Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
17
Міністерство охорони здоров`я України
Київський науково-дослідний інститут отоларингології
ім. проф. О. С. Коломійченка
Лакіза Сергій Олексійович
УДК: 616.322-002.2:615.37
Імунобіологічна дія діалізабельних
чинників із Лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт
14.01.19 - оториноларингологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового
ступеня кандидата медичних наук
Київ – 1998
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Київському науково-дослідному інституті отоларингології ім. проф. О. С. Коломійченка.
Науковий керівник:
заслужений діяч науки та техніки України, доктор медичних наук, професор Заболотний Дмитро Ілліч, директор Київського науково-дослідного інституту отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка.
Науковий консультант:
доктор медичних наук, професор Мельников Олег Феодосійович, завідувач лабораторії патофізіології та імунології Київського НДІ отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Філатов Віктор Хомич, завідувач кафедри отоларингології Харківського медичного університету;
доктор медичних наук, професор Дюмін Олег Валерійович, завідувач кафедри оториноларингології Одеського державного медичного університету.
Провідна установа: Київська державна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика, кафедра оториноларингології, МОЗ України, м.Київ.
Захист дисертації відбудеться 16_ грудня 1998 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.611.01 Київського науково-дослідного інституту отоларингології ім. проф. О.С. Коломійченка МОЗ України (252057, Київ вул.Зоологічна, 3)
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського науково- дослідного інституту отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка, МОЗ України (м.Київ, вул. Зоологічна, 3)
Автореферат розіслано "_16_"_листопада_ 1998 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат медичних наук А.І. Розкладка
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми
Незаперечні докази участі тонзил в реакціях імунітету, представлені за останні 20 років, сприяли більш стриманому підходу до оперативного лікуваня хронічного тонзиліту і розробці методів консервативної терапії цього захворювання, що базуються на принципах локальної та системної імуномодуляції (Б.С.Преображенский, Г.Н.Попова, 1970; Э.В.Гюллинг, О.Ф.Мельников, 1976; А.Е.Вершигора, 1978; В.Н.Горбачевский, 1980; А.И.Цыганов и соавт., 1980; О.Ф.Мельников, 1981; В.А.Попа, 1984; О.Г.Рыльская, 1990; А.В.Чернишов, 1991; Д.И.Тарасов, Б.К.Сагалович, 1995; В.В.Кіщук, 1996; Д.І.Заболотний, 1997; В.Ф.Філатов та співавт., 1997; В.М.Фролов та співавт., 1997; О.В.Дюмін, 1998; Surian, 1997; Okada et. al. 1986; Hirao et. al.,1996).
Належність тонзил до органів імунітету привела до численних спроб виділення із них біологічно-активних речовин поліпептидної та білково-пептидної природи (Э.В.Лукач, 1974; В.Х.Хавинсон и соавт., 1982; Falk, 1960; Roklin et. al, 1973; Schröder, 1972) ÿкі, однак, не отримали поширення як імуномодулятори для клінічного застосування. Розвиток молекулярної імунології, зокрема, розкриття структури і ролі численних цитокінів, які продукуються лімфоїдними та нелімфоїдними клітинами, дозволив не тільки розшифрувати механізми міжклітинної взаємодії, але й використати ці речовини у вигляді імуномодуляторів другого покоління (Н.В.Медуницин, 1980; С.М. Вядро, М.М. Навашин, 1989; Б.С.Утешев, 1989, Л.В.Ковальчук, Л.В.Ганьковская, 1995; Smith, 1988).
Вивчення цитокінового спектру піднебінних мигдаликів при хронічному тонзиліті показало, що в них має місце дефіцит ряду факторів, необхідних для формування повноцінної імунної відповіді (Murakata et. Al., 1996; Tanaka et. аl., 1996). Це підтверджується отриманими раніш даними про розвиток в мигдаликах при хронічному тонзиліті локальної імунологічної недостатності (О.Ф.Мельников, 1981; В.Д.Яковенко, 1985). Поряд із цим відмічено здатність піднебінних мигдаликів до продукції фактору некрозу пухлин (ФНП), інтерферону (ІНФ), що свідчить про їх активну імунологічну функцію. Це узгоджується з даними про виражений активуючий вплив на лімфоїдні утворення кишкового тракту октапептиду, отриманого із тканин тонзил (Н.М.Хмельницкая, 1991).
Таким чином, виділення із піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт імуноактивних субстанцій дозволить розшифрувати механізми захисної функції тонзил, варіанти їх порушення, а також отримати імуноактивні фактори, які можуть бути потенційними лікувальними засобами нового покоління.
Зв'язок з науковими програмами, планами, темами
Дисертація є складовою частиною науково-дослідних тем Київського НДІ отоларингології ім. проф. О.С.Коломийченко МОЗ України: “Розробка методів одержання алогенного та ксеногенного “фактору переносу” та застосування їх для лікування імунодефіцитів, хронічних інфекцій та злоякісних пухлин”, № держреєстрації 0193U039491; “Дослідження протипухлинної дії розчинного фактору(ів) із тканинних лімфоцитів”, № держреєстрації 0196U010082.
Мета роботи
Враховуючи викладене, метою роботи було виділення, біохімічна та імунологічна характеристика імуноактивних діалізабельних чинників із клітин піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт.
Задачі дослідження
1. Визначити оптимальний режим виділення із клітин піднебінних мигдаликів діалізабельних чинників.
2. Дати біохімічну характеристику отриманих діалізатів.
3. Провести дослідження по визначенню імуномодулюючих властивостей діалізатів із клітин піднебінних мигдаликів.
4. Дослідити вплив діалізабельних факторів із лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт на деякі механізми протипухлинної резистентності.
При проведенні досліджень використовували комплекс біохімічних, імунологічних, клінічних і статистичних методів дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів
1. Із клітин піднебінних мигдаликів модифікованим методом отримано діалізабельний фактор/ри (ДФ) із молекулярною масою <25 кД з широким спектром імуномодулюючих впливів.
2. Діалізабельний чинник містить низькомолекулярні білки, протеолітичні ферменти та має антипротеазні властивості.
3. Імуномодуючі властивості діалізату проявляються в його здатності переносити гіперчутливість сповільненої дії (ГСД) до стрептолізину-О (Ст-O), посилювати в декілька разів вторинну гуморальну імунну відповідь до цього антигену та збільшувати in vitro кількість Т-лімфоцитів, які експресують СD-2-рецептори.
4. Вихідний діалізат не має властивостей ІНФ, однак має активність ФНП, яка зростає при культивуванні крові із діалізатом.
5. Діалізат здатен активувати механізми протипухлинної резистентності – гальмувати розвиток пухлинного процесу у мишей при перещеплені їм карциноми Льюїс, активізувати природні кілерні клітини (ПК-клітини) хворих на рак гортані, а також викликати лізис клітин Hep-2, K-562, але не алогенних лімфоцитів тонзил і крові.
Практичне значення одержаних результатів
1. Розроблено технологію лабораторного отримання діалізабельного фактору із лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт, яка може бути основою для розробки промислової технології виробництва лікувального препарату.
2. Отримані в ході досліджень дані свідчать про те, що в мигдаликах, навіть при хронічному запаленні, містяться імуноактивні речовини, які відіграють важливу роль в забезпеченні гомеостазу, що передбачає більш диференційований підхід у розробці показань до оперативного лікування хронічного тонзиліту.
Впровадження у практику
Розроблену технологію лабораторного отримання діалізабельного фактора із лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт впроваджено у практику лабораторії патофізіології та імунології, а також лабораторії біохімії Київського НДІ отоларингології.
Рекомендується отримані дані використовувати в курсі лекцій з фізіології лімфоглоточного кільця.
Особистий внесок здобувача
Автору належить ідея технології експериментальних досліджень in vitro та in vivo. Експериментальні дослідження на тваринах виконані самостійно, імунологічні дослідження – спільно зі співробітниками лабораторії патофізіології та імунології Київського НДІ отоларингології, біохімічні – спільно зі співробітниками лабораторії біохімії КНДІОЛ. Обстеження хворих та забір клінічного матеріалу виконані автором самостійно.
Апробація результатів дисертації
Матеріали дисертації доповідалися на IV-му з`їзді отоларингологів Республіки Білорусь (Вітебськ, 1996); II Національному конгресі патофізіологів України “Актуальні питання клінічної імунології” (Київ, 1996); науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження проф. О.С.Коломійченка (Київ, 1998 р.).
Апробаційний захист дисертації відбувся 28 жовтня 1997 року на засіданні Вченої ради Київського НДІ отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка.
Публікації.
По темі дисертації опубліковано 4 журнальні статті, 2 – в збірках наукових праць.
Структура дисертації.
Дисертація викладена на 118 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури, який налічує 155 джерел, з них 79 – іноземних авторів. Роботу ілюстровано 23 таблицями та 6 рисунками.
ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень
Матеріалом для досліджень служили піднебінні мигдалики та периферична кров хворих на хронічний тонзиліт, периферична кров практично здорових осіб, лімфоїдні органи і периферична кров мишей ліній СВА; C57Bl/6, нелінійних мишей та щурів лінії Wistar. Крім того, матеріалом для досліджень були культури клітин різного гістогенезу: L-41, пухлинні лінії (К-562; Нер-2), фібробласти (L-929), лімфоцити алогенних мигдаликів та периферичної крові хворих раком гортані і пацієнтів із запальними процесами верхніх дихальних шляхів, еритроцити людини групи АВ.
Матеріал для досліджень отриманий від 66 хворих, в тому числі на хронічний тонзиліт (32); рак гортані (20); лімфосаркому верхніх дихальних шляхів (14), а також від 10 практично здорових осіб. Окрім того, в роботі використано 348 мишей ліній СВА, C57Bl/6, білих нелінійних мишей та 46 щурів Wistar.
Для одержання та дослідження імуноактивних субстанцій в діалізабельних фракціях тканинних лімфоцитів використані клітини піднебінних мигдаликів, а також досліджувалась периферична кров хворих на хронічний тонзиліт, котрим за показаннями була проведена тонзилектомія. Донорами лімфоцитів периферичної крові були також практично здорові особи, що проходили імунологічне обстеження в лабораторії патофізіології та імунології Київського НДІ отоларингології. Донори піднебінних мигдаликів представлені хворими з діагнозом: хронічний тонзиліт, декомпенсована форма, рецидиви ангін (И.Б.Солдатов, 1975). В роботі використані піднебінні мигдалики 20 чоловіків та 12 жінок віком від 16 до 40 років із давністю захворювання не менше 3 років.
При дослідженні імуноактивних властивостей діалізабельних фракцій із лімфоцитів мигдаликів і периферичної крові використовували клітини крові хворих на рак гортані, як правило, II-III стадії другої клінічної групи, які мали відхилення в стані імунної системи на момент обстеження, а також хворих на лімфосаркому верхніх дихальних шляхів.
Експериментальні дослідження виконані на нелінійних мишах, мишах ліній СВА, C57Bl/6, BАLB/c та щурах Wistar. Крім того, частина експериментів виконана на культурах клітин, таких як L-929, L-41 (ІМБГ НАН України), Hep-2 і K-562 (УНЦРМ). Штам клітин карциноми Льюїс отриманий із ІЕПОР НАН України. Тварини утримувалися в умовах віварію КНДІ отоларингології. Робота з ними проводилася у відповідності з правилами поводження із експериментальними тваринами.
В експериментах in vitro використовувались також короткотермінові культури алогенних тонзилоцитів, ксеногенних (еритроцити курей) і алогенних еритроцитів, на яких перевірялась цитотоксична дія одержаних діалізабельних фракцій. Культури готували в день постановки експерименту.
Методи біохімічного розділення та аналізу
Отримання фракцій розчинних діалізабельних факторів із лімфоцитів піднебінних мигдаликів хворих на декомпенсовану форму хронічного тонзиліту і периферичної крові людей здійснювали у відповідності з рекомендаціями Шрьодера, Лоренца (1979), з нашими модифікаціями, описаними у розділі власних досліджень. Визначення загального вмісту білку в діалізатах проводили за методом Лоурі (1951). Cумарну протеолітичну активність виявляли за методом К.М.Веремєєнко і спіавторів (1988). Для виявлення трипсиноподібної активності використовували хромогенний субстрат N-бензоїл-ДL-аргинін-п-нітроанілід-БАПНА (К.М.Веремєєнко, 1971). Активність трипсиноподібного ферменту калікреїну досліджували за допомогою специфічного хромогенного субстрату – хромозиму РК (Неlmark, Davie, 1984). Рівень кінінруйнуючого ферменту кінінази визначали за швидкістю розщеплення субстрату гіпурил-L-лізину (Folk et. al., 1960). Загальну антитриптичну активність досліджували за методом К.М.Веремєєнко і співавторів (1988).
Розділення білків діалізабельної фракції проводили методом диск-електрофорезу, використовуючи 15 % поліакріламідний гель із додецилсульфатом натрію (Tuemml, 1970).
Імунологічні методи
Присутність цитокінів у діалізатах із зруйнованих клітин піднебінних мигдаликів і супернатантах, отриманих після культивування клітин периферичної крові із діалізатами і без них, визначали за активністю, властивою окремим цитокінам.
Наявність в досліджених препаратах фактора некрозу пухлин досліджували в культуральному тесті за рівнем деструкції клітин лінії L-929, попередньо оброблених актиноміцином-D (Servа), використовуючи фотометричний тест із кристалічним фіолетовим.
Цитотоксичний індекс (ЦІ) розраховували за формулою:
ЦІ= (а-b) 100%
a
де а – оптична густина ямок із середовищем і b – оптична густина ямок с середовищем та супернатантом або діалізабельним фактором мигдаликів (ДФМ).
Оптичну густину вимірювали при довжині хвилі 540 нм. В основі данної методики лежать рекомендації Н.С.Дяченко і співавторів, (1994).
Активність фактору гальмування міграції (ФГМ) клітин крові виявляли використовуючи капілярний тест з планіметричною оцінкою рівня гальмування. В якості мігруючих клітин використовували лейкоцити крові здорових донорів, які виділяли методом спонтанного осаджування по оригінальній методиці (О.Ф.Мельников та співавт., 1985). При виконанні данної частини роботи використовували непрямий метод оцінки гальмування міграції клітин у відповідності із рекомендаціями О.Ф. Мельникова (1974).
Наявність в діалізатах фактору переносу визначали за здатністю препарату переносити гіперчутливість сповільненої дії до антигену стрептокока-Ст-О у інтактних мишей лінії СВА. Оцінку розвитку ГСД проводили по зміні маси підколінних лімфатичних вузлів згідно рекомендацій Е.В.Гюллінга, М.Б.Самбур (1981).
Активність колонієстимулюючого фактору виявляли в діалізаті клітин мигдаликів по рівню і якісній характеристиці ендогенних колоній у сублетально опромінених мишей лінії СВА (Till, McCulloch, 1961).
Інтерферон визначали по антивірусній активності препаратів – їх здатності захищати клітини від зараження вірусом хвороби везикулярного стоматиту (ВВС). Використовували методику 50 % противірусної захисної дії (ЦПД-50) у відповідності з рекомендаціями Н.С.Дяченко та співавторів (1994).
При дослідженні впливу діалізатів на активність природніх цитотоксичних клітин (ПЦК) практично здорових осіб і хворих на рак гортані використовували рекомендації О.Ф.Мельникова і співавторів, (1985). Застосовували два типи мішеней: клітини еритролейкозу людини К-562 та еритроцити курчат. Оцінку реакції проводили радіометрично на установці Гамма-12 (Україна), використовуючи в якості ізотопного маркера Cr51 (Amersham, Великобританія). Ефектори виділяли з периферичної крові шляхом розділення на градієнті щільності феколл-верографіну.
Рівень модуляції гуморального імунітету досліджували в експериментах in vivo на мишах лінії СВА. Вивчали реакції системи імунітету при введенні діалізатів, антигенів різного типу: стрептолізину-О, еритроцитів барана (ЕБ). При введенні стрептолізину-О сумарну продукцію антитіл оцінювали за допомогою реакції нейтралізації, при введенні еритроцитів барана – за реакцією гемаглютинації із застосуванням мікротитратора Такачі (О.Ф.Мельников, 1981).
При вивченні цитотоксичної дії діалізатів із клітин піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт та із клітин крові, використовували радіометричний метод оцінки ступеню деструкції мішеней із застосуванням Cr51 в вигляді ізотопного маркера. Крім цього, при використанні інших мішеней, наприклад клітин раку гортані людини Нер-2, застосовували вітальні барвники з наступною спектрофотометрією. Досліджували цитотоксичну дію діалізатів різного походження та супернатантів після дії ними на алогенні лімфоцити мигдаликів і ксеногенні еритроцити. Як правило, випробовували дози діалізатів по 2,20 та 200 мкг по білку, а супернатантів – 0,2 мл на 2 млн мішеней в об`ємі 1 мл середовища RPMI-1640 (Serva). Час культивування – 16 годин при температурі 37 оС.
Кількість лейкоцитів і іх розподіл за окремими формами досліджувались в мазках крові експериментальних тварин загальноприйнятим методом із використанням фарбування за Паппенгеймом. При цьому особливу увагу звертали на вміст великих грануловмісних лімфоцитів, які є носіями природньої клітинної цитотоксичності (К.П.Зак, З.А.Бутенко, 1988; І.Кохан, 1994).
Допоміжні методи
При дослідженні впливу діалізабельного фактора на розвиток експериментального пухлинного процесу у мишей лінії C57Bl/6, кожній із 38 мишей у ділянці стегна внутрішньом`язево вводили 3х103 клітин карциноми Льюїс. Через 6 діб тварин розділили на 2 групи (20 тварин в експериментальній групі і 18 – в контрольній). Тваринам експериментальної групи на протязі 2-х тижнів вводили 0,1 мл ДФ (2 мкг препарату по білку), отриманого з мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт. Тваринам контрольної групи на протязі двох тижнів вводили по 0,1 мл фізіологічного розчину.
Статистичні методи
При побудові багатофакторних експериментів використовували рекомендації А.І.Лисенкова (1979). Результати досліджень оброблені статистично з використанням параметричних та непараметричних критеріїв (Е.В.Гублер, 1978). При статистичній обробці результатів титрування визначали величину середнього геометричного титра і його похибки за методом В.И.Левинсона (1968).
Результати дослідження та їх обговорення
Для виділення із піднебінних мигдаликів хворих на хронічний тонзиліт імуноактивних речовин було використано модифікований метод Шрьодера-Лоренца. Діалізабельний фактор мигдаликів отримували із лімфоцитів тонзил шляхом їх механічної гомогенізації, серії циклів заморожування і відтавання з наступною обробкою ДНК-азою, активованою іонами магнію, та діалізом крізь целофанову мембрану протягом 16 годин. Установлено, що ДФМ є пептидно-білковою сумішшю із молекулярною масою < 25 кД, володіє активністю деяких протеолітичних ензимів. При електрофоретичному дослідженні білки ДФМ розподілялись переважно в зоні міграції - та -глобулінів. Подібна технологія отримання імуноактивних речовин, значним чином відрізняється від методик інших авторів (Е.В.Лукач, 1975; В.Х.Хавінсон та співавт., 1982; Schröder et. al., 1978).
Імуномодулюючі властивості діалізату проявились у його здатності переносити ГСД до Ст-О від людини до мишей, що може свідчити про наявність в ДФМ активності, подібної до фактору переноса.
Новим імуномодулюючим ефектом, відмінним від раніше описаних, є здатність ДФМ посилювати імунну реакцію на антигени стрептококу при формуванні гуморальної відповіді на Ст-О, коли замість передуючої дози антигену вводили ДФМ. Гуморальна відповідь при наступній імунізації Ст-О суттєво перевищувала рівень реакції, коли примуючою була ін`єкція вказаного антигену стрептококу (рис.1).
Групи тварин 4 1 3 2
Передуюча доза Фосф. буфер Ст.О ДФ крові ДФ мигдаликів
Повторна СтО СтО СтО СтО
ин'єкція
Рис. 1 Середньогеометричні титри антитіл в групах тварин при введенні ДФ із клітин крові та піднебінних мигдаликів
Феномен підсилення не пов`язаний з наявністю в ДФМ залишкових кількостей Ст-О, оскільки в дослідженнях радіометричним методом не виявлено ертитроцитолітичної здатності ДФМ по відношенню до червоних кров`яних тілець людини.
При проведенні подальших досліджень по імунологічній характеристиці ДФМ, була виявлена його здатність посилювати in vitro експресію СД-2 рецепторів на Т-лімфоцитах, що зближує його з препаратами, отриманими іншим шляхом із вилочкової залози та тонзил.
Важливим моментом, на наш погляд, є виявлення в ДФМ речовин, здатних посилювати диференціювання стовбурових поліпотентних клітин кісткового мозку, про що свідчать експерименти на опромінених мишах, у яких при введенні ДФМ збільшувалась кількість саме лімфоїдних елементів в колоніях селезінки (табл.1).
Таблиця 1
Склад клітинних колоній селезінки мишей дослідної і контрольної груп, які отримали сублетальну дозу -опромінення
|
Тип клітин |
Склад клітин, % |
|
|
Дослід |
Контроль |
|
|
Лімфоцити |
40,0 |
10,0 |
|
Мієлоцити-мієлобласти |
30,0 |
70,0 |
|
Лейкоцити (паличкоядерні та сегментоядерні) |
2,0 |
10,0 |
|
Інші клітини |
28,0 |
10,0 |
Фактор некрозу пухлини був виявлений не у всіх зразках діалізатів, так само, як і інтерферон, для продукції якого необхідна присутність інтерфероніндукуючого ліганду. В значній мірі це відноситься і до визначення в ДФМ фактору гальмування міграції лейкоцитів.
При вивченні цитотоксичних властивостей ДФМ по відношенню до алогенних клітин піднебінних мигдаликів, аденоїдів та ксеногенних еритроцитів (ЕК) було виявлено, що клітинні популяції лімфоглоточного кільця не руйнувались під впливом ДФМ, тоді як ксеногенні еритроцити піддавались лізису при 16-годинному контакті з ДФМ. З такою ж приблизно інтенсивністю руйнувались in vitro в присутності ДФМ пухлинні алогенні клітини-мішені карциноми гортані Hep-2 та еритролейкозу людини К-562 (рис.2).
Рис. 2 Цитотоксична активність ДФМ по відношенню до ксеногенних
ядровміщуючих еритроцитів та пухлинних клітин НЕР-2 та
К-562 in vitro
Обробка ДФМ лімфоцитів крові онкологічних хворих та практично здорових донорів супроводжувалась появою в супернатантах цитотоксичних факторів по відношенню до пухлинних клітин, які за рівнем своєї протипухлинної активності суттєво перевищували активність власне ДФМ (рис.3).