реферат дисертації на здобуття вченого ступеня доктора біологічних наук Київ 2000 Дисерт

Работа добавлена на сайт samzan.net:

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ГАРАЩУК ОЛЬГА ВІТАЛІЇВНА

УДК 612.822

Механізми регуляції кальцієвого гомеостазу в сомі та дендритах нейронів центральної

нервової системи ссавців

03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України та Інституті фізіології Заарландського університету Федеративної Республіки Німеччини.

Консультант:   академік, доктор біологічних наук, зав. відділом

фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Кришталь Олег Олександрович

Офіційні опоненти:  професор, доктор біологічних наук, зав. відділом фізіології стовбура мозку Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Лиманський Юрій Петрович

   

професор, доктор біологічних наук, заступник директора Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Костерін Сергій Олексійович

доктор медичних наук, Головний науковий співробітник Інституту фармакології і токсикології АМН України, керівник Центру доклінічного вивчення лікарських засобів Державного нуково-експертного центру МОЗ України Соловйов Анатолій Іванович

Провідна установа: Інститут фізіології ім. Петра Богача при Київському Національному університеті им. Тараса Шевченка

Захист відбудеться 11 квітня  2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д-96.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано 17 лютого 2000 р.

Вчений секретар спеціалізовоної ради,

доктор біологічних наук      Сорокіна-Маріна З.О.

Вступ

Актуальність проблеми: Йони кальцію є одними з найбільш важливих і універсальних регуляторів клітинних функцій. Змінами їх внутрішньоклітинної концентрації регулюється ряд фізіологічних та біохімічних процесів, таких як проліферація, секреція, виникнення збудження та його розповсюдження, синтез білків та ін. (Kostyuk, 1992). Підтримання внутрішньоклітинної концентрації йонів кальцію ([Ca2+]i) на дуже низькому рівні (10-8 -10-7 моль/літр) в стані спокою та часовий перебіг підвищення [Ca2+]i під час клітинної активності забезпечується завдяки взаємодії різноманітних структур, розташованих як в цитоплазмі, так і в мембрані клітини.

Останнім часом зусиллями багатьох дослідників (Костюк, 1992) було досягнуто значного прогресу в з`ясуванні молекулярних та функціональних механізмів дії цих структур в ізольованих нейронах та нейронах, культивованих in vitro. Проте ряд важливих аспектів кальцієвого гомеостазу в інтактних нейронах та їх дендритах, місцях розташування синаптичних контактів, все ще залишаються нез`ясованими. Грунтовного дослідження вимагають також питання взаємодії цих механізмів як на рівні окремої клітини, так і на рівні нативних мереж нейронів. Особливо це стосується нейронів ЦНС, дослідження яких в умовах, близьких до природних (наприклад, в зрізах мозку), довший час залишалось недоступним із-за відсутності адекватних методичних підходів. В той же час вивчення різноманітних процесів, які в нейронах ЦНС регулюються змінами [Ca2+]i, неможливе без грунтовного знання механізмів регуляції їх кальцієвого гомеостазу, а саме: (1) механізмів входу Ca2+ через канали, розташовані в клітинній мембрані, (2) механізмів вивільнення Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо і (3) механізмів зв'язування Ca2+ в цитоплазмі як відповідними білками, так і внутрішньоклітинними Ca2+-депо.

Мета роботи полягала в з'ясуванні синаптичних та клітинних механізмів, що впливають на рівень [Ca2+]i в цитоплазмі нейронів ЦНС в зрізах мозку, а також у вивченні їхньої взаємодії та зміни в процесі онтогенезу.

Для досягнення даної мети були поставлені такі конкретні завдання:

1.Вдосконалити метод точного вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків з метою його застосування для вивчення рецептор-каналів, розташованих в сомі та дендритах нейронів ЦНС в зрізах мозку. Порівняти кальцієву проникність соматичних та дендритних йонотропних глутаматних рецептор-каналів (NMDA- та не-NMDA-типу) в збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС.

2.Охарактеризувати молекулярну будову даних рецептор-каналів. Дослідити взаємозвўязок між кальцієвою проникністю глутаматних рецептор-каналів певного типу та їх молекулярною будовою.

3.Дослідити функціональні властивості соматичних та дендритних внутрішньоклітинних Ca2+-депо, що відповідають за Ca2+-індукований викид Ca2+ в цитоплазму. Порівняти функціональні властивості цих депо в збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС.

4.З'ясувати роль Ca2+-зв'язуючих білків (на прикладі кальбіндину) та їх вплив на часовий перебіг внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів.

5.Вивчити механізми генерації кальцієвих сигналів в період раннього постнатального розвитку. З'ясувати роль ГАМК-активованого підвищення [Ca2+]i в сомі та дендритах.

6.Дослідити взаємодію різних механізмів регуляції [Ca2+]i та їх роль в процесі формування функціональної глутаматергічної синаптичної мережі під час раннього постнатального розвитку.

Наукова новизна. В процесі виконання роботи метод точного вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків було вдосконалено та вперше застосовано для визначення Ca2+-проникності глутамат-активованих рецептор-каналів, розташованих на сомі та дендритах нейронів в зрізах мозку щурів. Завдяки цьому вперше вдалося виміряти Ca2+-проникність дендритних глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в фізіологічних умовах. Встановлено, що Ca2+-проникність дендритних, ймовірно синаптичних рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу, збігається з проникністю соматичних, позасинаптичних рецептор-каналів і становить 11.12% та 0.6% відповідно. 

Досліджено особливості молекулярної будови рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в принципових збуджуючих (на прикладі пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципових гальмівних (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) нейронах, а також інтернейронах (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки) в зрізах мозку щурів. Виявлено, що властивості глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA-типу зумовлюються присутністю домінантної NR2В-субодиниці.

Досліджено функціональні властивості соматичних та дендритних рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочку щурів. Показано, що в умовах фонової клітинної активності вони виступають в ролі кальцієвого буферу, чим сприяють підтриманню [Ca2+]i на низькому рівні. У період підвищеної клітинної активності, навпаки, ці депо здатні значно підсилювати Ca2+-сигнали в цитоплазмі завдяки процесові Ca2+-активованого викиду Ca2+.

Виявлено механізм „ємнісного" входу Ca2+ в нейрони ЦНС. Показано, що цей трансмембранний Ca2+-потік відповідає за наявність Ca2+ всередині депо, а отже, за їх дієздатність в стані спокою. Показано, що рианодин-чутливі Ca2+-депо мають надзвичайно велику буферну ємність і під час потужної клітинної активності здатні накопичувати до 20 разів більше йонів кальцію, ніж їх там знаходиться в стані спокою. Виявлено, що йони кальцію, вміст яких всередині депо збільшується пропорційно до підвищення [Ca2+]i, повільно витікають звідти протягом наступних хвилин після відновлення контрольного рівня [Ca2+]i. Завдяки цим властивостям рианодин-чутливі кальцієві депо здатні виступати в ролі елементу "памўяті" або "детектора співпадіння", значно підсилюючи лише ті внутрішньоклітинні Ca2+-сигнали, котрі виникають під час посиленої клітинної активності.

Використовуючи методи генної інженерії створено мишей-мутантів, позбавлених кальцій-звўязуючого білку кальбіндину. Показано, що кальбіндин виступає в ролі швидкодіючого кальцієвого буферу, що драматично зменшує наявність вільного кальцію в цитоплазмі нейрону протягом перших 100 мс після активації входу Ca2+.

Досліджено механізми генерації внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в період раннього постнатального розвитку щурів. Показано, що на ранніх стадіях постнатального розвитку, коли глутаматергічні синаптичні звўязки перебувають в зародковому стані, ГАМК, що є основним гальмівним нейромедіатором ЦНС у дорослому віці, викликає синаптичне збудження та генерацію внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в сомі та дендритах пірамідних нейронів гіпокампу внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів, а також Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Виявлено, що 85 % нейронів в зрізах гіпокампу щурів віком 1-7 днів бере участь в генерації спонтанних періодичних (0.007-0.03 Гц) Ca2+-сигналів, які виникають в усіх нейронах одночасно. Ці кальцієві осциляції в період раннього постнатального розвитку мають синаптичне походження і критично залежать від активації збуджуючих ГАМК-ергічних синапсів. Встановлено, що виявлена нейрональна активність здатна трансформувати зародкові глутаматергічні синаптичні контакти в функціональні синаптичні контакти зрілого типу і, таким чином, сприяти формуванню повноцінної мережі синаптичних зв`язків. В основі цієї здатності лежить синхронна активація описаних в роботі механізмів регуляції [Ca2+]i, як то глутамат- та ГАМК-активованих рецептор-каналів, потенціал-залежних Ca2+-каналів та внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Зважаючи на те, що зародкові глутаматергічні синаптичні контакти було виявлено при народженні, крім гіпокампу, також в корі (Isaac, 1997; Rumpel, 1998) та спинному мозку (Li, 1998) ссавців та оптичному тектумі амфібій (Wu, 1996), вперше описаний в даній роботі механізм переходу зародкових глутаматергічних синаптичних контактів в функціональні синаптичні контакти зрілого типу може мати універсальне значення.

Практична цінність роботи полягає у вдосконаленні методів вимірювання з метою дослідження Ca2+-проникності агоніст-активованих рецептор-каналів, розташованих в місцях синаптичних контактів, та у висвітленні механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу як в нейронах дорослих тварин, так і в нейронах, що знаходяться в процесі постнатального розвитку. Отримані в роботі дані про домінантну роль NR2В-субодиниці дають основу для створення високоселективних фармакологічних засобів, здатних протидіяти викликаній глутаматом під час травматичних пошкоджень та ішемії цитотоксичності. Висвітлення збудливої дії ГАМК під час раннього постнатального розвитку сприяє створенню ефективних лікарських засобів, які могли б застосовуватись при лікуванні дитячої епілепсії. Натепер найбільш поширеним терапевтичним засобом для лікування дитячої епілепсії є пентобарбітал, речовина, що підсилює ГАМК-активовані синаптичні струми. Не дивлячись на успішну дію цього препарату при лікуванні епілепсії у дорослих, чисельні дослідження вказують на обмежений успіх цього препарату при лікуванні новонароджених (Holmes, 1998), в ЦНС яких дія ГАМК є, найбільш ймовірно, збуджуючою. Більше того, дослідження, проведені на тваринах, вказують на негативний вплив пентобарбіталу на збільшення ваги мозку та розвиток сенсорних функцій під час постнатального розвитку (Mikati, 1994).

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Інституту біофізичної хімії імені Макса Планка (Гьоттінген, Німеччина), Інституту фізіології Заарландського Університету (Гомбург, Німеччина), Конференціях фізіологічного (Мюнхен, 1993; Йена, 1994; Мюнстер, 1995; Росток, 1997; Бонн 1999) та фармакологічного (Майнц, 1998) товариств Німеччини, Конференції фізіологічного товариства Великобританії (Лондон, 1993), Конференції Європейської асоціації з нейронаук (Відень, 1994; Берлін, 1998), Обўєднаній конференції німецького та швейцарського фізіологічних товариств (Цюріх, 1996), Конференціях нейрофізіологічного товариства Німеччини (Гьоттінген, 1995; 1997; 1999), Міжнародному симпозіумі з кальцій-звўязуючих білків (Лунд, 1997), Міжнародному симпозіумі з властивостей та функції глутаматних рецепторів (Тюбінген, 1998), Конференціях американського товариства з нейронаук (Вашінгтон, 1996; Нью-Орлеан, 1997; Лос Анджелес, 1998, Майамі, 1999) та лекціях, прочитаних на запрошення центру молекулярної медицини ім. Макса Дельбрюка (Берлін, 1998), відділу біохімії інституту психіатрії ім. Макса Планка (Мюнхен, 1998), біологічного факультету Бохумського університету (Бохум, 1999), медичного факультету університету ім. Мігеля Хернадеца (Аліканте, 1999) і біологічного факультету Кайзерслаутернського університету (Кайзерслаутерн, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 статей у наукових журналах та книгах.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 230 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 73 малюнками і 4 таблицями. Дисертація складається з вступу, опису сучасного стану досліджень, методів дослідження, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел з 220 найменувань.

ОбўЄкти та методи дослІдженнЯ

Робота виконувалась на візуально ідентифікованих нейронах в трансверсних зрізах гіпокампу, фронтальних зрізах серединної перетинки та сагітальних зрізах мозочку щурів (Garaschuk, 1995; Garaschuk, 1996; Garaschuk, 1997; Plant, 1997; Garaschuk, 1998). В дослідженнях використовували нейрони, розташовані на відстані 20-40 µм від поверхні зрізу, що сприяло збереженню будови нейронів та їх нативних синаптичних контактів. В більшості експериментів було поєднано електрофізіологічні та флюорометричні методи дослідження з метою одночасної реєстрації змін внутрішньоклітинної концентрації Ca2+ ([Ca2+]i) та асоційованих змін потенціалу на мембрані нейрону. Для реєстрації електричних сигналів використовували підсилювач EPC-9 (HEKA, Ламбрехт, Німеччина). Процеси запису даних, електричної стимуляції клітин та аплікації хімічних речовин контролювалися за допомогою комп`ютерної програми "Pulse" (HEKA, Ламбрехт, Німеччина). Для реєстрації флюорометричних Ca2+-сигналів використовували як установку на базі CCD-камери (charge-coupled device camera) (Garaschuk, 1998), так і установки на базі конфокального мікроскопу з одно- та двофотонним збудженням барвника. Забарвлення нейронів Ca2+-чутливим барвником fura-2 проводили або шляхом включення барвника у склад внутрішньоклітинного розчину, або шляхом інкубації зрізів в зовнішньоклітинному розчині, що містив fura-2 AM, спеціальну форму барвника, здатну проникати через клітинну мембрану (Garaschuk, 1998).

Для вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків, викликаних активацією глутаматних рецепторів, Ca2+-чутливий барвник fura-2 у високій концентрації (1-2 мМ) додавали до внутрішньоклітинного розчину. За цих умов fura-2 витісняє ендогенні кальцієві буфери, зв'язує всі йони Ca2+ і тому дає змогу вимірювати загальну кількість йонів кальцію, що проходять через клітинну мембрану. Цей метод дозволяє вимірювати трансмембранні кальцієві потоки при фізіологічних значеннях зовнішньоклітинної концентрації Ca2+ та при потенціалі спокою (Schneggenburger, 1993; Neher 1995).

Щоб дослідити взаємозв`язок між властивостями ліганд-активованих рецептор-каналів та їх молекулярним складом, ми використовували методи зворотньої транскрипції та ланцюгової реакції полімерази на окремих нейронах в зрізах (Lambolez, 1992). Після закінчення флюорометричних і/або електрофізіологічних вимірювань вміст цитоплазми нейрону висмоктували через ту саму піпетку, що використовувалась для внутрішньоклітинного діалізу, і досліджували на вміст мРНК, що кодує певні субодиниці ліганд-активованих рецептор-каналів (Garaschuk, 1996; Tempia, 1996; Plant, 1997).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Кальцієва проникність нативних глутаматних рецептор-каналів в нейронах ЦНС

Кальцієва проникність глутаматних рецептор-каналів в пірамідних нейронах СА1 регіону гіпокампу.

Для вимірювання Ca2+-проникності нативних глутаматних рецептор-каналів в сомі та дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу метод фіксації потенціалу на мембрані окремого, візуально ідентифікованого пірамідного нейрону, було поєднано з внутрішньоклітинною перфузією цього нейрону розчином, що містить високу концентрацію (1-2 мМ) Ca2+-чутливого барвника fura-2. Щоб встановити частку Ca2+ в агоніст-активованому катіонному струмі було визначено величину f, яка є відношенням зміни флюоресценції fura-2 на Ca2+-чутливій довжині хвилі (DF380) до загального катіонного струму через клітинну мембрану: f= DF380/ I dt (Neher, 1992; Schneggenburger, 1993; Garaschuk, 1996). Якщо катіонний струм переноситься виключно Ca2+, то f наближається до константи "fmax", що дорівнює DF380 на одиницю кальцієвого заряду. Якщо ж катіонний струм переноситься різними йонами, то f/fmax є "фракційним кальцієвим струмом", що скорочено позначається Pf. Значення Pf показує, який відсоток загального катіонного заряду переноситься йонами кальцію.

Проаналізувавши дані, отримані в результаті 302-х йонофоретичних аплікацій NMDA до соми 37 пірамідних нейронів регіону СА1, ми отримали значення PfNMDA, що дорівнює 10.69 ± 2.13%. Отже, при потенціалі на клітинній мембрані -60 мВ та зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 1.6 мМ приблизно 11 % загального заряду через соматичні рецептор-канали NMDA-типу переноситься йонами кальцію. Мал. 1 ілюструє залежність NMDA-активованих трансмембранних струмів і викликаних ними флюоресцентних сигналів від потенціалу на клітинній мембрані в присутності 1 мМ Mg2+ в зовнішньоклітинному розчині. Як показано на мал. 1Б, потенціал-залежність часових інтегралів NMDA-активованих трансмембранних струмів (QNMDA) відображає добре відому потенціал-залежність струму через NMDA-рецептор-канали, що зумовлюється потенціал-залежним блокуванням NMDA-рецептор-каналів йонами Mg2+ (Nowak, 1984; Mayer, 1987). Зауважте, що при потенціалах на мембрані від -70 до -20 мВ зміна амплітуди Ca2+-чутливих сигналів (DF380) відбувалась паралельно до зміни амплітуди QNMDA (мал.3Б), залишаючи, таким чином, PfNMDA без змін. Цікаво, що значний вхід Ca2+ через NMDA-активовані рецептор-канали спостерігався навіть тоді, коли загальний потік йонів через ці канали дорівнював 0 або набував протилежного напрямку (при потенціалах на мембрані від 0 до +30 мВ).

Мал. 1. Потенціал-залежність Ca2+-потоку через рецептор-канали NMDA-типу.

А, NMDA-опосередковані трансмембранні струми (внизу) та відповідні зміни F380 (вгорі) при різних підтримуваних потенціалах на мембрані нейрону. Б, залежність значень часового інтегралу відповідного NMDA-активованого струму (QNMDA) та значень амплітуди відповідних змін флюоресценції DF380 від підтримуваного потенціалу.

Мал. 2 ілюструє експеримент, метою якого було вимірювання Ca2+-проникності дендритних рецептор-каналів NMDA-типу. Розміщуючи йонофоретичну піпетку неподалік від головного апікального дендриту та аплікуючи NMDA на короткий час (20-50 мс), NMDA-активовані Ca2+-сигнали вдавалось викликали селективно в обмеженій ділянці дендриту, розташованому навпроти йонофоретичної піпетки (мал. 2). Аналізуючи дендритні сигнали ми отримали значення PfNMDA, що дорівнює 10.70 ± 1.96% (n= 9 нейронів).

Мал. 2. Вимірювання Ca2+-потоків через рецептор-канали NMDA-типу, розташовані на дендритах пірамідних нейронів. А, псевдокольорове зображення пірамідного нейрону СА1-регіону гіпокампу до (а) та підчас (b) короткої йонофоретичної аплікації NMDA (50 мс, 1 µА). Йонофоретичну піпетку позначено стрілкою. Б, NMDA-активований трансмембранний струм (внизу) та відповідна зміна F380 (вгорі), отримані в експерименті, проілюстрованому в А. Суцільна лінія є результатом симуляції кривої зміни флюоресценції на основі зміни трансмембранного струму згідно до рівняння: DF380(t) = f*[I(t) - I0]*Dt - [F380(t) - F380,0]*Dt/t, де I(t) - I0 - є приростом трансмембранного струму, а F380(t) - F380,0 - аналогічно виміряним приростом флюоресцентного сигналу (Schneggenburger, 1993). Параметри f і t змінюють доти, доки виміряний та симульований сигнали не співпадуть.

Порівнюючи безпосередньо Ca2+-проникність дендритних рецептор-каналів NMDA-типу з Ca2+-проникністю соматичних рецептор-каналів одного й того ж самого нейрону (мал. 3), майже ідентичні значення PfNMDA було отримано попарно в сомі та дендритах кожної з пірамідних клітин (n=7, мал. 4).

Мал. 3. Порівняння Ca2+-потоків через соматичні та дендритні рецептор-канали NMDA-типу одного й того ж самого нейрону. А, комбіноване епіфлюоресцентне та світлове зображення пірамідного нейрону СА1-регіону гіпокампу. Криві, представлені в Б і В, є кривими зміни флюоресценції в соматичному (1) та дендритному (2) регіонах відповідно. Б та В ілюструють синхронні зміни флюоресценції та трансмембранного струму внаслідок йонофоретичних аплікації NMDA почергово до соми (Б) та дендритів (В). А - ілюструє місце розташування йонофоретичної піпетки під час дендритних аплікацій NMDA.

Мал. 4. Порівняльна характеристика Ca2+-проникності соматичних та дендритних рецептор-каналів NMDA-типу. А, графік залежності декременту зміни флюоресценції DF380 від часового інтегралу QNMDA відповідного трансмембранного струму під час локальних соматичних (n=20, заштриховані символи) та дендритних (n=17, порожні символи) аплікацій NMDA. Б, порівняння значень PfNMDA, отриманих попарно в сомі та дендритах одних і тих же нейронів (n=7). В кожній з пар дендритне значення є нормалізованим до значення PfNMDA, отриманого в сомі відповідного нейрону.

Отже, Ca2+-проникність соматичних та дендритних глутаматних рецептор-каналів NMDA-типу є подібною, складаючи приблизно 11%.

До останнього часу рецептор-канали не-NMDA-типу вважались непроникними для Ca2+ (Jonas, 1992). В подальших експериментах ми дослідили можливу роль цих рецепторів як джерела глутамат-активованого входу Ca2+ в клітину. Йонофоретичні аплікації як АМРА, так і каїнату до апікальних дендритів пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу викликали чітко окреслені Ca2+-сигнали, засвідчуючи ненульову Ca2+-проникність цих рецептор-каналів. Варто, однак, зауважити, що для реєстрації АМРА- та каїнат-активованих Ca2+-сигналів було необхідно викликати значно більші трансмембранні струми, ніж у випадку NMDA-активованих сигналів. За цих умов середнє значення Pf для соматичних та дендритних каїнат-активованих рецептор-каналів дорівнювало 0.68 ± 0.20% (n= 12) та 0.61 ± 0.16% (n= 7) відповідно. Подібне значення Pf було отримано для соматичних каїнат-активованих рецептор-каналів. Мал. 5А ілюструє експерименти, в яких дендритні Ca2+-сигнали викликали за допомогою йонофоретичної аплікації АМРА. І в цьому випадку активація АМРА-рецепторів приводила до входу Ca2+ всередину клітини. В середньому, ми отримали значення Pf 0.66 ± 0.25% (n = 5 нейронів) для дендритних та 0.58 ± 0.34% (n = 9 нейронів) для соматичних аплікацій АМРА.

Мал. 5. Трансмембранний вхід Ca2+ через соматичні та дендритні рецептор-канали не-NMDA-типу. А, АМРА-активовані трансмембранні струми (внизу) та відповідні зміни F380 (вгорі), отримані внаслідок локальних йонофоретичних аплікацій АМРА до апікального дендриту пірамідного нейрону. Б, подібність значень Pf, виміряних попарно в сомі та дендритах пірамідних нейронів гіпокампу у відповідь на локальну йонофоретичну аплікацію АМРА і каїнату. Дендритні значення є нормалізованими до відповідних значень Pf, отриманих в сомі відповідного нейрону.

Щоб порівняти Ca2+-проникність соматичних та дендритних не-NMDA-рецепторів, відповідні значення Pf було виміряно попарно в сомі та дендритах одних і тих же нейронів (мал. 5Б). Дані досліди не виявили значної відмінності між Ca2+-проникністю соматичних та дендритних АМРА- та каїнат-активованих рецепторів. Отже, в даній роботі нам вперше вдалося виміряти Ca2+-проникність "класичних" глутаматних рецепторів не-NMDA-типу, що довгий час вважались непроникними для Ca2+, і встановити, що їх Ca2+-проникність становить 0.6%.

Кальцієва проникність глутаматних рецептор-каналів в клітинах Пуркіньє мозочку

На сьогодні загальноприйнятою є думка, що глутаматні рецептори в клітинах Пуркіньє мозочку представлені виключно рецепторами не-NMDA-типу, оскільки клітини Пуркіньє не мають функціональних NMDA-рецепторів (Perkel, 1990; Farrant, 1991; Llano, 1991). Оскільки до цього часу Ca2+-проникність класичних рецептор-каналів не-NMDA-типу вважалась мізерною, їх вплив на [Ca2+]i систематично не вивчався. Однак, як показано на мал.6, за умов присутності 1 мМ fura-2 у внутрішньоклітинному розчині йонофоретична аплікація як АМРА, так і каїнату викликала великі трансмембранні струми, кожен з яких супроводжувався значною зміною флюоресценції на Ca2+-чутливій довжині хвилі F380. В середньому, значення Pf для соматичних АМРА-активованих рецептор-каналів складало 0.57 ± 0.33 % (n=4), а значення Pf для соматичних каїнат-активованих рецептор-каналів складало 0.63 ± 0.12 % (n= 4) при потенціалі на клітинній мембрані від -60 до -80 мВ та зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 1.6 мМ.

Мал.6. Йонофоретичні аплікації АМРА і каїнату викликають активацію рецептор-каналів зі схожою Ca2+-проникністю. А, каїнат-активований трансмембранний струм (внизу) та відповідна зміна F380 (вгорі), виміряні в клітині Пуркіньє мозочку 4-денного щура. Суцільна лінія є результатом симуляції кривої зміни флюоресценції на основі зміни трансмембранного струму. Б, Аналогічно проілюстровані результати локальної аплікації АМРА до нейрону Пуркіньє в зрізі мозочку 5-денного щура. В, лінійна залежність між Ca2+-зарядом, що проникає в клітину напротязі перших 5-ти сек після активації АМРА-активованих рецептор-каналів, та сумарним переміщенням заряду за той самий час. Тангенс кута нахилу прямої, що є лінійним наближенням експериментальних даних, обчисленим за методом найменших квадратів, дорівнює значенню фракційного Ca2+-струму.

Таким чином, клітини Пуркіньє дійсно експресують рецептор-канали не-NMDA-типу з низькою Ca2+-проникністю, що нагадує проникність рецептор-каналів не-NMDA-типу в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу. Однак, зважаючи на велику амплітуду глутамат-активованих струмів в цих нейронах, за фізіологічних умов їх активація може викликати значну зміну [Ca2+]i.

Кальцієва проникність рецептор-каналів NMDA-типу в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки

Для отримання більш повного уявлення про властивості нативних глутаматних рецепторів в різних типах нейронів ЦНС ми провели дослідження NMDA-рецепторів в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки, котрі є одним з типів гальмівних інтернейронів.

Мал.7. Вимірювання фракційного Ca2+-струму через NMDA-активовані рецептор-канали в сомі нейронів серединної перетинки. А, мікрофотографія ГАМК-ергічного нейрону серединної перетинки. Б, трансмембранний струм (внизу) та асоційований Ca2+-сигнал (вгорі) у відповідь на йонофоретичну аплікацію NMDA. В, співвідношення значення електричного заряду, що потрапляв в клітину за умов активації рецептор-каналів NMDA-типу, та відповідного значення PfNMDA. Даний графік підсумовує результати, отримані в усіх дослідах цього типу.

Оскільки морфологічно ці нейрони не відрізняються від холінергічних нейронів, присутніх в цьому регіоні мозку (Naumann, 1992), всі досліджені клітини було ідентифіковано на основі наявності в них глутаматдекарбоксилази (GAD), специфічного маркера ГАМК-ергічних нейронів (Gritti, 1993). Мал. 7 ілюструє типовий ГАМК-ергічний нейрон серединної перетинки і зареєстровані в цьому нейроні зміни Ca2+-чутливої флюоресценції fura-2 (F390) та трансмембранного струму у відповідь на йонофоретичну аплікацію NMDA. Отримане в дослідах даного типу значення Pf для соматичних NMDA-активованих рецептор-каналів складало 12.0 ± 3.9% (n=10 клітин). Цікаво, що це значення майже співпадало зі значенням Pf, отриманим для пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу, засвідчуючи, що збудні та гальмівні нейрони в різних відділах ЦНС експресують функціонально схожі NMDA-рецептори.

Отже, в даній роботі ми вдосконалили метод, розроблений свого часу Неєром та Августином для вивчення кальцієвого гомеостазу в секреторних хромафінних клітинах (Neher, 1992), вперше пристосувавши його для вимірювання Ca2+-проникності нативних глутаматних рецепторів, розташованих на нейронах в зрізах мозку, де ці нейрони зберігають своє надзвичайно розгалужене дендритне дерево. Це дало можливість виміряти частку йонів кальцію, що проникають в нейрон через рецептор-канали NMDA- та не-NMDA-типу. Завдяки високій чутливості застосованого методу нам вдалося виміряти Ca2+-проникність "класичних" глутаматних рецепторів не-NMDA-типу, що довгий час вважались непроникними для Ca2+. Проведене нами дослідження дало змогу порівняти властивості глутаматних рецептор-каналів в основних типах нейронів ЦНС, таких як: принципові збуджуючі нейрони (на прикладі нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципові гальмівні нейрони (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) та гальмівні інтернейрони (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки). Таким чином, дана робота є найбільш повним, на сьогодні, порівняльним дослідженням Ca2+-проникності нативних глутаматних рецепторів в нейронах ЦНС. Крім того, в даній роботі ми розробили підхід (Garaschuk, 1998; Garaschuk, 1999), за допомогою якого метод вимірювання трансмембраних потоків можна застосувати для вивчення дендритних глутаматних рецепторів. На сьогодні, дана робота є єдиним дослідженням Ca2+-проникності дендритних глутаматних рецепторів за фізіологічних умов. В той час, як соматичні рецептори є в переважній більшості позасинаптичними, ймовірно, що велика частка досліджених нами дендритних рецепторів репрезентує синаптичні глутамат-активовані рецептори. Таким чином, нами встановлено близькість функціональних властивостей позасинаптичних (соматичних) та синаптич-них глутаматних рецептор-каналів як NMDA- так і не-NMDA-типу.

Взаємозвўязок між молекулярним складом та функціональними властивостями нативних глутаматних рецепторів

Щоб встановити, чи існує взаємозв'язок між молекулярною будовою нативних глутаматних рецепторів та їх Ca2+-проникністю, а також іншими функціональними властивостями, досліджені вище типи нейронів ЦНС було проаналізовано на вміст мРНК, що кодує різні субодиниці глутаматних рецепторів.

Молекулярна будова нативних NMDA-рецепторів в глутамат- та ГАМК-ергічних нейронах ЦНС

Нативні NMDA-рецептори складаються з пўяти різних субодиниць, названих NR1 та NR2A-D (щурі, (Monyer, 1992)) або z1і e1-e4 (миші, (Kutsuwada, 1992)). Попередні молекулярно-біологічні дослідження рекомбінантних рецепторів показали, що NR1-субодиниці зустрічаються у всіх відділах ЦНС та є необхідними для утворення функціональних NMDA-рецепторів (Monyer, 1994; Zukin, 1995). Різноманітні ж властивості рекомбінантних NMDA-рецепторів визначаються присутністю певного типу NR2-субодиниць (McBain, 1994). Тому ми зосередили свою увагу на виявленні мРНК, що кодують різні NR2-субодиниці.

Для встановлення взаємозв`язку між функціональними властивостями та молекулярним складом NMDA-рецепторів в нейронах певного типу вміст мРНК окремих клітин було досліджено за допомогою методу зворотньої транскрипції та ланцюгової реакції полімерази (Lambolez, 1992). Після закінчення електрофізіологічних та флюориметричних вимірювань вміст цитоплазми клітини було висмоктано через ту саму піпетку, що застосовувалась для внутрішньоклітинної перфузії, та проаналізовано на вміст мРНК, що кодують різні NR2-субодиниці. Використовуючи праймери, специфічні для комплементарних ДНК, які кодують NR2A-, NR2B- та NR2C-субодиниці, було показано, що в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки 96% клітин експресують NR2B-субодиницю. При цьому 20% проаналізованих клітин експресували виключно NR2B, 40% - NR2B та NR2A, 28% - NR2B та NR2C, і, нарешті, 8% експресували NR2B-, NR2C- та NR2A-субодиниці. Лише в одній з усіх проаналізованих клітин NR2B-субодиниці не було виявлено, натомість було знайдено виключно NR2A-субодиниці.

Таблиця 1. Субодиниці рецептор-каналів АМРА- та NMDA-типу, виявлені в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу.

В окремій серії експериментів присутність NR2D-субодиниці було виявлено в 75% проаналізованих нейронів. NR2B-субодиниця також виявилась присутньою в більшості пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу. З 23 проаналізованих клітин 19 експресували NR2B й NR2A, 2 - лише NR2B та 2 - NR2B, NR2A й NR2C (табл. 4.1). На підставі цих молекулярнобіологічних даних ми висунули гіпотезу, що функціональні властивості нативних NMDA-рецепторів, включаючи їхню проникність для Ca2+, в значній мірі обумовлюються присутністю домінантної NR2B-субодиниці.

Дійсно, коли цю гіпотезу було провірено більш детально для нейронів серединної перетинки, виявилось, що в них NMDA-рецептори з високою ефективністю блокуються зовнішньоклітинними йонами магнію, що характерно для рекомбінантних рецепторів, які включають NR2B-субодиницю. В подальших дослідах було показано, що NMDA-рецептори нейронів серединної перетинки з високою ефективністю блокуються також специфічним блокатором NR2B-субодиниці іфенпродилом (мал. 8).

Мал. 8. Вплив селективного блокатора рецептор-каналів NMDA-типу, що містять NR2В-субодиницю, іфенпродилу на амплітуду NMDA-активованих струмів. А та Б, блокування NMDA-активованих струмів іфенпродилом. Струми було зареєстровано під час поступової зміни потенціалу на мембрані нейрону від +40 до -80 мВ (60 мВ/сек, так званий voltage ramp) в присутності 50 µМ NMDA у зовнішньоклітинному розчині в контролі, та в присутності 3 µМ іфенпродилу. Наведені дані ілюструють різницю в ступені блокади, що спостерігалась в різних клітинах.

Більше того, основний рівень провідності окремих NMDA-активованих каналів, зареєстрованих у фрагментах клітинної мембрани цих ГАМК-ергічних нейронів, складав 42 pS та 49 pS при зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 2 та 1 мM відповідно. Подібні значення було отримано при вивченні провідності окремих каналів рекомбінантних NMDA-рецепторів, що складаються з NR1-, NR2A- або NR1-, NR2B-субодиниць (50/51pS; (Stern, 1992; Tsuzuki, 1994)).

Молекулярна будова нативних АМРА-рецепторів в глутамат- та ГАМК-ергічних нейронах ЦНС

Дослідження, подібні до описаних вище для NMDA-рецепторів, було проведено також для нативних АМРА-рецепторів в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочку. В цьому випадку цитоплазму нейронів було проаналізовано на вміст мРНК, що кодують GluRА-D субодиниці (Lambolez, 1992). З особливою увагою ми поставились до виявлення GluRB-субодиниці, що визначає Ca2+-проникність рекомбінантних АМРА-рецепторів (Hollmann, 1991; Hume, 1991; Burnashev, 1992). Як показано в таблиці 1, з 9 досліджених пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу всі експресували GluRA- і GluRB-субодиниці і всі, за винятком однієї клітини, експресували GluRC-субодиницю. Присутність GluRD-субодиниці було виявлено лише в одному нейроні.

Подібні дані було отримано також в дослідах з клітинами Пуркіньє мозочку, де фрагменти комплементарної ДНК, що відповідають GluRA-C-субодиницям, було виявлено в усіх нейронах обох досліджених вікових груп (Р5-7, n=8 клітин та Р14-17, n=6 клітин). В той же час GluRD-субодиницю було виявлено лише у двох клітинах молодшої вікової групи.

Таким чином, отримані молекулярно-біологічні дані узгоджуються з результатами вимірювання Ca2+-проникності і приводять до висновку, що низька Ca2+-проникність нативних рецепторів не-NMDA-типу зумовлюється присутністю в їх складі GluRВ-субодиниці.

Завдяки вивченню рекомбінантних глутаматних рецепторів за останній час було накопичено досить докладні дані про функціональні властивості деяких типів гомо- та гетеромерних рецепторів (Sommer, 1991; Burnashev, 1992; Monyer, 1992; Burnashev, 1995; Koh, 1995). Однак, як показано в цьому (див. табл. 1) та інших (Lambolez, 1992; Bochet, 1994; Monyer, 1994; Burnashev, 1995) дослідженнях, ці результати не можна безпосередньо застосувати для з`ясування властивостей нативних глутаматних рецепторів в нейронах ЦНС, оскільки ці нейрони містять велику кількість різних субодиниць глутаматних рецепторів. В нашому дослідженні ми вперше поєднали вимірювання Ca2+-потоків через нативні глутамат-активовані рецептор-канали на мембрані нейронів ЦНС та аналіз вмісту мРНК, які кодують ці рецептор-канали. Це дозволило співвіднести дані про Ca2+-проникність глутаматних рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу з їх молекулярною будовою. На основі порівняння молекулярної будови та функціональних властивостей глутаматних рецептор-каналів, виявлених в різних типах нейронів ЦНС, ми прийшли до висновку, що функціональні властивості, і в першу чергу Ca2+-проникність, рецептор-каналів NMDA-типу зумовлюються домінантною NR2В-субодиницею. Аналогічно, наші дослідження підтвердили виявлену при вивченні рекомбінантних не-NMDA-рецепторів визначальну роль GluR-В-субодиниці у детермінації властивостей гетеромерних не-NMDA-рецепторів. Таким чином, отримані нами дані дають змогу прогнозувати властивості нативних глутамат-активованих рецептор-каналів не-NMDA- та NMDA-типів спираючись на дані про їх молекулярну будову. Віриться, що отримані результати сприятимуть глибшому розумінню функції нативних глутаматних рецептор-каналів в різних відділах мозку та створенню ліків, здатних селективно впливати на певні види рецепторних комплексів.

Регуляція [Ca2+]i внутрішньоклітинними рианодин-чутливими Ca2+-депо

Викид та запасання йонів кальцію рианодин-чутливими Ca2+-депо в сомі і дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу

Викид Ca2+ в цитоплазму клітини з внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо може потенційно активуватися як специфічними агоністами рианодинових рецепторів (кофеїн, циклічна АДФ-рибоза), так і йонами Ca2+, що потрапляють в цитоплазму через мембрану клітини (так званий Ca2+-індукований викид Ca2+, СICR) (Nabauer, 1989). В переважній більшості наведених нижче експериментів для активації викиду Ca2+ з цих депо ми використовували специфічний агоніст кофеїн, який локально аплікували з тонкої скляної піпетки за допомогою тиску.

Мал. 9 ілюструє схему експерименту, розроблену нами для проведення наведених нижче дослідів. Короткотривала (3 с) аплікація кофеїну з піпетки, схематично зображеної на мал.9Б, до групи пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу, забарвлених ліпід-розчинним Ca2+-чутливим барвником fura-2 АМ, викликала зріст [Ca2+]i в усіх нейронах, що знаходились поблизу піпетки (мал. 9Г). Амплітуда кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в 105 пірамідних клітинах, розташованих безпосередньо поблизу піпетки, набувала значень від 50 до 600 нМ (в середньому 253±269 нМ, n=105 клітин з 85 зрізів гіпокампу).

Мал. 9. Ca2+-сигнали, викликані локальною аплікацією кофеїну до пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу. А, схема експерименту. Б, мікрофотографія шару пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу, забарвлених fura-2 AM. Пронумеровані прямокутники окреслюють регіони, сигнали від яких показано в В. В правому верхньому куті схематично позначено місце розташування мікропіпетки для аплікації кофеїну. В, кофеїн-активовані Ca2+-відповіді 4-х нейронів, позначених в Б, що знаходились в безпосередній близькості до мікропіпетки. Позначені літерами стрілки відмічають моменти часу, що відповідають аналогічно позначеним псевдокольоровим зображенням в Г. Г, псевдокольорові зображення, що ілюструють значення [Ca2+]i отримані в контролі (а), під час аплікації кофеїну (b) та після повернення [Ca2+]i до контрольного рівня (с).

Кофеїн-активовані Ca2+-сигнали спостерігались в переважній більшості (123 з 133) досліджених пірамідних нейронів і не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (мал. 10, 11; Vh=-60 мВ). На відміну від Ca2+-сигналів, викликаних активацією потенціал-залежних Ca2+-каналів, кофеїн-активовані Ca2+-сигнали зберігались за відсутності Ca2+ в зовнішньоклітинному розчині і селективно блокувались специфічним блокатором рианодинових рецепторів рианодином (n=21; мал. 10).

Мал. 10. Рианодин селективно блокує кофеїн-активовані Ca2+-сигнали в пірамідних нейронах гіпокампу. Кофеїн-активовані Ca2+-сигнали та асоційовані трансмембранні струми, зареєстровані в контролі та в умовах присутності 20 µМ рианодину в зовнішньо-клітинному розчині. На цьому та наступних малюнках момент аплікації кофеїну позначено трикут-никами. Зауважте, що рианодин селективно блокує кофеїн-активовані Ca2+-сигнали, не впливаючи на амплітуду транс-мембранних струмів та асоційованих Ca2+-сигналів, викликаних деполяриза-цією нейрону (вертикальні стрілки).

За умови присутності у внутрішньоклітинному розчині К+ як основного катіону кофеїн-активовані Ca2+-сигнали супроводжувались вихідним струмом (n= 4), котрий повністю блокувався при заміні К+ на Cs+ (мал. 10). Отже, викид Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо відбувається в безпосередній близькості від клітинної мембрани, так, що викликаний зріст [Ca2+]i є достатнім для активації Ca2+-активованих К+-каналів.

Щоб дослідити просторове розташування функціональних рианодин-чутливих Ca2+-депо, ми локально аплікували кофеїн до соми та дендритів одних і тих же пірамідних нейронів. Аплікація кофеїну як до соми, так і до дендритів приводила до реєстрації локального Ca2+-сигналу (мал. 11). Ca2+-сигнали, викликані в дендритах, не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (мал. 11Б) і, загалом, були подібними до сигналів, зареєстрованих в сомі (n=9 експериментів, 6 нейронів).

Отже, функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо знаходяться не лише в сомі, а також і в апікальних дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону, і можуть активуватись незалежно від соматичних Ca2+-депо.

Мал. 11. Локалізовані кофеїн-активовані Ca2+-сигнали в сомі і дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу. А, псевдокольорове зображення зросту [Ca2+]i, викликаного локальною аплікацією кофеїну до соми та апікального дендриту нейрону. Б, Ca2+-сигнал та асоційований трансмембранний струм, зареєстровані під час аплікації кофеїну до апікального дендриту іншого пірамідного нейрону.

Коли кофеїн аплікували декілька разів підряд, амплітуда Ca2+-сигналу, викликаного другою і наступними аплікаціями, завжди була меншою за амплітуду першого Ca2+-сигналу (мал. 12). Відновлення амплітуди кофеїн-активованого Ca2+-сигналу відбувалось спонтанно і поступово, протягом 2 хв після останньої аплікації.

Мал. 12. Спустошення та спонтанне відновлення Ca2+-вмісту рианодин-чутливих Ca2+-депо. А, три пари кофеїн-активованих Ca2+-сигналів, що відрізняються інтервалом між моментом першої та другої аплікації. Накладання контрольних Ca2+-сигналів один на один дозволяє проілюструвати часову залежність процесу відновлення Ca2+-вмісту всередині депо. Б, дані, отримані в усіх дослідах даного типу (29 нейронів, 56 пар даних). Амплітуду тестового Ca2+-сигналу було пронормалізовано на амплітуду контрольної відповіді та відкладено як функцію часового інтервалу Dt між цими аплікаціями. Суцільна лінія ілюструє наближення отриманих даних експоненційною функцією, отримане за методом найменших квадратів. Пунктирна лінія ілюструє апроксимацію отриманої функції до початку координат.

Часова константа спонтанного відновлення Ca2+-вмісту всередині Ca2+-депо становила 59 с. Активація потенціал-залежних Ca2+-каналів одразу після повного спустошення рианодин-чутливих Ca2+-депо 6-ма послідовними аплікаціями кофеїну приводила до підвищення [Ca2+]i і швидкого відновлення вмісту Ca2+ всередині депо, свідчачи, що в описаних дослідах йдеться саме про спустошення Ca2+-депо, а не, скажімо, про тимчасову десенситизацію рианодинових рецепторів в присутності кофеїну. Відновлення вмісту Ca2+-депо, викликане підвищенням [Ca2+]i, було значно швидшим за спонтанне відновлення.

В більшості тканин транспортування Ca2+ всередину внутрішньоклітинних депо відбувається за допомогою ендоплазматичних Ca2+-насосів (Ca2+-АТФаз), які, як відомо, зворотньо блокуються циклопіазоновою кислотою (CPA; (Seidler, 1989)) та незворотньо - тапсигаргіном ((Thastrup, 1990)). В наших дослідах присутність 20-30 мкМ СРА чи 1-3 мкМ тапсигаргіну у зовнішньоклітинному розчині перешкоджали спонтанному відновленню вмісту Ca2+ всередині депо, свідчачи, що цей процес опосередковується ендоплазматичними Ca2+-насосами. Цікаво, що навіть за відсутності попереднього спустошення Ca2+-депо, присутність СРА у зовнішньоклітинному розчині напротязі 7 хв приводила до зникнення кофеїн-активованих Ca2+-сигналів (6 з 6-ти клітин). Наведені дані свідчать, що рианодин-чутливі Ca2+-депо не є щільними і безперервно втрачають певну частину запасу Ca2+. В контролі цей спонтанний витік Ca2+ з депо урівноважується активним транспортом Ca2+ в протилежному напрямку, опосередкованим ендоплазматичними Ca2+-насосами.

Для подальшого з`ясування механізму спонтанного відновлення вмісту Ca2+ всередині депо ми дослідили, чи залежить це відновлення від присутності Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині. Як показано на мал. 13, у безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині зменшення амплітуди кофеїн-активованих Ca2+-сигналів відбувалося значно швидше, що свідчить про прискорене спустошення внутрішньоклітинних депо за цих умов. Більше того, відсутність Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині перешкоджала відновленню Ca2+-сигналів (n=6). Це вказує на необхідність трансмембранного входу Ca2+ для спонтанного відновлення його вмісту всередині депо (мал. 13).

Мал. 13. Спонтанне відновлення вмісту Ca2+ всередині депо вимагає трансмембранного входу Ca2+. Спонтанне відновлення вмісту Ca2+-депо, спустошених 6-ма послідовними аплікаціями кофеїну, відбувалося в контролі, але не за відсутності Ca2+ в зовнішньоклітинному розчині.

Процес трансмембранного входу Ca2+, необхідного для відновлення його вмісту всередині депо, блокувався такими неспецифічними блокаторами Ca2+-каналів, як 2 мМ Ni2+ (n=4) і 0.5 мМ D600 (n=9). Цей процес, однак, не блокувався селективним блокатором потенціал-залежних Ca2+-каналів L-типу нітрендипіном (10 мМ, n=5).

У підсумку, наведені дані свідчать, що спонтанне відновлення вмісту Ca2+ всередині внутрішньоклітинних Ca2+-депо критично залежить від його трансмембранного входу через Ni2+- та D600-чутливі, дигідропіридин-нечутливі Ca2+-канали, що здатні відкриватися при потенціалі спокою.

Ступінь заповнення внутрішньоклітинних Ca2+-депо йонами кальцію залежить від рівня [Ca2+]i

Як показано на мал. 14, зміни [Ca2+]i можуть впливати на амплітуду кофеїн-активованих Ca2+-сигналів. В усіх проведених експериментах (n=26) спостерігалась прямопропорційна залежність між амплітудою кофеїн-активованих Ca2+-сигналів та рівнем [Ca2+]i. Ця залежність віддзеркалює присутність більшої кількості Ca2+ у внутрішньоклітинних депо протягом (мал. 14) та одразу після (мал. 15) підвищення [Ca2+]i. Надлишок Ca2+, акумульований в депо під час підвищення [Ca2+]i, повільно витікає з депо так, що амплітуда кофеїн-активованих Ca2+-сигналів досягає контрольного рівня через 6-9 хв після відновлення контрольного рівня [Ca2+]i (мал. 15).

Мал. 14. Амплітуда кофеїн-активованих Ca2+-сигналів зростає зі зростом [Ca2+]i. А, кальцієві сигнали, викликані аплікацією кофеїну в контролі (значення [Ca2+]i = 42 нМ) та на фоні викликаного присутністю 40 мМ КСl підвищення [Ca2+]i (значення [Ca2+]i = 284 нМ). Б, представлена у вигляді гістограми залежність амплітуди кофеїн-активованого Ca2+-сигналу від рівня [Ca2+]i перед початком аплікації кофеїну. Дані було отримано попарно в 26 експериментах, подібних до наведеного в А. Амплітуду Ca2+-сигналу, викликаного після збільшення рівня [Ca2+]i, було пронормовано на амплітуду відповідного Ca2+-сигналу, викликаного в контролі.

Мал. 15. Після відновлення контрольного рівня [Ca2+]i вміст Ca2+ всередині депо повільно повертається до контрольного рівня. А, зверху: кофеїн-активовані Ca2+-сигнали було викликано в контролі та одразу після повернення [Ca2+]i до контрольного рівня після короткотривалого його зросту, викликаного короткою аплікацією КСl. Внизу: описаний вище експериментальний протокол було повторено, збільшивши часовий інтервал між підвищенням [Ca2+]i, викликаним аплікацією КСl, та тестовою аплікацією кофеїну. Б, гістограма, що підсумовує дані, отримані в 31 експерименті даного типу. Нормалізоване значення амплітуди тестового кофеїн-активованого Ca2+-сигналу відкладено як функцію часового інтервалу Dt. Для зручності інтервал Dt вимірювали від піку зросту [Ca2+]i, викликаного аплікацією КСl, до піку тестової аплікації кофеїну.

Ці результати свідчать, що рианодин-чутливі Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу мають високу ємність і можуть запасати значно більше йонів Ca2+, ніж їх там знаходиться в стані спокою. Таким чином, перехідне чи довготривале підвищення [Ca2+]i приводить до пропорційного збільшення запасів Ca2+ всередині депо.

Роль рианодин-чутливих Ca2+-депо в процесі Ca2+-активованого

викиду Ca2+

Усі отримані до цього часу дані свідчать про те, що рианодин-чутливі Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу виступають в ролі регульованого Ca2+-буферу. Однак в м`язах, як і у деяких типах нейронів (Friel, 1992; Hua, 1993; Llano, 1994), ці депо беруть безпосередню участь в процесі Ca2+-активованого викиду Ca2+ (CICR) в цитоплазму нейронів. Для з`ясування ролі цих депо в процесі CICR в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу ми порівняли амплітуду Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією клітинної мембрани, в контролі та після спустошення внутрішньоклітинних Ca2+-депо (мал. 16).

Мал. 16. Вплив кофеїн-опосередкованого спустошення внутрішньоклітинних Ca2+-депо на амплітуду Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією клітинної мембрани. Ca2+-сигнали, викликані короткотривалою локальною аплікацією 80 мМ КСl, було зареєстровано в контролі та після повного спустошення внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо шістьма послідовними аплікаціями кофеїну. Зауважте, що спустошення Ca2+-депо ніяк не впливало на амплітуду невеликих (D[Ca2+]i = 200 нМ) Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією клітинної мембрани в А, і в той же час спричиняло помітне зменшення амплітуди великих (D[Ca2+]i = 400 нМ) Ca2+-сигналів в Б.

Згрупувавши результати дослідів відповідно до амплітуди викликаного деполяризацією Ca2+-сигналу в контролі, ми виявили достовірне (p<0.001, t тест Стьюдента) зменшення амплітуди тестового сигналу (0.89 ± 0.10, n=16) для групи, де амплітуди в контролі перевищували 200 нМ. Жодного зменшення амплітуди тестового сигналу не було отримано для групи, де амплітуди в контролі не перевищували 200 нМ (1.05 ± 0.16, n=41). Наведені дані свідчать, що Ca2+-активований викид Ca2+ не відіграє суттєвої ролі для Ca2+-сигналів незначної амплітуди (< 200 нМ), в той же час цей процес може значно підсилювати амплітуду Ca2+-сигналів більшої амплітуди (> 200 нМ).

Властивості рианодин-чутливих Ca2+-депо в клітинах Пуркіньє мозочку

Кофеїн-активований викид Ca2+ з рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо в сомі та дендритах клітин Пуркіньє

Подібно до пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу в клітинах Пуркіньє кофеїн теж здатний викликати викид Ca2+ з рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо. При потенціалі на мембрані -60 мВ кофеїн-активовані Ca2+-сигнали не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (n=5), не залежали від присутності Ca2+ в зовнішньоклітинному розчині (n=5) і блокувались селективними блокаторами рианодинових рецепторів рианодином (n=22) та рутенієм червоним (n=5). Присутність кофеїну у зовнішньоклітинному розчині приводила до кофеїн-активованого зросту [Ca2+]i в сомі та в усіх видимих дендритах нейронів. Подібно до кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в пірамідних нейронах амплітуда соматичних кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в клітинах Пуркіньє зростала з підвищенням [Ca2+]i (мал. 17А). Цікаво, що подібна залежність спостерігалась також і для дендритних кофеїн-активованих Ca2+-сигналів (мал. 17Б), свідчачи про подібні функціональні властивості соматичних та дендритних Ca2+-депо.

Мал. 17. Залежність амплітуди кофеїн-активованих Ca2+-сигналів від рівня [Ca2+]i. А, дані, отримані в сомі перфузованих (заштриховані символи) та інтактних (порожні символи)  нейронів. Б, дані, отримані в дендритах перфузованих нейронів.

Кофеїн подовжує тривалість Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією клітинної мембрани та синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон

Ca2+-сигнали, викликані деполяризацією клітинної мембрани в сомі клітини Пуркіньє, в основному та другорядному апікальних дендритах, тривали значно довше в присутності 20 мМ кофеїну в зовнішньоклітинному розчині. Так, час від ініціації Ca2+-сигналу до моменту його спаду до 1/ 2 максимальної амплітуди (t1/2 ) збільшувався в 2.3 ± 0.8 рази в сомі, в 2.7 ± 1.2 рази в основному та в 3.2 ± 1.5 рази в другорядних апікальних дендритах (n=37). Цей викликаний кофеїном ефект спостерігався також протягом 4-х хвилин після його вилучення із зовнішньоклітинного розчину (n=9). Це збільшення тривалості Ca2+-сигналу не було пов'язаним з кофеїн-активованим збільшенням входу Ca2+ через клітинну мембрану, оскільки відповідні потенціал-залежні Ca2+-струми відрізнялися меншою амплітудою і прискореною інактивацією.

Щоб зўясувати, чи має викликане кофеїном збільшення тривалості потенціал-активованих Ca2+-сигналів пряме фізіологічне значення, ми розглянули вплив кофеїну на Ca2+-сигнали, викликані синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон. Оскільки амплітуда ГАМК- та глутамат-активованих синаптичних струмів зменшується в присутності 20 мМ кофеїну в зовнішньоклітинному розчині, подальші експерименти було проведено одразу після відмивки кофеїну, використовуючи той факт, що ефект кофеїну зберігається протягом наступних кількох хвилин. Під впливом кофеїну значення t1/2 синаптичних Ca2+-сигналів зростало від 2.9 ± 0.7 с до 10.8 ± 2.7 с в головному та від 3.9 ±0.9 с до 14.6 ± 3.1 с в другорядних дендритах. Таким чином, викликаючи збільшення тривалості Ca2+-сигналів, викликаних синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон, кофеїн є потенційно здатним впливати на ефективність синаптичної передачі в цих синапсах.

На основі наведених вище даних можна припустити, що викликане кофеїном збільшення тривалості потенціал-активованих Ca2+-сигналів віддзеркалює процес Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Дійсно, ефект кофеїну повністю блокувався антагоністом рианодинових рецепторів рутенієм червоним, оскільки нам не вдалося виявити викликаного кофеїном збільшення тривалості як потенціал-активованих, так і викликаних синаптичною стимуляцією (мал. 18) Ca2+ -сигналів в сомі та дендритах клітин Пуркіньє за умови присутності 10 µМ рутенію червоного у внутрішньоклітинному розчині.

Мал. 18. Рутеній червоний блокує кофеїн-опосередковане продовження тривалості дендритних Ca2+-сигналів, викликаних стимуляцією ліаноподібних волокон. А, Ca2+-сигнали, викликані стимуляцією ліаноподібних волокон в проксимальних дендритах клітини Пуркіньє, в контролі (порожні символи) та через 2 хв після номінальної відмивки 20 мМ кофеїну (заштриховані символи). Момент стимуляції ліаноподібних волокон позначено трикутником. Б, усереднені дані, що ілюструють значення t1/2 в контролі та в присутності кофеїну і рутенію червоного в зовнішньоклітинному розчині.

Наведені дані дають підставу вважати, що в основі викликаного кофеїном збільшення тривалості Ca2+-сигналів в сомі та дендритах лежить процес CICR з внутрішньоклітинних Ca2+-депо.

 Таким чином, дана робота є грунтовним дослідженням властивостей рианодин-чутливих Ca2+-депо в принципових збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС. Отримані дані свідчать, що функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо знаходяться не тільки в сомі, а і в дендритах даних нейронів, а також, що соматичні і дендритні Ca2+-депо є функціонально незалежними і, отже, здатні брати участь у локальних субклітинних процесах. В стані спокою ці депо відіграють роль буферу, ефективно нейтралізуючи надлишок йонів Ca2+, що потрапляють в клітину в результаті активації різноманітних трансмембранних процесів. Внутрішньоклітинні Ca2+-депо мають велику буферну ємність і є частково заповненими в стані спокою (мал.19).

Мал. 19. Схематичне узагальнення функціональних властивостей рианодин-чутливих Ca2+-депо в нейронах ЦНС. Пояснення в тексті.

Стан заповнення депо залежить від рівня [Ca2+]i і контролюється ендоплазматичними Ca2+-АТФазами (SERCA). Спустошені внаслідок активації рианодинових рецепторів Ca2+-депо заповнюються або спонтанно, шляхом активації виявленого нами механізму трансмембранного входу Ca2+, що функціонує в стані спокою, або внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. В той же час, на значне зростання трансмембранних Ca2+-потоків, як це відбувається, наприклад, за умов потужної нейрональної активності, внутрішньоклітинні Ca2+-депо відповідають Ca2+-активованим викидом Ca2+, таким чином значно підсилюючи внутрішньоклітинні Ca2+-сигнали.

 В пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу активація викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо не вимагала попереднього їх заповнення шляхом активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. Ці дані узгоджуються з даними інших авторів (Seymour-Laurent, 1995), отриманими внаслідок аплікації кофеїну до нейронів гіпокампу мишей в культурі. Отже, рианодин-чутливі Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу завжди зберігають здатність відповідати викидом Ca2+ на активацію рианодинових рецепторів. В протилежність цьому, рианодин-чутливі Ca2+-депо в клітинах Пуркіньє мозочку є переважно порожніми в стані спокою, і тому активація викиду Ca2+ в цих клітинах відбувається лише після попереднього їх заповнення. Найбільш ймовірно, що причиною цієї розбіжності є відсутність в клітинах Пуркіньє механізмів спонтанного заповнення внутрішньоклітинних Ca2+-депо (Garaschuk, 1997).

 Функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо було виявлено нами не тільки в сомі, але і в дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу та нейронів Пуркіньє мозочку щурів. В обох типах нейронів властивості соматичних та дендритних Ca2+-депо були схожими. Так, наприклад, в клітинах Пуркіньє мозочку щурів дендритні рианодин-чутливі Ca2+-депо демонстрували фармакологічні властивості та залежність вмісту від рівня [Ca2+]i дуже подібні до відповідних властивостей соматичних Ca2+-депо. Однак, за допомогою локальної аплікації кофеїну до соми та дендритів пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу вдалося показати, що за умов викиду Ca2+ та асоційованого з ним спустошення соматичних Ca2+-депо дендритні Ca2+-депо зберігали властивість відповідати на аплікацію агоністу викидом Ca2+. Ці досліди демонструють функціональну відособленість дендритних Ca2+-депо, що дає їм змогу приймати участь в локальних дендритних процесах інтеграції інформації.

 В даній роботі ми вперше описали процес спонтанного відновлення вмісту спустошених Ca2+-депо в нейронах ЦНС ссавців. Спонтанне відновлення вмісту Ca2+-депо не відбувалося в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині та за умови присутності у ньому неспецифічних блокаторів Ca2+-каналів Ni2+ та D600 як у дослідах з інтактними клітинами в присутності ТТХ, так і в перфузованих клітинах при фіксованому потенціалі на мембрані -60 мВ. Таким чином, механізм трансмембранного входу Ca2+, що відповідає за спонтанне відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо, здатен діяти при потенціалі спокою. Для пояснення даного механізму доводиться припустити присутність в клітинній мембрані певного класу Ca2+-каналів, що активуються внаслідок спустошення внутрішньоклітинних Ca2+-депо. В цьому випадку даний трансмембранний механізм нагадує добре відомий для незбудливих клітин механізм "ємнісного" ('capacitative') входу Ca2+, що активується внаслідок опосередкованого гормонами та нейротрансмітерами викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних IP3-чутливих Ca2+-депо (Tsien, 1990; Putney, 1993). Цікаво, що йони Ni2+ (2 mM), які успішно блокували спонтанне відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо в наших дослідах, є відомими блокаторами "ємнісного" входу Ca2+ в незбудливих клітинах (Tsien, 1990; Hoth, 1993).

 На додачу до "ємнісного" входу Ca2+, що діє при потенціалі спокою, як пірамідні нейрони СА1-регіону гіпокампу, так і клітини Пуркіньє мозочку володіють потужним механізмом заповнення внутрішньоклітинних Ca2+-депо внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. Дійсно, в нейронах обох типів вміст рианодин-чутливих Ca2+-депо швидко відновлювався внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. Це активність-залежне заповнення рианодин-чутливих Ca2+-депо спостерігається в багатьох типах нейронів (Brorson, 1991; Shmigol, 1994), і до цього часу вважалось універсальним і єдиним механізмом відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо в збудливих клітинах.

 Таким чином, трансмембранний вхід Ca2+ є необхідною умовою відновлення вмісту внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо в нейронах ЦНС. Для цього нейрони ЦНС володіють двома відмінними механізмами: (і) вперше описаним в даній роботі механізмом "ємнісного" входу Ca2+, що діє при потенціалі спокою, та (іі) механізмом активність-залежного входу Ca2+, що критично залежить від активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. В той час, як механізм активність-залежного відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо притаманний всім дослідженим на сьогодні типам нейронів ЦНС (Simpson, 1995), проведені нами дослідження свідчать, що механізм "ємнісного" входу Ca2+ є більш чи менш чітко вираженим, а то і майже відсутнім, в різних типах нейронів ЦНС, визначаючи їхню здатність до агоніст-активованого викиду Ca2+ за умови довготривалого перебування нейрону в стані спокою.

 Згідно до отриманих нами даних, рианодин-чутливі Ca2+-депо мають здатність активно регулювати амплітуду та тривалість фізіологічних Ca2+-сигналів. В стані спокою рианодин-чутливі Ca2+-депо виступають ефективним буфером Ca2+, що потрапляє в цитоплазму внаслідок активації потенціал- та агоніст-активованих каналів. На відміну від цього, під час епізодів посиленої клітинної активності, коли вміст Ca2+ всередині депо значно збільшується, підвищення [Ca2+]i відповідної амплітуди здатне викликати Ca2+-активований викид Ca2+ в цитоплазму нейрону. Нещодавно було показано (Shmigol, 1996), що підвищення концентрації Ca2+ всередині депо приводить до значного зниження порогу ініціації CICR. Ці дані дають підставу вважати, що рианодин-чутливі внутрішньоклітинні Ca2+-депо здатні відігравати роль "детектора співпадіння", вагомо підсилюючи лише ті фізіологічні Ca2+-сигнали, що виникають в період посиленої нейрональної активності.

Роль Ca2+-зв`язуючого білку кальбіндину в регуляції [Ca2+]i

Кальбіндин D28k є одним з найбільш поширених Ca2+-зв`язуючих білків в нейронах ЦНС ссавців (Baimbridge, 1992). В клітинах Пуркіньє мозочку кальбіндин складає біля 15% загальної маси внутрішньоклітинних білків (Baimbridge, 1982). З огляду на його поширеність, ми вибрали кальбіндин як модель для дослідження ролі Ca2+-зв'язуючих білків в регуляції Ca2+-гомеостазу в нейронах ЦНС. Для з`ясування впливу кальбіндину на регуляцію [Ca2+]i ми дослідили властивості Ca2+-сигналів, викликаних синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон. Досліди було проведено паралельно в контрольних мишах та мишах, позбавлених гену, що кодує кальбіндин D28k (Airaksinen, 1997), виведених нами в співробітництві з лабораторією проф. Тоенена (Мартінсріед, Німеччина). Гібридизація зрізів мозку з антитілами, направленими проти кальбіндину D28k, виявила присутність високого рівня кальбіндину в мозочку мишей дикого типу, та повну його відсутність в мозочку мишей-мутантів. В мишей-мутантів не було виявлено також надмірної експресії споріднених з кальбіндином Ca2+-зв`язуючих білків парвальбуміну, кальретиніну, кальбіндину D9k, кальмодуліну та ін. Таким чином результати наведених нижче експериментів дійсно спричинені відсутністю кальбіндину D28k.

В зрізах мозочку мишей-мутантів електрична стимуляція ліаноподібних волокон призводила до виникнення в нейронах Пуркіньє так званого комплексного спайку (Llinas, 1980), що не відрізнявся від контрольної відповіді. Так, разова стимуляція ліаноподібних волокон викликала 4.9 ± 2.0 та 5.1 ± 1.6 потенціалів дії відповідно в мутантах та мишах дикого типу. Подібною була також частота виникнення потенціалів дії (540 ± 105 та 505 ± 180 гц відповідно). В той же час, амплітуди дендритних Ca2+ сигналів в клітинах Пуркіньє мишей-мутантів, спричинених стимуляцією ліаноподібних волокон, були майже вдвічі більшими за контрольні, складаючи 0.44 ± 0.11 DF/F в контролі та 0.80 ± 0.25 DF/F в клітинах Пуркіньє мишей-мутантів. Це підвищення амплітуди дендритних Ca2+-сигналів спричинялося присутністю швидкого Ca2+-сигналу, з часовою константою 60 ± 20 мс, на піці Ca2+-відповіді, що був майже повністю відсутнім в контролі (мал. 20). Ca2+-сигнали в клітинах Пуркіньє гетерозиготних мишей мали проміжний характер, віддзеркалюючи градуальну зміну описаних властивостей в залежності від концентрації кальбіндину. Ми не виявили жодних відмінностей щодо рівня [Ca2+]i в стані спокою в клітинах Пуркіньє контрольних тварин та мишей-мутантів.

Мал. 20. Відсутність Ca2+-зв`язуючого білку кальбіндину D28k спричиняє драматичний зріст амплітуди викликаних синаптич-ною стимуляцією дендритних Ca2+-сигналів. А,Б, дендритні Ca2+-сигнали, викликані стимуляцією ліаноподібних волокон, в клітинах Пуркіньє мишей, позбавлених кальбіндину D28k (А, -}-, усереднений пробіг n=7 клітин, 4 тварини), та контрольних мишей (Б, +}+, усереднений пробіг n=6 клітин, 4 тварини). Криві над кожним пробігом є двоекспоненційним наближенням експериментальних даних, отриманим за методом найменших квадратів (суцільна лінія). Штрих-пунктирна лінія подає часовий перебіг швидкої компонен-ти цього наближення. В, максималь-не значення амплітуди швидкої компоненти в дослідах, проведених на клітинах Пуркіньє контрольних мишей, гетерозигот (+}-) та нуль-мутантів (-}-), відповідно. Г, значення [Ca2+]i в стані спокою, виміряне в інтактних, забарвлених fura-2 AM клітинах Пуркіньє контрольних мишей та нуль-мутантів. Зірочки позначають достовірно відмінні дані (t-тест Стьюдента, p<0.05). Момент стимуляції ліаноподібних волокон позначено трикутниками.

Таким чином, отримані дані свідчать, що фізіологічна роль кальбіндину D28k полягає у зв`язуванні йонів Ca2+ протягом перших 100 мс після ініціації Ca2+-сигналу, що дозволяє зарахувати кальбіндин D28k до швидкодіючих Ca2+-буферів з високою афінністю. Згідно літературних даних в клітинах Пуркіньє мозочку амплітуда та форма синаптично-активованих Ca2+-сигналів контролює багато різноманітних клітинних процесів, включаючи (1) регуляцію синаптичної передачі паралельних (Eilers, 1995) та повзучих (Eilers, 1995) синаптичних волокон, (2) збудність нейрону (Llinas, 1980), а також (3) довготривалі зміни ефективності збуджуючої (Konnerth, 1992) та гальмівної (Kano, 1992) синаптичної передачі. Як випливає з отриманих нами даних, всі ці процеси безпосередньо залежать від правильного функціонування Ca2+-зв`язуючого білку кальбіндину.

ГАМК-активовані Ca2+-сигнали в нейронах ЦНС

У зрілому віці g-аміномасляна кислота (ГАМК) є найбільш поширеним гальмівним нейромедіатором центральної нервової системи (ЦНС) ссавців (Sivilotti, 1991). Однак, отримані нами дані свідчать, що під час раннього постнатального розвитку активація ГАМКА-рецепторів спричиняє деполяризацію клітинної мембрани та викликає значне підвищення [Ca2+]i. Мал. 21А ілюструє Ca2+-сигнали, викликані фокальною аплікацією селективного ГАМКА-агоніста мусцимолу (10 µМ) до пірамідного нейрону СА1-регіону гіпокампу триденного щура. Усереднена амплітуда цих сигналів становила 250 ± 19.8 нМ (n= 42 нейрони). Мусцимол-активовані Ca2+-сигнали повністю блокувались селективним антагоністом ГАМКА-рецепторів бікукуліном (20µМ). Аналогічні дані було отримано під час зовнішньоклітинної аплікації ГАМК (n=33 нейрони). У дослідах, в яких мусцимол додавали у тій самій концентрації до зовнішньоклітинного розчину на 30-60 с, було встановлено, що напротязі перших двох тижднів після народження переважна більшість (97 %) пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу відповідають на селективну активацію ГАМКА-рецепторів підвищенням [Ca2+]i. Однак, як показано на мал. 21Б, усереднена амплітуда цього Ca2+-сигналу була максимальною перші 4 дні після народження, після чого починала поступово зменшуватись. На початку третього тиждня після народження мусцимол остаточно втрачав здатність викликати підвищення [Ca2+]i.

Мал. 21. Під час раннього постнатального розвитку мусцимол-опосередкована активація ГАМКА-рецептор-каналів викликає підвищення [Ca2+]i. А, Ca2+-сигнали, викликані локальною аплікацією 10 µМ мусцимолу, в контролі (зліва), в присутності бікукуліну (посередині) та після відмивання бікукуліну (справа). Момент локальної аплікації мусцимолу (300 мс, 73.5 Ра) позначено три-кутниками. Б, значення амплітуди Ca2+-сигналів, викликаних 30-60 с присутністю 20 µМ мусцимолу в зовнішньо-клітинному розчині, в залежності від віку тварин. Кожне значення є усередненням даних, отриманих в 2-8 зрізах, кожен з яких представ-лено 19-52 пірамідними нейронами. Амплітуди сигналів було пронорма-лізовано по відношенню до амплітуди сигналу, отриманого в день народження (Р0).

 

Коли колатералі Шафера (пресинаптичні волокна для пірамідних нейронів СА1-регіону) стимулювали електрично в гіпокампі новонароджених щурів та щурів двотиждневого віку, синаптично-активовані Ca2+-сигнали в гіпокампі новонароджених щурів повністю блокувалися селективним антагоністом ГАМКА-рецепторів бікукуліном (мал. 22) та були нечутливими до аплікації антагоністів глутаматних рецепторів APV та CNQX. На відміну від цих даних, наприкінці другого тиждня після народження аналогічна стимуляція синаптичних входів викликає Ca2+-сигнали, які тепер повністю блокуються сумішшю антагоністів глутаматних рецепторів (APV та CNQX) і злегка потенціюються в присутності бікукуліну (мал. 22).

Мал. 22. На відміну від глутаматергічної природи збудної синаптичної передачі в гіпокампі в зрілому віці одразу після народження збудна синаптична передача опосередковується ГАМКА-рецепторами. Ca2+-сигнали, викликані електричною стимуляцією колатералей Шафера на третій день після народження (вгорі) та через два тиждні після народження (внизу).

Таким чином, синаптично-активовані Ca2+-сигнали в гіпокампі щурів у період раннього постнатального розвитку спричиняються виключно активацією ГАМКА-рецепторів, яка спричиняє деполяризацію клітинної мембрани та активацію потенціал-залежних Ca2+-каналів. Ці дані узгоджуються з літературними даними щодо деполяризуючої дії ГАМК в новонароджених пірамідних нейронах кори мозку (Yuste, 1991; Owens, 1996), пірамідних нейронах СА3-регіону гіпокампу (Leinekugel, 1995), нейронах спинного мозку (Reichling, 1994), гіпоталамусу (Obrietan, 1995), клітинах Пуркіньє мозочку (Eilers, 1999), нейронах сітківки ока (Huang, 1996) та ін. Отже, в цей період розвитку найбільш поширений в ЦНС дорослих тварин гальмівний нейромедіатор ГАМК виступає в зовсім протилежній ролі, а саме, в ролі збуджуючого нейромедіатора.

Згідно з імуноцитохімічними даними, в багатьох відділах ЦНС ссавців мережа ГАМК-ергічних нейронів формується під час раннього ембріонального розвитку. На момент народження присутність густої мережі ГАМК-ергічних нейронів та власне ГАМК було виявлено в корі мозку, серединній перетинці, таламусі, стовбурі мозку, мозочку, смугастому тілі та ін. (Lauder, 1986). Таким чином можна припустити, що більшість нейронів ЦНС під час раннього постнатального розвитку перебуває під контролем деполяризуючої дії ГАМК. Видається ймовірним, що ГАМК-активоване підвищення [Ca2+]i є причиною багатогранного "трофічного" впливу ГАМК на ранніх стадіях розвитку, коли її аплікація викликає проліферацію клітин (Spoerri 1988; LoTurco, 1995), ріст нейритів (Spoerri 1988; Ben-Ari, 1994), хемотаксис (Behar, 1996) та контроль синтезу нейротрофінів (Marty, 1996). ГАМК-активоване підвищення [Ca2+]i потенціально здатне контролювати також експресію генів (Ghosh, 1994), виконання генетичних програм диференціації та програмованої смерті клітин (Franklin, 1992; Spitzer 1994), рухливість конусу росту (Rusanescu, 1995) та ін.

ГАМК-опосередковані осциляції [Ca2+]i в мережі нейронів гіпокампу

Завдяки відсутності гальмівної синаптичної передачі в мережі нейронів гіпокампу під час раннього постнатального розвитку, ця мережа нагадує систему з позитивним зворотнім звўязком. будь-яке збудження, що виникає в певних елементах такої системи, буде поширюватись, захоплювати все більше елементів, аж доки не охопить всю систему. Для мережі нейронів це збудження виражається синхронною активацією потенціалів дії в усіх елементах системи. За умов присутності клітинних механізмів гальмування (як то потенціал- та кальцій-залежні калієві канали, тощо) така активність набуває виду синхронних хвиль збудження, що повторюються з певною частотою.  Дійсно, нам вдалося виявити синхронні осциляції [Ca2+]i в мережі нейронів гіпокампу, що знаходяться на ранній стадії постнатального розвитку (early network oscillations (ENOs); (Garaschuk, 1998)). Ці осциляції повторювались ритмічно з низькою частотою (приблизно раз у хвилину) протягом всього часу реєстрації, що в окремих експериментах тривав понад 6 годин). Дані Ca2+-сигнали, що уособлюють синхронну активацію сотень клітин, виникали синхронно в СА1- та СА3-регіонах, свідчачи, що у віці від 1-7 днів (Р1-7) дана активність є притаманною усім нейронам гіпокампу, включаючи 85% пірамідних нейронів та 70% інтернейронів в stratum oriens і stratum radiatum (мал. 23). Амплітуда ENO-асоційованих Ca2+-сигналів в окремих нейронах змінювалась в діапазоні 25-1500 нМ, становлячи в середньому 246 ± 185 нМ (n= 22 зрізи, 683 нейрони).

Мал. 23. Зміни [Ca2+]i в окремих нейронах під час одного епізоду ENO. А, епіфлюоресцентне зображення шару пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу (довжина хвилі збудження 390 нм). Б-Ж, псевдокольорові зображення зміни [Ca2+]i під час одного епізоду ENO (див. З) в моменти часу, вказані в З. З, часовий перебіг епізоду ENO, що складався з чотирьох Ca2+-спайків. Наведена крива є усередненням змін [Ca2+]i в 107-ми окремих нейронах, зображених в А.

В регіоні СА1 гіпокампу ENO-асоційовані зміни [Ca2+]i мали характерний профіль розвитку (мал. 24). Вони вперше виникали на другий день після народження (Р1), досягали піку амплітуди в Р2, після чого протягом наступних двох тижднів амплітуда цих ENO-асоційованих Ca2+-сигналів поступово зменшувалась, а частота виникнення збільшувалась.

Мал. 24. Зміна форми ENO-асоційованих Ca2+-сигналів під час постнатального розвитку. Типові криві зміни [Ca2+]i окремих нейронів одразу після народження (Р0) та в пізніші моменти часу (Р2, Р6, Р12). Зауважте зміну амплітуди та частоти виникнення ENO-асоційованих Ca2+-сигналів.

Кожен з ENO-асоційованих Ca2+-сигналів супроводжувався високочастотною серією потенціалів дії, що виникали на гребені хвилі деполяризації (мал. 25). Середня тривалість хвилі деполяризації складала 477 ± 99 мс, а усереднена амплітуда - 38.3 ± 4.5 мВ. Усереднена частота виникнення потенціалів дії складала 22.0 ± 2.5 Гц, а частота виникнення потенціалів дії перед адаптацією (обчислена з інтервалів між першими 2-4 потенціалами дії) складала 90.3 ± 12.8 Гц (n=5 клітин, 52 спайки). ENO-асоційовані зміни [Ca2+]i і електричні сигнали, що лежать в їх основі, повністю блокувались зовнішньоклітинною аплікацією 250 нМ тетродотоксину (ТТХ), свідчачи, що генерація потенціалів дії є необхідною передумовою виникнення ENO.

Мал. 25. Блокатор потенціал-залежних Na2+-каналів ТТХ повністю блокує ENO. А,Б, одночасна реєстрація ENO-асоційованих Ca2+-сигналів та відповідної зміни потенціалу на мембрані нейрону (клітина 1), перфузованого внутрішньоклітинним розчином, що містив 150 µМ fura-2. Клітина 2 - один з розташованих поруч інтактних пірамідних нейронів, забарвлених fura-2 AM. Кожен з ENO-асоційованих Ca2+-сигналів супроводжувався деполяризацією клітинної мембрани та пачкою потенціалів дії. Як ENO-асоційовані зміни [Ca2+]i, так і електричні сигнали, що їх супроводжують, повністю зникали в присутності 250 µМ ТТХ. Певні відтинки кривих подано в Б більш детально. В, усереднені дані (n=7 зрізів, 18 клітин), що ілюструють дію ТТХ.

За умов фіксації потенціалу на мембрані нейрону спонтанні осциляції [Ca2+]i в ньому припинялись, а ENO-асоційовані Ca2+-сигнали в сусідніх клітинах супроводжувались кластерами синаптичних струмів. Ці спонтанні кластери синаптичних струмів були вихідними при потенціалах на мембрані, менших за потенціал реверсії хлорних струмів (n=5 нейронів, P1-P4), що свідчить, що вони виникли завдяки активації хлорної провідності (мал. 26). Протягом перших чотирьох днів після народження лише 3.0 ± 0.4 % (n=8 нейронів) всіх зареєстрованих спонтанних синаптичних струмів в пірамідних нейронах CA1-регіону можна було віднести на рахунок активації глутаматних рецепторів. На початку другого тиждня після народження (P5-P8) ця цифра зростала до 40.8 ± 6.0 % (n=3 нейрони). Ці дані свідчать про відсутність функціонуючої глутаматергічної синаптичної передачі в гіпокампі під час раннього постнатального розвитку. Тому не дивно, що ENO-асоційовані Ca2+-сигнали повністю блокувались зовнішньоклітинною аплікацією антагоніста ГАМКА-рецепторів бікукуліну (20 мкМ) як на рівні окремих клітин, так і на рівні популяції нейронів. Цікаво, що блокатори глутаматних рецепторів NMDA- та не-NMDA-типів APV та CNQX також ефективно блокували синхронні ENO-асоційовані Ca2+-сигнали на рівні популяцій нейронів, але не поодинокі спонтанні Ca2+-сигнали, що виникали асинхронно в різних нейронах.

Мал. 26. ENO-асоційовані кластери синаптичних струмів переносяться йонами хлору. А, вимірювання ENO-асоційованих трансмембранних струмів пірамідного нейрону, перфузованого внутрішньоклітинним розчином, що містив 150 µМ fura-2 та лише 2 мМ Сl- (клітина 4, теоретично обчислений потенціал реверсії хлорних струмів: -109 мВ), одночасно з реєстрацією ENO-асоційованих Ca2+-сигналів в розташованих поруч інтактних пірамідних нейронах (клітини 1-3). Підтримуваний потенціал на мембрані клітини 4 становив -20 мВ. Б, Вольт-амперна характеристика ENO-асоційованих трансмембранних струмів нейрону 4. Кожне значення є усередненою максимальною амплітудою 3-8 ENO-асоційованих трансмембранних струмів при даному потенціалі на мембрані. Окремі траси ілюструють ENO-асоційовані трансмембранні струми, зареєстровані при підтримуваному потенціалі на мембрані відповідно -20, -40, -50 та -60 мВ (зверху вниз).

Отже, хоч для виникнення ENO необхідна синергічна дія функціональних АМРА-, NMDA- та ГАМКА-рецепторів, саме ГАМКА-рецептори відіграють центральну роль в виникненні ENO-опосередкованих Ca2+-сигналів у пірамідних нейронах гіпокампу.

ENO-асоційовані Ca2+-сигнали в окремих пірамідних нейронах селективно блокувались за умов фіксації потенціалу на рівні -70 мВ (n=8). Окрім того, в 6/6 зрізів ENO-асоційовані Ca2+-сигнали блокувались за умов видалення йонів кальцію із зовнішньоклітинного розчину. Отже, ENO-асоційовані Ca2+-сигнали були спричинені активацією потенціал-залежних Ca2+-каналів. Відповідно, ENO-асоційовані Ca2+-сигнали блокувались блокаторами потенціал-залежних Ca2+-каналів широкого спектру. Цікаво, що йони нікелю (50 мкM), які в цій концентрації є селективними блокаторами потенціал-залежних Ca2+-каналів Т-типу, повністю блокували ENO-асоційовані Ca2+-сигнали. В той же час, селективний блокатор потенціал-залежних Ca2+-каналів L-типу нітрендипін (10 мкM) викликав 50% зменшення амплітуди постсинаптичних ENO-асоційованих Ca2+-сигналів, не впливаючи на частоту їх виникнення. Таким чином, активація потенціал-залежних Ca2+-каналів, зокрема Ca2+-каналів Т-типу, що в цьому віці складають переважну більшість потенціал-залежних Ca2+-каналів (Yaari, 1987), є необхідною передумовою виникнення  ENO-асоційованих Ca2+-сигналів.

Амплітуда ENO-асоційованих Ca2+-сигналів значно зменшувалась також в присутності блокаторів ендоплазматичних Ca2+-насосів тапсигаргіну (1 мкM) та циклопіазонової кислоти (10 мкM), складаючи, в середньому, лише 21 ± 5% від контрольної величини (n=83 нейрони, 4 зрізи). Аналогічні зміни спостерігались також під час аплікації селективного блокатора рианодинових рецепторів рианодину (20 мкM, n=23 клітини, 3 зрізи). Отже, під час ENO внаслідок ГАМК-опосередкованої активації потенціал-залежних Ca2+-каналів відбувається Ca2+-активований викид Ca2+ з внутрішньоклітинних депо, що приводить до підсилення амплітуди ENO-асоційованих Ca2+-сигналів.

Вирішальна роль синхронізованого входу Ca2+ через потенціал-залежні та глутамат-активовані канали у формуванні глутаматергічної синаптичної мережі зрілого типу

Як свідчать отримані нами дані, кожен з описаних в даній роботі механізмів входу Ca2+ в середину нейрону є функціонально важливим і приймає безпосередню участь в регуляції [Ca2+]i . Дані, наведені нижче, однак, є ілюстрацією випадку, коли критичної важливості набуває не лише функціонування кожного з описаних механізмів, але і їх синхронізованість та взаємодія.

Властивості глутаматергічних синаптичних контактів під час раннього постнатального розвитку

Під час раннього постнатального розвитку глутаматергічні синаптичні контакти відрізняються від глутаматергічних синаптичних контактів зрілого типу повною відсутністю в синаптичному струмі компоненту, спричиненого активацією постсинаптичних рецепторів не-NMDA-типу (Durand, 1996). Тому на цьому етапі постнатального розвитку електрична стимуляція колатералей Шафера викликає синаптичні струми лише за умов деполяризації клітинної мембрани, але не при потенціалі спокою (мал. 27А). Навіть високочастотна стимуляція синаптичних входів (25 імпульсів з частотою 50 Гц), прикладена в умовах фіксації струму, не викликала статистично достовірної зміни потенціалу на клітинній мембрані в жодній із спроб (n=8 нейронів; мал. 27Б).

Мал. 27. Властивості глутаматергічної синаптичної передачі під час раннього постнатального розвитку. А, усереднені записи 20-ти послідовних синаптичних струмів, отриманих внаслідок стимуляції колатералей Шафера в зрізі гіпокампу одноденного щура. Підтримуваний потенціал на мембрані нейрону становив +40 (вгорі) та -70 (внизу) мВ відповідно. Б, записи потенціалу на мембрані цього ж нейрону під час 4-х послідовних епізодів високочастотної стимуляції синаптичних входів (25 імпульсів з частотою 50 Гц), прикладеної в умовах фіксації струму.

Ці результати свідчать, що в період раннього постнатального розвитку синаптичні глутаматні рецептори не є функціональними в стані спокою, і що синаптична передача в глутаматергічній мережі може відбуватися лише за умов попередньої деполяризації клітинної мембрани внаслідок активації інших рецепторів. Відмітимо, що уже під кінець першого тиждня після народження значна частина (80%) (Durand, 1996; Garaschuk, 1998) глутаматергічних синаптичних контактів володіє функціональними постсинаптичними рецепторами не-NMDA-типу, нагадуючи синаптичні контакти дорослих тварин.

Роль ENO у формуванні глутаматергічної синаптичної мережі зрілого типу

Оскільки ENO-асоційовані Ca2+-сигнали виникають синхронно в пресинаптичних пірамідних нейронах регіону СА3 та постсинаптичних нейронах регіону СА1, а отже, задовольняють необхідні умови асоціативності, а також кожен з ENO-асоційованих Ca2+-сигналів спостерігається не лише в сомі, але й в апікальних дендритах пірамідних нейронів (мал. 28), в місцях формування глутаматергічних синаптичних контактів, ENO забезпечують активацію глутаматних рецепторів NMDA-типу синхронно з підвищенням [Ca2+]i в постсинаптичному нейроні, а отже, можуть сприяти функціональному включенню рецепторів не-NMDA-типу. Цей процес, що, як показано в біофізичних дослідах (Durand, 1996), вимагає синхронної стимуляції синаптичних входів і постсинаптичної деполяризації, вважають основним шляхом дозрівання глутаматних рецепторів (Hanse, 1997).

Мал. 28. ENO викликають зміни [Ca2+]i в місцях незрілих глутаматергічних контактів в дендритах інтактних постсинаптичних нейронів. Зліва: мікрофотографія нейронів СА1-регіону, розташованих на відстані 60 мкм від поверхні зрізу гіпокампу, отримана за допомогою флюорометричних вимірювань із застосуванням двофотонного збудження барвни-ка. Справа: ENO-асоційовані Ca2+-сигнали в сомі та головному апікаль-ному дендриті інтактного пірамід-ного нейрону. Ви-користовуючи да-ний метод вимірю-вання вдається за-реєструвати ENO-асоційовані Ca2+-сигнали на відстані до 70 мкм від соми.

Як було показано вище, протягом перших 4-х днів після народження типовою одиницею ENO є кластер з чотирьох - п`яти Ca2+-спайків з інтервалом між спайками приблизно 4 с. Кожен Ca2+-спайк викликається високочастотною серією потенціалів дії (середня частота 54 Гц), що виникають на гребені хвилі деполяризації (позначеної giant depolarising potential, GDP) з середньою тривалістю 600 мс (табл. 2).

Таблиця 2. Властивості природніх та симульованих ENO-асоційованих кластерів Ca2+-спайків.

В таблиці 2 наведено також і параметри ENO-подібного кластера Ca2+-спайків, що його було використано в подальших експериментах, оскільки присутність бікукуліну, необхідна для ідентифікації незрілих глутаматергічних синаптичних контактів, блокувала спонтанні ENO. В 7 з 8 експериментів ENO-подібна стимуляція синаптичних входів одночасно з ініціацією ENO-подібного кластеру постсинаптичних Ca2+-спайків спричиняла виникнення синаптичного струму, а отже, утворення нового, функціонуючого синаптичного контакту (мал. 29В, Г).

Коли аналогічний експериментальний протокол було прикладено до синаптичних контактів зрілого типу, ця ENO-подібна стимуляція викликала довготривалу потенціацію синаптичного струму (мал. 30, 6 з 6 нейронів). Як і в попередньому випадку, окремо взяті пре- (9/10 нейронів) та постсинаптична (n=7 нейронів) стимуляції не викликали жодної зміни ефективності синаптичної передачі. Як і передбачалось ((Durand, 1996) дана потенціація блокувалась антагоністом NMDA-рецепторів APV (50 мкМ, n= 3).

Мал. 29. Синхронна ENO-подібна активація пре- та постсинаптичного нейрону викликає утворення глутаматергічного синаптичного контакту зрілого типу. А, Б, окремо взята ENO-подібна стимуляція пресинаптичного нейрону не викликає жодної зміни ефективності синаптичної передачі. А, запис 5-ти послідовних відповідей (Vm = -70 мВ) на стимуляцію колатералей Шафера (вгорі) та усереднення 20-ти послідовних відповідей (внизу) до (зліва) та після (справа) ENO-подібної стимуляції колатералей Шафера (4 пачки стимулів з інтервалом 4 с, кожна пачка: 25 імпульсів, 50 Гц). Криві в рамках ілюструють усереднені постсинаптичні струми (n= 20 послідовних пробігів) при потенціалі на мембрані +40 мВ до (зліва) та після ENO-подібної стимуляції колатералей Шафера відповідно. Б, часова залежність усередненої амплітуди постсинаптичного струму. Момент часу 0 позначає момент ENO-подібної стимуляції колатералей Шафера. В, перетворення "мовчазного" глутаматергічного синаптичного контакту в синаптичний контакт зрілого типу внаслідок синхронної ENO-подібної стимуляції пре- та постсинаптичного нейрону. Експеримент, аналогічний до проілюстрованого в А, за винятком протоколу стимуляції, що в даному випадку становив поєднання стимуляції колатералей Шафера з деполяризацією (4 стимули з інтервалом 4 с, кожен стимул: деполяризація амплітудою 50 мВ, тривалістю 500 мс). Г, часова залежність усередненої амплітуди постсинаптичного струму узагальнює дані 6-ти експериментів, аналогічних до проілюстрованого в В.

Мал. 30. Синхронна ENO-подібна активація пре- та постсинаптичного нейрону викликає довготривалу потенціацію синаптичної передачі в глутаматергічних синапсах зрілого типу. А, ЗППС в контролі (зліва) та через 30 хв (посередині) після виникнення довготривалої потенціації синаптичної передачі. Графік справа є суперпозицією згаданих кривих. Б, часова залежність амплітуди ЗПСС. Момент часу 0 позначає момент поєднання стимуляції колатералей Шафера (4 пачки стимулів з інтервалом 4 с, кожна пачка: 20 імпульсів, 50 Гц) з деполяризацією (4 стимули з інтервалом 4 с, кожен стимул: деполяризація амплітудою 150 рА, тривалістю 500 мс, в умовах фіксації струму). Зауважте, що цей протокол стимуляції, котрий достовірно відтворює сигнали, що спостерігаються під час ENO, викликає потенціацію синаптичної передачі, що триває понад 40 хв.

Таким чином, наведені дані дають підставу вважати, що формування глутаматергічної синаптичної мережі зрілого типу відбувається внаслідок ENO-опосередкованої синергічної активації ГАМКА-та NMDA-рецепторів. Цей процес вимагає одночасного постсинаптичного входу Ca2+ через рецептор-канали NMDA-типу  та потенціал-активовані Ca2+-канали і, ймовірно, подальшого підсилення цього сигналу внаслідок Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо.

Отже, формування функціональної глутаматергічної синаптичної передачі в гіпокампі щурів відбувається протягом перших двох тижнів після народження і супроводжується виявленими нами синхронними осциляціями [Ca2+]i в майже усіх нейрональних елементах системи. Дані осциляції [Ca2+]i є відображенням синхронної електричної активності нейронів системи, що виникають одночасно в пре- та постсинаптичних нейронах завдяки синхронній активації ГАМКА- і NMDA-рецепторів та асоційованій активації потенціал-залежних Ca2+-каналів і, можливо, Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Згідно отриманих нами даних, ці осциляціі [Ca2+]i мають здатність викликати появу АМРА-опосередкованого компоненту синаптичного струму, що вважається основним кроком в формуванні глутаматергічної синаптичної передачі зрілого типу (Durand, 1996; Wu, 1996).

Згідно новітніх літературних даних, глутаматергічні синаптичні струми, що складаються виключно з NMDА-компоненту, було зареєстровано також в корі мозку (Isaac, 1997; Rumpel, 1998), спинному мозку (Li, 1998) та оптичному тектумі жаби (Wu, 1996; Isaac, 1997). В гіпокампі мережа синаптичних глутаматних рецепторів суттєво розвивається та дозріває під час перших двох тижднів після народження, і наприкінці другого тиждня стимуляція синаптичних входів викликає Ca2+-сигнали, які тепер повністю блокуються сумішшю антагоністів глутаматних рецепторів (APV та CNQX) і злегка потенціюються в присутності бікукуліну. Аналогічно, під час постсинаптичного розвитку кори мозку та оптичного тектуму жаби також спостерігалось зменшення числа синаптичних контактів даного типу, свідчачи, що ці синаптичні контакти є попередниками глутаматергічних синаптичних контактів зрілого типу. Ймовірність такої точки зору підтверджують також дані про те, що в згаданих препаратах має місце активність-залежна трансформація синаптичних струмів, що складаються виключно з NMDA-компоненту, в глутаматергічні синаптичні струми класичного типу (Durand, 1996; Wu, 1996; Isaac, 1997). В сукупності описані дані свідчать, що синаптичні струми, які складаються виключно з NMDA-компоненту, є прямими попередниками глутаматергічних синаптичних струмів зрілого типу.

 На даний час вважається загальновизнаним, що активність-залежне дозрівання синаптичних мереж критично залежить від синхронної нейрональної активності того чи іншого типу (Goodman, 1993; Singer 1995). І хоч в минулому головним джерелом цієї нейрональної активності вважались сенсорні сигнали, дані, отримані нещодавно в основному в процесі дослідження розвитку зорової системи, дали підставу вважати, що на ранніх стадіях постнатального розвитку основною рушійною силою активність-залежного розвитку нейрональних мереж є спонтанна синхронізована нейрональна активність (Katz, 1996). Саме таку нейрональну активність було знайдено нами в гіпокампі новонароджених щурів. Симулюючи пре- та постсинаптичну нейрональну активність, що спостерігається під час ENO, нам вдалося безпосередньо викликати функціональне включення рецепторів не-NMDA-типу в місцях попередньо незрілих синаптичних контактів та довготривалу потенціацію синаптичної передачі в синаптичних контактах зрілого типу. Разом взяті отримані дані свідчать, що в гіпокампі новонароджених щурів синхронні спонтанні осциляції в мережі нейронів є саме тим типом активності, який викликає розвиток глутаматергічної синаптичної мережі зрілого типу. Мал. 31 схематично ілюструє трансмембранні та внутрішньоклітинні механізми, що, згідно з нашими даними, відіграють важливу роль в даному процесі. Згідно цієї схеми, кожен з епізодів ENO викликає синхронну активацію NMDA- та ГАМКА-рецепторів. Викликана ГАМКА-рецепторами деполяризація клітинної мембрани приводить до активації потенціал-залежних Ca2+-каналів та розблоковування заблокованих йонами магнію NMDA-рецепторів. Вхід Ca2+ через рецептор-канали NMDA-типу викликає Ca2+-сигнали, що виникають локально в місцях незрілих глутаматергічних синапсів. Цей локальний NMDA-активований Ca2+-сигнал виникає на фоні глобального підвищення [Ca2+]i, що зумовлюється ГАМК-опосередкованою активацією потенціал-залежних Ca2+-каналів.

Мал. 31. Схематична ілюстрація висунутої гіпотези щодо механізмів, задіяних в формуванні глутаматергічної синаптичної передачі зрілого типу. Розгорнуте пояснення в тексті.

Як було показано для синаптичних Ca2+-сигналів зрілого типу (Yuste, 1995), результуючий Ca2+-сигнал, що реєструється в місці синаптичного контакту, є "нелінійним", себто має амплітуду, більшу за суму амплітуд складових Ca2+-сигналів. Найбільш ймовірно, причиною такої нелінійності є Ca2+-активований викид Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Цей локалізований Ca2+-сигнал значної амплітуди, найбільш ймовірно, і є основою специфічного по входу процесу трансформації незрілих глутаматергічних синаптичних контактів в синаптичні контакти зрілого типу.

Принципова різниця між цим складним механізмом, який активується під час синхронних осциляцій [Ca2+]і в мережі нейронів гіпокампу, та стандартною тетанічною стимуляцією синаптичних входів, що, як показано нами та іншими авторами (Harris, 1984; Muller, 1989; Liao, 1996), в цьому віці не викликає жодної зміни ефективності синаптичної передачі, полягає в присутності потужної деполяризації постсинаптичних нейронів, викликаної активацією синаптичних ГАМКА-рецепторів. Оскільки під час раннього постнатального розвитку деполяризуюча ГАМК-ергічна синаптична передача спостерігається не тільки в гіпокампі (Yuste, 1991; Reichling, 1994; Obrietan, 1995; Serafini, 1995; Huang, 1996; Rohrbough, 1996), можна твердити, що механізми, подібні до описаних в даній роботі, сприяють активному формуванню глутаматергічної синаптичної мережі в багатьох відділах ЦНС ссавців.

ВИСНОВКИ

1.Використовуючи сучасні електрофізіологічні, молекулярно-біологічні та оптичні методи вимірювання проведено розгорнуте дослідження механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу в різних типах нейронів ЦНС ссавців. Для виявлення закономірностей і відмінностей у регуляції [Ca2+]i різними типами нейронів, дослідження було проведено паралельно в принципових збуджуючих (на прикладі пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципових гальмівних (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) нейронах, а також інтернейронах (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки).

2.В роботі вперше безпосередньо виміряно Ca2+-проникність глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу. Вперше виміряно Ca2+-проникність дендритних, ймовірно, синаптичних рецептор-каналів, і показано, що їх Ca2+-проникність збігається з проникністю соматичних, позасинаптичних рецептор-каналів і становить 11 % та 0.6 % відповідно.

3.Досліджено особливості молекулярної будови рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в означених вище типах нейронів та її вплив на функціональні властивості цих каналів. Виявлено домінантну роль NR2В субодиниці в регуляції Ca2+-проникності рецептор-каналів NMDA-типу.

4.Досліджено функціональні властивості соматичних та дендритних рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Показано, що в умовах фонової клітинної активності вони виступають в ролі кальцієвого буфера, чим сприяють підтриманню [Ca2+]i на низькому рівні. У період підвищеної клітинної активності, навпаки, депо здатні значно підсилювати Ca2+-сигнали в цитоплазмі завдяки процесові Ca2+-активованого викиду кальцію.

5.Показано, що рианодин-чутливі Ca2+-депо мають надзвичайно велику буферну ємність і під час потужної клітинної активності здатні накопичувати до 20 разів більше йонів кальцію, ніж їх там знаходиться в стані спокою. Встановлено, що кількість Ca2+ всередині депо зростає зі збільшенням [Ca2+]i. Виявлено, що накопичені під час підвищення  [Ca2+]i йони кальцію повільно витікають з депо протягом наступних хвилин. Отже, рианодин-чутливі кальцієві депо здатні виступати в ролі елементу "памўяті" або "детектора співпадіння", значно підсилюючи лише ті внутрішньоклітинні кальцієві сигнали, котрі виникають під час посиленої клітинної активності.

6.Виявлено механізм „ємнісного" трансмембранного входу Ca2+. Показано, що цей механізм, що раніше вважався характерною ознакою незбудних клітин, відповідає за наявність Ca2+ у внутрішньоклітинних депо, а отже, за їх дієздатність в стані спокою.

7.На прикладі кальцій-звўязуючого білку кальбіндину вперше досліджено вплив внутрішньоклітинних кальцій-звўязуючих білків на регуляцію [Ca2+]i. Використовуючи методи генної інженерії створено мишей-мутантів, позбавлених білку кальбіндину. Показано, що кальбіндин виступає в ролі швидкодіючого кальцієвого буферу, що драматично зменшує наявність вільного кальцію в цитоплазмі нейрону протягом перших 100 мс після активації входу Ca2+.

8.Досліджено механізми генерації внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в період раннього постнатального розвитку. Показано, що на ранніх стадіях постнатального розвитку, коли глутаматергічні синаптичні звўязки перебувають в зародковому стані, ГАМК, основний гальмівний нейромедіатор ЦНС в дорослому віці, викликає синаптичне збудження та генерацію внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів і Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+- депо.

9.Виявлено, що 85 % нейронів в зрізах гіпокампу щурів віком 1-7 днів після народження бере участь в генерації спонтанних періодичних (0.007-0.03 Гц) кальцієвих сигналів, які виникають в сомі та дендритах усіх нейронів одночасно. Показано, що ці осциляції мають синаптичне походження і критично залежать від активації збуджуючих ГАМК-ергічних синапсів.

10.Встановлено, що виявлена нейрональна активність є першою відомою на сьогодні формою природньої активності, яка здатна трансформувати зародкові глутаматергічні синаптичні контакти в функціональні синаптичні контакти зрілого типу і, таким чином, сприяти формуванню повноцінної мережі синаптичних зв`язків, присутньої у зрілому віці. Показано, що в основі цієї здатності лежить синхронна активація описаних в роботі механізмів регуляції [Ca2+]i, якто глутамат- та ГАМК-активованих рецептор-каналів, потенціал-залежних Ca2+-каналів та внутрішньоклітин-них Ca2+-депо.

Гаращук О.В. Механізми регуляції кальцієвого гомеостазу в сомі та дендритах нейронів центральної нервової системи ссавців.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин.-Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 1999.

Механізми регуляції кальцієвого гомеостазу, включаючи механізми входу Ca2+ через клітинну мембрану, а також механізми зв'язування та вивільнення Ca2+ як внутрішньоклітинними Ca2+-депо так і білками, що зв'язують Ca2+, вивчали в сомі та дендритах нейронів ЦНС в зрізах мозку щурів. Для виявлення закономірностей і відмінностей у регуляції [Ca2+]i різними типами нейронів дослідження було проведено паралельно в принципових збуджуючих і принципових гальмівних нейронах, а також інтернейронах на прикладі пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу, клітин Пуркіньє мозочку та ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки. Поєднуючи сучасні електрофізіологічні, молекулярно-біологічні та оптичні методи вимірювання вдалося отримати детальні дані як про функціонування згаданих механізмів вцілому, так і про їх взаємодію під час процесів постнатального розвитку нейрональних мереж та процесів інтеграції інформації в цих мережах.

Ключові слова: кальцієвий гомеостаз, дендритні Ca2+-сигнали, глутамат-і ГАМК-активовані рецептор-канали, молекулярна будова рецептор-каналів, внутрішньоклітинні Ca2+-депо, Ca2+-активований викид Ca2+, Ca2+-осциляції в інтактній мережі нейронів, розвиток глутаматергічної синаптичної передачі.

Garaschuk O.V. Mechanisms of regulation of Ca2+ homeostasis in somata and dendrites of neurones in the mammalian central nervous system. Thesis for the degree of Doctor of Biological Sciences (the second degree) in the speciality 03.00.13- human and animal physiology.-O.O. Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.

Mechanisms of intracellular Ca2+ homeostasis, involving Ca2+ entry across the plasma membrane, and Ca2+ release and sequestration by intracellular Ca2+ stores and Ca2+-binding proteins, were investigated in different types of neurones in rat brain slices. Hippocampal CA1 pyramidal neurones, cerebellar Purkinje cells and GABAergic interneurones of the medial septum were studied as examples of the principal excitatory, the principal inhibitory and the local circuit neurones, respectively. In order to get an insight into Ca2+ regulation at the sites of synaptic contacts, experiments were carried out in parallel in the somata and in the dendrites of these cells. Activation of glutamate-sensitive channels, which provide the main excitatory input to these cells, produced a substantial Ca2+ influx across the plasma membrane: 11-12% and 0.6% of the total current through NMDA and AMPA channels was carried by Ca2+. When examined in the extrasynaptic somatic and the subsynaptic dendritic regions, NMDA and AMPA channels had similar Ca2+ permeabilities, suggesting their subunit compositions were probably similar in these two subcompartments. Comparing the functional properties of the receptors with the mRNA content of individual neurones we identified the NR2B subunit as a determinant of the Ca2+ permeability and the other functional properties of NMDA receptors. During early postnatal development, activation of GABAA receptors also caused large intracellular Ca2+ transients which were dependent on the Cl- flux across the membrane and resulting activation of voltage-gated Ca2+ channels. Synaptic activation of both glutamate- and GABA-activated channels was capable of producing Ca2+ release from the intracellular ryanodine-sensitive Ca2+ stores. In all types of cells studied the stores were functional in both the soma and the dendrites, although the size of Ca2+ pool readily releasable at rest was differed. The size of the pool was tightly regulated by a newly identified "spontaneous refilling mechanism". Because the latter depended on Ca2+ entry through the plasma membrane and operated at the resting membrane potential, it is probably analogous to the "capacitative Ca2+ entry" in nonexcitable cells. Analysis of synaptically-evoked Ca2+ transients in mutant mice lacking calbindin D28k identified this Ca2+-binding protein as a fast Ca2+ buffer controlling the waveform of the Ca2+ transients during 100 ms after their initiation. The interplay between the described mechanisms regulating Ca2+ homeostasis was studied during early postnatal development in the hippocampus, where these mechanisms were involved in spontaneous "early network oscillations" identified in this work. It was found that the synergistic activation of these mechanisms causes the activity-dependent maturation of a glutamatergic neuronal network transforming precursor synaptic contacts into functional, adult-type synapses.

Key words: Ca2+ homeostasis, dendritic Ca2+ signals, glutamate- and GABA-activated receptor-channels, subunit composition, intracellular Ca2+ stores, Ca2+-activated Ca2+ release, Ca2+ oscillations, neuronal networks, development of the excitatory synaptic transmission.

Гаращук О.В. Механизмы регуляции кальциевого гомеостаза в соме и дендритах нейронов центральной нервной системи млекопитающих.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.

Механизмы регуляции кальциевого гомеостаза, включая механизмы входа Ca2+ через клеточную мембрану, а также механизмы связывания и высвобождения Ca2+ как внутриклеточными Ca2+-депо так и Ca2+-связующими белками изучались в соме и дендритах нейронов в срезах мозга крыс. Для определения закономерностей и различий в регуляции [Ca2+]i различными типами нейронов исследования проводили параллельно в возбуждающих и тормозных нейронах, а также интернейронах на примере пирамидных клеток СА1-региона гиппокампа, клеток Пуркинье мозжечка и клеток серединной перепонки. Сочетание современных електро-физиологических, молекулярно-биологических и оптических методов исследования разрешило получить исчерпывающие данные как о функционировании указанных механизмов вцелом, так и о их взаимодействии во время процессов постнатального развития нейрональных сетей и процессов интеграции информации в этих сетях.

Ключевые слова: кальциевый гомеостаз, дендритные Ca2+-сигналы, глутамат- и ГАМК-активированные рецептор-каналы, молекулярное строение рецептор-каналов, внутриклеточные Ca2+-депо, Ca2+-активированный выброс Ca2+, Ca2+-осцилляции в интактной сети нейронов, развитие глутаматергической синаптической передачи.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Airaksinen M.S., Eilers J., Garaschuk O., Thoenen H., Konnerth A., Meyer M. Ataxia and altered dendritic calcium signalling in mice carrying a targeted nullmutation of the calbindin D28k gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.-V. 94.- P. 1488-1493.

2. Garaschuk O., Kovalchuk Y., Krishtal O. Glutamate and theta-rhythm stimulation selectively enhance NMDA component of EPSC in CA1 neurons of young rats // Neurosci Lett.- 1993.- V. 151.- P. 29-32.

3. Garaschuk O., Kovalchuk Y., Krishtal O. Glutamate induces long-term increase in the frequency of single NMDA channel openings in hippocampal CA1 neurons examined in situ // Eur. J. Physiol.- 1993.- V. 422.- P. 39.

4. Garaschuk O., Schneggenburger R., Tempia F., Konnerth A. Fractional Ca2+ currents through glutamate-receptor channels of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons // Eur. J. Neurosci.- 1994.- V. 7.- P. 195.

5. Garaschuk O., Konnerth A. P-type calcium channels are blocked by sustained ryanodine receptor-mediated calcium release // Pflügers Archiv.- 1994.- V. 426.- P. 65.

6. Garaschuk O., Yaary Y., Konnerth A. Functional characterization of ryanodine-sensitive calcium stores of CA1 hippocampal pyramidal neurons // Eur. J. Physiol.- 1995.- V. 429.- P. 24.

7. Garaschuk O., Schneggenburger R., Schirra C., Tempia F., Konnerth A. Fractional calcium currents through glutamate-receptor channels in hippocampal CA1 pyramidal neurons // Proc. of the 23rd Göttingen Neurobiol. Conf.- 1995.- V. 1.- P. 112.

8. Garaschuk O., Schneggenburger R., Schirra C., Tempia F., Konnerth A. Fractional Ca2+ currents through somatic and dendritic glutamate receptor channels of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones // J. Physiol. Lond.- 1996.- V. 491.- P. 757-772.

9. Garaschuk O., Hanse E., Noll-Hussong M., Konnerth A. Synchronized oscillatory calcium transients in the developing hippocampal neuronal network // Eur. J. Physiol.- 1996.- V. 431.- P. 66.

10. Garaschuk O., Yaari Y., Konnerth A. Release and sequestration of calcium by ryanodine-sensitive stores in CA1 hippocampal neurons // Soc. Neurosci. Abstr.- 1996.- V. 22.- P. 341.

11. Garaschuk O., Yaari Y., Konnerth A. Release and sequestration of calcium by ryanodine-sensitive stores in rat hippocampal neurones.// J. Physiol. Lond.- 1997.- V. 502.- P. 13-30.

12. Garaschuk O., Hanse E., Konnerth A. Mechanisms underlying oscillatory Ca2+ waves in the developing hippocampus // Eur. J. Physiol.- 1997.- V. 433.- P. 31.

13. Garaschuk O. ,Konnerth A. Dual role of ryanodine-sensitive calcium stores in central neurones // Neurohpysiology.- 1997.- V. 29.- P. 256-262.

14. Garaschuk O., Hanse E., Konnerth A. Early network oscillations promote maturation of glutamatergic synapses in the neonatal hippocampus // Soc. Neurosci. Abstr.- 1997.- V. 23.- P. 661.

15. Garaschuk O., Hanse E., Konnerth A. Developmental profile and synaptic origin of early network oscillations in the CA1 region of rat neonatal hippocampus.// J. Physiol. Lond.- 1998.- V. 507.- P. 219-236.

16. Garaschuk O., Plant T., Konnerth A. Quantitative estimation of NMDA receptor-mediated Ca2+ entry in central neurons // Proceedings of the Schering Research Foundation Workshop, B. Seeburg, Turski, Editor. 1998, Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris. P. 127-148.

17. Ãàðàùóê Î.Â. Âõ³ä Ñà2+ ÷åðåç NMDA ðåöåïòîðè ðîçòàøîâàí³ íà ñîì³ òà äåíäðèòàõ íåéðîí³â öåíòðàëüíî¿ íåðâîâî¿ ñèñòåìè // Íåéðîô³ç³îëîã³ÿ.- 1998.- Ò. 30.- Ñ. 226-231.

18. Garaschuk O. ,Konnerth A. Quantitative calcium imaging in brain slices // Imaging living cells, R. Rizzuto and C. Fasolato, Editors. 1998, Landes/Springer: Austin. P. 166-191.

19. Garaschuk O., Hanse E., Eilers J., Konnerth A. Two-photon imaging reveals dendritic Ca2+ transients associated with early network oscillations in the developing hippocampus// Eur. J. Neurosci.- 1998.- V. 10. - P. 221.

20. Garaschuk O., Viana F., Kovalchuk Y., Yaari Y., Konnerth A. Functional properties of the ryanodine-sensitive intracellular Ca2+ stores in central neurones // Calcium Signalling in the Nervous System.- 1998.- P. 42.

21. Garaschuk O. ,Konnerth A., Measuring calcium fluxes in dendritic domaines of neurones in brain slices // Imaging: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press.- 1999.- 36.1-36.10.

22. Ãàðàùóê Î.Â. Äåïîëÿðèçóþ÷à ä³ÿ g-àì³íîìàñëÿíî¿ êèñëîòè ï³ä ÷àñ ðàííüîãî ïîñòíàòàëüíîãî ðîçâèòêó íåéðîí³â öåíòðàëüíî¿ íåðâîâî¿ ñèñòåìè // Íåéðîô³ç³îëîã³ÿ.- 1999.- Ñ.313-317.

23. Garaschuk O., Konnerth A. Refilling mechanisms of Ca2+ stores in central neurons// Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol.- 1998.- 357.- P. 3.

24. Garaschuk O., Eilers J., Konnerth A. Two-photon imaging reveals propagating, ultra -slow oscillations in the immature cortex // Eur. J. Physiol.- 1999.- V. 437. - P. 50.

25. Garaschuk O., Eilers J., Konnerth A. Large-scale spontaneous network oscillations in the neonatal cortex // Proc. of the 27th Göttingen Neurobiol. Conf.- 1999.- V. 1. - P. 520.

26. Garaschuk O., Eilers J., Konnerth A. Two-photon imaging reveals large-scale ultraslow Ca2+ oscillations in the immature cortex // Soc. Neurosci. Abstr.- 1999.- in press.

27. Hanse E., Garaschuk O., Noll-Hussong M., Konnerth A. Synaptic mechanism of oscillatory calcium transients in the developing hippocampus // Eur. J. Physiol.- 1996.- V. 431. - P. 65.

28. Hanse E., Garaschuk O., Konnerth A. Early network oscillations in the developing hippocampus // Soc. Neurosci. Abstr.- 1996.- V. 22.- P. 1975.

29. Hanse E., Garaschuk O., Konnerth A. Intrinsic oscillatory calcium waves control maturation of the synaptic circuitry in the developing hippocampus.// Eur. J. Physiol.- 1997.- V. 433.- P. 133.

30. Hanse E., Garaschuk O., Konnerth A. Synaptically mediated calcium oscillations in the neonatal hippocampus // The tenth international symposium on calcium-binding proteins and calcium function in health and disease.- 1997.-P 91.

31. Hanse E., Durand G.M., Garaschuk O., Konnerth A. Activity-dependent wiring of the developing hippocampal neuronal circuit // Semin. Cell Dev. Biol.- 1997.- V. 8.- P. 35-42.

32. Kano M., Garaschuk O., Verkhratsky A., Konnerth A. Ryanodine receptor-mediated intracellular calcium release in rat cerebellar Purkinje neurones // J. Physiol. Lond.- 1995.- V. 487.- P. 1-16.

33. Konnerth A., Durand G.M., Hanse E., Garaschuk O., Kovalchuk Y. Activity-dependent wiring of the developing hippocampal neuronal circuit // Proc. of the 25th Göttingen Neurobiol. Conf.- 1997.- V. 1.- P. 7.

34. Konnerth A., Durand G., Garaschuk O., Hanse E., Kovalchuk Y. Activity-dependent maturation of glutamatergic synapses.// Eur. J. Neurosci.- 1998.- V. 10.- P. 1.

35. Konnerth A., Hanse E., Durand G., Eilers J., Garaschuk O. Large-scale network oscillations in the brain of neonates // Proc. of the 8-th Otto Loewi Meeting on cellular and molecular neurobiology.- 1999.-P. 43.

36. Konnerth A., Hanse E., Durand G., Eilers J., Garaschuk O. Large-scale network oscillations in the brain of neonates // Proc. of the Jacques Monod Conf.- 1999.-P. 5.

37. Kovalchuk Y., Garaschuk O., Krishtal O.A. Glutamate induces long-term increase in the frequency of single N-methyl-D-aspartate channel openings in hippocampal CA1 neurons examined in situ // Neuroscience.- 1993.- V. 54.- P. 557-559.

38. Kovalchuk Y., Garaschuk O., Krishtal O.A. Theta-rhythm stimulation changes the frequency dependence of CA3-CA1 synaptic transmission in hippocampal slices isolated from young rats // J. Physiol. Lond.- 1993.- V. 473.- P. 133.

37. Linn J., Garaschuk O., Konnerth A. Evidence for functional metabotropic glutamate receptors in the immature hippocampus // Eur. J. Physiol.- 1999.- V. 437.- P. 122.

40. Plant T., Schirra C., Garaschuk O., Rossier J., Konnerth A. Functional and molecular characterization of NMDA receptor channels in inhibitory GABAergic neurones // Eur. J. Physiol.- 1996.- V. 431.- P. 151.

41. Plant T., Schirra C., Garaschuk O., Rossier J., Konnerth A. Molecular determinants of NMDA receptor function in GABAergic neurones of rat forebrain // J. Physiol. Lond.- 1997.- V. 499.- P. 47-63.

42. Tempia F., Kano M., Schneggenburger R., Schirra C., Garaschuk O., Plant T., Konnerth A. Fractional calcium current through neuronal AMPA-receptor channels with a low calcium permeability // J. Neurosci.- 1996.- V. 16.- P. 456-466.

43. Âàëååâ, A.Ý., Ãàðàùóê Î.Â., Äàøêèí À.Í., Êðûøòàëü Î.À. Òàóðèí-àêòèâèðîâàííûå òîêè â íåéðîíàõ ìîçæå÷êà êðûñ // ÄÀÍ.- 1990.- Ò. 311.- Ñ. 748-750.

44. Âàëååâ, A.Ý., Ãàðàùóê Î.Â., Äàøêèí À.Í. Òàóðèí-àêòèâèðîâàííûå òîêè â èçîëëèðîâàííûõ íåéðîíàõ ìîçæå÷êà êðûñ // Íåéðîôèçèîëîãèÿ.- 1990.- Ò. 22.- Ñ. 780-786.

45. Viana F., Garaschuk O., Kovalchuk Y., Konnerth A. Functional properties of ryanodine-sensitive intracellular calcium stores in rat neocortical pyramidal neurons // Soc. Neurosci. Abstr.- 1998.- V. 24.- P. 80.

1. Принятие решений с помощью Excel Задача 1
2. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6 множества 1
3. Болезни органов дыхания
4. Государственный бюджет Республики Беларусь
5. це діяльність спрямована на створення умов для найбільш повного розвитку самоствердження і самореалізаці
6. 11 Лабораторная работа 2
7. Функционирование предприятия в сфере услуг ипотечного кредитования
8. Особливості оподаткування в Україні- становлення та розвиток
9. Деловые игры
10. Составление отчета о прибылях и убытках
11. Сопротивления на схеме на топологии
12. тема- Оцінка легкових автомобілів Виконала студентка групи ОД 3
13. Контрольная работа- Інформаційна система НБУ
14. Организация торгово-технологического процесса в магазине
15. ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКАк проекту закона СанктПетербурга
16. Нові технології в MacOS X10
17. а является линейной комбинацией столбцов строк в которых расположен базисный минор
18. О техническом регулировании
19. Вы конечно шутите мистер Фейнман Ричард Филлипс Фейнман Вы конечно шутите мистер Фейнма
20. Спокойное сияние слоновая кость 199 р

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе