Широко используются для выявления возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний определ
Работа добавлена на сайт samzan.net:
Вопрос 43: Иммунологические методы
Это диагностические лабораторные методы, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для выявления возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний, определения гормонов, беременности, видовой принадлежности белков, опухолевых антигенов, диагностики аутоиммунных болезней, для определения групп крови и совместимости переливаемой крови. Иммунологические исследования позволяют не только идентифицировать различные вирусные, бактериальные или паразитарные заболевания, но также определять титры антител к ним, что позволяет оценивать устойчивость организма к отдельным видам инфекционных болезней и прогнозировать их развитие. С помощью иммунологических методов изучают иммунитет по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.
В основе этих методов исследований лежит реакция «антиген-антитело» с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в сыворотке крови (в пробирке) различными методами.
Антиген - это вещество, которое «узнается» организмом животного как чужеродное, и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию. Антигенами могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразиты, а также любые другие вещества из внешней или внутренней среды (пыльца растений, белки трансплантатов тканей и органов, поверхностные белки клеток крови при ее переливании и другие соединения). В некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов. Одним из главных способов, с помощью которого организм защищается от проникновения антигенов, является выработка антител.
Антитела (иммуноглобулины — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) - это белки, которые образуются клетками организма животного в ответ на внедрение в него антигена. Антитела образуются против не всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившие название антигенных детерминант. Наиболее важным свойством антител является их способность специфически (то есть избирательно) связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело «узнает» и связывается только с одним определенным антигеном. Кроме этого возможно получение искусственным путем антител, которые будут специфически связываться с другими антителами, что широко используется для создания различных диагностических тест систем. Сыворотка крови, содержащая антитела к другим антителам называется антисывороткой.
Таким образом, высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки. На этой уникальной особенности антител и основаны все иммунологические методы анализа.
С помощью иммунологических исследований решаются две основные задачи:
- Определение антигенов. Когда неизвестным компонентом реакции является антиген. Для его обнаружения в исследуемом материале используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие высокоспецифичные антитела, которые были получены от животных после их вакцинации определенными антигенами.
- Определение антител. В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препаратами, используемыми в качестве антигена в иммунологических или, как их еще называют, серологических реакциях). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных к примененному антигену.
При исследовании антител к инфекционным заболеваниям, например к лептоспирозу или токсоплазмозу, достоверные результаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала анализируют кровь больного, взятую в первые дни заболевания. Затем, через 10 – 14 дней, изучают повторную пробу и на основании динамики нарастания антител ставят окончательный диагноз.
Иммунологические реакции протекают в две фазы:
- Специфическое связывание антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут.
- Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов антиген-антитело. Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов.
Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс.
В зависимости от механизма и учета результатов иммунологические методы исследования подразделяют на: реакции, основанные на явлении агглютинации; реакции, основанные на явлении преципитации; реакции с участием комплемента; реакции нейтрализации, реакции с использованием химических и физических методов (иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализы).
Реакция агглютинации.
В этой реакции антигенами являются крупные частицы - микробные клетки, эритроциты, лейкоциты и т.д., которые склеиваются антителами и выпадают в осадок на дно пробирки в виде иммунных комплексов в форме хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом. Это возможно благодаря особенностям строения молекулы антител, которые имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух “ветвей”. Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены. Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок. На этом основано определение групп крови и совместимости переливаемой крови перед гемотрансфузией, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности.
При диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух направлениях:
- определяют вид выделенного от больного животного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки, содержащей специфические антитела;
- обнаруживают антитела в сыворотке больного животного, используя стандартный микробный диагностикум, включающий антигены. Титром агглютинирующей сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.
Для обнаружения лептоспироза у животных и человека используют реакцию микроагглютинации (РМА), которую проводят на специальных планшетах в микрообъемах. При этом легко наблюдать образование клеточного осадка на дне лунки.
Отличаясь чувствительностью, реакция агглютинации также используется для идентификации антител к растворимым, мелкодисперсным антигенам. В этом случае она называется реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА). Для этого антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах или частицах латекса. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки крови, содержащей антитела к данному антигену.
Реакция преципитации.
Преципитация или осаждение иммунных комплексов происходит вследствие взаимодействия антител с растворимыми антигенами. В результате чего происходит их агрегация, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Различные разновидности реакции преципитации проводят либо в жидкой среде, либо чаще всего в твердых гелях агара. Метод, основанный на реакции преципитации, также называется методом иммунодиффузии.
Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки, вырезанные в агарозном геле, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации. Этот метод используется для диагностики инфекционного гепатита у животных.
Иммунологические методы с использованием химических и физических меток.
Эти методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, и нашли широкое применение в лабораторной диагностике болезней животных и человека.
Иммунофлюоресцентный анализ основан на использовании антител меченных флюоресцирующими веществами (флюорохромами). Меченые антитела связываются с антигеном, образуя иммунные комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Этот метод часто используют в иммуногистохими, т.е. для определения локализации антигена в клетках и тканях. При этом можно установить распределение антигена в тканях и клетках. С другой стороны иммунофлуоресценция позволяет обнаружить антитела, направленные к известному антигену данной ткани или клетки. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа: прямой, непрямой и конкурентный.
Вопрос 44:Биохимические методы
Биохимические методы в лабораторной диагностике наследственных болезней применяются с начала XX века. Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях больного) отражают сущность болезни более адекватно, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте. Значимость биохимических методов повышалась по мере описания наследственных болезней и совершенствования этих методов (электрофорез, хроматография, спектроскопия и др.).
Биохимические методы направлены на выявление биохимического фенотипа организма. Уровни, на которых оценивается фенотип, могут быть разными от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в моче или поте, поэтому биохимические методы чрезвычайно многообразны и их значение в диагностике наследственных болезней постоянно возрастает. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики наследственных болезней частично «отодвинула» интерес к биохимическим исследованиям, но вскоре стало ясно, что в большинстве случаев указанные методы дополняют друг друга, поскольку молекулярно-генетически описывается генотип, а биохимически — фенотип, а болезнь — это в конечном счёте фенотип. Несмотря на сложность, а иногда и дороговизну, биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственных болезней. Современные высокоточные технологии (жидкостная хроматография, масс-спект- рометрия, магнитная резонансная спектроскопия, бомбардировка быстрыми нейтронами) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни.
На первый взгляд может показаться, что самым точным методом диагностики является определение мутации на уровне ДНК. Однако это не всегда так. Реализация действия гена — сложный процесс, поэтому наличие «нормальной» структуры гена, а точнее, необнаружение мутации не всегда является полной гарантией нормального биохимического фенотипа.
Принципы биохимической диагностики наследственных болезней менялись в процессе развития генетики человека и биохимии. Так, до 50-х годов диагностика была направлена на поиски специфических для каждой болезни метаболитов в моче (алкаптонурия, фенилкетонурия). С 50-х до 70-х годов упор в диагностике был сделан на выявление энзимопатий. Разумеется, поиски метаболитов в конечных реакциях при этом не исключались. Наконец, с 70-х годов главным объектом при диагностике стали белки разных групп. К настоящему времени все эти объекты являются предметом биохимической диагностики.
Необходимо подчеркнуть, что биохимические методы (в отличие от цитогенетических) многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Объектами биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фиб- робласты, лимфоциты). При использовании просеивающего метода в биохимической диагностике можно выделить два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из этих уровней может быть разнообразно «нагружен» реакциями в зависимости от возможностей лаборатории.
Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы выявить здоровых индивидов и отобрать индивидов для последующего уточнения диагноза. В таких программах первичной диагностики в качестве объектов используются моча и небольшое количество крови. Программы первичной биохимической диагностики наследственных болезней могут быть массовыми и селективными Массовые просеивающие программы в диагностике фенилкетонурии, врождённого гипотиреоза, адреногенитального синдрома, врождённых аномалий развития нервной трубки и болезни Дауна описаны в главе 10.
Первый этап программы включает качественные и количественные тесты с мочой и кровью (14 тестов) на белок, кетокислоты, цистин и гомоцистин, креатинин, ионы аммония и др. Второй этап основан на методах тонкослойной хроматографии мочи и крови для выявления аминокислот, фенольных кислот, моно- и дисахаридов и других соединений. С помощью электрофореза мочи выявляют глико- заминогликаны.
Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорождённых являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное состояние, остановка роста. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретённых функций, специфическая для какой-либо наследственной болезни клиническая картина).
Вопрос 45: Онтогенетический метод.
Онтогенетический метод позволяет изучать закономерности проявления признаков в процессе развития. Целью метода является ранняя диагностика и профилактика наследственных заболеваний. Метод основан на биохимических, цитогенетических и иммунологических методах. На ранних стадиях постнатального онтогенеза проявляются такие заболевания как фенилкетонурия, галактоземия, Витамин -Д- резистентный рахит, своевременная диагностика которых способствует профилактическим мероприятиям, снижающих патологию заболеваний. Такие заболевания как сахарный диабет, подагра, алкаптонурия проявляются на более поздних стадиях онтогенеза. Особое значение метод имеет при изучении активности генов, находящихся в гетерозиготном состоянии, что позволяет выявлять рецессивные сцепленные с Х-хромосомой заболевания. Гетерозиготное носительство выявляется с помощью изучения симптомов заболевания (при анофтальмии - уменьшение глазных яблок); с помощью нагрузочных тестов (повышенное содержание фенилаланина в крови у больных фенилкетонурией); с помощью микроскопического исследования клеток крови тканей (скопление гликогена при гликогенозах); с помощью прямого определения активности генов
Вопрос 46:Метод генетики соматических клеток
Культивирование, клонирование, селекция и гибридизация соматических клеток
Метод генетики соматических клеток основан на размножении соматических клеток в искусственных условиях и позволяет анализировать генетические процессы в отдельных клетках и использовать их для изучения генетических закономерностей целостного организма. Благодаря быстрому размножению на питательных средах соматические клетки могут быть получены в количествах необходимых для анализа. Они успешно клонируются, давая генетически идентичное потомство. Разные клетки могут, сливаясь, образовывать гибридные клоны. Они легко подвергаются селекции на специальных питательных средах. Все это позволяет использовать культуры соматических клеток, полученные из материала биопсий (кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбриона) для генетических исследований человека. При этом используются следующие приемы: культивирование, клонирование, селекция, гибридизация. Клонирование позволяет получить достаточное количество клеточного материала для цитогенетических, биохимических, иммунологических и других исследований. Клонирование (получение потомков одной клетки) дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов. Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора клеток с определенными мутантными свойствами или другими характеристиками. Гибридизация соматических клеток представляет собой слияние совместно культивируемых клеток разных типов, образующих гибридные клетки со свойствами обоих родительских видов. Для гибридизации могут использоваться клетки разных индивидов, а также клетки животных. Гибридные клетки, содержащие два полных генома, при делении могут утрачивать хромосомы одного из видов. Таким образом, можно получить клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность изучать сцепление генов и их локализацию в определенных хромосомах. Методы генетики соматических клеток позволяют изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Предоставляют возможность лучше представить патогенез на биохимическом и клеточном уровнях. Развитие этих методов определило возможность точной диагностики наследственных болезней в пренатальном периоде.
Вопрос 47:Молекулярно-генетические методы
Молекулярно-генетический метод
Молекулярно-генетический метод основан на анализе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул ДНК. Основной целью этих методов является диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также выявление гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации. По-существу, молекулярная диагностика является наиболее объективным методом верификации наследственных заболеваний. Важно подчеркнуть, что нахождение мутаций в гомозиготном или гетерозиготном состояниях соответственно при рецессивных или доминантных заболеваниях является бесспорным подтверждением диагноза. Однако в тех случаях, когда мутации не удается обнаружить, решающее заключение при постановке диагноза сохраняется за клиницистом, так как используемые на практике методы молекулярной диагностики чаще всего не позволяют идентифицировать все возможные мутации в исследуемом гене.
Внедрению молекулярно-генетической методологии в клиническую практику способствовала разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК, произошедшая более 20 лет назад. Первооткрыватель этого метода Керри Мулис за свое изобретение был удостоен Нобелевской премии в 1993 году. Метод ПЦР позволяет тестировать состояния генов у отдельных индивидуумов. Его суть заключается в избирательном копировании in vitro небольшого фрагмента гена, в котором предположительно может быть локализована мутация, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК обследуемого. Небольшие размеры копируемого (или амплифицируемого) фрагмента гена в сочетании с их огромным числом позволяют в дальнейшем использовать очень простые методы для анализа этого участка ДНК, выявления его особенностей у обследуемого пациента. Главными из этих методов являются электрофорез амплифицированной ДНК, ее окрашивание, разрезание специфическими ферментами – рестриктазами, и определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента - секвенирование.
ПЦР лежит в основе ДНК-диагностики любых наследственных заболеваний. Данный подход широко используется и для анализа генетических факторов риска, предрасполагающих к развитию широко распространенных мультифакториальных заболеваний. В случае молекулярной диагностики инфекций амплифицируется фрагмент ДНК, специфичный для определенного возбудителя, а затем с помощью электрофореза и окрашивания на ДНК тестируется наличие этого фрагмента, а значит и самого возбудителя, в том биологическом образце, который был взят для анализа. Использование ПЦР в судебной медицине основано на амплификации высоко изменчивых областей генома, позволяющих проводить идентификацию личности – метод геномной дактилоскопии.
Преимуществом ДНК-диагностики по сравнению с биохимической или иммунологической диагностикой является использование унифицированного набора методов, практически не зависящего от целей проводимого исследования. Это методы выделения ДНК, ПЦР, электрофорез, рестрикция ДНК, гибридизация со специфическими ДНК-зондами и секвенирование. Таким образом, в пределах одной лаборатории можно заниматься ДНК- диагностикой широкого спектра заболеваний. Остановимся более подробно на ключевых методах молекулярной диагностики.
Выделение ДНК. Прежде всего, необходимо помнить, что основная масса ДНК находится в ядрах в составе хромосом в суперскрученном состоянии за счет взаимодействия с определенными белками. Таким образом, ДНК можно выделять из любого типа тканей или клеток, в которых содержатся ядра. Существует много модификаций методов выделения ДНК. Мы разберем только принципиальные основы одного из этих методов. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего производят забор из вены от 1 до 5 мл крови. Кровь нужно собирать в присутствии антикоагулянтов. После отстаивания крови отбирают слой, обогащенный лейкоцитами, и добавляют детергенты для разрушения мембраны клеток. С помощью мягкого центрифугирования осаждают ядра на дно пробирки. Сливают надосадочную жидкость, и к суспензии ядер добавляют детергенты, разрушающие их мембраны, а также протеолитические ферменты, разрушающие белки. Чаще всего используют протеиназу К. Таким образом ДНК выходит в раствор. На следующем этапе необходимо отделить фракцию высокомолекулярных ДНК от низкомолекулярных соединений, таких как фрагменты белков, липиды, углеводы и т.п. Одним из способов такого разделения является экстракция фенолом. При добавлении фенола и тщательном перемешивании низкомолекулярные соединения перейдут в фенол, который окрасится при этом в бурый цвет за счет присутствия фрагментов гемоглобина, а молекулы ДНК останутся на поверхности фенола, так как не смогут войти в этот плотный раствор. Светлый раствор над фенолом, содержащий ДНК, отбирают и проводят несколько раундов повторных очисток фенолом с добавлением на последних этапах хлороформа. Затем можно осадить ДНК из раствора, добавляя этанол. При 700 спирта ДНК выпадает в осадок в виде аморфного образования. В таком состоянии ее можно длительно хранить при низких температурах.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация ДНК это избирательный синтез in vitro большого количества копий (порядка миллиона) небольшого фрагмента ДНК размером, обычно, в сотни нуклеотидов по матричной молекуле ДНК. Для проведения ПЦР необходимо искусственно синтезировать небольшие однонитевые молекулы ДНК размером от 15 до 30 нуклеотидов, комплементарные концам амплифицируемого фрагмента ДНК. Эти молекулы носят название праймеры. Они служат «затравкой» для синтеза ДНК и потому определяют его специфичность. ПЦР проводится в специальных одноразовых пробирках в очень небольшом объеме, не превышающем, обычно, 50 мкл. В этот объем определенного буфера добавляют матричную ДНК (ДНК обследуемого), два типа искусственно синтезированных на коммерческой основе праймеров, фермент комплементарного синтеза ДНК – термофильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильных бактерий и потому способную выдерживать высокие температуры, и 4 типа дезокситрифосфатов (dNTP), которые служат в качестве строительного материала для синтеза ДНК.
На первом этапе матричную ДНК переводят в однонитевую форму путем нагревания раствора выше 950 в течение нескольких минут. Затем начинают циклически чередовать три кратковременные процедуры, длящиеся несколько десятков секунд: (1) отжиг или посадка праймеров - это происходит при охлаждении раствора до температуры, оптимальной для образования двунитевой структуры матричной ДНК с праймерами; (2) синтез ДНК, начиная с праймера – это происходит при повышении температуры раствора до значений, оптимальных для работы термофильной ДНК-полимеразы и (3) денатурация синтезированной ДНК – достигается повышением температуры раствора свыше 900 для перехода ДНК в однонитевую форму. Затем все повторяют, начиная с процедуры (1). Таким образом, при каждом цикле смены температур, происходит удвоение участка ДНК, расположенного между праймерами, причем длина этого участка в точности соответствует расстоянию между внешними концами праймеров. После проведения 25-30 подобных циклов количество вновь синтезированных фрагментов ДНК достигает или даже превышает миллион копий. Выбор программы смены температур и длительности каждой из процедур цикла, наряду с выбором праймеров и буфера, зависят от длины и специфики амплифицируемого фрагмента ДНК. Эти параметры и определяют искусство проведения ПЦР, и очень часто они подбираются эмпирически. Циклическая смена температур производится автоматически в приборе, который называется амплификатор ДНК или термоциклер. Таким образом, ПЦР простой в исполнении, не дорогостоящий, высокоточный и современный метод молекулярной диагностики.
Электрофорез ДНК принципиально не отличается от белкового электрофореза. Амплифицированную ДНК наносят на полиакриломидный или агарозный гель и включают ток. При этом начинается продвижение ДНК в геле от минуса к плюсу, и скорость этого продвижения зависит от длины молекулы и ее конфигурации. Через определенное время молекулы ДНК одинаковой длины сконцентрируются в узких зонах. Количество копий синтезированных в процессе проведения ПЦР ДНК, обычно, бывает достаточным для ее визуализации при использовании рутинного метода окрашивания ДНК этидиумом бромидом. При добавлении этого красителя к гелю полосы ДНК высвечиваются красным цветом при просмотре геля под ультрафиолетовой лампой.
Существует много модификаций ПЦР, удобных для проведения специфических исследований. Так, одномоментно можно амплифицировать не один, а несколько фрагментов ДНК – мультиплексная или множественная ПЦР. Асимметричная ПЦР позволяет вести преимущественный синтез одной цепи ДНК. Вводя специфические красители в праймеры можно оценивать количество копий амплифицированных фрагментов ДНК на автоматическом сканере – количественная ПЦР. Очень мощным является метод ПЦР в реальном времени. На базе ПЦР разрабатываются методы молекулярной цитогенетики – PRINS, количественная флуоресцентная ПЦР. Последний метод, основанный на мультиплексной амплификации повторяющихся хромосом-специфических полиморфных последовательностей ДНК, позволяет оценить количество копий специфических хромосом или их фрагментов, и он очень удобен для проведения пренатальной диагностики анеуплоидий у плода, таких как синдром Дауна, Эдвардса, Патау и др.
Молекулярная диагностика мутаций или ДНК-диагностика. Клинические методы молекулярной диагностики зависят от характера повреждения гена, то есть от типа мутации. Наиболее просто диагностируются структурные внутригенные мутации – делеции и инсерции, так как они изменяют длину, а значит, и электрофоретическую подвижность амплифицируемого фрагмента ДНК. Для диагностики таких мутаций достаточно провести ПЦР с использованием специфических праймеров и электрофорез, а затем сопоставить длину амплифицированного фрагмента ДНК в норме и у больного. У гомозигот по делеции размер амплифицированного фрагмента будет короче на величину делеции, а значит, этот фрагмент при электрофорезе будет двигаться быстрее и расположится ниже нормального. У гетерозигот на электрофореграмме будут два фрагмента – один нормальной величины и другой более короткий. Аналогично диагностируются инсерции, только длина амплифицированного фрагмента у мутантных гомозигот будет больше, а сам фрагмент на электрофореграмме будет располагаться выше нормального. У гетерозигот на электрофореграмме также будут два фрагмента – нормальной величины и длинный, то есть расположенный выше нормального.
Для диагностики более протяженных внутригенных делеций удобным является метод мультиплексной ПЦР с последующим электрофоретическим разделением маплифицированных фрагментов ДНК.
Молекулярная диагностика точковых мутаций миссенс- или нонсенс-типа более сложна, так как длина амплифицированного фрагмента при этом не меняется. Наиболее распространенным методом диагностики таких мутаций является метод рестрикционного анализа. Этот метод может быть использован только в тех случаях, когда мутации случайным образом изменяют последовательности, специфичные для узнавания рестриктазами - эндонуклеазами, катализирующими разрезание двунитевых последовательностей ДНК в местах локализации этих специфических сайтов. Для диагностики таких мутаций достаточно провести ПЦР, рестрикцию амплифицированного фрагмента ДНК с использованием специфической эндонуклеазы и электрофорез. При наличии в норме сайта рестрикции произойдет разрезание амплифицированного фрагмента и на электрофореграмме будет две полосы, соответствующие фрагментам ДНК, суммарная длина которых равна величине исходного амплифицированного фрагмента. Исчезновение сайта рестрикции в результате мутации приведет к тому, что у мутантных гомозигот разрезания амплифицированного фрагмента не произойдет и на электрофореграмме будет одна полоса, причем характер ее расположения будет аналогичен тому, который можно наблюдать после электрофореза до рестрикции. У гетерозигот выявятся все три полосы, одна из которых соответствует неразрезанному амплифицированному фрагменту, а две – продуктам рестрикции. В настоящее время идентифицировано более 500 различных рестриктаз, и для каждого из этих ферментов существует свой сайт узнавания. Поэтому, как только описывается какая-то новая мутация, сразу же с помощью определенной компьютерной технологии производится анализ окружающей ее нуклеотидной последовательности на предмет выявления сайтов рестрикции. Если этот поиск оказывается успешным, клиническая диагностика подобной мутации проводится методом рестрикционного анализа с использованием специфичной для данного сайта эндонуклеазы. Поскольку метод рестрикционного анализа очень прост и удобен в исполнении, существует много модификаций этого метода, направленных на искусственное введение сайтов рестрикции и т.п. Однако на них мы останавливаться не будем.
Универсальным методом диагностики точковых мутаций является метод аллель-специфических олигонуклеотидов (АСО). Этот метод основан на гибридизации амплифицированных ДНК со специфическими олигонуклеотидными ДНК-зондами. Он более трудоемок, так как требует синтеза и специфического мечения ДНК-зондов. Однако этот метод поддается автоматизации, и на его базе разрабатываются технологии, позволяющие одновременно тестировать десятки или даже сотни мутаций. При этом используются микрочиповые технологии, то есть меченные олигонуклеотиды в микроколичестве наносятся на твердые носители (чипы), а затем проводится их гибридизация с исследуемыми образцами ДНК.
Сходная технология – «микроэррей» – используется для анализа экспрессионного профиля генов, то есть множества генов, избирательно экспрессирующихся в специфических тканях или клетках, у пациентов с определенными патологическими состояниями, различающихся по возрасту, этнической принадлежности и другим параметрам. Техника «микроэррей» позволяет одновременно анализировать экспрессию десятков тысяч генов.
Секвенирование ДНК является самым объективным методом регистрации мутаций, при котором точно идентифицируется молекулярный характер повреждения. Однако в клинической практике этот метод используются редко в виду его трудоемкости и высокой стоимости.
Вопрос 48:Пренатальная диагностика наследственных заболеваний
Пренатальная диагностика наследственных и хромосомных заболеваний
В настоящее время одним из самых приоритетных направлений в медицинской генетике является пренатальная диагностика (ПД) наследственных и врожденных заболеваний. Каждый врач должен иметь представление об этом направлении. В задачи ПД входят: (1) выявление у плода тяжелой наследственной или врожденной патологии; (2) выработка рекомендаций по тактике ведения беременности; (3) медико-генетическое прогнозирование будущего потомства; (4) помощь в проведении новорожденным своевременных профилактических и лечебных мероприятий.
Для непосредственной оценки состояния плода наиболее эффективным и общедоступным методом является ультразвуковое исследование (УЗИ), позволяющее оценивать анатомическое развитие плода. ВПР при УЗИ выявляется более чем в 90% случаев. В настоящее время рекомендуется проведение УЗИ 3 раза – в 10-14, 19-22 и 32-34 недели беременности. При первом УЗИ определяется точный срок беременности, размеры плода, наличие грубых пороков развития. На этом сроке можно выявить анэнцефалию, отсутствие конечностей и другие грубые аномалии развития. Считается, что почти все анатомические дефекты плода формируются уже к 18-22 неделям. Обследование на этом сроке в высшей степени ответственно. При обнаружении ВПР у плода беременная должна быть направлена в медико-генетический центр, где работают высоко квалифицированные специалисты по ВПР у плода. Данные УЗИ в 32-34 недели беременности имеют значение для тактики ведения родов, указывая положение плода и т.д.
Несмотря на высокую разрешающую способность УЗИ, для большинства наследственных болезней этот метод диагностики оказывается неэффективен и используется инвазивная (от латинского слова invasio – проникновение) ПД. Инвазивная ПД основана на получении и анализе биологического материала плода – биоптата хориональной оболочки (метод хорионбиопсии), плаценты – плацентоцентез, амниотической жидкости –амниоцентез и крови из пуповины плода – кордоцентез. С диагностической целью хорионбиопсию проводят с 10 по 14 недели беременности, плацентоцентез или амниоцентез – с 14 по 20, кордоцентез – с 20 недели. Получение плодного материала заключается в следующем. Под контролем ультразвукового сканирования оператор специальной иглой, закрепленной в датчике-фиксаторе, через брюшную стенку проникает в хорион, плаценту, амниотическую полость или в пупочную вену и отсасывает (аспирирует) небольшое количество материала плода. Характер процедуры зависит от срока беременности. При хорион- или плацентобиопсии оператор аспирирует в иглу 15-20 мг ворсинок плодного места или хориона, амниотической жидкости получают не более 10 мл и крови – 1-1,5 мл. Этого материала вполне достаточно для проведения всех необходимых цитогенетических, молекулярных, биохимических и серологических исследований.
Самой распространенной причиной рождения детей с ВПР или с поражением легочной, сосудисто-сердечной и других систем является наличие у беременной внутриутробных инфекций бактериального, а чаще вирусного происхождения. По данным ИАГ им. Д. О. Отта РАМН частота генитального хламидиоза у беременных женщин составляет 25%. Риск передачи инфекции ребенку равен 40-70%. Примерно 6-7% новорожденных оказывается инфицированными хламидиями. Это ведет за собой поражение легких (воспаление легких), сердца (воспаление сердечной мышцы, так называемый миокардит), головного и спинного мозга (менингоэнцефалит) и т.д. Очень серьезным осложнением менингоэнцефалита может быть детский церебральный паралич и/или эпилептическая болезнь. Хотя и редко, но влекут за собой рождение ребенка с серьезными поражениями нервной системы цитомегаловирусная и токсоплазменная инфекции. Поэтому женщина, предполагающая стать матерью, непременно должна обследоваться на наличие генитальных инфекций и при их обнаружении проходить соответствующее лечение.
Большую угрозу для здоровья будущего ребенка представляет краснуха. Если женщина перенесла это вирусное заболевание в первом триместре беременности, то риск рождения у нее ребенка с поражением слуха (глухотой), зрения (катарактой) и сердца (врожденным пороком) – так называемой триадой Грэгга – составляет 50%. Этот риск хотя и уменьшается, но остается достаточно высоким в случае заболевания женщины на более поздних сроках беременности (25% – во втором и 7-10% – в третьем триместре беременности). Практически всегда при этом наблюдается поражение головного мозга и отставание психического развития ребенка.
Известно, что все люди делятся на две группы в отношении резус-принадлежности. 85% - резус положительные Rh(+), то есть имеют в крови белок, называемый резус-фактором. Остальные 15% его не имеют и являются резус-отрицательными – Rh(-). В том случае, если у резус-отрицательной женщины муж резус-положительный, то с вероятностью 25-50% и ребенок окажется с положительной резус-принадлежностью, то есть возникнет резус-конфликт между плодом и матерью. В главе 2.4 мы уже подробно писали об этиологии, патогенезе и профилактике резус-конфликта.
Каждая женщина с отрицательным резус-фактором должна знать о существовании противорезусного гама-глобулина. Применение этого препарата при резус-положительном плоде предотвращает формирование резусных антител в крови матери и далее гемолитической анемии у плода. Последнее вызывает развитие билирубиновой энцефалопатии с формированием у ребенка детского церебрального паралича с развитием эпилептиформноподобных судорог и глубокого отставания психического развития. Каждая женщина с отрицательной резус-принадлежностью должна знать о существовании анти-Д-иммуноглобулина, а также должна быть информирована специалистом (врачом-генетиком или гинекологом) о показании и методе применения этого препарата в своем конкретном случае. Напомним еще раз, что будущие родители должны знать свою группу крови по Rh и АВ0 системам. Женщина с Rh(-) непременно должна обсудить с врачом-генетиком проблемы профилактики рождения ребенка с ВПР.
В настоящее время во всем мире и у нас в стране проводится ПД хромосомных и некоторых моногенных заболеваний, причем только в тех семьях, в которых риск рождения больных детей заведомо повышен. Чаще всего, это те семьи, в которых уже имеется ребенок с тяжелым наследственным заболеванием. В этом случае целью ПД является предотвращение повторного рождения больного ребенка.
Пренатальная диагностика хромосомных болезней
ПД хромосомных болезней может проводиться на любом сроке беременности по анализу кариотипа плода. С возрастом беременной резко увеличивается риск рождения ребенка с хромосомной патологией. Повышен этот риск и у юных физиологически незрелых беременных. Если у женщин в возрасте до 30 лет вероятность рождения ребенка с хромосомной болезнью составляет, в среднем, 1 на 1000, то среди 40-летних женщин этот риск возрастает почти в 8 раз. Поэтому возраст беременной женщины является показанием для проведения ПД хромосомных болезней у плода. В развитых странах такая диагностика проводится всем женщинам старше 35-38 лет. Иногда причина рождения ребенка с хромосомной болезнью связана с присутствием сбалансированной хромосомной перестройки (транслокации) у одного из родителей больного. В этом случае при каждой беременности сохраняется высокий риск рождения больного ребенка, достигающий 10%, если сбалансированная транслокация присутствует у матери, и около 3% - при наличии хромосомной перестройки у отца. В подобных семьях обязательно рекомендуется проводить ПД хромосомных болезней плода и, в первую очередь, синдрома Дауна.
Мы уже упоминали, что частота синдрома Дауна составляет 1 на 700 новорожденных. При нормальном кариотипе родителей повторный риск иметь ребенка с синдромом Дауна у женщин, находящихся в возрасте от 20 до 30 лет невелик и, обычно, не превышает 1%, к 35 годам он увеличивается в два раза, а затем и в большее количество раз. Несмотря на это, наибольшее количество больных с синдромом Дауна рождается у женщин, находящихся в оптимальном детородном возрасте, так как доля женщин, решающихся завести ребенка в возрасте старше 35 лет, а тем более, старше 40 лет относительно невелика. Поэтому усилия многих специалистов были направлены на разработку простых и безопасных диагностических тестов, позволяющих отбирать для проведения ПД те семьи, в которых риск рождения детей с хромосомной патологией повышен. И такие тесты были найдены, хотя все они не доказывают наличие хромосомной патологии у плода, а лишь могут служить показаниями для проведения инвазивной ПД. Оказалось, что плоды с синдромом Дауна характеризуются некоторыми морфологическими особенностями (такими как отсутствие назальной косточки и утолщение воротникового пространства), которые могут быть выявлены при проведении УЗИ на сроке 10-13 недель беременности. Кроме того, при подобной патологии плода в крови беременной женщины могут наблюдаться количественные изменения некоторых белков. Мы уже писали об этом в предыдущей главе. Добавим только, что в первом триместре информативным является ассоциированный с беременностью белок-А, а на сроке 15-18 недель упоминавшийся выше АФП и хорионический гонадотропин человека (ХГЧ). Таким образом, при проведении в указанные выше сроки массовых УЗИ и соответствующих биохимических скринингов беременных женщин можно выявить до 90% плодов с болезнью Дауна. У нас в стране подобные обследования избирательно проводятся только в некоторых крупных городах, в первую очередь в Москве и Санкт-Петербурге. Для точного расчета риска синдрома Дауна по показателям указанных выше белков в крови беременной разработаны и широко применяются специальные компьютерные программы. При риске хромосомной патологии 0,5% и выше рекомендуется применение инвазивной ПД с целью кариотипирования плода. Таким образом, показаниями для проведения инвазивной ПД хромосомных болезней являются следующие: (1) возраст беременной 35 лет и старше; (2) наличие при предыдущей беременности ребенка (или плода) с хромосомной болезнью; (3) наличие у кого-либо из супругов или их родственников сбалансированных хромосомных перестроек; (4) наличие в предыдущей беременности ребенка (или плода) с множественными ВПР, у таких плодов более чем в 13% случаев встречаются хромосомные аномалии; (5) наличие ультразвуковых маркеров хромосомных болезней у плода; (6) риск у плода хромосомной патологии, в первую очередь болезни Дауна 0,5% и выше по результатам исследования маркерных сывороточных белков в крови матери; (7) применение женщиной или ее супругом фармакологических препаратов цитостатического действия или курсов рентгенотерапии незадолго до наступления беременности.
Вопрос 49:Генные болезни обмена веществ
Генные мутации у человека являются причинами многих форм наследственной патологии. Основные из них: генные болезни, врожденные пороки развития и заболевания с наследственной предрасположенностью.
Генные болезни проявляются наследственными дефектами обмена веществ - ферментопатиями.
Болезни с наследственным предрасположением отличаются от моногенных болезней тем, что для их проявления необходимо действие определенных факторов внешней среды.
Генные болезни обусловлены двумя видами изменений белковых продуктов. Первая группа болезней связана с качественным изменением белковых молекул, т.е. с наличием у больных аномальных белков (напр. аномальные гемоглобины), что обусловлено мутациями структурных генов. Другая группа характеризуется количественными изменениями содержания белка в клетке (повышенное, пониженное), что связано с мутациями функциональных генов (нарушение регуляции работы генов).
Вещества, накапливающиеся в результате изменения активности ферментов, либо сами оказываются токсическими, либо способствуют их образованию.
Общая частота генных болезней в популяции составляет 2-4%. Описано более 3тыс. наследственных болезней, обусловленных генными мутациями.
Генные болезни классифицируют по характеру метаболического дефекта: аминокислотного обмена, липидного, углеводного, стероидного, свертывающей системы крови, несовместимости матери и плода по антигенам групп крови (гемолитическая болезнь новорожденных), гемоглобинопатии, обмена металлов.
Болезни аминокислотного обмена. Наиболее часто встречающимися являются фенилкетонурия и альбинизм.
Фенилкетонурия - аутосомно-рецессивное заболевание в РБ встречается 1: 6000. Обусловлено наследственной недостаточностью фермента фенилаланингидроксилозы, превращающей фенилаланин (ФА) в тирозин. В случае не активности фермента, ФА не превращается в тирозин, а накапливается в сыворотке крови в больших количествах в виде фенилпировиноградной кислоты (ФПВК), которая выделяется с мочой и потом ("мышиного" запаха). ФПВК является нейротропным ядом, в результате у рожденных с заболеванием детей развивается впоследствии повышенная возбудимость и тонус мышц, судорожные эпилептиформные припадки, позже наблюдаются нарушения высшей нервной деятельности, умственная отсталость, микроцефалия. Заболевание проявляется после рождения. Для диагностики применяют тест с 10%-ным раствором хлорида железа (FeCl3), при добавлении которого в мочу появляется зеленое окрашивание. Эффективным методом лечения является диетотерапия - кормление ребенка пищей с низким содержанием фенилаланина. Лечение необходимо начинать с первых недель жизни и постоянно, в течение 7-10 лет, следить за содержанием ФА в крови. Мозг взрослого человека устойчив к высоким концентрациям ФПВК.
Альбинизм - аутосомно-рецессивное, с частотой 1:5000 1:25000. Обусловлено неспособностью меланоцитов образовывать меланин вследствие нарушения активности фермента тирозиназы. Наиболее распространенная форма глазо-кожная (кожа молочно-белая, светло-серая или светло-голубая радужная оболочка глаз, красный зрачок, чувствительность УФ-облучению, очень светлые волосы).
Алкаптонурия - аутосомно-рецессивное, довольно редкое (3-5: 1000000). Заболевание является дефектом оксидазы, катализирующей превращение гомогентизированной кислоты в ацетоуксусную и фумаровую. В результате гомогентизиновая кислота откладывается в соединительной ткани и наблюдается пигментация цвета охры (например хрящя-охроноз). Диагностика: потемнение подщелоченной мочи, а также появление оранжево-красного окрашивания при добавлении реактива Милана, содержащего ионы ртути, что подтверждает наличие в моче тирозина. Клинические проявления - в возрасте 40 лет и старше, поражение позвоночника и суставов.
Схема нарушений фенилаланинтирозинового обмена у человека ( х - мутация ).
Болезни углеводного обмена. Наиболее частыми дефектами являются неусвоение молочного сахара - галактоземия, неусвоение фруктозы - фруктоземия, пентозы - пентозурия, а также гликогенозы, сахарный диабет.
Гликогенозы.
Сахарный диабет - аутосомно-рецессивное, широко распространенное (около 4-5% гомозигот), пенетратность - 20%. Общая численность заболеваемости 1,2-1,3%. Характеризуется повышенным содержанием сахара в крови. Диагностика основана на определении глюкозы в крови, моче, активности инсулина. Острый диабет развивается при недостаточном образовании инсулина В - клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Поздно развивающееся заболевание сопровождается тучностью и атеросклерозом, лечится препаратами сульфанилмочевина.
Галактоземия - частота заболевания 1: 100 000. В основе заболевания - недостаточность фермента, расщепляющего галактозу и накопление её в крови, в разных тканях, выделение её с мочой. Позже происходит нарушение обмена глюкозы в печени, почках, головном мозге, приводящее к снижению её содержания в крови, а в моче по- являются аминокислоты (метионин, цистеин). Заболевание развивается после рождения при вскармливании молоком, с которым поступает лактоза - источник неметаболируемой галактозы. Симптомами являются: желтуха новорожденного, понос, рвота, постепенное развитие умственной отсталости, общая дистрофия, катаракта. При анализе мочи обнаруживают галактозу и белок. Раннее лечение диетой обеспечивает нормальное развитие, не лечение - гибель в первые месяцы жизни от сопутствующих инфекций или печеночной недостаточности, у выживших развиваются катаракта и умственная отсталость.
Нарушение обмена липидов. Они подразделяются на 2-е большие группы: сфинголипидозы и нарушение обмена липидов плазмы крови, обусловленные демиелинизацией нервных волокон (рассеянный склероз).
Все сфинголипидозы имеют аутосомно-рецессивный тип наследования (режесцепленный с Х-хромосомой). Это болезни внутриклеточного накопления сфинголипидов (разновидности гликолипидов). Оно обусловлено дефектом ферментов, катализирующих их расщепление. Напр. инфальтильная амавротическая семейная идиотия Тея-Сакса (частота 1:5000). Сфинголипиды являются важнейшими структурными компонентами клеточных мембран, в частности миелиновых оболочек нервных волокон, поэтому при их нарушении поражается серое и белое вещество головного мозга. Болезнь характеризуется прогрессирующими умственными и двигательными расстройствами вследствие изменений в головном мозге. Смерть наступает в 3-4 года.
Нарушение обмена липидов в плазме крови обусловлено нарушениями ферментов или клеточных рецепторов. Липиды плазмы представляют группу соединений, в основном жирных кислот, триглицеридов, холестерина и фосфолипидов часто развиваются ксантомы кожи, прогрессирует атеросклероз. Реальная форма лечения - ограничение количества жирных кислот в продуктах питания.
Болезни стероидного обмена. Представлены адреногенитальным синдромом, который наследуется как аутосомно-рецессивное заболевание с частотой 1:5000 - 1:67000. У девочек заболевание проявляется в форме псевдогермафродитизма, а у мальчиков - преждевременной вирилизацией. Синдром обусловлен врожденной гиперплазией надпочечников и наследственным дефектом биосинтеза стероидных гормонов коры надпочечников из-за снижения активности ферментов синтеза гормонов. В моче обнаруживается большие количества андрогенных 17-кетостероидов. Исходный пол определяется по половому хроматину в клетках буккального эпителия.
Нарушение обмена пуринов. К таким заболеваниям относится подагра. Это аутосомно-доминантное заболевание с пенетратностью 20% у мужчин и почти полным непроявлением у женщин. Болезнь развивается в пожилом возрасте в виде отложения уратов в тканях и возникновение воспалительных реакций. Примерно у 1-2% людей имеется наследственно обусловленное асимптоматическое нарушение пуринового обмена, которое выражается в торможении обмена мочевой кислоты и повышении содержания её в организме из-за ослабленного её почечного выделения.
Болезни свёртывающей системы крови. Они представлены гемофилиями А, В, С.
Гемофилия А - сцепленное с полом рецессивное заболевание. Обусловлено дефектом 8 фактора свертывания крови (антигемофильного глобулина). Ген расположен в длинном плече Х-хромосомы. Клинически проявляется на 2-3 году жизни. Для него характерны множественные гематомы. Преобладают кровоизлияния в крупные суставы конечностей, подкожные и внутримышечные гематомы кровотечения притравмах, наличие крови в моче. Болеют лица мужского пола.
Гемофилия В - сцепленное с полом рецессивное заболевание. Обусловлено дефектом фактора 9 (плазменного компонента тромбопластина). Болеют лица мужского пола. Клинические проявления также как при гемофилии А. Встречается в 10 раз реже, чем первая.
Гемофилия С - аутосомно-доминантное, обусловленное резким изменением антигемофильного глобулина (фактора 8) и снижением активности фактора, необходимого для сохранения целостности стенок сосудов. Наблюдается умеренная склонность к кровотечениям.
Гемоглобинопатии - заболевания, связанные с нарушением структуры молекулы гемоглобина. Большую часть структурных вариантов Нв состовляют одиночные замены аминокислот, в основе которых лежит замена одного азотистого основания другим с изменением кода триплета.
Наиболее известной формой аномалии гемоглобинов является серповидно-клеточная анемия, при которой в 6-ом положении В-цепи гемоглобина глутаминовая кислота замещена валином (НbS). Эта обуславливает пониженную растворимость гемоглобина, и у гомозигот эритроциты приобретают серповидную форму. У гомозигот развивается хроническая гипоксия и анемия, приводящая к смерти за счет гемолиза эритроцитов, низкой способностью HbS переносить кислород. у гетерозигот Ss содержание гемоглобина S относительно невелико.
Талассемия - мутация глобинового гена, приводящая к уменьшенному содержанию глобинов или их полному отсутствию. Причиной L - талассемии служат полные деления гемоглобиновых L - генов ( в L цепях). Таких генов четыре, и от количества отсутствующих генов зависит тяжесть заболевания. Они расположены в 16-й хромосоме. При B - талассемиях имеется дефицит синтеза В - глобина. В гомозиготном состоянии ген летален (выраженная гемолитическая анемия).
Болезни обмена металлов. К этой группе болезней относят гепатолентикулярную дегенерацию (болезнь Вильсона). Это аутосомно-рецессивное заболевание, для которого характерно накопление меди в тканях печени, мозга, почек, роговицы, повышенное выделение меди с мочой. В почечных канальцах нарушен транспорт аминокислот глюкозы, мочевой кислоты и фосфата.
В результате генной мутации развивается дефицит фермента, тормозящего синтез белка церруллоплазмина, который обеспечивает транспорт меди в организме. Ионы меди входят в состав многих ферментов митохондрий, участвующих в реакциях окисления. При недостатке церуллоплазмина повышается концентрация меди в крови и происходит накопление её в тканях. Заболевание проявляется в школьном возрасте. Наблюдается увеличение печени, селезенки, нарушение их функций, а также ЦНС, снижение количества форменных элементов крови. Затем развивается цирроз, поражение ЦНС, снижение интеллекта. Диагностика основана на определении концентрации церуллоплазмина в сыворотке крови.
Гемохроматоз - болезнь депонирование железа с ежедневным накоплением в количестве 2-4 мг. Избыточное отложение гемосидерина в печени, сердце, эндокринных железах. Проявляется циррозом печени, пигментированием кожи, сахарным диабетом у мужчин после 35 лет, но редок у женщин. Наследование в основном доминантное.
2. Нанотехнологии
3. это метод проб и ошибок
4. Методологические основы моделирования.html
5. И оправдана премудрость всеми чадами ее.html
6. Reforms in Civil 424 PRT VI
7. католическую епархию 12 февраля ~ ВР УССР приняла Постановление о возобновлении Крымской Автономной Советс
8. Наукоучение как теоретическая философия 3
9. Audio recorder on visual basic
10. Диагностические условия повышения адаптивности
11. го года с основания Римавероятно за несколько лет до первого года той эры началом которой всецивилизованны
12. На тему- Абай Кунанбаев Подготовила- Полтушева Г
13. Из каждой пары профессий нужно указать одну предпочитаемую
14. на тему- Стратегическое управление организацией в условиях рынка Преподаватель .html
15. Разработка приложения для сопровождения лабораторной работы
16. человечков и машин ~ легко моделировать различные ситуации и находить выход из сложных положений
17. ПО ТЕМЕ ПРОЦЕНТЫ Цену товара увеличили на 20 а затем еще раз на 20
18. Music in our life. There re lot of interesting pstimes people choose to occupy themselves in their free time- coin or stmp collecting plying musicl instruments listening to music r
19. Качественные задачи
20. 10ml 750 2 Chnel 810ml 750 3