Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
інститут мікробіології та імунології
ім. І.І. Мечникова
Дячишина Людмила ВІкторівна
УДК 616.34-008.87:547.461.2]-085
Зміни мікроекології кишечнику за дії оксалатів металів та корекція спричинених ними порушень
(Експериментальне дослідження)
03.00.07 - мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Буковинській державній медичній академії МОЗ України (м. Чернівці) на кафедрі клінічной імунології, алергології та ендокринології.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Бабич Євген Михайлович, Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, завідувач лабораторії крапельних інфекцій;
доктор медичних наук, професор Климнюк
Сергій Іванович, Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.
Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, кафедра мікробіології,
вірусології та імунології.
Захист дисертації відбудеться " 29 " листопада 2001року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради (Д 64.618.01) при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14)
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14)
Автореферат розісланий " 23 " жовтня 2001 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради кандидат медичних наук,
старший науковий співробітник І.Ю. Кучма
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Нормальна анаеробна та аеробна мікрофлора кишечнику виконує різноманітні позитивні функції, крім того її вважають екстракорпоральним органом (Шендеров Б.А., 1998). Представ-ники нормальної мікрофлори кишечнику присутні в організмі людини і тварин у вигляді фіксованих до відповідних рецепторів епітеліоцитів слизової оболонки мікроколоній, занурених у біологічну плівку. Біоплівка, яка вкриває слизову оболонку кишечнику, окрім полісахаридів мікробного походження, складається з мікроколоній морфологічно ідентичних клітин і муцину, який продукується епітеліоцитами (Бондаренко В.М. и соавт., 1998). Асоціації мікроорганізмів, які формують біоплівку на поверхні слизової оболонки кишечнику, стабільні й постійно виконують і регулюють ряд функцій організму - забезпечують колонізаційну резистентність слизової оболонки, затримують ріст і розмноження в кишечнику патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів за рахунок продукції органічних кислот та антибіотичних речовин (Румянцев В.Г., 1999; Парфенов А.И., 2001).
Антибіотики, імунодепресанти, цитостатичні речовини тощо при їх тривалому застосуванні порушують колонізаційну резистентність за рахунок негативного їх впливу на порожнинну та мукозну мікрофлору кишечнику (Коршунов В.М. и соавт., 1991; Станкевич В.В., 2000; Фурзікова Т.М. і співавт., 2000). На сучасному етапі недостатньо вивчені закономірності змін кишкової мікрофлори під впливом різних чинників навколишнього середовища, особливо ксенобіотиків, які систематично потрапляють в організм людини через продукти харчування та воду. Існує певна залежність між характером впливу чинників навколишнього середовища та їх небезпечністю: хімічне забруднення > біологічне > фізичне, тобто хімічні сполуки є найнебезпечнішими і частими негативними чинниками впливу на навколишнє середовище (Трахтенберг И.М., 1997; Сердюк А.М., 1998; Дейнека С.Є. і співавт., 1999). Серед них певну роль відіграють солі щавлевої кислоти (оксалати).
Оксалати знайшли широке застосування в різних галузях промисловості, виробництві фармакологічних препаратів, практичній медицині, лабораторній практиці тощо (Химия. Большой энциклопедический словарь, 1998). Разом з тим, дія оксалатів металів на організм людини та тварин вивчена недостатньо. Доведена їх нефро-, гепато- та нейротоксичність стосовно людей, які працюють з ними (Сильвестрова Л.А. и соавт., 1991; Игнатова М.С. и соавт., 1997; Міхєєв А.О., 2000). Крім того, спостерігаються часті отруєння оксалатами, які потрапляють в організм з харчовими продуктами (Даниленко В.С., Родионов П.В., 1986). Науковцями переважно вивчався вплив оксалатів на функціональний стан нирок, що знайшло підтвердження в експерименті (Сильвестрова Л.А. и соавт., 1991; Brinkley L.J. et al., 1990). Але вплив на мікроекологію кишечнику, через який вони саме потрапляють в організм людини, та на колонізаційну резистентність його слизової оболонки залишається поза увагою дослідників. Саме визначення впливу різних концентрацій оксалатів на мікрофлору кишечнику є основою ранньої діагностики та попередження розвитку патологічного процесу в нирках, печінці та нервовій системі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології Буковинської державної медичної академії на тему: "Мікроекологія товстої кишки у хворих різного віку на цукровий діабет та хронічні неспецифічні захворювання легень", реєстраційний № 0198U005598(1996-2002рр). Автор є виконавцем відповідного фрагменту.
Мета і завдання дослідження. Встановити зміни видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини та слизової оболонки кишечнику за умов дії різних доз оксалатів металів (натрію, магнію та кобальту), які потрапляють в організм експериментальних тварин внутрішньошлунковим шляхом, і виявити при цьому деконтамінуючу та коригуючу дії полікомпонентного біопрепарату біфіформ ("Ferrosan," Данія).
Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
1. Вивчити вплив різних доз (1/100, 1/500 і 1/1000 DL50) оксалатів натрію, магнію та кобальту на видовий склад та популяційний рівень мікрофлори порожнини товстої кишки експериментальних тварин при внутрішньошлунковому введенні ксенобіотиків.
2. Встановити вплив різних доз (1/100, 1/500 і 1/1000 DL50) оксалатів натрію, магнію та кобальту на колонізаційну резистентність слизової оболонки товстої кишки статевозрілих білих щурів при безпосередньому введенні в шлунок.
3. Дослідити видовий склад та популяційний рівень мукозної мікрофлори тонкої (клубової) кишки за умов внутрішньошлункового надходження різних доз оксалатів натрію, магнію та кобальту.
4. Виявити деконтамінуючу та коригуючу ефективність нового полімікробного бактерійного препарату біфіформ при експериментально сформованому дисбактеріозі у білих щурів, обумовленому внутрішньошлунковим введенням оксалату натрію.
Об’єкт дослідження. Видовий склад і популяційний рівень мікрофлори порожнини товстої кишки та слизової оболонки товстої та тонкої кишок; ксенобіотики - щавлевокислі натрій, магній та кобальт.
Предмет дослідження. Вплив різних доз ксенобіотиків (оксалатів натрію, магнію та кобальту) на зміни видового складу та популяційного рівня мікрофлори кишечнику; бактерійний препарат біфіформ, деконтамінуюча та коригуюча його ефективність при експериментальному дисбактеріозі.
Методи дослідження. Мікробіологічний - визначення видового складу та популяційного рівня мікрофлори інтактних та експериментальних тварин. Ксенобіотики вводились металевим зондом безпосередньо в шлунок експериментальних тварин в об’ємі 1,0 мл. Матеріалом для дослідження були шматочки товстої та тонкої кишок з їх вмістом, розміром 2-2,5 см, які відбиралися в стерильних умовах після евтаназії тварин за рекомендованими методами (Западнюк И.П. и совавт., 1983).
Мікроекологічні показники мікрофлори кишечнику розраховували за спеціальними формулами (Одум Ю., 1986; Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К., 1989; Климнюк С.І., 1995).
Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що оксалати натрію, магнію та кобальту при внутрішньошлунковому введенні в дозах 1/100, 1/500 DL50 впродовж 7 днів викликають глибoкі зміни видового складу мікрофлори порожнини товстої кишки, а також мікрофлори слизової оболонки товстої та тонкої кишок. Під впливом цих доз елімінують спочатку із порожнини, а потім і зі слизової оболонки еубактерії, біфідобактерії, лактобактерії та ентерококи.
Доза 1/1000 DL50 оксалатів магнію та кобальту не викликає суттєвих змін видового складу та популяційного рівня мікрофлори кишечнику та колонізаційної резистентності слизової оболонки товстої та тонкої кишок. Аналогічна доза оксалату натрію, який найчастіше спричиняє отруєння, викликає формування кишкового дисбактеріозу та порушення колонізаційної резистентності слизової оболонки кишечнику.
Біфіформ поступово відновлює видовий склад та популяційний рівень автохтонних облігатних аспорогенних анаеробних біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій та аеробних ентерококів. Він проявляє виражену деконтамінуючу дію стосовно умовно патогенних ентеробактерій, патогенних (ентерогемолітичних) ешерихій, стафілококів, пептокока та інших бактерій. Крім того, цей біологічний препарат створює умови для контамінації кишечнику дріжджоподібними грибами роду Сandida у високому популяційному рівні.
Практичне значення отриманих результатів. Результати роботи розширюють уявлення про механізми розвитку кишкових дисбактеріозів, вплив ксенобіотиків на організм тварин і, можливо, людини. Результати дослідження впливу малих доз ксенобіотиків на видовий склад та, особливо, на популяційний рівень мікрофлори порожнини товстої кишки можуть бути використані для діагностики отруєння оксалатами на виробництві.
Оксалати натрію, магнію та кобальту при внутрішньошлунковому введенні сприяють елімінації або вираженому дефіциту біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів, зростанню популяційного рівня умовно патогенних ентеробактерій, стафілококів та інших мікроорганізмів та контамінації кишечнику алохтонними патогенними ешерихіями та умовно патогенними мікроорганізмами.
Бактерійний препарат датської фірми "Ferrosan" біфіформ рекомендується використовувати для відновлення бактеріальної мікрофлори навіть за наявності патогенних ешерихій, при сформованому дисбактеріозі. Проте, його не рекомендується призначати хворим, які страждають дисбіозом (при наявності в кишечнику дріжджоподібних грибів роду Сandida).
Впровадження результатів дослідження. Результати роботи впроваджено в навчальний процес на кафедрах мікробіології та вірусології; госпітальної терапії та клінічної фармакології; загальної гігієни та екології Буковинської державної медичної академії; кафедрах мікробіології, вірусології та імунології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського та Луганського державного медичного університету, про що свідчать відповідні акти впровадження.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел. Дисертант самостійно оволоділа методами бактеріологічного та мікологічного досліджень випорожнень, тканин слизової оболонки товстої та тонкої кишок у нормі та при дисбактеріозах, провела експериментальні дослідження на білих щурах та обробку фактичного матеріалу з використанням статистичних методів опрацювання, написала всі розділи дисертаційного дослідження, сформувала основні положення, висновки та практичні рекомендації, підготувала матеріали до публікації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення, висновки та рекомендації дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на VI з’їзді Всеукраїнських лікарських товариств (травень 2001 р., м. Чернівці), науково-практичній конференції на тему: "Актуальні питання діагностики та лікування захворювань людини", присвяченій 10-річчю Чернівецького обласного медичного дігностичного центру (2001р. м. Чернівці) та щорічних наукових конференціях (1998-2000 рр.) Буковинської державної медичної академії.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, із них 7 журнальних статтей в наукових виданнях, рекомендованих ВАК України.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 172 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методів досліджень, двох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, списку використаних літературних джерел, що містить 188 вітчизняних і країн СНД та 53 зарубіжних авторів. Дисертація ілюстрована 31 таблицею та 7 рисунками.
Основний зміст роботи
Матеріал та методи дослідження. Встановлення величин середньосмертельних доз (DL50) для оксалатів натрію, магнію та кобальту проводилось на 3-х групах білих рендомбрендних щурів (n=10 для кожної групи) згідно з вказівками (Методические указания к постановке исследований, 1980).
Експерименти проведено на 121 статевозрілому щурі обох статей масою 0,15-0,18 кг (вік 5-7 місяців).
Виділення аеробних та анаеробних бактерій різних родин та видів проводили згідно загальноприйнятих методик. Ідентифікацию проводили за морфологічними, тинкторіальними, культуральними та біохіміч-ними властивостями (Нормальная микрофлора кишечника. Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника, 1997).
Видовий склад і популяційний рівень порожнинної мікрофлори товстої кишки та мукозної мікрофлори товстої і тонкої кишок оцінювали за умов внутрішньошлункового введення 1 мл стерильної дистильованої води або 1 % водного розчину крохмалю.
Кишковий дисбактеріоз моделювали одноразовим щоденним внутрішньошлунковим введенням металевим зондом вранці натщесерце ксенобіотиків – оксалатів натрію, магнію та кобальту в об’ємі 1 мл впродовж 7-ми днів у дозах 1/1000, 1/500 та 1/100 DL50. Кожна доза випробувалась на 7-ми тваринах.
На фоні сформованого за дії оксалату натрію дисбактеріозу, окрему групу тварин (n=21) залишали на дво-, тритижневий періоди та на 30 днів для вивчення динаміки відновлення мікрофлори порожнини товстої кишки та мукозної мікрофлори товстої та тонкої кишок.
Для корекції змін у мікробіоценозі кишечнику на фоні експериментально сформованого дизбактеріозу за дії оксалатів натрію, магнію та кобальту, використовували комплексний бактерійний препарат біфіформ ("Ferrosan", Данія). Вміст капсули біфіформу розчиняли в 1 мл фіз. розчину і вводили одноразово внутрішньошлунково металевим зондом впродовж 10 днів.
Екологічний стан мікробіоценозу порожнини товстої кишки та мукозної мікрофлори товстої та тонкої кишок оцінювали за індексом сталості (С %), показниками частоти виявлення (Рі ) та значущості (С) кожного виду (Одум Ю., 1986; Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К., 1989; Климнюк С.І., 1995).
Статистичну обробку отриманих даних проводили на PC IBM 586 за програмами статаналізу "Statgraphics" (США) та "Excel - 7.0" (Microsoft Office, США).
Результати дослідження та їх обговорення
Першим етапом було встановлення величин середньосмертельних доз (DL50) для оксалатів натрію, магнію та кобальту.
Внутрішньошлункова затравка щурів вищевказаними ксенобіотиками проводилась одноразово вранці натщесерце. Середньосмертельна доза (DL50) для оксалату натрію встановлена на рівні 1087 мг/кг, для оксалату магнію – 100000 мг/кг, оксалату кобальту – 5000 мг/кг.
В інтактних білих щурів (n=32), які отримували внутрішньошлунково впродовж 7 днів 1 мл стерильної дистильованої води або 1 % розчин крохмалю на воді, порожнинна мікрофлора товстої кишки була представлена резидентними мікроорганізмами – бактероїдами, біфідобактеріями, лактобактеріями, ентерококами, еубактеріями, стафілококами і фузобактеріями. Інші мікроорганізми (превотелли, пептокок, клостридії) належали до факультативних і виявлялись нечасто. Клебсієли, гемолітичні ешерихії та дріжджоподібні гриби роду Candida у всіх тварин контрольної групи не зустрічались.
Комплексне вивчення видового складу та популяційного рівня мікрофлори слизової оболонки товстої кишки інтактних білих щурів довело, що вона представлена бактероїдами, лактобактеріями, ешерихіями, біфідобактеріями та ентерококами. У незначній кількості тварин слизову оболонку цього біотопу колонізують превотелли та еубактерії.
Слизова оболонка тонкої кишки в інтактних тварин колонізована бактероїдами, лактобактеріями, ешерихіями, біфідобактеріями та ентерококами.
Внутрішньошлункове введення дози 1,09 мг/кг (1/1000 DL50) оксалату натрію призводило до значних змін видового складу мікрофлори порожнини товстої кишки за рахунок зменшення індексу сталості біфідобактерій, еубактерій, фузобактерій, елімінації ентерококів, зростанню цього показника для клостридій, протеїв, стафілококів. Вказана вище доза оксалату натрію призводила до зростання показника значущості бактероїдів, клостридій (у 2,86 рази), пептокока, пептострептококів, ешерихій, протеїв та стафілококів. На цьому фоні зменшується цей показник для автохтонних облігатних бактерій - біфідобактерій (у 2,13 рази), лактобактерій (на 80,72 %), еубактерій (на 90,54 %) та елімінуються ентерококи. Разом з тим, відбувається контамінація порожнини товстої кишки умовно патогенними ентеробактеріями (клебсієлами).
Збільшення дози до 2,18 мг/кг (1/500 DL50) призводить до елімінації біфідобактерій, еубактерій, зниження індексу сталості лактобактерій, фузобактерій. Одночасно спостерігається зростання цього показника для клостридій, клебсієл, протеїв, стафілококів, з’являються ентерогемолітичні кишкові палички. Паралельно спостерігаються зміни популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки. При цьому відбувається елімінація біфідобактерій та еубактерій у всіх піддослідних тварин, різке зниження рівня лактобактерій та ентерококів (на 97,13 %), показника значущості (у 3,96 рази) та коефіцієнта кількісного домінування (у 4,33 рази). Разом з тим, на цьому фоні різко зростають рівні колонізації умовно патогенними анаеробними бактеріями (клостридіями, пептококом, пептострептококами) та аеробних бактерій (ешерихій, клебсієл, протеїв, стафілококів). У більшості експериментальних тварин настає контамінація порожнини товстої кишки патогенними (гемолітичними) ешерихіями, клебсієлами, а в частини піддослідних тварин, формується кандидомікоз кишечнику.
За дії дози 10,87 мг/кг (1/100 DL50) спостерігається елімінація окрім вищевказаних мікроорганізмів ще й фузобактерій. Зростає індекс сталості клостридій, гемолітичних ешерихій, дріжджоподібних грибів роду Candida, знижується популяційний рівень лактобактерій (у 2,25 рази) і ентерококів (на 10,52 %). На цьому фоні зростає ступінь колонізації бактероїдами, превотеллами, клостридіями, пептококом, пептострептококами, ешерихіями, протеями, стафілококами, а також настає виражена контамінація кишечнику гемолітичними ешерихіями, клебсієлами та дріжджоподібними грибами роду Candida.
Вивчення впливу доз оксалату натрію на видовий склад та популяційний рівень мукозної мікрофлори тонкої кишки показало, що найменша доза призводить до зниження популяційного рівня біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій, ентерококів. На цьому фоні слизова оболонка цього біотопу контамінується та колонізується клостридіями, протеями та стафілококами в більшому ступені, ніж в інтактних тварин. Збільшення дози ксенобіотика сприяє посиленню негативних змін: при дозі 2,18 мг/кг елімінуються еубактерії, а при 10,87 мг/кг ще й біфідобактерії та ентерококи, різко знижуєтся популяційний рівень лактобактерій та ешерихій та одночасно зростає колонізація протеями, клебсієлами, клостридіями та стафілококами.
Оксалат магнію в дозі 100 мг/кг (1/1000 DL50) у більшості тварин не призводить до суттєвих змін видового складу і популяційного рівня мікрофлори вмісту товстої кишки. Спостерігається перехід фузобактерій із розряду константних (С % - 53,13) до розряду другорядних (С % - 28,57).
Оксалат магнію в дозі 200 мг/кг (1/500 DL50) призводить до часткової елімінації та зменшення популяційного рівня в порожнині товстої кишки біфідобактерій та лактобактерій, фузобактерій та еубактерій. Паралельно відбувається контамінація цього біотопу стафілококами, протеями, дріжджоподібними грибами роду Candida та клостридіями, про що свідчать зміни мікроекологічних показників. Оскільки за дії цієї дози настає контамінація цього біотопу дріжджоподібними грибами роду Candida, має місце розвиток кишкового дисбактеріозу I-II ступенів за В.М. Бондаренко та співавт. (1990).
Збільшення дози оксалату магнію до 1000 мг/кг (1/100 DL50) призводить до елімінації у всіх тварин еубактерій та фузобактерій, зменшення індексу сталості та популяційного рівня біфідобактерій, ентерококів, а в трьох тварин і лактобактерій. Важливим є те, що в п’яти тварин формувався кандидоз, а в трьох - спостерігалась контамінація цього біотопу гемолітичними ешерихіями. Паралельно збільшувалась частота висівання клостридій, пептострептококів, а для стафілококів і протеїв вона становила 100 %.
Вивчення змін видового складу мукозної мікрофлори товстої кишки показало, що за дії дози 100 мг/кг оксалату магнію суттєвих її змін не виникає. Окрім того ця доза не впливає на популяційний рівень, показник значущості та коефіцієнт кількісного домінування.
Доза оксалату магнію 200 мг/кг призводить до елімінації еубактерій, зменшення біфідобактерій, лактобактерій та ентерококів. Паралельно слизова оболонка даного біотопу колонізується протеями, стафілококами на помірному популяційному рівні.
Збільшення дози оксалату магнію до 1000 мг/кг сприяє елімінації біфідо-, лактобактерій, ентерококів та контамінації цього біотопу стафілококами, протеями та гемолітичними ешерихіями, популяційний рівень та екологічні показники яких зростають.
Дослідження впливу аналогічних доз оксалату магнію на видовий склад та популяційний рівень мукозної мікрофлори тонкої кишки показало, що доза 100 мг/кг не призводить до суттєвих змін як видового складу, так і популяційного рівня мікрофлори даного біотопу. Доза 200 мг/кг сприяє частковій елімінації з цього біотопу біфідо-, лактобактерій, ентерококів. Збільшення дози (1000 мг/кг) призводить до повної елімінації у всіх тварин біфідо-, лакто-, еубактерій, ентерококів. За дії двох останніх доз слизова даного біотопу колонізується протеями, клостридіями та дріжджоподібними грибами роду Candida.
Третім ксенобіотиком, вплив якого вивчався на стан мікробіоценозу кишечнику експериментальних тварин, був оксалат кобальту. Його мінімальна доза - 5 мг/кг (1/1000 DL50) не призводила до дестабілізації як видового складу, так і популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки.
Доза оксалату кобальту 10 мг/кг (1/500 DL50) призводила до зниження індексу сталості та популяційного рівня у біфідо-, еу- та фузобактерій. Водночас збільшуються показники значущості та коефіцієнти кількісного домінування в бактероїдів, клостридій, а також відбувається контамінація порожнини даного біотопу умовно патогенними ентеробактеріями (гафніями).
Оксалат кобальту в дозі 50 мг/кг (1/100 DL50) призводив до елімінації біфідо-, лактобактерій, ентерококів, еу- та фузобактерій. На цьому фоні наставала контамінація порожнини товстої кишки едвардсієлами.
Вивчення впливу оксалату кобальту на стан мікрофлори слизової оболонки товстої та тонкої кишок показало, що перша доза не порушує як видового складу, так і популяційного рівня цього біотопу. Дози 10 мг/кг частково, а 50 мг/кг повністю порушують колонізаційну резистентність слизової оболонки , про що свідчать незначне зменшення індексу сталості, популяційного рівня автохтонних облігатних бактерій та їх зростання для клостридій, ентеробактерій (протеїв), а остання ще й викликає зміни стафілококових популяцій.
Підсумовуючи отримані результати щодо вивчення видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки, слизової оболонки товстої та тонкої кишок, всі мікроорганізми, які виявлені нами в інтактних та експериментальних тварин за умов дії оксалатів металів, за їх функціональним значенням та участю в забезпеченні колонізаційної резистентності слизової оболонки кишечнику, можна класифікувати на 5 груп.
I група - автохтонні облігатні фізіологічно корисні бактерії, які є константними в порожнині товстої кишки інтактних тварин, формують колонізаційну резистентність слизової оболонки кишечнику (товстої та клубової кишок). При формуванні кишкового дисбактеріозу за дії різних доз оксалатів металів ці мікроорганізми першими елімінуються або ж настає їх виражений дефіцит у порожнині товстої кишки. Ці мікроорганізми в інтактних тварин визначаються на високому популяційному рівні. До них належать біфідобактерії, лактобактерії, еубактерії та ентерококи.
II група - автохтонні облігатні мікроби, постійно виявляються на високому популяційному рівні в порожнині товстої кишки як в інтактних тварин, так і при дисбактеріозах, сформованих за дії оксалатів металів. Вони колонізують слизову оболонку товстої та тонкої кишок на порівняно високому популяційному рівні. До цієї групи належать бактероїди, превотелли, кишкові палички, видовий склад та популяційний рівень яких практично не змінюються при формуванні кишкового дисбактеріозу за умов дії оксалатів металів.
III група - автохтонні факультативні мікроорганізми. Вони постійно виявляються на порівняно низькому популяційному рівні в порожнині товстої кишки, не беруть участі в формуванні колонізаційної резистентності слизової оболонки товстої та тонкої кишок. IV група - автохтонні факультативні мікроорганізми, які часто виявляються в порожнині товстої кишки на високому популяційному рівні. При формуванні кишкового дисбактеріозу зростають їх індекс сталості та показник значущості, а також коефіцієнт домінування. Ці мікроорганізми не колонізують слизової оболонки товстої та тонкої кишок як в інтактних, так і в тварин з явищами дисбактеріозу за дії оксалатів металів. До цієї групи належать пептокок і пептострептококи.
V група - алохтонні умовно патогенні та патогенні мікроорганізми, які не виявляються в інтактних тварин як в порожнині товстої кишки, так і на слизовій оболонці товстої та тонкої кишок. Ці мікроорганізми контамінують порожнину товстої кишки, а також здатні колонізувати слизову оболонку товстої та тонкої кишки експериментальних тварин, в яких сформувався кишковий дисбактеріоз за дії оксалату магнію. До таких мікроорганізмів належать ентерогемолітичні кишкові палички та дріжджоподібні гриби роду Candida.
Вивченя процесу самовідновлення мікрофлори кишечнику - як порожнинної, так і мукозної мікрофлори товстої та тонкої кишок показало, що після завершення введення оксалату натрію, видовий склад та популяційний рівень кишкової мікрофлори у більшості експериментальних тварин залишаються зміненими впродовж одного місяця та довше.
Введений внутрішньошлунково впродовж 10 днів на фоні сформованого дисбактеріозу за дії оксалату натрію, біфіформ призводить до позитивних змін видового складу та популяційного рівня автохтонних облігатних бактерій.
Рис. Класифікація мікроорганізмів кишечнику в нормі та за умов дії оксалату
натрію.
Значно зростає індекс сталості та коефіцієнт домінування автохтонних облігатних бактерій першої групи - біфідобактерій, еубактерій, лактобактерій та ентерококів у порожнині товстої кишки. Водночас має місце деконтамінація пептострептококів, патогенних ешерихій, клебсієл та протеїв, значно знижується популяційний рівень клостридій, пептокока, кишкових паличок, стафілококів.
Разом з тим, негативним є те, що при використанні біфіформу зростає індекс сталості, коефіцієнт домінування у порожнині товстої кишки дріжджоподібних грибів роду Candida (таблиці 1, 2).
Використання біфіформу для селективної деконтамінації умовно патогенних ентеробактерій та інших алохтонних мікроорганізмів, які контамінують слизову оболонку товстої кишки в процесі формування кишкового дисбактеріозу за дії оксалату натрію, а також для корекції видового складу та популяційного рівня мукозної мікрофлори товстої кишки, призводить до деконтамінації зі слизової оболонки товстої кишки умовно патогенних ентеробактерій (протеїв, клебсієл), клостридій та превотел, а також до відновлення видового складу та вихідного популяційного рівня автохтонних облігатних анаеробних біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій та аеробних ентерококів у більшості експериментальних тварин.
Видовий склад та популяційний рівень (lg КУО/г) анаеробних бактерій порожнини товстої кишки інтактних тварин, тварин з експериментальним дисбактеріозом (дисбіозом) до і після корекції біфіформом
|
Мікроорганізми |
Мікроекологічні показники |
Вихідні показники мікрофлори в нормі (n=32) |
Вихідні показники мікрофлори при дисбактеріозі (2,18 мг/кг) (n=7) |
Після бактеріотерапії біфіформом (n=7) |
|
І. Анаеробні бактерії |
||||
|
Біфідобактерії |
М±m C % КД |
8,88±0,31 96,88 111,44 |
0 0 0 |
7,99±0,17*** 100,0 107,54 |
|
Лактобактерії |
М±m C % КД |
9,56±0,37 93,75 116,09 |
4,87±0,31 42,86 26,79 |
9,17±0,14*** 100,0 123,42 |
|
Бактероїди |
М±m C % КД |
10,15±0,41 100,0 131,48 |
9,98±0,27 100,0 128,11 |
10,03±0,21 100,0 134,50 |
|
Превотелли |
М±m C % КД |
9,89±0,29 43,75 56,05 |
9,17±0,41 28,57 33,63 |
9,08±0,24 28,57 34,91 |
|
Еубактерії |
М±m C % КД |
9,47±0,33 84,37 103,45 |
0 0 0 |
9,17±0,27*** 28,57 35,26 |
|
Клостридії |
М±m C % КД |
3,01±0,21 21,88 8,53 |
7,07±0,28 71,43 34,83 |
4,17 14,29 8,02 |
Примітки: С % - індекс сталості; КД – коефіцієнт кількісного домінування; вірогідність різниць між 1 та 3 групами: ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 (наведено тільки статистично вірогідні відмінності).
При цьому знижуються вищезазначені показники для превотелл, бактероїдів і клостридій. Разом з тим, спостерігається колонізація слизової оболонки товстої кишки в частини (5-ти з 7-ми) експериментальних тварин дріжджоподібними грибами роду Candida, популяційний рівень яких сягає показників, близьких до критичних.
"Біотерапія" експериментального дисбактеріозу біфіформом призводить також не тільки до деконтамінації клебсієл, протеїв із слизової оболонки тонкої кишки, а також сприяє зростанню популяційного рівня, індексу сталості та коефіцієнту кількісного домінування біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій та ентерококів. Разом з тим, при цьому настає контамінація слизової оболонки тонкої кишки дріжджоподібними грибами роду Candida, популяційний рівень яких сягає від 3,93 до 4,89 lg КУО/г.
Видовий склад та популяційний рівень (lg КУО/г) аеробних бактерій порожнини товстої кишки інтактних тварин, тварин з експериментальним дисбактеріозом (дисбіозом) до і після корекції біфіформом
|
Мікроорганізми |
Мікроекологічні показники |
Вихідні показники мікрофлори в нормі (n=32) |
Вихідні показники мікрофлори при дисбактеріозі (2,18 мг/кг) (n=7) |
Після бактеріотерапії біфіформом (n=7) |
|
ІІ. Аеробні мікроорганізми |
||||
|
Кишкові палички |
М±m C % КД |
4,72±0,27 100,0 61,14 |
5,73±0,21 100, 73,56 |
4,79±0,11** 100,0 64,47 |
|
Е. coli Hly+ |
М±m C % КД |
0 0 0 |
8,75±0,30 57,14 64,40 |
0 0 0 |
Клебсієли |
М±m C % КД |
0 0 0 |
7,91±0,21 57,14 58,02 |
0 0 0 |
|
Протеї |
М±m C % КД |
4,02±0,05 50,0 26,4 |
9,18±0,19 100,0 117,84 |
0 0 0 |
|
Ентерококи |
М±m C % КД |
8,09±0,17 87,5 91,64 |
6,96±0,32 42,86 38,29 |
9,03±0,47** 71,43 86,81 |
|
Стафілококи |
М±m C % КД |
5,37±0,19 65,63 45,65 |
8,93±0,29 100,0 114,63 |
4,19±0,18*** 42,86 24,17 |
|
Дріжджоподібні гриби роду Candida |
М±m C % КД |
0 0 0 |
5,26±0,17 28,57 19,29 |
6,83±0,16*** 71,43 65,66 |
Примітки: С % - індекс сталості; КД – коефіцієнт кількісного домінування; вірогідність різниць між 1 та 3 групами: ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 (наведено тільки статистично вірогідні відмінності).
Висновки
1. Порожнинна та мукозна мікрофлора кишечнику є важливим екстракорпоральним детоксикаційним органом, який здатний акумулювати токсичні продукти, що потрапляють іззовні або утворюються в макроорганізмі з наступним їх виведенням у навколишнє середовище. Вона формує колонізаційну резистентність слизової оболонки кишечнику, виконує та регулює ряд функцій організму, зокрема, гальмує ріст та розмноження патогенних та умовно патогенних алохтонних мікроорганізмів.
2. Оксалати натрію, магнію та кобальту, що вводилися внутрішньо-шлунково в дозах 1/100, 1/500 і 1/1000 DL50, викликають формування дисбактеріозу (дисбіозу) у порожнині товстої кишки за рахунок елімінації або вираженого дефіциту автохтонних облігатних біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій та ентерококів, зростання популяційного рівня автохтонних факультативних ентеробактерій, клостридій та стафілококів та контамінації порожнини товстої кишки алохтонними патогенними (ентерогемолітичними) кишковими паличками та дріжджоподібними грибами роду Candida.
3. Ступінь дисбактеріозу порожнини товстої кишки залежить від дози оксалатів металів та природи катіона. Найглибші зміни мікрофлори порожнини товстої кишки викликає оксалат натрію, найменші - оксалат кобальту. Сила впливу оксалатів на мікроекологію порожнини товстої кишки прямо пропорційна їх дозі - збільшення дози ксенобіотика призводить до зростання ступеня змін як видового складу, так і популяційного рівня порожнинної мікрофлори.
4. Оксалати натрію, магнію та кобальту, які вводились безпосередньо в шлунок, призводять до глибоких порушень колонізаційної резистентності слизової оболонки товстої кишки за рахунок елімінації зі слизової оболонки та появи вираженого дефіциту еубактерій, біфідобактерій та ентерококів, лактобактерій і нормальних ешерихій, колонізації слизової оболонки умовно патогенними ентеробактеріями, стафілококами та клостридіями. Рівень змін колонізаційної резистентності слизової оболонки товстої кишки залежить від дози досліджуваного ксенобіотика та природи його катіона.
5. Мукозна мікрофлора тонкої (клубової) кишки зазнає змін за дії ксенобіотиків впродовж 7 днів, які характеризуються дефіцитом біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій, ентерококів та колонізацією слизової оболонки тонкої кишки умовно патогенними ентеробактеріями, стафілококами та клостридіями. Збільшення дози ксенобіотика негативно впливає на мукозну мікрофлору тонкої кишки. Високі (1/100 DL50) дози оксалатів є причиною елімінації біфідобактерій, еубактерій та ентерококів, дефіциту лактобактерій, ешерихій і колонізації умовно патогенними ентеробактеріями, стафілококами.
6. Процес самовідновлення порожнинної мікрофлори товстої кишки, мікрофлори слизової оболонки товстої та тонкої кишок після припинення внутрішньошлункового введення оксалату натрію продовжується понад один місяць, що вимагає використання для прискорення відновлення мікроекології кишечнику бактеріальних біологічних препаратів.
7. Біопрепарат біфіформ фірми "Ferrosan" (Данія) викликає селективну деконтамінацію алохтонних патогенних (гемолітичних) ешерихій та умовно патогенних ентеробактерій, стафілококів, пептокока, пептострептококів із порожнини товстої кишки та слизової оболонки товстої і тонкої кишок. Він є ефективним засобом корекції мікрофлори порожнини товстої кишки та мукозної мікрофлори слизової оболонки товстої і тонкої кишок та сприяє заселенню кишечнику автохтонними облігатними бактеріями, що призводить до відновлення колонізаційної резистентності слизової оболонки кишечнику. Біфіформ не тільки не сприяє селективній деконтамінації дріжджоподібних грибів роду Candida, а навпаки, сприяє контамінації цими мікроорганізмами порожнини товстої кишки і слизової оболонки товстої та тонкої кишок.
Практичні рекомендації
1. Для діагностики надходження пероральним шляхом малих доз оксалатів натрію, магнію та кобальту можна використати тест визначення видового складу та популяційного рівня мікрофлори вмісту порожнини товстої кишки, при якому буде визначений ступінь кишкового дисбактеріозу або дисбіозу.
2. Для відновлення порушеного видового складу та популяційного рівня мікрофлори кишечнику, зумовленого пероральним надходженням в організм оксалатів, доцільно, у випадку дисбактеріозу, призначати бактерійний препарат біфіформ. У випадку контамінації кишечнику дріжджоподібними грибами роду Candida, біфіформ протипоказаний.
Список опублікованих праць за темою дисертації
1. Дячишина Л.В. Вплив різних доз оксалату натрію на видовий склад та популяційний рівень мікрофлори порожнини товстої кишки в експерименті // Буковинський медичний вісник.- 1999.- № 3.- С. 187-195.
2. Дячишина Л.В. Колонізаційна резистентність слизової оболонки кишечнику білих щурів під впливом різних доз оксалату магнію // Експериментальна і клінічна медицина.- 2000.- № 1.- С. 22-27.
3. Дячишина Л.В. Деконтамінуюча та коригувальна ефективність біфіформу при експериментальному дисбактеріозі // Буковинський медичний вісник.- 2001.- № 1.- С. 155-159.
4. Дейнека С.Є., Проданчук М.Г., Власик Л.І., Дячишина Л.В. Гостра токсичність ряду органічних та неорганічних солей металів та видова чутливість до них // Вісник проблем біології і медицини.- 1999.- № 9.- С. 109-113.
5. Сидорчук І.Й., Дячишина Л.В. Вплив щавлевокислого натрію на колонізаційну резистентність слизової оболонки кишечника білих щурів // Інфекційні хвороби.- 1999.- № 3.- С. 57-63.
6. Сидорчук І.Й., Дячишина Л.В. Зміни видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки за дії щавлевокислого магнію // Експериментальна і клінічна медицина.- 2000.- № 2.- С. 32-36.
7. Сидорчук І.Й., Дячишина Л.В., ДейнекаС.Є. Екологічні порушення видового складу і популяційного рівня мікрофлори порожнини товстої кишки під впливом різних доз оксалату кобальту
// Одеський медичний журнал.- 2000.- № 2 (58).- С. 19-22.
8. Л.В. Дячишина. Деконтамінуюча та коригуюча ефективність біфіформа при експериментальному дисбактеріозі, зумовленому внутрішньошлунковим надходженням оксалату натрію // Актуальні питання клініко-лабораторної діагностики захворювань людини (Матеріали науково-практичної конференції, присвяченої 10-річчю Чернівецького обласного медичного діагностичного центру).- Чернівці, 2001.- С. 53-55.
Анотація
Дячишина Л.В. Зміни мікроекології кишечнику за дії оксалатів металів та корекція спричинених ними порушень.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07- мікробіологія. Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України, Харків, 2001 р.
Дисертацію присвячено питанням діагностики порушень мікробіоценозу кишечнику за умов дії ксенобіотиків (оксалатів натрію, магнію та кобальту) та відновленню цих змін.
Вивчено видовий склад і популяційний рівень мікрофлори вмісту товстої кишки та слизової оболонки товстої та тонкої кишок за дії різних доз (1/1000, 1/500, 1/100 DL50) оксалатів натрію, магнію та кобальту. Встановлено зміни як порожнинної так і мукозної мікрофлори досліджуваних біотопів.
Для відновлення мікрофлори кишечнику та корекції змін, що виникли за дії оксалатів, використано полікомпонентний біологічний препарат біфіформ ("Ferrosan", Данія). Він сприяє нормалізації порушеного мікробіоценозу за рахунок зменшення мікробної контамінації кишечнику факультативними та алохтонними патогенними та умовно патогенними мікроорганізмами, а також збільшенню популяційного рівня автохтонних облігатних фізіологічно корисних мікроорганізмів.
У випадку формування дисбіозу, призначення біфіформу не рекомендується, оскільки він сприяє розмноженню та колонізації слизової оболонки кишечнику дріжджоподібними грибами роду Candida.
Ключові слова: порожнинна мікрофлора, мукозна мікрофлора, товста кишка, тонка кишка, оксалат натрію, оксалат магнію, оксалат кобальту, біфіформ.
Аннотация
Дячишина Л.В. Изменения микроэкологии кишечника под влиянием оксалатов металлов и коррекция вызываемых ими нарушений.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова АМН Украины, Харьков, 2001 г.
Защищается диссертационная работа и 7 научных статей, которые содержат сведения об изменениях нормальной микрофлоры кишечника экспериментальных животных под влиянием ксенобиотиков и путях коррекции, вызываемых ими нарушений.
Эксперименты проведены на 121 белой крысе.
Изучалось влияние 3-х ксенобиотиков (оксалаты натрия, магния, кобальта) на состояние полостной микрофлоры толстой кишки и мукозной микрофлоры толстой и тонкой кишок. Каждый ксенобиотик вводился по 1,0 мл однократно внутрижелудочно в течение 7 дней в дозах 1/1000, 1/500, 1/100 DL50.
Установлено, что все вышеназванные химические соединения приводят к изменению микробного пейзажа разных биотопов кишечника, но наиболее выраженным токсическим влиянием обладает оксалат натрия. Учитывая полученные данные изучения видового состава и популяционного уровня микрофлоры полости толстой кишки и слизистой оболочки толстой и тонкой кишок, выявленные нами как в контрольной группе животных, так и в исследуемой (под влиянием оксалатов натрия, магния, кобальта), все микроорганизмы по их функциональному значению и участию в обеспечении колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника, можно классифицировать на следующие группы.
1-ая группа – аутохтонные облигатные физиологически полезные бактерии, являющиеся константными в просвете толстой кишки и принимающие участие в обеспечении колонизационной резистентности слизистой толстой и тонкой кишок. При формировании дисбактериоза под влиянием оксалатов металлов, они элиминируются первыми. К ним относятся бифидо-, лакто-, эубактерии, энтерококки.
2-ая группа – аутохтонные облигатные микроорганизмы, которые постоянно выявляются на высоком популяционном уровне в полости толстой кишки как у интактных, так и у экспериментальных животных. Кроме этого, они колонизируют слизистую оболочку кишечника и при дисбактериозах практически не изменяются. К ним относятся бактероиды, превотеллы, кишечные палочки.
3-ья группа – аутохтонные факультативные микроорганизмы. Выявляются постоянно на довольно низком популяционном уровне в просвете толстой кишки и не принимают участия в обеспечении колонизационной резистентности. При дисбактериозах, обусловленных оксалатами, существенно возрастает их популяционный уровень в просвете толстой кишки и, при этом, они иногда колонизируют и слизистую оболочку кишечника. Таковыми являются клостридии, ентеробактерии (протеи, клебсиеллы), стафилококки.
4-ая группа – аутохтонные факультативные бактерии, которые достаточно часто выявляются в просвете толстой кишки и при дисбактериозах оксалатной этиологии их показатель выявления и коэффициент доминирования существенно возрастают. Эти микроорганизмы как у интактных, так и у экспериментальных животных не участвуют в обеспечении колонизационной резистентности. К ним относятся пептококк и пептострептококки.
5-ая группа – аллохтонные условно патогенные и патогенные микроорганизмы, которые у животных контрольной группы как в просвете, так и на слизистой оболочке кишечника не выявляются. У экспериментальных животных они контаминируют полость толстой кишки и могут колонизировать слизистую оболочку. Такими микроорганизмами являются энтерогемолитические кишечные палочки и дрожжеподобные грибы рода Candida.
Для коррекции изменений микрофлоры кишечника, возникших под влиянием оксалатов металлов, использован биологический препарат бифиформ ("Ferrosan", Дания). Он приводит к нормализации видового состава и популяционного уровня микроорганизмов 1, 3, 4 групп, селективной деконтаминации ентерогемолитических кишечных палочек. На фоне лечения бифиформом наблюдается контаминация и колонизация слизистой кишечника дрожжеподобными грибами рода Candida.
Ключевые слова: полостная микрофлора, мукозная микрофлора, толстая кишка, тонкая кишка, оксалаты натрия, магния, кобальта, бифиформ.
Summary
Diachyshyna L.V. Changes of Intestinal Microecology under the Action of Metal Oxalates and Correction of Disorders Caused by them.- Manuscript.
Thesis for the scientific degree of a Candidate of Medical Science in speciality 03.00.07 - Microbiology. I.I. Mechnykov Institute of Microbiology and Immunology of the Ukrainian AMS, Kharkiv, 2001.
The dissertation deals with questions of diagnosing disorders of intestinal microbiocenosis under the action xenobiotics (sodium, magnesium and cobalt oxalates) and renewal of microbiological disorders.
The species composition and the population level of the microflora contents of the large and small intestine mucosa under the action of varying doses (1/1000, 1/500, 1/100 DL50) of sodium, magnesium and cobalt oxalates have been studied. Changes of both the cavitary and mucous microflora of the biotopes under study have been established. For the purpose of restoring the intestinal microflora and correcting of changes brought about by the action of the oxalates a polycomponent biological medication bifiform ("Ferrosan", Denmark) has been used. It is conducive to the normalization of disturbed microbiocenosis at the expense of a decrease of intestinal microbial contamination by the facultative and allochthonous pathogenic and opportunistic pathogenic microorganisms, as well as an increase of the population level of the autochthonous obligate physiologically useful microorganisms.
In case of the development of dysbios the administration of the bifiform is not recommended, so long as it promotes the reproduction and colonization of the intestinal mucous membranes by the yeast fungi of the Candida type.
Key words: cavitary microflora, mucous microflora, large intestine, small intestine, oxalates of sodium, magnesium and cobalt, bifiform.