У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

ПРАКТИКУМ Часть 1 для студентов обучающихся по специальности Медицинская биохимия 060112 Всего

Работа добавлена на сайт samzan.net: 2016-03-13

Поможем написать учебную работу

Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Предоплата всего

от 25%

Подписываем

договор

Выберите тип работы:

Скидка 25% при заказе до 3.2.2025

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Ставропольский государственный университет»

БИОХИМИЯ

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Часть 1

для студентов, обучающихся по специальности «Медицинская биохимия» (060112)

Всего лабораторных часов – 296 ч.

Изучается в 6, 7, 8, 9, 10 семестрах

Разработана: докт. мед. наук, профессор Т.П. Бондарь кафедры Физико-химические основы медицины, лабораторной диагностики и фармакологии; канд. биол. наук, доцент С.Ф. Андрусенко кафедры Биологической и медицинской химии; С.С. Аванесян, преподаватель кафедры Биологической и медицинской химии.

Дата разработки 5.09.2009г.

Согласована:

Декан медико-биолого-химического факультета

_________________/А.Л. Иванов/

«_____»________2009г.

Зав кафедрами

________________/Е.И. Еременко/

________________/ Т.П. Бондарь

    Рассмотрено УМК МБХФ

    «____» __________2009г.

     Протокол №___

   Председатель УМК____________

СТАВРОПОЛЬ 2009


БИОХИМИЯ

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Лабораторный практикум предназначен для подготовки студентов специальности 060112 – «Медицинская биохимия» и может быть использован при подготовке врачей-интернов и клинических ординаторов специальности «Клиническая лабораторная диагностика» - 158 с.

Составители:

доктор мед. наук, профессор Т.П. Бондарь

канд. биол. наук, доцент С.Ф. Андрусенко

преподаватель С.С. Аванесян

Рецензент:

заведующий кафедры клинической лабораторной диагностики Ставропольского государственной медицинской академии профессор Первушин Ю.В.


ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

При создании лабораторного практикума использована современная концепция преподавания биохимии, основанная на представлении учебного материала в виде завершенных по содержанию разделов. На основе знаний биохимии свое развитие получили новые дисциплины: энзимология, иммунология, молекулярная биология, генная инженерия, биотехнология. Знание биологической химии поможет студенту при изучении других дисциплин (гистологии, физиологии, фармакологии, клинической диагностики и др.).

Изучение курса биологической химии ставит своей задачей дать студентам сведения о химической природе, превращении веществ, входящих в состав организма человека, животных и растений. Обязательным является выполнение всех работ студентами, начиная от приготовления некоторых реактивов, до анализа и оценки результатов исследований. Каждая работа является контрольной задачей и обсуждение полученных результатов легче связать с соответствующим теоретическим материалом, чему способствуют, всесторонне охватывающие изучаемую тему. Методы исследования, изложенные в пособии, могут стать основой для последующей научно-исследовательской работы, подготовки курсовых и дипломных проектов.

Каждая работа построена по единой схеме: тема занятия; цель занятия – достижение единства теоретических знаний, приобретаемых по определенному разделу биохимии, и практических навыков, получаемых студентами при выполнении качественных и количественных исследований; теоретические основы занятия – краткое изложение некоторых вопросов по данной теме, включая знания необходимые для выполнения лабораторной работы и интерпретации ее результатов; ход работы – формирование у студентов умения выполнять лабораторные исследования с использованием биохимических навыков; литература – к каждому занятию дается основная и дополнительная литература для наиболее удобной работы студентов по изучаемой теме.

В результате изучения цикла студент должен:

Знать:

  •  методические основы организации контроля качества проведения биохимических исследований.
  •  правила техники безопасности при работе с медицинским инструментарием и Оборудование и посудам,   охраны труда и окружающей среды;
  •  теоретические и методические основы медицинской биохимии, необходимые для самостоятельной работы в области исследования природы и механизмов развития патологических процессов, а также для совместной работы с врачами-клиницистами по постановке диагноза, для совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики и лечения, для внедрения нового оборудования и разработки современных медицинских технологий.

Уметь:

  •  владеть методами исследования и анализа живых систем;
  •  интерпретировать экспериментальные результаты с целью выяснения молекулярных механизмов биохимических процессов;
  •  опыт наблюдения, описания, идентификации, классификации биологических объектов;
  •  организовать рабочее место для проведения биохимических исследований;
  •  производить необходимые расчеты;
  •  работать на приборах, которыми оснащена лаборатория;
  •  соблюдать правила охраны труда и техники безопасности;
  •  формулировать задачу исследования, выбирать адекватные методы и аппаратуру для ее решения, адекватные методы интерпретации результатов исследования с привлечением компьютерной техники.

Владеть:

  •  основами методов клинической биохимии, иммуноферментными методами;
  •  методами математического анализа, методами статистической обработки результатов наблюдений, методами планирования эксперимента;
  •  основами лабораторной техники химического эксперимента, методами физико-химического анализа;
  •  биохимическими и коагулологическими исследованиями;
  •  методами контроля качества биохимических анализов;
  •  способами организации преаналитического, аналитического и постаналитического этапа биохимического исследования;

Иметь опыт (навык):

- работы с учебниками, специальной медицинской литературой для совершенствования знаний в области биохимии;

- собственноручного выполнения биохимических и гемостазиологических лабораторных тестов.

По общим вопросам диагностической работы:

  1.  поставить лабораторный диагноз и провести дифференциальный диагноз, используя клинические и дополнительные методы исследования;
  2.  провести анализ работы лаборатории, определить способы ее улучшения;
  3.  организовать рабочее место для проведения биохимических и других исследований;
  4.  провести лабораторное обследование больных с помощью экспресс-методов (при отравлениях, массовых поражениях, катастрофах, авариях);
  5.  работать с контрольным материалом;
  6.  оценить результат исследования и сформулировать заключение (поставить лабораторный диагноз);
  7.  определить необходимость дополнительного обследования больного.

По биохимическим исследованиям:

  1.  получить сыворотку, плазму крови, взвесь эритроцитов для исследования;
  2.  приготовить Реактивы и материалы;
  3.  обработать химическую посуду;
  4.  работать на приборах, которыми оснащена лаборатория (фотоэлектроколориметры, спектрофотометры, центрифуги, провести электрофорез белков и др.);
  5.  подобрать соответствующие Реактивы и материалы для методов клинической биохимии, адаптировать Реактивы и материалы для используемой аппаратуры;
  6.  производить необходимые расчеты;
  7.  интерпретировать лабораторные показатели нарушения гемостаза при заболеваниях печени, желудочно-кишечного тракта и других органов;
  8.  определять клинико-диагностическое значение лабораторных показателей.

Пособие является методическим руководством к лабораторным занятиям по биологической химии и предназначено для подготовки студентов по специальностям «Медицинская биохимия», а также может быть использована при подготовке врачей-интернов и клинических ординаторов специальности «Клиническая лабораторная диагностика».


ОФОРМЛЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ЖУРНАЛА

Студент обязан вести лабораторный журнал, который является документом, отражающим всю его работу. На обложке или первой странице журнала должны быть написаны фамилия студента, его инициалы, номер группы, учебный год и название практикума. Для ведения журнала берут общую тетрадь в клетку, в которой сразу же нумеруют все страницы. Первые 2 страницы оставляют для оглавления, которое составляют по ходу работы. Результаты всех измерений или других операций записывают в журнал, используя левые страницы; правые страницы оставляют для расчетов и записей. Запрещается делать записи на отдельных листках бумаги.

Оформление журнала производят только ручкой, лаконично, аккуратно, непосредственно после проведения опыта. Запись должна содержать:

1. Дату выполнения работы. В журнале обязательно указывают дату выполнения эксперимента.

2. Название темы и название опыта - записывается полное название, без сокращений. Работа должна иметь название – заголовок, а каждый ее этап – подзаголовок, поясняющий выполняемую операцию. Заголовки пишутся прописными буквами. Каждый подзаголовок также снабжается заголовком, первая буква которого прописная, остальные строчные. Пункты и подпункты заголовками не снабжаются. Разделы должны иметь порядковые номера в пределах всей работы, обозначенные цифрой с точкой в конце.

3. Цель занятия – достижение единства теоретических знаний, приобретаемых по определенному разделу биохимии, и практических навыков, получаемых при выполнении качественных и количественных исследований.

4. Теоретические основы занятия – краткое изложение некоторых вопросов по данной теме, включая знания необходимые для выполнения лабораторной работы и интерпретации ее результатов.

5. Ход работы - формирует умения выполнять лабораторные исследования с использованием биохимических навыков. Кратко описывают ход работы и приводят использованные литературные источники.

6. Рисунок или схему используемого прибора - иллюстрации размещаются сразу после ссылки на них в тексте. Желательно иллюстрации размещать так, чтобы их можно было просматривать без поворота работы. Если поворот неизбежен, то иллюстрации надо ориентировать так, чтобы для их рассмотрения надо было повернуть работу по часовой стрелке. Иллюстрации должны нумероваться последовательно в пределах раздела и включать номера раздела и порядковый номер рисунка в разделе. Например: рис. 1.2; рис. 2.5. и т.п. Ссылки на ранее упомянутые иллюстрации дают сокращенным словом "смотри", например, (см. рис. 2.1.). При небольшом количестве рисунков допускается сквозная нумерация. Подписи необходимо размещать горизонтально, без рамок.

7. Уравнения происходящих в опытах реакций. Химические и физико-химические символы в тексте, структурные формулы органических соединений и математические формулы должны быть ясно и четко вписаны от руки.

8. Изменение окраски веществ, выделение газов и характер осадка - желательно оформлять результаты в виде таблицы или графика. Таблицы должны следовать за ссылкой на них. Таблицы нумеруются последовательно в пределах всей работы арабскими цифрами. Перед номером таблицы ставится слово "Таблица". Ниже по середине название таблицы. График строят на миллиметровой бумаге с точным обозначением величин на осях координат, и приводят их единицы измерения; графики снабжают заголовком, проставляют дату эксперимента и вклеивают в журнал.

9. Расчеты, проводимые при выполнении работы. Все физические величины нужно приводить в международной системе СИ. Значение переменных в математических выражениях символов должно быть разъяснено при первом их использовании. Значение каждого символа дают с новой строки в той последовательности, в какой они приведены в формуле. Первая строка расшифровки начинается со слова "где" без двоеточия после него, например:

y = ab,

где:  y - выход продукта; a, b - постоянные коэффициенты.

10. Указания по технике безопасности – напоминают о правилах работы с веществами в вытяжном шкафу, правила работы с газовой горелкой, электрическими приборами и некоторыми веществами.

11. Выводы - необходимо делать к каждому опыту и всей работе в целом, в том числе и давать ответы на поставленные в занятии  .

12. Литература – к каждому занятию дается основная и дополнительная литература для наиболее удобной работы студентов по изучаемой теме.


ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА И ОБОРУДОВАНИЕ

ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В практикуме по основам биохимии применяют следующую лабораторную посуду:

  1.  Колбы – круглодонные, плоскодонные, мерные (от 25 мл до 5,0 л),
  2.  Химические стаканы – различных объемов (чаще от 50 мл до 2,0 л),
  3.  Пробирки – цилиндрические и конические,
  4.  Цилиндры – от 10 мл до 2,0 л,
  5.  Мензурки – от 50 мл до 1,0 л.
  6.  Пипетки – емкостью от 0,1 мл до 100 мл – градуированные и пипетки Мора, автоматические, дозаторы.
  7.  Бюретки (иногда микробюретки).
  8.  Промывалки.
  9.  Фарфоровые тигли.
  10.  Фарфоровые чашки.
  11.  Фарфоровые ступки.
  12.  Эксикаторы.
  13.  Воронки.
  14.  Посуда для взвешивания – часовые стекла, бюксы, тигли.
  15.  Стеклянные палочки, лопаточки, наконечники.

Зарисовать в тетради лабораторную посуду и записать назначение каждого из вышеперечисленных предметов.

Мытье лабораторной посуды

  1.  Посуду после выполнения лабораторного анализа необходимо промыть в проточной водопроводной воде.

Затем тщательно промыть с помощью ершей.

  1.  Замочить на 1–2 часа в хромовой смеси («хромпик»). Можно использовать синтетические моющие средства, не содержащие биодобавок.
  2.  Отполоскать от моющего средства с помощью проточной водопроводной воды: 10 раз при использовании хромовой смеси и 15 раз – при использовании синтетических моющих средств.
  3.   Прополоскать в проточной дистиллированной воде 3 раза,
  4.  Чистую посуду высушить в сушильном шкафу при температуре 150–180 °С.

Сухую посуду (колбы, стаканы) закрыть фильтровальной бумагой либо поставить в шкаф или на стол вверх дном. Пробирки сложить в чистые коробки или ящики столов, выложенные чистой фильтровальной бумагой. Сверху их также следует прикрыть фильтровальной бумагой от пыли и грязи.

Лабораторное Оборудование

  1.  Спектрофотометры СФ–4, СФ–16, СФ–26, СФ–46.
  2.  Фотоэлектроколориметры (различных марок).
  3.  Центрифуги – различных марок и назначения.
  4.  рН-метры.
  5.  Иономеры с ионоселективными электродами.
  6.  Весы: аналитические, торсионные, технические.
  7.  Термостат.
  8.  Хроматографические камеры.
  9.  Автоматические анализаторы.

Подготовка воды для клинико-биохимических исследований

Воду для биохимического анализа следует использовать свежеперегнанную (1–2 дневную), прокипяченную, охлажденную.

  1.  Собирать дистиллированную воду следует в стеклянные бутыли лучше с нижним сливом, которые надо обязательно тщательно мыть 1 раз в 10–15 дней, как указано для всей посуды.
  2.  Бутыли с дистиллированной водой следует держать с закрытыми крышками или пробками.
  3.  Брать воду из бутыли следует через кран нижнего слива. Если такой кран отсутствует, то из силиконового (резинового) шланга с зажимом можно изготовить сифон. Такую систему следует использовать, чтобы полоскать посуду в проточной дистиллированной воде.
  4.  Дистиллированную воду для анализа (для разведения реагентов, для контрольной пробы) следует налить в термостойкую колбу через шланг сифона, прокипятить 3–5 минут и после охлаждения закрыть притертой или ватно–марлевой пробкой. Открытой воду не хранить. Колбу регулярно, не реже 1 раза в неделю, мыть по вышеуказанной схеме.
  5.  Отливать воду из колбы в стакан для работы можно, но стакан использовать только в течение рабочего дня, затем отправлять его в мойку.
  6.  Даже если используется деионизированная вода, кроме того, что она должна быть свежеперегнанной (1–2 дневной), ее обязательно следует кипятить. Это необходимо делать, потому что носители, на которых идет очистка воды в деионизаторах (ионообменные смолы), являются хорошей средой для размножения микроорганизмов. Попадая в деионизированную воду, микрофлора очень быстро изменяет ее состав.

Общие правила работы с наборами для клинико-биохимических исследований

При работе с биохимическими наборами для того, чтобы избежать наиболее распространенных ошибок, необходимо придерживаться следующих общих правил:

1. Тщательно изучить инструкцию по применению набора и пунктуально ей следовать, выполняя все рекомендации по условиям хранения компонентов набора и раствора рабочего реагента (температура, тара, время, освещение), а также по условиям проведения анализа (температура, последовательность добавления реагентов, время реакции и т.д.).

  1.  Не использовать наборы, если герметичность их упаковки нарушена или внешний вид не соответствует паспортным данным.
  2.  Наборы с истекшим сроком годности необходимо проверить на правильность определения по контрольным сывороткам. Если определенное вами содержание компонента соответствует паспортным данным контрольной сыворотки, то набор можно использовать. Без проверки использовать просроченные наборы нельзя.
  3.  Посуду для приготовления раствора рабочего реагента и пробирки для проведения анализа промыть либо с помощью хромовой смеси (хромпика), либо с помощью моющих средств, не содержащих биодобавки, тщательно прополоскать водопроводной, а затем дистиллированной водой и просушить в сушильном шкафу. Каждый раз для приготовления раствора рабочего реагента брать чистую посуду, не использовать посуду, пробирки, пипетки и наконечники для автоматических дозаторов повторно.
  4.  Использовать только дистиллированную, свежеперегнанную, прокипяченную, охлажденную воду.
  5.  Растворы рабочих реагентов из общей склянки (колбы, флакона) отлить в другую склянку (колбу, флакон) в количестве, необходимом на один рабочий день, и пользоваться ими, а не отбирать пипеткой многократно из общей склянки.
  6.  Использовать автоматические дозаторы для отбора проб сыворотки, калибратора, а также раствора рабочего реагента. Дозаторы необходимо регулярно, не менее одного раза в год, поверять.
  7.  Для измерения оптической плотности использовать кюветы с толщиной поглощающего свет слоя жидкости 1 см, если не указано специально, что можно использовать кюветы меньшей толщины. Объем помещаемого в кювету исследуемого раствора должен быть достаточным, чтобы луч света проходил ниже уровня жидкости.
  8.  При проведении анализа для инкубации проб следует использовать водяной термостат. Если все-таки приходится использовать воздушный термостат, то необходимо увеличить время прогрева рабочего раствора перед началом реакции с 5 минут до 10–15 минут.
  9.  Все растворы рабочих реагентов и других реагентов, готовых к использованию, после отбора реагента следует плотно закрыть и держать закрытыми.
  10.  Предельно внимательно и аккуратно следует работать с калибратором. Нельзя определять самим концентрацию калибратора или разбавлять его, чтобы получить более низкую концентрацию. Для отбора калибратора следует использовать только новые наконечники.
  11.  При внесении пробы в реакционную смесь, особенно если ее объем составляет 5–10 мкл, необходимо следить, чтобы проба не осталась на стеклах пробирки или кончике пипетки. Смесь после внесения пробы следует тщательно перемешать, не допуская при этом вспенивания.
  12.  В процессе растворения реагентов, содержащих ферменты, нельзя допускать вспенивания, так как это может привести к их инактивации.

Калибровка мерной посуды

Номинальная емкость мерной посуды не всегда соответствует ее истинной емкости. Для повышения точности объемного анализа мерную посуду, используемую в лаборатории, необходимо калибровать. За единицу объема в метрической системе мер принимают «истинный литр», т.е. объем, занимаемый массой воды в 1 кг при температуре ее наибольшей плотности (т.е. при 3,98°С), взвешенной в безвоздушном пространстве.

В качестве стандартной температуры при калибровании мерной посуды в настоящее время принята температура +20 °С. «Нормальный литр» равен объему такого количества вещества, которое занимает при +20°С объем истинного литра.

Мерную посуду калибруют или проверяют, определяя вес чистой воды, содержащейся в ней, или вес воды, вылитой из нее, при определенной температуре; по весу воды рассчитывают емкость посуды.

Калибровка мерных колб. Емкость мерной колбы проверяют путем взвешивания на технических весах воды, вмещаемой колбой. Для предотвращения ошибки, связанной с неравноплечностью технических весов, рекомендуется следующий порядок взвешивания.

Чистую сухую мерную колбу помещают на левую чашку весов. На эту же чашку ставят разновес, соответствующий весу воды в объеме калибруемой колбы. Затем уравновешивают весы и заполняют колбу дистиллированной водой, имеющей температуру окружающего воздуха. Следят за тем, чтобы при заполнении колбы капли воды не остались на стенке горла колбы выше метки (капли воды снимают фильтровальной бумагой). Колбу с водой взвешивают, уравновешивая весы снятием разновеса с левой чашки. Вес воды в колбе равен весу разновесов, снятых с левой чашки весов. (Если вес воды в колбе больше веса снятого разновеса, то для уравновешивания разновесы добавляют на правую чашку весов). Определение повторяют еще два-три раза.

Калибровка пипеток. Чтобы проверить емкость пипетки, надо взвесить на аналитических весах бюкс с крышкой.

Набрать в пипетку дистиллированную воду до черты (по нижнему мениску), перенести ее во взвешенный бюкс. После опорожнения пипетки выжидают еще 15 с и только после этого отнимают кончик пипетки от стенки сосуда. В кончике пипетки всегда1 остается небольшое количество жидкости. На это не обращают внимания, т.к. пипетка градуируется на вытекание, и та капля, которая остается в пипетке, не входит в ее объем. Поэтому эту каплю из пипетки не следует ни выдувать, ни выжимать.

Бюкс, в который перенесли воду, закрыть крышкой и снова взвесить. Вес воды в объеме пипетки находят по разности двух взвешиваний. Процедуру определения емкости пипетки проводят трижды, используя для этого три отдельные сухие емкости, и берут среднее арифметическое из 3-х взвешиваний.

При калибровке микропипеток взвешиваемый объем должен превышать погрешность взвешивания в 100 раз, так при калибровке микропипеток вместимостью 10 мкл необходимо поместить во взвешенный бюкс не менее 5 ее объемов.

Калибровка бюреток. Процедура проверки емкости бюретки такая же, как для пипеток, только проделывать ее надо для каждого объема последовательно, т.е. если бюретка вместимостью 50 мл, то взвешивают три раза 5 мл воды (спуская воду от нулевого деления до 5) и находят поправку, затем 10 мл и т.д. до 50 мл. При использовании автоматических микропипеток лучше пользоваться одним дозатором для отбора проб и калибратора, меняя только наконечники.

Применение международной системы единиц (СИ) в биохимической лабораторной практике

Масса –величина, характеризующая инерционные и гравитационные свойства тела. Массу тела в состоянии покоя определяют взвешиванием на весах. Результат взвешивания тела на весах следует называть массой, а не весом и выражать в единицах массы – килограммах (кг), граммах (г), дольных от грамма – миллиграммах (мг), микрограммах (мкг), нанограммах (нг).

Количество вещества – величина, определяемая числом структурных элементов (атомов, молекул, ионов, электронов и других частиц) в рассматриваемом веществе. За единицу количества вещества принят моль (моль – это количество вещества, содержащее столько структурных единиц, сколько содержится атомов в 0,012 кг изотопа углерода 12С. Число частиц в моле любого вещества одно и то же. Оно равно 6,021023 и называется «постоянной Авогадро»). Кратные и дольные единицы от моль – киломоль (кмоль), миллимоль (ммоль), микромоль (мкмоль) и др.

Молярная масса – это масса вещества, взятого в количестве 1 моль. Ее выражают в кг/моль или г/моль. В общем случае молярная масса вещества, выраженная в граммах, численно равна его относительной молекулярной (атомной) массе, выраженной в атомных единицах массы.

Массовая концентрация компонента – отношение массы компонента к объему смеси. Единицы в СИ – кг/м3, в биохимических исследованиях – г/л.

Молярная концентрация компонента (молярность компонента) – отношение количества вещества к объему смеси. Единицы в СИ – модь/м3, в биохимических исследованиях – моль/л (для выражения концентрации веществ с известной относительной молярной массой).

Нормальная концентрация, или нормальность, выражается числом эквивалентов вещества, содержащегося в 1 л раствора. Раствор, в 1 л которого содержится один эквивалент растворимого вещества, называется нормальным (0,1 экв. вещества – децинормальным, 0,01 экв. – сантинормальным, 0,001 экв. – миллинормальным).

Понятие «активность фермента» применяют для количественной характеристики биологических катализаторов – ферментов. В качестве единицы СИ принимается моль/с (моль в секунду) – активность фермента, катализирующего превращение 1 моля субстрата (имеется в виду убыль субстрата или образование продукта реакции) в 1 секунду при определенных условиях.

Скорость ферментативной реакции определяется по убыли субстрата или образованию продукта реакции за определенное время в определенном объеме исследуемого материала. В качестве единицы СИ принимается моль в секунду на кубический метр – моль/(см3). Однако для выражения результатов биохимических исследований пользуются единицами моль в секунду на литр – моль/(сл) или чаще миллимоль в час на литр – ммоль/(чл).

Показатели экскреции исследуемого компонента с суточным объемом мочи принято обозначать количеством выводимого вещества, отнесенного к единице измерения «сутки» (например, ммоль/сут, мкмоль/сут, нмоль/сут).

Для правильного использования кратных и дольных значений единиц в табл. представлены соответствующие множители и приставки.

Множители и приставки, применяемые для обозначения кратных и дольных единиц

Множитель

Приставка

Обозначение приставки (русское)

10-18

атто

а

10-15

фемто

ф

10-12

пико

п

10-9

нано

н

10-6

микро

мк

10-3

милли

м

10-2

санти

с

10-1

деци

д

101

дека

да

102

гекто

г

103

кило

к

106

мега

М

109

гига

Г

1012

тера

Т

1015

пета

П

1018

экса

Э

Методы расчета экспериментальных данных

Любой экспериментатор при проведении измерений получает серию данных, несколько отличающихся друг от друга, что может быть вызвано многими причинами. В основном различают систематические, случайные ошибки и промахи.

Систематические ошибки могут возникнуть в результате неисправной работы приборов, загрязнения реактивов. Такие ошибки повторяются при проведении всей серии измерений. Случайные, не зависимые друг от друга ошибки вызываются непредсказуемыми и поэтому неконтролируемыми явлениями. Промахи возникают вследствие недостаточного внимания исследователя: несоблюдения условий проведения эксперимента, неправильной подготовки образцов или записи наблюдений, ошибок при выполнении вычислений.

Статистическую обработку полученных опытным путем данных проводят по следующей схеме. Данные, полученные из п измерений, составляют ряд различающихся между собой величин х1, х2, х3...xn. Из этой серии находят пределы отклонения, где xi – данные, полученные при проведении измерений; – среднее арифметическое, найденное по формуле: .

Сумма всех положительных и отрицательных отклонений от среднего должна равняться нулю:.Это равенство выполняется тем точнее, чем точнее вычислено значение .

Единичные измерения в серии (выборке) характеризуются среднеквадратичной ошибкой или стандартным отклонением :

Число выборок может быть как угодно велико. Каждая из них является случайной со своей средней и среднеквадратичной ошибкой :

Вычисление погрешности результата измерений проводят при определении степени надежности α – долей случаев, в которых при данном числе измерений среднее арифметическое лежит в определенных пределах.

В большинстве случаев принимают α = 0,95 или 0,99. Это значит, что 95% или 99% всех измерений лежат в указанных пределах:

Коэффициент tα,k называется коэффициентом нормированных отклонений, или критерием Стьюдента (К). Эту величину находят по специальным таблицам в зависимости от α и К = n - 1. Величина К называется числом степеней свободы. Коэффициенты нормальных отклонений для значений а, равные 0,95 и 0,99, приведены в таблице.

Коэффициенты нормальных отклонений (tα,k)

α

К

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0,95

4,30

3,18

2,78

2,57

2,45

2,37

2,31

2,26

2,23

0,99

9,93

5,84

4,60

4,03

3,71

3,50

3,36

3,25

3,17

В завершение расчета определяют относительную ошибку:

Следовательно, порядок вычисления погрешностей должен быть записан в такой последовательности:

1) среднее арифметическое: ;

2) стандартное отклонение: ;

3) среднеквадратичная ошибка среднего: ;

4) погрешность результатов измерений: ,

где tα,k – коэффициент Стьюдента, найденный по таблице;

5) окончательный результат измерений: ;

6) относительная ошибка:

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ

В биохимических исследованиях используются растительные и животные ткани, а также продукты жизнедеятельности животных. В растениях анализу подвергаются семена, корни, корневища, корнеплоды, стебли, листья, цветки. У животных исследуют биохимические показатели в биологических жидкостях (моча, кровь, спинномозговая жидкость, молоко), а также в тканях органов (печень, селезенка, желудок, сердце, мозг и т. д.) и мышечную, костную, нервную, жировую ткани, эндокринные железы.

Перед началом анализа исследуемый образец взвешивают на аналитических весах, а затем ткань измельчают. Все операции производят при низкой температуре, с охлаждением инструментов, используемых во время опытов, а Реактивы и материалы должны быть помещены в ледяную баню. Если разрушение растительных тканей проводили на механической мельнице, то перед экстракцией помол необходимо взвесить, так как часть образца ткани во время измельчения может быть потеряна.

Для измельчения животных и растительных тканей с низкой влажностью (5–15%) используются механические мельницы. Разрушение тканей с высокой влажностью (65-–90%) проводят на гомогенизаторах. Ткани со средней влажностью (15–65%) обычно предварительно высушивают в сушильных шкафах с вакуумом при низкой температуре (60–70°С), что обеспечивает максимальную сохранность в них функционально активных веществ.

Перед началом экстракции ФАВ из разрушенных тканей животных и растений необходимо правильно подобрать растворитель. Экстракцию полярных, заряженных соединений проводят используя полярные растворители (вода, 50%-ный раствор этанола). Экстракцию гидрофобных компонентов гомогената тканей проводят с использованием неполярных растворителей (гексан, хлороформ, диэтиловый эфир и др.) или водных растворов с детергентами (тритоны: Х-45, Х-100, Х-114, Х-102, Х-165, Х-305; бридж: 35, 56, 58; луброл РХ и WX; твин: 20, 40, 60, 80 и др.).

Реагент

Время экстракции, час

1

2

Этанол 50%-ный

340 (100)

400 (100)

Хлороформ

146 (43)

118 (29)

Диэтиловый эфир

26(8)

60 (15)

Ацетон

77 (23)

70 (17)

Использование 50%-ного этанола обеспечивает максимальную экстракцию полярных БАВ из растительных тканей.

Влияние среды экстрагирования на содержание антиоксидантов (мкг/г сухих растений) в экстракте. Отделение неразрушенных клеток и ядер проводят центрифугированием. Режим центрифугирования подбирается индивидуально. Обычно для получения плазмы кровь центрифугируют со скоростью 3103 об/мин на центрифугах без охлаждения. Гомогенат ткани для энзимологических исследований центрифугируют со скоростью 7000–12000g при 0°С, в рефрижераторных центрифугах. Полученный после центрифугирования супернатант хранят в холодильнике при +4°С. Расчет объема супернатанта производят путем сложения величин объемов предварительно определенной в исследуемой растительной или животной тканях гидровлаги и раствора, взятого для экстракции ФАВ.

Качественный и количественный состав веществ, содержащихся в супернатанте, определяют по стандартным методикам. Следует придерживаться следующего правила при выборе методики: используемый метод должен быть специфичным, т.е. исключать возможность побочных реакций, затрудняющих интерпретацию полученных результатов, и легко воспроизводимым.

Экстр акция БАВ из растительных тканей

Органы растений – листья, стебли, корни – предварительно разрезанные на мелкие части, измельчают на механической мельнице в порошок с размером частиц в 1–2 мм (см. рис.1). Вытяжку готовят путем настаивания порошка в 50%–ном этаноле в соотношении 1:20 (1 г растительного порошка настаивают на 20 мл 50%-ного этанола). Экстракцию проводят в течение 24 ч при температуре воздуха +4 °С. Удаление неразрушенных частиц, клеток, ядер и прочего проводят путем фильтрования тканевого гомогената или центрифугированием при 7000 g в течение 10–15 мин при температуре 2–4 °С. Затем прозрачный раствор (фильтрат или супернатант) подвергают химическим исследованиям.

Приготовление гомогената из растительных тканей

Целое растение или его часть после взвешивания подвергают гомогенизированию путем механического растирания в ступке при постоянном охлаждении. Полученную однородную массу центрифугируют. Надосадочную жидкость подвергают исследованию.

Зерновки с влажностью 8–10% и другие сухие части растений измельчают на мельнице (2 г зерновок измельчают в течение 1 мин). Полученный сухой порошок взвешивают и растворяют в бидистиллированной воде или другой среде выделения, охлажденной до 0°С, в соотношении 1:3 (на 1 г зерновок добавляют 3 мл охлажденной среды выделения). После перемешивания исследуемый образец центрифугируют при 7000 g. Надосадочную жидкость (супернатант) используют для биохимических исследований.

Получение плазмы и сыворотки крови

Забор крови производится из вены с помощью иглы или иглы со шприцем в центрифужную пробирку (предварительно пробирка промывается дистиллированной водой). Пробирка и игла должны быть сухими, во влажных может происходить гемолиз эритроцитов, что может повлиять на результаты анализа. Кровь центрифугируют 15–20 мин со скоростью 3000 об/мин. В результате центрифугирования формируются два слоя: верхний, светло-желтый, – плазма, нижний, красный, состоит из форменных элементов крови. До начала биохимических исследований плазма крови хранится в холодильнике при температуре воздуха +4 °С.

Сыворотку крови получают после отстаивания крови в холодильнике при +4 °С в течение суток. После этого верхний слой жидкости осторожно сливают в чистую пробирку, не повреждая образовавшегося сгустка форменных элементов крови. Сыворотка крови отличается от плазмы тем, что в ней отсутствуют элементы свертывания крови.

Приготовление гомогената из тканей животных

Свежую ткань печени или мышц предварительно многократно промывают 0,9 % раствором NaCl (физиологический раствор), охлажденным до 0°С, а затем обсушивают фильтровальной бумагой и измельчают ножницами. На весах взвешивают измельченную ткань и помещают в стакан для гомогенизирования. В случае, если используется стеклянный гомогенизатор, зазор между стенкой и пестиком должен быть 0,2–0,3 мм; скорость вращения пестика не должна превышать 800 об/мин. Время измельчения тканей: печень – 30–40 сек, мышцы – до 60 сек. Если используют механический гомогенизатор, скорость вращения ножей можно доводить до 900 об/мин. Все работы необходимо проводить на холоде, помещая стакан гомогенизатора в чашку со льдом.

Разбавление при гомогенизировании должно проводиться с учетом содержания определяемого биологически активного вещества. Так, в случае определения активности алкогольдегидрогеназы в печени используют разбавление 1:3 или 1:5 (на 1 г сырой ткани добавляют 3 или 5 мл охлажденной среды выделения).

Полученный тканевой гомогенат центрифугируют при 7000 g в течение 10–15 мин (t 0 °C). Надосадочную жидкость (супернатант) подвергают биохимическим исследованиям.

Методики подготовки ФАВ исследуемых образцов

Экстракцию ФАВ из тканей лучше всего проводить при постоянном перемешивании смеси и температуре 0°С. Низкая температура среды позволяет исключить протекание химических процессов в гомогенатах ткани. По окончании экстракции удаляют не полностью разрушенные клетки и ядра путем центрифугирования или фильтрования. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сливают, а осадок отбрасывают. Исследованию подвергаются вещества, содержащиеся в надосадочной жидкости. Для воспроизведения результатов исследования необходимо придерживаться точного описания методики эксперимента.


РАЗДЕЛ 1

РАБОТА № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Для обнаружения белков существует две группы реакций: цветные реакции и реакции осаждения.

Цветные реакции на белки являются реакциями на структурные элементы белка — аминокислоты или образуемые ими химические группировки. При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции, обусловленные присутствием в белках определенных аминокислот и группировок.

1.1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)

Реакция обусловлена наличием в белках пептидных связей, соединяющих остатки аминокислот в молекуле белка путем отнятия элементов частицы воды из — СООН-группы одной аминокислоты и —NH2- группы другой:

В сильно щелочной среде в присутствии сернокислой меди образуются комплексные соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.

Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза — пептоны и полипептиды. Для ди- и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок окрашивания зависит от длины пептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или красное окрашивание. Биуретовая реакция положительна и с веществами небелкового характера, имеющими в своем составе не менее двух —СО—NH2-групп, к ним относятся, например, оксамид — H2N—CO—CO—NH2, биурет —H2N—CO—NH—CO—NH2, по которому и названа реакция.

Реактивы и материалы: раствор яичного белка, гидроксид натрияий, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы или пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку наливают 5 капель раствора белка, 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и по каплям, начиная с 1 капли, раствор сернокислой меди до появления при взбалтывании розово-фиолетового или сине-фиолетового окрашивания. Надо избегать избытка CuSO4, так как при дальнейшем его прибавлении все более усиливается нехарактерный синий оттенок и, наконец, выпадает осадокгидрата окиси меди.
  2.  При малых концентрациях белка в растворе в пробирку наливают 20 капель 10% раствора гидроксида натрия, добавляют 1—2 капли 1 % раствора сернокислой меди и перемешивают. Затем набирают в пипетку разбавленный раствор белка и осторожно спускают его по стенке пробирки так, чтобы он наслаивался сверху и не смешивался со щелочным раствором сернокислой меди. На границе двух слоев жидкости образуется фиолетовое кольцо.

1.2. Реакция Миллона

Реактив Миллона состоит из азотнокислых солей окиси и закиси ртути в HNO3 с примесью HNO2. Он дает окрашивание с фенолами, полифенолами. В случае белков реакция обусловлена присутствием в них тирозинового остатка со свободной фенольной группой. При нагревании раствора белка с реактивом Миллона образуется нитросоединение тирозина, которое, присоединяя ртуть, превращается в ртутную соль нитротирозина, имеющую пурпурно-красный цвет:

Белки, не содержащие тирозин (желатина, клупеин, сальмин и др.), не дают реакции Миллона.

Реактивы и материалы: раствор яичного белка, реактив Милона, фенол, 0,1% раствор, желатина, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. В пробирку наливают 5 капель раствора белка и 3 капли реактива Миллона. Образуется белый осадок (действие соли тяжелого металла, а также концентрированной азотной кислоты). При слабом нагревании (нагревать не выше 50 °С) осадок окрашивается сначала в розовый, а затем в пурпурно-красный цвет от образования ртутной соли нитропроизводного тирозина.

  1.  Для сравнения производят аналогичным образом Миллонову реакцию с желатиной. Жидкость остается бесцветной (или слегка желтеет), так как в молекуле желатины остатки тирозина отсутствуют.
  2.  Проделывают реакцию с фенолом. В пробирку наливают 10 капель раствора фенола, 5 капель реактива Миллона и осторожно нагревают. Появляется розовое окрашивание.

Реакции вредят хлориды, перекись водорода, алкоголь, большое количество минеральных солей, так как дают осадки с ртутью и превращают реактив в недеятельный. Щелочные растворы перед производством реакции должны быть нейтрализованы азотной или уксусной кислотой во избежание выпадения осадка окиси ртути.

1.3. Ксантопротеиновая реакция (Мульдера)

Реакция обусловлена наличием в белке циклических аминокислот — тирозина и триптофана, содержащих в своем составе бензольное ядро. При нагревании большинства белков с концентрированной азотной кислотой бензольное ядро тирозина и триптофана нитруется с образованием нитропроизводных желтого цвета. Последние при добавлении щелочи превращаются в соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.

Ксантопротеиновую реакцию (желтое окрашивание) можно наблюдать на коже, ногтях, шерсти и т. п. при попадании на них концентрированной азотной кислоты. Белки, не содержащие тирозина и триптофана, не дают ксантопротеиновой реакции (желатина, сальмин и др.). В отличие от тирозина и триптофана, фенилаланин подвергается нитрованию с большим трудом и, по-видимому, не обусловливает ксантопротеиновой реакции. Поскольку ксантопротеиновая реакция обусловлена нитрованием ароматического кольца, она может быть положительной с более простыми ароматическими соединениями, например с фенолом.

Реакцию нитрования и образования солей хиноидной структуры можно представить следующим образом:

Реактивы и материалы: раствор яичного белка или разбавленная сыворотка, азотная кислота, концентрированная, гидроксид натрия, 10% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы или пипетки.

Порядок выполнения работы

1. В пробирку наливают 5 капель раствора белка и 3 капли концентрированной азотной кислоты. Образуется осадок белка под действием кислоты. При нагревании осадок окрашивается в желтый цвет (нитрование) и постепенно растворяется (происходит гидролиз белка), сообщая желтую окраску раствору.

2. Содержимое пробирки охлаждают под краном. К охлажденной смеси прибавляют по каплям 10% раствор гидроксида натрия. Когда реакция жидкости сделается щелочной, появляется оранжевое окрашивание вследствие образования натриевой соли динитротирозина.

1.4. Реакция Адамкевича

Реакция обусловлена присутствием в белке остатков аминокислоты триптофана. Она основана на способности триптофана в кислой среде вступать в реакцию с глиоксилевой кислотой, образуя при этом окрашенные продукты конденсации. В качестве источника глиоксилевой кислоты обычно используют ледяную уксусную кислоту, содержащую примесь глиоксилевой.

Две молекулы триптофана, реагируя с глиоксилевой кислотой, образуют соединение красно-фиолетового цвета:

Реактивы и материалы: белок куриного яйца неразбавленный, уксусная кислота ледяная (в ней в виде примеси всегда содержится глиоксилевая кислота), серная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  К 1 капле неразбавленного белка или 5—10 каплям сыворотки добавляют 10 капель ледяной уксусной кислоты (или глиоксилевой кислоты) и слегка нагревают до растворения белка.
  2.  Содержимое пробирки охлаждают и, сильно наклонив пробирку, очень осторожно, по стенке подслаивают из пипетки около 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы обе жидкости не смешались. При стоянии на границе соприкосновения двух слоев жидкости возникает красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Окраска постепенно распространяется на весь раствор. При нагревании в кипящей водяной бане окрашивание развивается быстрее.

1.5. Реакция Шульце-Распайля

Данная реакция обусловлена наличием в белке остатка триптофана. Триптофан, взаимодействуя с оксиметилфурфуролом, даёт продукты конденсации, окрашенные в вишнево-красный цвет. Оксиметилфурфурол в этой реакции образуется из гексоз (быстрее из фруктозы), получающихся при гидролизе сахарозы под влиянием концентрированной серной кислоты.

Образование оксиметилфурфурола из фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты происходит в результате следующей реакции:

Реактивы и материалы: неразбавленные яичный белок или сыворотка крови, сахароза, 10% раствор, серная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

1. К 1 капле неразбавленного яичного белка или к 5—10 каплям сыворотки добавляют 1—2 капли 10% раствора сахарозы и пипеткой осторожно по стенке пробирки подслаивают около 1 мл концентрированной серной кислоты.

2. Легким встряхиванием пробирки смешивают обе жидкости. Вследствие выделения тепла при растворении H2SO4 в воде происходит саморазогревание жидкости на месте соприкосновения обоих слоев и появляется вишнево-красное окрашивание. Необходимо следить, чтобы жидкость не перегрелась выше 70С, так как иначе под влиянием H2SO4 происходит обугливание органического вещества и раствор буреет.

1.6. Реакция Фоля

Реакция обусловлена присутствием в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Эти аминокислоты под влиянием щелочи при нагревании разрушаются с образованием сероводорода. Последний в щелочной среде дает сернистый натрий, который, реагируя с плюмбитом натрия, образует черный осадок сернистого свинца. Для выявления сульфида натрия используют ацетат свинца, который при взаимодействии с гидроксидом натрия превращается в его плюмбит. В результате взаимодействия ионов серы и свинца образуется сульфид свинца черного или бурого цвета:

Другая серусодержащая аминокислота метионин более устойчива и при слабом щелочном гидролизе не разрушается.

Реактивы и материалы: неразбавленный яичный белок или сыворотка крови, гидроксид натрия, 10% раствор, уксуснокислый свинец, 5% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  Наливают в пробирку 10 капель 5% раствора уксуснокислого свинца и по каплям прибавляют 10% раствор гидроксида натрия до растворения образующегося вначале осадка гидрата окиси свинца.
  2.  Приливают несколько капель белка и смесь кипятят. Через некоторое время жидкость буреет и выпадает черный осадок сернистого свинца.

1.7. Нингидриновая реакция (реакция Руэманна)

Реакция обусловлена наличием в белке остатков -аминокислот. При нагревании растворов белка, пептидов и а-аминокислот с нингидрином образуются окрашенные соединения.

Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование -аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина:

Восстановленная форма нингидрина реагирует с избытком нингидрина и с аммиаком. При этом образуется продукт конденсации сине-фиолетового цвета:

В случае аминокислот (пролина и оксипролина) образуется продукт ярко-желтого цвета.

Нингидриновую реакцию дают некоторые амины, амиды кислот, а также аммонийные соли и др. соединения.

Реактивы и материалы: раствор белка или разбавленная сыворотка крови, нингидрин, 0,2% раствор в спирте.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку наливают 10 капель раствора белка, добавляют 3—6 капель 0,2% раствора нингидрина и кипятят.
  2.  Через 1—3 минуты наблюдают появление розового, красного, а затем сине-фиолетового окрашивания. Через некоторое время раствор становится синим.

Каждая из рассмотренных выше цветных реакций в отдельности не является специфичной для белка. Доказательством присутствия белка может служить лишь положительный результат нескольких реакций.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты работы оформить в виде таблицы. В выводах указать, на чем основаны цветные реакции на белки. Написать формулы определяемых аминокислот.

№

Название

Реактивы и условия

Окраска

Определяемые аминокислоты

1.8. Реакция с формальдегидом

При взаимодействии a-аминокислот с формальдегидом образуются относительно устойчивые карбиноламины – N-метилольные производные, содержащие свободную карбоксильную группу, которую затем титруют щелочью:

Эта реакция лежит в основе количественного определения a-аминокислот методом формального титрования (метод Сёренсена).

Реактивы и материалы: 1%-ный раствор глицина, индикатор метиловый красный, 40%-ный раствор формальдегида.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

В пробирку наливают 5 капель 1%-го раствора глицина и прибавляют 1 каплю индикатора метилового красного. Раствор окрашивается в желтый цвет (нейтральная среда). К полученной смеси добавляют равный объем 40%-го раствора формальдегида (формалин). Появляется красное окрашивание (кислая среда):

 

РАБОТА №2. РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Физико-химические свойства белков в значительной степени определяются их высоким молекулярным весом (белки - гидрофильные коллоиды), амфотерностью (белки - амфотерные электролиты) и лабильностью вторичной и третичной структур белка.

Белки под влиянием нагревания или воздействия органических растворителей, концентрированных минеральных кислот, органических кислот, солей тяжелых металлов, алкалоидных реактивов и других факторов претерпевают глубокие изменения, называемые денатурацией. Под денатурацией понимают негидролитическое разрушение белковой молекулы с деградацией ее вторичной и третичной структур.

Существуют различные способы изменения окружающей среды, влияющие на баланс слабых сил в водных растворах белков. Некоторые из них используются для осаждения белков.

  1.   Повышение температуры оказывает дезорганизующее влияние на растворитель и на макромолекулу путем увеличения энергии ее пептидных цепей. В результате возникают развернутые формы ранее глобулярных белков.
  2.   Изменение концентрации водородных ионов приводит к связыванию протонов ионизирующимися группами и модификации заряда белка. В результате видоизменяются не только ионные связи, стабилизирующие нативную структуру протеинов, но и межмолекулярные взаимодействия.
  3.   Добавление значительных количеств неводных растворителей (спирты, органические кислоты) и просто углеводородов может влиять на конформацию белков либо при непосредственном связывании, либо косвенно, уменьшая диэлектрическую константу среды и, следовательно, увеличивая внутри- и межмолекулярное электростатическое взаимодействие. Кроме того, при прибавлении менее полярных, чем вода, и просто гидрофобных веществ происходит разрушение гидрофобного ядра, т. к. термодинамически более выгодным становится развернутое (денатурированное) состояние ввиду изменения структуры растворителя.
  4.   Добавление нейтральных солей изменяет электростатическое взаимодействие путем экранирования зарядов в белках. При постепенном увеличении концентрации электролита сначала растворимость белка возрастает, а затем уменьшается. Важное значение в последнем процессе, кроме экранирования зарядов, имеет отнятие гидратной оболочки с поверхности протеинов.

5. Ионы тяжелых металлов, таких как серебро, медь, ртуть и свинец, соединяются с тиоловыми и карбоксильными группами и в высоких концентрациях служат осадителями белков.

В некоторых случаях при удалении денатурирующего агента может наблюдаться более или менее полное восстановление свойств белка. Осаждение белков высаливанием с помощью сернокислого аммония (в различных концентрациях) или других средних солей щелочных и щелочно-земельных металлов с последующим их удалением путем диализа практикуется для получения очищенных ферментных и гормональных препаратов из органов и тканей, а также лечебных сывороток и вакцин. С той же целью применяют осаждение белков непродолжительным действием спирта или ацетона при низкой температуре.

2.1. Реакции осаждения белков при нагревании

Реактивы и материалы: раствор белка или разбавленная сыворотка крови, уксусная кислота, 1% раствор, уксусная кислота, 10% раствор, хлористый натрии, насыщенный раствор, гидроксид натрия, 10% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  В 5 пробирок наливают по 10 капель раствора белка.

2.В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают. Опалесценция усиливается еще до того, как жидкость закипит. При кипячении может выпасть осадок. Растворы белков кипят неровно, толчками, так как белок по стенкам свертывается и в этих местах происходит перегревание, поэтому нагревание надо проводить осторожно, все время встряхивая пробирку. Усиление опалесценции объясняется укрупнением взвешенных частиц белка. Они удерживаются во взвешенном состоянии, так как эти частицы несут заряд.

  1.  К нейтральному раствору белка во второй пробирке прибавляют 1-2 капли 1% раствора уксусной кислоты (до слабокислой реакции на лакмус), осадка при этом не образуется. При нагревании вначале появляется опалесценция, а при дальнейшем нагревании и последующем кипячении выпадает белый хлопьевидный осадок белка. Осадок появляется вследствие того, что в слабокислой среде исследуемые белки находятся в изоэлекгрическом состоянии и, денатурируясь при нагревании, легко теряют свою растворимость в результате агрегации.
  2.  Нейтральный раствор белка в третьей пробирке подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до сильно кислой реакции среды (добавляют 1—3 капли) и нагревают до кипения. Осадок не выпадает, поскольку при избытке водородных ионов (по сравнению с той концентрацией их, которая нужна для достижения изоэлектрического состояния) белки, имевшие в исходном растворе отрицательный заряд, перезаряжаются и приобретают положительный заряд, что придает им устойчивость.
  3.  Раствор белка в четвертой пробирке подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до сильно кислой реакции среды, добавляют 2-3 капли насыщенного раствора поваренной соли и кипятят. Появляется белый хлопьевидный осадок белка, вследствие экранирования положительного заряда перезаряженных частиц белка противоположно заряженными ионами хлористого натрия путем адсорбции их. Кроме того, большое значение в этой реакции имеет водоотнимающее действие ионов поваренной соли.
  4.  К раствору белка в пятой пробирке добавляют 2—4 капли 10% раствора гидроксида натрия (до щелочной реакции) и кипятят. Осадка не образуется, так как в щелочной среде подавляется основная диссоциация белка, усиливается кислотная и отрицательный заряд на коллоидных частицах белка возрастает еще более.

Рекомендации к составлению протокола

Полученные данные внести в таблицу. В выводах обосновать причину образования или отсутствия осадка в различных условиях реакции среды.

Реакция среды

Цвет и вид осадка

Нейтральная

Слабокислая

Сильнокислая (10% СН3СООН)

Сильнокислая (10% СН3СООН)

+ повышение ионной силы (NaCl)

Щелочная (10% NaOH)

2.2. Осаждение белков солями тяжёлых металлов

Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (медь, железо, свинец, цинк, серебро, ртуть и др.) денатурируются и образуют нерастворимые в воде комплексные соединения, которые выпадают в осадок. Возникновение нерастворимых в воде комплексов обусловлено адсорбцией тяжелого металла на поверхности белковой молекулы. В избытке солей первоначально образовавшиеся осадки растворяются (за исключением солей AgNO3 и HgCl2), что связано с адсорбцией тяжелого металла на поверхности коллоидных частиц и появлением положительного заряда на молекуле белка (адсорбционная пептизация). На способности белков образовывать нерастворимые осадки с солями тяжелых металлов основывается использование белков в качестве противоядия при отравлении тяжелыми металлами (ртутные, свинцовые отравления), пока соли этих металлов еще не успели всосаться. При использовании белков (яичный белок, молоко) в качестве противоядий при отравлении следует давать их в больших количествах, учитывая то, что при избытке некоторых солей образуются с белками комплексные растворимые соединения. В случае отравления ртутными солями необходимо помнить, что осадок белка, образующийся при воздействии Hg2+, может раствориться в присутствии поваренной соли.

Со свежеприготовленным гидроксидом меди (II) все -аминокислоты в мягких условиях дают хорошо кристаллизующиеся внутрикомплексные (хелатные) соли меди (II) синего цвета:

глицинат меди (II)

В таких солях ион меди координационными связями соединен с аминогруппами.

Реактивы и материалы: раствор яичного белка или разбавленная сыворотка крови, сернокислая медь, 5% раствор, уксуснокислый свинец, 5% раствор, азотнокислое серебро, 3% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки, стеклянные палочки.

Порядок выполнения работы

  1.  В три пробирки наливают по 10 капель раствора белка.
  2.  В первую добавляют 1—2 капли 5% раствора сернокислой меди, во вторую 1—2 капли 5% раствора уксуснокислого свинца и в третью 1—2 капли 3% раствора азотнокислого серебра. Выпадает осадок белка во всех трех пробирках.
  3.  В каждую из трех пробирок добавляют избыток соответствующего осадителя, и раствор перемешивают стеклянной палочкой. В первой и второй пробирках наблюдается растворение осадка (пептизация). В третьей пробирке растворения осадка не происходит.

2.3. Осаждение белков алкалоидными реактивами

Алкалоидные Реактивы и материалы: осаждают как белки, так и алкалоиды — азотистые основания растений. Объясняется это наличием в белке азотистых гетероциклических группировок, аналогичных тем, которые находятся в молекулах алкалоидов (пиррольные, индольные, юшдазольные). Осаждение белков алкалоидными реактивами протекает в кислой среде и обусловлено образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотистыми группами белков. При этом происходит адсорбция аниона осадителя, например [Fe(CN)6]4-, на белковой молекуле, являющейся вследствие подкисления катионом. Белки, обладающие основным характером (протамины, гистоны), осаждаются алкалоидными реактивами в нейтральной среде.

Реактивы и материалы: раствор яичного белка или разбавленная водой сыворотка крови, уксусная кислота, 10% раствор, уксусная кислота, 1% раствор, железистосинеродистый калий, 5% раствор, вольфрамовокислый натрий, 10% раствор, танин, насыщенный раствор, пикриновая кислота, насыщенный раствор, раствор йодной ртути в йодистом калии

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  В две пробирки наливают по 10 капель раствора белка и подкисляют несколькими каплями 10% раствора уксусной кислоты.
  2.  В одну пробирку прибавляют 2—3 капли 5% раствора железистосинеродистого калия, в другую — 2—3 капли 10% раствора вольфрамата натрия, взбалтывая после добавления каждой капли. Наблюдают выпадение осадка. Осаждению белков железистосинеродистым калием мешает присутствие больших количеств средних солей в растворе; в этих случаях рекомендуется разбавлять испытуемую жидкость водой.
  3.  В три пробирки наливают по 10 капель раствора белка и подкисляют несколькими каплями 1% раствора уксусной кислоты.
  4.  В первую пробирку добавляют 2—3 капли раствора танина, во вторую — 5—6 капель раствора пикриновой кислоты, в третью — 1-2 капли раствора йодной ртути в йодистом калии. Во всех пробирках белок выпадает в осадок.

При осаждении танином осадок не образуется, если в растворе совершенно отсутствуют средние соли или имеется свободная минеральная кислота. В этих случаях прибавляют уксуснокислый натрий.

2.4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами, кроме ортофосфорной, денатурируются и осаждаются из раствора. Выпадение белка в осадок обусловлено дегидратацией белковых молекул и рядом других причин, например образованием нерастворимых комплексных солей из белка и кислот и др. Возможно, что в условиях кислой среды к положительно заряженным коллоидным частицам притягиваются отрицательно заряженные ионы NO3- и, адсорбируясь на молекулах белка, экранируют их заряд. В избытке серной и соляной кислот происходит растворение первоначально выпавших осадков белка. Избыток азотной кислоты не растворяет осажденный белок, поэтому для обнаружения белка в исследуемом материале пользуются азотной кислотой.

Реакция с азотной кислотой является высокоспецифичной и высокочувствительной. Она получила широкое применение при клинических исследованиях мочи на присутствие в ней белка (проба Геллера). Эта реакция лежит в основе количественного определения белка по методу Брандберг—Рабертс—Стольникова.

Реактивы и материалы: раствор белка или разбавленная сыворотка крови, азотная кислота, концентрированная, серная кислота, концентрированная, соляная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку наливают приблизительно 1 мл (15—20 капель) концентрированной азотной кислоты и затем, сильно наклонив пробирку (под углом 45°), осторожно приливают по стенке равный объем раствора белка. В месте соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка в виде кольца (проба Геллера). Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает.
  2.  То же проделывают, взяв вместо азотной кислоты концентрированную серную и соляную кислоты. Отличие заключается в том, что образовавшиеся осадки белка в избытке серной и, соответственно, соляной кислоты растворяются.

2.5. Осаждение белков органическими кислотами

Реакции с трихлоруксусной (СС13СООН) и сульфосалициловой кислотами являются весьма специфическими и чувствительными (сульфосалициловая кислота открывает белок в разведении 1: 50000). Они получили широкое практическое применение в клинических лабораториях при обнаружении белка в моче и других биологических жидкостях.

Сульфосалициловая кислота

Сульфосалициловая кислота осаждает также, помимо белков, продукты их распада — пептоны и высокомолекулярные полипептиды. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а полипептиды и низкомолекулярные азотсодержащие небелковые вещества остаются в растворе. Это свойство трихлоруксусной кислоты используется при определении небелкового (остаточного) азота крови, в состав которого входят продукты распада и обмена белков (полипептиды, аминокислоты, мочевина, мочевая кислота и др.). При этом белки крови осаждают трихлоруксусной кислотой, отделяют фильтрованием, а фильтраты анализируют на содержание в них небелкового азота. Освобождение фильтрата от трихлоруксусной кислоты достигается кипячением; при этом трихлоруксусная кислота разлагается на хлороформ и угольный ангидрид.

Реактивы и материалы: раствор белка или разбавленная сыворотка крови, сульфосалициловая кислота, 20% раствор, трихлоруксусная кислота, 5% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

  1.  В две пробирки наливают приблизительно по 1 мл раствор белка.
  2.  В одну пробирку добавляют несколько капель (1—2 капли) сульфосалициловой кислоты, а в другую такое же количество трихлоруксусной кислоты. Наблюдают выпадение осадка белка.

2.6. Осаждение белков органическими растворителями

При добавлении к раствору белка органических растворителей, например спирта, выпадает осадок белка. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Осаждение наступает только из нейтральных или слабокислых растворов (в слабокислой среде заряд на коллоидных частицах белка является наименьшим) и более полно в присутствии электролитов, например хлористого натрия, что связано с ослаблением внутримолекулярных ионных связей ввиду конкуренции добавленных анионов и катионов. Если осаждение производить при низкой температуре (от 0 до 15 °С) и полученный осадок быстро отделить от спирта, то белок сохраняет свои природные свойства и может быть вновь растворен в воде. Длительное воздействие спирта приводит к необратимой денатурации белка.

Однако некоторые белки, например проламины растений, растворимы в горячем 70—80% спирте, гормон поджелудочной железы — инсулин растворяется в подкисленном 60% спирте. Это зависит от особенностей их первичной структуры.

Реактивы и материалы: раствор яичного белка или разбавленная сыворотка крови, этиловый спирт, 96 0С, ацетон, хлороформ, хлористый натрий, насыщенный раствор, уксусная кислота, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

1. В пробирку наливают около 1 мл раствора белка, а затем при взбалтывании—этиловый спирт до появления осадка. При добавлении 1—2 капель 1% раствора уксусной кислоты образование осадка усиливается. Еще большее осаждение наблюдается при добавлении нескольких капель (1—2) насыщенного раствора поваренной соли.

2. Проделывают ту же реакцию, взяв вместо этилового спирта ацетон.

3. В пробирку наливают около 1 мл раствора белка и добавляют равный объем хлороформа. После встряхивания пробирки и последующего разделения слоев воды и хлороформа в верхнем слое жидкости появляется осадок белка. Денатурация белка хлороформом получила распространение при выделении нуклеиновых кислот и их очистке.

2.7. Осаждение белков фенолом

Осаждением белков фенолом пользуются для удаления их при выделении и очистке нуклеиновых кислот и специфических полисахаридов. На способности фенола денатурировать белки основано его дезинфицирующее действие.

Реактивы и материалы: раствор яичного белка или разбавленная сыворотка крови, фФенол, насыщенный раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, пипетки.

Порядок выполнения работы

В пробирку наливают 10 капель раствора белка и добавляют при взбалтывании фенол до появления мути или осадка. Осадок увеличивается при стоянии.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты работы записать в таблицу. В выводах указать на денатурационные изменения в белках, приводящие к их осаждению. Подчеркнуть роль слабых связей в поддержании вторичной и третичной структуры белков.

Осадители

Реактивы

Характер и цвет осадка

Чем обусловлена реакция

Соли тяжёлыхметаллов

Алкалоидные реактивы

Концентрированные минеральные кислоты

Органические кислоты

Органические растворители

2.8. Отделение альбуминов от глобулинов в сыворотке крови методом высаливания сернокислым аммонием и хлористым натрием

Альбумины и глобулины широко распространены в природе. Их различают в зависимости от места нахождения: сывороточные, яичные и т. д. Альбумины и глобулины растворимы в слабых растворах нейтральных солей, щелочей и кислот. Альбумины, в отличие от глобулинов, растворяются в чистой воде. Глобулины (за небольшим исключением) в воде не растворяются, поэтому при разбавлении яичного белка водой, когда концентрация содержащихся в яичном белке солей понижается, глобулины выпадают в осадок и вновь растворяются при добавлении поваренной соли. Одним из методов выделения альбуминов и глобулинов из растворов является высаливание. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация солей, что зависит от ионной силы осадителя и размера белковой молекулы. Так, глобулины выпадают из раствора при полунасыщении (при 50% насыщении) сернокислым аммонием, в отличие от альбуминов, которые высаливаются при полном насыщении данной солью. Это связано с тем, что у глобулинов больший молекулярный вес, чем у альбуминов. При высаливании поваренной солью и сернокислым магнием глобулины осаждаются при полном насыщении этими солями. Альбумины высаливаются при такой же концентрации поваренной соли и сернокислого магния, как и глобулины но, в отличие от глобулинов, осадок альбуминов выпадает только при подкислении раствора. Подкисление способствует осаждению альбуминов анионами средних солей. При осаждении сернокислым аммонием не требуется подкисления раствора альбуминов кислотой. Отчасти это объясняется тем, что сернокислый аммоний является кислореагирующей солью.

Отделение альбуминов от глобулинов в сыворотке крови имеет диагностическое и прогностическое значение. В норме соотношение между этими двумя фракциями сывороточного белка (А/Г) обычно колеблется в пределах 1,5-2,3. При многих патологических состояниях оно может изменяться. Например, во многих случаях инфекционных заболеваний наблюдается повышение количества глобулинов в плазме крови, и тогда это соотношение (белковый коэффициент) уменьшается.

Реактивы и материалы: сыворотка крови, сернокислый аммоний, насыщенный раствор, сернокислый аммоний, кристаллический, тонко измельченный, хлористый натрий кристаллический, тонко измельченный, уксусная кислота, 1% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, воронки с фильтром.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку наливают приблизительно 1—1,5 мл (20—30 капель) сыворотки крови и добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония. Выпадает осадок глобулинов.
  2.  Через 10 минут выпавший осадок глобулинов отфильтровывают. В фильтрате остается другая фракция белков—альбумины.
  3.  К фильтрату, содержащему альбумины, добавляют порошок сернокислого аммония до насыщения (до того момента, когда часть кристаллов сернокислого аммония остается нерастворимой, несмотря на взбалтывание). Выпадает осадок альбуминов.
  4.  Осадок альбуминов отфильтровывают и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.
  5.  В пробирку наливают приблизительно 1—1,5 мл (20—30 капель) сыворотки крови и добавляют порошок хлористого натрия до полного насыщения. Через несколько минут выпадает осадок глобулинов.
  6.  Выпавший осадок глобулинов отфильтровывают.
  7.  В фильтрате от глобулинов остаются альбумины. Для их осаждения к фильтрату добавляют 1—2 капли 1% раствора уксусной кислоты и кипятят. Выпадает осадок альбуминов.
  8.   Осадок альбуминов отфильтровывают и производят с фильтратом биуретовую реакцию. В отсутствии белка в фильтрате от альбуминов убеждаются по отрицательным результатам биуретовой пробы.

Рекомендации к составлению протокола

Полученные данные при высаливании белков записать в таблицу. В графе «Осаждаемая фракция» положительный результат отметить знаком +. В выводах указать, какая из белковых фракций легче осаждается и причины этого.

Электролит

Степень насыщения

Реакция среды

Осаждаемая фракция

альбумины

глобулины

РАБОТА №3. МАКРОМОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА БЕЛКА

Обнаружение многих аминокислот, выявляемых, например, цветными реакциями в составе белка, позволяет предполагать о большом размере протеинов. С помощью физических методов установлено, что молекулярные веса разных белков могут колебаться от 6000 дальтон до 1 000 000 дальтон и выше.

  1.  Сопоставление молекулярного веса

гемоглобина и рибофлавина

Хорошую возможность для разделения веществ с различными размерами молекул и даже для определения молекулярных весов некоторых белков предоставляет метод гель-фильтрации. При гель-фильтрации окрашенных смесей их разделение можно устанавливать визуально. Для удобства лучше взять сложный белок гемоглобин и рибофлавин.

Реактивы и материалы: гемоглобин, 5% раствор в 0,9% растворе хлористого натрия или гемолизированная профильтрованная кровь, рибофлавин, насыщенный раствор, хлористый натрий, 0,9% раствор.

Оборудование и посуда: стеклянная хроматографическая колонка 1,6x20 см, заполненная гелем «Сефадекс Г-25» в 0,9% растворе хлористого натрия и имеющая кран на нижнем конце, склянка с тубусом, содержащая элюирующий раствор 0,9% хлористого натрия, которую через резиновую трубку можно присоединить к верхнему концу колонки, пипетки на 1—2 мл, мерный цилиндр на 50 мл.

Порядок выполнения работы

1. Смешать в пробирке по 10 капель растворов гемоглобина и рибофлавина.

2. Открыть нижний кран колонки и выпускать из нее раствор хлористого натрия, пока верхний мениск жидкости не сравняется с верхним уровнем геля.

3. Тотчас после этого тонкой струйкой, не взмучивая верхнего слоя, нанести поверх геля 0,5—1 мл смеси гемоглобина и рибофлавина. Подождать до тех пор, пока эта смесь не впитается в гель.

4. Когда смесь гемоглобина и рибофлавина перейдет в гелевую фазу, осторожно наслоить поверх геля 2—3 мл 0,9% раствора хлористого натрия. Присоединить резиновую трубку от склянки с тубусом к верхнему концу колонки. Установить уровень промывающей жидкости в склянке приблизительно на 20 см выше уровня геля.

5. При непрерывном протекании жидкости через колонку со скоростью около 20—25 капель в минуту наблюдать за перемещением окрашенного кольца (элюцией гемоглобина и рибофлавина). Отметить начало расслоения окраски, их разделение. Собрать в отдельные пробирки окрашенный в красный цвет гемоглобин и желтый рибофлавин. Измерить количество промывной жидкости (элюата), вышедшее из колонки до момента выделения гемоглобина и рибофлавина. Эти показатели (элюционные объемы) записать в протоколе.

В выводах на основании элюционных объемов качественно сопоставить молекулярные массы гемоглобина и рибофлавина.

3.2. Диализ белка

Диализом называется освобождение коллоидных растворов от примесей, способных проникать через полупроницаемые растительные, животные и искусственные мембраны (пергамент, бычий или свиной пузырь, пленки из нитроцеллюлозы, ацетилцеллюлозы, целлофана и других материалов). При помощи диализа постепенно происходит удаление веществ, легко проникающих через мембрану, например электролитов и других кристаллоидов. В то же время белки, обладая макромолекулярной структурой, не проходят сквозь полупроницаемую мембрану. Благодаря этому свойству белка диализ является удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей органических и неорганических.

Реактивы и материалы: сыворотка крови или раствор яичного белка, хлористый натрий, насыщенный раствор, тринитроцеллюлозная основа фотокинопленки, 8% раствор в смеси этилового спирта и эфира 1:1, азотная кислота, 10% раствор, азотнокислое серебро, 1% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: пробирки для приготовления диализационных мешочков, скальпель, глазной пинцет, стакан с дистиллированной водой, стеклянные палочки, резиновые колечки, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  К 5 мл сыворотке крови или раствору яичного белка прибавляют 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия.
  2.  Предварительно чисто вымытую и высушенную пробирку (диаметром 2—2,5 см, длиной 4—5 см) наполняют 8% раствором тринитроцеллюлозной основы фотокинопленки и затем выливают его в склянку, из которой он был взят. Пробирку вращают между ладонями рук, меняя ее положение так, чтобы слой оставшегося раствора равномерно распределялся по стенкам и дну пробирки.

3. Для высыхания полученной на стенках пробирки пленки пробирку в опрокинутом положении вращают между ладонями до исчезновения запаха эфира (5—10 минут). Более прочные мешочки можно получить нанесением повторного слоя мембраны после испарения эфира из первого слоя.

4. Скальпелем или ногтем осторожно отделяют верхнюю часть пленки от края пробирки и в образовавшееся пространство между стеклом и пленкой и внутрь мешочка наливают воду. Пинцетом отделяют (осторожно) мешочек от стенок пробирки и извлекают. Во избежание пересыхания мешочки до проведения в них диализа сохраняют в дистиллированной воде.

5. Проделывают с солевым раствором белка, предназначенным для диализа, биуретовую реакцию, а с дистиллированной водой для наполнения диализационного стакана пробу на хлориды. Для этого к небольшому количеству воды добавляют 1 каплю 10% раствора азотной кислоты и 1 каплю 1% раствора азотнокислого серебра. Осадок не выпадает, что говорит об отсутствии хлоридов.

  1.  В мешочек наливают (предварительно удалив из него воду) на 1/3 объема солевой раствор белка и края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колпачками, надетыми на концы палочек.
  2.  Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, кладя зажимающие мешочек палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке не должен выступать над уровнем жидкости в стакане (см. рис.).

Через 1—1,5 часа от начала диализа берут две пробы (приблизительно по 10 капель) наружной жидкости (диализат).

  1.  С одной пробой диализата производят реакцию на хлориды, как описано в пункте 5. Выпадает осадок хлористого серебра. Это убеждает в том, что ионы хлористого натрия продиффундировали во внешний сосуд.

10. К другой пробе диализата прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сернокислой меди (биуретовая реакция).

Розоватого или фиолетово-красного окрашивания жидкости не наблюдается, что свидетельствует об отсутствии белка в диализате.

11. Отбирают 10 капель содержимого мешочка (диализируемая жидкость) и производят биуретовую реакцию, как указано выше. Появление красно-фиолетового окрашивания доказывает то, что белок не проник через поры мембраны и остался в мешочке.

Рекомендации к составлению протокола

Отметить результаты реакций на белок с содержимым диализационного мешочка и наружной жидкостью, а также реакций на хлориды в наружной жидкости до начала диализа и после него. В выводах указать, почему белки не диффундируют через поры полупроницаемой мембраны.

3.3. Хроматография аминокислот на бумаге

Анализ аминокислот в гидролизатах белков, в сыворотке крови необходим для оценки функции пораженной печени и для доказательства заболеваний, возникающих из-за нарушения обмена аминокислот.

Используют различные системы растворителей, например фенол, насыщенный водой. Вода с примесью фенола адсорбируется на бумагу и образует неподвижную фазу. Фенол, насыщенный водой, служит подвижной фазой. Хроматографию для ускорения проводят при 40 °С. Аминокислоты на хроматограммах выявляют реакцией с нингидрином. Образуются пурпурные и фиолетовые пятна.

Реактивы и материалы: Раствор лейцина, аланина и глутаминовой аминокислоты, 0,04 М, фенол, насыщенный водой, нингидрин, 0,1% раствор в ацетоне.

Оборудование и посуда: термостат, сушильный шкаф, имеющий перекладины с крючками для подвешивания хроматограмм, большие пробирки 2,4x18 см с плотными пробками, штативы для больших пробирок, полосы хроматографической бумаги «быстрая» 1,5x15 см, иглы с нитками, простые карандаши и линейки с делениями, калиброванные пастеровские микропипетки, чашки петри или пульверизаторы, пипетки на 5 мл, пинцеты.

Порядок выполнения работы

Стараться не касаться полосок бумаги руками, чтобы при обработке нингидрином не образовались побочные пятна.

  1.  Один конец полоски прокалывают иглой с ниткой. Нитку завязывают, чтобы получилась петля 5—6 см длиной.
  2.  На расстоянии 2 см от другого конца полоски проводят карандашом линию старта. В центре ее делают кружок диаметром 3 мм для нанесения в это место раствора аминокислот.
  3.  Укладывают полоску на стеклянные пробирки и наносят 0,02 мл раствора аминокислот последовательно порциями, подсушивая пятно, чтобы оно не выходило за пределы кружка.
  4.  В сухую пробирку для хроматографии на дно пипеткой наливают 2 мл фенола, насыщенного водой, стараясь не смочить стенки пробирки. Ставят пробирку в штатив строго вертикально.
  5.  Полоску опускают в пробирку, погружают на 0,5 см в фенол, стараясь ни в коем случае не размыть нанесенные аминокислоты. Пробирку плотно закрывают пробкой, прижимая петлю, чтобы полоска висела на нужном уровне (см. рис.).

 

  1.  Ставят штатив с пробирками в термостат, нагретый до 40 °С на 1,5 часа.
  2.  После хроматографии полоску вынимают, подвешивают за петлю в сушильном шкафу и высушивают 10 минут при 100 °С.
  3.  В чашку Петри наливают 15—20 мл раствора нингидрина. Полоску, удерживая пинцетами, проводят через раствор и вновь помещают в сушильный шкаф на 5—7 минут при 100 °С.

На хроматограмме измеряют линейкой расстояния от старта до середины пятен аминокислот и до фронта растворителя. Вычисляют коэффициент распределения для каждой аминокислоты.

Рекомендации к составлению протокола

В лабораторном журнале описать принцип распределительной хроматографии на бумаге. Зарисовать хроматографическую систему. Хроматограмму подклеить в журнал и обозначить отдельные аминокислоты. Сравнить полученные коэффициенты распределения со стандартом.

РАБОТА № 4. СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ

Сложные белки состоят из белка и небелковой части, называемой простетической группой. В соответствии с этим сложные белки при гидролизе, наряду с аминокислотами, дают соединения другого характера, например нуклеиновые кислоты, углеводы, фосфорную кислоту и пр. В зависимости от природы простетических групп протеины подразделяются на нуклеопротеины, хромопротеины, фосфопротеины, гликопротеины, липопротеины, металлопротеины.

4.1. Нуклеопротеины

Нуклеопротеины – соединения нуклеиновых кислот и простых белков, связь между белком и нуклеиновой кислотой имеет большей частью электростатическую природу, т.е. кислотные группы нуклеиновых кислот взаимодействуют с аминогруппами белков.

Нуклеопротеины содержатся во всех клетках животных и растительных организмов, в вирусах. Особенно много их в тканях, богатых ядрами (зобной железе, селезенке, дрожжах и др.) Они нерастворимы в воде, растворяются в щелочах, при слабом подкислении снова осаждаются. В минеральных кислотах, даже очень разбавленных, растворяются легко.

Нуклеиновые кислоты выполняют в организме ряд важнейших функций: они обеспечивают хранение и передачу генетической информации, участвуют в механизмах, при помощи которых эта информация реализуется в процессе синтеза всех клеточных белков. Отдельные нуклеотиды являются небелковой частью ряда окислительно-восстановительных ферментов и носителями макроэргических связей, используемых для энергетического обеспечения многих обменных реакций в организме.

4.1.1. Кислотный гидролиз нуклеопротеинов дрожжей и определение их состава

Дрожжи являются материалом, богатым рибонуклеопротеинами. Для доказательства присутствия в молекуле рибонуклеопротеина белковой части, пуриновых радикалов, остатка фосфорной кислоты и углеводной группы (пиримидиновые основания отщепляются с трудом) дрожжи подвергают гидролизу кипячением с серной кислотой. В гидролизате открывают продукты гидролиза рибонуклеопротеинов качественными реакциями.

Реактивы и материалы: дрожжи пекарские, прессованные или сухие, серная кислота, 5% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор, аммиак, концентрированный раствор, аммиачный раствор азотнокислого серебра, орциновый реактив, аммоний молибденовокислый, раствор в азотной кислоте, флороглюцин, 0,2% раствор в 30% соляной кислоте, сернокислый магний, 5% раствор, хлористый аммоний, 10% раствор, лакмусовая бумага.

Оборудование и посуда: круглодонная колба с пробкой, снабженной длинной стеклянной трубкой, служащей обратным холодильником, мерный цилиндр на 50 или 100 мл, воронка с фильтром, штатив с пробирками, капельницы, весы аптечные.

Порядок выполнения работы

1.В круглодонную колбу на 100 мл помещают 5 г свежих дрожжей (или 1 г сухих) и добавляют 40 мл 5% раствора серной кислоты.

2. Колбу закрывают пробкой, снабженной обратным холодильником, укрепляют ее в штативе и осторожно кипятят содержимое под тягой на асбестовой сетке в течение 1—1,5 часов.

3.Через 1—1,5 часа от начала кипения гидролизат в колбе охлаждают, переливают в мерный цилиндр и путем ополаскивания колбы дистиллированной водой доводят объем жидкости до первоначального.

4. Полученный раствор отфильтровывают и проделывают с ним реакции на присутствие белка и полипептидов, пуриновых оснований, углевода, фосфорной кислоты.

5.Белок и полипептиды открывают биуретовой пробой. К 5 каплям гидролизата добавляют 10% раствор гидроксида натрия до щелочной реакции (примерно 10 капель) и по каплям (1—2 капли) медного купороса до появления розово-фиолетовой или розовой окраски.

6. На пуриновые основания производят серебряную пробу. К 10 каплям гидролизата добавляют раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус (примерно 2—3 капли) и добавляют 5 капель аммиачного раствора азотнокислого серебра. В присутствии пуриновых оснований образуется бурый осадок их серебряных соединений. Если осадок тотчас не образовался, жидкости дают некоторое время спокойно постоять.

7.Углевод (пентозу) обнаруживают пробой Троммера, реакцией с орцином и реакцией с флороглюцином.

А. В основе пробы Троммера лежит окислительно-восстановительный процесс: в щелочной среде при нагревании альдегидная группа сахара окисляется, а гидрат окиси меди (осадок голубого или синего цвета) восстанавливается в гидрат закиси меди (осадок желтого цвета) или в закись меди (кирпично-красный осадок). Сахара, не имеющие свободной альдегидной группы, пробу Троммера не дают.

Окислительно-восстановительную реакцию можно представить в виде следующей схемы:

В пробирку наливают 10 капель гидролизата и нейтрализуют по лакмусу 10% раствором гидроксида натрия. К нейтрализованной жидкости добавляют равный объем 10% раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сернокислой меди до образования не исчезающей при взбалтывании голубой мути гидрата окиси меди. Осторожно нагревают до кипения верхнюю часть содержимого пробирки. Появляется желтый осадок гидрата закиси или кирпично-красный осадок закиси меди. Образование осадка указывает на наличие в гидролизате углевода, образовавшегося при гидролизе. Раствор медного купороса следует прибавлять очень осторожно, так как избыток гидроокиси меди переходит при нагревании, теряя воду, в черную окись меди, что затемняет основную реакцию. В случае определения углевода в нейтральной жидкости предварительная нейтрализация ее раствором гидроксида натрия не требуется.

Б. Реакция с орцином. К 10 каплям гидролизата добавляют равный объем орцинового реактива и нагревают до кипения. Наличие пентозы в гидролизате обусловливает при этом развитие зеленого окрашивания жидкости. Реакция зависит от того, что пентозы при нагревании с соляной кислотой (входящей в состав орцинового реактива) образуют фурфурол, который при взаимодействии с орцином дает окрашенные соединения.

Орцин   Фурфурол  Флороглюцин

В. Реакция с флороглюцином. К 10 каплям гидролизата добавляют равный объем раствора флороглюцина и нагревают до кипения. Появляется розовое окрашивание, переходящее затем в красное. Реакция обусловлена взаимодействием флороглюцина с фурфуролом, образующимся из пентозы при нагревании с соляной кислотой, в которой растворен флороглюцин.

8. Фосфорную кислоту открывают молибденовой пробой и пробой с магнезиальной смесью.

А. Молибденовая проба. К 10 каплям гидролизата прибавляют равный объем раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте и кипятят несколько минут. Содержимое пробирки охлаждают под струей холодной воды и наблюдают выпадение лимонно-желтого кристаллического осадка комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония, свидетельствующего о наличии в гидролизате фосфорной кислоты.  

H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3(PO4 · 12MoO3) + 21NH4NO3 + 12H2O

Б. Проба с магнезиальной смесью. В пробирку наливают 10 капель гидролизата и подщелачивают его концентрированным раствором аммиака. Добавляют равный объем магнезиальной смеси. Образуется белый кристаллический осадок двойной аммонийно-магниевой соли фосфорной кислоты (фосфорнокислый магний-аммоний) Mg(NH4)PO4. Раствор магнезиальной смеси готовят в отдельной пробирке следующим образом: к нескольким каплям 5% раствора сернокислого (или хлористого) магния добавляют по каплям концентрированный раствор аммиака до прекращения образования осадка и затем по каплям 10% раствор хлористого аммония до растворения осадка Mg(OH)2.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты реакций зафиксировать в таблице. В выводах указать, из чего состоят нуклеопротеины и их простетическая часть – нуклеиновые кислоты.

Наименование продуктов гидролиза

Употребляемые реактивы и температурные условия

Что наблюдается

Чем обусловлена реакция

4.1.2. Изучение химического состава рибонуклеопротеинов дрожжей

Реактивы и материалы: дрожжи, 10%-ный раствор серной кислоты, дистиллированная вода, Реактивы и материалы для определения составных частей нуклеотидов.

Оборудование и посуда: широкие пробирки, капельницы, стаканы, пробка с обратным воздушным холодильником, водяная баня, воронка для фильтрования, бумажные фильтры.

Порядок выполнения работы

200 мг дрожжей помещают в широкую пробирку и добавляют 5 мл 10%-го раствора серной кислоты и 5 мл дистиллированной воды. Перемешивают и закрывают пробкой с обратным воздушным холодильником. Пробирку помещают на кипящую водяную баню и кипятят при слабом нагревании 1 час. Затем пробирки охлаждают, фильтруют содержимое и с фильтратом (гидролизатом) проводят реакции на составные части нуклеотидов.

а) Биуретовая реакция на белок

К 5-6 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 10% -го раствора NaOH и 1 каплю 1%-го раствора сульфата меди. При наличии белка жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.

б) Серебряная проба на пуриновые основания

К 0,5 мл гидролизата добавляют аммиак до щелочной реакции на лакмус и 0,5 мл аммиачного раствора оксида серебра. Через 5 мин при стоянии выпадает небольшой хлопьевидный осадок серебряных соединений пуриновых оснований.

в) Реакция на пентозы

К 0,5 мл гидролизата добавляют 0,5 мл 10%-го раствора NaOH и по каплям раствор сульфата меди до образования гидрата окиси меди (избегать избытка). Нагревают до кипения. В случае присутствия моносахаридов (пентоз) образуется красный осадок закиси меди.

г) Молибденовая проба на фосфорную кислоту

К 0,5 мл гидролизата прибавляют равный объем молибденового реактива и кипятят несколько минут. Жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении образуется желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.

4.2. ХРОМОПРОТЕИНЫ

Хромопротеины состоят из простого белка и простетической группы, которая придает определенный цвет всему соединению. В организме многие из них являются катализаторами ряда важнейших окислительно-восстановительных процессов. Представителем хромопротеинов может служить кислородпереносящий пигмент эритроцитов крови млекопитающих гемоглобин.

При гидролизе гемоглобина в присутствии кислорода (на воздухе) гем освобождается в виде гематина, где железо трехвалентно. У гематина третья валентность железа связана с гидроксильной группой.

При действии на гемоглобин концентрированной уксусной кислоты в присутствии NaCl из гемоглобина образуются кристаллы гемина.

4.2.1. Открытие железа в гемоглобине

Реактивы и материалы: дефибринированная кровь, азотная кислота, концентрированная, соляная кислота, не содержащая железа, 10% раствор, калии железистосинеродистый, 5% раствор, калий роданистый, 5% раствор.

Оборудование и посуда: небольшая фарфоровая чашка (можно заменить фарфоровым черепком или крышкой тигля), тигельные щипцы, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. Несколько капель дефибринированной крови выпаривают досуха в небольшой фарфоровой чашке (под тягой), обугливают и озоляют, добавляя 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и продолжая нагревание до образования сухого остатка. При этом гем, являясь органическим веществом, разрушается, а железо переходит в состав золы.

2. Сухой остаток соскабливают и полученный порошок переносят в пробирку. Добавляют 20 капель 10% раствора соляной кислоты и взбалтывают в течение нескольких минут для растворения остатка и получения FeCl3.

3.Содержимое пробирки делят на две части и проделывают реакции на Fe3+.

А. К одной части жидкости добавляют по каплям 5% раствор железисто-синеродистого калия до появления зеленого или синего окрашивания вследствие образования берлинской лазури, которая затем может выпасть в виде синего осадка.       

4FeCl3 + 3K4Fe(CN)6 → 3Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl   

Б. К другой части жидкости добавляют по каплям 5% раствор роданистого калия до появления розового или красного окрашивания, указывающего на образование роданистого железа.

FeCl3 + 3KSCN → Fe(SCN)3 + 3KCl

4.2.2. Получение кристаллов гемина (Тейхмана)

При нагревании высушенной крови с ледяной уксусной кислотой кровяной пигмент распадается на глобин и гематин. Гематин при действии хлористого водорода, возникающего при взаимодействии хлористого натрия (имеющегося в крови или добавленного) и уксусной кислоты, переходит в хлоропроизводное гемин. Последний выкристаллизовывается при остывании.

Реактивы и материалы: дефибринированная кровь, ледяная уксусная кислота.

Оборудование и посуда: предметные стекла, покровные стекла, микроскоп, стеклянные палочки или капельницы.

Порядок выполнения работы

1. Стеклянной палочкой (или капельницей) наносят на предметное стекло каплю крови и размазывают ее встряхиванием стекла или краем другого предметного стекла (полученный мазок не должен быть очень тонким).

2. Кровь высушивают, держа стекло высоко над пламенем горелки во избежание перегревания выше 60 °С (контролировать нагрев прикосновением стекла к тыльной поверхности кисти руки).

3.После полного высушивания добавляют 1—2 капли ледяной уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают на маленьком пламени горелки до закипания кислоты.

4. После охлаждения препарат рассматривают под микроскопом, зарисовывают форму кристаллов. Если кристаллов гемина обнаружить не удается, то вводят под покровное стекло еще 1—2 ледяной уксусной кислоты, поднося капельницу к краю покровного стекла, и вновь нагревают.

При исследовании старых кровяных пятен геминовую пробу производят с соскобом пятна или же кусочек ткани с пятном режут на мелкие части.

Перед обработкой ледяной уксусной кислотой добавляют один маленький кристаллик хлористого натрия.

4.3. ФОСФОПРОТЕИНЫ

Фосфопротеины состоят из простого белка и фосфорной кислоты в качестве простетической группы. Фосфорная кислота соединена с остатками оксиаминокислот (серии, треонин) белковой части по типу сложных эфиров. К фосфопротеинам относится казеин молока, ововителлин яичного желтка и др. Они являются питательным материалом. Вместе с аминокислотами фосфопротеины доставляют необходимую для организма фосфорную кислоту. Фосфорная кислота особенно важна для развития скелета и зубов растущих организмов.

4.3.1. Гидролиз казеина и открытие в гидролизате белкового компонента и фосфорной кислоты

Для анализа в качестве фосфопротеина можно использовать казеин молока. При щелочном гидролизе казеин распадается на белок и фосфорную кислоту. Белок открывают биуретовой реакцией, а фосфорную кислоту молибденовой пробой. Ион РО" дает с молибдатом аммония в кислой среде фосфомолибдат аммония, который в результате восстановления гидрохиноном и сульфитом натрия переходит в молибденовую синь. Синий цвет пропорционален количеству молибдена в фосфомолибдате и, следовательно, количеству фосфора.

Реактивы и материалы: сухой казеин (порошок), гидроксид натрия 10% раствор, сульфат меди, 1% раствор, азотная кислота, 25% или концентрированная, аммоний молибденовокислый, раствор в азотной кислоте, гидрохинон, 2% раствор, раствор карбонат сульфита.

Оборудование и посуда: весы с разновесом, водяная баня, пипетки на 5 мл, стеклянные воронки с бумажным фильтром, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  К 100 мг сухого измельченного казеина прибавляют 5 мл 10% натра и помещают в кипящую водяную баню на 30 минут, помешивая время от времени содержимое пробирки.
  2.  После охлаждения к 10 каплям гидролизата прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и по каплям 1% раствор сернокислой меди до появления красно-фиолетового или сине-фиолетового окрашивания. Положительная биуретовая реакция доказывает белковую природу казеина.
  3.  Для открытия фосфорной кислоты к 20 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 25% азотной кислоты (до кислой реакции) и 10 капель раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте. Оставляют стоять на 5 минут.
  4.  Образующийся осадок белка и высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белков отфильтровывают с помощью бумажного фильтра.
  5.  К фильтрату, содержащему фосфорномолибденовокислый аммоний прибавляют 10 капель 2% раствора гидрохинона и оставляют стоять на 5 минут.

6. К содержимому пробирки добавляют 20 капель раствора карбонат сульфита медленно, по каплям, во избежание сильного образования пены. В присутствии фосфорной кислоты постепенно развивается синее окрашивание раствора.

4.4. ГЛИКОПРОТЕИНЫ

Гликопротеины – это белки, несущие ковалентносвязанные углеводы и их производные, а также нередко остатки серной и уксусной кислот. У некоторых гликопротеинов углеводная часть представлена мукополисахаридами. Они получили название мукопротеинов. При гидролизе белковая часть муцинов распадается на аминокислоты, а простетическая группа – на гексозы, гексозамины, нейраминовые кислоты и другие компоненты.

4.4.1. Выделение муцина и реакции на его белковую часть и углеводную группировку

Реактивы и материалы: уксусная кислота, 1% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор, -нафтол, 1% спиртовой раствор, серная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, стеклянные палочки.

Порядок выполнения работы

1. Для выделения муцина в пробирку собирают 5—10 мл слюны и добавляют такой же объем 1% раствора уксусной кислоты при помешивании стеклянной палочкой. Муцин выпадает в осадок в виде слизистого комочка.

2. Жидкость из пробирки осторожно сливают, задерживая муцин стеклянной палочкой.

3. Осадок муцина промывают водой, разделяют на две части, с которыми проделывают реакции на белок и углеводы.

4. Для открытия белка в пробирку помещают одну часть осадка муцина, добавляют при помешивании 10% раствор гидроксида натрия до растворения сгустка и проводят биуретовую реакцию. Положительный результат реакции доказывает белковую природу муцина.

5. Углеводы муцина обнаруживают нафтоловой пробой (реакция Подобедова-Молиша). Реакция обусловлена взаимодействием оксиметил-фурфурола, образующегося из гексоз под влиянием серной кислоты с -нафтолом. При этом образуется окрашенный продукт конденсации.

Ко второй половине осадка муцина добавляют 10—20 капель 1% спиртового раствора -нафтола, перемешивают и по стенке осторожно спускают равный объем концентрированной серной кислоты. На границе раздела жидкостей постепенно появляется фиолетово-красное кольцо, свидетельствующее о наличии углеводного компонента в составе муцина. Для развития окраски содержимое пробирки оставляют стоять на 1 час. Окрашенное кольцо хорошо заметно на белом фоне. Эта реакция дает положительный результат с любым углеводом - - как с простым, так и со сложным, а также со всеми веществами, в состав которых входят углеводы.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты работы на хромопротеины, фосфопротеины и гликопротеины оформить в виде таблицы. 

Наименование сложного белка

Простети-ческая группа

Химическая структура простетической группы

Реакции, характерные для простетической группы

Что наблюдается

Чем обусловлена реакция

4.4.2. Реакция с азотной кислотой

Реакция с азотной кислотой является высокоспецифичной и высокочувствительной. Она получила широкое применение при клинических исследованиях мочи на присутствие в ней белка (проба Геллера).

Реактивы и материалы: раствор белка или разбавленная сыворотка крови, азотная кислота, концентрированная, серная кислота, концентрированная, соляная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. В пробирку наливают 1 мл концентрированной азотной кислоты и затем, сильно наклонив пробирку (под углом 45°), осторожно приливают по стенке равный объем раствора белка. В месте соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка в виде кольца (проба Геллера). Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает.

2. То же проделывают, взяв вместо азотной кислоты концентрированную серную и соляную кислоты. Отличие заключается в том, что образовавшиеся осадки белка в избытке серной и, соответственно, соляной кислоты растворяются.

РАБОТА № 5. СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Ферменты — это белки, обладающие каталитической активностью. В клетках и жидкостях организма они выполняют роль биологических катализаторов, осуществляя свое действие путем снижения энергии активации.

5.1. Гидролиз крахмала α-амилазой слюны

α-Амилаза слюны относится к классу гидролаз. Специфическими субстратами α-амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. Для исследования действия α-амилазы слюны в качестве страта берут крахмал. Нерасщепленный крахмал образует с йодом комплекс синего цвета и не обладает восстановительной способностью, так как почти не имеет свободных альдегидных групп. α-Амилаза гидролизует -1,4-глюкановые связи в крахмале, гликогене и олигосахаридах, которые разрываются без определенного порядка. При гидролизе крахмала образуются последовательно промежуточные продукты: амилодекстрины (дают синее или фиолетовое окрашивание с йодом), эритродекстрины (красно-бурое окрашивание с йодом), ахродекстрины (не дают окрашивания с йодом), мальтодекстрины (не дают окрашивания с йодом). В качестве конечного продукта гидролиза под действием α-амилазы образуется смесь дисахарида мальтозы и моносахарида глюкозы. И мальтоза и глюкоза имеют свободные альдегидные группы, вследствие чего они обладают восстановительной способностью и открываются пробой Троммера.

Реактивы и материалы: разбавленная слюна (слегка ополаскивают рот дистиллированной водой для очищения его от остатков пищи, набирают новую порцию воды, примерно 15—20 мл и ополаскивают рот в течении 1—2 мин. собранную в стаканчик или пробирку жидкость профильтровывают и употребляют для анализа), крахмал, 1% раствор, свежеприготовленный., раствор йода в йодистом калии, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, стаканчики, воронки с фильтром, пипетки, термостат или водяная баня, снабженная термометром, стеклянные палочки, капельницы.

Порядок выполнения работы

1.К 5—10 каплям 1% раствора крахмала добавляют 1—2 капли раствора йода в йодистом калии и убеждаются в том, что крахмал с йодом дает синее окрашивание.

2.Заготавливают 8—10 пробирок, куда наливают по 1—3 капли раствора йода в йодистом калии.

3.В две другие пробирки помещают приблизительно по 5 мл раствора крахмала. В одну из них добавляют около 3 мл дистиллированной воды (контрольный опыт), а в другую—около 3 мл разбавленной слюны (основной опыт). Содержимое обеих пробирок перемешивают стеклянной палочкой и ставят пробирки в термостат при 37°С или держат в зажатой кисти руки. Замечают время.

4.Через несколько секунд (5—7) из контрольного и основного опытов отливают по несколько капель жидкости в пробирки с раствором йода в йодистом калии и наблюдают окрашивание. Отбор проб и реакцию с раствором йода производят несколько раз через короткие интервалы. Сначала синее окрашивание будет появляться от проб, взятых из обеих пробирок; затем из пробирки, где есть амилаза, проба жидкости начнет давать с йодом красно-бурое окрашивание. Вскоре отмечают, что пробы жидкости из пробирки слюной окрашивания с йодом более не дают. Эти различные окраски от йода указывают на то, что идет постепенный гидролиз крахмала с образованием декстринов. Когда последняя проба жидкости, взятая из пробирки со слюной, не изменит желтого цвета раствора йода, гидролиз считают завершенным и записывают время его окончания.

Пробы, взятые из контрольного опыта, все время дают синее окрашивание, что свидетельствует о том, что в отсутствие гидролиз крахмала не происходит.

5. С частью растворов основного и контрольного опытов производят пробу Троммера. С раствором из пробирки со слюной проба Троммера будет положительная, вследствие образования конечных продуктов ферментативного гидролиза крахмала. Раствор контрольного опыта пробу Троммера не дает. Наблюдают, что в пробирке с основным опытом опалесценция раствора процессе гидролиза исчезает.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты работы записать в таблицу. В выводах обратить внимание на то, что гидролиз крахмала под влиянием α-амилазы идет постепенно, через промежуточные продукты, при температуре тела или близкой к ней, в течение короткого времени. Обосновать, почему конечные продукты гидролиза дают положительную реакцию Троммера.

Название субстрата и продуктов гидролиза

Окраска с йодом

Время, затраченное на гидролиз

Температурные условия гидролиза

Реакция Троммера

5.2. Термолабильность α-амилазы слюны

Ферменты термолабильны, т. е. чувствительны к высокой температуре. Большинство ферментов разрушается при нагревании их до 60º—70°С в течение часа. При воздействии более высокой температуры (80º—100ºС) в течение нескольких минут ферменты обычно полностью утрачивают свою каталитическую активность вследствие денатурации. Свойство ферментов инактивироваться при кипячении можно показать на примере α-амилазы слюны.

Реактивы и материалы: разбавленная слюна, крахмал, 1% раствор, свежеприготовленный, раствор йода в йодистом калии, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, термостат или водяная баня (37 ºС).

Порядок выполнения работы

1. В пробирку отливают около 2 мл разбавленной слюны и кипятят в течение 2—3 минут (следя за тем, чтобы образующаяся пена также прогревалась), после чего охлаждают.

2. В две пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В одну из них добавляют 10 капель разбавленной слюны, в другую - 10 капель разбавленной слюны, предварительно прокипяченной и остуженной.

3. Содержимое обеих пробирок перемешивают и ставят в термостат при 37ºС на 10 минут.

4. После 10-минутного действия фермента на субстрат из каждой пробирки отбирают по 3—5 капель жидкости в заранее заготовленные пробирки с 1—2 каплями раствора йода в йодистом калии. Проба из пробирки с непрокипяченной слюной окрашивания с йодом не дает. Проба из пробирки с предварительно прокипяченной слюной дает с йодом синее окрашивание.

5. С оставшейся жидкостью в обеих пробирках производят реакцию Троммера. Она положительна там, где была непрокипяченная слюна, и отрицательна в случае действия на крахмал предварительно прокипяченной слюной.

Рекомендации к составлению протокола

Полученные данные занести в таблицу.

Фермент

Субстрат

Наличие крахмала в гидролизате

Реакция Троммера

α-амилаза

Прокипячённая амилаза

5.3. Специфичность α-амилазы слюны и сахарозы дрожжей

Специфическими субстратами для амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. Субстратом для фермента сахаразы (-В-фруктофуранозид—фруктогидролаза; КФ 3.2.1.26) служит дисахарид сахароза. Сахароза не дает пробу Троммера, так как в молекуле нет свободной альдегидной или кетонной группы вследствие дигликозидной связи между остатками глюкозы и фруктозы. После гидролиза сахарозы освобождается альдегидная группа глюкозы и кетонная группа фруктозы, которые и обусловливают положительную реакцию Троммера. Поэтому с помощью пробы Троммера можно выявить, произошел или не произошел гидролиз сахарозы.

Для исследования специфичности действия ферментов удобно пользоваться сахарозой, содержащейся в вытяжке из дрожжей.

Реактивы и материалы: разбавленная слюна, сахароза, источником служит 20% профильтрованная взвесь растёртых сухих дрожжей, крахмал, 1% раствор, свежеприготовленный, сахараза, 2% раствор,  гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, термостат или водяная баня, снабженная термометром.

Порядок выполнения работы

1. Производят пробу Троммера с раствором сахарозы и убеждаются в том, что она отрицательная.

2. Наливают в одну пробирку 10 капель 1% раствора крахмала, в другую - 10 капель 2% раствора сахарозы.

3. В обе пробирки добавляют по 5 капель разбавленной слюны, перемешивают содержимое пробирок и ставят их в термостат при 37ºС на 10—15 минут.

4. Через 10—15 минут с жидкостью из обеих пробирок проделывают пробу Троммера. Там, где в качестве субстрата был крахмал, наблюдается восстановление гидрата окиси меди, что указывает на расщепление крахмала под влиянием α -амилазы. В пробирке с сахарозой восстановления гидрата окиси меди не происходит. Это свидетельствует о том, что сахароза не гидролизовалась и, следовательно, она не является специфическим субстратом для α -амилазы.

5. Для выявления специфичности сахаразы наливают в одну пробирку 10 капель 1% раствора крахмала, а в другую — 10 капель 2% раствора сахарозы.

  1.  В обе пробирки добавляют по 5 капель сахаразы дрожжей, перемешивают содержимое пробирок и ставят их в термостат 37ºС на 10—15 минут.
  2.  Через 10—15 минут с жидкостью из обеих пробирок проделывают пробу Троммера. Там, где в качестве субстрата была сахароза наблюдается восстановление гидрата окиси меди, что указывает на расщепление сахарозы под влиянием сахаразы. В пробирке с крахмалом проба Троммера отрицательная; следовательно, крахмал не является субстратом для сахаразы.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты работы оформить в виде таблицы. В выводах записать, в чем проявляется специфичность ферментов и чем она обусловлена.

Фермент

Субстрат

Температура гидролиза

Реакция Троммера

5.4. Влияние рН на активность α-амилазы слюны (определение оптимума рН для действия амилазы)

Для каждого фермента имеется определенное значение рН среды, при котором он является наиболее активным. Для того чтобы исследовать влияние активной реакции среды на каталитическое действие фермента, нужно приготовить ряд растворов с различными значениями рН, добавить к ним субстрат, фермент и определить после икубации, в какой среде катализ идет с наибольшей скоростью.

Реактивы и материалы: слюна, разведенная водой (1 мл воды + 1—2 капли слюны), фосфатный буфер, 1/15 м со следующими значениями рн: 6,2; 6,8; 7,2; 8,0, крахмал, 0,5% раствор, раствор йода в йодистом калии

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, термостат или водяная баня, снабженная термометром.

Порядок выполнения работы

1. В 5 пробирок отмеривают по 10 капель фосфатного буфера (1/15 М со следующими значениями рН: 5,4; 6,2; 6,8; 7,2; 8.0.

2. Во все пробирки прибавляют по 10 капель 0,5% раствора крахмала и по 1 капле разведенной водой слюны.

3. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, тотчас же помещают их в термостат при 37 ºС и отмечают время.

4. Для выявления скорости гидролиза через интервалы в 1-2 минуты из всех 5 пробирок отбирают по 1 капле жидкости в другие пробирки и проделывают реакции с раствором йода в йодистом калии. Гидролиз в каждой пробирке проводят до стадии эритродекстрина, который дает красно-бурое окрашивание с йодом.

5. Отмечают время (в минутах) появления эритродекстрина в каждой из пяти пробирок.

Рекомендации к составлению протокола

Зависимость активности амилазы от рН среды представить графически, откладывая по оси абсцисс значение рН среды, при котором проводился гидролиз крахмала, а по оси ординат — время в минутах, необходимое для гидролиза крахмала до стадии эритродекстрина. Сделать вывод, при каком значении рН оптимум действия фермента.

5.5. Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны

Для оценки влияния активаторов или ингибиторов каталитическое действие ферментов допытывается в присутствии указанных веществ. Полученные результаты исследования сопоставляются с данными, полученными в контрольном опыте, проводившемся без добавления активатора или ингибитора.

Реактивы и материалы: слюна, разведенная водой (1 мл воды+1—2 капли слюны), хлористый натрий, 1% раствор, сернокислая медь, 1% раствор, крахмал, 0,5% раствор, раствор йода в йодистом калии

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, термостат или водяная баня, снабженная термометром.

Порядок выполнения работы

1. Заготавливают три пробирки. В первую пробирку наливают 10 капель 1% раствора хлористого натрия, во вторую — 10 капель 1% раствора сернокислой меди, в третью — 10 капель дистиллированной воды.

  1.  Во все пробирки добавляют по 20 капель 0,5% раствора крахмала и по 1 капле разведенной водой слюны.
  2.  Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, тотчас же помещают в термостат с температурой 37ºС и отмечают время.
  3.  Для выявления скорости гидролиза крахмала через интервал в 1—2 минуты из пробирок с гидролизуемым крахмалом отбирают по 1 капле жидкости в другие пробирки и проделывают с ней реакцию с раствором йода в йодистом калии. Гидролиз проводят до стадии эритродекстрина.
  4.  Отмечают время (в минутах) появления эритродекстрина.

Рекомендации к составлению протокола

Сделанные наблюдения записать в виде таблицы.

Исследуемый агент

Фермент

Субстрат

Время образования эритродекстрина

Время, затраченное на гидролиз крахмала до стадии эритродекстрина в первых двух пробирках, сопоставить со временем гидролиза крахмала в третьей пробирке (контрольной). На основании этого сопоставления сделать вывод об активирующем или ингибирующем действии взятых для исследования веществ.

5.6. Исследование ферментативной активности гидролаз

5.6.1. Выделение уреазы из соевой муки

Уреаза отличается высокой специфичностью действия, субстратом для нее является мочевина (диамид угольной кислоты). Уреаза содержится, например, в соевой муке.

Реактивы и материалы: соевая мука, смеси из 48 мл воды и 2 мл 0,1 н НС1 и нескольких капель толуола. 

Оборудование и посуда: весы, фарфоровая ступка с пестиком, шейкер, центрифугира.

Порядок выполнения работы

3-5 г соевой муки тщательно растирают в фарфоровой ступке в смеси из 48 мл воды и 2 мл 0,1 н НС1 и нескольких капель толуола. Смесь взбалтывают 1 час, а затем центрифугируют 15 мин при 5 тыс. об/мин. Полученный прозрачный раствор используют в качестве препарата уреазы.

5.6.2. Установление специфичности действия уреазы

Метод основан на том, что уреаза катализирует расщепление мочевины на углекислый газ и аммиак. Появление аммиака обнаруживают при помощи индикатора (фенолфталеина).

Реактивы и материалы: 1% раствор мочевины, 1% раствор амида никотиновой кислоты, спиртовый раствор фенолфталеина, раствор уреазы, 5% раствор мочевины, 5% раствора ацетамида, соевоя мука, лакмусовая бумага. 

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пипетки, термостат, весы.

Порядок выполнения работы

В одну пробирку наливают 2 мл 1% раствора мочевины, в другую - 2 мл 1% раствора амида никотиновой кислоты. В обе пробирки добавляют по 2-3 капли спиртового раствора фенолфталеина и 1 мл приготовленного ранее раствора уреазы. Пробирки помещают в термостат при 37 °С на 20 мин. Содержимое пробирок, в случае происшедшей реакции гидролиза, становится малиново-красным вследствие смещения реакции среды в щелочную область.

Параллельно с этим опытом делают другой: в одну пробирку отмеривают 1 мл 5% раствора мочевины и в другую 1 мл 5% раствора ацетамида Затем в обе пробирки добавляют по 1 г соевой муки. Содержимое пробирок перемешивают и ставят при 37 °С на 5 мин. Наблюдают в пробирках различие в окраске. Проведите пробу на рН с лакмусовой бумагой. В пробирке с мочевиной выделяется аммиак и лакмусовая бумага синеет. В пробе с ацетамидом изменений не происходит.

5.6.3. Установление термолабильности уреазы

Реактивы и материалы: вытяжка уреазы, раствор мочевины, фенолфталеин, 10% раствора гидроксида натрия, лакмусовая бумага. 

Оборудование и посуда: пробирки, водяная баня, термостат.

Порядок выполнения работы

Для определения берут две пробирки, в обе наливают по 1 мл вытяжки уреазы. Первую пробирку помещают на кипящую баню на 10 мин и охлаждают. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора мочевины и по 1-3 капли фенолфталеина. Оставляют пробирки при комнатной температуре на 5-10 мин. Записывают результат и делают вывод. Образование аммиака можно обнаружить и другим путем. С этой целью повторяют опыт и после термостатирования при 37 °С в реакционную смесь осторожно добавляют равный объем 10% раствора гидроксида натрия. Выделение аммиака обнаруживают по запаху или по посинению лакмусовой бумажки у отверстия пробирки.

5.7. Исследование ферментативной активности липазы

Липаза содержится в небольшом количестве в желудке, главным образом она входит в состав сока поджелудочной железы.

Желудочная липаза может действовать только на предварительно эмульгированные жиры (например, на жир молока). Она гидролизует триацилглицерины.

5.7.1. Исследование действия липазы на липиды животного происхождения

В тонкой кишке происходит гидролиз липидов, который катализируется липо-литическими ферментами, вырабатываемыми поджелудочной железой. Существует несколько типов панкреатических липаз. Одни из них специфичны в отношении эфирных связей в α-положении триацилглицерина, а другие гидролизуют связи в β-положении. Полный гидролиз происходит постадийно: сначала ферментами атакуются α- и α-1 связи, а затем более медленно гидролизуются β-моноацилглицерины.

Конечные продукты переваривания (глицерин, высшие жирные кислоты, а также ди- и моноацилглицерины) всасываются в стенки кишечника.

Реактивы и материалы: препарат липазы, молоко, фенолфталеин, раствор 0,01 моль/л гидроксида натрия.

Оборудование и посуда: колбы, пипетка, цилиндр, водяная баня, бюретка, штатив для титрования.

Порядок выполнения работы

Готовят 2 колбы для опытной и контрольной проб. Для контрольной пробы липазу предварительно кипятят в течение 10 мин на кипящей бане. В каждую колбу наливают молоко и препарат липазы, как указано в таблице.

Компоненты смеси

Опыт, мл

Контроль, мл

Молоко (разведённое в соотношении 1:10)

10

10

Препарат липазы

1

1 (прокипячённый)

Приготовленные инкубационные смеси перемешивают. Затем из каждой колбы отбирают по 1 мл смеси в заранее приготовленные стаканчики для титрования. В каждый стаканчик добавляют 2 капли раствора фенолфталеина и титруют раствором гидроксида натрия до слабо-розового окрашивания. При первом титровании нейтрализуют органические кислоты - молочную и другие, которые присутствовали в молоке до начала действия липазы.

Оставшуюся в колбах смесь помещают в термостат, температура которого 37 °С, и через определенные интервалы (10, 20, 30 мин) из каждой пробы отбирают (не вынимая из термостата) по 2 мл смеси и титруют 0,01 моль/л раствором гидроксида натрия. Время титрования и объем израсходованного гидроксида натрия фиксируют в таблице.

Объём щелочи, пошедшей на титрование, мл

Время инкубации, мин

0

10

20

30

Опытная проба

Контроль

Результат первого титрования, полученного до начала действия липазы, вычитают из результатов последующих титрований.

На основании полученных данных строят график, где по оси абсцисс откладывают время (в минутах), а по оси ординат - активность липазы, выраженную объемом 0,01 моль/л раствора гидроксида натрия в мл, пошедшего на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данный отрезок времени.

5.7.2. Исследование действия липазы на липиды растительного происхождения

Реактивы и материалы: подсолнечное масло, дистиллированаявода, гидрокарбонат натрия 1%, спиртовыйо 1%раствор фенолфталеина, препарат липазы.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, термостат.

Порядок выполнения работы

В две пробирки вносят по 1 мл подсолнечного масла и добавляют по 4 мл воды и 5 мл 1% гидрокарбоната натрия. Пробирки энергично встряхивают и добавляют 5 капель 1% спиртового раствора фенолфталеина. Затем в первую пробирку вносят 1 мл препарата липазы и перемешивают. Вторую пробирку оставляют без изменений. Обе пробирки ставят в термостат при 37 °С на 5-10 мин.

В пробирке с липазой раствор постепенно становится бесцветным, а в пробирке без липазы окраска не исчезает.

Объясните результат.

РАБОТА № 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

О количестве фермента чаще всего судят по его активности. Для выявления активности обычно определяют количество субстрата, изменяющегося под влиянием фермента в времени. Единица активности фермента, соответствующая превращению 1 моля субстрата за 1 секунду название «катал». Специфическая активность выражается отношением каталов на кг белка — кат/кг белка. Молекулярная активность выражается отношением каталов на моли ферментов — каталы/моли фермента. Концентрацию ферментативной активности следует выражать в каталах на литр — каталы/литр или микрокаталы/литр. Если субстрат служит белок, полисахарид или иная молекула, в которой фермент атакует более одной связи, то вместо микромоля субстрата следует учитывать микроэквивалент (мкэкв) затронутых реакцией групп. За превращением субстрата под влиянием фермента можно следить, пользуясь различными приемами (по убыли субстрата, по появлению в растворе тех или иных продуктов реакции, по изменению некоторых физических показателей и т. д.). При определении активности фермента следует строго соблюдать установленные методики условия опыта (температуру, кислотность, концентрацию субстрата).

6.1. Определение активности -амилазы по Вольгемуту

Количественное определение активности -амилазы по этому методу основано на установлении предельного разведения раствора -амилазы, при котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного количества крахмала до эритродекстрина.

Реактивы и материалы: слюна в разведении 1:10, крахмал, 0,1% раствор, свежеприготовленный, раствор йода в йодистом калии

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, пипетки на 1 мл, бюретки, карандаш для стекла, термостат или водяная баня.

Порядок выполнения работы

1.Собирают в пробирку слюну, переносят 1 мл ее в другую пробирку, куда добавляют из бюретки 9 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.

2.В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды.

3. В первую пробирку вносят 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и перемешивают путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки. Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку, перемешивая содержимое таким же образом, как это делалось ранее. 1 мл жидкости из второй пробирки переносят в третью, из третьей — в четвертую и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл жидкости удаляют. Таким образом, в первой пробирке слюна оказывается разбавленной в 20 раз, во второй — в 40, в третьей — в 80 раз и т. д.

4.Во все пробирки добавляют (начиная с десятой, где концентрация фермента наименьшая) по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Содержимое всех пробирок перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37 ºС на 30 минут.

5. Через 30 минут пробирки охлаждают под краном и добавляют в каждую по 1—2 капли раствора йода в йодистом калии. Отмечают пробирку с наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание. Активность -амилазы выражают количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при 37 °С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.

Например, если с красно-бурой окраской жидкость была отмечена в четвертой пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз и куда было прибавлено 2 мл 0,1% раствора крахмала, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил бы в 160 раз больше 0,1% раствора крахмала: 1/160 мл слюны расщепляет 2 мл — 0,1% раствора крахмала, 1мл слюны расщепляет х мл 0,1% раствора крахмала, т. е. х = 2∙1:1/160 = 320 мл 0,1% раствора крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут при 37 °С 320 мл 0,1% раствора крахмала. Условно это принимают за 320 единиц -амилазы по Вольгемуту. Результат принято изображать следующим образом: А 37º/30' = 320 ед.

Методом Вольгемута можно пользоваться для определения -амилазы в панкреатическом соке, крови, моче и других жидкостях организма.

Рекомендации к составлению протокола

Полученные данные практической работы занести в таблицу.

№ п/п

Разведение слюны

Количество крахмала, мл

Температура

Время течения реакции, мин

окраска с йодом

В выводах дать расчет активности амилазы в исследуемой слюне.

6.2. Определение активности каталазы крови по Баху и Зубковой

Каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Высокая концентрация ее найдена в печени и эритроцитах крови. Каталаза катализирует расщепление перекиси водорода, образующейся при тканевом дыхании, и тем самым препятствует накоплению ее в токсических для организма количествах. Перекись водорода разлагается каталазой на воду и молекулярный кислород.

Принцип определения активности каталазы основан на измерении количества перекиси водорода, которое может быть разрушено ферментом в определенных условиях за заданное время. Доля разложившейся перекиси водорода определяется по разности между количеством ее, взятым для опыта (контрольная проба) и оставшимся после действия каталазы (опытная проба) путем титрования перманганатом в кислой среде.

2КМnО4 + 5Н2О2 + ЗН2SО4 → 2Мn5О4 + К2SO4 + 8Н2О + 5О2

Активность фермента выражают каталазным числом и показателем каталазы. Каталазным числом называют количество мг Н2О2, которое разлагается 1 микролитром (1 мкл равен 0,001 мл или мм3) исследуемой крови в условиях опыта.

Показателем каталазы называют отношение каталазного числа к количеству миллионов красных кровяных телец в одном мкл исследуемой крови.

Каталаза содержится почти исключительно в эритроцитах (в строме), и активность ее увеличивается или уменьшается при соответствующих колебаниях их числа. Поэтому при определении активности каталазы рекомендуется сравнивать показатели каталазы, не каталазные числа.

Реактивы и материалы: перекись водорода, 1% раствор, свежеприготовленный, серная кислота, 10% раствор, марганцовокислый калий, 0,1 н. раствор, этиловый спирт, диэтиловый эфир.

Оборудование и посуда: мерная колба на 100 мл, микропипетки на 0,1 мл, конические колбочки, бюретки, пипетки на 1 мл и 2 мл, пипетки на 10 мл с делениями.

Порядок выполнения работы

  1.  В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды.
  2.  Берут кровь из безымянного пальца левой руки. Для этого кончик пальца обмывают стерильной дистиллированной водой, вытирают ватой и делают прокол иглой для взятия крови, предварительно вымытой спиртом и осушенной эфиром .
  3.  Первую выступившую каплю крови стирают сухой ватой. К появившейся новой капле прикасаются кончиком микропипетки, которую держат в горизонтальном положении. Кровь набирают выше метки 0,1 мл, после чего избыток ее удаляют прикосновением кончика пипетки к кусочку сухой ваты.
  4.  Пипетку опускают до дна в приготовленную мерную колбочку с дистиллированной водой и осторожно выдувают 0,1 мл крови. Затем пипетку промывают несколько раз путем втягивания и выливания жидкости.

5. Доливают мерную колбу водой до метки. Содержимое перемешивают и замечают время, когда кровь была разведена. Получается основное разведение крови (1:1000), содержащее в 1 мл 1 мкл крови. Оно используется для определения каталазного числа.

6.В две конические колбочки (опытную и контрольную) наливают по 7—8 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного разведения крови.

7.Содержимое контрольной колбочки кипятят в течение 2 минут для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения.

8.Обе колбочки оставляют стоять при комнатной температуре 30 минут считая с момента разведения крови.

9. В обе колбочки вносят по 2 мл 1% раствора перекиси водорода и вновь оставляют на 30 минут. Наблюдают за выделением пузырьков кислорода в опытной пробе.

10. В каждую колбочку наливают по 1 мл 10% раствора серной кислоты для прекращения действия фермента (в основной пробе) и создания кислой среды, необходимой для последующего титрования. Содержимое колбочек титруют 0,1 н. раствором марганцовокислого калия до розовой окраски.

11. На титрование контрольной пробы раствора марганцовокислого калия пойдет больше, так как каталаза там была инактивирована кипячением и перекись водорода не разлагала. В основной пробе часть перекиси водорода разрушается каталазой. Поэтому на титрование основной пробы раствора марганцовокислого калия затратится меньше. Находят разность между количеством 0,1 н. раствора КМnО4, пошедшим на титрование контрольной и опытной проб.

12. Рассчитывают каталазное число. Исходят из того, что молекулярный вес Н2О2 равен 34, грамм-эквивалент равен 17 г, 1 мл 0,1 н. раствора содержит 0,0017 г или 1,7 мг Н2О2. Так как 1 мл 0,1 н. раствора КМnО4 эквивалентен 1 мл 0,1 н. раствора Н2О2, то, умножив 1,7 на разность между количествами миллилитров 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, пошедшими на титрование в контрольной и опытной пробах, получают количество мг перекиси водорода, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, взятой для анализа, т. е. непосредственно получается каталазное число. В норме оно варьирует от 12 до 22.

Пример расчета. На титрование контрольной пробы ушло 12,3 мл 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, а на титрование опытной пробы – 2,3 мл. Таким образом, каталазой было разложено: 12,3-2,3=10 мл, что соответствует 17 мг перекиси водорода (1,7 мг/мл∙10 мл = 17 мг).

Если определялось также число эритроцитов, то из полученного каталазного числа вычисляют показатель каталазы. У здоровых людей показатель каталазы может быть в пределах от 2,96 до 4,97.

Рекомендации к составлению протокола.

Результаты работы записать в форме таблицы.

Разведение крови

Взято разведённой крови для анализа, мл

Количество 0,1н.раствора KMnO4, пошедшее на титрование, мл

Количество Н2О2, разложенное каталазой

Каталазное число

контроль

опыт

контроль

опыт

мл 0,1 н раствора

мг

В выводах сопоставить величину полученного каталазного числа с нормальными значениями его и оценить активность каталазы.

РАБОТА № 7. ВИТАМИНЫ. КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ВИТАМИНОВ

Витамины — незаменимые низкомолекулярные составные части пищи человека. Многие витамины функционируют как кофакторы ферментов (ретинол, аскорбиновая кислота, тиамин, ниацин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, цианкобаламин), но не все кофакторы ферментов являются витаминами. Некоторые витамины функционируют как биологические антиоксиданты (токоферол, аскорбиновая кислота), другие действуют как кофакторы метаболических реакций окисления-восстановления (токоферол, аскорбиновая кислота ниацин, рибофлавин, пантотеновая кислота). Витамины отличаются от всех других органических пищевых веществ (белков, жиров, углеводов) тем, что они требуются в очень малых количествах, выражающихся в мг и мкг.

Присутствие витаминов в пищевых продуктах и других материалах может быть обнаружено при помощи качественных цветных реакций на витамины или на основании свойства некоторых витаминов флуоресцировать. При этом учитывается способность тех иных витаминов растворяться преимущественно в воде или в липидах.

7.1. Витамин В1 (тиамин, анейрин)

Химически чистый тиамин — бесцветный кристаллический порошок, хорошо растворимый в воде. Тиамин устойчив в кислой среде (например, в желудке), но разрушается в щелочном растворе, поэтому варка пищи в щелочной среде приводит к потере витамина

Витамин B1 представляет собой замещенный пиримидин, связанный метиленовой группой с замещенным тиазолом. В виде своего пирофосфорного эфира он в организме животных и человека, в комплексе с другими коферментами — липоевой кислотой, коэнзимом A (HS—КоА), НАД+, ФАД — входит в состав ферментной системы, осуществляющей окислительное декарбоксилирование -кетокислот (пировиноградной, -кетоглутаровой). При отсутствии или недостаточном поступлении в организм тиамина окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты и последующее ее окисление нарушаются, что приводит к накоплению этой кислоты в тканях. Особенно резкие нарушения в превращениях пировиноградной кислоты наблюдаются в мозгу. Это выражается в различных расстройствах функции центральной и периферической нервной системы (невриты, параличи и др.).

Реакция окисления витамина В1 в тиохром (2,7-диметилтиохромин-8-этанол)

Реакция основана на способности тиамина окисляться в щелочной среде под действием красной кровяной соли в тиохром, который извлекается из раствора изобугиловым спиртом и дает в ультрафиолетовых лучах сине-голубую флюоресценцию.

Реактивы и материалы: тиамин в порошке, железосинеродистый калий, 5% раствор, гидроксид натрия, 30% раствор, изобутиловый спирт.

Оборудование и посуда: стеклянные лопаточки, штатив с пробирками, капельницы, капилляры, микропипетки, сухие стеклянные пробирки из нефлюоресцирующего стекла, флюороскоп.

Порядок выполнения работы

  1.  Щепотку (на кончике стеклянной лопаточки) порошка тиамина растворяют в пробирке в 5—10 каплях воды.
  2.  К раствору тиамина прибавляют 5 капель 5% раствора железосинеродистого калия, 10 капель 30% раствора гидроксида натрия и тщательно перемешивают.
  3.  Через 5—10 минут прибавляют 15 капель изобутилового спирта, интенсивно взбалтывают в течение 1/2—1 минуты и дают отстояться.
  4.  Верхний спиртовой слой при помощи капилляра или микропипетки переносят в сухую стеклянную пробирку из нефлюоресцирующего стекла и наблюдают голубую флюоресценцию этого раствора в ультрафиолетовых лучах.

7.2. Витамин В2 (рибофлавин)

Витамин В2 — оранжево-желтое кристаллическое вещество, трудно растворимое в воде. Наиболее богатыми источниками этого витамина являются дрожжи, яичный желток, молоко, печень, мясо. Суточная потребность взрослого человека в витамине В2 составляет 1,5—2,5 мг. Рибофлавин представляет собой замещенный изоаллоксазин, связанный с D-рибитолом. В виде рибофлавин-5'-фосфата он входит в состав простетической группы (ФАД) флавиновых ферментов организма человека и животных. При недостаточности рибофлавина нарушаются окислительно-восстановительные процессы, что влечет выпадение волос, заболевание глаз, воспалительное поражение слизистых ротовой полости и губ, а также прилежащих участков кожи и др.

Реакция восстановления витамина В2

Реакция основана на способности рибофлавина легко восстанавливаться и вновь окисляться. При восстановлении водород присоединяется к азоту по месту двойных связей в изоаллоксазиновом кольце.

Источником водорода служит реакция взаимодействия соляной кислоты с металлическим цинком. Выделяющийся водород восстанавливает рибофлавин (раствор желтого цвета) через розовый (или красный) родофлавин (промежуточный продукт) в бесцветное соединение — лейкофлавин.

Реактивы и материалы: витамин В2, 0,025% раствор, концентрированная соляная кислота, цинк металлический.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Отмеривают в пробирку 10 капель 0,025% раствора рибофлавина, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и небольшой кусочек металлического цинка. Тотчас же наступав бурное выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска бледнеет и, наконец, жидкость обесцвечивается.
  2.  При взбалтывании обесцвеченного раствора с воздухом лейкосоединение вновь окисляется в рибофлавин.

Поскольку витамин В2 участвует в построении флавиновых ферментов, описанная реакция демонстрирует механизм действия ферментов в процессе тканевого дыхания.

7.3. Витамин Вб (пиридоксин, адермин)

Витамин В6 — бесцветные кристаллы, хорошо растворимые в воде и спирте. Устойчив к нагреванию, щелочам и кислотам, разрушается на свету, особенно при действии ультрафиолетовых лучей. Хорошо сохраняется при кулинарной обработке пищи, а также при консервировании пищевых продуктов. Пиридоксин — общее название группы веществ, обладающих активностью витамина В6, к которой принадлежат пиридоксол, пиридоксаль и пиридоксамин.

Эти соединения в организме человека легко переходят друг в друга. Пиридоксаль и пиридоксамин являются коферментами ферментов, участвующих в основном в белковом обмене, в частности в превращениях аминокислот (в трансаминировании, декарбоксилировании и др.). Поскольку с обменом аминокислот связан синтез многих биологически важных веществ (гистамина, витамина РР, и др.), недостаток в пиридоксине приводит к глубоким нарушениям биохимических процессов в организме. Наиболее богатыми источниками витамина В6 являются зародыши пшеницы, дрожжи и печень. 

Реакция витамина Вб с хлорным железом

При взаимодействии витамина В6 с хлорным железом образуется комплексное соединение типа фенолята железа, окрашенное в красный цвет. Реакция обусловлена наличием в молекуле витамина В6 фенольного гидроксила в 3-м положении пиримидинового кольца.

Аналогичная реакция с такой же окраской получается при взаимодействии хлорного железа с раствором пирогаллола.

Реактивы и материалы: витамин Вб, 5% раствор, хлорное железо, 5% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

В пробирку вносят 5—10 капель 5% водного раствора витамина В6 и добавляют 1—2 капли 5% раствора хлорного железа. После встряхивания смеси возникает красная окраска жидкости.

7.4.Витамин В12 (цианкобаламин, антианемический)

Витамин В12 представляет собой игольчатые кристаллы рубиново-красного цвета благодаря присутствию кобальта. Хорошо растворим в воде и спирте. Недостаток витамина В12 у человека является причиной возникновения злокачественной анемии, для которой характерны нарушение кроветворной функции костного мозга (уменьшение числа эритроцитов, появление овалоцитов, макроцитов и мегалобластов) расстройство нервной системы. Производные витамина В12 выполняют роль коферментов во многих обменных процессах. Они носят название кобамидные коферменты. Ферменты, имеющие в своем составе кобамидные коферменты, участвуют в обмене метильной группы. Они, например, катализируют метилирование пиримидинового кольца при синтезе тимина.

Витамин В12 находится главным образом в продуктах животного происхождения. Наиболее богата им печень рогатого скота и цыплят. 

Открытие кобальта, содержащегося в витамине В12, реакцией с тиомочевиной

Витамин В12 — это единственный витамин, в молекуле которого содержится кобальт (4,5%). Его можно обнаружить после минерализации раствора витамина и последующей обработки тиомочевиной.

Корриновое ядро кобаламина (заместители при пирролах и двух других кобальтовых лигандах не показаны)

Реактивы и материалы: раствор витамина В12 в ампулах, серная кислота, концентрированная, тиомочевина, 10% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы, штатив с сеткой, беззольные фильтры.

Порядок выполнения работы

1.Вскрывают ампулу с раствором витамина В12 и переносят содержимое в пробирку.

2. Добавляют 3—5 капель концентрированной серной кислоты, закрепляют пробирку в штативе в несколько наклонном положении и производят сжигание до обесцвечивания в вытяжном шкафу.

3. После обесцвечивания жидкости к минерализату добавляют осторожно, понемногу, перемешивая, приблизительно 1 мл воды.

4.Наносят 2—3 капли 10% раствора тиомочевины на беззольный фильтр и высушивают над сеткой горелки.

5.После высушивания наносят на фильтр 1—2 капли полученного минерализата и вновь нагревают фильтр над сеткой. На фильтре, чаще по краю пятна, получается зеленое окрашивание, доказывающее присутствие кобальта в молекуле витамина В12.

7.5. Витамин РР (никотинамид, антипеллагрический)

Витамином РР являются никотиновая кислота и ее амид. Они обладают витаминной активностью в одинаковой мере. Никотиновая кислота представляет собой игольчатые кристаллы белого цвета, растворимые в воде и спирте. В организме из никотиновой кислоты, или никотинамида, образуются никотинамидаденшщинуклеотид (НАД) и никотинамид- адениндинуклеотидфодфат (НАДФ), участвующие в качестве коферментов в окислительно-восстановительных реакциях, катализируемых дегидрогеназами.

никотиновая кислота

никотинамид

У человека при отсутствии витамина РР в пище возникает пеллагра — заболевание, характеризующееся поражением кожи, расстройствами деятельности желудочно-кишечного тракта и нервной системы. Наиболее богаты витамином РР дрожжи, печень, почки. Суточная потребность в этом витамине 15—25 мг для взрослых и 15 мг для детей.

7.5.1. Качественная реакция на никотиновую кислоту с уксуснокислой медью

Реакция основана на том, что никотиновая кислота, имея в своей молекуле карбоксильную группу, образует соли. Медная соль никотиновой кислоты является труднорастворимым веществом голубого или синего цвета. Свинцовая соль имеет белый цвет.

Реактивы и материалы: никотиновая кислота в порошке, уксусная кислота, 10% раствор, уксуснокислая медь, 5% раствор или уксуснокислый свинец, 5% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. 5—10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10—20 каплях 10% раствора уксусной кислоты. 

2. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем раствора уксуснокислой меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает осадок синего цвета медной соли никотиновой кислоты.

7.5.2. Обнаружение пиридинового кольца в молекуле витамина РР

Никотиновая кислота является производным пиридина. Реакция основана на разрушении никотиновой кислоты при нагревании ее с содой с образованием свободного пиридина, имеющего своеобразный запах.

Реактивы и материалы: никотиновая кислота в порошке, углекислый натрий, безводный, в порошке.

Оборудование и посуда: стеклянные лопаточки, штатив с пробирками.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку помещают немного соды в порошке (на кончике г стеклянной лопаточки) и добавляют равное количество никотиновой кислоты.
  2.  Нагревают смесь в пламени горелки в вытяжном шкафу при включенной тяге. Устанавливают выделение пиридина по появлению характерного запаха.

7.6. Витамин С (аскорбиновая кислота, антицинготный)

Витамин С — кристаллы кислого вкуса, растворимые в воде. Не имея свободной карбоксильной группы, витамин С тем менее обладает кислыми свойствами вследствие диссоциации одного из енольных гидроксилов и способности его реагировать с катионами металлов, образуя соли (аскорбинаты). В кристаллическом виде аскорбиновая кислота устойчива, но легко разрушается в водных растворах. В основе качественных реакций и количественных методов определения аскорбиновой кислоты лежит окислительно-восстановительный процесс: аскорбиновая кислота окисляется дегидроаскорбиновую, а другое вещество (например, 2,6-дихлорфенолиндофенол) восстанавливается. Аскорбиновая кислота в oрганизме способствует некоторым окислительным процессам, например образованию стероидных оксигормонов в коре надпочечников, необходима для превращения фолиевой кислоты в фолиновую и параоксифенилпировиноградной кислоты в гомогентизиновую (при обмене тирозина), играет роль в образовании дезоксирибонуклеиновой кислоты и коллагена. Она предохраняет от окисления адреналин, тормозит действие фермента гиалуронидазы. При недостатке витамина С в пище у человека развивается цинга. При цинге повышается xpyпкость сосудов, возникают кровоизлияния, повреждаются кости особенно зубы, что связано с дегенеративным превращением специализированных клеток (одонтобластов и остеобластов) в соединительнотканные.

Суточная потребность в аскорбиновой кислоте взрослого человека при средних затратах физического труда — 50 мг. Индивидуальные отклонения от средней потребности в витамине С зависят от возраста, особенностей и состояния организма. Богаты витамином С лимоны, черная смородина, шиповник, хвоя, из животных продуктов — печень.

7.6.1. Реакция на витамин С железосинеродистым калием

Реакция основана на том, что аскорбиновая кислота, окисляясь в дегидроаскорбиновую в щелочной среде, может восстанавливать железосинеродистый калий до железистосинеродистого, последний взаимодействии с хлорным железом в кислой среде образует берлинскую лазурь.

Реактивы и материалы: вытяжка из шиповника, гидроксид натрия, 10% раствор, железосинеродистый калий, 5% раствор, соляная кислота, 10% раствор, хлорное железо, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку отмеривают 10 капель вытяжки из шиповника, добавляют 2 капли 10% раствора гидроксида натрия, 2 капли 5% раствора железосинеродистого калия и перемешивают.
  2.  К содержимому пробирки добавляют 6 капель 10% раствора соляной кислоты и 2 капли 1% раствора хлорного железа. Выпадает синий осадок берлинской лазури, свидетельствующий о присутствии аскорбиновой кислоты в вытяжке из шиповника.
  3.  Для контроля проделывают ту же реакцию, беря вместо вытяжки из шиповника дистиллированную воду. Появляется бурое окрашивание жидкости, обусловленное образованием железосинеродистой соли окиси железа.

7.6.2. Качественная реакция на витамин С с метиленовой синью

Реакция обусловлена окислением аскорбиновой кислоты и восстановлением метиленовой сини в бесцветную лейкоформу:

Реактивы и материалы: вытяжка из шиповника, метиленовая синь, 6,01% раствор, натрий кислый углекислый, 10% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку наливают 2 капли 10% раствора метиленовой сини, 2 капли 10% раствора соды, 10 капель вытяжки из шиповника и нагревают. Жидкость обесцвечивается.
  2.  Для контроля проделывают ту же реакцию, беря вместо вытяжки из шиповника дистиллированную воду. Обесцвечивания жидкости не происходит.

7.6.3. Качественная реакция на витамин С с 2,6-дихлорфенолиндофенолом

За счет окисления аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую происходит восстановление индикатора 2,6-дихлорфенолиндофенола в лейкосоединение:

Реактивы и материалы: вытяжка из шиповника, 2,6-дихлорфенолиндофенол, 0,02% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В две пробирки наливают по 10 капель 0,02% раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.
  2.  В одну из пробирок добавляют 10 капель вытяжки из шиповника, в другую 10 капель воды. Жидкость в пробирке с вытяжкой шиповника, обесцвечивается.

7.7. Витамин А (ретинол)

При недостатке витамина А синтез зрительного пурпура задерживается, сетчатка плохо воспринимает световые раздражения — наступает гемералопия («куриная слепота»). Витамин А необходим для поддержания нормального состояния эпителия. При авитаминозе А поражаются все виды эпителиальных клеток: эпителий роговой оболочки глаз (ксерофталмия и кератомаляция), кожи (сухость, кератозы), дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и др. Богаты витамином А сливочное масло, яичный желток, печень, жир из печени некоторых морских рыб, например трески (тресковый или рыбий жир). Провитамины витамина А — каротины — являются продуктами растительного происхождения.

Суточная потребность в витамине А для взрослого человека составляет 1—2,5 мг витамина А или 2—5 мг β-каротина. Витамин А и каротины в безводной среде дают с треххлористой сурьмой окрашенные продукты реакции. Эта реакция используется для качественного и количественного определения витамина А и каротина. Интенсивность окраски пропорциональна их содержанию в исследуемом материале.

7.7.1. Открытие витамина А в рыбьем жире с концентрированной серной кислотой

Реактивы и материалы: рыбий жир, свежий, хлороформ, сухой, серная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В сухой пробирке растворяют 1—2 капли рыбьего жира в 10 каплях хлороформа.
  2.  Добавляют 1—2 капли концентрированной серной кислоты, встряхивая после каждой капли. Появляется голубое или фиолетовое окрашивание, быстро переходящее в буро-красное. Реакция неспецифична.

7.7.2. Открытие каротина в шиповнике и обнаружение в нем ненасыщенных связей

Каротин открывается по появлению окраски при взаимодействии с треххлористой сурьмой или концентрированной серной кислотой.

Наличие в его молекуле ненасыщенных связей можно обнаружить по обесцвечиванию бромной воды, т. е. по способности каротина как соединения, имеющего двойные связи, присоединять бром по месту их разрыва:

-каротин

Реактивы и материалы: шиповник, сухой, хлороформ, сухой, треххлористая сурьма, насыщенный раствор в хлороформе, серная кислота, концентрированная, бромная вода.

Оборудование и посуда: фарфоровая ступка с пестиком, воронка с бумажным фильтром, штатив с пробирками (сухими), капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Одну-две сухие ягоды шиповника растирают в ступке, затем добавляют 2—3 мл хлороформа и растирание продолжают еще 1 минуту.
  2.  Содержимое ступки фильтруют через заранее приготовленный фильтр в сухую пробирку. Фильтрат окрашен каротинами в оранжевый цвет.
  3.  В сухой пробирке к нескольким каплям хлороформной вытяжки, содержащей каротин, добавляют около 20 капель раствора хлористой сурьмы в хлороформе. Появляется голубая окраска, которая даже при длительном стоянии не переходит в розово-фиолетовую.
  4.  В сухую пробирку вносят несколько капель хлороформной вытяжки и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется синяя окраска, переходящая в зеленую.
  5.  К нескольким каплям хлороформной вытяжки добавляют 1—2 капли бромной воды и встряхивают. Бромная вода обесцвечивается. В ходе реакции происходит не только обесцвечивание брома, но и обесцвечивание самого каротина. Избыток бромной воды добавлять не следует, так как он вызывает окрашивание хлороформного слоя.

7.8. Витамин D (кальциферол, антирахитический)

Известно несколько витаминов группы D (кальциферолы). Они образуются из провитаминов путем воздействия ультрафиолетового света. Провитаминами являются стерины, у которых в кольце В имеются две двойные связи. Естественным витамином, находящимся в тканях животного и человека, а также в рыбьем жире, является витамин D3 (холекальциферол), который образуется из 7-дегидрохолестерина в коже под влиянием ультрафиолетовых солнечных лучей. Витамин D2 (эргокальциферол) представляет собой искусственный продукт, полученный при ультрафиолетовом облучении эргостерина, содержащегося в растениях. Он применяется для лечебных целей и витаминизации пищевых продуктов.

Он путем стимуляции синтеза белка, связывающего кальций, увеличивает активное всасывание кальция и фосфатов в кишечнике. Кроме того, 1,25-(OH)2D3 влияет на обмен кальция и фосфоратов в костях и их реабсорбцию в почечных канальцах. Основные проявления недостаточности этого витамина касаются костной системы. Недостаток витамина D у детей приводит к возникновению рахита. Это приводит к деминерализации костей, их размягчению и искривлению. Суточная потребность маленьких детей в витамине D — 13-25 мкг, что составляет 500—1000 ме (1 ме = 0,025 мкг витамина D2 или D3). Богаты витамином D печеночный жир морских рыб, сливочное масло, желтки яиц.

Обнаружение витамина D в рыбьем жире с анилиновым реактивом

Реактивы и материалы: рыбий жир, анилиновый реактив (15 частей анилина и 1 часть концентрированной соляной кислоты).

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Отмеряют в сухую пробирку 10 капель смеси анилина с концентрированной соляной кислотой и прибавляют 5 капель рыбьего жира.
  2.  Содержимое пробирки осторожно при постоянном пepeмешивании нагревают до кипения и кипятят в течение 30 секунд.

В присутствии витамина D желтая эмульсия приобретает вначале грязно-зеленое, а затем буро-красное или красное oокрашивание.

7.9. Витамин Е (токоферолы, витамин размножения)

Под общим названием витамина Е известен ряд веществ, дающих витаминными свойствами и являющихся производными хромана. Самым активным из них является α-токоферол, выделяемый из масла пшеничных зародышей. Токоферолы в чистом виде представляют собой светло-жёлтое вязкое жидкое масло, не растворимы в воде, но растворимы в жирах и жирорастворителях. Они устойчивы к воздействию кислот к нагреванию (до 170оС), находясь в пищевых продуктах, стойки кулинарной обработке. Витамин Е необходим для процессов размножения. При отсутствии в пище крыс этого витамина у животных развивается бесплодие. Наиболее богаты витамином Е масла из зародышей пшеницы, семян яблок, шиповника, из облепихи, кукурузы, сои. Он содержится в семенах злаков, в мясе, жире, печени, в яичном желтке, масле, молоке. Для усвоения организмом витамина Е необходимо наличие желчи в кишечном содержимом.

Витамин Е обладает противоокислительным действием: он тормозит окисление ненасыщенных жирных кислот и тем самым предохраняет от разрушения ненасыщенные липиды, входящие в состав таких важных клеточных структур, как митохондрии. Задерживая окисление ненасыщенных жирных кислот, витамин Е уменьшает прогоркание жиров, а также окисление каротина и витамина А, находящихся вместе с ним в продуктах питания.

Качественная реакция на витамин Е с концентрированной азотной кислотой

Витамин Е окисляется при действии сильных окислителей (марганцовокислый калий, азотная кислота). Данная реакция обусловлена окислением токоферолов под влиянием концентрированной азотной кислоты в соединения, имеющие хиноидную структуру и окрашенные в красный цвет.

Реактивы и материалы: токоферол, спиртово-сахарный раствор, 0,1%, азотная кислота, концентрированная.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1% спиртово-сахарного раствора витамина Е и добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты.

  1.  Содержимое пробирки встряхивают. Образуется эмульсия, которая постепенно окрашивается в красный цвет.
  2.  Эмульсию оставляют стоять до расслоения. Окраска остается в верхнем масляном слое.

7.10. Витамин К (филлохинон, антигеморрагический)

Витамин К1 (филлохинон, получен из люцерны) — желтое масло, не растворимое в воде, легко разрушаемое светом и щелочами. Устойчив к нагреванию в нейтральной среде. Витамин К2 (фарнохинон, получен из гниющей рыбной муки) — желтый кристаллический порошок, в воде не растворим, неустойчив к нагреванию и к ультрафиолетовым лучам. Его биологическая активность ниже витамина К1. Оба витамина синтезированы. Витамин К является производным 2-метил-1,4-нафтохинона.

Витамин К необходим для синтеза клетками печени ряда факторов свертывания крови. В остатки глутаминовых кислот белковых молекул этих факторов вводится еще одна карбоксильная группа. Образуются остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты, через которые происходит присоединение ионов кальция. Поэтому после введения в организм антагонистов витамина К время свертывания крови увеличивается. При авитаминозе К появляются подкожные и внутримышечные кровоизлияния, содержание протромбина в крови понижается. Наиболее богаты витамином К капуста, шпинат, плоды рябины, печень.

Реактивы и материалы: витамин К, насыщенный раствор в этаноле, диэтилдитиокарбамат натрия, 2% раствор в этаноле, гидроксид натрия, 4% раствор в этаноле.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1.В пробирку вносят 4 капли спиртового раствора витамина К, добавляют 8 капель раствора диэтилдитиокарбамата натрия и 4 капли спиртового раствора гидроксида натрия.

2.Содержимое пробирки встряхивают. Постепенно появляется красное окрашивание жидкости.

Рекомендации к составлению протокола 

Занести результаты всех реакций на витамины в таблицу.

№ п/п

Материал, содержащий витамин

Название витамина

Употребляемые реактивы и материалы

Наблюдаемые окраски жидкости, осадка, появление запаха, обесцвечивание жидкости

На чём основана реакция

РАБОТА № 8. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ВИТАМИНОВ

8.1. Определение витамина С йодометрическим методом

Сущность метода заключается в изменении окраски йода при добавлении гипоиодита калия в зависимости от содержания витамина С (аскорбиновой кислоты). Метод предназначен для анализа содержания витамина С в пищевых продуктах растительного, животного и другого происхождения в сильно окрашенных растворах.

Реактивы и материалы: картофель, капуста, 1% раствора соляной кислоты, 2% раствор метафосфорной кислоты, кристаллики KI, 1% раствор крахмала, 0,001 н раствор гипоиодита калия, 2% раствор фосфорной кислоты.

Оборудование и посуда: гомогенизатор, мерная колба вместимостью 100 мл, шейкер, фильтровальная бумага, конические колбы вместимостью 100 мл, микробюретки.

Порядок выполнения работы

10 г измельченной навески (картофеля или капусты) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, заливают 20 мл 1% раствора соляной кислоты, смесь встряхивают, доводят объем до метки 2% раствором метафосфорной кислоты, выдерживают в течение 10 мин для более полного растворения витамина С. Содержимое колбы фильтруют через бумагу.

По 10 мл фильтрата отбирают в 3 конические колбы вместимостью 100 мл. В две колбы добавляют по кристаллику KI и 3 капли 1% раствора крахмала, полученные растворы титруют 0,001 н раствором гипоиодита калия из микробюретки. Даже в интенсивно-розовых растворах заметна фиолетовая окраска, появляющаяся от добавления 1 капли титранта. Для сравнения окраски третья колба должна стоять рядом.

Параллельно проводят титрование 10 мл 2% раствора Н3РО4 (контрольное титрование).

Расчет. Содержание витамина С (X, мг/100 г продукта) вычисляют по формуле:

Х= V1∙ V2 ∙К∙0,088∙100/V3∙g,

где V1 - объем раствора 0,001 н раствора гипоиодита калия, израсходованного на титрование за вычетом поправки на контрольное титрование, мл; V2 - объем испытуемой пробы, мл; g - навеска образца, взятого для анализа, г; V3 - объем анализируемого раствора, взятого на титрование, мл; 0,088 - количество аскорбиновой кислоты, точно соответствующей 1 мл 0,001 н раствора гипоиодита калия; К - поправка на титрование раствора.

Поправочный коэффициент устанавливают по 0,01 н раствору соли Мора. Титр соли Мора определяют по 0,01 н КМпО4, а титр раствора перманганата по 0,01 н раствору Н2С2О4. Для этого 1 мл концентрированной серной кислоты добавляют к 10 мл 0,01 н раствора Н2С2О4. Смесь нагревают до 80°С и титруют до слабо-розового окрашивания 0,01 н раствором КМnО4 (расход раствора В, мл). Затем титруют соль Мора, для этого к 10 мл раствора соли Мора добавляют 3 капли концентрированной серной кислоты и титруют 0,01 н КМпО4 (расход раствора V1, мл) до появления устойчивой слабо-розовой окраски. Далее титруют 0,001 н раствор гипоиодита калия. Для этого к 10 мл добавляют 5 мл насыщенного раствора оксалата натрия и титруют из микробюретки раствором соли Мора до перехода окраски в соломенно-желтую (расход раствора V2, мл). Поправку К рассчитывают по формуле:

К= V1 ∙ V2/В

Результаты определений рассчитывают до второй значащей цифры и округляют до первого знака после запятой.

За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое результатов (X) двух параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать 25% по отношению к среднему арифметическому при Р=0,95. (При независимом определении 60%).

8.2. Количественное определение витамина Р (рутина) в чае

Известно несколько соединений, обладающих Р-витаминной активностью. В основе их лежит скелет флавона.

Наиболее изучены строение и свойства рутина.

Рутин - кристаллическое вещество желто-оранжевой окраски. Содержится во всех продуктах, в которых обнаруживается витамин С. Много его в чае, фруктах, ягодах (бруснике, клюкве, сливе, винограде). Рутин участвует в окислительно-восстановительных процессах. Его присутствие усиливает окислительно-восстановительный эффект витамина С.

Количественное определение рутина основано на его способности окисляться перманганатом калия. В качестве индикатора применяют индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом после полного окисления всего рутина. Экспериментально установлено, что 1 мл 0,05 н раствора перманганата калия окисляет 3,2 мкг (0,00506 мкмоль) рутина. В черном чае содержится 300-500 мг/кг (474-790 мкмоль/кг) рутина.

Реактивы и материалы: черный или зеленый чай, дистиллированная вода, индигокармин.

Оборудование и посуда: конические колбы, пипетки.

Порядок выполнения работы

К 0,1 г черного или зеленого чая приливают по 50 мл горячей дистиллированной воды и проводят экстракцию в течение 5 мин. Отмеривают в конические колбочки по 10 мл экстракта, добавляют по 10 мл дистиллированной воды и 10 капель индигокармина. Титруют раствором перманганата калия до появления устойчивой желтой окраски. Расчеты производят по формуле:

Х= 3,2∙(0,00506)а∙50∙1000/10∙0,1 (мкг(мкмоль)/кг),

где 3,2(0,00506) - количество рутина (мкг, мкмоль), соответствующее 1 мл 0,05н раствора перманганата калия; а- количество 0,05 н раствора перманганата калия, израсходованное на титрование, мл; 10 - количество вытяжки, взятое для титрования, мл; 50 - общий объем экстракта; 0,1 - масса сухого вещества, мг; 1000- коэффициент пересчета на 1 кг сухого вещества.

РАБОТА № 9. УГЛЕВОДЫ

Углеводы - обширный класс соединений, широко распространенных в природе. По химической природе это органические вещества, представляющие собой альдегиды или кетоны многоатомных спиртов.

9.1. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УГЛЕВОДОВ

Метод основан на неодинаковой способности углеводов адсорбироваться на тех или иных адсорбентах и различной растворимости в смешивающихся жидкостях. Для идентификации углеводов на хроматограммах используют метчики, входящие в состав смеси и нанесенные на ту же хроматограмму. Степень подвижности углеводов на хроматограмме выражают через соотношение пути, пройденного данным соединением от линии старта к расстоянию, пройденному фронтом растворителя (Rf):

Rf = a/b,

где а - расстояние от линии старта до центра пятна; b - расстояние от старта до финиша.

Реактивы и материалы: 5%-ные водные растворы углеводов, разделяющая смесь состава: н-бутанол - уксусная кислота - вода (60 мл-15 мл-25 мл), реагентдля проявления состава: н-бутанол - вода - уксусная кислота - фосфорная кислота - анилин дефиниламин (60 мл-25 мл-15 мл- 10 мл-1 мл- 2 г).

Оборудование и посуда: хроматографические пластины, хроматограическая камера, термостат.

Порядок выполнения работы

На пластины наносят 1 мл 5% водного раствора углеводов в виде сплошной полосы длиной 2-5 мм, отступая от бокового и нижнего краев пластины на расстояние 1 см. Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью до высоты 0,5 см. Состав разделяющей смеси: н-бутанол - уксусная кислота - вода (60 мл-15 мл-25 мл). Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути, составляющая 9 см. По окончании разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре в вытяжном шкафу до испарения остатков растворителя.

Высушенные пластинки погружают в реагент, представляющий собой смесь: н-бутанол - вода - уксусная кислота - фосфорная кислота - анилин дефиниламин (60 мл-25 мл-15 мл- 10 мл-1 мл- 2 г). Пластинки снова высушивают и проявляют в термостате при температуре 120 °С в течение 5 минут. После проявления сопоставляют расположение пятен углеводов, которое будет различным в силу разной степени подвижности веществ.

9.2. РЕАКЦИИ НА ОТКРЫТИЕ УГЛЕВОДОВ. СВОЙСТВА УГЛЕВОДОВ

9.2.1. Реакция «серебряного зеркала»

Как и у всех альдегидов, окисление моносахаридов приводит к соответствующим кислотам. Так, при окислении глюкозы аммиачным раствором гидрата окиси серебра образуется глюконовая кислота.

Реактивы и материалы: 0,2 н раствор нитрата серебра, раствор гидроксида натрия 2 н., раствор аммиака 2 н., раствор глюкозы 0,5%, раствор фруктозы 0,5%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В большую пробирку поместите 3 капли 0,2 н раствора AgNO3, 5 капель 2 н NaOH и добавляйте по каплям 2 н NH4OH до полного растворения образующегося осадка. Полученный бесцветный раствор - аммиачный раствор гидрата окиси серебра.

Затем к аммиачному раствору гидрата окиси серебра добавьте 3-4 капли 0,5% раствора глюкозы и слегка подогрейте. Металлическое серебро выделится либо в виде осадка черного цвета, либо в виде блестящего зеркального налета, если стенки пробирки химически чисты. Запишите уравнения реакций.

Аналогичный опыт проделайте с 0,5% раствором фруктозы.

9.2.2. Реакция Селиванова (открытие фруктозы)

Фруктоза содержится в зеленых растениях и нектаре. Особенно ее много в плодах, поэтому ее второе название — плодовый сахар. Фруктоза гораздо слаще других сахаров.

-D-фруктоза

Реактивы и материалы: раствор фруктозы 0,5%, раствор глюкозы 0,5%, реактив Селиванова (0,5% раствор резорцина в 20% соляной кислоте).

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В первую пробирку вносят 10 капель 0,5% раствора фруктозы, во вторую пробирку - 10 капель 0,5% раствора глюкозы. В обе пробирки добавляют в равных объемах свежеприготовленный реактив Селиванова (0,5% раствор резорцина в 20% соляной кислоте). Осторожно нагрейте. На 1-й стадии с фруктозой образуется оксиметилфурфурол, который во 2-й стадии, конденсируясь с резорцином, дает красный цвет.

9.2.3. Проба Бенедикта на глюкозу

Глюкоза — самая распространенная из моноз как в растительном, так и в животном мире. Содержится в свободном виде в зеленых частях растений, семенах, различных фруктах и ягодах. В больших количествах содержится в винограде — отсюда происходит ее другое название — виноградный сахар.

-D-глюкоза

Реактивы и материалы: Реактив Бенедикта (в колбу на 1 л наливают 700 мл дистиллированной воды, добавляют 173 г лимоннокислого натрия (Na3C6H507-11 H2O), 100 г безводного (или 200 г кристаллического) углекислого натрия. Нагревают до растворения. Отдельно растворяют 17,3 г сернокислой меди в 100 мл воды. Смешивают оба раствора, непрерывно взбалтывая, и после охлаждения доливают до 1 л дистиллированной водой в мерной колбе), раствор глюкозы 5%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В пробирку наливают 5 мл реактива Бенедикта и прибавляют 0,5 мл 5% раствора глюкозы. Перемешивают и нагревают 1 мин на пламени или 5 мин на водяной бане. Раствор охлаждают и через 5 минут отмечают результаты. При наличии глюкозы раствор окрашивается в зеленый, желтый или красный цвет, на дне образуется осадок.

9.2.4. Реакция Молиша

Пентозы с -нафтолом в присутствии серной кислоты образуются продукты конденсации, имеющие окраску от красной до синей.

Реактивы и материалы: раствор глюкозы, спиртовый раствор -нафтола, концентрированная серная кислота.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

К 1 мл раствора глюкозы добавляют 1-2 капли спиртового раствора -нафтола, затем по стенке пробирки к смеси осторожно приливают 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы кислота не смешивалась с водным слоем. Появление темно-фиолетового кольца на границе двух слоев указывает на присутствие углевода или вещества, содержащего углевод.

9.2.5. Цветная реакция с ванилином на фруктозу

Эта реакция основана на конденсации продуктов расщепления фруктозы с ванилином, причем, в зависимости от концентрации углевода, получается слабо розовое и красное окрашивание.

Реактивы и материалы: ванилиновый реагент (растворяют 0,2 г ванилина в смеси 25 мл концентрированной соляной кислоты 75 мл 85% фосфорной кислоты, хранить в закрытой темной склянке), раствор фруктозы 1%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, водяная баня, лед.

Порядок выполнения работы

1 мл раствора фруктозы 1% - смешать с 5 мл ванилинового реагента и нагреть две минуты на водяной бане, после чего быстро охладить в ледяной воде.

9.2.6. Реакция Подобедова-Милыша

Рибоза - моносахарид (альдопентоза), входит в состав РНК, динуклеотидов и др. биологически активных веществ.

Реактивы и материалы: раствора рибозы 5%, -нафтол, тимол, концентрированная серная кислота.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В 2 пробирки налить по 2 мл раствора рибозы. В 1-ю добавить 1 мл -нафтола, во 2-ю 1 мл тимола. В обе пробирки осторожно по стенке добавить концентрированной серной кислоты. На границе раздела фаз жидкостей образуется красное кольцо.

9.2.7. Реакция пентоз с уксуснокислым анилином

Реактивы и материалы: любая порошкообразная пентоза, раствор соляной кислоты, анилин, уксусная кислота.

Оборудование и посуда: пробирки, фильтровальная бумага, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В пробирку поместить несколько крупинок любой пентозы и прилить 2 мл раствора соляной кислоты (1:1). На фильтровальную бумагу нанести 2 капли анилина и 2 капли уксусной кислоты. Затем подносят эту бумажку у отверстию пробирки со смесью пентозы с соляной кислотой и кипятят реакционную смесь. Через 1-2 минуты на бумаге появляется розово-красное пятно. Образуется фурфурол.

Фурфурол

9.2.8. Проба Гайнеса

Проба основана на свойстве глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди в гидрат закиси меди (желтый цвет) или закись меди (красный цвет).

Реактивы и материалы: реактив Гайнеса (13,3 г кристаллического сульфата меди растворяют в 400 мл воды; 15 г глицерина разводят в 200 мл воды; 50 г NaOH растворяют в 400 мл воды, смешивают первый и третий растворы и тотчас приливают второй), раствор глюкозы 5%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель, водяная баня.

Порядок выполнения работы

К 1-2 мл реактива Гайнеса приливают 10 капель 5% раствора глюкозы, кипятят или ставят на кипящую водяную баню. В присутствии глюкозы появляется желтая или красная окраска жидкости и осадок.

9.2.9. Восстановление глюкозы и отсутствие восстановления фруктозы

У восстанавливающих углеводов имеется свободный полуацетального гидроксил, который определяет восстанавливающие свойства и реакции, свойственные моносахаридам. У невосстанавливающих углеводов не содержится свободного полуацетального гидроксила и не проявляются характерные реакции для альдегидной группы.

Реакция Троммера

Реакция Беккереля-Троммеpa, обычно носящая название реакции Троммера, основана на способности глюкозы восстанавливать в щелочном растворе окись меди в закись меди.

Реактивы и материалы: раствор глюкозы 0,5 %, гидроксид натрия 2 н., сульфат меди 0,2 н, раствор фруктозы 0,5%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В большую пробирку поместите 0,5 мл 0,5 % раствора глюкозы и 6-8 капель 2 н NaOH. Затем по каплям добавляйте 0,2 н раствор CuSO4, пока не прекратится его растворение. Осторожно нагрейте пробирку. Голубой не растворимый в воде осадок гидрата окиси меди постепенно переходит в желтый, а затем в красный осадок закиси меди. Аналогичный опыт проделайте с 0,5% раствором фруктозы.

9.2.10. Реакция Барфеда

Реакция Барфеда позволяет отличить моносахариды от дисахаридов мальтозного типа, обладающих восстанавливающими свойствами (лактозы, мальтозы, целлобиозы). Она основана на том, что восстанавливающие свойства моносахаридов сохраняются также в кислой среде, тогда как днсахариды восстанавливают металлы только при щелочной реакции. При взаимодействии дисахаридов с реактивом Барфеда красный осадок закиси меди появляется не сразу, а лишь спустя некоторое время (15—20 мин.), когда произойдет их гидролитический распад, который катализируется кислотами.

Реактивы и материалы: реактив Барфеда (готовят из 6 % раствора ацетата меди (II) в 1 % уксусной кислоте), раствор глюкозы 5%, раствор сахарозы 10%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

10 мл раствора глюкозы нагревают с 1 мл реактива Барфеда. Аналогичную операцию проделать с раствором сахарозы. Оставить пробирки на 15-20 мин, отметить произошедшие изменения.

9.2.11. Реакция с тимолом

Является одной из наиболее чувствительных общих реакций на углеводы и углеводные компоненты в сложных соединениях. Углеводы при взаимодействии с концентрированной серной кислотой разлагаются с образованием фурфурола и 5-оксиметилфурфурола, которые конденсируются с тимолом, образуя хромоген, который окисляясь в серной кислоте, дает окрашенное хиноидное соединение.

Реактивы и материалы: кристаллики сахара, концентрированная соляной кислота, спиртовой раствор тимола 5%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы.

Порядок выполнения работы

Несколько кристалликов сахара нагревают с 10 мл концентрированной соляной кислоты и добавляют 5% спиртовой раствор тимола. Появляется красная окраска.

9.2.12. Восстанавливающая способность лактозы

Лактоза - молочный сахар, состоит из остатков -галактозы и -глюкозы, соединенных между собой 1,4-глюкозидной связью.

У восстанавливающих дисахаридов связь между мономерами осуществляется за счет спиртового и полуацетального гидроксилов. Таким образом, одно из моносахаридных звеньев сохраняет свободный полуацетальный гидроксил, который определяет восстанавливающие свойства и все реакции, свойственные моносахаридам.

Реактивы и материалы: молоко, раствор гидроксида натрия 10 %, раствор сульфата меди 2%.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В пробирку вносят 1 мл молока и 5 капель 10% раствора гидроксида натрия. Затем по каплям добавляют 2% раствор сульфата меди до полного растворения. Осторожно нагревают, голубой осадок гидрата окиси меди переходит в желто-оранжевый, а затем в красно-коричневый осадок.

9.2.13. Отсутствия восстанавливающей способности сахарозы

Сахароза состоит из a-D-глюкопиранозы и b-D-фруктофуранозы.

Они соединены a1 - b2 связью за счет гликозидных гидроксилов.

У невосстанавливающих дисахаридов гликозидная связь образована за счет полуацетальных гидроксилов обоих моносахаридов. Они не содержат свободного полуацетального гидроксила и не проявляют характерных реакций альдегидной группы.

Реактивы и материалы: раствор сахарозы 0,5%, раствор гидроксида натрия 2н., раствор сульфата меди 2н.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пробиркодержатель.

Порядок выполнения работы

В пробирку вносят 0,5 мл 0,5 % раствора сахарозы и 6 капель 2 н раствора гидроксида натрия. Затем по каплям добавляют 0,2 н раствора сульфата меди, пока не прекратится его растворение. Осторожно нагревают пробирку. Отметить происходящее.

9.2.14. Растворение целлюлозы в медноаммиачном растворе

Целлюлоза - клетчатка, один из самых распространённых природных полимеров (полисахарид); главная составная часть клеточных стенок растений, обусловливающая механическую прочность и эластичность растительных тканей. Также обнаружена в организме некоторых низших беспозвоночных.

Структурной единицей целлюлозы является D- глюкопираноза, звенья которой соединены 1,4--гликозидными связями в линейные неразветвлённые цепи:

Реактивы и материалы: медно-аммиачный раствор (реактив Швейцера), целлюлоза (вата) теплая вода, подкисленная 2-3 мл концентрированной серной кислоты. 

Оборудование и посуда: пробирки, стеклянные палочки, стаканы на 100 мл.

Порядок выполнения работы

В пробирку наливают 5 мл медно-аммиачного раствора (реактив Швейцера), опускают в него маленький кусочек целлюлозы (ваты) и тщательно перемешивают содержимое пробирки стеклянной палочкой до полного растворения целлюлозы. Получается вязкая жидкость, ее выливают тонкой струйкой в стакан (100 мл), наполненный теплой водой, подкисленной 2-3 мл концентрированной серной кислоты. Целлюлоза выделяется из раствора в виде хлопьев.

9.2.15. Взаимодействие  полисахаридов с йодом

Амилопектин - полисахарид, одна из фракций крахмала, с раствором йода в йодиде калия амилоза дает темно-синюю окраску. Йод заходит внутрь спирали амилозы и образует при этом комплексное соединение темно-синего цвета.

Раствор гликогена с йодом окрашивается от фиолетово-коричневого до фиолетово-красного цвета.

Реактивы и материалы: раствора крахмала 1%, гликоген, разбавленный раствора йода в иодиде калия.

Оборудование и посуда: пробирки, палочки, пробиркодержатели.

Порядок выполнения работы

В одну пробирку наливают 1 мл 1% раствора крахмала, а в другую 1 мл гликогена и затем добавляют 2-3 капли разбавленного раствора йода в иодиде калия. В пробирке с раствором крахмала появляется синее окрашивание, исчезающее при нагревании и появляющееся вновь при охлаждении. Гликоген с раствором йода дает красно-бурое окрашивание.

9.2.16. Действие на углеводы реактива Фелинга

В присутствии восстановителей после нагревания осаждается оксид или гидроксид меди(I); цвет осадка от желтого до красного, иногда зеленого в зависимости от степени дисперсности и размера его частиц. Аналогично реагируют кетозы (последние в щелочной среде легко изомеризуются в альдозы), многоатомные фенолы, фенилгидразин и др. органическое производные гидразина, а также гидразиды карбоновых кислот. Кетоны (за исключением кето-спиртов), одноатомные фенолы и большинство ароматические альдегидов не восстанавливают реактив Фелинга. Для обнаружения углеводов иногда используют так называемой нейтральный реактив Фелинга, который вместо NaOH содержит Na2CO3.

При добавлении к осадку гидроксида меди (II) раствора, содержащего глюкозу, осадок сначала растворяется, затем при нагревании раствор приобретает окраску от бурой до жёлто-оранжевой.

Реактивы и материалы: раствора глюкозы 5%, раствора крахмала 1%, формалина, дистиллированная вода, реактив Фелинга (раствор CuSO4 и тартрата калия-натрия в 10%-ном растворе NaOH).

Оборудование и посуда: пробирки, стеклограф, капельницы, пробиркодержатели.

Порядок выполнения работы

Пронумеровать 4 пробирки. В 1-ю налить 1 мл раствора глюкозы, во 2-ю 1 мл раствора крахмала, в 3-ю 1 мл раствора формалина, в 4-ю 1 мл воды. В каждую пробирку добавить 1 мл реактива Фелинга. Нагрейте все пробирки и сделайте выводы.

9.3. ЙОДОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛАКТОЗЫ

Сущность метода заключается во взаимодействии между альдегидной группой молочного сахара или глюкозы с йодом в щелочной среде, в которой йод окислитель:

3I2 + 5NaOH 5NaI + NaIO3 + 3H2O

NaIO NaI + 3O

Выделившийся атомарный кислород окисляет молочный сахар в лактобионовую кислоту:

3C12 H22 O11 + 3O  3C12H22O12

лактобионовая кислота

а глюкозу, образовавшуюся при инверсии сахарозы, в глюконовую кислоту:

3С6 H12 O6 + 3O 3C6H12O7

глюконовая кислота

При определении углеводовберут избыток йода и по разнице между количеством взятого и не прореагировавшего йода титрованием раствором гипосульфита натрия находят содержание сахара:

I2 + 2Na2S2O3  2NaI + Na2S4O6

Молочный сахар имеет одну альдегидную группу и при переходе в лактобионовую кислоту присоединяет 1 атом кислорода.

Это эквивалентно 2 атомам йода или 1 мл 0,1 н раствора, окисляющего 18,01 мг молочного сахара (360,2:2). Грамм-эквивалент сахарозы при йодометрическом определении равен 171,0 (молекулярному весу, делённому на 2 (342:2)) ,так как одна молекулы глюкозы, полученной из сахарозы, соответствует 2 атома йода, то 1 мл 0,1 н раствора окисляет 17,1 мг сахарозы (фруктоза йодом практически не окисляется).

Реактивы и материалы: молоко, дистиллированная вода, раствор сульфата меди 2н., раствор гидроксида натрия 1 н., раствор йода 0,1 н., раствор соляной кислоты 0,5 н, раствор гипосульфита натрия 0,1н, раствор крахмала 1%.

Оборудование и посуда: пипетки на 2 и 5 мл, мерные колбы на 100 и 200 мл, фильтровальная бумага, цилиндры, бюретки, штативы.

Порядок выполнения работы

Отмеряют 5 мл молока в мерную колбу на 200 мл, прибавляют до половины колбы дистиллированную воду, 5 мл раствора сульфата меди 2н. и 2 мл 1 н раствора гидроксида натрия, перемешивая жидкость после прибавления каждого реактива.

Доливают до 200 мл водой, снова перемешивают и оставляют для отстаивания на 20 минут в темноте.

Отстоявшуюся жидкость профильтровывают в сухую колбу через складчатый фильтр.

25 мл фильтрата переносят в коническую колбу на 250 мл с притёртой или резиновой пробкой, приливают 12,5 мл 0,1 н раствора йода и сейчас же при непрерывном перемешивании добавляют из бюретки 18 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия.

Закрывают колбу пробкой и оставляют в темноте на 20 минут при комнатной температуре.

Прибавляют в колбу 4 мл 0,5 н раствора соляной кислоты, оттитровывают выделившийся йод 0,1н раствором гипосульфита натрия в присутствии 1% раствора крахмала. Титрование ведут медленно, сначала без прибавления индикатора (до получения светло-жёлтой окраски), затем прибавляют 1 мл 1% раствора крахмала и продолжают титрование до момента, когда от 1 капли раствора гипосульфита исчезнет синяя окраска.

Проводят холостую пробу, для чего в другую такую же колбу отмеривают 12,5 мл 0,1 н раствора йода, добавляют при непрерывном помешивании 18 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия и, закрыв колбу пробкой, оставляют в темноте на 20 минут, а затем проводят определение как в первой колбе.

Расчёт результатов

Содержание лактозы в % находят по формуле:

Л = 0,873·(а - б)

где Л – содержание лактозы; а - количество 0,1 н раствора гипосульфита, пошедшего на титрование йода в холостой пробе, мл; б - количество 0,1 н раствора гипосульфита, пошедшего на титрование йода при определении в фильтрате, мл; 0,873 – поправка на количество лактозы, реагирующее с 1мл 0,1 н раствора йода, г.

РАБОТА № 10. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ГЛИКОГЕНА

Гликоген служит резервным углеводом животных и микроорганизмов. В организме животных гликоген содержится в печени, Значительно менее богата им мышечная ткань. В дрожжах содержание гликогена составляет до 30% (в сухом веществе).

В организме гликоген существует в двух формах: прочно связанный с белками (и потому извлекается из тканей трудно) и слабо связанный с белками (легко экстрагируется горячей водой и растворами трихлоруксусной кислоты).

Существуют два метода выделения гликогена. В первом случае используемую ткань обрабатывают 30% раствором гидроксида калия на кипящей водяной бане. При такой жесткой обработке ткани распадаются, большинство веществ гидролизуется, но гликоген не изменяется и может быть осаждён спиртом. Во втором случае гликоген извлекается 5% раствором уксусной кислоты. Но при этом трудно извлечь полностью гликоген, связанный с белками.

10.1. Выделение гликогена из дрожжей

Реактивы и материалы: пивные дрожжи, раствор сахарозы 20%, раствор трихлоруксусной кислоты 5% и 10%, кварцевый песок, этанол 65% и 96%, эфир, раствор Люголя.

Оборудование и посуда: термостат, центрифуга, фарфоровые ступка и пестик, конические колбы на 200 мл, стеклянные палочки, весы, бюксы, сушильный шкаф, предметные стекла.

Порядок выполнения работы

10 г пивных дрожжей размешивают в 200 мл 20% раствора сахарозы и инкубируют в термостате при 25 С 3 часа. Происходит интенсивное брожение, в процессе которого в дрожжевых клетках накапливается гликоген (готовит лаборант).

Затем процесс прерывают, дрожжи быстро отделяют центрифугированием и растирают в предварительно охлаждённой ступке в течение 10 минут с 10 мл охлаждённого до 0 С 10% раствора трихлоруксусной кислоты с добавлением 3 г кварцевого песка.

Смесь центрифугируют 2-3 минуты при 3000 об/мин. Кислый экстракт сливают в коническую колбу на 200 мл и хранят при температуре 0 С. Осадок переносят в ступку и снова экстрагируют 5 мл охлаждённой 5% трихлоруксусной кислотой. Эту операцию повторяют трижды.

К экстракту добавляют двойной объём этанола, перемешивают и оставляют при 0 С на 30 минут, после чего осадок (гликоген) отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок гликогена для его очистки растворяют в трех объёмах подогретой воды, размешивают его стеклянной палочкой. Затем приливают двойной объём (по отношению к взятой воде) этанола, оставляют на 30 минут в холодильнике, после чего центрифугируют.

Осадок гликогена дважды промывают 5 мл 65% этанола, хорошо размешивают и каждый раз отделяют центрифугированием.

После этого гликоген промывают 5 мл 96% этанола и 10 мл эфира. Гликоген количественно переносят в предварительно взвешенный бюкс, высушивают в сушильном шкафу при 80 С и вновь взвешивают.

Расчёт результатов

Рассчитывают выход гликогена (в пересчёте на сухое вещество дрожжей).

Х = а∙2·100 / в, %

где а – количество гликогена, г;

2 – коэффициент пересчета;

100 – множитель перевода в проценты;

в – навеска дрожжей, г.

Растворяют на предметном стекле небольшую часть гликогена в нескольких каплях воды и добавляют раствор Люголя. Фиксируют окраску, появляющуюся при охлаждении и исчезающую при нагревании.

10.2. Гидролиз гликогена

Небольшую часть гликогена гидролизуют и доказывают наличие в его составе глюкозы.

Реактивы и материалы: гликоген, 10% раствор соляной кислоты, 10% раствор гидроксида натрия, реактив Фелинга.

Оборудование и посуда: пробирки, стеклянные палочки, капельницы, пробиркодержатели.

Порядок выполнения работы

К гликогену добавляют 3-4 мл 10% раствора соляной кислоты и кипятят 15-20 минут. Охлаждают и нейтрализуют смесь 10% раствором гидроксида натрия. Добавляют равный объём Фелинговой жидкости. Смесь нагревают до начала кипения. Образуется красный оксид меди.

10.3. Выделение гликогена из печени

Гликоген содержится практически во всех органах и тканях животных и человека; наибольшее количество обнаружено в печени и мышцах.

Реактивы и материалы: печени животного, ступка и пестик, 5% раствор трихлоруксусной кислоты, дистиллированная вода.

Оборудование и посуда: пробирки, стеклянные палочки, капельницы, пробиркодержатели, бумажные фильтры.

Порядок выполнения работы

0,5 г печени животного помещают в ступку, добавляют 3 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и растирают пестиком 10 мин. Затем к экстракту добавляют 5 мл дистиллированной воды, суспензию перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный водой.

Далее проводят опыты как описано в предыдущем опыте.

РАБОТА № 11. ЛИПИДЫ

Липиды содержатся во всех организмах, различаются по химическому составу и структуре, но сходны по растворимости (нерастворимы в воде (исключение - лизолецитин) и растворимы в органических растворителях— эфирах, спирте, бензоле, хлороформе и др.). Липиды служат богатым источником энергии. При окислении в организме энергетическая ценность жира составляет 9,0 ккал/г (37,7 кДж/г). Липиды входят в состав клеточных мембран, выполняя структурную функцию и обусловливая определенную степень проницаемости этих образований для различных веществ. Важна роль липидов как теплорегулятора и амортизатора. К липоидам относятся фосфолипиды, гликолипиды, сульфолипиды, стерины и стериды.

11.1. ЛИПИДЫ И ИХ ОБМЕН

11.1.1. Открытие непредельных жирных кислот

Непредельные жирные кислоты легко присоединяют галогены по месту двойных связей, образуя галогенпроизводные жирных кислот, что доказывается обесцвечиванием раствора брома или йода:

Реактивы и материалы: растительное масло или рыбий жир, раствор в хлороформе, бром или йод, раствор в хлороформе.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  К 15—20 каплям раствора жира в хлороформе прибавляют при взбалтывании по одной капле хлороформного раствора брома или йода.
  2.  Вначале наблюдают обесцвечивание растворов брома или йода вследствие присоединения галоидов по месту двойных связей молекулах жирных кислот. После насыщения всех непредельных связей дальнейшее добавление растворов брома или йода обесцвечивания их не вызывает.

О содержании непредельных жирных кислот в жире можно судить по его «йодному числу», показывающему количество граммов йода, присоединенных к 100 г жира.

Рекомендации к составлению протокола

Записать ход и химизм реакции. Сделать вывод о наличии ненасыщенных жирных кислот в исследованном жире.

11.1.2. Эмульгирование жиров

Эмульгирование жиров необходимо для ускорения переваривания жиров пищи в полости кишечника ферментом липазой, так как оно вызывает увеличение поверхности соприкосновения жира с водным раствором липазы. Эмульгаторами являются поверхностно-активные вещества – белки, соли желчных кислот, мыла. Наибольшей эмульгирующей активностью обладают щелочно-реагирующие соли желчных кислот, которые вместе с желчью изливаются в двенадцатиперстную кишку через желчный проток. Они адсорбируются на поверхности жировых капель, образуя тончайший слой, причем гидрофильные группы желчных кислот обращены в сторону водной фазы, а гидрофобные радикалы направлены к жиру. При этом происходит уменьшение поверхностного натяжения на разделе двух фаз (вода/жир), что приводит к распаду капелек жира на более мелкие.

Реактивы и материалы: растительное масло (или рыбий жир), желчь, разведенная в 2 раза, раствор белка, натриевое мыло, 1% раствор, натрий углекислый, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. Берут 5 пробирок. В первую наливают 15 капель дистиллированной воды, во вторую - - 15 капель разведенной желчи, в третью - 3—15 капель раствора белка, в четвертую - - 15 капель 1% раствора мыла и в пятую - - 15 капель 1% раствора соды.

2. В каждую пробирку добавляют по 3—4 капли растительного масла, одновременно взбалтывают содержимое всех пробирок и ставят их по порядку в штатив.

3. Наблюдают в первой пробирке расслоение неустойчивой эмульсии на жир и воду, а во второй, третьей, четвертой и пятой образование эмульсии.

Эмульгирование жира содой обусловлено образованием мыла в результате взаимодействия углекислого натрия с присутствующими в жире свободными жирными кислотами.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты опыта занести в таблицу, отметив стойкость образовавшейся эмульсии и степень ее дисперсности.

Исследуемый липид

Эмульгаторы

без

желчь

белок

мыло

сода

В выводах указать, в присутствии каких эмульгаторов получалась наиболее стойкая эмульсия. Отметить сравнительную значимость разных физиологических эмульгаторов жиров для процессов переваривания их в кишечнике.

11.1.3. Влияние желчных кислот на активность панкреатической липазы

Расщепление жиров в кишечнике на глицерин и высшие жирные кислоты совершается главным образом при участии липазы, секретируемой поджелудочной железой, и, в меньшей степени, липазы, выделяемой железами слизистой кишечника. Триглицерид распадается на глицерин и три молекулы жирных кислот:

Для действия липазы на жир необходимо присутствие желчных кислот образующихся в печени. Они вызывают эмульгирование жиров, приводящее к увеличению поверхности соприкосновения жира с липазой. По химической природе желчные кислоты являются производными холановой кислоты:

Холановая кислота

В качестве источника липазы используют вытяжку из поджелудочной железы или препарат панкреатина. Жирные кислоты обнаруживаются титрованием щелочью.

Опыт предусматривает три варианта воздействия на молочный жир: 1) липазой без желчи, 2) липазой вместе с желчными кислотами, 3) желчью без липазы.

Реактивы и материалы: молоко прокипяченное, фенолфталеин, 1% раствор в этиловом спирте, гидроксид натрия, 10% раствор, гидроксид натрия, 0,1 н. раствор, панкреатин препарат поджелудочной железы, содержащий липазу (навески по 100 мг), желчь.

Оборудование и посуда: мерный цилиндр, конические колбочки на 25 и 50 мл, бюретки, пипетки на 5 мл.

Порядок выполнения работы

1. В колбочку наливают 20 мл молока и нейтрализуют его кислотность, обусловленную присутствием кислых солей. Для этого в колбу приливают 2 капли 1% раствора фенолфталеина и 4 капли 10% раствора гидроксида натрия (избегать избытка), после чего при тщательном перемешивании содержимого колбы осторожно добавляют 0,1 н. раствор гидроксида натрия до слабо-розовой окраски.

2. Из нейтрализованного молока готовят в конических колбочках опытные пробы по следующей схеме.

№ пробы

Молоко,  мл

Панкреатин, мг

Желчь,

 мл

Вода,

 мл

Результаты титрования в мл через

15мин

30мин

45мин

60мин

1

5

100

–

1

2

5

100

1

–

3

5

–

1

–

3. Пробы тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре.

4. Через 15 минут от начала инкубации пробы титруют из бюретки 0,1 н раствором NaOH до слабо-розовой окраски, после чего вновь оставляют при комнатной температуре. Количество израсходованной щелочи фиксируют в таблице 2.

5. Титрование проб повторяют через 30, 45 и 60 минут от начала инкубации. Каждый раз оттитровывается то количество жирных кислот, которое освобождается из жира молока при его гидролизе липазой за данный отрезок времени (15 минут).

Рекомендации к составлению протокола

Изобразить графически динамику расщепления жира липазой для каждой пробы, откладывая на оси абсцисс время в минутах, а на оси ординат количество 01 н. раствора NaOH (в мл), израсходованного на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данное время (15, 30, 45, 60 минут).

Выразить активность липазы как концентрацию карбоксильных групп жирных кислот, образовавшихся в 100 мл молока за все время исследования, пользуясь следующей формулой:

где х – концентрация СООН-групп, образующихся в 100 мл молока, мг %; 0,1 –нормальность раствора NaOH; А – количество 0,1 н. раствора NaOH, израсходованного на титрование 5 мл молока за все время инкубации (сумма всех титрований), мл; 5 – количество молока в титруемой пробе, мл.

На основании хода кривых на графике и полученных данных концентрации карбоксильных групп сделать вывод о зависимости активности липазы от присутствия желчных кислот. Отметить зависимость количества образовавшихся свободных жирных кислот от продолжительности ферментативного действия.

11.1.4. Роль сывороточного альбумина в транспорте высших ук ирных кислот в крови

Кровь всегда содержит некоторое количество неэстерифицированных (свободных) высших жирных кислот, появляющихся при ферментативном расщеплении липазой липидов пищи и жировых депо организма. Высшие жирные кислоты, не растворимые в воде, транспортируются в плазме крови главным образом в виде комплексов с альбуминами.

Опыт заключается в сравнении растворимости свободных жирных кислот и их комплексов с сывороточным альбумином. Комплекс возникает при взаимодействии растворимой натриевой соли высших жирных кислот (мыло) с альбумином. При добавлении соляной кислоты натрий вытесняется и образуются свободные жирные кислоты:

R—COONa + НСl → R–COOH + NaCl

В комплексе с сывороточным альбумином высшие жирные кислоты остаются в растворе, а в отсутствие альбумина выпадают в осадок. Следует избегать избытка соляной кислоты, которая, вызывая денатурацию белка, может нарушить его способность к комплексообразованию.

Реактивы и материалы: натриевое мыло, 1% раствор, сыворотка крови, соляная кислота, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. В две пробирки вносят по 6 капель раствора мыла. В первую добавляют 20 капель сыворотки крови, во вторую - столько же воды. Пробирки слегка встряхивают.

2. В пробирку с добавленной водой вливают по каплям (1—2 капли) 1% раствор соляной кислоты только до появления осадка свободных жирных кислот.

3. В пробирку с сывороткой крови приливают такое же количество кислоты. Жирные кислоты не выпадают в осадок, так как образуют с сывороточным альбумином комплексное соединение.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты исследования записать и обосновать различия в растворимости свободных жирных кислот и их комплексов с альбумином крови, а также указать на значение комплексообразования.   

11.2. ФОСФОЛИПИДЫ

Фосфолипиды (фосфатиды) относятся к липоидам. В их состав входят: фосфорная кислота, высокомолекулярные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, альдегиды высших жирных кислот, спирты (глицерин, инозит, сфингозин) и азотистые основания (холин, этаноламин, серии). Фосфолипиды, входя в состав всех клеточных мембран, содержатся в каждой клетке живого организма, особенно много их в нервной ткани и в желтке яиц. Фосфолипиды обладают способностью образовывать с белками сложные комплексы — липопротеины.

11.2.1. Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по фосфору

Фосфолипиды осаждают трихлоруксусной кислотой вместе с белками крови. Полученный осадок минерализуют и в остатке определяют неорганический фосфор. О содержании фосфолипидов в сыворотке крови судят косвенно по количеству фосфорной кислоты, находимой колориметрически.

Реактивы и материалы: сыворотка крови, трихлоруксусная кислота, 10% раствор, хлорная кислота, 57% раствор, молибденовокислый аммоний, 4% раствор, рабочий раствор аминонафтолсульфоновой кислоты – эйконогена, рабочий стандартный раствор однозамещенного фосфорнокислого калия, содержащий в 1 мл 0,01мг фосфора.

Оборудование и посуда: микропипетка на 0,2 мл, пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями, пробирки обычные, пробирки центрифужные, центрифуга, стеклянные бусинки, песчаная баня, фотоэлектроколориметр.

Порядок выполнения работы

1. В центрифужную пробирку помещают 3 мл дистиллированной воды и наливают 0,2 мл сыворотки крови. Добавляют 3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, первые 1,5 мл по каплям, встряхивая пробирку, остальные — быстрее. Оставляют стоять 1—2 минуты.

2. Через 1—2 минуты содержимое пробирки центрифугируют 3-5 минут. Надосадочную жидкость сливают и переворачивают пробирку, пока не стечет вся жидкость.

3. К полученному осадку прибавляют 1 мл 57% раствора хлорной кислоты и 1—2 стеклянные бусинки для равномерного кипения.

4. Пробирку нагревают 20—30 минут на песчаной бане при 180°С, пока смесь не станет бесцветной. Рекомендуется наблюдать за процессом, пока не пройдет образование пены — 5 минут. После охлаждения объем опытных проб доводят дистиллированной водой до 7 мл.

5. Для приготовления контрольной пробы берут 0,8 мл 57% раствора хлорной кислоты и доводят водой до 7 мл.

  1.  Готовят три стандарта (для достоверности), содержащие по 2 мл рабочего стандартного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия и по 0,8 мл 57% раствора хлорной кислоты. Объем каждой стандартной пробы дистиллированной водой доводят до 7 мл.
  2.  Для определения фосфора в каждую пробирку (опытные, контрольные и стандартные) прибавляют по 1 мл 4% раствора молибденовокислого аммония, перемешивают и добавляют по 1 мл раствора амино-нафтолсульфоновой кислоты, доводя дистиллированной водой объем до 10 мл. Содержимое пробирок вновь перемешивают.
  3.  Через 20 минут после прибавления аминонафтолсульфоновой кислоты интенсивность окраски измеряют на ФЭКе против контроля при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Липоидный фосфор в 100 мл сыворотки в мг%; рассчитывают по формуле:

X = Еоп ∙ 0,02 ∙ 100/Ест ∙ 0,2 = Еоп ∙ 10/Ест

где X – липоидный фосфор в мг%;

Еоп – оптическая плотность опытной пробы;

Ест – оптическая плотность стандартной пробы;

0,02 – содержание фосфора в 2 мл стандарта (мг);

0,2 – количество сыворотки в опыте (мл).

Концентрацию общих фосфолипидов вычисляют умножением полученной концентрации липоидного фосфора на 25, так как липоидный фосфор составляет 4% (1/25 часть) молекулы фосфолипидов.

Норма концентрации липоидного фосфора у взрослых – от 6,1 до 14,5 мг% или 1,97—4,68 ммоль/л (коэффициент пересчета 0,323).

Рекомендации к составлению протокола

Пользуясь приведенными формулами, вычислить концентрацию липоидного фосфора и общих фосфолипидов в сыворотке крови.

В выводах сопоставить полученный результат с нормальными показателями.

11.2.2. Обнаружение фосфатидилхолина в желтке куриного яйца

Лецитины, относящиеся к группе фосфолипидов, не растворяются в воде и ацетоне, но хорошо растворяются в спирте, эфире, хлороформе.

Реактивы и материалы: спиртовой раствор лецитина (в стакан помещают половину куриного желтка и, помешивая, прибавляют 40 мл горячего спирта, раствор охлаждают и фильтруют в сухую пробирку); ацетон; дистиллированная вода.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы.

Порядок выполнения работы

С сухую пробирку вносят 10 капель ацетона и 2 капли раствора лецитина. Выпадает белый осадок. В другую пробирку прибавляют к 10 каплям лецитина несколько капель дистиллированной воды до образования устойчивой эмульсии.

11.3. СТЕРИНЫ (СТЕРОЛЫ) И СТЕРИДЫ

Стерины — вторичные одноатомные непредельные циклические спирты, содержащие ядро циклопентанпергидрофенантрена. Представителем стеринов животных и человека является холестерин. Холестерин входит в состав липопротеинов тканей и крови. Особенно богаты холестерином мозг, надпочечники, яичный желток, желчь. Холестерин используется для синтеза витамина D, желчных кислот, кортикостероидов, эстрогенов и андрогенов. Холестерин нерастворим в воде и растворяется в хлороформе, эфире, ацетоне, горячем спирте и других органических растворителях, а также в жирах.

11.3.1. Открытие холестерина в тканях головного мозга

По химической природе холестерин является циклическим ненасыщенным вторичным спиртом.

Цветные реакции на холестерин зависят от дегидратации холестерина под действием концентрированной серной кислоты и последующей конденсации получаемых продуктов с образованием непредельных углеводородов с сопряженными двойными связями, дающих с серной кислотой различные окрашенные производные.

Реактивы и материалы: мозг, кальций сернокислый (гипс), в порошке, хлороформ, серная кислота концентрированная, уксусный ангидрид.

Оборудование и посуда: весы аптечные, ступка фарфоровая, стеклянная пластинка, сушильный шкаф, скальпель или нож, стеклянная палочка или лопаточка, пипетка на 5 мл, воронка с бумажным фильтром, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1.Высушенный с гипсом мозг заливают в пробирке 5 мл хлороформа и экстрагируют 5 минут при комнатной температуре при интенсивном постоянном встряхивании.

2.Экстракт отфильтровывают в сухую пробирку, делят на две части и открывают холестерин двумя реакциями.

3.Для реакции Зальковского к одной части хлороформного экстракта мозга приливают равный объем концентрированной серной кислоты и содержимое перемешивают осторожным встряхиванием пробирки.

4.Дают жидкости отстояться. В результате образования холестерилена продукта дегидратации холестерина верхний хлороформный слой оказывается окрашенным в красный цвет. Нижний слой (H2SO4) имеет желто-оранжевую окраску с зеленой флуюоресценцией (жидкость в проходящем свете прозрачна и желто-красного цвета, в отраженном свете кажется мутной с зеленым оттенком).

5.Для постановки реакции Либермана—Бурхарда к другой части хлороформного экстракта мозга приливают 7 капель уксусного ангидрида и 1—2 капли концентрированной серной кислоты.

6.Жидкость хорошо перемешивают, после чего она принимает сначала синюю, затем сине-зеленую и, наконец, зеленую окраску. При незначительном количестве холестерина в растворе может сразу появиться зеленая окраска. Растворы, содержащие больше холестерина (1% и выше), дают сначала красную окраску, быстро пере ходящую в фиолетовую, синюю и, наконец, в зеленую. Последнюю окраску обусловливает сульфокислота холестерилена.

11.3.2. Количественное определение общего холестерина в сыворотке крови прямым методом по реакции Златкис– Зака

Метод основан на реакции холестерина с уксусной и серной кислотами в присутствии хлорного железа. Химизм реакции неизвестен. Видимо, происходит дегидратация холестерина под действием серной кислоты и его окисление хлорным железом. Интенсивность развивающейся красно-фиолетовой окраски прямо пропорциональна количеству холестерина в исследуемой пробе.

Реактивы и материалы: сыворотка крови, уксусная кислота ледяная, рабочий раствор хлорного железа, приготовленный из основного раствора, основной стандартный раствор холестерина, содержащий в 1 мл 1 мг холестерина.

Оборудование и посуда: микропипетка на 0,1 мл, пипетки мерные с делениями емкостью 1, 2, 5 мл, штатив с пробирками, фотоэлектроколориметр.

Порядок выполнения работы

1 .К 0,1 мл сыворотки прибавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорного железа.

2. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 15 минут при комнатной температуре.

3. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре против контроля при длине волны 510—560 нм (зеленый светофильтр), в кювете с толщиной слоя 1 см.

4. Контроль. К 0,1 мл дистиллированной воды прибавляют 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорного железа. Далее обрабатывают как опыт.

5. Расчет производят по калибровочному графику.

6. Построение калибровочного графика. Из основного стандартного раствора холестерина готовят разведения, как указано в таблице.

Норма содержания холестерина в сыворотке крови 120—250 мг% (3,12—6,50 ммоль/л).

№ пробирки

Основной стандартный раствор холестерина, мл

Ледяная уксусная кислота, мл

Рабочий раствор хлорного железа, мл

Содержание холестерина в пробе, мг%

1

0,1

3,0

2,0

100

2

0,2

3,0

2,0

200

3

0,3

3,0

2,0

300

4

0,4

3,0

2,0

400

5

0,5

3,0

2,0

500

7.Через 20 минут пробы фотометрируют, как исследуемые, против контроля.

Примечание. При концентрациях холестерина более 350 мг% исследуемую сыворотку разводят физиологическим раствором, полученные результаты умножают на разведение.

Рекомендации к составлению протокола

Пользуясь составленным графиком, определить концентрацию холестерина в сыворотке крови. Полученный результат сопоставить в выводах с нормальными показателями.

 

РАБОТА № 12. ПОКАЗАТЕЛИ ЛИПИДОВ. ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПИДОВ

12.1. ПОКАЗАТЕЛИ ЛИПИДОВ

Качество липидов характеризуется следующими показателями или числами: кислотное число - это количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г масла или жира, оно характеризует качество масел и жиров, оценивая степень гидролиза триацилглицеридов ферментом липазой; число омыления - это количество миллиграммов едкого кали, необходимое как для омыления жирных кислот в составе триацилглицеридов, так и для нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г исследуемого масла или жира; йодное число - это количество граммов йода, эквивалентное галоиду, присоединившемуся по месту двойных связей к 100 г исследуемого масла или жира.

12.1.1. Количественная оценка степени ненасыщенности липидов по йодному числу

Йодное число показывает число двойных химических соединений в жире. На каждое двойное соединение приходится одна молекула йода. Таким образом, устанавливается, сколько грамм йода могут химически связать 100 грамм взятого масла. Определение йодного числа масла используется например при изготовлении мыла, чем ниже показатель йодного числа, тем твёрже будут готовое изделие. По йодному числу можно определить как долго будет храниться готовое мыло. Чем выше йодное число, тем больше ненасыщенных кислот в жире, тем выше вероятность его прогоркания.

Реактивы и материалы: реактив Дома 0,05 н раствор пиридинбромида (к 2,5 г или 1,85 мл концентрированной серной кислоты в 5 мл ледяной уксусной кислоты прибавляют 2 г или 2,06 мл пиридина в 5 мл ледяной уксусной кислоты; смесь охлаждают и приливают к ней 2 г или 0,63 мл брома, затем разбавляют до объема 500 мл ледяной уксусной кислотой); хлороформ, 0,05 н раствор пиридинбромида, раствора йодистого калия, 1% раствор крахмала, вода, 0,02 н раствор тиосульфата натрия.

Оборудование и посуда: плоскодонные колбы с пришлифованной стеклянной пробками емкостью 50 мл, пипетки, цилиндры, быретки, штативы для титрования.

Порядок выполнения работы

К 5 мл хлороформного раствора липидов добавляют 5 мл раствора пиридиндибромида. Смесь встряхивают в колбе с пришлифованной стеклянной пробкой емкостью 50 мл. Через 15 мин прибавляют 0,5 мл раствора йодистого калия, 0,5 мл воды, несколько капель раствора крахмала и титруют выделившийся йод стандартным 0,02 н раствором тиосульфата натрия. Холостой опыт проводят также с 5 мл хлороформа. Йодное число рассчитывают по формуле:

,

где а - результат титрования холостого опыта; б - результат титрования опытной пробы; в - навеска липидов, г.

12.1.2. Обнаружение перекисных соединений

При взбалтывании хлороформного раствора растительного масла в кислой среде с раствором йодистого калия жидкость приобретает желтую окраску вследствие образования молекулярного йода и йодистого калия, окисляемого перекисными соединениями. Отсутствие йода подтверждается окрашиванием крахмала в синий цвет.

Реактивы и материалы: свежее подсолнечное масло, старое подсолнечное масло, смесь ледяной уксусной кислоты с хлороформом, раствор йодистого калия, 0,5% раствора крахмала, раствор гипосульфита натрия.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы.

Порядок выполнения работы

В одну пробирку вносят 2 капли свежего подсолнечного масла, в другую 2 капли несвежего. Добавляют в каждую пробирку по 10 капель смеси ледяной уксусной кислоты с хлороформом, по 5 капель раствора йодистого калия и встряхивают. Затем еще по 2 капли 0,5% раствора крахмала. Одна пробирка остается бесцветной, в другой жидкость окрашивается в синий цвет (несвежее масло). В пробирку, окрашенную в синий цвет, добавляют по каплям раствор гипосульфита и наблюдают исчезновение синей окраски. Чем больше капель гипосульфита пошло на обесцвечивание, тем выше содержание перекисных соединений.

12.1.3. Количественное определение перекисного числа

Методика определения перекисей в жире основана на взаимодействии жира, содержащего органические перекиси, с HJ с выделением йода, который оттитровывают Na2S2O3. HJ образуется в результате реакции между KJ и СН3СООН. Перекисные числа дают условную характеристику порчи жира, т.к. йод выделяется после внесения KJ, может расходоваться на присоединение по месту двойных связей непредельных жирных кислот, на взаимодействие с альдегидами.

Реактивы и материалы: пробы липидов, хлороформ, уксусная кислота, 50% раствора KJ, вода, раствор крахмала 1%, раствор тиосульфата натрия 0,002 моль/л и 0,01 моль/л.

Оборудование и посуда: весы, плоскодонные колбы, пробки к колбам, шейкер, бюретки, штатив для титрования.

Порядок выполнения работы

В колбу помещяют 5 г липидов, добавляют 10 мл хлороформа, приливают 15 мл СН3СООН и 1 мл 50% раствора KJ, после чего колбу сразу же закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин и оставляют на 5 мин в темном месте при температуре 20-25°С. Затем добавляют 75 мл воды, перемешивают и добавляют пять капель раствора крахмала. Выделившийся йод титруют раствором Na2S2O3, используя раствор следующей концентрации в зависимости от предполагаемого значения перекисного числа: С (1/2Na2S2O3) = 0,002 моль/л, если перекисное число равно 6,0 ммоль/кг, или С (1/2Na2S2O3) = 0,01 моль/л, если перекисное число равно или более 6,0 ммоль/кг.

Для каждой испытуемой пробы выполняют два измерения. Контрольное измерение проводят параллельно с основными измерениями.

Если на контрольное измерение пойдет более 0,1 мл 0,01 моль/л раствора Na2S2O3, то проверяют соответствие реактивов требованиям стандартов.

Перекисное число (X) в ммоль активного кислорода на кг пробы вычисляют по формуле:

где Vo - объем раствора Na2S2O3, использованный при контрольном измерении, мл; V1 - объем раствора Na2S2O3, использованный при измерении, мл; С - концентрация использованного раствора Na2S2O3, моль/л; m - масса испытуемой пробы, г; 1000 - коэффициент, учитывающий пересчет результата измерения в ммоль на кг.

12.1.4. Определение кислотного числа

Кислотное число отражает количественное содержание в масле свободных жирных кислот, накопление которых обусловлено главным образом гидролитическим расщеплением глицеридов и отчасти окислительными превращениями, происходящими при хранении, особенно на свету. Наличие свободных жирных кислот снижает вкусовые достоинства и катализирует окислительные процессы, ускоряя порчу продукта. Этот показатель характеризует степень свежести масла и по мере хранения возрастает: чем больше величина кислотного числа, тем менее свежее масло. Кислотное число выражается количеством миллиграммов едкого калия, необходимого для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г масла.

Сущность метода определения кислотного числа заключается в растворении определенной массы растительного масла в смеси растворителей с последующим титрованием свободных жирных кислот раствором гидроксида калия или натрия.

Реактивы и материалы: масло, смесь спирта с диэтиловым эфиром (1:2), фенолфталеин, раствором гидроксида натрия 0,1 н.

Оборудование и посуда: весы, плоскодонные колбы, пипетки, бюретка, штатив для титрования.

Порядок выполнения работы

При исследовании светлых масел к навеске масла 2-3 г приливают 25 мл смеси спирта с диэтиловым эфиром (1:2), добавляют 3 капли фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором щелочи до розовой окраски. Кислотное число (К.ч.) вычисляют в мг КОН по формуле:

,

где 5,611 - титр 0,1 н раствора щелочи; К = I - поправка к титру 0,1 н раствора щелочи; V - количество мл 0,1 н раствора щелочи, израсходованного на титрование; М - масса масла, г.

12.2. ОМЫЛЕНИЕ ЛИПИДОВ

В результате щелочного гидролиза, называемого омылением, получают глицерин и мыла.

Мыла способны эмульгировать нерастворимые в воде масла и жиры. Мыла формируют гидрофильную оболочку вокруг капель жира, образуя мелкодисперсную смесь с водой или эмульсию.

В щелочной среде образуются мыла - соли высших жирных кислот (натриевые - твёрдые, калиевые - жидкие).

12.2.1.Получение натриевого твердого мыла

12.2.1.1. Получение мыла из жира

Реактивы и материалы: липиды, спиртовый раствор гидроксида натрия (2,5 г щелочи в 6 мл воды и 15 мл этилового спирта), насыщенного раствора хлорида натрия.

Оборудование и посуда: весы, фарфоровый стакан или чашка, стеклянная палочка, водяная баня, фильтровальная бумага, воронка, весы.

Порядок выполнения работы

5 г навески липидов помещают в фарфоровый стакан и расплавляют массу на открытом огне. При перемешивании к расплавленному жиру добавляют тонкой струей спиртовый раствор гидроксида натрия. Смесь кипятят 10-15 мин и добавляют 10-15 мл насыщенного раствора хлорида натрия и охлаждают в бане с водой. Образующийся поверхностный слой мыла извлекают из стакана, высушивают фильтровальной бумагой и взвешивают. Рассчитывают выход мыла на взятую навеску жира.

12.2.1.2. Получение мыла из стеарина

Реактивы и материалы: смесь карбоната натрия и воды (1:1), расплавленный стеарин с горящей свечи. 

Оборудование и посуда: весы, выпаривательная чашка, стеклянная палочка, стеклянная пластина.

Порядок выполнения работы

Нагреть в выпаривательной чашке смесь карбоната натрия и воды (1:1). Добавить расплавленный стеарин с горящей свечи. Перемешать. Вспенившуюся массу выложить на стеклянную пластинку и охладить. Рассчитывают выход мыла на взятую навеску стеарина.

12.2.1.3. Получение мыла из воска

Реактивы и материалы: концентрированный раствор гидроксида натрия, воска, насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование и посуда: весы, фарфоровая чашка, стеклянная палочка.

Порядок выполнения работы

В фарфоровую чашку добавить 15 мл концентрированного раствора гидроксида натрия и 5 г воска. Смесь нагреть до слабого кипения при постоянном перемешивании. Подливать в смесь воду по мере уменьшения объема до первоначального уровня. Через 20-30 мин в смесь добавить 25 мл горячего раствора хлорида натрия. Смесь встряхнуть, дать отстояться. При охлаждении всплывает мыло.

Рассчитывают выход мыла на взятую навеску воска.

12.2.2. Получение калиевого жидкого мыла

Реактивы и материалы: растительное (касторовое) масло, спиртовый раствора гидроскида калия 50%, дистиллированная вода.

Оборудование и посуда: весы, фарфоровая чашка, стеклянная палочка, электрическую печь.

Порядок выполнения работы

В фарфоровую чашечку поместите 0,5 мл растительного (желательно касторового) масла и 10 капель 50% спиртового раствора едкого калия. Стеклянной палочкой хорошенько размешайте щелочь с маслом до получения однородной эмульсии. Затем поставьте чашечку на электрическую печь и при незначительном подогревании продолжайте помешивать, пока не получится однородная, прозрачная, слегка желтоватая жидкость. Затем добавьте дистиллированной воды до объема 10 мл и тщательно перемешайте. Получится раствор жидкого мыла.

12.2.3. Определение содержания жирных кислот в твердом мыле

Реактивы и материалы: твердое мыло, вода, соляная кислота.

Оборудование и посуда: весы, нож, стакан на 100 мл, электроплитка до растворения, стеклянная палочка, фильтровальная бумага, воронка.

Порядок выполнения работы

Взвесить 3 г твердого мыла. Нарезать тонкими полосками и поместить в стакан на 100 мл. Добавить 25 мл воды и нагреть на электроплитке до растворения. Добавить 5 мл соляной кислоты и нагреть до образования масляного слоя при постоянном перемешивании. Охладить массу, отделить жир фильтрованием. Полученные ЖК взвесить и вычислить их процентное содержание в образце по формуле:

Использовать полученное мыло для следующего опыта.

12.2.4. Определение содержания жирных кислот в жидком мыле

Реактивы и материалы: раствор калиевого мыла, концентрированная соляная кислота.

Оборудование и посуда: пробирки, фильтровальная бумага, воронка, весы.

Порядок выполнения работы

В пробирку с 2 мл раствора калиевого мыла добавить 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. Образуются жирные кислоты, нерастворимые в воде. Они будут собираться в верхней части пробирки. Отделить жир фильтрованием. Полученные ЖК взвесить и вычислить их процентное содержание в образце по формуле, представленной выше.

12.2.5. Образование нерастворимых кальциевых мыл

Реактивы и материалы: раствор калиевого мыла, раствор хлорида кальция.

Оборудование и посуда: пробирка, стеклянная палочка. 

Порядок выполнения работы

В пробирку с 1 мл раствора калиевого мыла добавить 1 мл раствора хлорида кальция и перемешать.

Наблюдается образование нерастворимых кальциевых мыл:

2 КООС(СН2)16СН3 + CaCI2  KCI + Са(ООС(СН2)16СН3)2.

12.2.6. Обнаружение ненасыщенных жирных кислот

При добавлении бромной воды к маслам желтая окраска брома исчезает, что обусловлено наличием в маслах ненасыщенных жирных кислот, присоединяющих бром по месту двойной связи.

Реактивы и материалы: раствор сливочного масла в хлороформе, раствор подсолнечного масла в хлороформе, бромная вода (5 г брома растворяют в 100 мл воды и встряхивают под тягой).

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки.

Порядок выполнения работы

В первую пробирку наливают 1 мл раствора сливочного масла в хлороформе, а во вторую 1 мл раствора подсолнечного масла в хлороформе. В каждую пробирку добавляют по каплям бромную воду (5 г брома растворяют в 100 мл воды и встряхивают под тягой) при встряхивании до прекращения обесцвечивания.

Отметьте количество капель бромной воды, добавленной в каждую пробирку.

12.2.7. Обнаружение стеролов в растительном масле

Реактивы и материалы: подсолнечное масло, хлороформ, смесь серной кислоты с формалином, уксусный ангидрид. 

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки.

Порядок выполнения работы

В сухую пробирку вносят 2 капли подсолнечного масла, 20 капель хлороформа. Добавляют 20 капель смеси серной кислоты с формалином и взбалтывают. Раствор разделяется на два слоя: хлороформный (вишневого цвета) и серной кислоты (красно-коричневого цветя с зеленой флуоресценцией). Из верхнего хлороформного слой отбирают 5-6 капель в сухую пробирку, добавляют 1-2 капли уксусного ангидрида и наблюдают появление синего окрашивания, переходящего в зеленое.

 


РАЗДЕЛ 2

РАБОТА № 13. ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ

13.1. Исследование действия каталазы крови

Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. По химической природе каталаза является геминферментом, так как в состав простетической группы этого фермента входит гем:

2Н2О2 О2 + 2Н2О

Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода путем разложения ее на воду и молекулярный кислород. Перекись водорода может образоваться в организме во время течения окислительно-восстановительных процессов.

Реактивы и материалы: кровь, перекись водорода, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

В пробирку наливают 10—15 капель 1% раствора перекиси водорода и добавляют каплю крови. Жидкость вспенивается, так как происходит бурное выделение пузырьков кислорода. Результаты опыта заносятся в таблицу.

№

п/п

Ферменты

Субстрат

Реакция, катализируемая ферментом

Выявление действия ферментов

13.2. Качественное определение активности

сукцинатдегидрогеназы мышц

Дегидрогеназа янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназа) окисляет янтарную кислоту (сукцинат) в фумаровую (фумарат). Коферментом в этой реакции служит флавинадениндинуклеотид (ФАД).

В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется 2,6-дихлохфенолиндофенол, его натриевая соль.

В водном растворе окисленная форма 2,6-дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения бесцветна. Активность сукцинатдегидрогеназы мышц определяют, добавляя к мышечной кашице растворы янтарной кислоты и натриевой соли окисленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола. Если сукцинатдегидрогеназа активна, интенсивность синей окраски ослабляется благодаря образованию бесцветной восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола.

Реактивы и материалы: мышцы, 2,6-дихлорфенолиндофенол, 0,001 N раствор, М/15 фосфатный буфер, рН 7,4, гидроксид натрия, 0,1 N раствор, янтарная кислота, 5% раствор.

Оборудование и посуда: пипетка на 5 и 1 мл, капельницы, пробирки, термостат, весы, ножницы, ФЭК.

Порядок выполнения работы

В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну (опытную) пробирку добавляют 5 капель 5% раствора янтарной кислоты и (для нейтрализации) 5 капель 0,1 н раствора гидроксида натрия, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 N раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной ткани поперечнополосатых мышц только что убитого животного. Обе пробирки помещают на 20 минут в термостат при 37 °С. Сравнивают интенсивность окраски в контрольной и опытной пробирках.

Сделать выводы.

РАБОТА № 14. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

В печени содержатся ферменты, при участии которых происходит фосфоролиз гликогена и дальнейшее превращение его до стадии образования фосфоглицериновой кислоты. Этот процесс может протекать в атмосфере азота и в атмосфере кислорода в присутствии фторида натрия. Если процесс протекает в атмосфере азота, в среде накапливается НАДНН+. Если процесс превращения гликогена происходит в атмосфере кислорода, то образовавшийся НАДНН+ окисляется при участии ферментов митохондриальной дыхательной цепи с образованием НАД и Н2О. При окислении НАДНН+ образуются 3 молекулы АТФ.

Убыль минерального фосфата под влиянием ферментов, содержащихся в печени, в атмосфере кислорода протекает более интенсивно, чем в атмосфере азота.

Реактивы и материалы: измельченная печень, фосфатный буфер рн 8,2, трихлоруксусная кислота, 5% раствор, молибденовокислый аммоний, 2,5% раствор, раствор эйконогена и сульфата натрия, фтористый натрий, 1% раствор, серная кислота, 5 n раствор, крахмал, 1% раствор.

Оборудование и посуда: термостат, ножницы, пинцет, фарфоровая ступка, химические стаканчики на 25 мл, весы технические или роговые, битое стекло, измельченное до порошка, шприцы без иглы, воронки, пипетки глазные, пробирки или склянки с притертыми пробками на 10 мл, газометр, заполненный кислородом, или кислородная подушка, газометр, заполненный азотом, лед.

Порядок выполнения работы

На технических весах взвешивают навеску печени, записывают ее вес, затем помещают печень в фарфоровую ступку, стоящую на льду. Печень измельчают ножницами, добавляют немного битого стекла и растирают пестиком до получения однородной массы. После этого постепенно добавляют М/30 фосфатный буфер с рН 8,2 в количестве, равном весу печени. Содержимое ступки продолжают размешивать пестиком и добавляют 2 капли 1% раствора фтористого натрия. Полученную массу оставляют на несколько минут в ступке, чтобы осело стекло, затем часть вытяжки сливают в стеклянный стаканчик, стоящий на льду.

В 4 пробирки с притертыми пробками отмеривают при помощи шприца без иглы по 10 капель вытяжки из печени, приливают туда по 10 капель М/30 фосфатного буфера с рН 8,2, по 5 капель 1% раствора крахмала и добавляют по 1 капле фторида натрия. В 2 пробирки (контрольные) добавляют по 10 капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты для денатурации ферментов. Помещают в штатив одну контрольную и одну опытную пробирки и пропускают через них кислород в течение 5 минут. В другой штатив также помещают контрольную и опытную пробирки и пропускают через них азот в течение 5 минут. Все четыре пробирки закрывают притертыми пробками и помещают в термостат при 38° на 30 минут. После этого в опытные пробирки добавляют по 10 капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Содержимое всех пробирок фильтруют в чистые пронумерованные пробирки через влажные бумажные фильтры, помещенные в воронки. В пробирках с фильтрами проводят цветную реакцию на фосфор: добавляют в каждую пробирку по 10 капель молибдата (смесь равных объемов 2,5% раствора молибденовокислого аммония и 5N раствора серной кислоты) и 5 капель смеси растворов эйконогена и сульфата натрия. Помещают пробирки в термостат на 10 минут. Наблюдают развитие синей окраски, получаемой в результате реакции неорганического фосфата с молибденовым реактивом. Сравнивают визуально интенсивность окраски в контрольных и опытных пробирках, термостатировавшихся в атмосфере кислорода и в атмосфере азота. Отмечают, в какой из опытных пробирок более интенсивно произошла эстерификация неорганического фосфата — в атмосфере кислорода или в атмосфере азота.

Делают выводы.

Примечание. При отсутствии эйконогена его можно заменить 1% раствором гирохинона 0,5 мл и 2 мл карбонатсульфитной смесью следующего состава: 40 г безводного карбоната натрия в 200 мл воды и 7,5 г сульфита натрия в 50 мл воды с последующим смешиванием растворов.

РАБОТА № 15. МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ

15.1. Сопоставление редокс-потенциалов рибофлавина и метиленового синего

В живых организмах наиболее важными донорами электронов служат атомы водорода органических молекул. При помощи переносчиков электронов, имеющих промежуточный потенциал, осуществляется сложная последовательность реакций тканевого дыхания. Склонность к участию в окислительно-восстановительных реакциях может быть определена путем потенциометрических измерений, сводящихся к определению электродвижущей силы цепи, которая составлена из химически инертного электрода, погруженного в исследуемую редокс-систему, и электрода сравнения.

Стандартные окислительно-восстановительные потенциалы, измеренные при рН 7, обозначаются Ео. Окислительно-восстановительный потенциал является величиной, пропорциональной изменению свободной энергии. Вещество с большим окислительно-восстановительным потенциалом (с учетом алгебраического знака) окисляет вещество с меньшим окислительно-восстановительным потенциалом. Т.е. редокс-потенциалы являются мерой способности молекул обмениваться электронами.

Помимо потенциометрического измерения часто используют колориметрический метод, наблюдая изменение окраски специальных редокс-индикаторов в испытуемом растворе. Обычно в восстановленном состоянии эти индикаторы бесцветны, а в окисленном обладают определенной окраской. Причем для каждого индикатора зона перехода связана с характерной для него величиной E0.

Реактивы и материалы: рибофлавин, 0,025% суспензия, метиленовый синий, 0,01% раствор, соляная кислота, концентрированная, цинк, гранулированный.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку наливают 5-6 капель воды, 1 каплю взвеси рибофлавина и добавляют по каплям раствор метиленового синего до появления синего или зеленовато-синего окрашивания смеси.
  2.  Бросают в окрашенную смесь кусочек цинка и капают 1 каплю концентрированной соляной кислоты. Выделяющийся водород начинает снижать редокс-потенциал системы, происходит восстановление метиленового синего и рибофлавина. Восстановление первого из них происходит быстрее, поэтому цвет смеси становится сначала зеленым, затем зеленовато-желтым и наконец бледно-желтым или розоватым.
  3.  Слабо окрашенную жидкость сливают в другую пробирку и наблюдают за изменением цвета. Водород более не образуется, а остаток его уходит в воздух. Восстановленная форма рибофлавина через метиленовый синий передает электроны и ионы водорода на кислород воздуха и раствор желтеет. После этого происходит окисление лейкометиленового синего, и содержимое пробирки меняет цвет через зеленый в синий.

Записать результаты опыта и составить схему переноса водорода (электронов и ионов водорода) с учетом стандартных окислительно-восстановительных потенциалов использованных компонентов.

15.2. Обнаружение дегидрогеназ лимоннокислого цикла

Непосредственному дегидрированию в организме под влиянием дегидрогеназ подвергаются многие субстраты. Наиболее важными среди них являются изолимонная, α-кетоглутаровая, янтарная (сукцинат), яблочная кислоты, участвующие в цитратном цикле (цикле трикарбоновых кислот или цикле Кребса). Отщепленный от субстратов водород (протоны и электроны) передается при помощи комплекса ферментов тканевого дыхания в конечном итоге на кислород.

Изолимонная кислота окисляется при дегидрировании и декарбоксилировании в α-кетоглутаровую кислоту, а янтарная — в фумаровую.

При исследовании каталитического действия дегидрогеназы изолимонной кислоты (изоцитратдегидрогеназы) в качестве субстрата используют лимонную кислоту, которая изомеризуется в изолимонную под влиянием фермента аконитатгидратазы (КФ 4.2.1.3), содержащейся в тканевой кашице наряду с другими ферментами цикла трикарбоновых кислот.

Реактивы и материалы: мышечная кашица, цитрат натрия, 3% раствор (нейтрализованный по лакмусу), сукцинат натрия, 3% раствор (нейтрализованный по лакмусу), сульфосалициловая кислота, 20% раствор, метиленовая синь, 0,002% раствор, вазелиновое масло или керосин.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, шпатель, капельницы, стеклянная палочка, водяная баня с термометром или термостат, карандаш для стекла.

Порядок выполнения работы

  1.  В три пронумерованные пробирки вносят шпателем равные количества мышечной кашицы 0,2 г.
  2.  В первую пробирку добавляют 10 капель раствора цитрата натрия, во вторую — сукцината натрия, а в третью (контрольную) — 10 капель раствора сульфосалициловой кислоты. Если между кусочками мышцы остались пузырьки воздуха, их удаляют стеклянной палочкой.
  3.  В каждую пробирку добавляют по капле раствора метиленовой сини и по 10 капель вазелинового масла. Вазелиновое масло покрывает поверхность раствора, благодаря чему создаются анаэробные условия и тем самым предотвращается окисление восстановленных соединений кислородом воздуха.
  4.  Пробирку помещают в термостат или водяную баню при 37°С. Отмечают постепенное обесцвечивание метиленовой сини в пробирках с раствором цитрата и сукцината. В контрольной пробе метиленовая синь не обесцвечивается, т.к. фермент был инактивирован сульфосалициловой кислотой.

Результаты практических работ по обнаружению действия дегадрогеназы молока и дегидрогеназ лимонного цикла занести в таблицу.

Источник фермента

Фермент

Субстрат

Реакция катализируемая ферментом

Акцептор водорода

Восстановление метиленовой сини

Не инактивированный фермент

Инактвированный фермент

РАБОТА № 16. ПЕРЕВАРИВАНИЕ УГЛЕВОДОВ

В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ

Целью работы является изучение влияния слюны, желудочного сока и панкреатина (ферментного препарата, полученного из поджелудочной железы) на полисахариды пищи: крахмал и целлюлозу.

Реактивы и материалы: крахмал, 1%-ный раствор; целлюлоза, 1%-ная водная суспензия, желудочный сок; панкреатин, 5%-ный раствор; слюна; сульфат меди, 1%-ный раствор; гидроксид натрия, 10%-иый раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками; пипетки; бюретки; термостат (37 °С); газовая горелка.

Порядок выполнения работы

1. Готовят пробы соответственно таблице:

№ пробы

Раствор крахмала, мл

Суспензия целлюлозы, мл

Слюна, мл

Желудочный сок, мл

Панкреатин, мл

1

1,0

–

1,0

–

–

2

–

1,0

1,0

–

–

3

1,0

–

–

1,0

–

4

–

1,0

–

1,0

–

5

1,0

–

1,0

1,0

–

6

–

1,0

1,0

1,0

–

7

1,0

–

–

–

2,0

8

–

1,0

–

–

2,0

Для инкубации пробирки помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. После инкубации содержимое каждой пробирки анализируют на присутствие продуктов расщепления полисахарида с помощью реакции Троммера. Для этого в каждую из 8 пробирок добавляют по 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и по 5 капель 1%-ного раствора сульфата меди. Осторожно нагревают верхнюю часть раствора в пробирке до закипания на газовой горелке и кипятят в течение 1 мин. Появление красного осадка оксида меди (I) указывает на положительную реакцию Троммера в присутствии глюкозы и мальтозы.

Результаты опыта оформляют в виде таблицы:

№

Субстрат

Обнаружение продуктов реакции

Фермент, расщепляющий углеводы

Источники фермента

Объяснение результатов

РАБОТА № 17. МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ

Липиды представляют собой смесь сложных эфиров спирта глицерина и высших жирных кислот (стеариновой, пальмитиновой, олеиновой и др.). Очень велико значение входящих в состав жиров высоконепредельньгх высших жирных кислот (линолевой, линоленовой, арахидоновой). Простагландины являются веществами биологически активными, несущими информационную функцию (модулируют силу и частоту сердечных сокращений, расширяют сосуды в некоторых частях тела, обладают бронхорасширяющим действием, сокращают мускулатуру матки, в связи с чем применяются в медицине для усиления родовой деятельности, и др.). К липоидам относятся фосфолипиды, гликолипиды, сульфолипиды, стерины и стериды.

17.1. Открытие непредельных жирных кислот в жире

Непредельные жирные кислоты легко присоединяют галогены по месту двойных связей, образуя галогенпроизводные жирных кислот, что доказывается обесцвечиванием раствора брома или йода:

Реактивы и материалы: растительное масло или рыбий жир, раствор в хлороформе, бром или йод, раствор в хлороформе.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  К 15—20 каплям раствора жира в хлороформе прибавляют при взбалтывании по одной капле хлороформного раствора брома или йода (окрашен).
  2.  Вначале наблюдают обесцвечивание растворов брома или йода вследствие присоеди-нения галоидов по месту двойных связей в молекулах жирных кислот. После насыщения всех непредельных связей дальнейшее добавление растворов брома или йода обесцвечивания их не вызывает.

Сделать вывод о наличии ненасыщенных жирных кислот в исследованном жире.

17.2. Эмульгирование липидов

Эмульгирование необходимо для ускорения переваривания жиров пищи в полости кишечника ферментом липазой, так как оно вызывает увеличение поверхности соприкосновения жира с водным раствором липазы. Наибольшей эмульгирующей активностью обладают щелочно-реагирующие соли желчных кислот, которые вместе с желчью изливаются в двенадцатиперстную кишку через желчный проток. Они адсорбируются на поверхности жировых капель, образуя тончайший слой, причем гидрофильные группы желчных кислот обращены в сторону водной фазы, а гидрофобные радикалы направлены к жиру. При этом происходит уменьшение поверхностного натяжения на разделе двух фаз (вода/жир), что приводит к распаду капелек жира на более мелкие.

Реактивы и материалы: растительное масло (или рыбий жир), желчь, разведенная в 2 раза, раствор белка, натриевое мыло, 1% раствор, натрий углекислый, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Берут 5 пробирок. В первую наливают 15 капель дистиллированной воды, во вторую — 15 капель разведенной желчи, в третью—15 капель раствора белка, в четвертую — 15 капель 1% раствора мыла и в пятую — 15 капель 1% раствора соды.
  2.  В каждую пробирку добавляют по 3—4 капли растительного масла, одновременно взбалтывают содержимое всех пробирок и ставят их по порядку в штатив.

3. Наблюдают в первой пробирке расслоение неустойчивой эмульсии на жир и воду, а во второй, третьей, четвертой и пятой — образование эмульсии.

Эмульгирование жира содой обусловлено образованием мыла в результате взаимодействия углекислого натрия с присутствующими в жире свободными жирными кислотами.

Результаты опыта занести в таблицу, отметив стойкость образовавшейся эмульсии и степень ее дисперсности.

Исследуемый жир

Эмульгаторы

без

желчь

белок

мыло

сода

В выводах указать, в присутствии каких эмульгаторов получалась наиболее стойкая эмульсия. Отметить сравнительную значимость разных физиологических эмульгаторов жиров для процессов переваривания их в кишечнике.

17.3. Качественные реакции на желчные кислоты

Присутствие желчных кислот можно обнаружить реакцией Петтенкофера. Желчные кислоты дают пурпурное окрашивание с оксиметилфуролом, образующимся из фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты.

Реактивы и материалы: сахароза, 20% раствор; серная кислота, концентрированная; желчь, разведенная водой в 2 раза.

Оборудование и посуда: сухое часовое стекло, капельница, стеклянная палочка. 

Порядок выполнения работы

На сухое часовое стекло наносят 1 каплю желчи и 1 каплю раствора сахарозы, хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Рядом наносят 3 капли концентрированной серной кислоты (стекло не сдвигать с места). Через некоторое время на месте слияния капель наблюдают развитие красного окрашивания, переходящего при стоянии в красно-фиолетовое.

17.4. Роль сывороточного альбумина в транспорте высших жирных кислот в крови

Опыт заключается в сравнении растворимости свободных жирных кислот и их комплексов с сывороточным альбумином. Комплекс возникает при взаимодействии растворимой натриевой соли высших жирных кислот (мыло) с альбумином. При добавлении соляной кислоты натрий вытесняется и образуются свободные жирные кислоты:

R-COONa + НС1 → R-COOH + NaCl.

В комплексе с сывороточным альбумином высшие жирные кислоты остаются в растворе, а в отсутствие альбумина выпадают в осадок. Следует избегать избытка соляной кислоты, которая, вызывая денатурацию белка, может нарушить его способность к комплексообразованию.

Реактивы и материалы: натриевое мыло, 1% раствор, сыворотка крови, соляная кислота, 1% раствор. 

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В две пробирки вносят по 6 капель раствора мыла. В первую добавляют 20 капель сыворотки крови, во вторую – столько же воды. Пробирки слегка встряхивают.
  2.  В пробирку с добавленной водой вливают по каплям (1—2 капли) 1% раствор соляной кислоты только до появления осадка свободных жирных кислот.
  3.  В пробирку с сывороткой крови приливают такое же количество кислоты. Жирные кислоты не выпадают в осадок, так как образуют с сывороточным альбумином комплексное соединение.

Рекомендации к составлению протокола

Результаты исследования записать и обосновать различия в растворимости свободных жирных кислот и их комплексов с альбумином крови, а также указать на значение комплексообразования.

17.5. Определение общих фосфолипидов в сыворотке крови по фосфору

Фосфолипиды осаждают трихлоруксусной кислотой вместе с белками крови. Полученный осадок минерализуют и в остатке определяют неорганический фосфор. О содержании фосфолипидов в сыворотке крови судят косвенно — по количеству фосфорной кислоты, находимой колориметрически.

Реактивы и материалы: сыворотка крови, трихлоруксусная кислота, 10% раствор, хлорная кислота, 57% раствор, молибденовокислый аммоний, 4% раствор, рабочий раствор аминонафтолсульфоновой кислоты — эйконогена, рабочий стандартный раствор однозамещенного фосфорнокислого калия, содержащий в 1 мл 0,01 мг фосфора.

Оборудование и посуда: микропипетка на 0,2 мл, пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл с делениями, пробирки обычные, пробирки центрифужные, центрифуга, стеклянные бусинки, песчаная баня, фотоэлектроколориметр.

Порядок выполнения работы

  1.  В центрифужную пробирку помещают 3 мл дистиллированной воды и наливают 0,2 мл сыворотки крови. Добавляют 3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, первые 1,5 мл по каплям, встряхивая пробирку, остальные – быстрее. Оставляют стоять 1—2 минуты.
  2.  Через 1—2 минуты содержимое пробирки центрифугируют 3—5 минут. Надосадочную жидкость сливают и переворачивают пробирку, пока не стечет вся жидкость.
  3.  К полученному осадку прибавляют 1 мл 57% раствора хлорной кислоты и 1—2 стеклянные бусинки для равномерного кипения.
  4.  Пробирку нагревают 20—30 минут на песчаной бане при 180°С, пока смесь не станет бесцветной. Рекомендуется наблюдать за процессом, пока не пройдет образование пены — 5 минут. После охлаждения объем опытных проб доводят дистиллированной водой до 7 мл.

Для приготовления контрольной пробы берут 0,8 мл 57% раствора хлорной кислоты и доводят водой до 7 мл.

Готовят три стандарта (для достоверности), содержащие по 2 мл рабочего стандартного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия и по 0,8 мл 57% раствора хлорной кислоты. Объем каждой стандартной пробы дистиллированной водой доводят до 7 мл.

Для определения фосфора в каждую пробирку (опытные, контрольные и стандартные) прибавляют по 1 мл 4% раствора молибденовокислого аммония, перемешивают и добавляют по 1 мл раствора аминонафтолсульфоновой кислоты, доводя дистиллированной водой объем до 10 мл. Содержимое пробирок вновь перемешивают.

Через 20 минут после прибавления аминонафтолсульфоновой кислоты интенсивность окраски измеряют на ФЭКе против контроля при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Липоидный фосфор в 100 мл сыворотки (в мг%) рассчитывают по формуле:

X = Еоп · 0,02 · 100 / Ест · 0,2 = Еоп · 10 / Ест

где X—липоидный фосфор в мг%;

Еоп—оптическая плотность опытной пробы;

Ест — оптическая плотность стандартной пробы;

0,02 — содержание фосфора в 2 мл стандарта (мг);

0,2 — количество сыворотки в опыте (мл).

Концентрацию общих фосфолипидов вычисляют умножением полученной концентрации липоидного фосфора на 25, так как липоидный фосфор составляет 4% (1/25 часть) молекулы фосфолипидов.

Норма концентрации липоидного фосфора у взрослых — от 6,1 до 14,5 мг% или 1,97—4,68 ммоль/л (коэффициент пересчета 0,323).

Пользуясь приведенными формулами, вычислить концентрацию липоидного фосфора и общих фосфолипидов в сыворотке крови. В выводах сопоставить полученный результат с нормальными показателями.

17.6. Открытие холестерина в тканях головного мозга

Стерины — вторичные одноатомные непредельные циклические спирты, содержащие ядро циклопентанпергидрофенантрена. Представителем стеринов животных и человека является холестерин. В некоторых тканях человеческого организма находится преимущественно неэстерифицированный холестерин (эритроциты), другие ткани (надпочечники, сыворотка крови и др.) содержат также и связанный холестерин в виде эфиров с высокомолекулярными жирными кислотами (стериды). Холестерин входит в состав липопротеинов тканей и крови. В плазме крови холестерин является составной частью сложных липопротеидных комплексов (хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности, липопротеины промежуточной плотности, липопротеины низкой плотности и липопротеины высокой плотности). Особенно богаты холестерином мозг, надпочечники, яичный желток, желчь.

Реактивы и материалы: мозг, кальций сернокислый (гипс), в порошке, хлороформ, серная кислота концентрированная, уксусный ангидрид.

Оборудование и посуда: весы, ступка фарфоровая, стеклянная пластинка, сушильный шкаф, скальпель или нож, стеклянная палочка или лопаточка, пипетка на 5 мл, воронка с бумажным фильтром, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Высушенный с гипсом мозг заливают в пробирке 5 мл хлороформа и экстрагируют 5 минут при комнатной температуре при интенсивном постоянном встряхивании.
  2.  Экстракт отфильтровывают в сухую пробирку, делят на две части и открывают холестерин двумя реакциями.
  3.  Для реакции Зальковского к одной части хлороформного экстракта мозга приливают равный объем концентрированной серной кислоты и содержимое перемешивают осторожным встряхиванием пробирки.
  4.  Дают жидкости отстояться. В результате образования холестерилена — продукта дегидратации холестерина верхний хлороформный слой оказывается окрашенным в красный цвет. Нижний слой (H2SO4) имеет желто-оранжевую окраску с зеленой флуюоресценцией (жидкость в проходящем свете прозрачна и желто-красного цвета, в отраженном свете кажется мутной с зеленым оттенком).
  5.  Для постановки реакции Либермана—Бурхарда к другой части хлороформного экстракта мозга приливают 7 капель уксусного ангидрида и 1—2 капли концентрированной серной кислоты.
  6.  Жидкость хорошо перемешивают, после чего она принимает сначала синюю, затем сине-зеленую и, наконец, зеленую окраску. При незначительном количестве холестерина в растворе может сразу появиться зеленая окраска. Растворы, содержащие больше холестерина (1% и выше), дают сначала красную окраску, быстро переходящую в фиолетовую, синюю и, наконец, в зеленую. Последнюю окраску обусловливает сульфокислота холестерилена.

РАБОТА № 18. ПЕРЕВАРИВАНИЕ ЖИРОВ ЛИПАЗОЙ ПОДЖЕЛУДОЧНОГО СОКА

Расщепление жиров в кишечнике на глицерин и высшие жирные кислоты совершается главным образом при участии липазы, секретируемой поджелудочной железой, и, в меньшей степени, липазы, выделяемой железами слизистой кишечника. В итоге триглицерид распадается на глицерин и три молекулы жирных кислот:

Для действия липазы на жир необходимо присутствие желчных кислот образующихся в печени. Они вызывают эмульгирование жиров приводящее к увеличению поверхности соприкосновения жира с липазой. Опыт предусматривает три варианта воздействия на молочный жир: 1) липазой без желчи, 2) липазой вместе с кислотами, 3) желчью без липазы.

Реактивы и материалы: молоко прокипяченное, фенолфталеин, 1% раствор в этиловом спирте, гидроксид натрия, 10% раствор, гидроксид натрия, 0,1 н. раствор, панкреатин - препарат поджелудочной железы, содержащий липазу (навески по 100 мг), желчь.

Оборудование и посуда: мерный цилиндр, конические колбочки на 25 и 50 мл, бюретки, пипетки на 5 мл.

Порядок выполнения работы

1. В колбочку наливают 20 мл молока и нейтрализуют его кислотность, обусловленную присутствием кислых солей. Для этого в колбу приливают 2 капли 1% раствора фенолфталеина и 4 капли 10% раствора гидроксида натрия (избегать избытка), после чего при тщательном перемешивании содержимого колбы осторожно добавляют 0,1н раствор гидроксида натрия до слабо-розовой окраски.

2.Из нейтрализованного молока готовят в конических колбочках опытные пробы по таблице.

№

Молоко, мл

Панкреатин, мг

Желчь, мл

Вода, мл

Титрование в мл 0,1 н. раствора NaOH через, мин

15

30

45

60

1

5

100

-

1

2

5

100

1

-

3

5

-

1

-

3. Пробы тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре.

  1.  Через 15 минут от начала инкубации пробы титруют из бюретки 0,1 н. раствором NaOH до слабо-розовой окраски, после чего вновь оставляют при комнатной температуре. Количество израсходованной щелочи фиксируют в таблице.
  2.  Титрование проб повторяют через 30, 45 и 60 минут от начала инкубации. Каждый раз оттитровывается то количество жирных кислот, которое освобождается из жира молока при его гидролизе липазой за данный отрезок времени (15 минут).

Изобразить графически динамику расщепления жира липазой для каждой пробы, откладывая на оси абсцисс время в минутах, а на оси ординат — количество 01 н. раствора NaOH (в мл), израсходованного на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данное время (15, 30, 45, 60 минут).

Выразить активность липазы как концентрацию карбоксильных групп жирных кислот, образовавшихся в 100 мл молока за все время исследования, пользуясь следующей формулой:

где х — концентрация СООН-групп, образующихся в 100 мл молока, мг%;

0,1 — нормальность раствора NaOH;

А — количество 0,1 н. раствора NaOH, израсходованного на титрование 5 мл молока за все время инкубации (сумма всех титрований), мл;

5 — количество молока в титруемой пробе, мл.

На основании хода кривых на графике и полученных данных концентрации карбоксильных групп сделать вывод о зависимости активности липазы от присутствия желчных кислот. Отметить зависимость количества образовавшихся свободных жирных кислот от продолжительности ферментативного действия.

РАБОТА № 19. ОБМЕН БЕЛКОВ

19.1. Переваривание белков пепсином

Переваривание белков начинается в желудке под влиянием желудочного сока. Желудочный сок, выделяемый железами слизистой оболочки стенок желудка, представляет собой жидкость, содержащую 99% воды, свободную соляную кислоту, кислореагирующие фосфаты, хлористый натрий, протеолитический фермент — пепсин, липолитический фермент — липазу (расщепляет только эмульгированный жир) и другие вещества. Пепсин выделяется главными клетками желез слизистой желудка в виде неактивного профермента — пепсиногена. Под влиянием соляной кислоты от пепсиногена отщепляются полипептиды, в результате чего пепсиноген преврщается в активный фермент пепсин, способный к гидролитическому расщеплению пептидных связей белков. Пепсин является эндопептидазой, так как действует преимущественно на внутренние пептидные связи. Однако под влиянием пепсина разрываются также и некоторые пептидные связи, находящиеся на конце полипептидной цепи, что сопровождается появлением свободных аминокислот. В результате гидролиза белков пепсином образуются пептоны — смесь более или менее сложных полипептидов, а также в небольшом количестве свободные аминокислоты.

Реактивы и материалы: фибрин, желудочный сок или 0,1% раствор пепсина в 0,2% соляной кислоте, натрий углекислый, 2% раствор, гидроксид натрия, 0,4% раствор, соляная кислота, 0,2% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, лакмусовая бумага, капельницы, термометр, водяная баня или термостат на 38—40 °С.

Порядок выполнения работы

  1.  В одну пробирку наливают 20 капель желудочного сока или 0,1% раствора пепсина в 0,2% соляной кислоте.
  2.  В другую пробирку помещают 20 капель желудочного сока или 0,1 % раствора пепсина в 0,2% соляной кислоте, нейтрализованных содой.
  3.  В третью пробирку вливают 20 капель желудочного сока или 0,1% раствор пепсина в 0,2% соляной кислоте, предварительно под щелоченных 0,4% раствором NaOH.
  4.  В четвертую пробирку закапывают 20 капель желудочного сока или 0,1 % раствора пепсина в 0,2% соляной кислоте, предварительно подвергнутых кипячению.
  5.  В пятую пробирку отмеривают 20 капель 0,2% раствора НСl.
  6.  Во все пять пробирок добавляют одинаковые небольшие кусочки фибрина, и пробирки помещают в термостат при 38—40°С.
  7.  После переваривания (растворения) фибрина в первой пробирке (примерно через 30 минут от начала опыта) все пробирки вынимают из термостата и наблюдают за изменениями фибрина.

Переваривание фибрина в первой пробе указывает на то, что пепсин действует в присутствии соляной кислоты. Фибрин во второй и третьей пробах остается неизмененным, так как пепсин в нейтральной и щелочной среде неактивен. В четвертой пробе, где фермент был инактивирован кипячением, и в пятой пробе, в которой пепсина не было, может произойти лишь набухание фибрина под влиянием соляной кислоты.

8. Содержимое каждой пробирки фильтруют и с фильтратом производят биуретовую реакцию. Положительная реакция обнаруживается только в первой пробе, где был активный пепсин, соляная кислота, фибрин, что указывает на присутствие в фильтрате продуктов переваривания белка.

Результаты наблюдений занести в таблицу.

№ пробы

Фермент

Субстрат

Реакция среды

Инактивация пепсина кипячением

Видимые изменения фибрина

Биуретовая реакция

Выводы. В соответствии с полученными данными указать оптимальные условия для переваривания белка пепсином и роль соляной кислоты в этом процессе.

19.2. Переваривание белков ферментами поджелудочной железы

Переваривание белков в двенадцатиперстной кишке происходит под действием ферментов поджелудочной железы трипсина и химотрипсина, которые действуют как на белки, так и на продукты расщепления белков – полипептиды, расщепляя их до коротких пептидов и небольшого количества свободных аминокислот. В качестве источника ферментов в опыте используют 2%-ный раствор панкреатина в 0,5%-ном растворе карбоната натрия или глицериновую вытяжку из поджелудочной железы. В качестве субстрата — кусочки фибрина или яичного белка.

Реактивы и материалы: 2%-ный раствор панкреатина в 0,5%-ном растворе карбоната натрия или глицериновая вытяжка поджелудочной железы; фибрин или денатурированный белок куриного яйца, уксусная кислота, 1%-ный раствор; синий лакмус.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками; термостат (37—40 °С).

Порядок выполнения работы

В три пробирки наливают по 1 мл раствора панкреатина или вытяжки поджелудочной железы. Содержимое первой пробирки кипятят 2 мин и охлаждают под струей холодной воды. Содержимое второй пробирки нейтрализуют 1%-ным раствором уксусной кислоты до кислой реакции на лакмус.

Во все три пробирки опускают по кусочку фибрина или яичного белка и помещают их в термостат при 37 – 40 °С.

Через 40—60 мин пробирки вынимают, перемешивают, отмечают видимые изменения и проделывают биуретовую реакцию со всеми пробирками.

Полученные результаты вносят в таблицу и делают выводы.

№ пробы

Субстрат

Фермент

Реакция среды

Видимые изменения

Биуретовая проба

Выводы

РАБОТА №20. АНАЛИЗ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА

Путем последовательного действия протеолитических ферментов белки лишаются видовой и тканевой специфичности. Примерно 95-97% белков пищи всасывается в виде свободных аминокислот. Ферментный аппарат осуществляет поэтапное, избирательное расщепление пептидных связей. Превращение профермента пепсиногена в активный фермент пепсин происходит в желудке и протекает в присутствии соляной кислоты.

20.1. Титрование кислот желудочного содержимого

Кислоты желудочного содержимого оттитровывают 0,1 н. раствором гидроксида натрия. Для установления момента полного оттитровывания свободной соляной кислоты и других кислореагирующих соединений применяют различные индикаторы с разными зонами перехода окраски. Титруют на белом фоне.

Реактивы и материалы: пепсин, Фенолфталеин, 1% спиртовой раствор. Интервал перехода окраски при рн 8,2—10,0. стабилен при хранении при комнатной температуре, 4-диметиламиноазобензол (метиловый желтый, диметиловый желтый), 0,5% спиртовой раствор. интервал перехода окраски при рн 2,9—4,0. стабилен при хранении при комнатной температуре, ализаринсульфоновокислый натрий [ализариновый красный], 1% водный раствор. интервал перехода окраски при рн 4,3—6,3. стабилен при хранении при комнатной температуре, гидроксид натрия, 0,1 н. раствор.

Оборудование и посуда: пипетки на 5 мл, конические колбы на 50 мл, бюретки на 25, 50 или 100 мл.

Порядок выполнения работы

  1.  В колбу наливают 5 мл профильтрованного желудочного содержимого, добавляют 1-2 капли 1% спиртового раствора фенолфталеина 1-2 капли 0,5% спиртового раствора диметиламиноазобензола и титруют при постоянном помешивании 0,1 н. раствором гидроксида натрия до перехода первоначального красного цвета в желто-розовый («цвет семги»). Количество щелочи, израсходованной на титрование, соответствует количеству свободной соляной кислоты и выявляется индикатором диметиламиноазобензолом.
  2.  Не доводя уровня щелочи в бюретке до первоначального, продолжают титрование до перехода окраски в стойкий красный цвет. Общее количество щелочи, считая от начального уровня ее в бюретке, соответствует общей кислотности и выявляется индикатором фенолфталеином.
  3.  В другую колбу отмеривают 5 мл желудочного содержимого, добавляют 1-2 капли 1% водного раствора ализаринсульфоновокислого натрия и титруют при постоянном помеши-вании до перехода первоначальной желтой окраски в фиолетовую. Количество щелочи, использованной на титрование, соответствует сумме всех веществ, дающих кислую реакцию, кроме связанной соляной кислоты, и выявляется индикатором ализаринсульфоновокислым натрием. В каждой порции извлеченного желудочного содержимого определяют свободную соляную кислоту, общую кислотность и, в случае необходимости, связанную соляную кислоту.

Расчет. Результаты титрования выражают в мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия, затраченных на нейтрализацию свободной соляной кислоты и других кислореагирующих соединений в 100 мл желудочного содержимого (условные титрационные единицы). Так как для титрования берут 5 мл желудочного содержимого, а расчет ведут на 100 мл, то количество потраченной щелочи умножают на 20. Одна условная титрационная единица соответствует концентрации соляной кислоты, равной 1 ммоль/л.

Пример расчета

Первая порция (первая колба):

1. 1,5мл 0,1 н. NaOH (желто-розовый цвет).

Свободная соляная кислота—1,520 = 30 титр. ед. (30 ммоль/л).

2. 2,6 мл 0,1 н. NaOH (красный цвет).

Общая кислотность — 2,620 = 52 титр. ед. (52 ммоль/л). Вторая порция (вторая колба):

2 мл 0,1 н. NaOH (фиолетовый цвет).

Все вещества, дающие кислую реакцию, кроме связанной соляной кислоты,

2,020 = 40 титр. ед. (40 ммоль/л).

Связанная соляная кислота — 52—40 = 12 титр. ед. (12 ммоль/л).

Нормальные величины: свободная соляная кислота — 20—40 титр. ед. (20—40 ммоль/л), общая кислотность — 40—60 титр. ед. (40—60 ммоль/л), связанная соляная кислота — 4—20 титр. ед. (4—20 ммоль/л).

Результаты титрования записать в таблицу.

Количество жидкости, взятой для титрования

Количество 0,1н. раствора гидроксида натрия, израсходованного на титрование, мл

Количество титрационных единиц (ммоль/л)

до желто-розового цвета

до красного цвета

до фиолетового цвета

свободная соляная кислота

общая кислотность

связанная соляннаякислота

20.2. Колориметрический метод определения протеолитической активности поджелудочного сока

Для определения протеолитического активности поджелудочного сока используют метод, основанный на количественном определении продуктов расщепления белка (аминокислот, пептидов и др.) под влиянием поджелудочного сока. Так называемый тирозиновый метод определения – протеолитической активности, поджелудочного сока основан на определении тирозина, образующегося в результате переваривания белков сыворотки или плазмы крови, количество, которого прямо пропорционально активности протеолитических ферментов (трипсина, химотрнисина). Тирозин с фенольным реактивом дает синее окрашивание, интенсивность которого определяется на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. В качестве субстрата в данной работе используется сухая плазма крови крупного рогатого скота.

Реактивы и материалы: вода, раствор сухой плазмы крови, разведенный поджелудочный сок, трихлоруксусная кислота, 0,5 н. раствор NaOH, фенольный реактив.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, термостат, стеклянные палочки, фильтровальная бумага, вороки, фотоэлектроколориметр с красным светофильтром.

Порядок выполнения работы

В опытную и контрольную пробирки наливают по 5 мл 2,5% раствора сухой, плазмы крови, в третью пробирку наливают 3 мл разведенного поджелудочного сока. Все три пробирки помещают в термостат при 38° на 10 минут.

После прогревания в опытную и контрольную пробирки из третьей пробирки наливают по 1 мл разведенного поджелудочного сока, а в контрольную пробу добавляют еще 10 мл трихлоруксусной кислоты. Пробы быстро перемешивают и, отметив время, помещают в термостат.

Через 20 минут в опытную пробирку приливают 10 мл трихлоруксусной кислоты, перемешивают и затем фильтруют.

В фильтрате проводят определение образовавшегося тирозина. Для этого в две другие пробирки наливают по 10 мл 0,5 н. раствора NaOH, по 5 мл фильтрата, соответственно из опытной и контрольной проб, по 1 мл фенольного реактива и быстро перемешивают. Появляется синее окрашивание, постенно усиливающееся между 20-й и 40-й минутами. В этом промежутке и определяется интенсивность окраски на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром.

Разность между оптической плотностью опытной и контрольной проб соответствует величине прироста тирозина под влиянием ферментативного гидролиза белков плазмы.

Количество тирозина определяют пи калибровочной, кривой, которая строится по стандартным растворам тирозина, содержащим 0,5—1,0—1,5 мг тирозина (исходная концентрация — 1 мг тирозина в 5 мл раствора). Ни оси абсцисс откладывают концентрации тирозина, на оси ординат — соответствующие показания оптических плотностей.

РАБОТА № 21. ИССЛЕДОВАНИЕ ГОРМОНОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

Гормоны принадлежат к различным классам органических соединений, синтезируемых в эндокринных железах или железах внутренней секреции. Это биологически активные вещества, оказывающие регуляторное влияние на обмен веществ.

21.1. Гормон поджелудочной железы — инсулин

Инсулин образуется в (i-клетках островков Лангерганса из своего предшественника — проинсулииа. По химической природе он является белком. Полипептидные цепи соединены в двух точках дисульфидными мостиками. Инсулин дает почти все характерные цветные реакции на белок.

Реактивы и материалы: препарат инсулина в ампулах (можно использовать в разведении 1:100), NaOH, 10%-ный раствор; CuSO4, 1%-ный раствор; реактив Миллона; ацетат свинца, 5%-ный раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками; пипетки.

Порядок выполнения работы

1. Биуретовая реакция. К 1 мл раствора инсулина добавляют 5—б капель раствора гидроксида натрия и 1—2 капли раствора сульфата меди (II), перемешивают. Жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.

  1.  Реакция Миллона. К 5—10 каплям раствора инсулина добавляют 2—3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. Образуется осадок в виде сгустка красного цвета.
  2.  Реакция Фоля. К 5—10 каплям раствора инсулина (использовать неразбавленный препарат) добавляют 2—Змл раствора NaOH и кипятят 10 мин на маленьком пламени горелки. После охлаждения добавляют 1—2 капли реактива Фоля — появляется бурое окрашивание.

Примечание. Приготовление реактива Фоля: к одной капле раствора ацетата свинца добавляют по каплям раствор 10%-ного гидроксида натрия до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца. При стоянии или нагревании бурое окрашивание может усилиться до черного и может выпасть черный осадок.

21.2. Гормоны щитовидной железы

Гормоны щитовидной железы представляют собой иодированные производные аминокислоты тирозина. При сплавлении измельченной и высушенной ткани щитовидной железы с углекислым калием или натрием образуется йодистый калий. При взаимодействии йодистого калия с йодноватокислым калием в кислой среде выделяется свободный йод, который можно обнаружить по окраске с крахмалом:

5KI + KIO3 + 3H2SO4 → 3I2 + 3K2SO4 + 3Н2О

Реактивы и материалы: ткань щитовидной железы, измельченная и высушенная, калий или натрий углекислый, кристаллический (na2co310н2о), серная кислота, концентрированная, крахмал, 1% раствор, калий йодноватокислый, 1% раствор.

Оборудование и посуда: ступка фарфоровая с пестиком, тигель фарфоровый, стеклянные палочки, воронки диаметром 3—5 см, с бумажными фильтрами, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В ступку помещают 100—200 мг измельченной и высушенной ткани щитовидной железы и тщательно растирают ее с 500 мг кристаллического углекислого калия или натрия.
  2.  Растертую массу переносят в тигель, который ставят на асбестовую сетку и нагревают на слабом огне, не допуская обугливания. Сплавление заканчивают, когда сплав станет порошкообразным со своеобразным запахом и появится слегка заметный дымок.

3.Содержимое тигля охлаждают, после чего прибавляют 2 мл горячей воды, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и отфильтровывают.

4. К фильтрату прибавляют 3—5 капель концентрированной серной кислоты, 2—3 капли 1% раствора крахмала и 1—2 капли 1% раствора йодноватокислого калия. Выделившийся йод дает с крахмалом синее окрашивание. Результаты работы оформить в виде таблицы.

Название желез внутренней секреции

Гормон, выделяемый железой

Химическое строение гормона

Исследуемый материал

Реактивы

Что наблюдается

Чем обусловлена реакция

Отметить роль исследуемых гормонов в обмене веществ, проявление гипер- и гипофункции соответствующих желез внутренней секреции. В выводах сопоставить химизм проделанных качественных реакций с химической природой изучаемых гормонов или с наличием в их молекуле характерных группировок.

21.3. Гормон мозгового слоя надпочечников – адреналин

В основе химической структуры адреналина лежит ядро пирокатехина. При взаимодействии адреналина с хлорным железом возникает изумрудно-зеленое окрашивание. Реакция обусловлена наличием пирокатехиновой группировки в молекуле адреналина. Образуется соединение типа фенолята зеленого цвета.

Подобное окрашивание в присутствии хлорного железа получается с пирокатехином.

Реактивы и материалы: адреналин, 0,1% раствор, хлорное железо, 3% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, пирокатехин, 0,05% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку помещают 10 капель 0,1% раствора адреналина и прибавляют 1 каплю 3% раствора хлорного железа. Жидкость окрашивается в изумрудно-зеленый цвет.
  2.  К содержимому пробирки добавляют 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия. Окраска переходит в винно-красную, а затем в коричневую.
  3.  Проделывают такую же пробу с 0,05% раствором пирокатехина и убеждаются в том, что она аналогична реакции с адреналином. Это доказывает присутствие ядра пирокатехина в молекуле адреналина.

Сделать вывод.

21.4. Гормоны коркового слоя надпочечников (кортикостероиды)

Кортикостероиды имеют в основе своего строения кольцо циклопентанпергидро-фенантрена. Они синтезируются в корковом слое надпочечников из ацетилкоэнзима А (активная форма уксусной кислоты, источником которой являются как углеводы, так и липиды) или из холестерина. Важнейшим промежуточным продуктом является прогестерон. Из прогестерона образуются также женские (эстрогены) и мужские (андрогены) половые гормоны.

Основными нейтральными 17-кетостероидами, встречающимися в моче человека, являются андростерон, этиохоланолон, дегидроэпиандростерон, эпиандростерон и др.

Реакция открытия 17-кетостероидов в моче основана на способности 17-кетостероидов давать в щелочной среде с мета-динитробензолом продукт конденсации красного или красно-фиолетового цвета за счет метиленовой группы (СН2), соседней с кетогруппой. Интенсивность окраски пропорциональна количеству находящихся в моче 17-кетостероидов.

Реактивы и материалы: моча, метадинитробензол, 2% раствор в этаноле, натрия гидроксид, 30% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  В пробирку вносят 5 капель мочи, добавляют 5 капель 30% раствора гидроксида натрия и 5 капель 2% раствора мета-динитробензола.
  2.  Содержимое пробирки смешивают и оставляют стоять на несколько минут. При стоянии появляется красное окрашивание, обусловленное наличием 17-кетостероидов в моче. Сделать вывод.

21.5. Гормоны половых желез

В основе структуры половых гормонов лежит кольцо циклопентанпергидрофенантрена. Их биосинтез может происходить в коре надпочечников, однако образование основной массы этих гормонов сосредоточено избирательно: андрогенов – в мужских половых железах, эстрогенов – в яичниках (во время беременности также в плаценте).

Женские половые гормоны (эстрадиол, эстрон, эстриол) содержат фенолъное кольцо (А) и поэтому дают ряд реакций, характерных для фенолов.

При взаимодействии диазореактива с эстроном образуется соединение, окрашенное в желтый цвет.

Реактивы и материалы: фолликулин, масляный раствор (в ампулах), сульфаниловая кислота, 1% раствор, азотистокислый натрий, 5% раствор, углекислый натрий, 10% раствор.

Оборудование и посуда: штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Получают диазореактив. Для этого в пробирке смешивают 3 капли 1% раствора сульфаниловой кислоты и 3 капли 5% раствора азотистокислого натрия.
  2.  К диазореактиву добавляют 3 капли масляного раствора фолликулина и 2 капли 10% раствора углекислого натрия.
  3.  Пробирку встряхивают и наблюдают постепенное окрашивание жидкости в желтый цвет.

Сделать вывод.

21.6. Открытие фолликулина

Реактивы и материалы: спиртоый раствора фолликулина, концентрированная серная кислота, вода, 30%-ный раствор гидроксида натрия, реактив Фолина.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, водяная баня.

Порядок выполнения работы

Реакция с концентрированной серной кислотой

В пробирку берут 1 мл спиртового раствора фолликулина и помещают ее в кипящую водяную баню на 5—10 мин для испарения спирта. К оставшемуся в пробирке фолликулину добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты и пробирку вновь помещают в кипящую водяную баню на 5—10 мин. Жидкость в пробирке окрашивается в соломенно-желтый цвет, переходящий при нагревании в оранжевый и имеющий зеленую флюоресценцию.

Образование фенолята фолликулина

В две сухие пробирки приливают по 0,5 мл раствора фолликулина. В первую добавляют 1 мл воды и отмечают образование эмульсии фолликулина. Во вторую, добавляют такое же количество 30%-ного раствора гидроксида натрия — помутнения не возникает, так как в щелочной среде происходит образование фенолята фолликулина.

Реакция на фенольную группу

К 2 мл раствора фолликулина добавляют 1 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия и 1 мл реактива Фолина. Возникает синее окрашивание, характерное для фенольной группы.

РАБОТА № 22. МИНЕРАЛЬНЫЙ ОБМЕН

Минеральные вещества поступают в организм с пищей и водой. Основную часть этих соединений составляют хлористые, сернокислые, фосфорнокислые и. углекислые соли калия, натрия, магния и кальция. В небольших количествах (мг, мкг) поступают йод, бром, фтор, железо, медь, марганец, цинк, кобальт, молибден и другие микроэлементы.

Минеральные вещества в организме содержатся в двух состояниях: в виде свободных ионов и в связанной с органическими веществами форме (белками, ферментами, витаминами). Что касается микроэлементов, то все они находятся в связанном состоянии (кобальт — в витамине В12, медь — в тирозиназе и церулоплазмине, цинк — в карбоангидразе, в инсулине). Минеральные вещества связываются с органическими молекулами ковалентными (йод — в тиреоглобулине, в тироксине), электростатическими (магний и кальций — с различными ферментами) и координационными связями (железо — в гемопротеидах).

22.1. Определение фосфатов

Фосфор в организме находится в виде неорганических солей и органических соединений (фосфорные эфиры углеводов, фосфопротеины, нуклеиновые кислоты, АМФ, АДФ, АТФ, фосфолипиды и др.). Он широко участвует в обменных процессах организма – белковом, углеводном, липидном.

22.1.1. Определение неорганического фосфора в сыворотке крови по восстановлению фосфорно-молибденовой кислоты

Принцип метода заключается в том, что после осаждения белков сыворотки в центрифугате остается неорганический фосфор, который с молибденовой кислотой образует фосфорно-молибденовую кислоту. Последняя восстанавливается эйконогеном до синего фосфорно-молибденового комплекса. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации неорганического фосфора в сыворотке крови.

Реактивы и материалы: сыворотка крови, трихлоруксусная кислота, 10% раствор, аммоний молибденовокислый, 5% раствор, раствор эйконогена, рабочий стандартный раствор однозамещенного фосфорнокислого калия, приготовленный из основного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия и содержащий 0,02 мг фосфора в 1 мл.

Оборудование и посуда: пипетки емкостью 1, 2 и 5 мл с делениями, центрифуга, фотоэлектроколориметр, штатив с пробирками или колбочки.

Порядок выполнения работы

  1.  К 1 мл сыворотки прибавляют 4 мл дистиллированной воды, 5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и смешивают. Выпадает осадок белков. Через 10 минут центрифугируют при 3000 об/мин. 10 минут.
  2.  К 5 мл центрифугата добавляют 1 мл 5% раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл дистиллированной воды.
  3.  Смесь оставляют на 20 минут при комнатной температуре, затем измеряют оптическую плотность на ФЭКе против контроля при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) в кювете толщиной слоя 1,0 см.

Калибровочный график

Контроль готовят одновременно с опытной пробой. К 2,5 мл трихлоруксусной кислоты приливают 2,5 мл воды, 1 мл молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена, 1,8 мл воды. Оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из рабочего стандартного раствора готовят разведения, как указано в таблице.

№ пробы

Рабочий стандартный раствор, мл

Раствор трихлоруксусной кислоты, мл

Раствор молибденовокислого аммония, мл

Раствор эйконгена, мл

Дистиллированая вода,

Содержание фосфора в пробе

мг

мг%

1

0,5

2,5

1,0

0,2

3,8

0,01

2

2

1,0

2,5

1,0

0,2

3,3

0,02

4

3

2,0

2,5

1,0

0,2

2,3

0,04

8

4

3,0

2,5

1,0

0,2

1,3

0,06

12

5

4,0

2,5

1,0

0,2

0,3

0,08

16

После 20-минутного стояния пробы измеряют как опытные против контроля. На основании полученных при фотометрировании данных строят калибровочный график на миллиметровой бумаге, откладывая на оси ординат найденные величины оптической плотности, а на оси абсцисс – соответствующие им количества фосфора.

Полученные данные содержания неорганического фосфора в сыворотке записать в таблице и сопоставить с нормальными показателями.

22.1.2. Определение фосфатов в слюне

Реактивы и материалы: трихлоруксусная кислота (тху), 10% раствор, аммоний молибденовокислый, 5% раствор в 5 н. растворе H2SO4 с добавлением 0,5% раствора аскорбиновой кислоты.

Оборудование и посуда: фильтровальная бумага, воронки для фильтрования, термостат, пробирки.

Порядок выполнения работы

  1.  2 мл слюны осаждают 2 мл 10% раствора ТХУ. Фильтруют.
  2.  К 2 мл фильтрата прибавляют 4 мл 5% раствора молибденовокислого аммония в 5 н. H2SO4 с добавлением 0,5% раствора аскорбиновой кислоты. Перемешивают и инкубируют в термостате при 45°С в течение 20 минут.

Наблюдают появление синего преходящего окрашивания, и выпадение осадка желтого цвета комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония. Связать обнаружение фосфатов кальция в слюне с состоянием эмали зуба.

22.2. Определение кальций

Кальций участвует в поддержании определенной проницаемости всех клеточных мембран, уменьшает уровень возбудимости нервных клеток (при недостатке его наступает перевозбуждение — тетания), принимает участие в свертывании крови, выполняет опорные функции, входя в состав костной ткани, активирует ряд ферментов. Всасывание кальция, поступающего с пищей, осуществляется путем связывания его со специальным белком, который находится в щеточной кайме клеток кишечного эпителия, после чего кальций транспортируется внутрь клеток. Синтез кальцийсвязывающего белка происходит в цитоплазме клеток кишечника при помощи активной формы витамина D3 – 1,25 – (OH)2D3.

Метод количественного определение кальция в сыворотке крови по де Ваарду основан на осаждении кальция непосредственно из сыворотки без предварительного осаждения белков в виде щавелевокислого кальция:

Оксалат кальция разлагается при нагревании с серной кислотой:

Освободившаяся щавелевая кислота оттитровывается перманганатом калия:

По количеству щавелевой кислоты, определенной титрованием перманганатом калия, выясняют количество кальция, которое было с ней связано.

Реактивы и материалы: сыворотка крови, щавелевокислый аммоний, 4% раствор, аммиак, 2% раствор, серная кислота, 1 н. раствор, марганцовокислый калий, 0,01 н. раствор.

Оборудование и посуда: центрифуга, центрифужные весы, пипетки емкостью 1 и 2 мл, стеклянные палочки или запаянные пастеровские пипетки, водяная баня, нагретая до 70 °С, микробюретка.

Порядок выполнения работы

  1.  В одну центрифужную пробирку наливают 1 мл сыворотки крови и 1 мл дистиллированной воды (опытная проба), а в другую 2 мл дистиллированной воды (контрольная проба). Эта проба служит контролем на содержание в реактивах кальция и на полноту отмывания от избытка щавелевокислого аммония.
  2.  В обе пробирки добавляют по 0,5 мл 4% раствора щавелевокислого аммония, слегка встряхивают и оставляют на 30 минут, после чего 10 минут центрифугируют. Перед центрифугированием пробирки попарно уравновешивают.
  3.  Осторожно, чтобы не взмутить осадок, опрокидывают обе пробирки и сливают всю жидкость, после чего края пробирок протирают фильтровальной бумагой для полного удаления жидкости. Щавелевокислый кальций в опытной пробирке остается на дне в виде белого осадка
  4.  Осадок щавелевокислого кальция отмывают от избытка щавелевокислого аммония и других веществ сыворотки слабым раствором аммиака (в слабощелочной среде щавелевокислый кальций нерастворим).

Для этого в обе центрифужные пробирки наливают по 2 мл 2% раствора аммиака, встряхивают и вновь центрифугируют в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, и промывание осадка производят еще 2 раза, повторяя манипуляции, описанные выше.

  1.  Сливают жидкость после последнего центрифугирования, и в обе пробирки вносят по 1мл 1 н. раствора серной кислоты для растворения осадка щавелевокислого кальция. Осадки размешивают стеклянными палочками и, не вынимая их, помещают пробирки в нагретую водяную баню на 2 минуты.
  2.  Горячий раствор титруют при помешивании палочками из микробюретки 0,01 н. раствором перманганата до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение одной минуты.

Расчет производят по формуле:

х = (а – б) • 0,2 • 100,

где х — количество кальция в сыворотке крови, мг%;

а — количество 0,01 н. раствора марганцовокислого калия, израсходованное на титрование опытной пробы, мл;

б — количество 0,01 н. раствора марганцовокислого калия, потраченное на титрование контрольной пробы, мл;

0,2 – количество кальция, эквивалентное 1 мл 0,01 н. раствора перманганата, мг;

100 — коэффициент для пересчета на 100 мл сыворотки.

Если содержание кальция желательно выразить в ммоль/л, то полученное значение (х) умножают на 0,25.

Результаты определения занести в таблицу. Сопоставить полученные данные с нормальными величинами содержания кальция в сыворотке крови.

22.3. Обнаружение роданидов в слюне

Роданиды слюны обнаруживают по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хлорного железа. Это типичная и чувствительная реакция на роданиды обусловлена образованием роданистой соли трехвалентного железа в результате взаимодействия ионов Fe3+ и SCN- и образования различных комплексов, имеющими состав от Fe(H2O)5NCS2+ до Fe(NCS)63-. Некоторые органические соединения, например, соли лимонной и уксусной кислот, препятствуют образованию окраски.

Реактивы и материалы: хлорное железо, 0,01% раствор, соляная кислота, 2% раствор.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, стеклянная палочка.

Порядок выполнения работы

  1.  К 5 каплям слюны добавляют 2 капли 2% раствора HCl и 2 капли 0,01% раствора FeCl3.

Развивается красное окрашивание.

В гранулоцитах локализован фермент лактопероксидаза, которая окисляет имеющийся в слюне роданид с помощью перекиси водорода бактериального происхождения в гипотиоционат:

Гипотиоционат чрезвычайно бактерициден и совместно с Н2О2 или ее радикалами действует антикариесогенно. Содержание роданидов велико в слюне курильщиков, что связано с поступлением в их организм синильной кислоты табачного дыма.

При составлении протокола сравните интенсивность окраски роданида железа в слюне курильщика и у некурящих табак.

22.4. Определение кальция и фосфора в ткани зуба

В построении зуба принимают участие три вида плотных тканей: эмаль, дентин, цемент.

Неорганические вещества зубной ткани представлены главным образом гидроксиапатитом [Са3(РО4)2]3•Са(ОН)2. Это малорастворимые кристаллы с высокой механической прочностью обеспечивают опорную функцию костной и зубной тканей. Находящиеся в кристаллической решетке гидроксильные ионы могут обмениваться на ионы фтора и хлора с образованием фторапатита [Са3(РО4)2]3 • CaF2 и хлорапатита [Са3(РО4)2]3 • СаСl2.

Реактивы и материалы: зубы высушенные спиртом и эфиром, соляная кислота, 10% раствор, щавелевокислый аммоний, насыщенный раствор, метиловый красный, 0,1% спиртовой раствор, аммиак, разбавленный водой в отношении 1:4, серная кислота, разбавленная водой в отношении 1:4, марганцовокислый калий, 0,05 н. раствор, аммоний молибденовокислый, 5% раствор, раствор эйконогена, 10. рабочий стандартный раствор однозамещенного фосфорнокислого калия, приготовленный из основного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия и содержащий 0,02 мг фосфора в 1 мл.

Оборудование и посуда: весы аптечные, конические колбы, мерные цилиндры на 50 мл, мерные колбы на 50 и 100 мл, пипетки емкостью 1, 2 и 5 мл с делениями, центрифуга, центрифужные весы, стеклянные палочки, водяная баня, нагретая до 70 °с, микробюретки, фотоэлектроколориметр, штатив с пробирками.

Порядок выполнения работы

  1.  Для исследования минерального состава зуба необходимо растворить минеральные вещества (преимущественно апатиты) в соляной кислоте. Для этого навеску в 0,5 г зуба помещают в колбу и добавляют 30 мл 10% раствора соляной кислоты. Содержимое колбы кипятят на сетке под тягой.
  2.  Когда зуб полностью растворится, содержимое колбы охлаждают и переносят количественно в мерную колбу или цилиндр на 50 мл. Объем жидкости доводят до 50 мл, добавляя дистиллированную воду. Полученный гидролизат используют для качественного обнару-живания кальция и фосфора и их количественного определения.
  3.  Качественная реакция на кальций. К 2 мл гидролизата приливают избыток насыщенного раствора щавелевокислого аммония до выпадения белого кристаллического осадка оксалата кальция.
  4.  Качественная реакция на фосфор. К 2 мл гидролизата прибавляют избыток раствора молибденовокислого аммония и нагревают. Образуется фосфорномолибденовокислый аммоний, окрашивающий жидкость в желтый цвет. При дальнейшем нагревании появляется желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония.

5. Количественное определение кальция. 1 мл гидролизата (содержит 0,01 г зуба) вносят в центрифужную пробирку, добавляют 3 капли индикатора метилового красного и нейтрализуют жидкость разбавленным аммиаком до появления оранжевого окрашивания.

  1.  Для осаждения кальция наливают 3 мл насыщенного раствора щавелевокислого аммония и оставляют пробирку на 30 минут, после чего осадок отделяют центрифугированием (предварительно уравновесив пробирки) и сливают надосадочную жидкость, не взмучивая осадка.
  2.  Осадок промывают разбавленным аммиаком. Для этого в пробирку после удаления надосадочной жидкости приливают 5 мл разбавленного аммиака, перемешивая осадок стеклянной палочкой, и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают описанным выше способом, осадок еще один или два раза промывают разбавленным аммиаком.
  3.  После последнего промывания осадок растворяют в 3 мл разбавленной серной кислоты и на водяной бане подогревают пробирку до 70°С. Горячую жидкость титруют 0,05 н. раствором марганцовокислого калия до слабо-розового цвета.
  4.  Параллельно ставят и обрабатывают как опыт контрольную пробу, взяв вместо 1 мл гидролизата 1 мл дистиллированной воды.

10. Содержание кальция в зубе вычисляют по формуле:

,

где х — содержание кальция в зубе, в %;

В — количество марганцовокислого калия, использованное на титрование опыта после вычета контроля, мл;

1 — количество мг кальция, эквивалентное 1 мл 0,05 н. раствора перманганата;

10000 — коэффициент для пересчета на 100 г зуба;

1000 — коэффициент для пересчета мг в г.

  1.  Количественное определение фосфора. 0,5 мл гидролизата вносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют дистиллированной воды до метки и перемешивают содержимое.
  2.  5 мл разбавленного гидролизата (содержит 0,25 мг зуба) переносят в пробирку (или колбочку), прибавляют 1 мл 5% раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл дистиллированной воды.

Пробирку оставляют на 20 минут при комнатной температуре, затем измеряют оптическую плотность на ФЭКе против контроля при длине волны 630—690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Одновременно с опытной пробой готовят контроль. Для этого 0,3 мл 10% раствора соляной кислоты (соответствует концентрации 10% НСl в 0,5 мл гидролизата) вносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют воды до метки и перемешивают содержимое. 5 мл жидкости отмеривают в пробирку (или колбочку), добавляют 1 мл 5% раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл дистиллированной воды. Оставляют стоять при комнатной темпера-туре на 20 минут.

Калибровочный график

15. Расчет производят по калибровочному графику с учетом разведения и по формуле:

где х — содержание фосфора, %;

А — количество фосфора, найденное по калибровочному графику, мг;

0,25 — количество ткани зуба, отвечающее 5 мл разбавленного гидролизата, взятым для колориметрирования, мг;

100 — коэффициент для пересчета на 100 мг зубной ткани. Содержание фосфора в зубе составляет около 15%.

Вычислить содержание кальция и фосфора в зубной ткани и полученные данные занести в таблицу. В выводах сопоставить содержание кальция и фосфора в разных биологических объектах.

22.5. Исследование минерального состава кости

При действии на кость соляной кислоты минеральная часть кости растворяется, остаток состоит в основном из белков. Кости заливают 5%-ным раствором соляной кислоты и оставляют на сутки или более. Затем солянокислую вытяжку, содержащую минеральные соли, сливают, органическую часть кости (оссеин) заливают водой. Органическую часть кости, представляющую собой в основном костный коллаген, вынимают из воды, измельчают ножом и промывают длительное время водой. Затем кипятят с водой и получают, поскольку был исключен процесс золки, техническую желатину. В солянокислой вытяжке, полученной при мацерации кости, содержатся кальций, магний, железо, фосфорная кислота, калий, натрий, фтор. Больше всего содержится кальция и фосфорной кислоты.

22.5.1. Реакция на кальций

Открытие кальция основано на нерастворимости щавелевокислого кальция, образующегося при воздействии на растворимые соли кальция щавелевокислым аммонием. В солянокислой вытяжке кальций находится в виде хлористого кальция

CaCl2 + (NH4)2C2O4 = CaC2O4 + 2NH4Cl.

Реактивы и материалы: солянокислая вытяжка, 5% раствор щавелево-кислого аммония.

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки.

Порядок выполнения работы

В пробирку с 5 мл солянокислой вытяжки приливают 2—3 мл 5%-ного раствора щавелево-кислого аммония, встряхивают и наблюдают за образованием белого осадка щавелевокислого кальция.

22.5.2. Реакция на магний

Открытие магния основано на образовании двойной фосфорноаммонийной магниевой соли в фильтрате после удаления кальция в виде щавелевокислой соли (СаС2О4 отфильтровывают). Так как магний бывает связан главным образом с фосфорной кислотой, то обычно достаточно добавить только гидрат аммония

MgHPO4 + NH4OH → MgNH4PO4 + H2O.

В фильтрате после удаления кальция в виде щавелевокислого кальция (СаС2О4) и магния в виде фосфорноаммонийномагниевой соли (MgNH4PO4) открывают оставшуюся фосфорную кислоту. Для этого к фильтрату добавляют магнезиальную смесь, выпадает осадок (MgNH4PO4).

Реактивы и материалы: для приготовления магнезиальной смеси берут 11 г MgCl2, добавляют 14 г NH4Cl, затем 25 мл NH4OH (плотность 0,91) и 175 мл воды.

Оборудование и посуда: пробирки, водяная баня.

Порядок выполнения работы

Наличие фосфорной кислоты в полученном осадке проверяют молибденовокислым аммонием (NH4)MoO4 Осадок растворяют в небольшом количестве 10%-ного раствора азотной кислоты и нагревают с 3 мл (NH4)MoO4 на водяной бане. В присутствии фосфорной кислоты после охлаждении выпадает осадок фосфорномолибденовокислого аммония.

РАБОТА № 23. БИОХИМИЯ МЫШЕЧНОГО СОКРАЩЕНИЯ

23.1. Разделение белков мышечной ткани

В солевой вытяжке из мышечной ткани содержатся следующие белки: миоген, миоальбумин, актомиозин, глобулин X и миоглобин. Миоген, миоальбумин и миоглобин можно извлекать также водой.

При разбавлении солевой вытяжки водой в осадок выпадают актомиозин и глобулин X.

Реактивы и материалы: дистиллированная вода, солевая вытяжка, кристаллический хлористый натрий, насыщенный раствор сернокислого аммония (1/3 насыщения), насыщенный раствор сернокислого аммония (2/3 насыщения).

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пипетки, стеклянная палочка, химический стаканчик, воронка, фильтровальная бумага.

Порядок выполнения работы

1. В пробирку с дистиллированной водой постепенно добавляют по каплям солевую вытяжку. В момент смешивания капли вытяжки с водой хорошо видно образование осадка водонерастворимых белков (актомиозина и глобулина X).

  1.  К солевой вытяжке, помещенной в пробирку, добавляют при энергичном встряхивании кристаллический хлористый натрий до насыщения. В осадок выпадают актомиозин, глобулин X и частично миоген.
  2.  В химический стаканчик помещают 20 мл солевой вытяжки и добавляют 10 мл насыщенного раствора сернокислого аммония ('/а насыщения). Выпавший осадок актомиозина отфильтровывают и к 20 мл фильтрата добавляют 7 мл насыщенного раствора сернокислого аммония (2/3 насыщения). В осадок выпадают миоген и глобулин X.

23.2. Ферменты мышечной ткани

Мышечная ткань богата ферментами.

Сукцинатдегидрогеназа — этот фермент участвует в процессе клеточного дыхания. Он отнимает водород от янтарной кислоты, окисляя ее в фумаровую. Доказать наличие в мышечной ткани сукцинатдегидрогеназы можно реакцией с метиленовой синью.

Метиленовая синь способна окисляться и восстанавливаться, при этом окисленная форма ее имеет синюю окраску, а восстановленная — бесцветна. Метиленовая синь может служить промежуточным переносчиком водорода

Реактивы и материалы: мышечная кашица, 3% раствор янтарной кислоты нейтрализованной 10% раствором гидроксида натрия и доведенной до слабощелочной реакции по лакмусу, 0,02% водный раствор метиленовой сини.

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы, пипетки, термостат.

Порядок выполнения работы

В две пробирки помещают по 3—4 г мышечной кашицы.

В первую пробирку добавляют 0,5 мл 3% раствора янтарной кислоты нейтрализованной 10% раствором гидроксида натрия и доведенной до слабощелочной реакции по лакмусу.

В обе пробирки добавляют по две капли 0,02% водного раствора метиленовой сини, встряхивают и ставят в термостат при 37 °С.

Через некоторое время в первой пробирке метиленовая синь обесцвечивается, во второй — сохраняет первоначальную окраску.

23.3. Экстрактивные вещества мышечной ткани

В мышечной ткани содержится 0,2—0,3% креатина и 0,003% креатинина.

Метод открытия креатина основан на превращении его в креатинин, что происходит при нагревании с кислотами.

Креатинин открывается по реакции с пикриновой кислотой [С6Н2(NО2)3ОH] в присутствии щелочи; при этом образуется оранжево-красная окраска.

Реактивы и материалы: водная вытяжка из мяса, 1 н. соляная кислота, 1 н. раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор пикриновой кислоты, 10%-ный раствор гидроксида натрия.

Оборудование и посуда: пробирки, водяная баня, воронка, фильтровальная бумага, пипетки.

Порядок выполнения работы

В пробирку помещают 10 мл водной вытяжки из мяса, добавляют 5 мл 1 н. соляной кислоты и нагревают в течение 1 ч в кипящей водяной бане.

Жидкость отфильтровывают и 5 мл фильтрата осторожно нейтрализуют 1 н. раствором гидроксида натрия по лакмусу. Затем прибавляют 2—3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и столько же 10%-ного раствора гидроксида натрия.

Появление оранжево-красной окраски указывает на наличие креатинина. Реакция зависит отчасти от присутствия в мышечной ткани креатинина, но главным образом от креатина, превратившегося в креатинин при нагревании с соляной кислотой.

23.4. Минеральные вещества мышечной ткани

В состав мышечной ткани входят К+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-, SO42-, PO43- и др. Наиболее просто их определять в остатке после озоления. Однако при температуре озоления возможны потери хлора. Поэтому, когда определяют хлор, сжигание производят только до обугливания. Большинство минеральных веществ можно определять в золе.

Для определения железа небольшое количество (несколько граммов) измельченной мышечной ткани помещают в фарфоровый тигель и озоляют обычным образом. Золу смывают в стакан 10%-ным раствором соляной кислоты, тщательно перемешивают и после настаивания в течение 5—10 мин отфильтровывают через бумажный фильтр. В фильтрате содержатся почти все минеральные составные части мышечной ткани.

Реакция основана на образовании роданового железа, имеющего красную окраску:

FeCl3 + 3KCNS = Fe(CNS)3 + 3KCl.

Реактивы и материалы: солянокислая вытяжка из золы, 5%-ный раствор роданистого калия (KCNS).

Оборудование и посуда: пробирки, капельницы.

Порядок выполнения работы

К 5 мл солянокислой вытяжки из золы добавляют 5%-ный раствор роданистого калия (KCNS) и наблюдают за появлением красной окраски.

23.5. Получение и исследование свойств желатины из сухожилий

Сухожилия крупного рогатого скота очищают от фасций, промывают водой, разрезают на куски и заливают насыщенным раствором известкового молока Ca(OH)2. На 100 г сухожилий берут 200 мл известкового молока.

Золка продолжается 1—2 недели. Золеные сухожилия промывают водой, а затем нейтрализуют. При нейтрализации сухожилия заливают 1%-ным раствором соляной кислоты и после достижения слабокислой реакции (рН около 6) по универсальному индикатору на разрезе сухожилия нейтрализацию заканчивают. Сухожилия промывают водой, затем помещают в стакан, который ставят в водяную баню при 60—70 С. Здесь выплавляется желатина. Раствор ее используют для проведения соответствующих опытов.

Реактивы и материалы: 1%-ный раствор желатины, 4%-ный раствор желатины, 1 %-ный раствор уксусной кислоты, 1%-ным раствор желатины, сухой сернокислый аммоний, насыщенный раствор танина.  

Оборудование и посуда: пробирки, пипетки, капельницы.

Порядок выполнения работы

  1.  Кипятят в пробирке 1%-ный раствор желатины и устанавливают, что этот белок не свертывается при нагревании.
  2.  В пробирку наливают 2—3 мл 4%-ного расплавленного раствора желатины, охлаждают под струей холодной воды и отмечают, что через некоторое время желатина застывает, образуя гель.
  3.  В пробирку наливают 5 мл 4%-ного расплавленного раствора желатины, добавляют 0,5 мл 1 %-ного раствора уксусной кислоты, кипятят 10—15 мин и после охлаждения наблюдают отсутствие желирующей способности. Желатина легко гидролизуется при кипячении с кислотами. Этим объясняется потеря желирующей способности.
  4.  Проделывают с 1%-ным раствором желатины ксантопротеиновую реакцию и убеждаются, что от азотной кислоты осадка не образуется, появляется лишь слабо-желтая окраска. Это указывает на то, что в желатине содержится очень мало аминокислот с бензольным ядром.

К 5 мл 1%-ного раствора желатины добавляют сухой сернокислый аммоний до выпадения желатины в осадок.

К 5 мл 1%-ного раствора желатины добавляют насыщенный раствор танина. Желатина выпадает в осадок. Реакции 5 и 6 указывают на способность желатины осаждаться реактивами, применяемыми для осаждения других белков.

23.6. Обнаружение молочной кислоты

Молочная кислота в присутствии фенолята железа (реактив Уффельманна), окрашенного в фиолетовый цвет, образует лактат железа желто-зеленого цвета.

Реактивы и материалы: мышцы, кварцевый песок, дистиллированная вода, реактив Уффельманна (20 капель 1% раствора фенола + 2 капли 1% раствора хлорного железа), смоченная водой вата.

Оборудование и посуда: ступка с пестиком, капельница.

Порядок выполнения работы

  1.  1 г мышц растирают до гомогенного состояния в ступке с небольшим количеством кварцевого песка в течение 3 мин, добавив 5 капель воды. Затем приливают 3 мл дистиллированной воды и фильтруют через смоченную водой вату.
  2.  К 15 каплям фильтрата добавляют по каплям реактив Уффельманна (20 капель 1% раствора фенола + 2 капли 1% раствора хлорного железа) до появления фиолетовой окраски. В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска жидкости переходит в желто-зеленую, так как образуется лактат железа. Для сравнения проводят реакцию Уффельманна с раствором молочной кислоты и наблюдают развитие желто-зеленого окрашивания.

РАБОТА № 24. БИОХИМИЯ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ

Важнейшее значение печени в обмене веществ в первую очередь определяется тем, что она является как бы большой промежуточной станцией между портальным и общим кругом кровообращения. В печень человека более 70% крови поступает через воротную вену, остальная кровь попадает через печеночную артерию. Начальным этапом распада гемоглобина является разрыв одного метинового мостика с образованием вердоглобина. В дальнейшем от молекулы вердоглобина отщепляются атом железа и белок глобин. В результате образуется биливердин, который представляет собой цепочку из четырех пиррольных колец, связанных метановыми мостиками. Затем биливердин, восстанавливаясь, превращается в билирубин – пигмент, выделяемый с желчью и поэтому называемый желчным пигментом. Образовавшийся билирубин называется непрямым (неконъюгированным) билирубином. Он нерастворим в воде, дает непрямую реакцию с диазореактивом, т.е. реакция протекает только после предварительной обработки спиртом.

В печени билирубин соединяется (конъюгирует) с глюкуроново кислотой. Эта реакция катализируется ферментом УДФ-глюкуронилтранс-феразой, при этом глюкуроновая кислота вступает в реакцию в активной форме, т.е. в виде УДФГК. Образующийся глюкуронид билирубина получил название прямого билирубина (конъюгированный билирубин). Он растворим в воде, дает прямую реакцию с диазореактивом. Большая часть билирубина соединяется с двумя молекулами глюкуроновой кислоты, образуя диглюкуронид билирубина.

Диглюкоронид билирубина

Образовавшийся в печени прямой билирубин вместе с очень небольшой частью непрямого билирубина выводится с желчью в тонкую кишку. Здесь от прямого билирубина отщепляется глюкуроновая кислота и происходит его восстановление с последовательным образованием мезобилирубина и мезобилиногена (уробилиногена).

Определение содержания билирубина в крови (общего, непрямого и прямого), а также уробилиногена мочи имеет важное значение при дифференциальной диагностике желтух различной этиологии.

Тимоловая проба (НТК «Анализ-Х») (УИРС)

Увеличение тимоловой пробы характерно для вирусных гепатитов, токсических поражений печени, умеренно сохраняется повышенной в постгепатитном периоде, циррозах печени, особенно постнекро-тическом, а также при коллагенозах и миеломах. При механических желтухах тимоловая проба у 75% больных отрицательная, что имеет дифференциально-диагностическое значение, а проба Бурштейна — Самая (увеличение β-липопротеинов) — положительная. При паренхиматозных желтухах обе пробы положительные. При взаимодействии сыворотки с тимоловым буфером появляется мутность вследствие образования комплекса «глобулин—тимол—липоид». Интенсивность помутнения зависит от количества взаимного соотношения отдельных белковых фракций.

Реактивы и материалы: концентрированный раствор тимола — 15 мл; стандартная суспензия BaSO4 — 10 мл; серная кислота, 0,2 М раствор; тимоловый реактив.

Приготовление реактива. В мерную колбу на 1000 мл налить около 900 мл дистиллированной воды и при постоянном перемешивании магнитной мешалкой пипеткой постепенно добавить 15 мл тимолового реактива. Кончик пипетки погрузить в воду в колбе. Раствор долить дистиллированной водой до метки и перемешивать еще 10 мин. Хранить при комнатной температуре. Раствор устойчив несколько месяцев.

Порядок выполнения работы

Реактивы и материалы добавляют в соответствии с таблицей:

Реактивы и материалы

Количество реактива, мл.

Проба

Контрольный реактив 1

Контрольный реактив 2

Сыворотка

0,05

–

0,05

Тимоловый реактив

3,00

3,00

–

Физиологический реактив

–

0,05

3,00

Перемешивают и оставляют стоять ровно на 30 мин при комнатной температуре. Потом снова перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы против контрольного реактива 1. Если сыворотка хилезная, измеряют оптическую плотность против контрольного раствора 2: λ 620—690, кювета шириной 5 мм.

При построении калибровочного графика измеряют основной контрольный реактив 2, что соответствует 20 ед. S—Н, а затем из реактивов 2 и 3 разбавлением приготавливают серию растворов согласно следующей таблице:

Раствор 3 (H2SO4), мл

Раствор 2 (BaSO4), мл

Единицы помутнения, S–H

4,5

1,5

5

3,0

3,0

10

1,5

4,5

15

–

6,0

20

В пробирках хорошо смешивают растворы 2 и 3 и ровно через 30 мин измеряют оптическую плотность против воды. Перед измерением содержимое пробирок еще раз перемешивают. Нормальные величины по этому методу: тимоловая помутнения — 0—4 ед. S—Н; предельные величины — 4—5 ед. S—Н; патология — свыше 5 ед. S—Н.

В протоколе отметьте цель занятия, принцип метода, ход работы (кратко), диагностическое значение. Сделайте выводы о концентрации гемоглобина в исследуемой сыворотке и о содержании билирубина в исследуемом образце. Оцените печеночные пробы.

В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований выпишите и выучите величину концентрации гемоглобина, билирубина и тимоловой пробы в крови.


РАЗДЕЛ 3

РАБОТА № 25. РН И БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ

Постоянство концентрации ионов водорода – необходимое условие правильного протекания биохимических процессов. В организме постоянный рН в различных тканях и органах поддерживается буферными системами, а вне организма при проведении биохимических реакций – буферными смесями.

Буферные смеси состоят преимущественно из растворов слабых кислот и их щелочных солей. Они поддерживают постоянный рН, связывая известное количество ионов Н+ и ОН-, образующихся в процессе реакции или специально добавленных.

Одной из употребительных буферных смесей является лимоннофосфатная. А важнейшими буферными системами крови являются бикарбонатная, фосфатная, белковая и наиболее мощная гемоглобиновая.

25.1. Лимонно-фосфатная буферная смесь.

Приготовление растворов

Реактивы и материалы: раствор Na2HPO4 (0,2 М), соль Na2HPO4·12H2O; дистиллированная вода, лимонная кислота, универсальный индикатор.

Оборудование и посуда: фильтровальная бумага, воронка, стаканы, стеклянные палочки, термостат, электроплитка, весы, форфоровая чашка.

Порядок выполнения работы

1. Раствор Na2HPO4 (0,2 М) готовят из очищенного препарата соли. Соль Na2HPO4·12H2O растворяют при нагревании в 1,3 части воды; раствор фильтруют и охлаждают при помешивании. Осадок отсасывают и высушивают при 36 – 38°С в течение нескольких дней, контролируя содержание кристаллизационной воды прокаливанием. Препарат точно соответствует формуле дигидрата, когда потери массы при прокаливании составляют 25,28±0,1 %. Для приготовления 1 л 0.2 М раствора требуется 35,603 г Na2HPO4·2H2O.

2. Для приготовления раствора лимонной кислоты пригодна лимонная кислота квалификации ч.д.а. На 1 л 0,1 М раствора требуется 21,008 г лимонной кислоты.

Для приготовления буферных смесей в пробирках смешивают буферные растворы в соотношениях, указанных в таблице.

№

pH

0,2 М раствор Na2HPO4, мл

0,1 М раствор лимонной кислоты, мл

1

2,2

0,20

9,80

2

2,4

0,62

9,38

3

2,6

1,09

8,91

4

2,8

1,58

8,42

5

3,0

2,05

7,95

6

3,2

2,47

7,53

7

3,4

2,85

7,15

8

3,6

3,22

6,78

9

3,8

3,55

6,45

10

4,0

3,85

6,15

11

4,2

4,14

5,86

12

4,4

4,41

5,59

13

4,6

4,68

5,32

14

4,8

4,93

5,07

15

5,0

5,15

4,85

16

5,2

5,36

4,61

17

5,4

5,58

4,42

18

5,6

5,80

4,20

19

5,8

6,05

3,95

20

6,0

6,31

3,69

21

6,2

6,61

3,39

22

6,4

6,92

3,08

23

6,6

7,28

2,72

24

6,8

7,72

2,28

25

7,0

8,24

1,76

26

7,2

8,69

1,31

27

7,4

9,08

0,92

28

7,6

9,36

0,64

29

7,8

9,57

0,43

30

8,0

9,72

0,28

25.2. Определение рН исследуемого раствора универсальным индикатором

Реактивы и материалы: исследуемый раствор, универсальный индикатор.

Оборудование и посуда: капельницы, форфоровая чашка, шкала с окраской индикатора.

Порядок выполнения работы

Окраска универсального индикатора изменяется в большом интервале рН (4–10,5). Окраска обычных индикаторов изменяется в очень небольшом пределе рН (1,5–2,0). Способность универсального индикатора изменять окраску в большом интервале рН обусловлена тем, что он представляет собой смесь нескольких индикаторов. Ниже приведен состав одного из универсальных индикаторов.

Масса индикатора, мг на100мл спирта

Индикатор, входящий в состав универсального индикатора

Метиловый красный .... 20

Бромтимоловый синий ... 40

Фенолфталеин ......... 80

Пользуясь бумажной цветной шкалой, можно определить рН, сравнивая окраску исследуемого раствора после его смешения с индикатором; 2–3 мл раствора, помещенного в фарфоровую чашечку, смешивают с двумя-тремя каплями универсального индикатора; подбирают одинаковую окраску на цветной шкале.

25.3. Свойства буферных растворов

Реактивы и материалы: буферную смесь, дистиллированная вода, индикатор метилоранж, 0,1 н. раствор серной или соляной кислоты.

Оборудование и посуда: капельницы, форфоровые чашки, шкала с окраской индикатора.

Порядок выполнения работы

1. При разведении буферного раствора водой рН практически не меняется. Готовят буферную смесь по заранее заданному рН. В одной части смеси определяют рН, а другую часть разводят дистиллированной водой в 5–10 раз и после разведения вновь определяют рН.

Установив, что при умеренном разведении буферной смеси водой рН не меняется, делают вывод, что при работе с буферными жидкостями можно применять разбавление водой без смещения рН, что имеет большое практическое значение при определении рН в мутных и окрашенных жидкостях.

2. При добавлении к буферному раствору кислоты или щелочи рН резко не меняется. В одну пробирку наливают дистиллированную воду, в другую – буферную смесь с рН, близким к рН дистиллированной воды (рН дистиллированной воды обычно равен 6,0–6,5). В обе пробирки добавляют по две капли метилоранжа и по каплям 0,1 н. раствор серной или соляной кислоты.

Устанавливают, что для изменения рН воды требуется одна капля кислоты, а для изменения рН буферной смеси – значительное количество кислоты.

25.4. Приготовление буферного раствора и определение его буферной емкости

Регулирующее действие буферных растворов на величину рН буферного раствора можно наблюдать при добавлении к нему определенного количества кислоты или щелочи, а также при его разведении.

25.4.1. Приготовление ацетатного буфера

Реактивы и материалы: 0,05 н. раствор уксусной кислоты, 0,05 н. раствор уксуснокислого натра.

Оборудование и посуда: пипетки, стаканы.

Порядок выполнения работы

Сливают 0,05 н. раствор уксусной кислоты и 0,05 н. раствор уксуснокислого натра в одном из указанных соотношений:

СН3СООН 0,05 н., мл

CH3COONa 0,05 н., мл

рН

8,8

1,2

3,8

6,3

3,7

4,4

4,0

6,0

4,8

2,1

7,9

5,2

25.4.2. Определение буферной емкости раствора по щелочи

Реактивы и материалы: буферная смесь, дистиллированная вода, 0,1 н. раствор NaOH.

Оборудование и посуда: капельницы, стаканчики, потенциометр со стеклянным электродом, пипетки, стеклянные палочки.

Порядок выполнения работы

10 мл полученной смеси отмеряют в стаканчик и потенциометрически, используя стеклянный электрод, точно устанавливают рН раствора. Добавляют 1 мл 0,1 н. раствора NaOH, перемешивают и вновь определяют рН. При очень малых или очень больших сдвигах рН нужно взять новую порцию раствора и соответственно увеличить или уменьшить количество добавляемой щелочи.

Рассчитывают буферную емкость по уравнению:

где ∆ b – количество миллиграмм-эквивалентов добавленной щелочи или кислоты; ∆рН = рН2 – pH1, т. е. разница в величине рН буферного раствора до и после прибавления щелочи.

25.4.3. Определение буферной емкости раствора по кислоте

Реактивы и материалы: буферная смесь, дистиллированная вода, 0,1 н. раствор H2SO4 или НСl.

Оборудование и посуда: капельницы, стаканчики, потенциометр со стеклянным электродом, пипетки, стеклянные палочки.

Порядок выполнения работы

Буферную емкость раствора по кислоте определяют таким же образом, как и по щелочи, пользуясь 0,1 н. раствором H2SO4 или НСl вместо щелочи. То же самое проделывают при добавлении тех же растворов щелочи и кислоты к дистиллированной воде, предварительно определив ее рН.

25.4.4. Определение буферной емкости раствора при разведении

Реактивы и материалы: буферная смесь, дистиллированная вода.

Оборудование и посуда: капельницы, стаканчики, потенциометр со стеклянным электродом, пипетки, стеклянные палочки.

Порядок выполнения работы

Влияние разведения на величину рН и буферную емкость раствора определяют при разведении в 2–3 раза. Измеряют величину рН раствора до и после разведения и рассчитывают буферную емкость.

Результаты работы оформляют в виде таблицы:

Буферная емкость раствора

Исследуемый раствор

Буферная емкость

по щелочи

по кислоте

при разведении

Буферный раствор

Дистиллированная вода

Выводы:

РАБОТА №26. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО АЗОТА МЕТОДОМ КЬЕЛЬДАЛЯ

Сущность метода определения общего количества азота сводится к мокрому озолению органических веществ исследуемой ткани серной кислотой при нагревании в присутствии катализаторов. В процессе озоления органические вещества исследуемой ткани сгорают: углерод до СО2, водород до Н2O, сера до SO2, азот превращается в NH3, из которого при реакции с серной кислотой образуется (NH4)2SO4. Часть серной кислоты, окисляющей органические вещества, восстанавливается до SO2. Аммиак из сернокислого аммония вытесняется щелочью по реакции: (NH4)2 SO4 + 2NaOH → Na2SO4+2NH3 + 2H2O

и отгоняется в титрованную кислоту. По количеству связавшейся с аммиаком кислоты судят о количестве азота.

Реактивы и материалы: мышечная ткань, концентрированная серная кислота, 0,05 н. серная кислота, сернокислая медь, сернокислый калий, дистиллированная вода, индикатора (метилрота), испытуемый раствор, 33% щелочь, 0,05 н. раствор щелочи.

Оборудование и посуда: весы, колба Кьельдаля емкостью 100 мл, стеклянный стаканчик с притертой крышкой, стеклянная палочка, электроплитка, воронка, мерная колба на 100 мл, прибор для отгонки аммиака, холодильник, лакмусовая бумажка.

Порядок выполнения работы

Навеску ткани около 0,5 г берут по разности непосредственно в колбу Кьельдаля емкостью 100 мл следующим образом: в стеклянный стаканчик с притертой крышкой и стеклянной палочкой помещают исследуемый объект, например мясной фарш. Взвешивают, записывают массу, отделяют небольшой кусочек фарша палочкой и помещают его в колбу Кьельдаля; стаканчик с фаршем вновь взвешивают. По разности масс определяют массу фарша, взятого для анализа. Навеску исследуемой ткани или точно измеренное количество исследуемой жидкости заливают 5–10 мл концентрированной серной кислоты. Для ускорения озоления в колбу добавляют около 0,2 г сернокислой меди и 1,5 г сернокислого калия. Далее смесь нагревают, причем колбу ставят наклонно на электроплитку, чтобы при кипячении не происходило выбрасывания содержимого. Вначале нагревание ведут осторожно. Озоление смеси продолжают до полного исчезновения бурой, а затем желтой окраски. Следы желтой окраски характеризуют неполноту сгорания. При полном сгорании раствор становится бесцветным или зеленоватым. Если на горлышке колбы остались обуглившиеся частицы, колбе дают остыть и затем смывают их водой внутрь колбы, после чего продолжают озоление. После озоления и охлаждения содержимое колбы смывают дистиллированной водой через воронку в мерную колбу на 100 мл и доводят раствор до метки. Для отгонки аммиака применяют прибор. В приемную колбу отмеряют 10 мл 0,05 н. серной кислоты, добавляют три – пять капель индикатора (метилрота) и устанавливают ее под холодильник, погрузив конец холодильной трубки в кислоту. Это необходимо потому, что первые порции аммиака газообразные. Нагревают воду в парообразователе до кипения. В отгонную колбу через воронку вводят 5 мл испытуемого раствора, затем 2–3 мл дистиллированной воды, 10–12 мл 33%-ной щелочи и еще раз 2–3 мл воды. Количество щелочи должно быть взято в избытке по сравнению с кислотой. Его можно рассчитать, исходя из количества кислоты, взятой для сжигания, с учетом последующего разведения. Воронку снимают; отверстие закрывают стеклянной палочкой. Реакция жидкости должна быть щелочной. Это легко определить по появлению синей окраски, обусловленной гидратом окиси меди. Пускают пар в колбу, закрывая отверстие сосуда стеклянной палочкой. Через 15 мин после отгонки конец холодильной трубки вынимают из кислоты. Отгонку продолжают 20–25 мин. По прошествии этого времени прекращают впуск пара в отгонную колбу, открывая отверстие сосуда. Конец холодильной трубки обмывают дистиллированной водой, проверяют полноту отгонки по красной лакмусовой бумажке, снимают приемную колбу и производят титрование 0,05 н. раствором щелочи. Предварительно 10 мл 0,05 н. раствора кислоты оттитровывают 0,05 н. раствором щелочи с индикатором метилрот.

Содержание азота выражают в процентах; расчет производят по следующей формуле:

,

где а – количество 0,05 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование 10 мл 0,05 н. раствора кислоты, мл; b – количество 0,05 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование испытуемого раствора, мл; е – навеска, г; K – поправка к раствору щелочи; 200 – разведение; 5 – количество испытуемого раствора в мл, взятое для отгонки из колбы емкостью 200мл; 0,0007 – количество азота, эквивалентное 1 мл 0,05н. раствора щелочи, г.

РАБОТА № 27. РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Реактивы и материалы: бумага фильтровальная; вата; палочки стеклянные; смесь спирта и эфира (1:1); сыворотка крови, вода.

Оборудование и посуда: рефрактометр, вата.

Порядок выполнения работы

Коэффициентом рефракции называют отношение синуса угла падения луча света к синусу угла его преломления. Коэффициент рефракции принято обозначать буквой n:

Между показателем преломления и концентрацией вещества в растворе для многих соединений характерна прямо пропорциональная зависимость. Коэффициент преломления раствора белка или белоксодержащей жидкости биологического происхождения находят с помощью рефрактометра. Работают с рефрактометром следующим образом: раскрывают камеру с призмами, тщательно ополаскивают призмы водой, промокают фильтровальной бумагой и окончательно осушают, протирая призмы ватой, смоченной смесью спирта и эфира (1:1). Стеклянной палочкой наносят на нижнюю призму 2 капли дистиллированной воды и закрывают камеру. Устанавливают рефрактометр так, чтобы призмы ею были ярко освещены или прямым светом, или пучком света, отраженным от зеркала. Об этом судят по степени освещенности видимого в окуляр поля. Если граница тени окрашена и расплывчата, поворотом рукоятки ахроматора добиваются чёткости и бесцветности границы. Поворотом призм или окуляра рефрактометра подводят границу темного поля к перекрестку нитей окуляра. Делают отсчет по шкале. При температуре 20°С отсчет должен быть 1,333 (показатель преломления воды при 20°С). Это значит, что прибор установлен и работает правильно. После того как прибор установлен по воде, камеру с призмами раскрывают, воду удаляют фильтровальной бумагой и сушат призмы смесью спирта с эфиром. На нижнюю призму наносят прозрачную каплю, сыворотки крови и закрывают камеру. Делают отсчет, как описано выше. Настройку прибора сбивают и делают еще один отсчет. Эту операцию повторяют снова. Все три значения заносят в рабочий журнал и вычисляют среднюю величину. По ней, пользуясь специальной таблицей, находят процентное содержание белка в сыворотке крови. Найденное значение заносят в журнал. По окончании работы смывают водой с призм прибора сыворотку, удаляют воду фильтровальной бумагой и осушают призмы спирто–эфирной смесью. На нижнюю призму накладывают, кусочек фильтровальной бумаги и закрывают камеру. В таком состоянии прибор оставляют до следующего определения. Если во время проведения отсчета температура не равна 20°С, то в полученное значение показателя преломления вносят поправку 0,0001 на каждый градус. При более низкой температуры поправку вычитают, высокой – прибавляют.

Зависимость между показателем преломления и концентрацией белка в растворе

Показатель преломления

Концентрация белка (в %) при показателе преломления с точностью до десятичных

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1,337

0,60

0,66

0,72

0,77

0,83

0,89

0,95

1,01

1,07

1,12

1,338

1,18

1,24

1,30

1,36

1,41

1,47

1,53

1,59

1,65

1,70

1,339

1,76

1,82

1,88

1,94

2,00

2,05

2,11

2,17

2,23

2,29

1,340

2,34

2,40

2,46

2,52

2,58

2,63

2,69

2,75

2,81

2,87

1,341

2,93

2,98

3,04

3,10

3,16

3,22

3,27

3,33

3,39

3,46

1,342

3,51

3,57

3,62

3,68

3,74

3,80

3,86

3,91

3,97

4,03

1,343

4,09

4,15

4,20

4,26

4,32

4,38

4,44

4,50

4,55

4,61

1,344

4,67

4,73

4,79

4,84

4,90

4,96

5,02

5,08

5,13

5,19

1,345

5,25

5,31

5,37

5,43

5,48

5,54

5,60

5,66

6,22

5,77

1,346

5,83

5,89

5,95

6,01

6,07

6,12

6,18

6,24

6,30

6,36

1,347

6,41

6,47

6,53

6,59

6,65

6,70

6,76

6,82

6,88

6,94

1,348

7,00

7,05

7,11

7,17

7,23

7,29

7,34

7,40

7,46

7,52

1,349

7,58

7,63

7,69

7,75

7,81

7,87

7,93

7,98

8,04

8,10

1,350

8,16

8,22

8,27

8,33

8,39

8,46

8,51

8,57

8,62

8,68

1,351

8,74

8,80

8,86

8,91

8,97

9,03

9,09

9,15

9,20

9,26

1,352

9,32

9,38

9,44

9,50

9,55

9,61

9,67

9,73

9,79

9,84

1,353

9,90

9,96

10,02

10,08

10,13

10,19

10,25

10,31

10,37

10,43

1,354

10,48

10,54

10,60

10,66

10,72

10,77

10,83

10,89

10,95

11,01

1,355

11,06

11,12

11,18

11,23

11,29

11,35

11,41

11,47

11,52

11,58

1,356

11,64

11,70

11,76

11,81

11,87

11,93

11,99

12,05

12,10

12,16

1,357

12,22

12,28

12,34

12,39

12,45

12,51

12,57

12,63

12,68

12,74

1,358

12,80

12,86

12,92

12,97

13,03

13,09

13,15

13,21

13,26

13,32

1,359

13,38

13,44

13,50

13,55

13,61

13,67

13,73

13,79

13,84

13,90

1,360

13,96

14,02

14,08

14,13

14,19

14,25

14,31

14,37

14,42

14,48

РАБОТА №28. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ФОСФОРА В ТКАНЯХ

Метод определения общего фосфора основан на минерализации ткани и определении фосфора по интенсивности окраски, образующейся при восстановлении фосфорно-молибденовой кислоты гидрохиноном и сульфитом натрия.

Метод состоит из следующих основных операций: высушивание и озоление навески, сплавление золы с карбонатной смесью и извлечение фосфатов водой, образование фосфорно-молибденовой кислоты, развитие цветной реакции при восстановлении гидрохиноном и сульфитом натрия, измерение интенсивности окраски.

Реактивы и материалы: биологическая ткань, карбонатная смесь: углекислый натрий и углекислый калий в соотношении 1:1, хорошо перемешанные и растертые в ступке; ледяная уксусная кислота; 10%-ный раствор молибденовокислого аммония; раствор гидрохинона и сульфита натрия: 2 г дважды перекристаллизованного гидрохинона и 10 г сульфита натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды; однозамещенный фосфорнокислый калий.

Оборудование и посуда: сушильный шкаф, весы, ступка с пестиком, стаканчик для взвешивания с притертой крышкой, термостат, муфельная печь, тигель, водяная баня, фотоэлектроколориметр с оранжевым или красным светофильтром.

Порядок выполнения работы

Навеску мелко нарезанной ткани высушивают при 110–120°С до постоянного веса, затем растирают в ступке до тонкого порошка. Порошок помещают в стаканчик для взвешивания с притертой крышкой и повторно высушивают в термостате до постоянного веса, по разности в доведенный до постоянного веса платиновый тигель берут навеску порошка (0,1000– 0,5000 г). Навеску осторожно озоляют при красном накале (примерно 500°С) в муфельной печи (по разности весов до и после сжигания может быть установлен вес золы).

В зависимости от взятой навески в тигель добавляют 0,5–1 г карбонатной смеси, тщательно перемешивают и сплавляют в муфельной печи в течение 20–30 мин. Сплав обрабатывают горячей водой, раствор фильтруют в мерную колбу на 25–50 мл, остаток промывают горячей водой. К фильтрату добавляют 4–8 мл уксусной кислоты. После прекращения выделения углекислого газа добавляют 4 мл 10%-ного раствора молибденовокислого аммония и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

К 25 мл раствора добавляют 2 мл раствора, состоящего из гидрохинона и сульфита натрия, нагревают раствор в кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждают, объем доводят водой до 100 мл и измеряют интенсивность голубой окраски при помощи фотоэлектроколориметра с оранжевым или красным светофильтром в отношении контрольного раствора. Контрольный раствор делают одновременно с опытным. По снятому отсчету с помощью калибровочного графика находят содержание фосфора в растворе, взятом для цветной реакции.

Построение калибровочного графика и расчет производят так же, как при определении неорганического фосфора с учетом разведений и навески.

Для построения калибровочного графика используют 0,1916 г однозамещенного фосфата калия (КН2РО4), который растворяют в воде, и после добавления 10 мл 0,1 н. серной кислоты объем доводят водой до 1000 мл; 1 мл такого раствора содержит 0,1 мг P2O5.

Количество неорганического фосфора, пересчитанное на 100 г мяса, вычисляют по формуле:

где с – количество Р2О5, соответствующее величине оптической плотности, мг;

50 – объем раствора при осаждении белков, мл; 

100 – объем без белкового раствора после разбавления, мл; 25 – объем раствора при проведении цветной реакции, мл; 100 – множитель перевода в проценты;

е – навеска мяса, г; 

25 – объем без белкового раствора, взятый для разбавления, мл; 

5 – объем без белкового фильтрата после разбавления, взятый для цветной реакции, мл.

Если точно следовать описанной методике, то вышеприведенную формулу можно упростить:

.

Величина относительной ошибки определения для этого метода лежит в пределах 3 – 5%.

РАБОТА №29. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИКОГЕНА

Метод основан на выделении гликогена из мышечной ткани и цветной реакции с антроном. Метод состоит из следующих основных операций: гидролиз белков мышечной ткани щелочью, выделение гликогена из раствора этиловым спиртом, промывание гликогена и его растворение, реакция с антроном и развитие окраски, измерение интенсивности окраски.  При нагревании навески мышечной ткани с крепким раствором щелочи происходит гидролиз мышечных белков, при этом гликоген освобождается из клеток. Гликоген не растворяется в спирте, поэтому он выпадает в осадок при добавлении довольно большого количества спирта. Прибавление сюда же нескольких капель концентрированной серной кислоты способствует осаждению гликогена вследствие образования сульфата аммония.

Окрашенный от зеленого до сине-зеленого цвета продукт реакции имеет максимум поглощения при длине волны 620 ммк. Интенсивность окраски раствора измеряют на спектрофотометре СФ-4 или фотоэлектроколориметре ФЗК-М или фотометре ФТ-2 с красным светофильтром с максимум пропускания при той же длине волны.

Реактивы и материалы: 50%-ный раствор едкого кали, 96-, 60- и 80%-ный этиловый спирт, эфир, концентрированная химически чистая серная кислота, антрон (производное антрахинона), гликоген или глюкоза (для построения калибровочного графика), 95%-вая серная кислота (к 50 мл воды прибавляют 1 л концентрированной H2SO4 и охлаждают), свежеприготовленный 0,2%-ный раствор антрона в 96%-ной серной кислоте. 0,2 г антрона помещают в мерную колбу на 100 мл, растворяют и доводят до метки 95%-ной серной кислотой, после выдержки в течение 1 ч раствор готов для использования (на 1 день работы), 30%-ный водный раствор едкого кали, свежеприготовленный 0,2%-ный раствор антрона в 95% -ной серной кислоте (0,2 г антрона в 100 мл 95%-ной серной кислоты).

Оборудование и посуда: центрифугира, центрифужные пробирки, технические весы, пробирки, штатив, водяная баня, сифон, пипеткой, стеклянная палочка, спектрофотометр.

29.1. Определение содержания гликогена в мышечной ткани

Порядок выполнения работы

В центрифужные пробирки размером 25 x 160 мм вносят 5 мл 50%-ного раствора едкого кали и около 2,5 г мяса, взвешенного на технических весах с точностью до 0,01 г. Пробирки помещают в специальный штатив, вместе с которым их ставят в кипящую водяную баню. После образования однородного раствора (все частички мяса растворились) пробирки охлаждают, добавляют 5 мл дистиллированной воды, осаждают гликоген 40 мл 96%-ного спирта и вносят несколько капель концентрированной серной кислоты.

Пробирки оставляют на 24 ч, после чего центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, жидкость над осадком сливают тонким сифоном или осторожно удаляют пипеткой. Осадок последовательно промывают 15 мл 60%-ного, затем 80%-ного спирта и, наконец, 96%-ным спиртом, а затем эфиром.

Для отделения промывных жидкостей пробирки с содержимым центрифугируют 30 мин. После каждого центрифугирования жидкость над осадком сливают, пользуясь вышеуказанным приемом. При обработке эфиром центрифугирования не требуется, после 10 мин настаивания эфир сливают из пробирки, а его следы удаляют на водяной бане.

Каждую порцию промывной жидкости добавляют не сразу, а в два приема. Сначала вносят небольшую часть жидкости и тщательно распределяют в ней остаток, перемешивая его стеклянной палочкой, а затем добавляют оставшееся количество, тщательно смывая в пробирку приставшие к палочке частицы.

После удаления следов эфира к остатку добавляют 5 мл горячей воды, раствор перемешивают вращательным движением пробирки и нейтрализуют соляной кислотой по лакмусу (сначала двумя каплями концентрированной, а затем 2%-ным раствором).

Из пробирки раствор гликогена переносят в мерную колбу соответствующей емкости (если парное мясо – в колбу на 500 мл, если же мясо, выдержанное в течение 1–2 суток, – на 25– 50 мл). Для проведения цветной реакции в две пробирки молибденового стекла размером 30 x 200 мм помещают аликвотные части раствора гликогена (например, 0,5 и 1,5 мл), добавляют до 5 мл дистиллированной водой и погружают в водяную баню со льдом. Осторожно, непрерывно перемешивая, приливают тонкой струей 10 мл свежеприготовленного раствора антрона в 95%-ной серной кислоте. Затем жидкости еще раз осторожно перемешивают вращательным движением и пробирки помещают на 10 мин в сильно кипящую водяную баню. По окончании нагревания пробирки быстро охлаждают в воде со льдом и измеряют оптическую плотность в отношении контрольного раствора. Образовавшаяся зеленая окраска при использовании реактивов высокой чистоты устойчива на протяжении 4–5 ч.

Контрольный опыт проводят в аналогичных условиях, помещая в пробирку 5 мл дистиллированной воды и 10 мл раствора антрона в серной кислоте.

Оптическая плотность контрольного раствора, измеренная относительно серной кислоты, не должна быть более 0,08.

При помощи калибровочного графика находят концентрацию гликогена во взятом на цветную реакцию количестве раствора и затем пересчитывают на содержание его в мясе.

,

где α – количество гликогена, вычисленного по калибровочному графику, мг;

25 – емкость мерной колбы, в которой был растворен осадок

гликогена;

100 – множитель перевода в проценты;

n – количество исследуемого раствора, взятого на цветную

реакцию, мл;

е – навеска мяса, г.

Чтобы построить калибровочный график, готовят стандартный раствор. Для приготовления стандартного раствора применяют тщательно очищенный и высушенный в эксикаторе гликоген, полученный из печени только что убитого кролика, или пользуются химически чистым препаратом глюкозы; для перевода глюкозы в гликоген результаты определения делят на 1,11.

Взвешивают на аналитических весах 16 мг гликогена, навеску растворяют теплой, дистиллированной водой в мерной колбе на 200 мл, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем водой до метки и тщательно перемешивают. Такой раствор содержит в 1 мл 0,08 мг гликогена. Из него готовят серию растворов для построения калибровочного графика, помещая в пробирки количества, указанные в табл.

Количество гликогена, мг

Количество раствора гликогена, мл

Количество воды, мл

Количество раствора антрона, мл

0,01

0,125

4,875

10,0

0,02

0,25

4,75

10,0

0,04

0,50

4,50

10,0

0,06

0,75

4,25

10,0

0,08

1,00

4,00

10,0

0,12

1,50

3,50

10,0

0,16

2,00

3,00

10,0

0,20

2,50

2,50

10,0

После добавления антрона пробирку помещают точно на 10 мин в сильно кипящую водяную баню и через определенный промежуток времени (например, 5 мин) заливают раствором антрона следующую пробирку и нагревают ее так же, как и предыдущую.

Если интенсивность окраски раствора не изменяется в течение некоторого промежутка времени, то можно подготовить для измерения сразу несколько растворов. Для этого предварительно устанавливают время, в течение которого измерение возможно. После 10 мин нагревания и охлаждения раствора до комнатной температуры измеряют его оптическую платность, держатель с кюветами вынимают из камеры спектрофотометра и оставляют на 5 или 10 мин, после чего вновь ставят в камеру прибора и измеряют светопоглощение раствора. Такую операцию повторяют несколько раз в течение, например, 1 ч. Если практически получается одна и та же величина оптической плотности, то окраску раствора можно считать стабильной на протяжении исследованного периода времени. Это дает право одновременно подготовить для измерения нужное число пробирок с растворами, что значительно экономит время, затрачиваемое на анализ.

Для построения калибровочного графика необходимо провести не менее трех серий определений, используя каждый раз вновь приготовленный раствор гликогена или глюкозы.

29.2. Определение содержания гликогена в печени

В пробирку молибденового стекла (или стекла пирекс) размером 20 x 160 мм помещают навеску 1,00 г тщательно измельченной печени, добавляют 3 мл 30%-ного раствора едкого кали и нагревают на сильно кипящей водяной бане в течение 20 мин. По истечении этого времени пробирку охлаждают в холодной воде, содержимое пробирки количественно переносят в мерную колбу и доводят объем дистиллированной водой до метки. Емкость мерной колбы подбирают в зависимости от возможного содержания гликогена в печени: если анализируют печень только что убитого животного, измельченную при охлаждении, то выбирают колбу на 200–600 мл; для анализа печени, хранившейся длительное время, берут колбу на 25–50 мл.

Цветную реакцию с антроном и измерение проводят так же, как при определении содержания гликогена в мышечной ткани.

РАБОТА № 30. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

30.1. Определение суммарного количества нуклеиновых кислот

Метод определения суммарного количества нуклеиновых кислот основан на определении разностей оптической плотности (метод ∆), применяемый для уменьшения влияния различных примесей в исследуемых экстрактах.

При использовании этого метода в основу расчетов берут не .абсолютные величины оптических плотностей, а разность между оптической плотностью при 270 ммк и оптической плотностью при 290 ммк (D270–D290 = ∆D270). Предварительно на гидролизатах стандартных препаратов дрожжевой РНК и тимусовой ДНК было найдено, что ∆D270 равна 0,19.

Метод состоит из следующих операций: экстракция нуклеиновых кислот хлорной кислотой, центрифугирование экстракта, измерение на спектрофотометре в ультрафиолете.

Реактивы и материалы: навеска ткани (5–500 мг), 0,5 н. хлорная кислота (НClО4),

Оборудование и посуда: водяная баня, центрифуга, спектрофотометр.

Порядок выполнения работы

Навеску ткани (5–500 мг) заливают точно отмеренным количеством (5–10 мл) 0,5 н. хлорной кислоты (НClО4) и нагревают в кипящей водяной бане 20 мин. После охлаждения и центрифугирования надосадочную жидкость используют для измерения поглощения в ультрафиолете на спектрофотометре СФ-4 непосредственно (в случае малых количеств определяемого вещества) или после соответствующего разведения в 0,5 н. хлорной кислоты.

Измерение на спектрофотометре производят при 270 ммк и 290 ммк в отношении контрольного раствора (чистая 0,5 н. хлорная кислота). Если измерение производили в односантиметровых кварцевых кюветах, то расчет производят следующим образом: разность между оптической плотностью при 270 ммк и оптической плотностью при 290 ммк делят на 0,19 и получают количество микрограммов нуклеинового фосфора в 1 мл испытуемого раствора.

Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновой кислоты пользуются средним пересчетным коэффициентом 10,3.

Метод дает возможность определять содержание нуклеиновой кислоты также в том случае, когда в изучаемом материале содержится только РНК или только ДНК.

Для пересчета с содержания фосфора на содержание РНК пользуются коэффициентом 10,5, а на содержание ДНК–10,1, исходя из теоретического содержания фосфора – 9,5 в РНК и 9,9 в ДНК.

Рекомендуется производить дополнительное контрольное измерение при 260 ммк. Оптическая плотность при 260 ммк должна быть приблизительно равна оптической плотности при 270 ммк (в пределах ±15%). Отклонение от последней больше чем на ±15% указывает на наличие большого количества мешающих примесей нуклеиновой природы. В этом случае иногда помотает предварительная отмывка навески материала на холоду 0,2 н. раствора хлорной кислоты.

30.2. Определение нуклеиновых кислот в крови

(по П. В. Симакову)

Из сложных белков особое значение имеют нуклеопротеиды, играющие ведущую роль в передаче наследственных признаков, в синтезе белка, во многих процессах обмена. Нуклеопротеиды состоят из белка и сложных полинуклеотидов, или нуклеиновых кислот, которые в своем составе содержат азотистые основания, углеводы (моносахариды) и фосфорную кислоту. Различают рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые (ДНК) кислоты в зависимости от того, какой моносахарид – рибоза или дезоксирибоза – входит в их состав. Так как все три компонента (азотистое основание, углевод и фосфорная кислота) входят в состав нуклеиновых кислот всегда в постоянных молярных концентрациях (в отношении 1:1:1), определение нуклеиновых кислот обычно проводят, исследуя содержание какого-либо одного из указанных компонентов.

Принцип метода основан на экстракции нуклеиновых кислот (суммарного количества РНК и ДНК) горячей хлорной кислотой с последующим определением нуклеинового фосфора в растворе фотометрированием при 270 и 290 ммк; по концентрации нуклеинового фосфора вычисляют содержание нуклеиновых кислот. Точность метода ±10%.

Реактивы и материалы: 0,5 и 0,6 н. раствор хлорной кислоты.

Оборудование и посуда: спектрофотометр, центрифуга электрическая, водяная баня, широкие центрифужные пробирки на 30–40 мл, микропипетки на 0,1 мл, пипетки на 1–2 мл, мерный цилиндр на 20–25 мл, воронки стеклянные (малого размера), пробирки химические.

Порядок выполнения работы

Определение нуклеиновых кислот в крови. В 1,4 мл воды, налитой в широкие центрифужные пробирки, помещают 0,1 мл крови и размешивают. К полученному гемолизату прибавляют 13,5 мл 0,6 н. раствора хлорной кислоты и перемешивают. Пробирку помещают на 20 мин. в сильно кипящую водяную баню и закрывают маленькой воронкой. За это время происходит полный гидролиз нуклеиновых кислот, связанных с белками, и осаждение белков. Затем пробирку охлаждают струей воды из крана и центрифугируют 10–15 мин. при 1500 об/мин. Жидкость сливают в чистую пробирку и фотометрируют при 270 и 290 ммк в кювете с рабочей длиной 10 мм против 0,6 н. раствора хлорной кислоты.

Определение нуклеиновых кислот в тканях. Навеску материала от 5 до 500 мг заливают точно отмеренным количеством (5–10 мл) 0,5 н. раствора хлорной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане 20 мин. Дальнейший Порядок выполнения работы и расчет те же, что и при определении нуклеиновых кислот в крови (А. С. Спирин).

Расчет содержания нуклеиновых кислот в крови производят по формуле:

,

где А–Б – разность между оптическими плотностями исследуемого раствора при 270 и 290 ммк,

0,19 – поправка при измерении оптической плотности исследуемого раствора при 270 и 290 ммк;

Г – объем раствора крови с хлорной кислотой;

В – объем крови, взятой для исследования;

10,3 – коэффициент пересчета на количество нуклеиновых кислот;

100 – коэффициент пересчета в процентах.

РАБОТА № 31. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПИРТА В КРОВИ

Для определения спирта и других летучих соединений в крови имеются различные методы. Среди них есть и газохроматографические методы, использующие методику Ne-adspace или экстракцию растворителя. Однако эти процедуры длительные и иногда неточные. Jain описал непосредственный ввод крови в газовый хроматограф для определения спиртов и других летучих соединений. Этот метод описан ниже.

Реактивы и материалы:

Приготавливают исходный раствор этанола (10 мг/мл) путем разбавления 12,7 мл абсолютного этанола (100% или 200%) дистиллированной водой до 1 л.

Для приготовления рабочего стандартного раствора (50 мг/мл крови) 5 мл исходного раствора разбавляют кровью до 100 мл.

Приготавливают внутренний стандарт изобутанола (10 мг/мл) разбавлением 14,4 мл изобутанола до 1 л дистиллированной водой.

Для приготовления стандартного рабочего раствора (около 50 мг/100 мл воды) 5 мл исходного раствора изобутанола разбавляют до 100 мл дистиллированной водой.

Оборудование и посуда: пипетки, пробирки, шприц, газовый хроматограф.

Порядок выполнения работы

Два объема по 0,5 мл раствора внутреннего стандарта изобутанола переносят с помощью пипетки в две различные пробирки (7,4 мл), одна с маркировкой «известный», другая – с маркировкой «неизвестный». Калиброванной пипеткой на 0,5 мл (Microchemical Specialities Company, Berkeley, Calif.) 0,5 мл рабочего стандарта этанола переносят в пробирку с маркировкой «известный». Пипетку промывают трижды раствором внутреннего стандарта для удаления всей неизвестной пробы. Затем вновь с помощью калиброванной пипетки 0,5 мл известной крови переносят в пробирку с маркировкой «неизвестный». Пипетку промывают трижды раствором внутреннего стандарта для количественного переноса всех неизвестных проб. С помощью шприца на 1 мкл (№ 7101 Hamilton Co, Whitter, Calif.) пробы объемом 0,5 мкл дублированно «известной» и «неизвестной» смеси вводятся в газовый хроматограф.

Газохроматографические условия. Используется одноколоночный газовый хроматограф, снабженный пламенно-ионизационным детектором и самописцем на 1 мв. Колонка представляет собой спиральную трубку из нержавеющей стали длиной 1,7 м с наружным диаметром 0,25 дюйма, наполненная 30% карбоваксом 20 М на промытом кислотой хромо-сорбе W (60/80 меш). Наполненная колонка может быть получена от фирмы-изготовителя или наполнена в лаборатории добавлением 100 г хромосорба W (промытый кислотой, 60/80 меш) к раствору 30 г карбовакса 20 М в хлороформе. Избыток растворителя испаряют на паровой бане, а покрытый материал нагревают в течение ночи в термостате при 105°С. Колонку наполняют этим материалом и кондиционируют при 180°С потоком газа–носителя (азота). Другие газохроматографические условия: температура термостата 100 или 130°С; температура устройства для ввода пробы 160°С; диапазон 0,1; аттенюация 64; расход азота газ–носитель, водорода и кислорода 35 мл/мин, 28 мл/мин и 100 мл/мин соответственно.

Концентрацию спирта вычисляют по формуле C2(HX/HS)x x(Rs/Rx)=Mr спирта/100 мл неизвестной пробы, где С2 – концентрация стандартного раствора спирта в мг/100 (50 мг/100 мл использовалось в этой процедуре); Нх – высота пика этанола из «неизвестной» крови; Hs – высота пика внутреннего стандарта изобутанола из «неизвестной» крови; Rx – высота пика этанола из «известного» раствора этанола и Rs – высота пика внутреннего стандарта изобутанола из «известного» раствора этанола.

С помощью этой процедуры Jain показал, что 1 – 60 мг спирта/100 мл крови дает линейный отклик детектора.

РАБОТА № 32. ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Определение лидокаина, анестезина, новокаина и других лекарственных препаратов проводится на газовом хроматографе с пламенно–ионизационным детектором с последующим количественным расчетом методом абсолютной калибровки.

Реактивы и материалы: стандартные растворы лидокаина, анестезина, новокаина 1% водные или спиртовые растворы.

Оборудование и посуда: Хроматограф Цвет-500 или любой другой марки с пламенно – ионизационным детектором. Колонка хроматографическая с 3%SE-30 или 3%OV-17 (l = 3м, d = 3мм).

Подготовка к анализу.

На хроматографе Цвет-500 устанавливают необходимые режимы.

Расход газа – носителя – 60мл/мин

Расход воздуха – 300мл/мин

Расход водорода – 30мл/мин

Температура детектора – 220 °C

Температура колонки –200 °C

Температура испарителя – 250 °C

Порядок выполнения работы

Включить самописец, подключенный к хроматографу. 2-5мкл анализируемой пробы микрошприцом ввести в нагретый испаритель хроматографа. Для количественной оценки и идентификации места выхода компонентов предварительно необходимо в нагретый испаритель хроматографа вводить стандартные смеси исследуемых компонентов.

Массовую долю (X,%) препарата рассчитывают по формуле:

,

где S1 – площадь компонента в стандартной смеси, мм2

 S – площадь компонента в анализируемом растворе, мм2

 X1 – массовая доля исследуемого компонента (в %) в стандартной смеси.

 

РАБОТА № 33. ПРЯМОЕ АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ 3d-ЭЛEMEHTOB (Fe, Сu, Mn, Co, Ni) и Zn в БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Элементы 3d-группы периодической системы (Fe, Cu, Mn, Co, Ni) и Zn, обладающие биологической активностью, помимо физиологического, в более высоких концентрациях могут оказывать фармакологическое и токсическое действия на организм. В настоящее время это актуально в связи с увеличением содержания данных элементов в окружающей среде, что обусловлено в основном источниками промышленного загрязнения, а кроме того, определенная роль в этом может принадлежать и геохимическим факторам. Следует отметить сопряженность указанных элементов в метаболических реакциях. Все сказанное определяет необходимость всестороннего и глубокого изучения их обмена в норме и при патологии. Поэтому разработка адекватных методов определения микроэлементов в биологическом материале является актуальной задачей медицины. Одним из современных методов оценки обмена микроэлементов в организме является атомно-абсорбционная спектрофотометрия, обладающая рядом преимуществ перед традиционными химическими способами. Цель настоящей работы – опробовать технику прямого атомно-абсорбционного определения Fe, Cu, Mn, Co, Ni и Zn без предварительного их разделения и экстрагирования в сыворотке крови человека и крыс, а также в печени, селезенке и костном мозге последних.

Реактивы и материалы: Депротеинизирующий 0,6М раствор ТХУ и НС1 (био-тест «Железо», «Lachema», ЧССР). 1,6М раствор НСl (ос. ч.) для разведения всех стандартов. Стандартный раствор Fe (Fe2+, 17,90 мкмоль·л–1; био-тест «Железо», «Lachema», ЧССР). Раствор хлорного Fe (Fe3+, 1,79 ммоль·л–1; био-тест «Общая связывающая способность», «Lachema», ЧССР). Стандартный раствор Cu (Cu2+, 3 ммоль·л–1; био-тест «Медь», «Lachema», ЧССР). Стандартные растворы Mn, Co, Ni и Zn, приготовленные по ГОСТу 4212–76 (соответственно 1,82, 1,70, 1,70, 1,53 ммоль·л–1).

Оборудование и посуда: ААС Perkin Elmer 2280, электропечь СНОЛ-1,6.2,5.1/П-М1У4.2, центрифуга, термостатированная водяная баня, платиновые тигли, полистироловые пробирки, дозаторы.

Порядок выполнения работы

Подготовку проб сыворотки крови для микроэлементов анализа проводили стандартным методом. Сыворотку депротеинизировали 0,6М раствором ТХУ и НСl (отношение объемов сыворотки и, депротеинизирующего раствора 1:1) и одновременно денатурировали при 90°С в течение 15 мин. Микроэлементы определяли в супернатанте, полученном после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Анализ элементов в тканях проводили после их озоления стандартным сухим методом. Первоначально навеску сырого биоматериала доводили при 105°С до абсолютно воздушно-сухой массы (постоянной массы), взвешивали. Затем последовательно повышали температуру и заканчивали озоление при 500°С, пока не получали светлую однородную золу. Последнюю растворяли в 1,6 М НСl при 80–90°С. Элементы определяли непосредственно из полученного солянокислого раствора без разделения и экстрагирования. Объем соляной кислоты, используемой для растворения золы, составлял 1 мл на 200 мг абсолютно воздушно-сухой массы печени и селезенки, а для костного мозга – 1 мл на 50 мг. На всех этапах работы обращали особое внимание на защиту проб от возможного загрязнения.

РАБОТА № 34. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЩЕСТВ МЕТОДОМ ТСХ

34.1. Определение углеводов в крови методом ТСХ

При изучении патологических состояний, сопровождающихся нарушениями углеводного обмена, сталкиваются с проблемой идентификации углеводовв биологических жидкостях. В первую очередь речь идет о состояниях, при которых происходит чрезмерное выделение глюкозы, галактозы, фруктозы и пентоз. Детальное обсуждение с биохимической точки зрения показывает, насколько важную информацию о характере изменений метаболизма углеводов можно получить с помощью хроматографических методов.

34.1.1. Открытие сахароз по Барону и Экономидису в моче

Реактивы и материалы: силикагель, 0,1 М борная кислота, биологические пробы, система н-бутанол – уксусная кислота (1:1), анилиновый реактив. 

Анилиновый реактив: 1 г анилина и 1 г дифениламина в 100 мл ацетона. 10 мл этого раствора перед употреблением смешивают с 1 мл 85%-ной фосфорной кислоты. Хроматограммы нагревают при температуре 120°С; окрашивание появляется через 5 мин.

Оборудование и посуда: пластинки, сушильный шкаф, шприц, хроматографическая камера, пульверизатор.

Порядок выполнения работы

Приготовление слоя. 1 часть силикагеля G смешивают с 2 частями 0,1 М борной кислоты. После нанесения на пластинки слой сушат 2 ч при комнатной температуре и затем 30 мин при 105°С.

Нанесение проб и хроматографирование. После нанесения 5 мкл исследуемой мочи и 5–10 мкг эталона хроматографируют до расстояния 12–15 см при 37 °С в системе н-бутанол – уксусная кислота (1:1).

Обнаружение. После сушки хроматограммы сахара обнаруживают опрыскиванием анилиновым реактивом.

Значения RF углеводови окраска пятен под действием анилинового реактива

Сахар

hRF

Окрашивание

Сахар

hRF

Окрашивание

Лактоза

7

Сине-серое

Фруктоза

21

Коричневое

Сахароза

16

Коричнево-серое

Глюкоза

28

Мальвово-серое

Галактоза

19

Мальвово-серое

Ксилоза

31

Синее

34.1.2. Количественное определение сахароз по Банхеру

Реактивы и материалы: силикагель, дистиллированная вода, биологические пробы, смесь этилацетат – ацетон – вода (40:50:10), смесь н-бутанол – уксусная кислота – эфир – вода (45:30:15:5), анилиновый реактив.

Оборудование и посуда: пластинки, сушильный шкаф, шприц, хроматографическая камера, пульверизатор.

Порядок выполнения работы

Приготовление слоя. 30 г силикагеля G смешивают с 65 мл дистиллированной воды и после нанесения на пластинки слой сушат в течение ночи при комнатной температуре. Так получаются более воспроизводимые результаты, чем при сушке слоя при повышенной температуре.

Хроматографирование. Образец наносят на старт в углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев. В первом направлении элюируют смесью этилацетат – ацетон – вода (40:50:10), пока фронт не пройдет расстояние 15–18 см. После высушивания во втором направлении пользуются смесью н-бутанол – уксусная кислота – эфир – вода (45:30:15:5).

Обнаружение. Сахара или их производные обнаруживают анилиновым реактивом – после опрыскивания хроматограмму сушат 10–15 мин при 80 – 100 °С и окраску пятен наблюдают в видимом.

Сорбент: силикагель G;

системы: первое направление – этилацетат – ацетон – вода (40:50:10), второе направление – н-бутанол – уксусная кислота – эфир – вода (45:30:15:5);

обнаружение: анилиндифениламиновый реактив. 1 – глюкоза; 2 – арабиноза; 3 – рибоза; 4 – ксилоза; 5 – эритроза; 6 – глицериновый альдегид; 7 – гликолевый альдегид; 8 – диоксиацетон; 9 – метилглиоксаль; 10 – глиоксаль; 11 – редуктон.

Сыворотка крови. Сыворотку освобождают от белка добавлением пикриновой кислоты (75 мг/л). Окрашенную в желтый цвет жидкость после центрифугирования хроматографируют. Если в распоряжении имеется достаточное количество исследуемого материала, можно затем подвергнуть пробу обессоливанию так, как делают с мочой.

34.2. Определение холестерина в крови методом ТСХ

Липиды, извлеченные из головного мозга в виде хлороформного экстракта, наносят на специально приготовленный слой силикагеля, которым предварительно покрывается стеклянная пластинка. Разделение глицеридов и общей фракции липидов производят в системе растворителей: гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота. Хроматограммы проявляют 10% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты, парами йода или концентрированной серной кислотой для обнаружения веществ в виде окрашенных пятен.

Реактивы и материалы: биологический материал, свежеприготовленную смесь хлороформа и этанола (2:1), хлороформ, «свидетели» хлороформные растворы холестерина, моно-, ди- и триглицеридов, смесь растворителей гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2), 10% спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты.

Оборудование и посуда: мерная колбочка на 25 мл с притертой пробкой, складчатый фильтр, воронка, выпаривательная чашка, электроплитка, капилляры, пластинки, хроматографическая камера, пульверизатор, сушильный шкаф.

Порядок выполнения работы

1. Извлечение липидов из мозга. Для извлечения липидов из головного мозга 250 мг ткани помещают в мерную колбочку на 25 мл с притертой пробкой, куда предварительно наливают свежеприготовленную смесь хлороформа и этанола (2:1). Содержимое колбы энергично перемешивают в течение 3–5 минут, доводят хлороформ–метаноловой смесью до метки, снова перемешивают и через 5–10 минут фильтруют через складчатый фильтр. Полученный липидный экстракт упаривают досуха и осадок растворяют в, 1 мл хлороформа.

2. Нанесение экстракта на пластинки. Хлороформный экстракт липидов наносят с помощью капилляра на приготовленную пластинку на расстоянии 1 см от края пластинки. Пробу наносят осторожным прикосновением капилляра так, чтобы слой силикагеля при этом не нарушался. После того как растворитель испарится, пробу наносят еще раз. На той же стартовой линии на пластинку на расстоянии 1 см друг от друга наносят в качестве «свидетелей» хлороформные растворы холестерина, моно-, ди- и триглицеридов.

3. Установление пластинки в хроматографической камере. Пластинку помещают в камеру, куда предварительно наливают смесь растворителей, состоящую из гексана – диэтилового эфира – уксусной кислоты (73:25:2). Камера представляет собой стеклянный сосуд с подставкой для пластинки. Пластинку с нанесенным веществом устанавливают в камере под углом в 10–15°, так чтобы нижний край пластинки с нанесенными пробами был погружен в жидкость приблизительно на 0,5 см. Разделение общей фракции липидов и глицеридов происходит в течение 50 минут при комнатной температуре.

4. Проявление хроматограмм. По истечении указанного срока пластинку вынимают из камеры и высушивают на воздухе в течение 30 минут. Хроматограммы проявляют, опрыскивая из пульверизатора 10% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты. Опрыскивание хроматограммы проводят в стеклянном колпаке диаметром 20–30 см и высотой 40–60 см, установленном с наклоном 5–10°.

Опрыскиваемую пластинку помещают на стеклянной подставке высотой в 10 см. Колпак закрывают стеклом. В отверстие, просверленное в стекле, вставляют кончик пульверизатора и струю опрыскивающей жидкости направляют под пластинку. При опрыскивании в камере создается устойчивый туман, при котором достигается хорошее проявление пятен без нарушения слоя сорбента. После опрыскивания кислотой пластинку нагревают до 80–100° в сушильном шкафу. На желтом фойе проявляются пятна, окрашенные в синий цвет.

На хроматограмме обнаруживаются 8 пятен. В первом пятне у старта находятся фосфолипиды; второе пятно неидентифицировано; в третьем пятне содержится холестерин; четвертое пятно принадлежит моноглицеридам; пятое – диглицеридам; шестое – свободным жирным кислотам, седьмое – триглицеридам и, наконец, в восьмом пятне содержатся эфиры холестерина.


РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

ОСНОВНАЯ

  1.  Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биохимия. – М.: Медицина, 2007. – 704 с.
    1.  Биологическая химия : учебное пособие для студентов вузов / Ю. Б. Филиппович и др.; под ред. Н. И. Ковалевской.- М. :Academia, 2008 .- 254 с.
    2.  Клиническая биохимия / Под ред. В.А. Ткачука. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2007. – 512 с.
    3.  Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. – М.: Дрофа, 2004. – 640 с.
    4.  Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. – М.: Медицина, 2008. – 542 с.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

  1.  Аффинная хроматография. Методы. / Под ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла. М.: Мир, 1988. - 278 с.
  2.  Баркаган З.С. Основы диагностики нарушений гемостаза / М. 1999.
  3.  Баркаган Л.З. Нарушения гемостаза у детей. М., Медицина, 1993
  4.  Биологическая химия. Под редакцией Н.В. Кириловой. – СПб.: СПХФА, 2003. – 89 с.
  5.  Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. Под ред. Е.С. Северина и А.Я. Николаева. – М.: ГЭОТАР-Мед, 2001. - 448 с.
  6.  Биохимия: Учебник для мед. ВУЗов / Под ред. Чл.-корр. РАН Е.С. Северина. – 2002. – 168 с.
  7.  Браунштейн А.Е. На стыке химии и биологии.– М.: Наука, 1987. - 239 с.
  8.  Васильев В.П. Аналитическая химия. Кн.1. Титриметрические и гравиметрический методы анализа. - М.: Дрофа, 2002. - 368 с.
  9.  Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. / Под ред. А. Хеншнен и др. - М.: Мир, 1988. - 622 с.
  10.  Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических молекул. - М.: Мир, 1982. - 448 с.
  11.  Гринстейн Б., Гринстейн А. Наглядная биохимия. – М.: ГЭОТАР Медицина, 2000. - 119 с.
  12.  Гюнтер Х. Введение в курс спектроскопии ЯМР. - М.: Мир, 1984. - 478 с.
  13.  Долгов В.В., Ованесов Е.Н., Щетникович К.А. Фотометрия в лабораторной практике. – СПб.: «Витал Диагностикс СПб», 2004.
  14.  Иванов Е.П.  Руководство по гемостазиологии. Минск, Беларусь, 1991
  15.  Иммунологические методы. /Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. – 472с.
  16.  Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск, Беларусь, 2004
  17.  Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. В 2-х тт. – Т.1. М.: Мир, 1981. 616 с. – Т.2. М.: Мир, 1981. - 524 с.
  18.  Клиническая лабораторная аналитика. В 5 томах. /Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Агат-Мед, 2002.
  19.  Клиническое руководство по лабораторным тестам/ Под ред. Н.У. Тица /Перевод с англ. Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Изд-во «ЮНИМЕД-пресс», 2003.
  20.  Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1998. - 479 с.
  21.  Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Биологическая химия – М.: Academia, 2008. – 256 с.
  22.  Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. - М.: Мир, 2000. - 469 с.
  23.  Комаров Ф.И. и др. Биохимические исследования в клинике. Л., Медицина, 1998
  24.  Кунце У., Шведт Г. Основы качественного и количественного анализа. - М.: Мир, 1997. - 424 с.
  25.  Лабораторная диагностика эндотоксикоза. Лейкоцитарные индексы интоксикации. Методические рекомендации // Составители Бондарь Т.П., Первушин Ю.В. Ставрополь. – 2004.
  26.  Лабораторная оценка воспаления при острой коронарной болезни сердца. Методические рекомендации для врачей клинической лабораторной диагностики // Составители Бондарь Т.П., Абасова Т.В., Цогоева Т.В. – Ставрополь.- 2006.
  27.  Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / Под ред. О. Микеша. - М.: Мир, 1982. - 784 с.
  28.  Лабораторные и инструментальные исследования в диагностике: Справочник /Под ред. В.Н. Титова. – 2004.
  29.  Лабораторные исследования в клинической биохимии: Методические рекомендации для специалистов по клинической лабораторной диагностике. // Составители Бондарь Т.П., Первушин Ю.В. Ставрополь. – 2003.
  30.  Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. В 2-х томах. – М.: Мир,1993. – 384, 415 с.
  31.  Методы исследования и клинико-диагностическое значение изучения тромбоцитов Методические рекомендации. // Составители Бондарь Т.П., Первушин Ю.В., Марченко Л.А., Муратова А.Ю. Ставрополь. – 2004.
  32.  Мошкин А.В., Долгов В.В. Обеспечение качества в клинической лабораторной диагностике. М. 2004.
  33.  Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. – М.: Медицина. – 2002.
  34.  Нейрохимия / Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова.– М.: Изд-во Ин-та биомедхимии РАМН, 1996.– 400 с.
  35.  Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Медицинское информационное агенство, 2001. – 496 с.
  36.  Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. - М., 2002. - 248 с.
  37.  Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.
  38.  Правовые основы лабораторной службы, М, Лабинформ, 1998.
  39.  Практикум по биохимии / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 509 с.
  40.  Практикум по биохимии растений. / Под ред. Полевого В.В., Щипарёва С.М. - СПб.: Изд-во С.-Петербургск. ун-та, 1996. - 200 с.
  41.  Практическая химия белка / Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. - 623 с.
  42.  Проскурин И.К. Биохимия. – М.: Владос-пресс, 2001. – 236 с.
  43.  Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. – Ростов-на-Дону: Феникс, 1999. – 542 с.
  44.  Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. - М.: Мир, 1986. - 398 с.
  45.  Робертс Т. Радиохроматография. М.: Мир, 1981. - 260 с.
  46.  Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии. - Л.: Наука, 1986. - 229 с.
  47.  Сборник тестов и задач по биохимии. Под редакцией И.П. Ашмарина, А.Я. Николаева. – Москва: Издательство Московского университета, 1996. – 234 с.
  48.  Северин Е.С., Алейников Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия. – М.: Медицина, 2000 - 168 с.
  49.  Справочник биохимика. Досон Р. и др. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
  50.  Сухомлин К.Г. Биохимия с основами физической и коллоидной химии. – Краснодар: КубГАУ, 2003. – 335с.
  51.  Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови.- М., Оптимум пресс.-1994
  52.  Тумаков С.А. Краткий терминологический словарь по биохимии. - М.: Перспектива, 2002. - 254 с.
  53.  Уайт А. и др. Основы биохимии. (Т.1-3). М., Мир, 1981
  54.  Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. – М.: Книжный дом «Университет», 2002. – 376 с.
  55.  Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии – М.: Мир, 1980. – 582 с.
  56.  Фролов Ю.П. Современные методы биохимии. – Самара: СУ, 2003. – 411 с.
  57.  Хаваш Е. Ионо- и молекулярноселективные электроды в биологических системах. - М.: Мир, 1988. - 221 с.
  58.  Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика). Кн.2. Количественный анализ. Физико-химические (инструментальные) методы анализа. - М.: Высшая школа, 2003. - 559 с.
  59.  Хроматография. Практическое приложение метода. / Под ред. Э. Хефтмана. В 2-х ч. – Ч.1. М.: Мир, 1986. 336 с. – Ч.2. М.: Мир, 1986. - 422 с.
  60.  Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. - М.: Мир, 1980. 6- 62 с.
  61.  Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. - М.: Мир, 1980. - 622 с.
  62.  Эллиотт В., Эллиотт Д. Биологическая химия и молекулярная биология. – М.: НИИМБХ РАМН, 2000. – 692 с.


СОДЕРЖАНИЕ

Пояснительная записка          3

Оформление лабораторного журнала       6

Лабораторная посуда и оборудование для биохимических исследований 8

Раздел 1            18

Работа № 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты    18

Работа №2. Реакции осаждения белков       24

Работа №3. Макромолекулярная природа белка     33

Работа № 4. Сложные белки         37

Работа № 5. Свойства ферментов         46

Работа № 6. Определение ферментативной активности     54

Работа № 7. Витамины. Качественный анализ витаминов    58

Работа № 8. Количественный анализ витаминов     71

Работа № 9. Углеводы          73

Работа № 10. Выделение и анализ гликогена      83

Работа № 11. Липиды          85

Работа № 12. Показатели липидов. Химические свойства липидов  93

Раздел 2            100

Работа № 13. Исследование ферментов дыхательной цепи    100

Работа № 14. Окислительное фосфорилирование     101

Работа № 15. Моделирование биологических       

окислительно-восстановительных систем      103

Работа № 16. Переваривание углеводов в желудочно-кишечном тракте  105

Работа № 17. Метаболизм липидов        106

Работа № 18. Переваривание жиров липазой поджелудочного сока  111

Работа № 19. Обмен белков         112

Работа №20. Анализ желудочного сока       114

Работа № 21. Исследование гормонов различных классов    117

Работа № 22. Минеральный обмен        121

Работа № 23. Биохимия мышечного сокращения     129

Работа № 24. Биохимия печеночной ткани      132

Раздел 3            135

Работа № 25. Рн и буферные системы       135

Работа №26. Определение общего азота методом кьельдаля   139

Работа № 27. Рефрактометрическое определение концентрации белков

в сыворотке крови          140

Работа №28. Определение общего фосфора в тканях     142

Работа №29. Определение содержания гликогена     143

Работа № 30. Количественное определение нуклеиновых кислот   146

Работа № 31. Газохроматографическое определение спирта в крови  149

Работа № 32. Газохроматографическое определение лекарств           150

Работа № 33. Прямое атомно-абсорбционное определение 3d-элemehtob (Fe, Сu, Mn, Co, Ni) и Zn в биологическом материале             151

Работа № 34. Определение веществ методом ТСХ            152

Литература                   155

150

PAGE  135




1. Оценка платежеспособности и финансовой устойчивости предприятия на примере ОАО
2. РЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата юридичних наук ХАРКІВ ~2
3. 01 S- Функция выявления закономерностей исторического развития ~ это функция - социальной памяти - про
4. Работа с одномерными массивами.html
5. Тема 8. Проблеми організації та діяльності конституційної юстиції в Україні 2 години Для ст
6. і Грошей ~ і кишеня не сходиться
7. Topics covered Trigonometric 1
8. Варианты заданий по ИДЗ 2 часть 1 ДЛЯ ВСЕХ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ КРОМЕ АЭС ЯЭ
9. Тема- День защитника Отечества II
10. Статья 22 Информация о состоянии здоровья 1

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе