Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
70
Глава 5. Токсикодинамика
Токсикодинамика - раздел токсикологии, в рамках которого изучается и рассматривается механизм токсического действия, закономерности развития и проявления различных форм токсического процесса.
5.1. Механизм токсического действия
Взаимодействие на молекулярном уровне токсиканта с организмом, приводящее к развитию токсического процесса, называется механизмом токсического действия.
В основе механизма действия могут лежать физико-химические и химические реакции взаимодействия токсиканта с биологическим субстратом.
Токсический процесс, инициируемый физико-химическими эффектами, как правило, обусловлен растворением токсиканта в определенных компартментах клетки, ткани, организма. При этом существенно изменяются их физико-химические свойства. Так, неполярные молекулы ряда ксенобиотиков: предельных углеводородов, спиртов, эфиров, галогенированных углеводородов, низкомолекулярных циклических углеводородов - накапливаются в липидных бислоях возбудимых биологических мембран. При этом изменяются удельный объем, вязкость, проницаемость мембран для ионов и тем самым модифицируются их физиологические свойства. Кислоты, щелочи, растворяясь в водной фазе клетки, ткани, изменяют рН среды. При интенсивном воздействии это может привести к денатурации макромолекул, их разрушению.
Особенность данного типа эффектов - отсутствие специфичности в действии токсиканта. Токсичность определяется физико-химическими свойствами вещества (величиной коэффициента распределения в системе масло/вода, константы диэлектрической проницаемости, константы диссоциации и т.д.).
Чаще в основе токсичности лежат химические реакции токсиканта с определенными субстратами - компонентами живой системы.
В токсикологии (как и фармакологии) любой структурный элемент живой (биологической) системы, с которым вступает в химическое взаимодействие токсикант (лекарство) обозначают термином “рецептор”. В таком прочтении это понятие ввел в химеобиологию в начале ХХ века Пауль Эрлих (1913).
Спектр энергетических характеристик рецептор-лигандного взаимодействия необыкновенно широк: от образования слабых, легко разрушающихся связей, до формирования необратимых комплексов (см. ниже). Характер взаимодействия и структура сформировавшегося комплекса зависят не только от строения токсиканта, конформации рецептора, но и от свойств среды: рН, ионной силы и т.д. В соответствии с законом действующих масс количество образовавшихся комплексов вещество-рецептор определяется энергией взаимодействия (сродством) и содержанием обоих компонентов реакции (вещества и рецептора к нему) в биологической системе.
Рецепторы могут быть “немыми” и активными. “Немой” рецептор - это структурный компонент биологической системы, взаимодействие которого с веществом не приводит к формированию ответной реакции (например, связывание мышьяка белками, входящими в состав волос, ногтей, или растворение ДДТ в липидах вакуолей жировых клеток сальника и подкожной клетчатки). Активный рецептор - структурный компонент биологической системы, взаимодействие которого с токсикантом инициирует токсический процесс (например, активный центр цитохромоксидазы, взаимодействие с которым синильной кислотой, приводит к острому отравлению).
Как известно, в биологии термин “рецептор” используется еще и для обозначения структур, способных избирательно взаимодействовать с эндогенными молекулами-биорегуляторами (нейромедиаторами, гормонами, субстратами и т.д.) и принимающих непосредственное участие в восприятии и передаче регуляторных сигналов.
Для того, чтобы избежать терминологических трудностей, для обозначения структурных элементов организма, взаимодействуя с которыми токсикант инициирует токсический процесс, вместо термина “рецептор”, в настоящее время часто используют термин - “структура-мишень”.
Мишенями (рецепторами) для токсического воздействия могут быть:
- структурные элементы межклеточного пространства;
- структурные элементы клеток организма;
- структурные элементы систем регуляции клеточной активности.
Любая клетка, ткань, орган содержат огромное количество потенциальных рецепторов (структур-мишеней) различных типов (“запускающих” различные биологические реакции), с которыми могут вступить во взаимодействие химические вещества. Поэтому связывание токсиканта на рецепторе какого-то одного типа является избирательным лишь в определенном диапазоне его концентраций во внутренней среде. Увеличение концентрации токсиканта в биосистеме приводит не только к увеличению числа связанных рецепторов одного типа, но и к расширению спектра типов рецепторов, с которыми он вступает во взаимодействие, а, следовательно, к изменению его биологической активности. Это одно из фундаментальных положений токсикологии, доказанное многочисленными наблюдениями.
Принимаются постулаты:
- токсическое действие вещества выражено тем сильнее, чем большее количество активных рецепторов (структур-мишеней) вступило во взаимодействие с токсикантом;
- токсичность вещества тем выше, чем меньшее его количество связывается с “немыми” рецепторами, чем эффективнее оно действует на активные рецепторы (структуры-мишени), чем большее значение имеет рецептор и повреждаемая биологическая система для поддержания гомеостаза целостного организма.
Наиболее часто токсический процесс развивается в результате воздействии химических веществ на белки (повреждение структурных белков, нарушение активности энзимов), нуклеиновые кислоты, липиды биомембран, селективные рецепторы эндогенных биорегуляторов.
В результате такого воздействия клетки либо повреждаются (цитотоксическое действие), либо нарушаются механизмы регуляции их функций.
5.1.1. Химизм реакции токсикант - рецептор
Взаимодействие токсиканта со структурами-мишенями подчиняется тем же закономерностям, что и любая химическая реакция, протекающая ex vivo и, следовательно, во многом зависит от свойств вещества. Большинство высоко токсичных соединений - инертные в химическом отношении молекулы. Химически активные соединения при контакте с покровными тканями немедленно вступают с ними во взаимодействие и, вызывая лишь местные повреждения, не проникают во внутренние среды организма.
Сила межмолекулярного взаимодействия между токсикантом, проникшим во внутренние среды организма, и биологической молекулой-мишенью действует, как правило, локально; образующаяся связь способна к диссоциации. Высвободившаяся из связи с токсикантом биомишень, часто восстанавливает исходные свойства. В подобных случаях достаточно элиминировать не связавшуюся часть токсиканта из организма для того, чтобы сдвинуть химическое равновесие в сторону разрушения комплекса «токсикант-мишень», и, тем самым, устранить действие яда. Например, обратимо взаимодействуют со структурами-мишенями летучие неполярные растворители (гексан, толуол и др.), ингаляция которых сопровождается нарушением сознания, развитием наркотического эффекта.
Некоторые токсиканты образуют с молекулами-мишенями прочные комплексы, разрушить которые возможно только с помощью других средств, образующих с ядом еще более прочную связь. В частности, для восстановления активности ацетилхолинэстеразы, ингибированной фосфорорганическими соединениями (ФОС) применяют вещества из группы оксимов, вступающие во взаимодействие с токсикантами и вызывающие тем самым дефосфорилировани активного центра энзима.
Иногда в процессе метаболизма ксенобиотика в клетках образуются весьма активные в химическом отношении промежуточные продукты. При действии на биомолекулы они образуют с ними чрезвычайно прочные связи, разрушить которые практически не возможно: биомишень повреждается необратимо. Таким образом, например, иприт взаимодействует с пуриновыми основаниями нуклеиновых кислот.
Типы химических связей, образующихся между токсикантом и структурой-мишенью, и их прочность (энергия связи), представлены в таблице 10.
Таблица 10.
Различные типы связей, формирующихся между токсикантами
и молекулами-мишенями организма
|
Вид связи |
Пример |
Энергия связи (кДж/мол) |
|
Ионная |
20 |
|
|
Ковалентная |
40 – 600 |
|
|
Донорно-акцепторная |
4 - 20 |
|
|
Ион-дипольная |
8 - 20 |
|
|
Диполь-дипольная |
4 - 12 |
|
|
Водородная |
4 - 28 |
|
|
Ван-дер-Ваальса |
1 - 4 |
|
|
Гидрофобная |
1 - 6 |
Как следует из приведенных данных, наиболее прочной является ковалентная связь между токсикантом и молекулой-мишенью. Именно этот тип взаимодействия, как правило, приводит к необратимому повреждению рецептора.
5.1.2. Взаимодействие токсикантов с белками
Основными функциями белков являются: транспортная, структурная, энзиматическая. Токсический эффект может развиваться при нарушении каждой из этих функций. Особое значение имеет ингибиторное действие токсикантов на энзимы.
Угнетение активности энзимов происходит различными путями, зависящими от строения токсиканта. Возможны:
- денатурация (изменение конформации) белковой части фермента;
- блокада активных центров ферментов;
- конкуренция с коэнзимом (его связывание, истощение запасов);
- взаимодействие с аллостерическим центром;
- взаимодействие с субстратом.
- связывание активаторов ферментативной активности;
К числу веществ, денатурирующих белки, относятся крепкие щелочи, кислоты, окислители, ионы тяжелых металлов. В основе денатурации лежит нарушение внутрибелковых связей, стабилизирующих вторичную, третичную, четвертичную структуру апофермента. Наиболее часто токсиканты взаимодействуют с СООН-, NH-, OH-, SH-группами белков. Многочисленные токсиканты, взаимодействующие с SH-группами, называются тиоловыми ядами (мышьяк, ртуть, люизит).
Целый ряд высокотоксичных соединений, структурно напоминая субстрат, способны взаимодействовать с активными “центрами” энзимов, угнетая их активность. К таким веществам относятся ингибиторы холинэстеразы (ФОС, карбаматы и т.д.), ингибиторы аконитазы (метаболиты фтор-, хлоруксусной кислоты). Многие токсиканты, взаимодействуя с простетической группой энзимов, блокируют их активность. Таким способом, например, сульфиды и цианиды ингибирует цитохромоксидазу, ряд других энзимов, простетической группой которых являются железо-содержащие порфириновые структуры.
Примерами токсикантов, взаимодействующих с субстратами с образованием продуктов, ингибирующих активность энзимов, являются гидразин (взаимодействие с пиридоксалем, образование пиридоксальгидразонов, ингибиторов пиридоксалькиназы), мышьяковистая кислота (взаимодействует с фосфоглицероальдегидом - продукт ингибирует гликолиз).
Известно, что целый ряд ферментов “работает” лишь в присутствии активаторов. К числу последних часто относятся ионы металлов: Mg, Mn, Co, Zn, Cu, Ca и т.д. Удаление указанных ионов из среды сопровождается существенным снижением активности ферментов. Представителями веществ, реализующих токсическое действие по этому механизму, являются хелатирующие агенты. Наиболее токсичные представители - производные гидроксиизохинолина и дитиокарбаматы. Дитиокарбаматы связывают ион Cu, активизирующего важнейший энзим метаболизма спиртов - альдегид-дегидрогеназу. Некоторые производные дитиокарбаматов, образующие комплексы с Mn, Co, используются в качестве фунгицидов.
Поскольку подавляющее большинство процессов, протекающих в организме, имеет ферментативную природу, угнетение активности ферментов - наиболее частая причина развития интоксикаций, имеющих самые разнообразные проявления.
5.1.3. Взаимодействие токсикантов с нуклеиновыми кислотами
Дезоксирибонуклеиновые кислоты - основной компонент хромосомного аппарата клеток. Рибонуклеиновые кислоты в клетках образуют три пула - информационной, транспортной, рибосомальной РНК. Их функция - участие в синтезе белка.
К числу веществ, вступающих в химическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, относятся нитриты, сернистый, азотистый, кислородный иприты, этиленоксид, этиленимин, гидразин и его производные, гидроксиламин, нитрозамины, аренокисды, полициклические углеводороды, метаболиты афлатоксинов, соединения мышьяка, золота и многие другие вещества. Эти токсиканты, образуют ковалентные связи с аминогруппами пуриновых и пиримидиновых оснований и с углеводно-фосфатной основой молекулы нуклеиновых кислот. При этом происходит нарушение их свойств.
Многие ксенобиотики образуют нековалентные связи с ДНК. При этом меняется конформация макромолекул. Так, известно высокое сродство к нуклеиновым кислотам производных акридина, которые, встраиваясь в молекулу ДНК между соседними парами оснований (интеркалация), изменяют её структуру. Таков же, вероятно, механизм действия этидиумбромида, профлавина и др. Антрациклин, хлорахин, актиномицин и некоторые другие антибиотики также изменяют конформацию нуклеиновых кислот, не образуя с ними ковалентных связей.
Последствия повреждения ДНК и РНК зависят от дозы токсиканта и сопровождаются нарушениями процессов синтеза белка, клеточного деления и передачи наследственной информации.
5.1.4. Взаимодействие токсикантов с липидами мембран
Липиды - инертные в химическом отношении молекулы, поэтому их взаимодействие с токсикантами в основном носит физико-химический характер. Важнейшая функция липидов - формирование биологических мембран. Вещества, разрушающие, изменяющие структуру липидов, нарушающие взаимодействие между молекулами липидов (гидрофобные связи) повреждают биологические мембраны и поэтому называются мембранотоксикантами. К числу таких относятся многие спирты, предельные и галогенированные углеводороды, бензол, толуол (“неэлектролиты”), детергенты (поверхностно-активные вещества: мыла, сапонины), окислители, щелочи и другие денатурирующие агенты, а также яды обладающие фосфолипазной активностью (яды змей и т.д.). В результате нарушения структурной целостности мембран развивается деформация, лизис клеток и их гибель. При действии сапонинов на мембраны эритроцитов развивается гемолиз. Действуя в малых дозах на возбудимые мембраны нервных клеток ЦНС, органические растворители, спирты вызывают седативно-гипнотический эффект.
5.1.5. Взаимодействие с реактивными структурами возбудимых мембран
Реактивные структуры возбудимых мембран - это ионные каналы и селективные рецепторы для эндогенных биологически активных веществ (нейромедиаторов, гормонов и т.д.). Они представляют собой определенным образом организованный комплекс белковых молекул, встроенных в структуру биологической мембраны. Ионные каналы и рецепторные структуры в ряде случаев функционируют как единая система.
Выделяют следующие типы селективных рецепторов мембран:
- непосредственно формирующие ионные каналы;
- связанные с G-протеинами;
- обладающие тирозинкиназной активностью;
- образующие межрецепторные сети.
1. Рецепторы формирующие ионные каналы. К числу известных каналобразующих рецепторов относятся никотинчувствительный рецептор ацетилхолина (Н-холинорецептор), ГАМК-эргический, глицинэргический рецепторы. Первый из упомянутых является каналом для ионов Na+, два других - для ионов Cl-. Известно большое количество веществ, действующих на эти рецепторы. Например, курарин, никотин, анабазин (действуют на холинорецепторы), бициклофосфаты, норборнан, пикротоксинин (действуют на ГАМК-рецепторы), стрихнин (действует на рецепторы к глицину).
К этой же группе рецепторов возможно отнести Na+-, К+, Ca2+- каналы возбудимых мембран, для которых пока не найдены эндогенные химические агонисты. Тем не менее ионные каналы имеют рецепторную область связывания высокотоксичных ядов животного происхождения, таких как тетродотоксин, сакситоксин, батрахотоксин и др.
2. Рецепторы, связанные с G-протеинами. Особый вариант передачи регуляторных сигналов в организме на молекулярном уровне представлен механизмом взаимодействия эндогенных лигандов с рецепторами, ассоциированными с G-протеинами (регуляторными протеинами). К числу рецепторов такого типа относятся, в частности, мускаринчувствительные холинэргические рецепторы (М-холинорецепторы), и -адренорецепторы и т.д.
Функционирование системы передачи сигнала с помощью G-протеинов наилучшим образом изучено на примере -адренорецепторов (рисунок 13).
Рисунок 13. Схема проведения сигнала, через систему рецептора связанного с G-протеинами
Токсиканты могут нарушать передачу сигнала на любом из этапов его проведения, действуя на рецептор, аденилатциклазу и т.д. Например, холерный и коклюшный токсины вызывают АДФ-рибозилирование G-протеина (белка превращающего гуанозинтрифосфат в гуанозиндифосфат) после его связывания с молекулой ГТФ. В итоге развивается стойкая активация аденилатциклазы и перевозбуждение соответствующих клеток слизистых оболочек.
В настоящее время известно огромное количество веществ синтетических и естественного происхождения, избирательно взаимодействующих с рецепторами данного типа. Среди них многочисленные лекарственные средства (холинэргические, катехоламинэргические, серотонинэргические препараты), интоксикация которыми развивается как при перевозбуждении, так и блокаде рецепторов. Сюда же относится большая группа веществ, обладающих психодислептической активностью (диэтиламид лизергиновой кислоты, псилоцин, псилоцибин, буфотенин, мескалин, хинуклидинилбензилат - BZ и т.д.).
3. Рецепторы с тирозинкиназной активностью. К рецепторам данного типа относятся, в частности, рецепторы к инсулину и гормону роста. Пусковым сигналом процессов, приводящих к активации клетки, является развивающееся фосфорилирование внутриклеточных белков по молекуле тирозина. Токсиканты, избирательно действующие на данный тип рецепторов, пока не известны.
4. Рецепторы, образующие межрецепторные сети. Наилучшим образом в группе рецепторов данного типа изучены рецепторы к Fc-фрагменту (fragment crystalline) антител (иммуноглобулинов). С действием на рецепторы данного типа связывают экзоцитоз биологически активных веществ, и в частности, гистамина из тучных клеток, лежащий в основе анафилактических реакций на химические вещества, обладающие антигенными свойствами.
5.2. Общие механизмы цитотоксичности
Часто в основе токсического действия веществ лежит повреждение клеток, сопровождающееся их функциональными, либо структурно-функциональными изменения. Разнообразие формирующихся при этом эффектов со стороны целостного организма обусловлено сложностью организации клеток, многообразием клеточных форм, составляющих организм. Сформировавшиеся в процессе эволюции особенности структуры и функции отдельных клеточных типов, формирующих различные органы и ткани, настолько существенны, что чувствительность различных клеток к токсикантам может отличаться в тысячи раз. Тем не менее, живое объединено общностью фундаментальных свойств, а это позволяет выделить и некоторые общие механизмы, лежащие в основе цитотоксического действия ксенобиотиков. К числу важнейших можно отнести следующие:
- нарушение энергетического обмена;
- активация свободно-радикальных процессов в клетке;
- повреждение клеточных мембран;
- нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция;
- нарушение процессов синтеза белка и клеточного деления.
Необходимо отметить, что все эти механизмы тесно связаны друг с другом. Порой один из них является пусковым, но в дальнейшем особую значимость для судьбы поврежденной клетки приобретают другие. Очень часто два или несколько из упомянутых механизмов связаны между собой по типу “порочного круга”.
5.2.1. Нарушение процессов биоэнергетики
Жизнь клеток есть постоянный процесс синтеза сложных молекул (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов, липидов и т.д.), то есть структур с достаточно высокой энтальпией и низкой энтропией. Синтетические процессы, идущие с поглощением энергии, невозможны без одновременного протекания реакций, сопровождающихся ее высвобождением. Основным видом таких реакций в организме является гидролитическое расщепление богатых энергией веществ, содержащих пирофосфатные связи (макроэрги), таких как: аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), аденозиндифосфорная кислота (АДФ), гуанозинтрифосфорная кислота (ГТФ), цитозинтрифосфорная кислота (ЦТФ), уридинтрифосфорная кислота (УТФ), ацилфосфаты и др. В конечном итоге энергетические возможности клетки определяются запасами макроэргов, и в первую очередь - АТФ. Процессы, обеспечивающие поддержания определенного уровня АТФ в клетках организма, составляют основу и сущность энергетического обмена.
Основными элементами биологической системы, обеспечивающей образование макроэргов в организме, являются:
- механизмы доставки кислорода к клеткам;
- механизмы биологического окисления субстратов-источников энергии (ферменты цикла трикарбоновых кислот, ферменты дыхательной цепи);
- механизмы сопряжение биологического окисления и фосфорилирования молекул-предшественников макроэргических соединений (например, образования АТФ из АДФ и фосфата).
Механизмы, посредством которых токсиканты могут нарушать энергетический обмен, разнообразны.
Непрямым механизмом повреждающего действия на энергообмен является повреждение токсикантами систем транспорта кислорода в организме и понижение его парциального давления в тканях (оксид углерода, метгемоглобинообразователи).
Мышьяк, ртуть, их органические и неорганические соединения, другие тяжелые металлы, иодацетат и проч., способны взаимодействовать с сульфгидрильными группами целого ряда энзимов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот и подавлять их активность (сульфгидрильные яды). Действие таких веществ на энергообмен малоспецифично и, как правило, сопровождается нарушением и других метаболических процессов. Специфичнее действуют токсиканты - взаимодействующие с активными центрами энзимов, непосредственно регулирующих реакции биологического окисления и фосфорилирования.
Ингибирование энзимов цикла трикарбоновых кислот (ТКК) является пагубным для клетки. Так, некоторые фторированные спирты и фторкарбоновые кислоты (ингибиторы ферментов цикла ТКК), являются чрезвычайно токсичными соединениями, вызывающими смертельное отравление в дозах нескольких миллиграмм на килограмм массы.
Большое токсикологическое значение имеют вещества, действующие на цепь дыхательных ферментов. Окисление субстратов, образующихся в цикле ТКК при угнетении активности таких ферментов, прерывается и исчезает движущая сила процесса синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Токсиканты, блокирующие элементы цепи дыхательных ферментов (цианиды, сульфиды, азиды), могут в течение нескольких минут привести организм к гибели.
Некоторые вещества способны разобщать процессы биологического окисления и фосфорилирования. Такими свойствами обладают, например, 2,4-динитрофенол (ДНФ), динитро-о-крезол (ДНОК), хлорфенолы, арсенаты и др. Механизм действия разобщителей до конца не выяснен. Полагают, что они облегчают переход протонов через мембрану из митохондрий в цитоплазму. Двигателем же процесса образования АТФ из АДФ и неорганического фосфата как раз и является градиент протонов по обе стороны мембраны митохондрий, поддерживаемый реакциями биологического окисления. В результате действия “разобщителей” синтез АТФ в клетках прекращается, а образующаяся в ходе окисления субстратов энергия рассеивается в форме тепла.
Наконец еще одним механизмом нарушения энергообеспечения клетки является угнетение митохондриальной транслоказы, обеспечивающей транспорт ситезированной АТФ из митохондрий в цитоплазму. Таким образом, действует, в частности атрактилозид, вещество выделяемое из растения Distel Atractylis gummifera, произрастающего в средиземноморье.
Результатом токсического повреждения энергетического обмена клеток является нарушение их функций и гибель. Наибольшей чувствительностью к ингибиторам энергопродукции обладают клетки нервной системы, почек, миокарда.
5.2.2. Активация свободнорадикальных процессов в клетке
Некоторые ксенобиотики, попав во внутренние среды организма, подвергаются метаболическим превращениям, в ходе которых образуются промежуточные продукты (см. раздел “Биотрансформация ксенобиотиков в организме”). Многие промежуточные продукты существуют в форме свободных радикалов, т.е. в форме молекул, на внешней орбитали которых находится неспаренный электрон. Наличие такого электрона делает метаболит способным к активному взаимодействию с различными структурами-мишенями (рисунок 14).
Рисунок 14. Некоторые эффекты свободных радикалов
К числу веществ, действие которых может быть обусловлено образованием свободных радикалов, относятся иприты, фосген, четыреххлористый углерод, бенз(а)пирен, паракват и многие другие.
Способность веществ метаболизировать с образованием радикалов обычно связывают с величиной их одноэлектронного восстановительного потенциала. Соединения с высокой афинностью к электрону предрасположены к их акцепции и легко восстанавливаются системами метаболизма ксенобиотиков, в то время как вещества с низким сродством к электрону восстанавливаются биосистемами плохо. В присутствии кислорода восстановленные радикалы спонтанно окисляются до исходной формы, а затем вновь подвергаются восстановлению. Складывается своеобразный окислительно-восстановительный цикл превращения ксенобиотика. Вещества, не вступающие в окислительно-восстановительный цикл не являются источниками образования свободных радикалов в клетках. Например, хлороформ (НССl3) является слабым источником свободных радикалов из-за низкой способности к одноэлектронному восстановлению. Напротив, четыреххлористый углерод (CCl4) легко метаболизирует в трихлорметильный активный радикал (*ССl3) и инициирует каскад радикал-инициирующих реакций.
Превращения молекулы в системе окислительно-восстановительного цикла сопровождается активацией молекулярного кислород путем одновалентного восстановления последнего до супероксид-аниона (О2-*). Супероксид при взаимодействии с водой с большой скоростью дисмутирует с образованием перекиси водорода (Н2О2) и чрезвычайно активного оксиданта - гидроксильного радикала (ОН*). Эти, так называемые, вторичные радикалы представляют большую опасность для клетки, поскольку, обладая достаточной стабильностью, взаимодействуют с самыми разными биомолекулами, повреждают их и провоцируют формирование цепных реакций дальнейшего образования третичных и т.д. активных радикалов из воды, липидов, аминокислот. Интегральный эффект такого каскада радикал-инициирующих реакций приводит к значительному нарушению физиологии клетки, её повреждению (рисунок 15).
Рисунок 15. Окислительно-восстановительный цикл трансформации ксенобиотиков, сопровождающийся активацией свободнорадикальных процессов в клетке
О2* - супероксидный анион; ОН* - гидроксильный радикал
Содержание в клетке свободных радикалов жестко контролируются широким спектром как ферментативных, так и неферментативных механизмов антирадикальной защиты. Основными элементами ферментативной защиты являются: супероксиддисмутаза, каталаза, глутатион-пероксидаза, глутатион-редуктаза; неферментативной - -токоферол, -каротин, аскорбиновая кислота, восстановленный глутатион, мочевая кислота. Отдельные элементы системы защиты действуют комплексно и потенцируют эффект друг друга. Они локализуются либо в гидрофобных, либо гидрофильных компартментах клеток (например, токоферол - липофилен, глутатион, аскорбиновая кислота - гидрофилны). Результатом действия системы антирадикальной защиты клетки является превращение свободных радикалов в нереакционноспособные вещества. Однако если функционирование окислительно-восстановительного цикла превращения ксенобиотика, проникшего в организм в относительно высокой дозе, будет продолжаться в течение достаточно длительного времени, механизмы клеточной защиты могут истощиться, и произойдет повреждение клетки.
Итогом такого действия является изменение функционального состояния и гибель клетки, мутация её генетического кода, что на уровне макроорганизма приводит к явлению массивной клеточной гибели (некроз), разрастанию соединительной ткани в органе (фиброз), развитию новообразований в отдаленные периоды после действия токсиканта, тератогенезу (рисунок 16).
Рисунок 16. Активация свободнорадикальных процессов в клетках и их последствия
Характер повреждающего действия активных радикалов во многом определяется их стабильностью и расстоянием на которое они могут мигрировать от места своего образования. Наиболее реакционноспособные радикалы (винилгалогены, дигидропиридины) разрушают только образующие их энзимы. Метаболиты, обладающие меньшей реакционной способностью, способны выходить даже за пределы органов, в которых они образуются, и повреждать другие органы и ткани (метаболиты гексана, вызывает периферическую нейропатию, пирролизидиновых алкалоидов мигрируют из печени в легкие, где повреждают сосуды и т.д.).
5.2.3. Повреждение мембранных структур
Помимо непосредственного действия на липидный бислой (см. выше) возможны и иные механизмы повреждения токсикантами биомембран. К числу важнейших относятся:
- активация перекисного окисления липидов;
- активация фосфолипаз.
Активация перекисного окисления липидов. Благодаря высокому содержанию ненасыщенных связей в углеводородной цепи жирных кислот, фосфолипиды клеточных мембран наиболее предрасположены к реакции окисления, инициируемой свободными радикалами, образующимися в клетке (см. выше). Этому способствует то обстоятельство, что молекулярный кислород в 7 - 8 раз лучше растворяется в липидной фазе, чем в воде и гидрофильных сайтах клетки. Атака активных форм кислорода на ненасыщенные связи жирных кислот приводит к образованию пероксидных радикалов (“перекисное окисление липидов”) и разрушению биологических мембран. Процесс перекисного окисления сопровождается также образованием из липидов высоко реакционно-способных и легко диффундирующих карбонильных радикалов, которые могут обусловливать неблагоприятные процессы, развивающиеся в клетках далеко за пределами места своего образования не только клетки, но и органа. Хорошо кровоснабжающиеся и насыщенные кислородом ткани (легкие, сердце, головной мозг) являются более чувствительными к повреждающему действию прооксидантов.
Активация фосфолипаз. Важным механизмом повреждения биологических мембран является гидролиз фосфолипидов, наступающий вследствие активации фосфолипаз (особенно фосфолипазы A2). Активация энзима происходит в результате прямого или опосредованного (гипоксия, нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция и т.д.) действия многих токсикантов на клетки организма (рисунок 17).
В результате действия фосфолипазы А2 на липиды биологических мембран высвобождается арахидоновая кислота. Последняя является, в свою очередь, субстратом энзима циклооксигеназы. Превращение арахидоновой кислоты под влиянием энзима приводит к образованию эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов) - веществ, активирующих воспалительные процессы в тканях. Под влиянием другого энзима 5-липоксигеназы арахидоновая кислота превращается в лейкотриены и эйкозатетраеноевые кислоты - химиоатрактанты нейтрофилов, вещества, регулирующие сосудистую проницаемость.
Еще одним продуктом энзиматического расщепления липидов мембран является фактор агрегации тромбоцитов (ФАТ) - клон биологически активных веществ (более 150 аналогов) близкого строения. ФАТ чрезвычайно токсичные вещества (LD50 для кролика - 0,005 мг/кг; для собаки - 0,07 мг/кг), вызывающие при внутривенном введении шокоподобное состояние (острый, некупируемый коллапс, бронхоспазм и др.).
Рисунок 17. Образование биологически активных веществ при участии фосфолипаз, активируемых в ходе токсического процесса
Поскольку система внутриклеточных мембран также является мишенью для действия многочисленных токсикантов, среди них можно выделить группу митохондриальных ядов, повреждающих различные звенья процессов биоэнергетики, веществ действующих на шероховатый (нарушение процессов синтеза белка) и гладкий эндоплазматический ретикулум (индукция или угнетение метаболизма ксенобиотиков), лизосомальные мембраны (провоцируют аутолиз клеток) и др.
5.2.4. Нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция
Нарушение гомеостаза внутриклеточного кальция, сопровождающееся существенным повышением его концентрации в цитоплазме клетки, лежит, как полагают, в основе механизма клеточной гибели при различных патологических состояниях, в том числе при острых отравлениях. Цитотоксическое действие самых разных токсикантов (цианидов, четыреххлористого углерода, свинца, органических соединений олова и ртути, алкилирующих агентов, диоксина и т.д.), как полагают, хотя бы отчасти, связано с повышением уровня кальция внутри клеток.
В норме низкая концентрация кальция в цитоплазме поддерживается энергозависимыми механизмами его активного удаления из клетки и компартментализации в клеточных органеллах (рис. 18).
Рисунок 18. Схема регуляции ионов кальция в цитоплазме
Нарушение механизмов поддержания гомеостаза внутриклеточного кальция, как это видно из представленной схемы обмена иона, может стать следствием:
- повреждения биологических мембран и усиления их проницаемости для ионов;
- нарушения биоэнергетики клетки, приводящие к истощению запасов макроэрогов;
- изменения функционального состояния белковых комплексов (в том числе путем действия на соответствующие рецепторы), образующих каналы для Са2+.
Все эти механизмы могут приводить к усилению инфлюкса кальция из внеклеточной жидкости и его высвобождению из депо в цитоплазму клетки. Примеры веществ, повреждающих механизмы поддержания гомеостаза кальция внутри клеток, представлены на таблице 11.
Таблица 11.
Некоторые вещества, нарушающие внутриклеточный гомеостаз кальция
|
1. Высвобождение кальция из митохондрий: - динитрофенол - динитрокрезол - кадмий |
3. Усиление поступление кальция через плазматическую мембрану: - четыреххлористый углерод - 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин |
|
2. Высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума: - четыреххлористый углерод - бромбензол - перекиси - альдегиды |
4. Угнетение эффлюкса кальция из клетки: - цистамин - хиноны - паракват - ванадий |
Цитотоксический эффект, опосредованный стойким повышением содержания свободного кальция в цитоплазме, в настоящее время связывают с развивающимся при этом повреждением целостности цитоскелета и неконтролируемой активацией катаболических энзимов (фосфолипаз, протеаз, эндонуклеаз).
Повреждение цитоскелета. Цитоплазма клетки помимо цитозоля и клеточных органелл, как правило, содержит еще и нитевидные белковые структуры, которые в массе формируют клеточный скелет. Это образование выполняет не только стабилизирующую и структурирующую, но и другие функции, среди которых обеспечение клеточного деления, внутриклеточный транспорт, секреция, обмен рецепторных белков, регуляция клеточной подвижности и формы.
При действии разнообразных веществ на изолированные клетки (культура ткани) выявляется отчетливое изменение формы их поверхности: появляются выпячивания цитоплазмы (пузырьками - blebs). Такое “пузырение” (или вскипание - blebbing) клеточной мембраны - один из ранних признаков разрушения сети цитоскелета, предшествующий разрушению клетки.
Кальций вовлечен в процесс поддержания структуры цитоскелета через ряд Са2+-связывающих протеинов и Са2+-зависимых энзимов, обеспечивающих ассоциацию белков цитоскелета с белками плазматической мембраны. Во-первых стойкое увеличение концентрации кальция в цитозоле разрушает комплекс актина микрофиламентов с -актинином, белком, связывающим микрофиламенты цитосклета с белками плазматической мембраны. Во-первых Са2+ активирует протеазы (см. ниже), которые могут расщеплять актин-связывающие белки, разрушая тем самым места прикрепления филаментов цитоскелета к клеточной мембране. Отщепление цитоскелета от мембраны приводит к ослаблению фиксации последней и её “вскипанию”, что и наблюдается при действии различных токсикантов на клетки.
Активация фосфолипаз. Эти энзимы широко представлены в различных клетках. Особое значение имеют фосфолипазы А2, основная функция которых состоит в удалении из мембран поврежденных фосфолипидов, путем отщепления жирных кислот, подвергшихся пероксидации. Фосфолипаза А2 являются Ca2+- и кальмодулин-зависимыми энзимами, и, следовательно, чувствительными к повышению кальция в цитоплазме. При интоксикациях стимуляция фосфолипаз избыточным кальцием приводит к усилению разрушения фосфолипидов мембран и повреждению клеток.
Активация протеаз. К числу протеаз, с оптимумом активности в области нейтральных значений рН, относятся: АТФ-зависимые и Са2+_зависимые (кальпаины) протеазы. Кальпаины присутствуют практически во всех клетках млекопитающих. Они локализуются вне лизосом, в мембранных структурах в форме неактивного комплекса с ингибиторными протеинами (кальпастатины). Основные функции кальпаинов - репарация цитоскелета и клеточных мембран, разрушение рецепторных протеинов и их обновление, активация некоторых энзимов, участие в процессах митоза. Неуправляемая активация кальпаинов кальцием приводит к повреждению микрофиламентов цитоскелета и гибели клеток.
Активация эндонуклеаз. При завершении клеткой жизненного цикла активируется процесс “программированной” физиологической клеточной гибели - апоптоз. На ранних этапах в апоптотической клетке проявляются морфологические изменения: “вскипание” клеточной и ядерной мембран, уплотнение органел, конденсация хроматина. Биохимическим коррелятом процесса является активация эндонуклеаз, энзимов, расщепляющих хроматин на фрагменты - олигонуклеосомы. Установлено, что кальций участвует в активации эндонуклеаз, а повышение его содержания в цитоплазме значительно активирует процесс фрагментации ДНК. Активация эндонуклеаз может быть причиной гибели клеток печени, миокарда, почек и т.д. при отравлениях многими химическими веществами.
5.2.5. Повреждение процессов синтеза белка и клеточного деления
В основе нарушения процессов синтеза белка, клеточного деления и передачи наследственной информации лежит повреждение токсикантами молекул ДНК, РНК и ферментов, участвующих в их синтезе и репарации (табл. 12).
Таблица 12.
Возможные точки приложения повреждающего действия токсикантов на процессы синтеза белка и клеточного деления
|
1. Синтез ДНК. Репликация - изменение структуры (конформации) ДНК - нарушение процесса полимеризации ДНК - нарушение синтеза нуклеотидов - нарушение процесса репарации ДНК - нарушение механизмов регуляции синтеза ДНК |
|
2. Синтез РНК. Транскрипция - разрушение РНК - нарушение полимеризации РНК - нарушение процессии РНК - нарушение синтеза нуклеотидов - нарушение механизмов регуляции синтеза РНК |
|
3. Синтез белка. Трансляция - нарушение организации и процессии рибосом и полисом - нарушение полимеризации аминокислот - нарушение образования аминоацетил-tРНК - нарушение формирования конформации белка и его третичной и четвертичной структур - нарушение механизмов регуляции трансляции |
Кроме представленных в таблице 12 существуют и другие способы токсического повреждения процессов. Так, в фазе приготовления к митозу возможно повреждение центриолей и угнетение синтеза митотического аппарата, образующего клеточное веретено. Веретено формируется SH-содержащими протеинами (тубулином), которые благодаря -S-S- связям образуют нитевидные структуры. Естественно, токсиканты, взаимодействующие с SH-группами, способны повреждать митотическое веретено, и тем самым нарушать клеточное деление. Примерами таких токсикантов являются мышьяк, ртуть и их соединения, колхицин, подофилотоксин и др.
Повреждающее действие химических веществ на ДНК называется генотоксическим. Результатом генотоксического действия ксенобиотиков нередко является мутагенез.
Мутации - это наследуемые изменения генетической информации, хранящейся в ДНК клеток. Химические вещества, способные вызывать мутации называются мутагенами.
Все клетки организма находятся в одной из фаз клеточного цикла:
1. Покоя (фаза G0): клетка функционирует или покоится (большинство соматических неделящихся клеток);
2. Синтеза клеточных компонентов, необходимых для последующего синтеза ДНК (фаза G1): идет накопление необходимого количества пуриновых и пиримидиновых оснований и других химических компонентов ДНК. В делящейся клетке процесс занимает до 40% общего времени цикла клеточного деления;
3. Синтеза ДНК (фаза S): осуществляется “сборка” новой молекулы ДНК из наличествующих в клетке компонентов. Процесс занимает до 39% времени клеточного цикла.
4. Синтеза клеточных компонентов для митоза (фаза G2). В частности синтезируется мономеры и полимер тубулина и т.д. Процесс занимает около 19% времени цикла делящейся клетки.
5. Митоза (фаза M): разделение генетического материала между вновь образующимися дочерними клетками; клеточное деление. Процесс занимает 2% времени.
Некоторые химические вещества способны вызывать мутации лишь тех клеток, которые находятся в определенной фазе цикла, это так называемые цикло-специфичные вещества. Другие действуют на генетический аппарат не зависимо от того, в каком периоде клеточного цикла находится клетка (цикло-неспецифичные). Такая особенность определяется механизмом токсического действии веществ (см. выше). К числу цикло-неспецифичных принадлежат мутагены, способные вызывать химическое повреждение ДНК (алкилирующие агенты и химические модификаторы нуклеотидов). Все остальные мутагены являются цикло-специфичными.
Основными видами мутаций, вызываемых химическими веществами, являются: 1) точечная мутация, связанная с модификацией одного нуклеотида в структуре ДНК, (замещение нуклеотида, выпадение нуклеотида из цепи, включение дополнительного нуклеотида в цепь); 2) хромосомные аберрации, т.е. изменение структуры хромосом (разрывы молекул ДНК, транслокации фрагментов ДНК) или числа хромосом в клетке.
Далеко не всякая модификация молекулы ДНК (мутация) является опасной для организма.
Клетки обладают способностью корректировать и устранять повреждения ДНК. Вследствие этого лишь небольшое число мутаций, инициированных токсикантом, сохраняется в процессе репликации молекулы. Однако если мутация не распознана, извращенная информация транскрибируется в РНК, а затем экспрессируется в форме неполноценного протеина. Последствия этого для клетки могут быть либо несущественны, либо критичны, в зависимости от функций, выполняемых протеином.
Неблагоприятные эффекты мутагенеза определяются также и тем, в клетках какого типа он реализуется: половых или соматических, стволовых и делящихся или созревающих и зрелых. Результатом грубых мутаций половых клеток и делящихся клеток развивающегося плода являются: стерильность особи, врожденная патология у потомства, тератогенез, гибель плода. Мутации стволовых и делящихся соматических клеток сопровождаются структурно-функциональными нарушениями тканей с непрерывной физиологической регенерацией (система крови, иммунная система, эпителиальные ткани) и канцерогенезом. Повреждение токсикантом ДНК зрелой соматической клетки не приводит к пагубным последствиям для организма.
Последствия повреждения ДНК зависят от дозы токсиканта. Высокие дозы вызывают цитостатический эффект (гибель пула делящихся клеток), дистрофические изменения в клетке, более низкие - канцерогенное, тератогенное действие.
Существует представление, согласно которому проникновение в организм даже единственной молекулы генотоксиканта (в отличие от токсикантов с иным механизмом токсического действия) может привести к пагубным последствиям. Дело в том, что химическое повреждение единичной молекулы ДНК в единичной клетке макроорганизма, при стечении обстоятельств, может стать причиной образования целого клона клеток с измененным геномом. Вероятность такого события бесконечно мала, но теоретически возможна. Такой характер действия веществ на биосистемы называется беспороговым.
5.3. Развитие токсического процесса
Повреждение биологических систем в наиболее общей форме реализуется нарушением основных функций живого:
- раздражимости;
- энергетического обмена;
- пластического обмена;
- системы физиологической регенерации и размножения;
- информационного обмена;
- интегративной регуляции.
Нарушение энергетического обмена, как правило, приводит к быстрому формированию нарушений со стороны наиболее энергоемких органов (ЦНС, сердечная мышца, почки). Нарушение пластического обмена сопровождается медленным развитием длительно текущих патологических процессов со стороны наиболее чувствительных органов и систем. Нарушение системы физиологической регенерации тканей проявляется поражением, прежде всего системы крови, эпителия слизистой ЖКТ, органов дыхания, кожи и её придатков. Нарушение информационного обмена приводит к нарушению механизмов нервной и гуморальной регуляции процессов, происходящих в организме. Вещества, нарушающие нервную регуляцию, как правило, вызывают быстро развивающиеся эффекты.
Клиника интоксикации зависит от того, какие органы и ткани будут, прежде всего, вовлечены в патологический процесс.
Проявления токсического процесса, инициируемого токсикантами различных групп, рассматриваются ниже.