Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Методы выделения чистых культур микроорганизмов
Методы выделения чистых культу аэробных микроорганизмов
Методы выделения чистых культур микроорганизмов можно подразделить па две основные группы: а) мето ды, основанные на принципе механического разделения микроорганизмов; б) методы, основанные на биологиче ских свойствах микроорганизмов.
Методы, основанные на принципе механического разде ления микроорганизмов.
Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе реносят во 2-го чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма териале на одной из чашек вырастают отдельные коло нии, пригодные для выделения чистой культуры микро организма.
Рассев петлей (посев штрихами). Метод прин ципиально не отличается от предыдущего, но более эко номичен. Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии, описываемые согласно таблице.
Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержа щихся микроорганизмов по величине. Этот метод при меняется главным образом для очистки вирусов от бак терий.
Методы, основанные на биологических свойствах мик роорганизмов.
Метод Шукевича. Исследуемый ма териал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая верхние края культуры в конденсационную воду свежескошенно-го агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру.
Метод прогревания. Позволяет отделить спо-рообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогрева ют исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10—15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую пи тательную среду прорастают.
Бактериостатический метод (метод инги-бирования). Основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микроор ганизмов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамноложительных микроорганизмов и не влияют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомици на1 позволяет освободить нитчатые грибы и дрожжи от бактериальной флоры.
Серная-кислота (5% раствор) быстро убивает боль шинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка вы живает в этих условиях.
Метод обогащения. Исследуемый материал за севают на элективные питательные среды, способствую щие росту определенного вида микроорганизмов.
Метод заражения лабораторных живот ных или растений. Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделе ния их от сапрофитной флоры. Для заражения подбира ют наиболее восприимчивые к предполагаемому возбу дителю инфекции виды животных или сорта растений. После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выявлении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным.
Методы выделения чистых культу анаэробных микроорганизмов
Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био логических методов.
Физические методы. Основаны на выращивании мик роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:
В качестве редуцирующих веществ обычно использу ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и зали вают сверху небольшим количеством стерильного вазе линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.
В качестве легко окисляемых веществ используют глю козу, лактозу и муравьинокисльтй натрий.
Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи ми веществами является среда Китта — Тароцци, кото рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ робов.
Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про изводят по способу Виньяль —Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде ления отдельной колонии трубку надрезают напильни ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней шего выращивания и изучения в чистом виде.
Удаление воздуха производят путем его механическо го откачивания из специальных приборов — анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.
Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.
Химические методы. Основаны на поглощении кисло рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S2O4.
Биологические методы. Основаны на совместном вы ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.
Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.