульфофенилмалоновая кислота (II), кото рая при декарбокснлировании превращается в п-сульфо-фенилуксусную (III):
Из 3- и 5-фенильных соединений (IV) образуется 3-(«-сульфофенил)-глутаровая кислота (V), которая при ex-окислении превращается в 4-окси-3-(п-сульфофенил)-масляную (VI), затем в л-сульфофенилянтарную (VII), декарбоксилирование последней приводит к 3-(«-сульфо-фенил)-пропионовой (VIII), которая может расщепиться до я-сульфобензойной кислоты (IX):
Таким образом, метаболизм линейных алкнлбензол-сульфонатов с нечетным количеством углеродных атомов в алкильной цепи происходит через образование л-суль-фофенилуксусной или бензойной кислот.
Все пять возможных изомеров а-С^-алкилбензолсуль-фонатов (X) разрушаются с образованием л-сульфофе-нилянтарной (VII) и л-сульфофенилпропионовой (VIII) кислоты, а затем л-сульфобензойной кислоты (IX):
Хорват с сотрудниками предпринял попытку более детально изучить метаболизм разветвленных алкплбен-золсульфонатов. Из накопительной культуры была выде лена и определена до рода бактерия Pseudotnonas sp. НК-1, способная использовать алкилбензолсульфонат в качестве источника серы (Benarde et al., 1965). Культура не развивалась в минеральной среде с глюкозой без источника серы (NH4C1 —1,0; Na2HPO4 —1,0; КС1 — 0,5; MgCl2— 0,1; глюкозы — 0,1 г в I л дистиллирован ной воды) и давала хороший рост на той же среде с ал-килбензолсульфонатом (0,1 %). Однако прямого отщепле ния сульфонатной части молекулы и образования нера створимого алкилбензола не наблюдалось.
Параллельные опыты по выращиванию Pseudomonas sp. НК-1 на средах с минеральным источником серы — (NH4)2SO3 и алкилбензолсульфонатом в различных кон центрациях показали, что в условиях, когда глюкоза яв ляется лимитирующим развитие культуры фактором, бактерии используют ПАВ в качестве дополнительного источника энергии, т. е. разрушают алкилбензолсульфо нат по типу кометаболизма (Horvath, Koft, 1972). В культуральной жидкости обнаруживаются изопропа-нол и триметилкарбинол, метилфенилкарбинол и фенил-этиленгликоль, а впоследствии миндальная кислота, бен-знловый спирт, бензойная кислота и пирокатехин.
Важную роль в процессе деструкции алкилбензол-сульфоната культурой Pseudomonas sp. НК-1 играет фе нол. С его образованием в среде алкилбензолсульфонат быстро исчезает. В связи с тем, что в отсутствие глюко зы исследуемая бактерия растет на среде с фенолом только при наличии алкилбензолсульфоната, авторы пред полагают следующий соокислительный механизм разру шения ПАВ культурой Pseudomonas sp. НК-1 в присут ствии фенола:
Но поскольку додецилбензол не обнаруживается в культуральной жидкости, остается предположить, что это расщепление должно наступать после некоторой ча стичной деструкции алкильной цепи молекулы додецнл-бензолсульфоната.
Другие авторы (Focht, Williams, 1970; Ripin et al.. 1971) не обнаружили фенола при разрушении л-толуол-сульфоната бактериями рода Pseudomonas. По мнению Хорвата (Horvath, Koft, 1972), это можно объяснить тем, что микробная деструкция органических соединений с использованием кометаболизма отличается от нормаль ного их метаболизма путем прямой атаки вещества, слу жащего единственным источником углерода и энергии.
Образование из алкилбензолсульфонатов в качестве промежуточных продуктов бензилового спирта, бензаль-дегнда и бензойной кислоты подтверждается методом одновременной адаптации по Станиеру (Stanier, 1947).
Pseudomonas sp. НК-1 способна расти на солевой пи тательной среде с пирокатехином, однако развитие куль туры на такой среде тормозится при добавлении к ней алкилбензолсульфоната. При определенном соотношении пирокатехина и ПАВ (2,0:0,25 ммоль) Pseudomonas sp. НК-1 не растет даже в присутствии глюкозы. По мне нию авторов, такая комбинация этих веществ приводит к созданию какой-то «токсической обстановки», и это, по-видимому, не позволяет достичь более чем 75— «U/o-ного разрушения алкилбензолсульфоната с помо щью бактерий.
Исследователи предложили следующую вероятную схему микробной деструкции додецилбензолсульфоната:
Приведенная схема в значительной мере правдопо добна и экспериментально обоснована, однако строго не доказана, до некоторой степени гипотетична, поскольку опыты проводились не с чистыми индивидуальными алкилбензолсульфонатами, а с их неопределенной и очень богатой смесью. Тем не менее это известный шаг вперед в изучении микробной деструкции сложных и важных синтетических соединений, в очень больших ко личествах поступающих в окружающую человека среду.
В связи с тем, что связанная с бензольным кольцом алкилбензолсульфоната сульфогруппа не вступает, по-видимому, в биохимические реакции до тех пор, пока не будет разрушена боковая алкильная цепь, открывается возможность проследить за судьбой серы в алкилбензол-сульфонатах на примере более простых соединений, та ких как п-толуолсульфонат и л-бензолсульфонат. Райпин с сотрудниками (Ripin et al., 1971) изучали разрушение бактериями этих «модельных» соединений. Из воды пру- ■ да был выделен микроорганизм, идентифицированный согласно классификации Станиера (Starrier et al., 1966) как Pseudomonas testosteroni H-8, способный расти на простой минеральной среде с арилсульфонатами (1 г в 1 л), используя их в качестве единственного источника углерода, серы и энергии. Ps. testosteroni H-8 утилизи рует бензолсульфонат, n-толуолсульфонат и этилбензол-сульфонат. Более высокие гомологи — пропил-, бутил-, гексил- и додецилбензолсульфонаты не поддерживают рост культуры. Не могут служить источниками углерода и другие родственные соединения — 2,5-диметил- и 2,4-диметилбензолсульфонаты, я-сульфобензоат, n-фенол- и катехолсульфонаты.
При выращивании Ps. testosteroni Н-8 на среде с бен-золсульфопатом небольшая часть серы ассимилируется клеткой (опыты проводились с радиоактивным изото пом), остальная выделяется в среду в виде сульфата, увеличивая кислотность до такой степени, что может ли митировать рост культуры. Для создания достаточно ем кого буфера минеральная среда должна содержать зна чительные количества одно- и двузамещеиных фосфорно кислых солей калия (3,0 и 7,0 г в 1 л соответственно). При росте культуры на других источниках углерода (глутамате, я-оксибензоате) такой высокой концентра ции фосфатов не требуется.
Окисление бензолсульфоната отмытой клеточной сус пензией заметно ингибируется цианидом калия, иодаце-татом, хлористой ртутью, мышьяковистым калием и ази дом натрия. Фтористый натрий, 2,4-динитрофенол, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), гидрокси-ламин и бисульфит натрия не оказывают существен ного угнетающего эффекта.
Культура Ps. testosteroni Н-8 обладает, по-видимому, активной сульфитоксидазой, и это позволяет ей при рас щеплении бензолсульфоната не накапливать в среде сульфита.
Кэйн и Фарр (Cain, Farr, 1968) выделили из очист ных сооружений и из речной воды, куда поступали сто ки промышленных предприятий, 12 культур бактерий рода Pseudomonas, в основном Ps. aeruginosa. Бактерии выращивали на среде без минерального источника серы (NH4C1 —1,0; К2НРО4—1,0; MgCl2 —0,1; раствор ми кроэлементов, в котором сульфаты заменены хлорида ми,— 10 мл; сульфонат— I г в 1 л деминерализованной воды). Все культуры гидролитически освобождали суль-фонатную группу бензол- и толуолсульфонатов в виде сульфита, который быстро превращался в сульфат. Ме-тильная группа толуолсульфоната не отщеплялась в на чале процесса. Дальнейшее разрушение включает ги-дроксилирование бензольного кольца и его разрыв но мета-механизму (9 культур) и орто-механизму (3 куль туры бактерий):
1 Если при выделении бактерий использовать среду с И-л-октацецилбензолсульфокатами, то изолируются куль туры также рода Pseudomonas, которые хорошо растут *на средах с алкилбензолсульфонатамн с длинной ал-кильной цепью (до 18 углеродных атомов), а также на бензол- и толуол-га-сульфонатах.
Расщепление (1 -феиилундецил) -бензол-я-сульфоната чистой культурой Bacillus sp., использующей алкилбен-золсульфонат как основной источник углерода и серы, происходит, по-видимому, в такой последовательности (Willets, Cain, 1970): I) отщепление сульфонатной груп пировки, вероятнее всего на поверхности клетки, с осво бождением сульфита и я-оксифенилалкановой кислоты; 2) ассимиляция сульфита, его внутриклеточное окисле ние до сульфата и восстановление до сульфида; 3) асси миляция я-оксифенилалкановой кислоты путем класси ческого р-окисления алкильной части цепочки и орто-рэсщепления ароматического ядра.
Специфическая активность десульфонирующего фер мента увеличивается в 100 раз при выращивании бак терий на (1-фенилундецил)-бензол-я-сульфонате по сравнению с клетками, выросшими на сукцинате. Наблю дается репрессия, но не ингибирование фермента суль фитом. Алкилбензолсульфонаты в небольших концентра циях разрушаются также бактериями Е. coli (Pollack^ Anderson, 1970) и дрожжами родов Hansenula, Candida (Standard, Ahearn, 1970).
Микробное разрушение органических эфиров серной кислоты — алкилсульфатов происходит довольно легко. Как показали опыты с бесклеточными экстрактами из неидентифицированной грамотрицательной бактерии* выделенной из сточных вод на синтетической ищ неральной среде с додецилсульфатом в качестве единт ственного источника углерода и серы, деструкция алкил сульфатов происходит путем прямого гидролитического расщепления эфирной связи с образованием сульфата и тоответствующего спирта (Yu-Chih Hsu, 1963). Фермент (или ферменты), ответственнный за эту реакцию, адаптивный и не образуется при выращивании бактерий в среде с цитратом как источником углерода. Бесклеточ ный экстракт гидролизует кроме додецилсульфата еще и децил- и тетрадецилсульфаты.
Микроорганизмы способны окислять серу, связанную в органическом соединении. Об этом можно судить из приведенных в обзоре Геррета (1971) данных о превра щении в почзе некоторых содержащих тиоэфирную связь пестицидов (темик, мезурол) в соответствующие суль-фоксиды и сульфоны.
Бензолсульфинат тоже быстро окисляется бактериями рода Pseudomonas, выросшими на среде с бензол- и то-луолсульфонатами, поглощая 0,5 моль кислорода на 1 моль субстрата (Cain, Farr, 1968).
Можно предполагать, что микроорганизмы способны восстанавливать связанный с органической частью мо лекулы атом серы. Известно, что при бактериальном раз рушении алкилбензолсульфонатов образуется сероводо род (Leclerc, Beaujean, 1952). Ауниньш и Тупурейне (1972) наблюдали существенное увеличение перманга-натной окисляемости лигносульфонатов в начальной фа зе их деструкции при самоочищении воды. Приведенный авторами график напоминает кривую зависимости, по лученную нами (Гвоздяк и др., 1972) при наблюдении с помощью реакции диазотированмя за микробным разру шением n-нитроанилина: в нашем случае увеличение ко личества диазотирующихся групп было обусловлено вос-■становлением нитросоединения до амина. Возможно, сульфогруппа лигносульфонатов тоже восстанавливает ся до сульфидной, которая затем в процессе химическо го анализа жидкости окисляется перманганатом, что при водит к соответствующему всплеску на кривой. К сожа лению, прямых доказательств этому нет.
Существует достаточно большое сходство в восста новлении неорганических нитратов и сульфатов (Бандур-ски, 1968). Можно было бы ожидать такой же аналогии и в разрушении органических форм окисленного азота и серы. Но сульфоорганические вещества разрушаются в природе, по-видимому, в основном путем прямого ги дролитического расщепления, а восстановительный путь деструкции органических сульфонатов микроорганизма ми — явление, значительно менее распространенное, чем восстановление нитросоединений.
Глава YIII. ТРАНСФОРМАЦИЯ МЕТАЛЛОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
К металлорганическим соединениям можно от нести соли органических кислот, комплексные соединения органических молекул с металлами и вещества, в кото рых металл непосредственно химически связан с угле родом. Скорость микробного разрушения солей органи ческих кислот и комплексных соединений определяется в основном строением органической части молекулы. Утилизация ее приводит к освобождению неорганических соединений (гидроокисей) металла (Alexander, 1971). Полная деструкция такого рода веществ сопровождает ся подщелачиванием среды, иногда настолько большим, что это даже препятствует дальнейшему течению микро биологической реакции.
В результате изучения деструкции галлата, цитрата, малоната и малата железа бактериями рода Pseudomo nas, Moraxella и некоторыми другими, выделенными из сооружений по водоподготовке, Мак-Рей с сотрудниками (McRae et al., 1973) показали, что освобождающееся в результате микробного разложения этих солей железо может взаимодействовать с бактериальной клеткой, на капливаться на ее поверхности или проникать внутрь. Это приводит к биомиграции металлов и может быть причиной загрязнения водоемов и водопроводной воды.
Особую опасность для окружающей среды представ ляют органические производные тяжелых металлов, в первую очередь ртути, олова, меди и некоторых других. Многие из них обладают высокой физиологической активностью и находят применение в качестве бактери цидных и фунгицидных средств, в частности для пред отвращения разложения древесины, в борьбе с образо ванием слизи на предприятиях, где используется большое количество воды, например, в производстве бумаги (Мельников, 1968; Lesperance, 1971). Естественно, такие соединения угнетают процессы биологической очистки во ды как в очистных сооружениях, так и в водоемах. Однако в природе находятся микроорганизмы, спо собные осуществлять различные реакции с тяжелыми ме таллами и их органическими производными. Еще в 1955 г. Рассел (Russel, 1955) показал, что при исполь зовании фенилмеркурацетата в качестве фунгицида для защиты древесины от базидиомицетов на дереве сна чала развивается Penicillium roqueforti T h о m, который не только выдерживает значительно более высокие кон центрации антисептика, чем другие грибы, по инактиви-рует фенилмеркурацетат, адсорбируя и разрушая его. После такой грибной детоксикации дерево становится доступным вторичной инфекции грибом Stereum sangui-nolentum, вызывающим типичную красную гниль дре весины.
Показано (Stutzenberger, Bennett, 1965), что Staphy-lococcus aureus более резистентен к ртутьорганическим соединениям в присутствии Escherichia coli, которая про дуцирует экстрацеллюларно глутатион и сероводород. Повышенную устойчивость адаптированных дрожжей к иону ртути также объясняют их способностью продуци ровать больше сероводорода по сравнению с неадаптиро ванными (Zambonelli, 1958). Из почвы методом накопи-' тельной культуры на среде, содержащей глюкозу, мине ральные соли, витамины и фенилмеркурацетат, выделена образующая H2S культура Pseudomonas К 62, которая способна переносить в тысячу раз более высокую кон центрацию соединений ртути, чем Escherichia coli или Pseudomonas aeruginosa (Tonomura et al., 1968b). Ра диоактивный анализ распределения меченой ртути в раз личных частях клеток Pseudomonas К 62 показал, что ртуть локализуется в основном на их поверхности. Куль тивирование этой бактерии при аэрации в среде с фенил-м€ркурацетатом, этилмеркурфосфатом и метилмеркур-хлоридом приводит к выделению ртути и соответственно бензола, этана и метана (Tonomura et al., 1972; Furuka wa et al., 1969). Из выросшей на среде с глюкозой, ми неральными солями, витаминами и фенилмеркурацета-том культуры был получен бесклеточный экстракт, спо собный в присутствии глюкозы (0.01М), НАД (0.06М) и тиогликолята (1мМ) разрывать C-Hg-связь в фенилмер-курацетате и этилмеркурфосфате. Установлено, что эта реакция связана с дегидрогеназой глюкозы (p-D-глюко-за: НАД(Ф) оксидоредуктазон, КФ 1.1.1.47), которая
1ЯЯ
катализирует образование НАД-Н2 или НАДФН2 из НАД. Наглядно показано, что наличие в реакционной сре де только лишь НАД-Н2 и тиогликолята не обеспечивает разрушения ртутьорганических соединений, в то время как прибавление к бесклеточному экстракту НАД-Иг вместо глюкозы и НАД приводит к положительному ре зультату (Tonomura, Kanzaki, 1969). В дальнейшем из Pseudomonas К 62 был выделен и очищен (осаждением сульфатом аммония и хроматографированием на колон ках с сефадексом G-150 и ДЭАЭ-сефадексом) фермент ный препарат, катализирующий в присутствии НАДФ-Нг, цитохрома С и тиогликолята все те реакции восстано вительного разложения ртутьорганических соеди нений, что и развивающийся микроорганизм. Фермент представляет собой флавопротеид и содержит ФАД в качестве простетической группы (Furukawa, Tonomura, 1972а). Синтез фермента клетками Pseudomonas К 62 индуцируется фенилмеркурацетатом, этилмеркуртиоса-лицилатом натрия, металлической ртутью и ее солями, но не HgS или двухвалентными нонами других тяжелых металлов — меди, железа, кадмия, кобальта, олова, цин ка, свинца. Ацетат кадмия и сернокислая медь даже подавляют индукцию фермента, вызванную соединения ми ртути (Furukawa, Tonomura, 1972b).
Спэнглер с сотрудниками (Spangler et al., 1973) без труда выделили из чешуи рыбы и ила озера, загрязняе мого ртутьорганическимн веществами, чистые культуры микроорганизмов (принадлежащих в основном к роду Pseudomonas), которые без специальной адаптации раз рушали бромметилртуть как в аэробных, так и в ана эробных условиях. В результате этой реакции в обоих случаях образуется металлическая ртуть и метан.
Таким образом, ртутьорганические соединения разру шаются в очистных сооружениях и в природе с освобо ждением ртути в виде Hg2+. Неорганическая ртуть — один из самых токсичных тяжелых металлов. Кроме то го, в последнее время показано, что некоторые микроор ганизмы способны метилировать ртуть, превращая ее в еще более токсичное ртутьорганическое соединение. Органические производные ртути кумулируются по тро фической цепи, и многие японцы, употреблявшие рыбу, вы ловленную в Миноматском заливе, подверглись серьез ному заболеванию, которое было вызвано загрязнениемзалива сточными водами, содержащими ртутьорга-нические соединения. Сейчас в Японии и некоторых дру гих странах запрещено использование органических со единений ртути. Неорганическая же ртуть достаточно широко применяется в химической промышленности — при производстве хлора и щелочей, взрывчатых веществ и пластмасс, в электронной и нефтехимической промыш ленности, и ее попадание в водоемы хотя и строго лимитируется, но не исключается. Было отмечено, что пресноводные рыбы, особенно щука (Esox lucius), неко торых районов Швеции, Северной Америки содержали значительное количество метил- и диметилртути. Оказа лось, что эти ртутьорганические соединения образуются из металлической ртути под влиянием микрофлоры, оби тающей в иле на дне водоемов и в организме рыб (Jensen, Jernelov, 1969).
Тономура и сотрудники (Tonomura et al., 1972; Yama-da, Tonomura, 1972b) выделили из почвы анаэробную споровую бактерию — Clostridium cochlearium, метили рующую неорганическую ртуть. Витамин Bi2 и глюкоза стимулировали синтез ртутьорганических веществ. Cl. co chlearium выращивали на среде, содержащей МПБ, пеп тон, глюкозу, цистеин, витамин E>i2, NaCl и HgCl2 (5— 15 мг/л). Воздух в колбах с культуральной жидкостью . заменяли азотом, и хотя организм может развиваться при довольно высоких значениях окислительно-восста новительного потенциала (+50 мв), образование метил-меркурхлорида происходит на ранней стадии роста куль туры, когда Eh среды резко понижается. За появлением метилмеркурхлорида следили с помощью тонкослойной и газо-жидкостной хроматографии, радиографии, а также по образованию метана при разложении ртутьорганиче-ского соединения культурой Pseudomonas К 62.
Метилртуть синтезируется из HgCl2, Hgl2, HgO Hg(NO3)2, Hg(CN)2, Hg(SCN)2 и Hg(CH3COO)2, но не из HgS. Следовательно, природные условия, при которых происходит достаточно интенсивное выделение сероводо рода в среду (например, сульфатредукция, метановое брожение) способствуют элиминированию ртути и пре пятствуют ее дальнейшему превращению в ртутьоргани ческие производные; там же, где этого нет, всегда суще ствует возможность биосинтеза метилртути из ее неорга нических соединений.
В уд и сотрудники (Wood et al., 1968) показали, что диметилртуть образуется путем переноса метильной группы от метилкобаламина к Hg2+ в присутствии эк стракта метанообразующей бактерии, развивающейся за счет Н2 и СО2 (Bryant et al., 1967).
Механизм превращения ртути в се органические про изводные состоит в следующем. Известный донор ме-тильных групп в биологических системах — метилкобала-мин (Г) деметилируется, и освободившаяся метильная группа ферментативным либо даже чисто химическим пу тем присоединяется к иону ртути. При этом вначале образуется диметилртуть (III), которая затем взаимодей ствует с хлоридом ртути (II), в результате чего появля ется метилмеркурхлорид (IV) (Imura et al., 1971; Ber-tilisson, Neujahr, 1971):
Таким образом, высокотоксичные метилпропзводные ртути легко генерируются из неорганической ртути в присутствии метилкобаламина. Если учесть, что метилко-баламин синтезируется многими организмами, в том чис ле и микроорганизмами, особенно метанообразующимп бактериями, которые очень распространены в илах во доемов и очистных сооружений, то можно себе предста вить всю опасность попадания в воду ртути в любом виде.
Недавно Александер и сотрудники показали возмож ность микробного образования метановых производных некоторых металлоидов. Из бытовых сточных вод выде лен штамм Penicilllum sp., способный превращать неор ганические соединения селена и теллура (Na2Se03; Na2Se04; TeCU; H2Te03; H6Te06) в соответствующие диметилпроизводные (Fleming, Alexander, 1973). Обра зование этих продуктов доказано с помощью газовой хроматографии и масс-спектрального анализа. Микроб ное метилирование селена стимулируется сульфат-ионом и метнонином, в то время как Mg2+, гомоцистеин и го-моцистин не оказывают никакого влияния на этот про цесс. Еще три вида грибов — Candida humicola, Gliocla-diutn roseum и Penicilliurn sp., тоже обитающих в
сточных водах, обладают способностью синтезировать из мышьяковистых соединений токсичный газ триметилар-син (Сох, Alexander, 1973).
Биосинтез металлорганическнх соединений—очень широко распространенное явление у микроорганизмов, отнюдь не ограничивающееся только лишь простым ме тилированием (Perlmann, 1965). В этой связи не вызы вает удивления способность микробов к трансформации и деструкции этих веществ в природе и в очистных со оружениях.
ЗАКЛЮЧЕНИЙ
Микробы способны вовлекать органические со единения в разнообразные биохимические реакции, в ре зультате которых организм получает строительный ма териал, энергию, либо инактивируют яды. И хотя сте пень проявления этого свойства не бесконечна для одного вида микроорганизмов, необыкновенное разнообразие мира микробов приводит к тому, что практически все органические соединения претерпевают те или иные био химические превращения. Микроорганизмы принимают активное участие в циклах углерода, азота и других био генных элементов на Земле, они обеспечивают важней шие звенья круговорота веществ в природе.
В настоящее время превращение веществ в некоторых экологических системах нарушается. Мы являемся если не соучастниками, то свидетелями рождения мертвых и умерщвления живых озер, превращения чудесных, бога тых фауной и флорой речек в лишенные жизни сточные канавы. Отравляются не только водоемы, хотя на воде это более всего заметно, загрязняется почва, воздух — вся биосфера. Таков отрицательный результат индустри альной и научно-технической революций, бездумного использования природных ресурсов.
Наряду со стремительной индустриализацией, интен сификацией добычи полезных ископаемых, урбаниза цией, увеличением населения и его концентрированием важную, если не первостепенную, роль в загрязнении окружающей среды играют синтетические органические соединения, которые раньше в природе не встречались. К настоящему времени синтезировано около 2,5 млн. та ких веществ. Сначала нашли применение только еди ничные — в основном взрывчатые, красящие, лекарствен ные. Но особенно широкое распространение синтетиче ские органические соединения получили в последние 25—30 лет: всевозможные ядохимикаты, синтетические полимеры, смолы, поверхностно-активные веществавыпускаются сотнями миллионов тонн в год. Постоянное, неуклонное и достаточно бурное увеличение производ ства и применения этих веществ приводит к тому, что они становятся важным и весьма неприятным экологи ческим фактором.
Многие синтетические органические вещества трудно разрушаются, они накапливаются в природе, кумулиру-ются в живых организмах и все больше загрязняют окружающую среду. Резистентность, неподатливость к биологическому разрушению синтетических органических соединений обусловлена необычностью их химического строения, тем, что в процессе эволюции живой мир не сталкивался с этими веществами. И все же практически нет такого органического соединения, которое не подвер галось бы биохимическим превращениям с помощью ми кроорганизмов. Это удивительное свойство микробов не находит пока удовлетворительного объяснения. Ссылки на поразительную изменчивость микроорганизмов, адап тацию, приспособляемость и т. п. не отвечают на вопрос о механизме образования ферментов, специфических по отношению к необычному, не встречающемуся в природе веществу.
Пути и способы регуляции биосинтеза ферментов с помощью субстратов получили определенное эксперимен тальное обоснование, и их описание приводится уже в учебниках микробиологии (Stanier et al., 1971; Шлегель, 1972). Образование ферментов возможно только при на личии в геноме клетки микроба соответствующих генов, в которых содержится информация о строении данного каталитического белка.
В недавно опубликованной обобщающей работе Ю. Н. Карасевич (1971) рассматривает различные тео ретически предполагаемые случаи изменения и использо вания общей и «полезной» генетической информации, заложенной в микроорганизмах. Автор приходит к вы воду, что формально новое свойство использовать не обычный субстрат «возникает в результате изменения генетического аппарата клетки, а не за счет приобре тения дополнительного количества полезной информа ции». В то же время нельзя отрицать новообразования ферментов, возникновения биосинтетических функций и регуляторных механизмов у микробов в процессе эво люции. ;
Согласно центральной догме молекулярной био логии, поток информации в любом организме имеет сле дующее направление: нуклеиновые кислоты (ДНК з* т±РНК) -*- белок, который уже воздействует на опреде ленный субстрат. Субстрат не может непосредственно влиять на формирование специфического по отношению к нему белка, так как последний синтезируется на ну клеиновых кислотах, которые несут информацию о пер вичной структуре белка, а ферментативная активность обусловлена третичной и четвертичной его структурой. Следовательно, обратная связь между субстратом и ге номом невозможна, тем не менее микроорганизмы адап тируются к необычному веществу, вырабатывают, по-пи-димому, необходимые для превращения этого вещества ферменты или находят какие-то другие пути вовлечения синтетических соединений в свой метаболизм.
Весьма вероятно, что важную роль в процессе вклю чения синтетических соединений в ферментативные про цессы играет именно тот факт, что каталитические свой ства ферментов обусловлены не первичной, а третичной (четвертичной) структурами. Последние далеко не так жестки, как первичная структура: они образуются за счет полярных (водородных) и неполярных (гидрофоб ных) связей, вандерваальсовых сил, а не за счет истин ных, валентных, прочных химических связей, и это может облегчать изменение конформации ферментов в значительных пределах. Возможно, именно поэтому спе цифичность ферментов не абсолютна, и многие из них способны взаимодействовать с синтетическими аналогами природных субстратов.
Анализ химического строения синтетических и при родных органических соединений приводит к заключе нию, что связи между атомами в молекулах тех и дру гих веществ аналогичны. Например, синтетический хлор бензол или дихлордифенилтрихлорметилметан (ДДТ), с одной стороны, и такой продукт жизнедеятельности акти-номицетов, как хлортетрациклин или грибной хлорфла-вонин — с другой, содержат однотипное сочленение остатков хлора и углерода. В природе не встречаются тринитротолуол, нитроанилин или нитроглицерин, одна ко эти вещества по типу связи нитрогруппы с углерод ным скелетом аналогичны природным хлоромицетину и нитропропионовой кислоте. То же можно сказать и оборганических соединениях фосфора и серы, не являются исключением металлорганические соединения и синтети ческие полимеры.
Следовательно, искусственно созданные синтетиче ские органические соединения можно рассматривать как новые комбинации старых, давно известных живому ми ру типов сочленения атомов в молекуле, и в связи с этим их биохимическое разрушение вполне правдоподобно, хотя и может претерпевать некоторые затруднения. Не исключена возможность неспецнфичных или нефермента тивных, в частности, связанных с окислительно-восстано вительными реакциями, превращений синтетических веществ микроорганизмами. Все это до некоторой сте пени снимает трудности объяснения того, почему у ми кробов обнаруживается способность разрушать ранее в природе не встречавшиеся органические соединения. Бо лее того, это позволяет находить новые подходы к по иску микроорганизмов, активно разрушающих те или иные органические соединения.
По-видимому, очень важную роль в вовлечении не обычных соединений в метаболизм микробов играет ко-метаболизм. Четкого теоретического обоснования это яв ление пока не имеет, его открытие было неожиданным и еще раз продемонстрировало, насколько разнообразны и необычны способы взаимодействия микроорганизмов со средой и как далеко не полностью раскрыты потенци альные возможности этих организмов.
Установление механизма адаптации чрезвычайно ин тересно с теоретической точки зрения и принесло бы огромную пользу в первую очередь биологической очист ке окружающей среды, облегчило бы придание микро организмам свойств эффективно минерализовать синте тические органические загрязнения.
Деструкцию органических веществ осуществляют са мые разнообразные микроорганизмы: бактерии, грибы, актиномицеты. Отдельные группы микробов разрушают синтетические органические вещества по-разному: одни используют их в качестве источников углерода, азота, фосфора или серы для конструктивного обмена, другие потребляют эти необычные вещества для конструктив ного и для энергетического обмена, третьи могут чер пать из них только энергию, иногда лишь незначительную ее часть, и превращать их по типу соокисления или коме-
таболизма. Знание метаболиче&ких возможностей различ ных групп микроорганизмов может указать на перспек тивность или бесперспективность поиска среди них ми кробов, способных очищать окружающую человека среду от тех или иных загрязнителей.
Большое значение приобретает выяснение природы промежуточных продуктов метаболизма синтетических органических соединений. При всем разнообразии пу тей метаболизма наблюдается одна общая тенденция: микроорганизмы стремятся как можно быстрее и проще превратить исходное необычное соединение в вещество, встречающееся в природе, либо аналогичное таковому, а затем в ключевое соединение основных метаболитных циклов. Биологическая очистка сточных вод и поныне ча сто описывается в литературе термином «биологическое окисление», поскольку принимаются во внимание про дукты полной минерализации органических соедине ний — предельно окисленные вещества: углекислый газ, вода, нитраты и др. Опыты показывают, что в действи тельности при разрушении органических веществ проис ходят самые разнообразные реакции — окисление, дезме-тилирование, декарбоксилирование, восстановление как, например, в случае органических нитросоединений. Био химическое разрушение нитросоединений нельзя интен сифицировать созданием лучших окислительных условий (аэрацией или увеличением гН2 среды). Как раз наобо рот, снижение окислительно-восстановительного потен циала способствует начальной фазе деструкции этих ве ществ микроорганизмами.
По мере изучения микробного разрушения все новых и новых синтетических органических соединений, посту пающих в окружающую среду, открываются неисчерпае мые биохимические возможности мира микроорганизмов. Однако для реализации этих возможностей необходимо создавать соответствующие условия.
Существенную помощь в познании закономерностей микробной деструкции органических соединений может оказать анализ предполагаемых конечных продуктов раз рушения этих веществ. Так, разрушение белков, амино кислот, мочевины и других азотсодержащих веществ, которые встречаются в бытовых сточных водах, приводит к образованию определенного количества аммиака, и реакция среды смещается в щелочную сторону. Поэтомуактивный ил, организмы которого лучше всего развива ются в слабощелочной среде, прекрасно зарекомендовал себя именно в очистке бытовых стоков. Аналогичным, возможно бол*е резким, повышением рН среды должен сопровождаться распад солей органических кислот, ме-таллорганических соединений, в результате которого образуются гидроокиси металлов.
Деструкция же органических галоидопроизводных, а также фосфорорганических соединений ведет к подкис-лению среды за счет образования соответствующих ми неральных кислот. Естественно, для разрушения каждой группы этих органических соединений необходимы раз личные микроорганизмы и несходные условия.
Проблема микробной деструкции синтетических орга нических соединений включает следующие важнейшие научно-практические задачи: изучение механизма вза-. имодействия подлежащих деструкции веществ с микроб ной клеткой (внеклеточная подготовка веществ к их ассимиляции, проникновение через оболочку, индукция-ферментов, вызывающих трансформации синтетических, не встречавшихся в природе соединений); выяснение пу тей биохимической деструкции синтетических веществ в клетке, природы промежуточных и конечных продуктов метаболизма; установление зависимости между строе нием подлежащих разрушению органических соединений и группами микроорганизмов, наиболее быстро и эффек тивно осуществляющими этот процесс. Решение этих за дач послужит научной основой использования микроор ганизмов для очистки промышленных сточных вод и окружающей человека среды от новых, не встречавших ся ранее в природе веществ.
Литература
Адаптация у микроорганизмов. М., ИЛ, 1956.
А л и х а н ян С. И. Генетика микроорганизмов. М., Медгиз, 1963, 124.
Анатомия бактерий. М., Медгиз, 1960.
А и i н а Я. О.—В кн.: Саштарна охорона водоймищ i очистка про-мислових спчиих вод. Ки1в, 1959, 131.
Аристовская Т. В.— Почвоведение, 1961, 11, 40.
А у н и н ь ш Э. А., Тупурейне А. Д.— В кн.: Материалы IV Все-союз. симпоз. по совр. пробл. самоочищения и регулирования ка чества воды. (II секция). Таллин, 1972, 14.
Базякина Н. А.—водоснабжение и санитарная техника, 1940, 6, 38.
Базякина Н. А., С т о л я р о в а Л. И. Полная очистка в аэро-тенках концентрированных сточных вод от пидролиза каменного угля. Водгео. М., 1956.
Бальдачч_и J. Расширение классификации актииомицетов.— Мик робиология, 1959," 28," 2, 274.
Банд у реки Р.—В кн.: Биохимия растений (под ред. Дж. Бон нер и Дж. Вагнер). М„ «Мир», 1968, 272.
Б е к к е р 3. Э.— Физиология грибов и их практическое использова ние. М., Изд-во МГУ, 1963.
Белозерский А. Н. Нуклеиновые кислоты и их биологическое значение. М., «Знание», 1963.
Белозерский А. Н., Спирин А. С.— Изв. АН СССР, сер. биол., 1960, 50.
Белозерский А. Н., С п и р и н А. С.— В кн.: Нуклеиновые кис лоты, 3. М„ ИЛ., 1962, 123.
Бердже Д. Н. Определитель микробов. Киев, Изд-во АН УССР, 1936.
Б л а г н и к Р., 3 а н о в а В. Микробиологическая коррозия. М.—* Л., «Химия», 1965.
Блохина И. Н., Леванова Г. Ф. Первичная структура ДНК и систематика бактерий. Строение ДНК и положение организмов в системе. М., Изд-во МГУ, 1972.
Б о б к о в а Т. С., 3 л о ч е в с к а я И. В., Рудакова А. К., Чекунова Л. Н. Повреждение промышленных материалов и изделий под воздействием микроорганизмов (справочник). М., Изд-во МГУ, 1971.
Брагинский Л. П. Пестициды и жизнь водоемов. Киев, «Нау-кова думка», 1972.
В а и - Н и л ь К. Вклад микробов в биологию. М., 1959, 144.
В е й б у л л К. Анатомия бактерий. М., Медгиз, 1960.
В е й с ф е й л е р Ю. К., К а р а с е в а В. Т. Генетика микроорганиз мов. Труды симпозиума по проблеме наследственности и измен чивости микроорганизмов. М., Медгиз, 1963. В и н б е р г Г. Г., О с т а п е н я П. В., Сивко Г. Н., Л е в и -н а Р. И. Биологические пруды в практике очистки сточных вод. Минск, 1966.
Ворошилова А. А., Дианова Е. В.— Микробиология, 1937, 6, 6, 741.
Г а к Д. 3.— Гидробиол. журн., 1967, 3, 2, 59.
Г а н Т. С, Ю р о в с ь к а Е. М., Т е п л и ц ь к а Л. I.— В кн.: Саштар-на охорона водоймищ i очистка промисл. сп«них вод. КиТв, Вид-во АН УРСР, 1959, 148.
Г а у з е Г. Ф. Вопросы классификации актиномицетов-антагопистов. М., Медгиз, 1957.
Гвоздяк П. I.— Мжробюл. журн., 1971, 33, 769.
Гвоздяк П. И.— В кн.: Биологическая очистка сточных вод. Киев, «Наукова думка», Тез. докл., 1973.
Гвоздяк П. И., Удод В. М., Черняева В. Б., Чехов ская Т. П.— В кн.: Проблемы коллоидно» химии и химии воды. Киев, «Наукова думка», 1970, 81.
Гвоздяк П И., У д о д В. М., Р о т м и с т р о в М. Н. Авт. сви-дет. СССР, кл. С 02 с, 5/10, № 333135, опубл. 21. III 1972.
Гвоздяк П. И., Ротмистров М. Н., Удод В. М., Чехов ская Т. П., Б з т а го в а Ж. Ф.— В кн.: Водоподготовка и очистка промышленных стоков, 9. Киев, 1972, 34.
Гельман Н. С, Л у к о я н о в а М. А., Островский Д. Н. Дыхательный аппарат бактерий. М., «Наука», 1966.
Генетика микроорганизмов. Труды симпозиума по проблеме наслед ственности и изменчивости микроорганизмов. М., 1963.
Геррет Р.— В кн.: Разложение гербицидов (под ред. П. Кер«и и Д. Кауфмана). М.. «Мир», 1971, 117.
Гольдфарб Д. М. Введение в генетику бактерий. М., «Наука», 1966.
Гончарова К. П., Журавлева 3. Д.— Сахарн. пром., 1971, 4, 29.
Горовиц-Власова Л. М. Определитель бактерий. М.— Л., Снабтехиздат, 1933.
Г р а д о в а Н. Б., К о н д р а т ь е в а Т. Ф., К р у ч и н и и а Л. К.— Микробиол. синтез, 1966, 18, 3.
Дин А., Хиншельвуд С—В кн.: Адаптация у микроорганиз мов. М„ 1956, 42.
Д р у й Э. Г., Г а р К. А„ X о х р я к о в а В. С — ДАН СССР, J971, 200, 977. eJ
Дубинин Н. П. Горизонты генетики. М., 1970. ;
Егорова А. А.— Микробиология, 1942, II, 131.
Егорова А. А.— Микробиология, 1946, 15, 467.
Ж а ко б Ф., Вольман Э. Пол и генетика бактерий, М ИЛ 1962.
Жуков А. И., Калабина М. М., Роговская Ц. И.— Гигиена и санит., 1957, 5, 68.
Заварзин Г. А.—Микробиология, 1961, 30, 3, 393; 30, 5, 952.
Заварзин Г. А. Литотрофные микроорганизмы. М. «Наука» 1972.
Зайцева Г. Н., Белозерский А. Н.— Микробиология, 1957, 26, 722.
Зайченко Е. А., Юзвенко В. Н., Гриценко В. И.— Сахар ная пром., 1971, 2, 65.
t К
L К
И е о vc а л и м с к и й Н. Д. Азотное и витаминное питание микро организмов. М.—Л., Изд-во АН СССР, 1949.
Иерусалимский Н. Д. Основы физиологии микробов. М., Изд-во АН СССР, 1963.
Иерусалимский Н. Д., Андреева Е. А., Гришанко-в а Е. Л., Головлев Е. Л., Дорохов В. В., Жуко ва Л. Н.— Прикл. биохим. и микробиол., 1965, 1, 163.
Имшенецкий А. А. Строение бактерий. М.— Л., Изд-во АН СССР, 1940.
Имшенецкий А. А., Солнцева Л. И.—Микробиология, 1937, в, 13.
Имшенецкий А. А., С о л н ц е в а Л. И.— Микробиология, 1945 14, 324.
Кабакова Л. Ф., Сафронова В. М., Шнеерсон Л. И.— В кн.: Исследования в области очистки буроугольных и торфя ных газогенераторных вод. М., ОНТИ, 1934, 55.
Калабина М. М., Роговская Ц. И. Распад фенолов под влиянием микроорганизмов. М., ОНТИ, 1934.
Калабина М. М., Шнеерсон Л. И.—В кн.: Очистка про мышленных сточных вод. М., 1962.
К а р а с е в и ч Ю. Н. Основы молекулярной биологии. Генетика и селекция микроорганизмов (под ред. проф. С. И. Алиханяна) М., «Наука», 1964.
Карасевич Ю. Н. Успехи микробиологии, 7. М., «Наука», 1971.
Карклиньш Р. Я., Пробок А. К. Биосинтез органических кислот. Рига, «Зинатне», 1972.
Кашкин П. Н.— Труды Ин-та микробиол. АН СССР, 1958, 5.
К в а с н i к о в 6. I., Т и н я н о в а Н. 3., Кривицький I. П — Мжробюл. журн., 1970, 32, 3, 294.
К ер ни П., Кауфман Д. Разложение гербицидов. М., «Мир» 1971. '
К и р и ч е и к о А. Г., X в а т В. М — Кокс и химия, 1970, 7, 42.
К л ю й в е р А., В а н - Н и л ь К. Вклад микробов в биологию М ИЛ, 1959. ' "
К л юн ков В. В., Роговская П. И., Шнеерсон Л. И — Гигиена и санит., 1954, 7, 36.
Ковалева Н. Г.— Труды ВНИИ ВОДГЕО, 1970, 23, 70.
Ко л ее о в Ю. Ф.— Изв. высш. учебн. заведений. (Строительство и архитектура), 1971, 6, 127.
Костовецький Я. И.— В кн.: Санкарна охорона водоймищ i очистка промислових ст1чних вод. Kni'B, Вид-во АН УРСР 1959, 35.
К р а с и л ь н и к о в Н. А. Лучистые грибки и родственные им орга низмы. М.—Л., Изд-во АН СССР, 1938.
Красильников Н. А.— Микробиология, 1945, 14, 3, 164.
Красильников Н. А.— Микробиология, 1947, 16, 5, 381.
Красильников Н. А.— Микробиология, 1948, 17, 2, 105.
Красильников Н. А. Определитель бактерий и актииомицетов М.—Л., Изд-во АН СССР, 1949.
Красильников Н. А.—Труды Ин-та микробиол. АН СССР 1952, 2.
Красильников Н. А. Лучистые грибки. Высшие формы. М, «Наука», 1970. Крисе А. Е. Изменчивость актиномицетов. М., Изд-во АН СССР, 1937.
К у Д л а й Д. Г. Изменчивость микробов кишечной группы. М., Медгиз, 1954.
Кудлай Д. Г.— В кн.: Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней, 1. М, Медгиз, 1962, 473.
Кудлай Д. Г. Эписомы и инфекционная наследственность бакте рий. М., Медгиз, 1969.
Кудрявцев В. И,— ДАН СССР, 1938, 19, 6-7, 513.
Кудрявцев В. И.— Микробиология, 1939, 8, 3-4, 395.
Кудрявцев В. И.— В кн.: Труды конференции по направленной изменчивости и селекции микроорганизмов. М., Изд-во АН СССР, 1952, 147.
Кудрявцев В. И. Систематика дрожжей. М., Изд-во АН СССР, 1954.
Курсанов Л. И. Пособие по определению грибоь из родов Asper-gillus и Penicillium. M., Медгиз, 1947.
Лабинская А. С, Пономарева И. Р.— Учен. зап. Моск. ин-та санит. и гиг., 1960, 4, 37.
Лебедева М. Н., Воропаева С. Д. Лекарственная устойчи вость микроорганизмов. М., Медгиз, 1960.
Левина 3. В., X а и т С. В., Качан И. А.—Прикл. биохим. и микробиол. 1971, 7, 128.
Лилли В., Барнет Г. Физиология грибов. М., ИЛ, 1953.
Логв1 ненко Л. I.— Мжробюл. журн., 1970, 32, 3, 317.
Л о п а т и к М. Д.—Микробиология, 1964, 33, 236.
Л у с М. Феноксиалкилкарбоновые кислоты.— В кн.: Разложение гер бицидов. М., «Мир», 1971.
Малек И.— Микробиология, 1956, 25, 6, 659.
Матвиенко А. М.— В кн.: Биологическая наука в университетах и педагогических институтах Украины за 50 лет. Харьков, 1968, 16.
Матвиенко А. М.— В кн.: Тезисы докладов V делегатского съез да Всесоюз. бот. об-ва. Киев, 1973, 295.
Мельников Н. Н. Химия пестицидов. М., «Химия», 1968.
Месробяну Л., Пэунеску Э. Физиология бактерий. Бухарест, «Меридиане», 1963.
М и н о с я н С. А., П а н и я н Р. П.— В кн.: Материалы симпозиума и координационного совещания по содержанию остаточных коли честв пестицидов в пищевых продуктах. М., 1969.
Мишустин Е. Н. Микроорганизмы и продуктивность земледе лия. М., «Наука», 1972.
Наумова Р. П.— В кн.: IX Междунар. конгресс по микробиол., Тез. докл. М., «Медицина», 1966, 253.
Наумова Р. П., Белов И. С—Биохимия, 1968, 33, 946.
Наумова Р. П.— Биохимия, 1969а, 34, 975.
Наумова Р. П.— Прикл. биохим. и микробиол., 19696, 5, 43.
Наумова Р. П.— Микробиология, 1969в, 38, 451.
Н е и и ч В. Н., Д р и н ф е л ь д П. И., Ц е л ы к о в с к а я Н. К., Дахненко Н. Я.— Кокс и химия, 1960, 1, 38.
Никитин Д. И., Васильева Л. В., Л о х м а ч е в а Р. А. Новые и редкие формы почвенных микроорганизмов. М., «Нау ка», 1966.
Новогрудский Д. М. Почвенная микробиология. Алма-Ата, Изд-во АН Казахской ССР.
Осницкая Л. К.— Микробиология, 1962, 31, 769.
П а л а м а р -М о р д в и н цев а Г. М., Марин ич В. К., Г р а-бовская В. В., Ней га уз С. М.—У::р. бот. журн., 1966, 23, 4, 80.
Паламар-Мордвинцева Г. М., Ступина В. Б., К р а-в е ц В. В., Паляничка Л. Ф., К у з ь м и н В. А.— Гигиена и санит., 1969, 106.
Перфильев Б. В., Г а бе Д. Р. Капиллярные методы изуче ния микроорганизмов. М.— Л., Изд-во АН СССР, 1961.
Перцовская А. Ф., Дуда В. Н., Звягинцев Д. Г.— По чвоведение, 1972, 11, 17.
Пешков М. А. Цитология бактерий. М.— Л., 1955.
Пидопличко Н. М. Грибная флора грубых кормов. Киев, Изд-во АН УССР, 1953.
Пробст Г., Тип Дж.— В кн.: Разложение гербицидов (под ред. П. Керни и Д. Кауфмана). М., «Мир», 1971, 248.
Прокофьева-Бельговская А. А. Строение и развитие ак тиномицетов. М., Изд-во АН СССР, 1963.
Путилина Н. Т.— Гигиена и санит., 1952, 12, 8.
П у т и л и и а Н. Т.— Микробиология, 1959, 28, 5, 757.
Путилина Н. Т.— Микробиология, 1961, 30, 2, 294.
Путилина Н. Т., К в и т и и ц к а я Н. Н., К о с т о в е ц к и й Я. И. Микробный метод обесфеноливания сточных вод. Киев. «Здо ров'я», 1964.
РаботноваИ. Л. Общая микробиология. М., 1966.
Разложение гербицидов (под ред. П. Керни и Д. Кауфмана). М., «Мир», 1971.
Разумов А. С— Микробиология, 1957, 26, 3, 392.
Рапопорт И. А.— Вестн. АН СССР, 1970, 11, 59.
Р а й а н Ф. Д.— Микробиология, 1958, 27, 6, 673.
Робиноу К. Ф.— В кн.: Р. Ж. Дюбо. Бактериальная клетка. М, ИЛ, 1948.
Робиноу К. Ф. Анатомия бактерий, Шестой симпозиум Общества общей микробиологии. М., Медгиз, 1960.
Роговская Ц. И,— Микробиология, 1951, 20, 3, 265.
Роговская Ц. И., Лазарева М. Ф.— Микробиология 1959 28, 4, 565.
Роговская Ц. И., Лазарева М. Ф,—Микробиология, 1963, 32, 6, 1047; 1964, 33, 1, 140.
Роговская Ц. И Биохимический метод очистки производствен ных сточных вод. М., 1967.
Роджерс Г. Д. Метаболизм бактерий. М., ИЛ, 1963.
Рубан Е. Л. Физиология и биохимия нитрифицирующих бакте рий. М„ «Наука», 1961.
Рудзрога А. И.— В кн.: Санитарная гидробиология и водная токсикология. Рига, 11, 1968, 164.
С а л м а н о в а Л. С, Ж д а и о в а Л. А., С о б о л е в с к а я Т. H.-»i В кн.: Ферменты микроорганизмов. М., «Наука», 1973, 134.
Скрябин Г. К., Кузнецов В. Д., Глухо в а А. А.—Авт. свид., № 185316, Бюл. изобр. № 17, опубл. 13.VIII. 1966. Скрябин Г. К., Голов лева Л. А.—Микробиол. пром., 1970, 6, 53.
Скрябин Г. К., Голов лев а Л. А,—Изв. АН СССР, сер. биол., 1972, 2, 232.
Скрябин Г. К., Г о л о в л е в а Л. А.— Труды Всесоюз. н-и. ин-та ядерной геофизики и геохимии, 1970, 8, 247.
Соловьев В. И., П р о к о ш е в а Г. А.—Прикл. биохим. и ми кробиол., 1970, 6, 686.
Со т и и к о в а Е. В.— Микробиол. пром., 1972, 1, 40.
Станиер Р.— В кн.: Адаптация у микроорганизмов. М., 1956, 13.
Стефенсон М. Метаболизм бактерий. М., ИЛ, 1951.
Столбунов А. К., Багнюк В. М., Прядкина В. В.— В кн.: Мат-лы IV Всесоюз. симпозиума по современным проблемам самоочищения и регулирования качества воды. Таллин, 1972, 153.
Столбунов А. К.—В кн.: Круговорот вещества и энергии в озе рах и водохранилищах, Лиственничное на Байкале, 1973, 83.
Ступина В. В., Багнюк В. М.— В кн.: Тезисы докл. V деле гатского съезда Всесоюз. бот. об-ва. Киев, 1973, 321.
Татаренко Е. С. Селекция и изменчивость плесневых грибов-продуцентов ферментов. Автореф. докт. дис. Харьков, 1970.
Та у сон В. О,—Микробиология, 1932, 1, 1,49.
Т и м а к о в В. Д.— В кн.: Генетика микроорганизмов. Труды сим позиума. М., 1963.
Ткаченко Н. И., Друблянец Э. Э.— Микробиология, 1959, 28, 5, 763.
Т о м ч и к Я. Анатомия бактерий. М., Медгиз, 1960.
Удод В. М., Ротмистров М. Н., Роговская Ц. И., Гвоздяк П. И.— Микробиология, 1972, 41,213.
Уемура И., Ков а и И., Ко-Минг В.— В кн.: IX Междунар. конгресс по микробиол. Тез. докл. М., «Медицина», 1966, 248.
Улезло И. В. Ферменты микроорганизмов. М., «Наука», 1973, 123.
Уоллен Л., Стодола Ф., Джексон Р. Типовые реакции ферментативной химии. М., ИЛ, 1962.
Ф о стер Д. Химическая деятельность грибов. М., ИЛ, 1950.
Хан Ф.— В кн.: Механизм действия антибиотиков. М., «Мир», 1963, 354.
Холодный Н. Г. Железобактерии. М., Изд-во АН СССР, 1953.
Худяков Н. Н.— Сельскохозяйственная микробиология. М., Гос. техн. изд-во, 1926.
Цион Р. А. Определитель микробов. М., 1948.
Шапошников В. Н.—Микробиология, 1944, 13, 1, 1.
Шапошников В. Н., О с н и ц к а я Л. К., Ч у д и н а В. И — Микробиология, 1960а, 29, 3, 320.
Шапошников В. Н., О с н и ц к а я Л. К., Ч у д и н а В. И.— Микробиология, 19606, 29, 164.
Шевцова I. I.—Вкник КДУ, сер. бюл., 1969, 11, 149.
Шевцова И. И., Маринич В. К, Нейгауз С. М.—Науч. докл. высшей школы, биол. науки, 1969, 4, 91.
Шлегель Г. Общая микробиология. М, 1972.
Шнитцер Р., Г р у н б е р г Э. Устойчивость микроорганизмов к лекарственным веществам. М., 1960.
Штурм Л. Д.— Микробиология, 1958, 27, 6, 740.
9ПЛ .
Юровская Е. М.— В кн.: Докл. науч. конф. по гигиене водо-снабж. и еанит. водоемов, 1. Киев, 1961.
Юровская Е. М., Ботвинова Л. Е., Ерусалим-с к а я А. Ф.— Микробиология, 1968, 37, 4, 655.
Юровская Е. М.— Мжробюл. жури., 1971, 33, 2, 692.
Я ч е в с к и й А. А. Основы микологии. Л., 1933.
AdaraseA. D.— Water Res., 1968, 2, 665.
Agardy F. J, Cole R. D., Pearson E. A., 1963.—Цит. no Toerien D. F., H a 11 i n g h W. H. J., 1969.
Alexander M. Microbial Ecology. New York, 1971.
Alexander M., Lustigman B. K — J. Agr. Food Chem., 1966, 14, 410.
Allen L. A.— J. Hyg., 1944, 43, 424.
Anderson D. A.— Int. J. Air Water Poll., 1966, 10, 223.
Anderson R. E.— Water Poll. Abstr., 1969, 42, 263.
A n n icch i a rico S. L., D'Arca S. A., Borgioli A., Tar si t a n i G.— Nuovi Ann. Ig. e Microbiol., 1971, 22, 229
A u d u s L. J.— Nature, 1950, 166, 356.
Austin B. L., Forster С F,—Water Waste Treat. J., 1969 12, 208.
Barker H. A,— Ind. Engng. Chem., 1956a, 48, 1438.
Barker H. A. Bacterial Fermentations. New York, 1956b.
Barker P. S., M о r r i so n F. O.—Canad. J. Zool., 1964, 42 324
Barker P. S., Morrison F. O., W h i t a k e r R. S — Nature 1965, 205, 621.
В a r t h a R.—J. Agr. Food Chem., 1968, 16, 602.
Bartha R., Pramer D.— Science, 1967, 156, 1617.
Bartha R., L i n k e H. A., Pramer D.—Science, 1968, 161, 582
Bartha R., Pramer D.— Adv. Appl. Microbiol., 1970 13 317
В art nick i E. W., Castro С. Е.—Biochemistry, 1969,'в 4677
Becker J. Q., Shaw S h. G.—Appl. Microbiol., 1955, 3 173
Belser N. O., Castro С. Е.— J. Agr. Food Chem., 1971, 19 23
В e n a r d e M. А„ К о f t B. W., H о r v a t h R. S., S h a u 1 i s L — Appl. Microbiol., 1965, 13, 103.
Bertilisson L, Neujahr H. Y.—Biochemistry, 1971 !0 2805
Bielaszczyk E., Czerwinska E., Janko Z.; К о t а г s k i A К о w a 1 i k R., Kwiatkowski M., Zoledziowska J — Acta microbiol. Pol., 1967, 16, 243.
В о 1 I a g J.-M., В r i g g s G. G., D a w s о n J. E., Alexan der M.—J. Agr. Food Chem,, 1968, 16, 829.
Bollag J.-M., Alexander M.—Soil. Biol. a. Biochem., 1971, 3,
Bouthillier P. H., Brown G. D,—Wat. Poll. Contr., 1971a,
Bouthillier P. H., Brown G. D.— Wat. Poll. Contr., 1971b,
109, 12, 26. Bray H. G., H у b s Z., J a m e s S. P., T h о r p e W. V.— Biochem
J., 1953, 53, 266. Bringmann G., Kuhn R.—Gesundheits Ing., 1959, SO, 115.
V Bringmann G., Kuhn R.—Gesundheits Ing., 1959a, 80, 239. Bringmann G., Schroder W.— Gesundheits Ing., I960, 81,'205. Bringmann G., Kuhn R.—Gesundheits Ing., 1971, 92, 273 Brodie A. F., Gots J. S.— Arch. Biochem. Biophys., 1952, 39, 165. Bryant M. P., W о I i n E. A., W о I i n M. J., W о 1 f e R. S.—
Arch. Mikrobiologie, 1967, 59, 20.
Bryson V., Zrybalski W.—Advances in Genet., 1955, 7, 1. Buck Т. С, Keefer С. Е., Hatch H.—Sew. Ind. Wast., 1953,
25, 993.
Buck T. C, Keefer С E., Hatch H,—Sew. Ind. Wast., 1954,
26, 164.
Bueding E., Jolliffe N,—J. Pharmacol. Exptl. Therap., 1946,
88, 300. Burbank N. C, Cookson J. Т., Goeppner J., Broo-
m a n D.— Int. J. Air Water Poll., 1966, 10, 327. Bush M. Т., Touster O., Brockman J. E.—J. Biol. Chem.,
1951, 188, 685.
Butterfieid С. Т.— Public Health Rept., 1935, 50, 671.
В u 11 e r f i e 1 d С. Т., R u с h h о f t С. С, М с N a m e e P. D. — Se wage Wks. J., 1937, 9, 173.
Butterfield С. Т., Ruchhoft С. С, McNamee P. D.— Public Health Rept., 1937a, 52, 387.
Butterfield С. Т., W a 11 i e E.—Sewage Wks. J., 1941, 13, 639.
Byrde R. J. W., Woodcock D.—Biochem. J., 1957, 65, 682.
Cain R. В.—J. Gen. Microbiol., 1958, 19, 1.
Cain R. В., F a r r D. R.— Biochem. J., 1968, 108, 859.
С a 1 a w а у W. Т., Carroll W. R., Long S. K.— Sew. Ind. Wast.,
1952, 24, 642.
Cardini G., Catelani D., Sorlini G., Treccani V.— Ann.
Microbiol. ed. enzimol., 1966, 16, 217.
С art wright N. J., С a i n R. В.—Biochem. J., 1959a, 71, 248. С art wright N. J., Cain R. В.—Biochem. J., 1959b, 73, 305. Castro T. F., В art nick i E. W.—Biochem. Biophys. Acta, 1965,
100, 384.
Castro T. F., Yoshida Т.—J. Agr. Food Chem., 1971, 19, 1168. Chacko C. J., Lockwood J. L., Zabik M,—Science, 1966,
154, 893. Chambers С W., Thabak H. Н„ К a bier P. W.—Wat. Poll.
Contr. Fed., 1963, 35, 1517. Channon H. J., Mills G. Т., W i 11 i a m s R. Т.—Biochem. J.,
1944, 38, 70. Chmielowski J., Zabuzek S., Kusznik W., Wasilew-
ski W. Stresz. nadesl. donies. XVI z-du Polsk. Tow. Mikro-
biol. Lublin, 1967. Collins J. A., Langlois В. Е,—App., Microbiol., 1968, 16,
799.
Cook R.—Water Res., 1968, 2, 849. Cooke W. В.—Mycopathol. Mycol. Appl., 1962, 18, 225. Co оке W. B. 1956.—Цит. по Pike F. В., Curds С R., 1971. Co оке W. В., 1965,—Цит. по Т о e r i e n D. F., H a 11 i n gh W. A. J ,
1969.
С о о к e W. В., Н i r s h A.— Sew. Ind. Wast., 1958, 30, 138. Cooke W. В., Ludzack F. J.—Sew Ind. Wast., 1958, 30, 1490. Cooke W. В., Moore W. А., К abler P. W.—Sew. Ind. Wast.,
1956, 28, 1075. Cooke W. B, Phaff H. J., M i 11 e г M, W., S h i f r i n e M
Knapp E. P.—Mycologia, 1960,52,210.
Cox D. P., Alexander M.— Bull. Environ. Contam. and Toxico!.,
1973, 9, 84.
Crabtree K., McCoy E.—Int. J. Syst. Bacteriol., 1967, 17. 1. С r a b t r e e K., McCoy E., Boyle W. C, R о I i с h G. A.—
Appl. Microbiol., 1965, 13, 218. Crabtree K., Boyle W., McCoy E., Rohlich G. A.—
Wat. Poll. Contr. Fed., 1966, 38. Curtis E. J. C— Water Res., 1969, 3, 289. Cyrus Z., Sladka A.— Hydrobiologia, 1970, 35, 383. Dagley S., Evans W. C, R i b b о n s D. W.—Nature, 1960, 188,
4750, 560.
Davis E. M., Gloyna E. F.—J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1969, 41, 1494.
DeineraaM. H.— Appl. Microbiol., 1972, 24, 857.
De la Haba G.—Science, 1950, 112,203.
Dias F. F., Bhat J. V.—Appl. Microbiol., 1964, 12, 412.
Dutton P. L., Evans W. C—Biochem. J., 1969, 113, 525.
D u x b u г у J. M., T i e d j e J. M., Alexander M., Daw-son J. E.—J. Agr. Food Chem., 1970, 18, 199.
E garni F., Ebata M., S a t о R.—Nature, 1951, 167, 118.
Engelbrecht R. S., McKinney R. E.—Sew. Ind. Wast., 1957, 29, 1350.
Engelhardt J. P., Grun L,—Arch. Hyg. Bacteriol., 1969, 153, 433.
Engelhardt G., Wallnofer P. R., Plapp R.— Appl. Micro biol., 1971, 22, 284.
Engelhardt G., Wallnofer P. R., Plapp R —Appl. Micro biol., 1972, 23, 664.
Evans W. C— Biochem. J., 1947, 41, 373.
Evans W. C, Smith B. S. W,—Biochem. J., 1951, 49, 1, X.
Evans W. C, Smith B. S. W,—Biochem. J., 1954, 57, XXX.
F a r r D. R., С a i n R. В.— Biochem. J., 1968, 106, 879.
Feist С F., He gem an G. D.—J. Bacteriol., 1969, 100, 869
Feldman A. E — Sew. Ind. Wast., 1957, 29, 539.
Fillipi G. M., Vennes J. W.—Appl. Microbiol., 1971, 22, 49.
Fleming R. W., Alexander M.— Appl. Microbiol., 1972, 24 424. ■ •■-
F о с h t D. D.— Bacteriol. Proa, 1970, 8.
Focht D. D., Williams T. D.—Can. J. Microbiol., 1970, 16, 309.
Focht D. D., Alexander M.—Appl. Microbiol., 1970,20, 608
Focht D. D., Alexander M.~J. Agr. Food Chem. 1971 19, 20.
Fouts J. R., Brodie В. В.—J. Pharmacol. Exptl. Therap 1957 119, 197.
Fowler G. J., A r d e г n E., L о с к e 11 W. Т.— Proc. Roy. Soc , 1911, Ser. B, 83, 149.
French A. L., Hoopingarner R. A.—J. Econ. Entomol., 1970, 63, 765.
Friedman B. A., Dugan P. R., 1968.— Цит. по Parsons А. В ,
Dugan P. R., 1971. Friedman B. A., Dugan P. R., Pfister R. M., Rem-
s e n С. С— J. Bacteriol., 1968, 96, 2144. F r i e d r i с h H.— Arch. Microbiol., 1956, 25, 297. Furukawa К., Suzuki Т., Tonomura К.—Agr. Biol. Chem.,
1969, 333, 128.
Fuiukawa K., Tonomura K.— Agr. Biol. Chem., 1972a, 36,
Suppl. 2441. Furukawa K., Tonomura K.— Rept. Ferment. Res. Inst., 1972b,
42, 45. Ganapati S. V., A m i n P. M.—J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1972,
44, 769. G a n n J. D., С о 11 i e г R. E, Lawrence С H.— J. Wat. Poll.
Contr. Fed., 1968, 40, 185.
Gaunt J. K., E va ns W. C—Biochem. J., 1961, 79, 25. G eh m H. W.—J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1963, 35, 4. Gibson D. T, Koch J. R., S с h u 1 d С L, К a 11 i о R. E.—
Biochemistry, 1968, 7, 3795.
Gingell R., Walker R.— Xenobiolica, 1971, 1, 231. Gottlieb D., Carter H. E., Robbins H. E., В u r g R. W.—
J. Bacteriol., 1962, 84, 888.
Granville G. D., Stern K. G.— Biochem. J., 1935, 29, 487. Grossman A., Grudzieii J., Slepowronski J.—Koks —
Smola —Gaz, 1965, 10, 249.
Groves K., Chough K. S.—J. Agr. Food Chem., 1970, 18, 1127. Gundersen K-, J e n s e n H. L.— Acta Agric. Scand., 1956, 6, 100. Gutenmann W. H., L i s к D. J.—J. Dairy Sci., 1967, 50, 1516. Halls N. A., Board R. G —J. Appl. Bacteriol., 1973, 36, 465. Harmann L, Singrun M. E —Wat. Sew. Wks, 1968, 115, 289. Harper D. В., Blakley E. R.—Can. J. Microbiol., 1971, 17, 1015. Harris F. W., Cockburn Т., Anderson T.— Waterworks,
1927, 66, 24. Hattingh W. H. J., Kotze J. P., Thiel P. G., Toerl-
e n D. F., S i e b e r t M. L,— Water Res., 1967, 1, 255. Hawkes H. A. The Ecology of Waste Water Treatment. Oxford,
Pergamon Press, 1963. Hayaishi O., Hashimoto K.—J. Biochem. (Tokyo), 1950, 37,
371. Hegeman G. D., Rosenberg S. L.— Ann. Rev. Microbiol,
1970, 24, 499.
Heukelekian H., Heineman В.—Sewage Wks J., 1939 11 436.
Heukelekian H., Littman M. L— Sewage Wks J., 1939, 11 752.
Heukelekian H., Rand M— Sew. Ind. Wast., 1955, 27.
Heukelekian H., Schulhoff H. В.—Sewage Wks J., 1938 10 43.
Hey man J. J., M о 1 о f A. H.—J. Wat. Poll. Contr. Fed 1967 39, 50.
Hey man J. J., M о 1 о f A. H.—Env. Science Technol., 1968, 2 773
Hobson P. N.— Proc. Biochem., 1973, 8, 19.
Hob son P. N., Shaw B. G.— In: Microbial Aspects Pollut Lon don—New York, 1971, 103.
Holm H. W, Vennes J. W.—Appl. Microbiol., 1970, 19, 988.
Horvath R. S.—Biochem. J., 1970, 119, 871.
Horvath R. S., Alexander M.—Appl. Microbiol., 1970a. 20, 254.
Horvath R. S., Alex a n der M.—Can. J. Microbiol., 1970b, 16,
1131.
Horvath R. S.—J. Agr. Food Chem., 1971, 19, 291. Horvath R. S., Koft B. W.—Appl. Microbiol., 1972, 23, 407. Huddleston R. L., Allred R. C—Devs Ind. Microbiol., 1963,
4, 24.
Hughes D. E.— Biochem. J., 1965, 96, 181. Hungate R. E — Bact. Rev., 1950, 14, 1. Imura N.. S u к e g a w a E., Pan S. K., N a g а о К., К i m J. Y.,
К w a n Т., U к i t а Т.— Science, 1971, 172, 3989, 1248. Itagaki E., Fujita Т., Sato R.—J. Biochem. (Tokyo), 1963,
53, 389. Iturriaga R., Rheinheimer G.— Kiel. Meeresforsch., 1972,
28, 213.
Jackson R. A., Waters W. A.—J. Chem. Soc, 1960, 1653. Jacob F., M о n о d J.— In: V-th Int. Congr. Biochern. Moskow,
Symp. I, Preprint 91, 1961.
Jacubowska J., Nowakowska-Waszczuk A.—Acta mi crobiol. Polon., 1967, 16, 227.
J a n i с к e W.— Gas und Wasser Fach., 1968, 109, 1181. Janota-Bassalik L., Olczyk C, Kaczozowska M.—
Acta microbiol. Polon, 1969, BI, 31. Jensen H. L—Acta Agric. Scand., 1960, 10, 83. Jensen H. L.—Acta Agric. Scand., 1963, 13, 404. J e n s e n H. L., P e t e r s о n H J.— Nature, 1952, 170, 39. Jensen H. L., Gundersen K.— Nature, 1955, 175, 341. Jensen H. L., Lautrup-Larsen G.— Acta Agric. Scand., 1967,
17, 115.
Jensen S., Jernelov A.— Nature, 1969, 223, 5207, 753. Johnson В. Т., Goodman R. N., Boldberg H. S,— Science,
1967, 157, 360. Johnson В. Т., Knowles С. О.—Bull. Env. Contam. Toxicol.,
1970, 5, 158. Jones G. L., Carrington E. G.— J. Appl. Bacteriol., 1972, 35,
395.
J о у с e G. H., D u g a n P. R.— Devs Ind. Microbiol., 1970, 11, 377. Kader S. M.— In: Stresz. nadesf donies. XIV z-du Polsk. Tow.
Mikrobiol. Lublin, 1967, 341.
Kallman B. J., Andrews A. K.— Science, 1963, 141, 1050. Kaneko Tatsuhiko, Kitamura Кипре i, Yamamoto
Yasushi,—J. Gen. Appl. Microbiol., 1969, 15,317. Kanska Z.—Verh. Int. Ver. Theoret. Angew. Limnol., 1966, 16, 911. К а р о о r J. P., M e t с a 1 f R. L., N у s t г о m R. F., Sang-
ha G. K.—J. Agr. Food Chem., 1970, 18, 1145. Kato Ikinori, Izaki Kazuo, Takahashi Hajime — J.
Gen. Appl. Microbiol., 1971, 17, 439. Kato K., Fukumura Т.— Chem. Ind., 1962, 25, 1146. Kaufman D. D., Kearney P. C—Appl. Microbiol., 1965, 13, 443. Kearney P. C—J. Agr. Food Chem., 1965, 13, 561. Keefer С E., Buck T. C, H a t с h H.— Sew. Ind. Wast., 1953
25, 1174. Keefer C.E., Buck T. C, H a t с h H.— Sew. Ind. Wast., 1953, 25,
1406. KirchgessnerN. H.— Sew. Ind. Wast., 1958, 30, 191.
Kir sen E. J.—Devs Ind. Microbiol., 1969, 10, 170.
Kirsch E. J., Sykes R. M.—Progr. Ind. Microbiol., 1971, 9, 155.
Kiuchi K., Kuraishi H., Murooka H., A i d a K-, U e m u -
ra T.—J. Gen. Appl. Microbiol., 1968, 14, 387. K1 u c z y c k i K.— Acta microbiol. Polon., 1959, 8, 165. Ko W. H., Lock wood J. L.—Can. J. Microbiol., 1968, 14,
1069. Kobojasi Miticharu, Kawamura Acuo, Oi Sotaro,
Micami Kodzi, Murata Knomi, Kunigasa Yosi-
chiro, Kavasugi Tataaki — Bull. Japan Soc. Scient. Fish,
1969, 35, 1021.
Koch J. R., K a 11 i o R. E.— Biochemistry, 1968, 7, 2653. K o t z e J. P., T h i e 1 P. Q., T o e r i e n D. F., H a 11 i n g h W. H J.,
Siebert M. L—Water Res., 1968, 2, 195. Kramer H. P.— J. Amer. Wat. Wks Assoc, 1965, 57, 3. Kra.zel Z., Kosinkiewicz B.—Acta microbiol. Polon., 1972,
4,3. Krzemieniewska H., Krzemieniewski S.— Bull. Int. Acad.
Polon. Sci., Cl. Sci. Math. Nat., 1937, B. I, 11. Kucharski J., Sterniriski A.—Gaz, Woda i Techn. Sanit.,
1960, 34, 439.
K ii s t k a M.— 1961— Uht. no Zdybiewska M., 1968 Lackey J. B., W a 11 i e E.— Sewage Wks J., 1940, 12, 669. Land a S.—Gaz, Woda i Techn. Sanit., 1959, 33, 431. Langlois B. E.. Collins J. A.—J. Dairy Sci., 1970, 53, 1666. Lanzilotta R. P., Pramer D.—Appl. Microbiol., 1970a, 19, 301. Lanzilotta R. P., Pramer D.—Appl. Microbiol., 1970b, 19, 307. Leadbetter E. R., Foster J. W.— Arch. Biochem. Biophvs
1959, 82, 491. Leclerc E., Beanjean P.—Bull. cent. Beige Etude Doc Eaux
1952 17 152
Lespera nee T. W.—Wat. Wast. Eng., 1971, 8, A-13. Lichtenstein E. P.— J. Econ. Entomol., 1957, 50, 545. Lighthart B., Loew G. A.—J. Wat. Poll. Contr. Fed, 1972,
41, 2078. Lighthart B., Oglesby R. T.— J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1969
41, R267.
Little H. N.— J. Biol. Chem., 1957, 229, 231. Lode O.—Acta Agr. Scand., 1967, 17, 140. L o o s M. A., B o 11 a g J. M., Alexander M.— J. A<?r Food
Chem., 1967, 15, 858.
Lorenz M.—Chem. Techn., 1963, 15, 167.
Loveless J. E., Painter H. A.—J. Gen. Microbiol., 1968 52 1 Luri a S. E., Del b ruck M.—Genetics, 1943, 28, 491. Lutin P. A.—J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1970, 42, 1632 Lynn G. E., Powers T. Y.— Sew. Ind. Wast., 1955, 27, 61. McRae J. C, Alexander M., Rovira A. D — J Gen Micro biol., 1963, 32, 69. McRae J. C, Edwards J. F., Davis N.~Appl Microbiol
1973, 25, 991.
Madhosingh C— Can. J. Microbiol., 1961, 7, 553. Mah R., 1969,—Uht. no Kirsch E. J., Sykes R. M., 1971.
Mah R Chynoweth D. P., 1969.-Uht. no Kirsch E. J., Syk'es R. M., 1971.
m « u i I R__Ant van Leeuw., 1954, 20, loo.
M l.ne G W- J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1960, 32, 1300.
M a 1 o n e T h." C - Nature, 1970, 227, 848.
M a r 1 i n J.— Crobs and Soils, 1966, 18, 9.
Martins J., D r e w s B.- Chem.-Zeit., 1966, 90, 7.
M a s s i n i R.- Arch, fur Hyg., 1907, 61.
Matsumura F., Boush G. M.— Science, 1966, 153, 1278.
F, Boush G. M.—Science, 1967, 156, 959.
F Boush G. M.—J. Econ. Entomol., 1968, 61, 610.
F Boush G. M., Tai A.—Nature, 1968, 219, 965.
F, Pa til K. C, Boush G. M.—Science, 1970,
F., Pa til K. C, Boush G. M.—Nature, 1971,
K. C, Bo*
Matsumura Matsumura Matsumura Matsumura
170, 1206. Matsumura
230, 325. Matsumura F., Khanvilkar V. G., Patil
ush G. M.—J. Agr. Food Chem., 1971, 19, 27. McElroyW. D., Spenser D.— In: Inorganic Nitrogen Meta bolism. Johns Hopkins Press, Baltimore, 1956. McKinney R. E.— Sew. Ind. Wast., 1952, 24, 117. McKinney R. E. Biological Flocculation. Treatment of Sewage and /• Industrial Wastes. New York, 1956. (McKinney R. E., Horwood M. P.—Sew. Ind. Wast., 1952,
24, 117. McKinney R. E., Weichlein R. G.—Appl. Microbiol., 1953,
1, 259. McKinney R. E., Symons Y. M.—Sew. Ind. Wast., 1959, 31,
549.
M e i s s n e r B.— Wasserwirt.-Wassertechn., 1955, 3, 470. Mendel J. L., W a 11 o n M. S.— Science, 1966, 151, 1527. M i g u 1 a W. System der Bakterien, 2, 1900. Mills C, C h i 1 d J. J., S p e n c e r J. F. T.— Ant. van Leeuw^
1971, 37, 281. : Mitchell K. Water pollution Microbiology. New York — London—,
Sydney —Toronto, 1972. ■ '•
Molina J. A. E., Alexander M.-J. Bacteriol., 1971, 105, 489. Mudrack K — Gas und Wasserfach, 1971, 112, 33. M u n j k o I.— rtojionp. h uiyMap., 1972, 18, 29.
Mylroie R. L, H u n g a t e R. E.— Can. J. Microbiol., 1954, 1, 55. N a s o n A.— In: Inorganic Nitrogen Metabolism. Johns Hopkins
Press. Baltimore, 1965, 109.
Neuberg C, Reinfurth E.— Biochem. Z., 1923, 138, 561. Neuberg C, Welde E.— Biochem. Z., 1914a, 60, 472. Neuberg C, Welde E.— Biochem. Z., 1914b, 62, 470. Neujahr H. G., V a r g a J. M.—Eur. J. Biochem., 1970, 13, 37. Nei Nisabur o.— XaKKO KoraKy fl3accn.— J. Ferment. Technol...
1972, 50, 536; P}KE, 1973, 4B 1091. Painter H. A.— J. Gen. Microbiol., 1954, 10, 177. Painter H. A.— Water Res., 1970, 4, 393.
Painter H. A., Hopwood A. P.— Rep. Progr. Appl. Chem,
1969, 54, 405. P a 1 a t y J.- Sb. Vys. Sk. Chem. Technol., 1958, 2, 259. P a r k e D. V.— Biochem. J., 1961, 78, 262.
Parker V. H.— Biochem. J., 1952, 51, 363.
Parsons A. B., Dugan P. R.—Appl. Microbiol., 1971, 21, 657.
Pas veer A.—J. Wat. Poll. Confr. Fed., 1969, 41, 1340.
Pateman J. A., R e v e r B. M., Cove D. J.—Biochem. J., 1967,
104, 103. P a t i 1 K. C, M a t s u m u r a F., B o u s h G. M.— Appl. Microbiol.,
1970, 19, 879.
Pavvlaczyk M.— Acta microbiol. Polon., 1965, 14, 207. Pawlaczyk-Szpilowa M.—Zesz. nauk. Polit. Wrocl., I. S.,
1965, 1, 3.
Payne W. J., Feisal V. E.—Appl. Microbiol., 1963, 11, 339. P e r 1 m a n n D.— Adv. Appl. Microbiol., 1965, 7, 103. Peter G., Wuhrmann K., 1971.—Uht. no Pike F. B.,
Curds C. R., 1971. Petrycka H., Kluczycki K.—Zesz. nauk. Polit. Slask., I. S,
1962, 64 (4), 43.
Phaup J. D.—Water Res., 1968, 2, 597.
Pichinoty F., Mucchielli A., Pelatan C— Arch. Micro biol., 1970, 70.
Pike F. B., Curds C. R.—In: Microbiol. Aspects Pollut. Lon don—New York, 1971, 123.
Pipes W. O.—Adv. Appl. Microbiol., 1966, 8, 77. Pipes W. O., Jones P. H.—Biotechnol. Bioeng., 1963, 5, 287. P1 a p p F. W., Chapman G. A., Morgan J. W.— J. Econ.
Entomol., 1965, 58, 1064. Pollack V. A., Anderson D. A —Appl. Microbiol., 1970, 20,
727.
Porges N.—Adv. Appl. Microbiol., 1960, 2, 1. Prakasam T. B. S., Dondero N. C— Appl. Microbiol., 1967,
15, 461. Prakasam T. B. S., Dondero N. C—Appl. Microbiol., 1967a
15, 1122. Prakasam T. B. S., Dondero N. C—Appl. Microbiol 1970
19, 663. Probst G. W., Golab T., Her berg R. J., Holzer F. J.,
Parke S. J., Schans C. V., Tepe J. B.—J. Agr Food
Chem., 1967, 15, 592.
Raghu K., McRae J. C— Science, 1966, 154, 263. R a i s t r i c k H., S t 6 s s 1 A.— Biochem. J., 1958, 68, 647. Rao B. V., B h a t J. V — Biochem. J., 1972, 128, P38. Rao S. S., Washington D. R.—Appl. Microbiol., 1968, 16, 942 Richardson L. T. S., Miller D. M.—Can. J. Bot 1966 38
163. ' '
R i e c h e A., H i 1 g e t a g G., Martini A., Lorenz M.— Wass-
erwirt-Wassertechn., 1962, 12, 27.
Riesen V. von.— Trans. Kansas Acad. Sci., 1955, 58, 337. Ripin M. J., Noon K. F., Cook T. M.—Appl. Microbiol., 1971, >E 21, 49. Rogers M. R., Kaplan A. M.—J Wat. Poll. Contr. Fed., 1970,
42, R263.
Roinestad F. A., J a 11 I.—Appl. Microbiol. 1970 19,973 Ruchhoit C, C, Wat kins J. H.—Sewage Wks J., 1928, 1, 52.
Ruchhoft C. C, Kachmar J. F.—Sewage Wks j., 1941, 13, 3.
Russel P.—Nature, 1955, 176, 4493, 1123.
S a z A. K, S 1 i e R. B.— J. Biol. Chem., 1954a, 210, 407.
Saz A K, Slie R. B.—Arch. Biochem. Biophys., 1954b, 51, 5.
Saz A. K., Martinez L. M.—J. Biol. Chem., 1956, 223, 285.
Scheline R. R., Nygaard R. T., Longberg B.— Food Cosmef.
Toxicol., 1970, 8, 55.
S c h o f i e 1 d T.— J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1971, 70, 32. Schroeder E. D., Bush A. W.—J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1968.
40. Part 2, R445. Sethunathan N, Bautista E. M., Yoshida T.— Can. J.
Microbiol., 1969, 15, 1349. Sharabi N. E., Bordeleau L. M.—Appl. Microbiol., 1969. 18,
369. Shargel L, Akov S h., Mazel P.—J. Agr. Food Chem., 1972,
20, 27. Siddiquellah M., McGrath R., Vining L. C, Sala F.,
West lake D. W. S.—Can. J. Biochem., 1967, 45, 1881. Siebert M. L, Hattingh W. H. J.—Water Res., 1967, 1, 13. S i e b e r t M. L., Toerien D. R, H a 11 i n g h W. H. J.— Water
Res., 1968, 2, 545.
Siebert M. L, Toerien D. F—Water Res., 1969, 3, 241. Simpson J.R, Evans W. C—Biochem. J., 1953, 55, XXIV. Sletten O., Singer R. H.—J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1971, 43,
2118.
Smith G. N, Worrel C. S.—Arch. Biochem., 1949, 24, 216. Smith G. N., Worrel C. S.—Arch. Biochem., 1950a, 28, 232. Smith G. N., Worrel C. S.— Arch. Biochem., 1950b, 28, 1. Smith G. N., Worrel C. S.—J. Bacteriol., 1953, 65, 313. Smith P. N.— Devs Ind. Microbiol., 1966, 7, 156. Smith P. H., Hungate R. E.—J. Bacteriol, 1958, 75, 713. Spangler W. J, Spigarelli J. L.—Appl. Microbiol., 1973,
25, 488.
Standard P. D, Ah earn D. G.—Appl. Microbiol., 1970, 20, 646. StutzenbergerF. J., Bennett E. O.— Appl. Microbiol, 1965,
13, 570.
S t a n i e r R. Y.— J. Bacteriol, 1947, 54, 339. S t a n i e r R. Y.— Bact. Rev, 1950, 14, 179. Stanier R. Y, Palleroni N. J, Doudoroff M.— J. Gen.
Microbiol, 1966, 43, 159.
Stanier R. Y, Doudoroff M, Ad el berg E. A. Gene ral Microbiology. London, 1971.
S t a s i a k M.— Gaz, Woda i Techn. Sanit, 1967, 41, 276. Stevenson I. L.— Cgn. J. Microbiol, 1967, 13, 205. S t o 1 p H.— Naturwiss, 1968, 2, 57.
Stolp H, Petzold H.— Phytopathology, 1962, 45, 364. Strzelczyk E, Donderski W, Lewosz W.— Acta micro biol. Polon, 1972, B4, 191. Sunaga Takashi, Arai Taketoshi. Hhxoh cafiKHHraKy fl3ac-
ch — Japan. J. Bacteriol, 1972, 27, 809; P>KB, 1973, 7B 699. Sussman C. H.—J. Milk and Food Technol, 1969, 32, 379. Takashi F u k u mu r a — Plant and Cell Physiol, 1966, 7, 93. Teutenberg A.— Arch. Microbiol, 1964, 48, 21. Tezuka Yasuhiko — Appl. Microbiol., 1969, 17, 222.
T h i e 1 P. G., T o e r i e n D. F, H a 11 i n g h W. H. J., K o t z e J. P., S i e b e r t M. L.— Water Res., 1968, 2, 391.
Tiedje J. M., Alexander M.—J. Agr. Food Chem., 1969, 17, 1080.
Tiedje J. M., Duxbury J. M., Alexander M., Daw-son J. E.—J. Agr. Food Chem., 1969, 17, 1021.
Timonin M. J.— Sci. Agr., 1946, 26, 122.
Toerien D. F.—Water Res., 1967, 1, 55.
Toerien D. F., H a 11 i n gh W. H. J.—Water Res., 1969, 3, 385.
Toerien D. F., Siebert M. L., H a 11 i n gh W. H. J.—Water Res., 1967, 1, 497.
Toerien D. F., Thiel P. G., Hat Singh W. H. J.—Water Res., 1968, 2, 505.
Tomlinson T. C— J. Soc. Chem., Ind., 1942, 61, 53.
Tomlinson T. G., H a 1 1 H.—Inst. Sew. Purif. J., 1950, 4,
Tonomura K., Furukawa, K., Yamada M.— In: IV-th Ferment. Sympos. (Abstracts). Kyoto, Japan, 1972, 104.
K., Kanzaki F.—Biochem. Biophys. Acta, 1969,
338. Int.
Tonomura
227. Tonomura
184,
K., Naka garni T.. F u t a i F, Maeda K.—Natu re, 1968a, 217, 5129, 644. Tonomura K., Nakagami T., Futai F., Maeda K.—
J. Ferment. Technol., 1968b, 46, 506. T o s a T., C h i b a t a J.— J. Bacteriol., 1965, 89, 9199. Tranter E. K., C a i n R. B.— Biochem. J., 1967, 103, 22. Ueda S., Earle R. L.—J. Gen. Appl. Microbiol., 1972, 18, 239. Unz R. F., Farrah S. R.—Appl. Microbiol., 1972, 23, 524. Villanueva J. R.— J. Gen. Microbiol., 1959, 20, VI. Villanueva J. R.— J. Biol. Chem., 1964, 239, 773. W a k s m a n S. A., S t o c k e s I. L., B u 11 e r M. R.— J. Marine
Biol. Assoc, 1936—1937, 21. Walker R., Gingell R., Murrels D. F,—Xenobiotica, 1971, 1,
221.
W a 11 n 6 f e r P.— Weed Res., 1969, 9, 333.
Wallnofer P. R., Bader J.—Appl. Microbiol., 1970, 19, 714. W a 11 i e E.— Sewage Wks J., 1943, 15, 476. Wedemeyer G.— Science, 1966, 152, 647. Wedemeyer G.— Appl. Microbiol., 1967a, 15, 569. Wedemeyer G.— Appl. Microbiol., 1967b, 15, 1494. Wester field W. W., Ri chert D. A., Higgins E. S.—J.
Biol. Chem., 1957, 227, 379.
Westfall B. B.—J. Pharmacol. Exptl. Therap., 1943, 79, 23. Westlake W. E., Gunther F. A.— In:. Organic Pesticides in
the Environment. Symp. 150th Meeting Amer. Chem. Soc, 1966,
110. Westlake D. W. S., Vi n i n g L. C—Biotechnol. Bioeng., 1969,
11,1125. Westlake D. W. S., S a 1 a F., M c G r a t h R., V i n i n g L. C—
Can. J. Microbiol., 1968, 14, 587.
W i 11 e t s A. J., Cain R. B.— Biochem. J., 1970, 120, 28P. Williams P. P.— Bacteriol. Proc, 1967, 67, 8. Winogradsky H.—C. r. Acad. Sci. (Paris), 1935, 200, 1886.
Winter W., S t a r k e W., K r u g e r W., J a n e t z k i E.— Fortschr. Wasserchemie, 1971, 13, 33.
Wood J. M., Kennedy F. S., Rosen C. G.—Nature, 1968, 220, 5163, 173.
Wu T. T., Lin E. C. C, T a n a k a S.—J. Bacteriol., 1968, 95, 447.
W u h r m a n n K.— Adv. Appl. Microbiol., 1964a, 6, 119.
Wuhrmann K.— In: Principles and Applications in Aquatic Mi crobiology. New York, 1964b.
WursterCh. F.— Science, 1968, 159, 1474.
Yall I., Sinclair N. A., B o u g h t o n W. H., Knudsen R. C, Lafferty W. C—Chem. Eng. Progr. Symp. Ser, 1971, 67, 95.
Yamada M., Tonomura K.— Rept. Ferment. Res. Inst., 1972a,
42, 37. Yamada M., Tonomura K.—J. Ferment. Technol., 1972b, 50,
159. Yamashina I., Shikata S., E garni F.—Bull. Chem. Soc.
Japan, 1954, 27, 42.
Yasuhiko T —J. Wat. Poll. Contr. Fed., 1973, 45, 1, 531. Y u - C h i h Hsu.— Nature, 1963, 200, 4911. Yule W. N., Chibs M., Morley H. V.—J. Agr. Food Chem..
1967, 15, 1000.
Z a m b o n e 11 i C.— Ann. Microbiol. Enzimol., 1958, 8, 27. Zdybiewska M.—Zesz. nauk. Polit. Slask., Chemia, 1963, 88, 3. Zdybiewska M.— Post, mikrobiol., 1968, 7, 161.
Оглавление
Предисловие............... 3
Введение................ 5
Глава I. Микрофлора, участвующая в очистке окружающей .
среды от органических загрязнителей ..... 8 V
Глава II. Систематика, строение и физиологическая актив ность микроорганизмов-деструкторов..... 38- ^
Глава III. Приспособительная изменчивость бактерий ... 79 /
Глава IV. Микробное разрушение фенолов....... 101
Глава V. Разрушение галоидорганических соединений мик роорганизмами .............. 115
Глава VI. Деструкция синтетических органических соедине ний азота................ 140
Глава VII. Микробное разрушение серусодержащих соедине ний .................. 175
Глава VIII. Трансформация металлорганических веществ . . 187
Заключение............... 193
Литература............... 199
Предметный указатель........... 216
Указатель латинских названий микроорганизмов . 219
2. как в прошлом так и в настоящем
3. Вариант 12 1 Какие бывают двери по количеству полотен а внутренние;
4. тематизований звід правил що дозволяють здійснювати соціальну роботу розумно діяти на
5. разному интерпретируются отдельными отраслями социального знания что обусловливает относительность и про
6. ТЕМА-волейбол
7. где фиксированное число а произвольное натуральное число члены некоторой числовой последовате
8. Практический навык- оценка биохимического исследования крови Общий билирубин ~ 205 мкмоль-л Прямой ~ 170 м
9. Роль религии в современном мире
10. МЭО Группа 105220 Отчет о выполнении лабораторной работы 4 по дисциплине КИТ ВСТАВК
11. Ростовский государственный экономический университет РИНХ Факультет Юридический
12. Страхование товара и коммерческого риска
13. The Blck Deth.html
14. Рок Боттом Римейндерс
15. ESTEL Color System засвоєння технологій застосування даних продуктів
16. 6 Введение
17. Реферат- Растровий відбиток
18. МЭРИ КЭЙ Новый гаджет для очистки кожи это не просто щеточка1
19. это принципиальный фактор вашего роста
20. тема национальных счетов