ІНСТРУМЕНТАЛЬНІ МЕТОДИ АНАЛІЗУ

Работа добавлена на сайт samzan.net:

КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І

ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

ФАКУЛЬТЕТ БІОТЕХНОЛОГІЇ

Кафедра екобіотехнології та біорізноманіття

ЗВІТ НАВЧАЛЬНІЙ ПРАКТИЦІ

з дисципліни

“ІНСТРУМЕНТАЛЬНІ МЕТОДИ АНАЛІЗУ”

Студентки 2 курсу 1 групи
                                                                  Факультету Біотехнології

                                                                  Козяревскої А. В.
                                                                  Перевірив: доцент кафедри
                                                                  екобіотехнології та біорізноманіття
                                                                  к.б.н. Ліханов А.Ф.

                                            

                                                 Київ - 2013

                                                          Зміст

Вступ

1.  Методи вимірювання основних фізико-хімічних параметрів розчинів, реагентів та біологічних систем
2.  Методи електрофорезу в молекулярно-генетичних дослідженнях
3.  Використання методів фотоколориметрії та спектрофотометрії  в біотехнології рослин
4.  Тонкошарова хроматографія
5.  Методи мікроскопічного аналізу біологічних об’єктів
6.  Визначення активності поліфенолоксидази
7.  Висновок

Список літератури

                                                 Вступ

1.Методи вимірювання основних фізико-хімічних параметрів розчинів, реагентів та біологічних систем

Матеріали та обладнання: рН-метр, магнітний змішувач, мірний циліндр на 50 мл, стакан на 50 мл, колба на 50 мл, КН2РО4; Na2НРО4 ; 12 Н2О; СН3СООNа; 1н НСl; СН3СООН; 1н NаОН, трис (оксиметил) амінометан.

Хід роботи

1.  Приготувати 0,07М фосфатного буфера, рН=7,5
2.  На електронних вагах зробити наважку реактивів: КН2РО4 ‒ 0,24 г  розчинити в 25 мл води; Na2НРО4 ∙12 Н2О (л) – 0,626 г розчинити в 25 мл води.
3.  Змішати розчини у співвідношенні 2,5 : 1 (25мл Na2НРО4 та 10 мл КН2РО4).
4.  Кислою або лужною сіллю за допомогою рН-метра довести рН до 7,5.
5.   Самостійно зробити розрахунки і приготувати 1н ацетатний буфер з різним рівнем рН від 3,5 до 6,5.
6.   Визначити рН отриманих буферних розчинів і перевірити результати власних розрахунків.

Рис. 1. рН- метр

2.Методи електрофорезу в молекулярно-генетичних дослідженнях

Мета роботи: Навчитися виділяти дезоксирибонуклеїнові кислоти та проводити їх вивчення за допомогою електрофорезу 

Матеріали та обладнання: рослинний матеріал, буфер для лізису, розчин 5 М ацетату калію, фенол, хлороформ, 70%-вий і 96%-вий етанол, пробірки, мікропестики, автоматичні піпетки, центрифуга Епендорф, льодяна баня.

Хід роботи

1.  Беруть 1 см2 листкового рослинного матеріалу, кладуть в пробірку.
2.  Додають 400 мкл буферу для лізису і розтирають пестиком до гомогенного стану. Склад буферу для лізису: 250 мМ Тріс
   (рН 8,0), 250 мМ NaCl, 50 мМ ЕДТО, 0,5%-вий НДС. Інтенсивно перемішують протягом 5 хв на вортексі. Інкубують протягом 20 хв на бані при температурі 65 °С.
3.  Додають 200 мкл 5 М ацетату калію, перемішують. Інкубують протягом 20 хв на льодяній бані. Осаджують клітинні рештки центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв. Відбирають надосад у нову пробірку.
4.  Додають рівний об’єм фенолу, плавно перемішують до одержання гомогенної емульсії. Розділяють водну і органічну фази центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 5 хв. Намагаючись не захопити частинки інтерфази, відбирають водну фазу в чисту пробірку.
5.  Додають рівний об’єм хлороформу, плавно перемішують. Центрифугують при 12000 об/хв протягом 5 хв. Знову обережно відбирають водну фазу в чисту пробірку.
6.  Додають два об’єма холодного 96%-вого етанолу, плавно перемішують до випадання осаду. Для більш повного випадання осаду можна охолодити пробірку за температурою -20 °С протягом 30 хв. Осаджують нуклеїнові кислоти центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв.
7.  Промивають осад 200 мкл 70%-вого етанола, ретельно випарюють етанол. Якщо осад відокремиться від дна, повторюють центрифугування. Висушують осад і розчиняють в 50 мкл води. Розчин ДНК зберігають за температури +4 °С.
8.  Приготування агарозного гелю. Додають розраховану кількість порошку агарози у відповідний об’єм електрофорезного буферу. Концентрацію агарози вибирають в залежності від довжимни фрагментів ДНК.
9.  Суміш нагрівають на водяній бані, доки не розчинеться вся агароза. Охолоджують розчин до 50 ºС і додають водний розчин бромистого етидію (10 мг/мл) до кінцевої концентрації  0,5 мкг/мл.
10.  Заливають розчин в спеціальну ванночку, попередньо встановив гребінку. Після того, як гель повністю застигне прибирають гребінку і поміщають гель в електрофорезну кювету.
11.  Додають достатню кількість електрофорезного буферу так, щоб гель був закритий його шаром на 1 – 2 мм.
12.  Зразки ДНК змішують з буфером і наносять в лунки геля під електрофорезний буфер. Буфер для зразка містить: 0,25% бромфенолового синього, 40% сахарози в воді.
13.  Вмикають електричний струм. За 15 хв. гель виймають і проглядають на транселюмінаторі. З бромистим ітидієм молекули ДНК під впливом УФ світяться яскраво червоним світлом.

Рис. 2. Гель-електрофорез зразків ДНК

3. Використання методів фотоколориметрії та спектрофотометрії  в біотехнології рослин

Матеріали, реактиви та обладнання: 1) спектрофотометр; 2) електроплитка; 3) піпетки на 1 мл та 10 мл; 4) пробірки на 25-30 мл; 5) термостійку склянку на 200 мл; 6) дистильована вода; 7) мірна колба на 100 мл; 8) розчин безидину; 9) 0,3% перекис водню; 10) ацетатний буфер рН 4,7.

Рис. 3. Спектрофотометр

Хід роботи

1. Наважку сирого рослинного матеріалу 500 – 750 мг розтерти у ступці з ацетатним буфером.

2. Гомогенат настояти 10 хв., перенести в епендорфи об’ємом 2 мл і центрифугувати 5 хв. 4000 об/хв..

3. Супернатант обережно злити і розбавити у буферному розчині у співвідношенні 1: 5.

4. В кварцові кювети внести по 2 мл екстракту, розчину бензидину, дистильованої води. Далі у контрольну кювету долити 2 мл води та поставити її на каретку фотоколориметру виставити стрілку гальванометру на «0» (червоний світлофільтр). В кювету із дослідним зразком внести 2 мл перекису водню, увімкнути секундомір і визначити час за який стрілка гальванометра досягне протилежного краю  шкали.

       4. Тонкошарова хроматографія

Тонкошарова хроматографія – метод розділення речовин різної полярності.
Процес подібний паперової хроматографії, але його перевагою є велика швидкість аналізу, більш високу якість розділення, і можливість вибору однієї з нерухомих фаз, що володіє найбільш відповідними властивостями. На даний момент тонкошарова хроматографія (ТШХ) є одним з основних методів аналізу сумішей органічних речовин в наукових лабораторіях і повністю витіснив паперову хроматографію.

                                                Хід роботи:

Беремо пластинку, попередньо активують в сушільній шафі при 105-110 С.
На відстані 20 мм від краю пластинки (лінія старту) наносять за допомогою самплеру розчини порівняння.

4 мкл та розчини екстрактів різних сортів полуниці і смородини:

1.  Екстракт полуниці без горішків
2.  Полуниця з нормальними листками
3.  Полуниця з аномальними ягодами
4.  Листками аномальними полуниці
5.  Чорна смородина
6.  Червона смородина  
   
   
   Нанесені на пластинку зразки висушують, поміщають в хроматографічну камеру.

Пластина з нанесеними краплями зразків (суміш червоного і синього компоненту) в процесі поділу.

5.Методи мікроскопічного аналізу біологічних об’єктів

 Матеріали та обладнання : рослинний матеріал (зафіксований та порізаний на мікротомі), предметні та покривні скельця, набір реактивів, кедровий бальзам, бюкси для фарбування та промивки препаратів, мікроскоп
Хід роботи

1. Користуються свіжим і фіксованим матеріалом, зрізи роблять від руки небезпечною бритвою.

2. Свіжі зрізи відразу поміщають на предметне скло в дистильовану воду.

3. Зрізи звільняють від води за допомогою фільтрувального паперу.

4. Поміщають зрізи в 5%-ный спиртової розчин флороглюцина, де тримають 3 хв.

5. Потім піпеткою капають на зрізи 3-4 краплі 25% сірчаної кислоти, покривають покривним склом і аналізують під мікроскопом.

Рис. 4. Світловий мікроскоп лабораторного класу

                           Рис. 5. Лапка жучка під світловим мікроскопом

             6.Визначення активності поліфенолоксидази

       Поліфенолокосідаза, або про-діфенолоксідаза, або тирозиназа  так само, як і пероксидаза, грає найважливішу роль в диханні рослин, каталізуючи реакцію окислення поліфенолів. Система «поліфенол-хінон» є посередником при окисленні органічних сполук у процесі дихання рослин. Цей фермент каталізує окислення в присутності молекулярного кисню не тільки різноманітних поліфенолів, а й монофеноли (зокрема, тирозину), о-ді-фенолів з утворенням відповідних хінонів. Встановлено, що залежно від того, з якого джерела отримана поліфенолоксидаза, здатність її до окислення о-дифенолу, поліфенолів і монофеноли різна. Метод заснований на вимірюванні активності ферменту по швидкості утворення синьо-фіолетового забарвлення окисленого ді-метил-n-фенілендіаміна.

      Реактиви та апаратура: 1) 0,02%-ний розчин диметил-n-фенілендаміна (20 мг на 100 см3 дистильованої води) або 0,02%-ний розчин парафенилендиаміна на 0,01 н. щавлевої кислоти, 2) розчин 0,01 н. щавлевої кислоти, 3) 1%-1ний розчин пірокатехіну (1 г в 100 см3 0,01 н. щавлевої кислоти), 4) фосфатний буфер pH 7,4; 5) ФЕК-М.

        Хід аналізу: Наважку (0,5 або 1 +0,001 г) рослинного матеріалу тонко подрібнюють у порцеляновій ступці в присутності буфера (pH 7,4), переносять у мірну колбу на 50 см3 і доводять тим же буфером до мітки. Визначення активності ферменту виробляють або безпосередньо у суспензії, або після центрифугування або фільтрування. У 2 кварцові кювети фотоелектроколориметра доливають компоненти реакційної суміші в наступному порядку: 2 см3 витяжки, 2 см дистильованої води, 2 см3 розчину диметил-n-парафені-лендіаміна. Кювети ставлять у фотоелектроколориметр і встановлюють нульову точку при помаранчевому (або червоному) світлофільтрі. Потім, як і у випадку визначення пероксидази, відводять правим барабаном стрілку гальванометра в праве положення (E = 0,125). Після цього в контрольну кювету (ліворуч) доливають 2 см3 0,01 н. розчину щавлевої кислоти, а в дослідну (праворуч) -2 см3 розчину пірокатехіну в 0,01 н. щавлевої кислоти. Відразу ж включають секундомір. Після вливання розчину пірокатехіну стрілка починає рухатися від краю шкали до Пулєв діленню зі швидкістю, що залежить від активності ферменту у витяжці. У той момент, коли стрілка досягає нульового розподілу, секундомір зупиняють.

                               7. Висновок

                                     Список літератури

1.  Аналітична хімія / В.В. Болотов, А.Н. Гайдукевич, Е.Н. Свечникова та ін. Під ред. В.В.Болотова. – Харків: Вид-во НФАУ «Золотые страницы», 2004. – С. 232-329.
2.  Барыкина Р. П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. – М.: Изд-во МГУ, 2004. – 312 с.
3.  Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. – М.: Мир, 1982. – 448 с.
4.  Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.
5.  Пермяков А.И. Микротехника: Учеб.-метод. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1988. – 58 с.
6.  Практикум по биохимии: Учеб. пособие/ Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Изд-во МГУ, 1989. – 509 с.
7.  Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Изд-во ин. лит., 1954. – 718 с.
8.  Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М.: Сов. наука, 1957. – 467 с.
9.   Сайфидинова А.Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия анализа биологических образцов. Учебно-методическое пособие. – СПб.: Соло, 2008. – 72 с.
10.  Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии: Пер. с англ. – М.: Мир, 1978. – 269 с.
11.   Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии. – Рига: Зинатне, 1988. – 390 с.
12.   Кантере В.М. Теоретические основы технологи микробиологических процессов / В.М. Кантере.  М.: 1990.  272 с.
13.   Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам: Пер. с англ./ Под ред. О. Микеша. – М.: Мир, 1982. – Ч. ІІ. – 381 с.
14.   Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во ин. лит-ры, 1962. – 962 с.

1. Тема- Научный стиль
2. Курсовая работа- Заходи щодо формування стада української чорно-рябої молочної породи великої рогатої худоби
3. майор міліції С
4. Тема- Блочные составные шифры
5. ПО ТЕМЕ- ВАШ РЕБЕНОК ИДЕТ В 1 КЛАСС.
6. ВОЛОГОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Юридический факультет УТВЕРЖДАЮ
7. тема касового виконання бюджетуrdquo; для студентів денної та заочної форми навчання Зміст системи ка
8. Берн Швейцария Бернский собор или Мюнстер самая заметная достопримечательность столицы Шв
9. Сравнительный анализ теорий психического развития [3
10. 82099
11. ФЗ РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЗАКОН ОБ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ Приня.html
12. Центр международных связей А
13. Предупреждение преступлений в сфере компьютерной информации
14. ВОПРОСЫ И ОТВЕТЫ ПО ОСТЕОЛОГИЯ
15. Физиология промежуточного мозга
16. Використання промислових технологій в м Рівне
17. Реферат- Размещение рекламы на телевидении- технологический и информационные аспекты
18.  Interntionl Trde- Export nd Import There re cler benefits to being open to interntionl trde- trde llows people to produce wht they produce best nd to consume the gret vriety of goods nd services
19. Острый абсцесс и гангрена легких
20. и совершенно бесплатно Всю переписку я уже сохранил и выложу в своём блоге на своей конференции и в других с

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе