Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Національна академія наук України
Iнститут молекулярної бiологiї та генетики НАНУ
На правах рукопису
Кожухова Наталiя Едуардiвна
УДК 575.11.113:854.78
Дослiдження молекулярно-генетичного
полiморфiзму геному кукурудзи
методом полiмеразної ланцюговоi реакцii
03.00.26-молекулярна генетика
Автореферат дисертації
на здобуття наукового ступеню
кандидата бiологiчних наук
Київ - 1999
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі генної інженерії Селекційно-генетичного інституту УААН (м.Одеса)
Науковий керівник:
доктор біологічних наук, професор,
член-кор. УААН
Сиволап Юрій Михайлович,
Селекційно-генетичний інститут УААН, зав.відділом
генної інженерії
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор
Малюта Станіслав Станіславович
завідувач відділом молекулярної генетики
Інституту молекулярної біології і генетики НАН України
кандидат біологічних наук
Комарницький Ігор Климентійович
старший науковий співробітник
Інституту клітинної біології і
інженерії НАН України
Провідна установа:
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України
Захист дисертації відбудеться 20 квітня 1999 р. о 10 год. На засідінні Спеціалізованої Вченої Ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул. Заболотного, 150
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту Молекулярної біології і генетики НАН України
Автореферат розіслано 19 березня 1999 р.
Вчений секретар Спеціалізованої Вченої Ради
кандидат біологічних наук Л.Л.Лукаш
Актуальнiсть теми. Iдентифiкацiя генотипiв рослин - сортiв, лiнiй, гiбридiв та визначення iх генетичних взаемовiдносин е однiею з основ селекцii рослин. В останнi роки для характеристики генетичного матерiалу використовують методи, що заснованi на профiлюваннi ДНК, зокрема, шляхом аналiзу продуктiв полiмеразноi ланцюговоi реакцii (ПЛР). Найбiльше поширення в дослiдженнi молекулярно-генетичного полiморфизму знайшли два методи ДНК-профiлювання. У першому використовують короткi праймери вiдомоi послiдовностi, але обранi на довiльнiй основi - довiльно праймована ПЛР. Другий пiдхiд заснований на застосуваннi двох специфiчних праймерiв для амплiфiкацii конкретного регiону ДНК, який мiстить мiкросателiтнi повтори - SSR-ПЛР. Практичнi вимоги до вибору технiки ДНК-профiлювання складаються з вiдносно невеликих витрат коштiв та часу, технiчноi простоти, надiйностi, вiдтворюваностi.
Використання рiзноманiтних методiв ДНК-профiлювання для iдентифiкацii та диференцiацii генотипiв цiнних сiльскогосподарських культур, зокрема кукурудзи, рекомендовано Мiжнародною Спiлкою захисту нових сортiв рослин (UPOV - Union for the Protection of New Varieties of Plants). Створення бази даних ДНК-профiлювання лiнiй та гiбридiв, якi широко районованi у Пiвденному регiонi Украiни, е актуальним та доцiльним i виконуеться в рамках завдання "Опрацювати генно-iнженернi технологii дiагностики та видiлити маркери важливiших селекцiйних ознак сiльскогосподарських культур" програми НТП УААН "Теоретичнi основи селекцii та насiнництва сiльскогосподарських культур" (03.04-МВ/322-97).
Мета та завдання дослiдження. Мета роботи полягае в аналiзi молекулярно-генетичного полiморфiзму геному кукурудзи за допомогою двох технiк ДНК-профiлювання-довiльно праймованоi ПЛР (ДП-ПЛР) та SSR-ПЛР. Для досягнення поставленоi мети в дисертацiйнiй роботi вирiшували наступнi завдання: 1. Аналiз характеру успадкування амплiконiв; 2. Визначення гiбридностi простих гiбридiв; 3. Порiвняльне дослiдження внутрiшньовидового молекулярно-генетичного полiморфiзму кукурудзи рiзними методами; 4. Аналiз кореляцiй мiж амплiконами та деякими агро-номiчно важливими ознаками.
Наукова новизна та практичне значення отриманих результатiв. Наукова новизна результатiв складаеться з розробки умов добору праймерiв, що дозволяють диференцiювати генотипи кукурудзи, порiвняльного аналiзу рiзних типiв маркерiв - бiохiмiчних та молекулярних, якi отриманi рiзними методами ДНК-профiлювання, та в обгрунтуваннi вибору маркера для конкретних задач дослiджень.
Практичне значення полягае в оптимiзацii умов ПЛР, зокрема, температурного режиму та складу реакцiйноi сумiшi. Запропонована тест-панель з шести SSR-локусiв для визначення гiбридностi простих гiбридiв кукурудзи. Проведена iдентифiкацiя локусiв, якi вiдповiдають за деякi кiлькiснi ознаки.
Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача становить: оптимiзацiя умов проведення ПЛР, зокрема, складу реакцiйноi сумiшi; аналiз внутрiшньовидового полiморфiзму Zea mays L. рiзними методами ДНК-профiлювання; порiвняльний аналiз дискримiнацiйноi сили бiохiмiчних та молекулярних маркерiв; вивчення характеру успадкування амплiконiв, якi отриманi рiзними ПЛР-методами, у F1-гiбридах кукурудзи; визначення кореляцiй мiж амплiконами та деякими агрономiчно важливими ознаками кукурудзи.
Апробацiя результатiв дисертацii. Результати дослiджень, якi включенi в дисертацiю, доповiдались на VI Мiжнароднiй конференцii "Frontiers in biochemistry and molecular biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Москва, 1995 р.); Мiжнароднiй науково-практичнiй конференцii "Наслiдки наукових пошукiв молодих вчених-аграрникiв в умовах реформування АПК" (Чабани, 1996 р.); Мiжнароднiй конференцii "Молекулярно-генетические маркеры растений" (Ялта, 1996 р.); Мiжнароднiй конференцii "Молекулярная генетика и биотехнология" (Мiнськ, 1998 р.).
Публiкацii. Результати дисертацii опублiкованi в трьох статтях, шести тезах, науково-методичному посiбнику.
Структура дисертацii. Дисертацiя складаѕться iз вступу, шести роздiлiв - огляду лiтератури, матерiалiв та методiв, результатiв та обговорення (у чотирьох роздiлах); висновкiв.
Робота викладана на 105 сторiнках i мiстить 14 малюнкiв та 11 таблиць. Список використованоi лiтератури включаѕ 119 джерел.
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
Iнбреднi лiнii, якi використовувались для дослiджень внутрiшньовидового полiморфизму кукурудзи (Zea mays L.) за допомогою ДП-ПЛР та електрофорезу зеiну, наступнi (у дужках вказана належнiсть до гетерозисноi групи): О156Rf, HMV404, Mk159 (Mindszenpusta); F2, F7, Ma21, Ep1 (Lacaune); Mo17, Од140, Р426, А619, С103, Oh43 (Lancaster); CM105, W63, Wf9, A632, A634, B14, B37, B55, B73, B76 Reid); P101, P165, P343, P480, A344 (Iodent).
Для дослiдження внутрiшньовидового полiморфiзму кукурудзи (Zea mays L.) методом SSR-ПЛР та пошукiв асоцiацiй мiж амплiконами та локусами кiлькiсних ознак використовували наступнi iнбреднi лiнii: ОМ150, ОМ150зм, ОМ151, Мо17, Мо17св, F564c, F564зс, F564-12зс, Р343м, Р101зм, О156Rfмв, HMV2/75м, HMV2/75зм, HMV404мв, HMVD4-1-1, Од7, Од7мв, ГК26св, ГК26м, ГК26зм, Р165мв, Од140мв, Од329, Од322, ГК11м, ГК11зм, ГК11, ОМ74, ОК40зм, Р354зм, ВIР44зм, ВIР40зм, Од428, Од430, Р3295, Од532, Од433-1, Од433-4, Од437-1, Од437-2, Од441-1, СА33, ИК107, Р092, Од427, Р346зм, Р502зм, Р502мв, СМ7зм, ИК205-2, СН586-12, Ea2087зм, W64ASc, W64ASзc, RS186.
Матерiалом для аналiзу успадкування амплiконiв та визначення гiбридностi F1-гiбридiв кукурудзи були батькiвськi форми Р346 i Р502, Од7 i Од24, Р346 i ГК26, ГК26 i Р101, О156 i HMV404, ГК11 i ОМ74, F564 i F564-12, ГК26 i Р502, Р346 i ИК205-2, СА33 i ИК107-1, ОК40 i F2 та вiдповiднi iм гiбриди Р3978, Кедр, Роза, Смена, Сувенир, Сюрприз, Мелодiя, Стожар, Сирень, Платан, Астра.
Видiлення рослинноi ДНК. ДНК видiляли з кожного з десятьох етiольованих проросткiв для визначення типовостi лiнii та з пятьох проросткiв у всiх iнших випадках. Для цього проростки розтирали скляним товкачем у епендорфi до отримання однорiдноi маси, додавали 0,5 мл лiзуючого буферу, до складу якого входить 20 mM Na EDTA, 100 mM трис-HCl pH 8,0 (25 C), 1,4 M NaCl, 2% CТАВ, та iнкубiрували в термостатi одну годину при 60oС. Додавали рiвний об'ем сумiшi хлороформу та iзопентанолу (24:1) та розмiшували на вортексi. Для роздiлення фаз проводили 5-хвилинне центрифугування в Eppendorf 5415 при 14000 об/хв. Водну фазу вiдбирали в iнший епендорф та додавали рiвний об'ем iзопропанолу. ДНК осаджували 5-хвилинним центрифугуванням при 14000 об/хв. Супернатант виливали та висушували при кiмнатнiй температурi 0,5 години. Осадок ДНК розчиняли в 200 мкл буферу ТЕ наступного складу : 10 mM трис-HCl pH 8,0, 1 mM Na EDTA в присутностi 1 мкг/мл РНКази А. Концентрацiю ДНК визначали на DNA Fluorometer, model TKO 100 (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA).
Умови полiмеразноi ланцюговоi реакцii. Полiмеразну ланцюгову реакцiю (ПЛР) здiйснювали на амплiфiкаторi "Терцик" (м.Москва, Росiя) у наступному режимi: початкова денатурацiя – 94oС, 2 хв.; заключна елонгацiя – 72oС, 3 хв. для всiх типiв ПЛР; 30 основних циклiв; денатурацiя – 94oС, 1 хв; вiдпалювання декамерних самiтних праймерiв – 46oС, 1 хв.; 20-членних праймерiв – 52oС, 1 хв.; елонгацiя – 72oС, 2 хв. При проведеннi SSR-ПЛР умови 30 основних циклiв були наступнi: 94oС, 10 сек.; 60oС, 10 сек.; 72oС, 10 сек.
Реакцiйна сумiш об'емом 20 мкл мiстила: 1 х буфер, в склад якого входили 50 mM KCl, 20 mM трис-HCl pH 8,4 (25оС), 4 mM MgCl2, 0,01% твин-20; 0,2 mM кожного dNTP; по 0,2 mkM праймера; 20 нг ДНК; 1 одиниця ДНК-полiмерази Taq. На реакцiйну сумiш наносили 20 мкл мiнеральноi олii. При використаннi кожного праймера здiйснювали негативний контроль.
Продукти амплiфiкацii ДНК (5 мкл реакцiйноi сумiшi) аналiзували електрофорезом у 2%-ому агарозному гелi при ДП-ПЛР або в 4%-ому агарозному гелi при проведеннi SSR-ПЛР в 1хТВЕ (50mM трис-H2BO3, 1 mM Na -EDTA pH 8,0) 5-7 годин при 100-120 V на апаратi Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, USA) при 4oС, фарбували бромистим етiдiѕм i фотографували в УФ-свiтлi на фотоплiвку "Мiкрат 300".
Електрофоретичнi профiлi амплiфiковано§ ДНК кожного генотипу оцiнювали вiзуально й кодували бiнарно: наявнiсть або вiдсутнiсть смуги позначали "1" чи "0" вiдповiдно.
Комп'ютерний аналiз одержаних результатiв. Для встановлення генетичних дистанцiй за методом Nei, Li i побудови дендрограм взаѕмовiдносин генотипiв за методом кластерiзацii "UPGMA" на основi даних електрофоретичного розподiлу бiлкiв та амплiконiв використовували комп'ютерну програму "TREE 4.0". Для визначення кореляцiй мiж амплiконами та локусами кiлькiсних ознак застосовували комп'ютерну програму "MAP_QTL". Показником вiрогiднiстi середнiх значень агрономiчних показникiв був параметричний критерiй Ст'юдента (t-критерiй), який визначали як вiдношення рiзницi середнiх вибiркових до iх помилки. Вiрогiднiсть кореляцiй обчислювали на 1% i 0,1% рiвнi значущостi.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ
1. Вивчення характеру успадкування амплiконiв
При доборi та оцiнцi генетичного маркеру велике значення мае прогнозування його успадкування. Для того, щоб визначити можливiсть використання ПЛР для iдентифiкацii iнбредних лiнiй простих гiбридiв кукурудзи, провели тестування F1-гiбридiв та оцiнили характер успадкування амплiконiв. Дослiджували 33 генотипи кукурудзи: 18 генотипiв за допомогою ПЛР з пятьма довiльними праймерами i 30 - з шiстьма парами SSR-праймерiв. Всього було дослiджено 246 анонiмних ПЛР-локусiв (82% полiморфних) i шiсть SSR-локусiв.
З 203 полiморфних амплiконiв, отриманих шляхом ДП-ПЛР, 3,94% показали "неменделiвську поведiнку": для 3,53% вiдзначена вiдсутнiсть батькiвського фрагменту в ДНК-спектрi гiбрида, а для 0,5% - наявнiсть у ДНК-спектрi гiбрида фрагменту, який не e характерним для батькiвських спектрiв; iншi амплiкони успадковувались домiнант-рецесивним шляхом. При SSRР-аналiзi по шести локусах "неменделiвську поведiнку" вiдзначено в 5% випадкiв. Обговорюються можливi пояснення "неменделiвськоi поведiнки" амплiконiв при ДП-ПЛР та SSR-ПЛР.
Через те, що гiбридна гетерозигота частiше виявляeться при SSRP-аналiзi, цей метод використовували для визначення "гiбридностi" простих гiбридiв кукурудзи. Наявнiсть кодомiнантноi гетерозиготи встановлено у 80% випадкiв по одному-п'яти багатоалельним високоварiабiльним SSR-локусам. Для кожного SSR-локуса пiдрахована ймовiрнiсть виключення РЕ (probability of exclusion) небатькiвських чоловiчих форм шляхом порiвняння з парами материнська форма/потомок вiдомих ге-
нотипiв у популяцii, а також спiльна ймовiрнiсть виключення (combined probability of exclusion). Для шiстьох дослiджених нами SSR-локусiв значення РЕ складали: для adh2n - 0,57; ppdka2 - 0,18; phi064 - 0,65; phi085 - 0,18; phi016 - 0,41; phi061 - 0,16. У зв'язку з тим, що дослiджуванi локусу не зчепленi, СРЕ склала 0,95. Це значення показуѕ, що небатькiвська чоловiча форма може бути неправильно iдентифiкована як батькiвська лише у 5% порiвнянь.
Ситуацiй, коли по одному локусу отримано кодомiнування, а по iншому - "неменделiвська поведiнка", не спостерiгалось. Неможливiсть iдентифiкувати два гiбриди пов'язана з мономорфнiстю батькiвських лiнiй i вiдповiдного гiбрида в одному випадку, та, можливо, засмiченням материнськоi батькiвськоi лiнii в iншому випадку. Тому при тестуваннi гiбридностi доцiльно проводити попереднiй аналiз типовостi лiнiй та чистоти гiбридного насiння. Для цього достатньо провести амплiфiкацiю ДНК iз 10 iндивiдуумiв з використанням однiei пари праймерiв, та при наявнiстi мало§ кiлькiстi нетипових спектрiв (до 10%) у подальших аналiзах використовувати ДНК з типовим спектром. Якщо вiдсоток нетипових спектрiв ДНК буде високим, а також якщо лiнii будуть показувати великий вiдсоток гетерозигот, правомiрно зробити висновок про засмiчення лiнii. Визначення гибридностi в такому разi недоцiльно.
2. Дослiдження внутрiшньовидового полiморфiзму кукурудзи за допомогою бiохiмiчних i молекулярних маркерiв
Оцiнка генетичноi рiзноманiтностi джерел зародковоi плазми e одним з основних завдань селекцiйних програм полiпшення кукурудзи.
У поданiй роботi дослiджений ряд iнбредних лiнiй кукурудзи з вiдомою належнiстю до гетерозисних груп за допомогою ДП-ПЛР з метою розподiлу лiнiй за ступенем iх генетичноi вiддаленостi та порiвняння даних з результатами, отриманими аналiзом електрофоретичних спектрiв зеiну.
ДНК-профiлi лiнiй отриманi амплiфiкацiѕю з десятьма довiльними праймерами. Пiдiбранi праймери дозволили дiскримiнувати усi лiнii, тобто спектри ДНК були унiкальнi для кожноi лiнii i мали вiд 10 до 17 компонентiв. Проаналiзовано 187 амплiконiв, з котрих 76% були полiморфнi.
На дендрограмi зв'язкiв мiж лiнiями видiлились два основних кластера. Перший кластер включав двi лiнii гетерозисноi групи Lancaster: Oh43 и A619, походження якоi пов'язано з Oh43 ([A171xOh43]xOh43). Другий кластер складався з кiлькох субкластерiв. У першому субкластерi згрупувалися лiнii гетерозисноi групи Lacaune французькоi селекцii (F2, F7, Ma21, Ep1) i лiнii гетерозисноi групи Iodent (P430, P343, P165, P101, A344, Од430). В одному субкластерi розмiщенi лiнii А344 i ВIР44, якi мають практично один генотип, але якi репродукувались багато рокiв у рiзних еколого-географичних зонах. (Лiнiя ВIР44 e аналогом американськоi лiнii А344.) Лiнii гетерозисноi групи Reid (В55, В73, Р346; B14 i спорiдненi iй А632, А634 i СМ105) створили другий субкластер. У цей субкластер також вiйшли двi лiнii гетерозисноi групи Lancaster Mo17 и C103, яка e однieю з батькiвських форм Мо17. Але вони не були попарно пов'язанi.
Третiй субкластер включав три лiнii гетерозисноi групи Mindszenpusta (сестринськi лiнii HMV404, О156Rf, Мк159).
Мiнiмальнi генетичнi дистанцii були отриманi мiж гетерозисними групами Lacaune i Iodent (середнe 0,286), а максiмальнi - мiж гетерозисними групами Lancaster i Mindszenpusta (середнe 0,428) (табл.1).
Найменше коливання значеннь генетичних дистанцiй було в межах гетерозисноi групи Lacaune, а найбiльше - мiж лiнiями гетерозисноi групи Lancaster. У цiлому, групування лiнiй за даними полiморфiзму довжин амплiфiкованих фрагментiв ДНК
збiглось з очiкуваною як по педiгрi, так i по гетерозиснiй належнiстi.
Електрофоретичнi спектри зеiну бiльшостi дослiджених лiнiй кукурудзи були специфiчними i представленi 7-13 компонентами. Деякi близькоспорiдненi лiнii не розрiзнялись за електрофоретичними спектрами зеiну. Iз 30 лiнiй, якi включенi
Таблиця 1
Значення генетичних дистанцiй мiж i в межах гетерозисних груп
|
Гетерозисная группа |
Lacaune |
Lancaster |
Mindszen-pusta |
Reid |
Iodent |
|
Lacaune |
0,124-0,156 |
0,329-0,445 |
0,349 |
0,312- 0,329 |
0,259- 0,312 |
|
Lancaster |
0,329-0,445 |
0,101-0,410 |
0,410-0,445 |
0,174-0,445 |
0,329-0,445 |
|
Minszenpusta |
0,349 |
0,410-0,445 |
0,171-0,300 |
0,349 |
0,349 |
|
Reid |
0,312-0,329 |
0,174-0,445 |
0,349 |
0,073-0,262 |
0,312-0,329 |
|
Iodent |
0,259-0,312 |
0,329-0,445 |
0,349 |
0,312-0,329 |
0,103-0,312 |
до аналiзу, унiкальнi спектри зеiну були у 21. На дендрограмi розподiлу лiнiй за даними електрофорезу зеiну не спостерiгалось закономiрностей за гетерозисною належнiстю та походженням.
Дендрограми розподiлу лiнiй кукурудзи, якi побудованi за даними аналiзу полiморфiзму ДНК i запасних бiлкiв, рiзняться в значнiй мiрi.
Аналiз продуктiв амплiфiкацi§ ДНК дозволяѕ отримати бiльш об'eктивну, нiж при розглядi спектрiв бiлкiв, картину генетичних взаeмовiдносин серед лiнiй кукурудзи, що пов'язано з бiльш повною в першому випадку iнформацiѕю про мiнливiсть генетичного матерiалу.
Подiбна сiтуацiя може бути пов'язана з тieю обставиною, що зона, яка кодуe зеiни, охоплюe незначну частину геному, у той час як амплiкони e результатом амплiфiкацii рiзних регiонiв геному, включаючи структурнi та неструктурнi зони. Зеiни дають iнформацiю про мiнливiсть у чотирьох локусах, а за допомогою ДНК-профiлювання вивчено бiльш 200 анонiмних локусiв.
Дискримiнацiйна сила ДНКових маркерiв за рiвнем полiморфiзму значно вища, нiж бiохiмiчних (бiлкових) маркерiв. Однieю з причин цього e бiльший охват геному ДНКовими маркерами. Аналiз електрофоретичних спектрiв зеiну не дозволив унiкально диференцiювати всi дослiдженi лiнii, у той час як аналiз ДНК-профiлiв привiв до iдентифiкацii всiх лiнiй i iх кластерiзацii, яка спiвпадаe (крiм деяких сiтуацiй) з очiкуваною за даними педiгрi i належнiстi до гетерозисних груп.
3. Вивчення молекулярно-генетичного полiморфизму кукурудзи методами SSR- и ДП-ПЛР
Для диференцiацii та iдентифiкацii лiнiй використовували SSRР-аналiз шести локусiв. Кiлькiсть алелiв на локус варiювала вiд двох до п'яти. Для кожного локусу пiдраховували частоти алелiв та iндекси полiморфностi (Polymorphic Index Content - PIC) для оцiнки дискримiнацiйноi сили локуса (табл.2). Середнe значення PIC складало 0,57.
Значення генетичних дистанцiй за даними SSRP-анализу були вiд 0 до 0,62. Нерозпiзнаними за дослiдженими локусами виявились близькоспорiдненi лiнii (при спiльностi геному бiльш 95%), якi рiзнились системою ЦЧС-Rf (цитоплазматична чоловiча стерильнiсть i гени Rf).
Таблиця 2
Значення частот алелiв i iндексу полiморфностi
для шести SSR-локусiв
|
SSR-локус |
Adh2n |
Ppdka2 |
Phi064 |
Phi085 |
Phi015 |
Phi061 |
|
Число аллелей: по литературным данным по результатам нашего анализа |
5 4 |
4 2 |
7 5 |
3
2 |
7 3 |
3 2 |
|
Значение PIC: по литературным данным по результатам нашего анализа |
- 0,70 |
- 0,48 |
0,82 0,78 |
0,75 0,50 |
0,84 0,55 |
0,71 0,40 |
|
Частота аллелей |
1-0,20 2-0,41 3-0,28 4-0,11 |
1-0,59 2-0,41 |
1-0,26 2-0,20 3-0,15 4-0,28 5-0,11 |
1-0,45 2-0,55 |
1-0,45 2-0,50 3-0,05 |
1-0,28 2-0,72 |
За результатом ДП-ПЛР з десятьма довiльними праймерами отримано 156 амплiконiв, з котрих 71% був полiморфним. Спектр амплiфiкованоi ДНК кожноi лiнii мiстив вiд 10 до 17 компонентiв. Усi лiнii були унiкально диференцiйованi. Значення ге-
нетичних дистанцiй варiювали в межах 0,04-0,58.
Аналiз за допомогою ДП-ПЛР виявив бiльше полiморфiзмiв, нiж SSRР-аналiз. У кукурудзи SSRР-аналiз не даѕ такого великого збiльшення дискримiнацiйноi сили, як у соi, пшеницi, томату. Проте SSRР-аналiз у нашому дослiдженнi пiдтвердив близькоспорiдненiсть таких пар лiнiй, як ОМ150 i ОМ150зм; Р502 i Р502мв; F564с, F564зс i F564-12зс; ГК11 i ГК11м; ГК26м i ГК26зм. Кореляцiя мiж даними, отриманними двома типами аналiзу, складаe 0,4.
У розробцi теоретичних та практичних аспектiв селекцii кукурудзи необхiдно застосовувати обидва методи - SSR- i ДП-ПЛР, якi доповнюють один одного i дозволяють ефективно вирiшувати найактуальнiшi проблеми покращання цiei культури.
4. Пошуки асоцiацiй амплiконiв з локусами, якi
контролюють деякi господарсько важливi ознаки кукурудзи
Проаналiзували кореляцii мiж амплiконами, отриманими шляхом ДП-ПЛР и SSR-ПЛР, i 21 агрономiчно важливими ознаками за кiлькiсними показниками 1995 i 1996 рр. Вiрогiднiсть кореляцiй оцiнювали тiльки на високому (1% и 0,1%) рiвнi значущостi. За даними 1995 р. 11 кiлькiсних ознак вiрогiдно корелювали з 11 амплiконами. У 1996 р. дев'ять кiлькiсних ознак вiрогiдно корелювали з десятьма амплiконами. Сiм вiрогiдних кореляцiй спiвпадали за даними обох рокiв. Проаналiзували кореляцii мiж ознаками. За даними 1995 р. знайдено 17 вiрогiдних кореляцiй (13 позитивних i чотири негативних). За даними 1996 р. виявили 33 вiрогiднi кореляцii (24 позитивних i дев'ять негативних), до того ж 13 кореляцiй 1995 р. зберiгались i у 1996 р. Мiж однаковими ознаками за два роки отримана позитивна кореляцiя за всiма показниками. Основнi компоненти урожайностi, такi як маса 1000 зерен, кiлькiсть рядiв зерен, висота рослин, висота прикрiплення качанiв, показали позитивну кореляцiю мiж собою за даними обох рокiв. Показана складнiсть iдентифiкацii локусiв кiлькiсних ознак, прояв яких залежить вiд умов навколишнього середовища. За даними двох рокiв за рiзних погодних умов визначено 40% вiрогiдних кореляцiй меж амплiконами i кiлькiсними ознаками i 76% вiрогiдних кореляцiй мiж самими ознаками. Отриманi маркери можна рекомендувати для аналiзу селекцiйно-генетичного матерiалу.
ВИСНОВКИ
Дослiдження внутрiшньовидового молекулярно-генетичного полiморфiзму кукурудзи рiзними методами ДНК-профiлювання дозволило зробити наступнi висновки:
1. Для iдентифiкацii та диференцiацii лiнiй i гiбридiв кукурудзи доцiльно комплексне застосування двох ПЛР-методiв, що вiдрiзняються за кiлькiстю дослiджених локусiв та характером успадкування.
2. Дискримiнацiйна сила маркерiв, отриманих шляхом ДП-ПЛР, вища, нiж бiлкових та SSR-маркерiв, що дозволяe унiкально диференцiювати лiнii кукурудзи (навiть при спiльностi геномiв бiльш 95%).
3. Кластеризацiя лiнiй за результатами ДП-ПЛР-аналiзу спiвпадаe з очiкуваною по педiгрi та по належностi до гетерозисних груп.
4. SSRР-аналiз бiльш надiйний i вiдтворюваний, нiж ДП-ПЛР, для рiшення таких задач, як визначення чистоти гiбридного насiння, типовостi лiнiй i батькiвства простих гiбридiв.
5. Запропонована тест-панель з шести SSR-локусiв для визначення "гiбридностi" простих гiбридiв кукурудзи, яка показала високу ймовiрнiсть виключення (СРЕ=0,95).
6. У результатi двурiчного аналiзу кiлькiсних ознак лiнiй визначенi вiрогiднi кореляцii мiж амплiконами та деякими важливими агрономiчними ознаками.
Список публiкацiй за темою дисертацii
1. Сиволап Ю., Кожухова Н., Асыка Ю. Исследование генетических взаимоотношений у линий кукурузы при помощи RAPD и зеинов // Цитология и генетика. - 1997. - Т.31, N 1. - С.16-20.
2. Вербицкая Т., Кожухова Н., Гужва Д., Сиволап Ю., Соколов В.Дифференциация линий кукурузы при помощи молекулярных маркеров. // Кукуруза и сорго. - 1997. - N 6. - С.7-11.
3. Кожухова Н., Солоденко А., Сиволап Ю. Наследование продуктов амплификации ДНК у F1-гибридов кукурузы и подсолнечника // Цитология и генетика. - 1998. - N 4. - С.26-31.
4. Sivolap Yu., Chebotar S., Kalendar R., Kozhuhova N. Inter and intraspecies genome changeability of some cultivated cereals // Тезисы VI Международной конференции "Frontiers in biochemostry and molecular biology. The legacy of Andrey Belozersky". - Москва, 1995 г.
5. Кожухова Н., Сиволап Ю. Аналiз полiморфiзму довжини амплiфiкованих фрагментiв ДНК кукурудзи (Zea mays) // Материалы международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Наслiдки наукових пошукiв молодих вчених-аграрникiв в умовах реформування АПК". - Чабани, 1996. - С.222.
6. Кожухова Н., Сиволап Ю., Вареник Б. Ассоциации продуктов амплификации ДНК с локусами, контролирующими некоторые хозяйственно ценные признаки кукурузы // Тезисы докладов международной конференции "Агробиотехнологии растений и животных". - Киев, 1997. - С.21-22.
7. Кожухова Н. Полимеразная цепная реакция и особенности ее применения для анализа полиморфизма // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях. Научно-методическое руководство. Под ред. Ю.М.Сиволапа. - Киев: Аграрна наука, 1998. – 156 c.
8. Кожухова Н., Вербицкая Т. Молекулярно-генетический полиморфизм кукурузы // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях. Научно-методическое руководство. Под ред. Ю.М.Сиволапа. - Киев: Аграрна наука, 1998. – 156c.
Кожухова Н.С. Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму генома кукурудзи методом полімеразної ланцюгової реакції.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.26-молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології й генетики НАН України, Київ, 1998
Дисертацiя присв'ячена питанням використання основних пiдходiв ДНК-профiлювання (довiльно праймована-ПЛР та SSR-ПЛР) для дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму кукурудзи, зокрема, для iдентифiкацi§ та диференцiацii генотипiв. Проведено порiвняльний аналiз дискримiнацiйноi сили бiохiмiчних та молекулярних маркерiв. Вивчено характер успадкування амплiконiв, отриманих рiзними методами ПЛР. Запропонована тест-панель iз шести SSR-локусiв для визначення "гiбридностi" простих гiбридiв кукурудзи. Проведено кореляцiйний аналiз амплiконiв i агрономiчно важливих ознак за кiлькiсними показниками двох рокiв.
Ключові слова: генетичний полiморфизм, ПЛР, кукурудза
Кожухова Н.Э. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма генома кукурудзы (Zea mays L.) методом полимеразной цепной реакции.- Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 - молекулярная генетика.- Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998
Диссертация посвящена вопросам использования основных подходов ДНК-профилирования (ПП-ПЦР и SSR-ПЦР) для исследования молекулярно-генетического полиморфизма кукурузы, в частности, для идентификации и дифференциации генотипов. Проведен сравнительный анализ дискриминационной силы биохимических и молекулярных маркеров. Изучен характер наследования ампликонов, полученных различными методами ПЦР. Предложена тест-панель из шести SSR-локусов для определения "гибридности" простых гибридов кукурузы. Проведен корреляционный анализ ампликонов и агрономически важных признаков по количественным показателям двух лет.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, ПЦР, кукуруза
Kozhuhova N. Molecutar-genetic polymorphism investigation of maize (Zea mays L.) gemone by polymerase chain reaction.- Handcopy.
Thesis for the Degree of Candidate of Biological sciences on speciality 03.00.26 - molecular genetics. - Molecular biology and genetics institute NAS, Ukraine. Kiev, 1998
The dissertation was devoted to various DNA-profiling techniques (AP-PCR and SSR-PCR) usage for molecular-genetic polymorphisms investigation in maize. Genotype identification and differentiation were elaborated. Comparative analysis for discriminative power of biochemical and molecular markers was carried. The character of inheritance of amplicons developed by various PCR-methods was studied. The test-pannel of six SSR-loci was suggested for "hybridity" determination of simple maize hybrids. Cоrrelative analysis of amplicons and agronomically important traits based on quantitative indices for two years was carried.
Key words: genetic polymorphysm, PCR, maize