Исходный уровень знаний и навыков Студент должен знать Строение водорастворимых В1 В2 В6 PP С

Работа добавлена на сайт samzan.net:

БИОХИМИЯ ВИТАМИНОВ И ГОРМОНОВ

Занятие 24

Витамины

Цель занятия: изучить специфические биохимические функции витаминов, их роль в метаболизме.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение водорастворимых (В1, В2, В6, PP, С, Н) и жирорастворимых (A, D, E, K) витаминов, их основные свойства.
Строение и механизм действия ферментов.
Строение и механизм действия коферментов.
Механизмы перекисных процессов и антиоксидантной защиты.
Механизмы интеграции обмена углеводов, липидов и белков.

Студент должен уметь:

Проводить качественный анализ на биологически активные вещества.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Общая характеристика и классификация витаминов. История учения о витаминах (работы Л. И. Лунина, К. А. Сосина, Х. Эйкмана, К. Функа, Ф. Г. Гопкинса). Групповая характеристика витаминов. Гиповитаминозы и авитаминозы, их причины (алиментарные, повышенная потребность, парентеральное питание, заболевание ЖКТ, глистные инвазии, применение лекарственных препаратов и антивитаминов, врожденные нарушения обмена витаминов).
2. Каждый витамин рассматривается по схеме:
  1. Химическая природа и основные свойства (устойчивость к действию света, pH среды, высокой температуре и др.).
  2. Превращения в организме и механизмы активации.
  3. Механизм действия (участие в обмене веществ, физиологические эффекты).
  4. Картина гипо-, авитаминоза и гипервитаминоза и их клинико-лабораторная диагностика.
  5. Источники витаминов и содержание в продуктах питания.
  6. Показания к применению, профилактические и лечебные дозы.
3. Водорастворимые витамины.
  1. Химическое строение витаминов B1 (тиамин), B2 (рибофлавин), PP (никотинамид, ниацин), B6 (пиридоксин), C (аскорбиновая кислота), H (биотин).
  2. Знание химического строения необязательно для пантотеновой кислоты, пангамовой кислоты, фолиевой кислоты, витамина B12 (кобаламин), витамина U.
  3. Жирорастворимые витамины.
  4. Знание химического строения обязательно для витаминов А (антиинфекционный, витамин роста), D (антирахитический), их провитаминов и метаболитов, E (антистерильный), K (антигеморрагический).
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторные работы.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Какие вещества могут полностью заменить пищевой метионин:

а) бетаин; б) цистеин; в) гомоцистеин; г) витамин B6; д) орнитин; е) карнитин; ж) карнозин; и) креатин?

2 Действие яичного белка авидина связано с тем, что он:

а) растворяет сгустки фибрина; б) препятствует всасыванию биотина; в) блокирует образование холина из бетаина; г) действует как ингибитор трипсина; д) является антивитамином Н; е) является антивитамином А; ж) является антивитамином Е; з) является антивитамином К?

3 Какой метаболический путь страдает от дефицита биотина:

а) синтез кетоновых тел из ПВК; б) образование лактата из глюкозы; в) образование глюкозы из лактата; г) синтез ЖК; д) окисление ЖК; е) элонгация ЖК; ж) синтез кетоновых тел из ЖК?

4 В какие превращения включается аденозин-кобаламин:

а) малонил-КоА  ацетил-КоА; б) -кетоглутарат  сукцинил-КоА; в) ацетил-КоА  ОМГ-КоА; г) пропионил-КоА  метилмалонил-КоА; д) метилмалонил-КоА  сукцинил-КоА; е) сукцинил-КоА  порфобилиноген; ж) ПВК  ацетил-КоА?

5 1,25-дигидрохолекальциферол (кальцитриол) является активной формой:

а) витамина А; б) витамина B1; в) витамина С; г) витамина D; д) витамина К; е) витамина В2; ж) витамина Н; з) витамина U?

6 Триада «Д» – деменция, диарея, дерматит – связана с дефицитом:

а) витамина А; б) витамина B12; в) витамина C; г) биотина; д) ниацина; е) тиамина; ж) холекальциферола; з) пиридоксаля?

7 Какие соединения имеют структурное сходство с витамином К:

а) коэнзим Q; б) викасол; в) тироксин; г) салицилаты; д) витамин Е; е) гистидин; ж) дикумарол; з) фактор Кристмаса?

8 Какие из кофакторов не нуждаются в специфических витаминах-предшественниках:

а) FAD; б) NAD; в) АТФ; г) гем; д) АПБ; е) NAD; ж) FМN; з) HS KоА?

9 Кальцитриол увеличивает в крови уровень:

а) Mg2+; б) Cu2+; в) Ca2+; г) Fe2+; д) Na+; е) К+; ж) Н2РО42-; з) Сl-?

10 В животных тканях триптофан является предшественником:

а) HS KоА; б) никотинамида; в) SAM; г) FAD; д) АТФ; е) NADР; ж) FМN; з) NAD?

11 Какие из витаминов необходимы при окислении пропионата:

а) B12; б) пантотеновая кислота; в) биотин; г) фолиевая кислота; д) тиамин; е) рибофлавин; ж) ниацин; з) пиридоксин?

12 Производные фолиевой кислоты являются коферментами в реакциях:

а) сер  гли; б) образования мочевины; в) образования пиримидинов; г) ЦТК; д) образования пуринов; е) сер  креатин; ж) сер  холин; з) сер  гем?

13 Для реакций гидроксилирования необходимы:

а) NADPH; б) тетрагидрофолиевая кислота; в) O2; г) H2O2; д) АТФ; е) аскорбат; ж) HS KоА; з) тиамин?

14 Длительная закупорка желчных протоков является причиной развития:

а) остеомаляции; б) синдрома бери-бери; в) куриной слепоты; г) мегалобластической анемии; д) синдрома трех "Д"; е) геморрагий; ж) хейлоза; з) диареи?

15 Найдите соответствие: дефицит витаминов – проявления:

А) аскорбиновой кислоты;	а) пеллагра;
Б) никотиновой кислоты;	б) бери-бери;
В) тиамина;	в) геморрагии новорожденных;
Г) D;	г) гипопротромбинемия;
Д) K;	д) гипокальциемия?

16 Найдите соответствие: витамин – реакции:

А) тиамин;	а) карбоксилирования пропионата;
Б) пантотеновая кислота;	б) трансаминирования аминокислот;
В) никотиновая кислота;	в) транскетолазные;
Г) пиридоксин;	г) активации пальмитата;
Д) биотин;	д) окисления лактата?

17 Найдите соответствие: дефицит соединения – состояние:

А) витамина А;	а) мегалобластическая анемия;
Б) рибофлавина;	б) гипохромная анемия;
В) железа;	в) эндемический зоб;
Г) фолата;	г) ксерофтальмия;
Д) иода;	д) хейлоз?

18 Найдите соответствие: метаболические пути – витамин:

А) ЦТК;	а) В1;
Б) пентозный цикл;	б) РР;
В) ГНГ из пирувата;	в) В2;
Г) ГНГ из аминокислот;	г) В6;
Д) анаэробный гликолиз;	д) Н?

19 Найдите соответствие: фермент – кофактор:

А) трансальдолаза;	а) биотин;
Б) метилмалонил КоА-мутаза;	б) аденозилкобаламин;
В) -кетоглутаратдегидрогеназа;	в) Fe и Cu.;
Г) цитохромоксидаза;	г) тиамин;
Д) ацетил коа карбоксилаза;	д) ниацин?

20 Найдите соответствие: кофактор – фермент:

А) пиридоксальфосфат;	а) трансаминаза;
Б) биотин;	б) сукцинатдегидрогеназа;
В) тиаминпирофосфат;	в) пируваткарбоксилаза;
Г) витамин B2;	г) трансформилаза;
Д) ТГФК;	д) пируватдегидрогеназа?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Качественные реакции на витамин B1

Витамин B1 состоит из пиримидинового и тиазольного колец. Он получил название тиамина, поскольку содержит серу и азот:

Тиаминпирофосфат, а в некоторых тканях – тиаминтрифосфат (соответственно ТПФ или ТТФ), является коферментной формой тиамина и синтезируется в печени путем прямого переноса фосфата от АТФ:

ТПФ в составе ферментов углеводного обмена участвует в окислительном декарбоксилировании -кетокислот и в транскетолазной реакции. Его недостаток вызывает поражение периферической нервной системы, сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта. При этом в крови накапливаются пировиноградная кислота и другие -кетокислоты.

Реакция окисления

Принцип метода. В щелочной среде тиамин окисляется феррицианидом калия в тиохром, обладающий при ультрафиолетовом облучении синей флюоресценцией. Реакция протекает по следующей схеме:

Ход работы. К 1 капле 5 %-го раствора тиамина прибавляют 5–10 капель 10 %-го раствора едкого натра, 1–2 капли 5 %-го раствора феррицианида калия и взбалтывают. Прогрев флюороскоп в течение 10 минут, наблюдают синюю флюоресценцию при облучении раствора ультрафиолетовыми лучами.

Диазореакция

Принцип метода. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета.

Ход работы. К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1 %-го раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 5 %-го раствора нитрата натрия добавляют 1–2 капли 5 %-го раствора тиамина и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5–7 капель 10 %-го раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа №2. Качественная реакция на витамин B2

Рибофлавин состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола:

Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов (флавопротеидов – FP) в виде коферментов флавинадениндинуклеотида (FAD) и флавинаденинмонодинуклеоитда (FMN). Флавопротеиды катализируют окислительно-восстановительные реакции. Они участвуют в окислении D-аминокислот, -окислении жирных кислот, в работе дыхательных цепей митохондрий и микросом и др. Биологическое действие флавиновых ферментов связано с наличием окислительно-восстановительных свойств изоаллоксазинового кольца.

При недостатке в организме В2 возникают поражения слизистых в виде хейлита, глоссита и др.

Принцип метода. Окисленная форма витамина В2 представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витамин В2 основана на способности его легко восстанавливаться, при этом раствор витамина В2, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, так как восстановленная форма витамина В2 бесцветна.

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В2, добавляют 5 капель концентрированной HCl, опускают зернышко металлического цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, восстанавливающего рибофлавин, жидкость при этом постепенно розовеет и обесцвечивается. Сравнивают обе формы витамина В2 по флюоресценции, поместив каждую пробирку под освещение флюороскопа.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа №3. Качественная реакция на витамин В6

Группа витамина В6: пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин – являются производными 3-оксипиридина, носят общее название пиридоксина и обладают активностью витамина В6.

В организме эти соединения подвергаются фосфорилированию при участии АТФ с образованием коферментов фосфопиридоксаля, фосфопиридоксамина, которые входят в состав ферментов, участвующих в белковом обмене, в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования аминокислот, десульфинирования, дегидратирования аминокислот, в образовании витамина PP из триптофана и в некоторых других реакциях.

При недостатке витамина В6 у животных прежде всего нарушается обмен белков, у человека недостаточность этого витамина встречается редко.

Принцип метода. Витамин В6 при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета.

Ход работы. К 5 каплям 1 %-го раствора витамина В6 приливают равное количество 1 %-го раствора хлорного железа и перемешивают. Развивается красное окрашивание.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа №4. Качественная реакция на витамин E

Витамин E существует в виде нескольких изомеров: ,  и -токоферолов, которые отличаются друг от друга порядком расположения метильных групп в бензольном кольце. Токоферолы – маслянистые жидкости, растворимые в растительных маслах и жировых растворителях.

Витамин E является мощным антиоксидантом. Некоторые производные витамина E участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, связанных с окислительным фосфорилированием.

Витамин E может депонироваться в мышцах и поджелудочной железе.

Принцип метода. Спиртовой раствор -токоферола окисляется хлоридом железа (Fe3+) в токоферилхинон красного цвета:

Ход работы. В сухую пробирку берут 4–5 капель 0,1 %-го спиртового раствора -токоферола, прибавляют 0,5 мл 1 %-го раствора хлорида железа, тщательно перемешивают. Содержимое пробирки приобретает красное окрашивание.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа № 5. Количественное определение витамина C

Биологическая роль аскорбиновой кислоты в организме исключительно важна и многообразна. Она участвует в окислительно-восстановительных процессах и связана с системой глутатиона.

Аскорбиновая кислота участвует в синтезе стероидных гормонов в коре надпочечников и катехоламинов в мозговом слое надпочечников и необходима для процесса гидроксилирования как кофактор ферментов гидроксилаз, например дофамингидроксилазы и др. Она участвует в образовании тетрагидрофолиевой кислоты из фолиевой кислоты, процессинге коллагена (гидроксилировании лизина в оксилизин, пролина в оксипролин), ускоряет всасывание железа, а также активирует фермент желудочного сока пепсиноген, что особенно важно при недостатке соляной кислоты в желудочном соке.

Принцип метода. Метод основан на способности витамина C восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6 ДХФИФ – краска Тильманса), который в кислой среде имеет красную окраску, при восстановлении – обесцвечивается, а в щелочной среде окраска синяя. Для предохранения витамина C от разрушения исследуемый раствор титруют в кислой среде щелочным раствором 2,6 ДХФИФ до появления розового окрашивания.

Для расчета содержания аскорбиновой кислоты в продуктах (капуста, картофель, хвоя, шиповник и др.), используют формулу

0,088АГ  100
X = ,
БВ

где X	– содержание аскорбата в 100 г продукта, мг;
0,088	– коэффициент пересчета;
А	– результат титрования 0,001 н раствором 2,6 ДХФИФ, мл;
Б	– объем экстракта, взятый для титрования, мл;
В	– количество продукта, взятое для анализа, мг;
Г	– общее количество экстракта, мл;
100	– пересчет на 100 г продукта.

Ход работы.

1 Определение содержания витамина C в капусте.

Навеску капусты – 1 г тщательно растирают в ступке с 2 мл 10 %-го раствора соляной кислоты, объем доводят до 10 мл и фильтруют. Отмеривают для титрования 2 мл фильтрата, добавляют 10 капель 10 %-го раствора соляной кислоты и титруют 2,6 ДХФИФ до розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 с.

По формуле, указанной выше, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты в 100 г продукта (в мг). По норме их должно быть (в мг): капуста – 25–60; хвоя – 200–400; шиповник – 500–1500.

2 Определение содержания витамина C в картофеле.

Взвешивают 5 г картофеля, тщательно растирают в ступке с 20 каплями 10 %-го раствора соляной кислоты (для того, чтобы картофель не темнел). Постепенно приливают дистиллированную воду – 15 мл. Полученную массу сливают в стаканчик, ополаскивают ступку водой, сливают ее по стеклянной палочке в стаканчик и титруют 0,001н раствором 2,6 ДХФИФ до розового окрашивания. В 100 г картофеля содержится 1–5 мг витамина C.

3 Определение содержания витамина C в моче.

Определение содержания витамина C в моче дает представление о запасах этого витамина в организме, так как наблюдается соответствие между концентрацией витамина C в крови и количеством этого витамина, выделяемым с мочой. Однако при гиповитаминозе С содержание аскорбиновой кислоты в моче не всегда понижено. Часто оно бывает нормальным, несмотря на большой недостаток этого витамина в тканях и органах.

У здоровых людей введение per os 100 мг витамина C быстро приводит к повышению его концентрации в крови и моче. При гиповитаминозе C ткани, испытывающие недостаток в витамине, задерживают принятый витамин C, и его концентрация в моче не повышается. C мочой у здорового человека экскретируется 20–30 мг/сут или 113–170 мкмоль/сут витамина C. У детей уровень экскреции этого витамина понижается при многих острых и хронических инфекционных и соматических заболеваниях.

Ход работы. В стаканчик или колбочку отмеривают 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды, перемешивают, подкисляют 20 каплями 10 %-го раствора соляной кислоты и титруют 0,001н раствором 2,6 ДХФИФ до розового окрашивания.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты в моче проводят по формуле

0,088АВ
X = ,
Б

где X	– содержание аскорбиновой кислоты в суточной моче, мг/сут;
0,088	– коэффициент пересчета;
А	– результат титрования 0,001н раствором 2,6-ДХФИФ, мл;
Б	– объем мочи, взятый для титрования, мл;
В	– среднее суточное количество мочи (для мужчин – 1500 мл, для женщин – 1200 мл).

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 133–169; 1998. С. 204–242.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 167–172.

Дополнительная

Экспериментальная витаминология / Под ред. Ю. М. Островского. Минск: Наука и техника, 1979.
Витамины / Под ред. М. И. Смирнова. М.: Медицина, 1974.
Бышевский А. Ш., Терсенов О. А. Биохимия для врача. Екатеринбург: 1994. С. 134–144.
Методы оценки и контроля витаминной обеспеченности населения / Под ред. В. Б. Спиричева. М.: Наука, 1984.

Занятие 25

Общая эндокринология. Механизм действия гормонов

Цель занятия: изучить химическое строение, классификации, механизмы действия гормонов, принципы и уровни организации нейро-эндокринной системы. Изучить механизмы регуляции Ca-P обмена.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение и свойства основных классов гормонов (стероидные, пептидные, катехоламины).
Строение аденилатциклазного комплекса.
Механизмы регуляции активности ферментов через системы вторичных посредников (мессенджеров).
Структуру хроматина и регуляцию биосинтеза белка.
Механизмы интеграции обмена углеводов, липидов и белков.
Основные онтогенетические изменения морфологических признаков, функций и метаболизма.

Студент должен уметь:

Проводить титрометрический анализ.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Гормоны. Характеристика. Свойства. Паракринное и аутокринное действие гормонов. Номенклатура, классификация гормонов по химическому строению, месту образования, механизму действия и др.
2. Принципы организации нейро-эндокринной системы:
  1. Иерархический – уровни организации нейро-эндокринной системы:
- уровень внутриклеточных гормонов: строение, метаболизм и биологическая роль цАМФ и цГМФ (строение аденилатциклазного комплекса). Основные ферменты, стадии метаболизма и метаболиты (PG, LT, Tx) арахидоновой кислоты, (C20:4) и инозитолфосфатидов – в норме и при патологии;
- уровень гормонов периферических желез;
- уровень тропных гормонов гипофиза;
- уровень гипоталамических нейрогормонов.
  1. Наличие прямой и обратной связи положительной и отрицательной связи (+, – взаимодействия).
  2. Наличие центрального и периферического эффекта гормонов.
  3. Наличие порога чувствительности гипоталамуса.
1. Факторы, определяющие интенсивность гормонального эффекта. Общая схема синтеза гормонов. Процессинг гормонов. Понятие о прогормонах и антигормонах. Секреция гормонов. Циркуляторный транспорт гормонов в крови и факторы, определяющие его. Метаболизм гормонов в периферических тканях (катехоламинов, пептидных, стероидных и тиреоидных), характеристика ферментов. Пути экскреции гормонов.
2. Тканевой спектр действия гормонов. Характеристика гормональных рецепторов, их локализация. Механизм действия гормонов – катехоламинов, пептидных, стероидных и тиреоидных. Роль "внутриклеточных" гормонов и Ca2+ в реализации гормональных эффектов.
3. Протеинкиназы, их характеристика и роль в реализации гормональных эффектов. Взаимоотношения Ca2+ и аденилатциклазного комплекса.
4. Феномен десенситизации, его механизм и биологическое значение. Пермиссивные и сенсибилизирующие эффекты гормонов.
5. Гормональная регуляция Ca-P обмена. Паратгормон и кальцитонин. Понятие об экзогенных гормонах – витамин D3, его тканевой метаболизм и метаболиты. Рахит, характеристика биохимических нарушений.
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторные работы.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Какие гормоны вырабатываются в нейрогипофизе:

а) окситоцин; б) АДГ; в) рилизинг-факторы; г) инсулин; д) гонадотропины; е) катехоламины; ж) гестагены; з) альдостерон?

2 Какие гормоны активируют ГНГ:

а) кортикостероиды; б) инсулин; в) глюкагон; г) соматотропин; д) тироксин; е) соматостатин; ж) адреналин; з) прогестерон?

3 Гиперкальциемия наблюдается при:

а) гиперпаратиреозе; б) гипервитаминозе D; в) лейкозах; г) гипопаратиреозе; д) рахите; е) спазмофилии; ж) холецистите; з) инфаркте миокарда?

4 Гипокальциемия обнаруживается при:

а) рахите; б) хронических нефритах; в) закупорке желчных путей; г) гиперпаратиреозе; д) гипопаратиреозе; е) метастазах рака в кости; ж) гиповитаминозе D; з) атеросклерозе?

5 Какие системы участвуют в регуляции объема внеклеточной жидкости:

а) ренин – ангиотензин – альдостерон;

б) гипоталамус – нейрогипофиз;

в) гипоталамус – гипофиз – кора надпочечников;

г) калликреин – кининовая система;

д) симпато – адреналовая система;

е) аденилатциклазная?

6 Гиперфосфатемия отмечается при:

а) нарушении выделительной функции почек; б) гипопаратиреозе; в) гиперпаратиреозе; г) гипервитаминозе D; д) гиповитаминозе D; е) гипотиреозе; ж) гипертиреозе; з) гиперкортицизме?

7 Концентрация гистамина в крови возрастает при:

а) переохлаждении; б) перегревании; в) аллергических отеках; г) бронхиальной астме; д) переутомлении; е) ожирении?

8 Концентрация серотонина в крови возрастает при:

а) карциноидном синдроме;

б) опухоли хроматаффинной ткани (феохромоцитоме);

в) злокачественных новообразованиях простаты;

г) неоперабельных опухолях прямой кишки;

д) тромбоцитопении;

е) аллергических состояниях?

9 Какие факторы способствуют минерализации костной ткани:

а) низкий уровень витамина C; б) высокий уровень Ca2+ в плазме; в) паратгормон; г) 24, 25-дигидроксихолекальциферол; д) эстрогены; е) ацидоз; ж) кальцитонин; з) кальцитриол?

10 Как изменяются показатели сыворотки крови при гиперпаратиреозе:

а) повышается содержание тироксина;

б) повышается содержание паратгормона;

в) повышается содержание Ca2+;

г) снижается содержание Ca 2+;

д) снижается концентрация фосфата;

е) повышается концентрация фосфата;

ж) повышается судорожная активность;

з) повышается нейромышечная возбудимость?

11 Кальцитриол является активной формой:

а) витамина K; б) витамина E; в) витамина D; г) витамина B1; д) витамина B12; е) витамина H; ж) витамина U; з) витамина B2?

12 Какие соединения активируют синтез кальцийсвязывающего белка в энтероцитах:

а) кальций; б) 1,25-дигидрохолекальциферол; в) -токоферол; г) кальцитонин; д) паратгормон; е) витамин D3; ж) андрогены; з) инсулин?

13 Что включает механизм действия прогестерона:

а) взаимодействие с рецепторами мембраны;

б) проникновение гормона в клетку;

в) активацию аденилатциклазы;

г) синтез "полового" белка;

д) взаимодействие с внутриклеточными рецепторами;

е) взаимодействие с хроматином?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Определение кальция в моче по методу Сулковича

При гиперпаратиреозе, передозировке витамина D, опухолях костей и некоторых других заболеваниях наблюдается гиперкальциемия, которая исключительно опасна для здоровья. В связи с этим необходим длительный контроль за содержанием кальция в сыворотке крови. Определение уровня кальция в моче может быть использовано для ориентировочной оценки его содержание в сыворотке крови.

Принцип метода. В кислой среде в присутствии реактива Сулковича (состав: щавелевая кислота 2,5 мг, оксалат аммония 2,5 г, ледяная уксусная кислота 5 мл, дистиллированная вода до 150 мл) кальций выпадает в осадок в виде оксалата кальция.

Ход работы. В пробирку с 1 мл мочи прибавляют 0,5 мл реактива Сулковича. Отмечают прозрачность раствора.

Оценка. Отсутствие помутнения означает, что содержание кальция в моче ниже нормы. При этом в крови отмечается гипокальциемия (содержание в сыворотке менее 1,8–2 ммоль/л).

Легкое помутнение указывает на нормальный уровень кальция 2,25–2,6 ммоль/л. Резкое (молочного вида) помутнение характерно для гиперкальциемии при условии, что последующая проба с кипячением не обусловлена присутствием уратов или белка.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Лабораторная работа № 2. Качественные реакции, подтверждающие белковую природу инсулина

Принцип метода (см. раздел "Химия белка").

Ход работы.

1 Биуретовая реакция. В пробирку с 1 мл раствора инсулина добавляют 5–6 капель раствора гидроксида натрия и 1–2 капли раствора сульфата меди (II). После перемешивания жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.

2 Реакция Милона. К 5–10 каплям раствора инсулина добавляют 2–3 капли реактива Милона и осторожно нагревают. Образуется осадок в виде сгустка красного цвета.

3 Реакция Фоля. К 5–10 каплям раствора инсулина (использовать неразбавленный препарат) добавляют 2–3 мл раствора гидроксида натрия и кипятят 10 мин на маленьком пламени горелки. После охлаждения добавляют 1–2 капли раствора Pb(ONa)2. Появляется бурое окрашивание.

Примечание – Раствор Pb(ONa)2 приготовить в отдельной пробирке. Для этого к одной капле раствора ацетата свинца добавляют по каплям раствор 10 %-го гидроксида натрия до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца. При стоянии или нагревании бурое окрашивание может усилиться до черного и может выпасть черный осадок.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 133–169; 1998. С. 248–297.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 351–364.
Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2. С. 147–169, 170–172, 193–204.
Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 433–457.

Дополнительная

Дильман В .М. Эндокринологическая онкология. М.: Медицина, 1974, 1983.
Розен В. Б. Основы эндокринологии. М.: Высшая школа, 1984.
Уайт А. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981. Т. 3. С. 1499–1513, 1529–1542, 1563–1574.
Эндокринология и метаболизм / Под ред. П. Фелига и др. М.: Медицина, 1985. Т. 1, 2.
Теппермен Дж., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир. 1989.

Занятие 26

Частная эндокринология.
Гормоны периферических желез

Цель занятия: изучить механизмы действия гормонов, участвующих в регуляции метаболизма.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение и свойства основных классов гормонов (стероидные, пептидные, катехоламины).
Строение аденилатциклазного комплекса.
Механизмы регуляции активности ферментов через системы вторичных посредников (мессенджеров).
Структуру хроматина и регуляцию биосинтеза белка.
Механизмы интеграции обмена углеводов, липидов и белков.
Основные онтогенетические изменения морфологических признаков, функций и метаболизма.

Студент должен уметь:

Проводить качественный анализ на биологически активные вещества.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. ТТГ. Химическая природа, регуляция секреции, механизм действия.
  1. Щитовидная железа. T3, T4 – химическая природа, биосинтез, регуляция секреции, механизм действия, роль в обмене, метаболизм в тканях, основные клинические проявления гипо- и гиперфункции T3 и T4. Механизм возникновения эндемического зоба.
2. СТГ. Химическая природа, регуляция секреции, механизм действия, механизм анаболических и контринсулярных эффектов. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
3. Поджелудочная железа. Инсулин, глюкагон, соматостатин. Химическая природа, регуляция секреции, механизм действия, роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперинсулинизма.
  1. Диабет 1-го типа (инсулиндефицитный) и диабет 2-го типа (инсулинрезистентный). Причины возникновения, сравнительная характеристика (сходство и отличия).
4. АКТГ. Химическая природа, механизм действия, основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
  1. Глюкокортикоиды. Строение, регуляция синтеза и секреции, метаболизм в тканях. Механизм действия, роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперкортицизма.
  2. Минералокортикоиды, химическая природа, регуляция секреции, метаболизм в тканях, механизм действия, роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
  3. Мозговое вещество надпочечников. Катехоламины. Химическая природа, биосинтез, регуляция секреции, метаболизм в тканях, механизм действия, роль в обмене.
5. Гонадотропины, ФСГ, ЛГ. Химическая природа, механизмы регуляция секреции, механизм действия.
  1. Половые гормоны. Андрогены. Химическая природа, регуляция секреции, механизм действия, роль в обмене, метаболизм в тканях. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
  2. Эстрогены. Химическая природа, регуляция секреции, механизм действия, роль в обмене, метаболизм в тканях. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
  3. Гестагены. Прогестерон, химическая природа, регуляция секреции, механизм действия, роль в обмене, метаболизм в тканях. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
6. Гормоны желудочно-кишечного тракта. Химическая природа. Биологическая роль и клиническое применение.
7. Гормоны тимуса. Химическая природа. Биологическая роль и клиническое применение.
8. Эндорфины, энкефалины – структура, биологическая роль.
9. Адаптивная роль гормонов. Стресс, основные проявления. Стадии стресса и их клиническое значение. Понятие о дистрессе и эустрессе. Гормональная регуляция энергетического обмена при стрессе.
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторные работы.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Эстрогены выделяется с мочой в виде конъюгата:

а) с глюкуроновой кислотой; б) цистеином; в) глицином; г) глутамином; д) белком; е) сульфатом?

2 Какие превращения не характерны для животной клетки:

а) эстрон  эстриол; б) эстрон  эстрадиол;

в) эстрон  дигидротестостерон;

г) 17-дегидроксипрегненолон  тестостерон;

д) прогестерон  эстрогены; е) холестерол  эстрогены?

3 Чем можно объяснить вирилизацию при синдроме Кушинга:

а) усилением глюкокортикоидных эффектов; б) слабыми минералокортикоидными и сильными глюкокортикоидными эффектами; в) сильными минералокортикоидными и слабыми глюкокортикоидными эффектами; г) действием андрогенов надпочечников; д) действием эстрогенов надпочечников; е) действием гестагенов надпочечников?

4 Холестерин превращается:

а) в инозитолтрифосфат; б) кортикостероиды; в) желчные кислоты; г) полиеновые жирные кислоты; д) эндорфины и энкефалины; е) кальцитриол?

5 Как метаболизирует холестерин у человека:

а) переходит в гликохолевую кислоту; б) является компонентом мембраны; в) превращается в ацетил-КоА; г) превращается в кортизол; д) превращается в CO2 и воду; е) экскретируется с мочой?

6 Гиперкортицизм сопровождается:

а) увеличением содержания гликогена в печени; б) уменьшением содержания гликогена в печени; в) увеличением массы скелетной мускулатуры; г) уменьшением массы скелетной мускулатуры; д) атрофией надпочечников; е) гипертрофией надпочечников; ж) увеличением уровня АКТГ в крови; з) уменьшением уровня АКТГ в крови?

7 Какие метаболиты включает биосинтез тестостерона:

а) изопентенилпирофосфат; б) прегненолон; в) ланостерин; г) фитостерин; д) кортизол; е) прогестерон; ж) эстриол; з) ДОФА?

8 При каких болезнях отмечается повышение уровня кортизола в крови:

а) болезнь Хартнупа; б) синдром Иценко-Кушинга; в) болезнь Аддисона; г) Базедова болезнь; д) микседема; е) гипофизарная кахексия; ж) сахарный диабет; з) синдром Леша-Нихана?

9 Назовите причины гипернатриемии:

а) полиурия; б) олигурия; в) некомпенсированный сахарный диабет; г) ограниченный прием жидкости; д) гиперкортицизм; е) болезнь Аддисона; ж) болезнь Гирке; з) синдром Иценко-Кушинга?

10 Какие гормоны синтезируются в сетчатой зоне коры надпочечников:

а) андрогены; б) катехоламины; в) дезоксикортикостерон; г) соматотропин; д) альдостерон; е) эстрогены; ж) гестагены; з) соматостатин?

11 Для феохромоцитомы характерна:

а) гипергликемия; б) кетонемия; в) гиперкатехоламинемия; г) ацидоз; д) азотемия; е) кетонурия; ж) гипогликемия; з) гипертензия?

12 Какие гормоны синтезируются в клубочковом слое коры надпочечников:

а) АДГ; б) глюкокортикоиды; в) андрогены; г) эстрогены; д) минералокортикоиды; е) катехоламины?

13 При хроническом гипокортицизме (болезни Аддисона) наблюдается недостаточность:

а) андрогенов; б) катехоламинов; в) глюкокортикоидов; г) минералокортикоидов; д) эстрогенов; е) катехоламинов?

14 Для акромегалии характерно повышение уровня:

а) глюкагона; б) СТГ; в) инсулина; г) эстрогенов; д) тироксина; е) адреналина; ж) АКТГ; з) андрогенов?

15 Повышение экскреции катехоламинов с мочой встречается при:

а) феохромоцитоме; б) бронхиальной астме; в) гипертермии; г) стенокардии покоя; д) инфаркте миокарда; е) шоке?

16 Когда снижается экскреция с мочой 17-кетостероидов:

а) адреногенитальный синдром; б) гиперплазия коры надпочечников; в) опухоли коры надпочечников; г) болезнь Иценко-Кушинга; д) болезнь Аддисона?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Обнаружение иода в препарате щитовидной железы

Принцип метода. При щелочном гидролизе тироксина образуется иодид калия, из которого иод вытесняется иодатом калия. Выделившийся свободный йод дает с крахмалом синее окрашивание.

В лаборатории кафедры (!) проводят гидролиз аптечного тиреоидина по следующей методике. В фарфоровой ступке растирают 10 таблеток тиреоидина. Полученный порошок пересыпают в колбу для гидролиза и заливают 25 мл 10 %-го раствора NaHCO3. Перемешивают, закрывают пробкой с обратным холодильником и ставят на песчаную баню. Содержимое пробирок кипятят 10–15 мин и охлаждают.

Ход работы. К 1 мл гидролизата, полученного в лаборатории, помещают в фарфоровую чашку и нейтрализуют 10 %-м раствором серной кислоты, добавляя ее по каплям до слабокислой реакции на лакмус. Затем добавляют 2 капли раствора крахмала и 2-3 капли раствора KIO3. Выделившийся йод окрашивает жидкость в синий цвет.

Лабораторная работа № 2. Качественные реакции на адреналин

Принцип метода. Адреналин и норадреналин образуются из аминокислоты тирозина и являются производными пирокатехина. Присутствие в их структуре пирокатехинового кольца определяет химические свойства этих гормонов. Они легко окисляются в нейтральных растворах с образованием красного пигмента – адренохрома, который при последующей полимеризации образует меланины.

Ход работы.

1 Реакция с хлоридом железа (III).

В пробирку вносят 3 капли раствора адреналина и 1 каплю 1 %-го раствора хлорида железа (III). Проявляется изумрудно-зеленое окрашивание, которое затем при добавлении 1 капли раствора гидроксида натрия приобретает вишнево-красный цвет. Реакция обусловлена тем, что пирокатехиновое ядро образует с ионами железа (III) соединения типа фенолятов.

2 Диазореакция на адреналин.

В пробирку вносят 2–3 капли раствора адреналина, 2 капли 10 %-го раствора KIO3 и 2 капли раствора уксусной кислоты. Перемешивают и слегка нагревают. Жидкость окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена тем, что при взаимодействии адреналина с диазореактивом образуется азокраситель.

Лабораторная работа № 3. Обнаружение 17-кетостероидов в моче

Принцип метода. Метод основан на взаимодействии 17-кетостероидов с м-динитробензолом в щелочной среде с образованием продуктов конденсации розово-фиолетового цвета.

Ход работы. В пробирку вносят 20 капель мочи и 30 капель раствора мдинитробензола, который добавляют медленно, так, чтобы он стекал по стенке пробирки. Пробирку не встряхивать. Затем по стенке пробирки добавляют 6 капель раствора гидроксида натрия.

Верхний слой жидкости окрашивается в розово-фиолетовый цвет.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 170–203; 1998. С. 248–297.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 351–364.
Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2. С. 147–169, 170–172, 193–204.

Дополнительная

Эндокринология и метаболизм / Под. ред. П. Фелига и др. М.: Медицина, 1985.
Дильман В. М. Эндокринологическая онкология. М.: Медицина, 1974, 1983.
Розен В. Б. Основы эндокринологии. М.: Высшая школа, 1984.
Уайт А. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981, Т. 3. С. 1542–1702.
Теппермен Дж., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир, 1989.

Занятие 27

Контрольное по разделу
«Биохимия витаминов и гормонов»

Цель занятия: контроль усвоения вопросов пройденного раздела “Биохимия витаминов и гормонов”.

Контрольные вопросы

Гормоны. Определение. Свойства. Номенклатура, классификация.
Принципы организации нейро-эндокринной системы:
1. иерархический. Уровни организации нейро-эндокринной системы:
  1. внутриклеточные гормоны (цАМФ), (цГМФ), их тканевой метаболизм. Строение и функция аденилатциклазного комплекса. Схема метаболизма арахидоновой кислоты, основные ферменты, их обмен в норме и при патологии;
  2. гормоны периферических желез;
  3. тропные гормоны гипофиза;
  4. гипоталамические нейрогормоны;
2. наличие прямой и обратной связи (+, – взаимодействия);
3. наличие центрального и периферического эффекта гормонов;
4. наличие порога чувствительности гипоталамуса.
Факторы, определяющие гормональный эффект.
1. Общая схема синтеза гормонов. Понятие о прогормонах и антигормонах.
2. Механизм действия гормонов (катехоламинов, пептидных, стероидных, тиреоидных).
3. Характеристика рецепторов, их клеточная локализация.
Феномен десенситизации, его механизмы и биологическое значение. Пермиссивный, сенсибилизирующий эффекты гормонов.
Роль ионов Са2+ в регуляции гормональных эффектов. Витамин D и его метаболиты. Регуляция Ca-P обмена. Паратгормон и кальцитонин. Нарушение Ca-P обмена. Рахит.
ТТГ. Химическая природа, механизм действия. Щитовидная железа. Т3, Т4 – химическая природа, биосинтез, метаболизм в тканях. Механизм действия, роль в обмене, основные клинические проявления гипо- и гиперфункции Т3 и Т4.
СТГ. Химическая природа, механизм действия, основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
Поджелудочная железа. Проинсулин, инсулин, глюкагон, соматостатин – химическая природа, регуляция секреции, механизм действия. Роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции инсулина. Диабет I типа (инсулинодефицитный) и диабет II типа (инсулинорезистентный). Сходство и различия.
АКТГ. Химическая природа. Механизм действия, основные клинические проявления гипо- и гиперфункции. Глюкокортикоиды – строение, регуляция секреции, метаболизм в тканях, механизм действия, роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции. Минералокортикоиды – химическая природа, регуляция секреции, метаболизм в тканях, механизм действия, роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции.
Мозговое вещество надпочечников. Катехоламины – химическая природа, регуляция секреции, метаболизм в тканях, механизм действия, роль в обмене.
Гонадотропины, ФСГ, ЛГ. Химическая природа, механизм действия.
Половые гормоны. Андрогены. Химическая природа, регуляция секреции, механизм действия, роль в обмене. Основные клинические проявления гипо- и гиперфункции. Гестагены. Прогестерон – химическая природа, регуляция секреции, механизм действия.
Гормоны тимуса. Химическая природа. Биологическая роль.
Эндорфины.
Адаптивная роль гормонов. Понятие о стрессе. Гормональная регуляция энергетического обмена при стрессе.
История учения о витаминах (работы Лунина Н. И., Сосина К. А., Эйкмана К., Функа К.).
Общая характеристика и классификация витаминов. Групповая характеристика витаминов:
1. химическая природа и основные свойства (устойчивость к действию света, рН, высокой температуре);
2. роль витаминов в обмене веществ. Физиологические эффекты;
3. картина гипо- , авитаминоза и гипервитаминоза и их лабораторная диагностика;
4. содержание в продуктах питания;
5. источники витаминов, профилактическая и лечебная дозы.
Гиповитаминозы и авитаминозы, их причины (алиментарное, парентеральное питание, заболевание ЖКТ, глистные инвазии, повышенная потребность, лекарственные препараты, антивитамины).
Водорастворимые витамины: В2 (рибофлавин), В1 (тиамин), РР (никотинамид, ниацин), В6 (пиридоксин), Н (биотин), пантотеновая кислота, пангамовая кислота, фолиевая кислота, В12 (кобаламин), С (аскорбиновая кислота).
Жирорастворимые витамины: витамины А (антиинфекционный, витамин роста), D (антирахитический), их провитамины и метаболиты, Е (антистерильный), К (антигеморрагический).
Врожденные нарушения метаболизма витаминов.
БИОХИМИЯ КРОВИ, ПОЧЕК И ПЕЧЕНИ

Занятие 28

Основы регуляции КОС. Белки крови

Цель занятия: изучить механизмы изменения физико-химических констант крови в норме и при патологии. Научиться определять содержания кальция в плазме крови и щелочной резерв крови.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Состав крови.
Строение и функции форменных элементов.
Основные физико-химические константы крови.
Основные положения теории буферных растворов.
Принципы и механизм работы ионных АТФ-аз.

Студент должен уметь:

Проводить титрационный анализ.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Функции крови, основные физико-химические константы крови (pH, pCO2, pO2, плотность, осмолярность), их изменения при патологии. Плазма крови – качественный и количественный состав. Содержание триглицеридов, глюкозы, белка, общих липидов, мочевины, натрия, калия, кальция, магния, хлора, HCO3-).
2. Белки плазмы крови, их классификация, характеристика отдельных представителей и методы выделения: электрофорез, высаливание и др. Изменения белкового спектра при патологии.
3. Основные небелковые компоненты крови. Остаточный азот, его происхождение и диагностическое значение.
4. Понятие о кислотно-основном состоянии (КОС). Основные принципы регуляции КОС:
  1. изоосмолярность;
  2. электронейтральность;
  3. постоянство pH.
5. Механизмы регуляции КОС:
  1. физико-химические (разбавление, буферные системы);
  2. физиологические (роль почек, легких, печени, ЖКТ и др.).
6. Классификация нарушений КОС (ацидозы, алкалозы, их виды). Основные механизмы развития респираторных, метаболических и выделительных нарушений КОС. Физиологические механизмы коррекции нарушений КОС. Способы оценки нарушений КОС (показатели КОС и электролиты крови, pH мочи и др.).
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторные работы.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Главным соединением в крови, содержащим азот небелкового происхождения, является:

а) мочевина; б) аммиак; в) пурины; г) карнитин; д) аминокислоты; е) мочевая кислота; ж) билирубин; з) эрготионеин?

2 Назовите типичные представители белков острой фазы:

а) церулоплазмин; б) трансферрин; в) гаптоглобин; г) фибриноген; д) орозомукоид; е) C-реактивный белок; ж) гемоглобин; з) альбумин; и) транскортин; к) 1 антитрипсин?

3 Какой из иммуноглобулинов является секреторным?

а) Ig А; б) Ig G; в) Ig Е; г) Ig D; е) Ig M?

4 Вязкость крови зависит от содержания в крови:

а) мочевины; б) количества клеток; в) фибриногена; г) белков “острой” фазы; д) холестерина; е) ЛП; ж) альбумина; з) гормонов?

5 Чем обусловлен гиперосмолярный синдром:

а) избытком глюкозы; б) увеличением уровня мочевины; в) гипернатриемией; г) повышения уровня альбумина; д) гиперкетонемией?

6 Слабощелочная реакция плазмы крови поддерживается:

а) анионами хлора; б) ионами HCO3-; в) ионами HPO42-; г) протеинат-ионами; д) катионами металлов?

7 Содержание ферритина в сыворотке крови снижается при:

а) железодефицитных анемиях; б) анемиях, связанных с беременностью; в) острых воспалительных процессах; г) коллагенозах; д) онкологических заболеваниях; е) травмах; ж) послеоперационном периоде?

8 Беременность сопровождается увеличением:

а) содержания сывороточного железа; б) общей железосвязывающей способности сыворотки крови; в) процента насыщения трансферрина железом; г) уровня ферритина; д) содержания свободных протопорфиринов в эритроцитах; е) уровня трансферрина; ж) уровня гемоглобина?

9 Метаболический ацидоз развивается:

а) при накоплении в организме кетоновых тел; б) накоплении лактата и др. органических кислот; в) гиперпродукции кетокислот и органических кислот; г) длительном приеме кислой пищи; д) приеме мочегонных средств – ингибиторов карбангидразы (дикарб); е) гиповентиляции; ж) гипервентиляции; з) рвоте; и) диарее?

10 Основными причинами развития метаболического ацидоза являются:

а) увеличенное введение в организм H+ ионов; б) повышенное образование кетоновых тел, лактата и др.; в) повышенная потеря HCO3-; г) потеря ионов K+; д) потеря ионов Сl-; е) введение ионов Сl-; ж) введение ионов HCO3-; з) дефицит инсулина?

11 Изменение pH крови при метаболическом ацидозе сопровождается:

а) усилением диссоциации HbO2; б) гиперкалиемией; в) снижением содержания K+ в клетках паренхиматозных органов; г) увеличением pCO2; д) стимуляцией симпато-адреналовой системы; е) снижением pCO2?

12 Для коррекции метаболического ацидоза применяют:

а) кислородотерапию; б) введение растворов HCO3-; в) введение трис-буфера; г) переливание свежей крови; д) введение солей калия с добавлением глюкозы и инсулина; е) введение гипертонического раствора глюкозы; ж) введение физраствора (хлорида натрия)?

13 В каких случаях развивается метаболический ацидоз:

а) сахарный диабет; б) стеноз привратника; в) гипокалиемия; г) отек легких; д) почечная недостаточность; е) острый ринит; ж) острая пневмония; з) переломах костей?

14 В каких случаях развивается метаболический алкалоз:

а) задержка H2CO3; б) задержка органических кислот; в) образование кетоновых тел в организме; г) гиповентиляция легких; д) гипервентиляция легких; е) лечение кортикостероидами без препаратов калия; ж) рвота; з) диарея?

15 Выделительный негазовый алкалоз вызывается:

а) задержкой в организме оснований; б) потерей натрия; в) потерей калия; г) усилением мочевой экскреции хлоридов; д) введением растворов HCO3-; ж) длительным приемом "щелочной" пищи; з) рвота; и) диарея?

16 При активном ревматическом процессе возрастает уровень:

а) альбуминов; б) 1-глобулинов; в) 2-глобулинов; г) -глобулинов; д) глобулинов; е) церулоплазмина; ж) гаптоглобина; з) С-реактивного белка?

17 В состав каких белковых фракций входит трансферрин:

а) альбуминов; б) 1-глобулинов; в) 2-глобулинов; г) -глобулинов; д) глобулинов; е) ЛП; ж) гаптоглобина; з) С-реактивного белка?

18 В состав каких белковых фракций входит C-реактивный белок:

а) альбуминов; б) 1-глобулинов; в) 2-глобулинов; г) -глобулинов; д) глобулинов; е) пре--глобулинов?

19 В состав каких белковых фракций входят криоглобулины:

а) альбуминов; б) 1-глобулинов; в) 2-глобулинов; г) -глобулинов; д) глобулинов; е) пре--глобулинов?

20 -фетопротеин обнаруживается в сыворотке крови при:

а) норме у взрослых; б) острой пневмонии; в) паренхиматозном гепатите; г) первичном раке печени; д) тератобластомах с элементами эмбрионального рака; е) метастазах в печень; ж) у беременных женщин; з) у новорожденных?

21 Наиболее ранний белок острой фазы воспаления:

а) C-реактивный белок; б) гаптоглобин; в) альфа-кислый-гликопротеин (орозомукоид); г) антипротеазный ингибитор (1 антитрипсин); д) фибриноген; е) трансферрин; ж) транскортин?

22 При каком патологическом состоянии возникает абсолютная гипопротеинемия:

а) тяжелый тиреотоксикоз; б) цирроз печени; в) неспецифический язвенный колит; г) нефротический синдром; д) плазмоцитома; е) ожоговая болезнь; ж) сахарный диабет?

23 При каких состояниях снижен синтез Ig G:

а) туберкулез легких; б) бактериальный эндокардит; в) ожоговая болезнь; г) нефротический синдром; д) хронические энтероколиты; е) злокачественная опухоль; ж) сахарный диабет?

24 При какой патологии повышается уровень сиаловых кислот в сыворотке крови:

а) инфаркт миокарда; б) туберкулез легких; в) цирроз печени; г) острая фаза ревматизма; д) язвенная болезнь желудка; е) острая пневмония; ж) ожоговая болезнь; з) нефротический синдром; и) хронические энтероколиты; к) злокачественная опухоль?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Определение кальция в сыворотке крови (метод Мойдина и Зака)

Принцип метода. Метод основан на способности органических соединений-комплексонов взаимодействовать с ионами кальция. В качестве комплексона используется трилон Б (ЭДТА, или динатриевая соль этилендиаминтетраацетата). Трилоном Б титруют ионы кальция, предварительно связанные с индикатором-мурексидом. Момент полного связывания кальция с трилоном Б определяется по изменению цвета мурексида (в комплексе с ионами кальция мурексид красно-оранжевого цвета, свободный от кальция мурексид окрашивается в сине-фиолетовый цвет). Комплекс кальция с трилоном Б более прочен, чем комплекс с мурексидом. Зная концентрацию и объем раствора трилона Б, пошедшего на титрование, находят содержание кальция.

Нормальное содержание кальция в сыворотке крови 2,25–2,64 ммоль/л (9–11 мг%). Состояние гипокальциемии наблюдается при авитаминозе D (рахите), у беременных, при недостаточной функции паращитовидной железы, заболеваниях почек, отравлениях фторидами. Гиперкальциемия встречается реже (гиперпаратиреоз, опухоли, деструктивные процессы в костной ткани, лейкозы).

Ход работы.

В два стаканчика (опытная и контрольная пробы) наливают по 5 мл раствора мурексида. В стаканчик для опытной пробы вносят 0,2 мл исследуемой сыворотки крови (раствор становится розовым). Титруют из пипетки или бюретки раствором трилона Б до исчезновения розовой окраски и восстановления фиолетового цвета (сравнивать с окраской контроля).

Расчет. Исходя из того, что 1 мл 0,1 моль/л раствор трилона Б эквивалентен 0,12 мг Ca, рассчитывают содержание кальция в сыворотке крови, в мг%:

X = V  0,12  100,

где V – объем трилона Б, пошедший на титрование опытной пробы, мл.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Лабораторная работа № 2. Титрометрический метод определения "щелочного" запаса крови

Принцип метода. Количество всех оснований цельной крови составляет ее щелочной запас. К цельной крови добавляют для нейтрализации всех оснований заведомо большее количество соляной кислоты. Избыток кислоты оттитровывают щелочью до значения pH (pH = 5,0), равного изоэлектрической точке основных белков крови, которые выпадают в осадок, при этом появляется легкое белесоватое помутнение. Щелочной запас выражается в МЭКВ щелочи, соответствующих количеству связанной основаниями крови соляной кислоты, в перерасчете на 1 л крови.

Ход работы. В стаканчик вносят 10 мл 0,01н раствора соляной кислоты, добавляют 0,2 мл крови, тщательно перемешивают. Прозрачный бурый раствор титруют из пипетки 0,1н раствором NaOH до появления легкого белесоватого помутнения.

Расчет производят по формуле

(1 – а)  0,1  1000

мэкв/л NaOH = ,

0,2

или

(1 – а)  4  100

мг% NaOH = ,

0,2

где 1	–	1 мл 0,1н раствора HCl, взятой для нейтрализации;
а	–	количество щелочи, пошедшей на титрование, мл;
0,1	–	количество мэкв в 1 мл щелочи;
0,2	–	количество крови, мл;
1000	–	коэффициент пересчета на 1 л крови;
4	–	количество NaOH в 1 мл 0,1н раствора, мг.

В норме щелочной запас составляет 100–115 мэкв/л, или 400–460 мг% NaOH.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 438–464; 1998. С. 567–599.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 435–439.

Дополнительная

Агапов Ю. А. Кислотно-щелочной баланс. М.: Медицина, 1968.
Робинсон Дж. Кислотно-щелочное равновесие. М.: Медицина, 1970.
Рут Г. Кислотно-щелочное равновесие и электролитный баланс. М.: Медицина, 1978.
Гомеостаз / Под ред. П. Д. Горизонтова. Медицина, 1980.
Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2. С. 319–325.
Зилва Дж.Ф., Пэнелл П .Р. Клиническая химия в диагностике и лечении. М.: Медицина, 1986.
Руководство по клинической лабораторной диагностике. Т. 3. Клиническая биохимия / Под ред. М. А. Базарновой. Киев, 1991.
Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. И. У. Тица. М.: Медицина, 1986.

Занятие 29

Обмен гемоглобина

Цель занятия: изучить особенности метаболизма железа и основных форменных элементов крови, изучить биохимию гемоглобина в норме и при патологии. Научиться определять в крови содержание гемоглобина и билирубина.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение и свойства олигомерных белков.
Кривые диссоциации оксимиоглобина и оксигемоглобина.
Гликолиз, пентозный цикл, ЦТК.
Перекисные процессы, антиоксидантная защита.
Система гемостаза.

Студент должен знать:

Состав крови.
Строение и функции форменных элементов.
Основные физико-химические константы крови.
Строение и свойства олигомерных белков.
Кривые диссоциации оксимиоглобина и оксигемоглобина.
Метаболизм углеводов.
Перекисные процессы, антиоксидантная защита.

Студент должен уметь:

Работать на колориметре.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Общая характеристика, особенности метаболизма эритроцитов (гликолиз, пентозный цикл, изоцитратдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, трансаминазы и др.). Na/K АТФ-аза, минеральный состав эритроцитов. Глутатион. Строение, функции, ферменты обмена глутатиона. Антиоксидантная защита. Характеристика белков и фосфолипидов мембран эритроцитов.
2. Гемоглобин, строение, свойства, производные, виды Hb. Аномальные Hb. Сравнительная характеристика Hb и миоглобина.
3. Дыхательная функция крови, ее регуляция. Спектры крови гемоглобина и его производных. Гипоксия, аноксия, виды. Нарушение обмена при гипоксии. Регуляция степени сродства Hb к кислороду. Роль 2,3-ДФГК.
4. Обмен хромопротеидов. Переваривание и всасывание. Обмен гемоглобина. Биосинтез гема до порфобилиногена (локализация, ферменты). Распад Hb в клетках РЭС (образование неконъюгированного билирубина). Механизм конъюгации билирубина в печени. Превращение билирубина в кишечнике. Диагностическое значение определения билирубина и продуктов его обмена в крови и моче при различных видах желтух (гемолитической, паренхиматозной, обтурационной).
5. Метаболизм железа. Механизмы всасывания, транспорта и депонирования.
6. Особенности метаболизма лейкоцитов. Биохимические основы фагоцитоза.
7. Особенности метаболизма тромбоцитов.
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторные работы.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Какие из указанных соединений могут превращаться в желчные пигменты:

а) холевая кислота; б) гем; в) триглицериды; г) холестерин; д) фосфолипиды; е) миоглобин; ж) ДНК; з) цитохромы?

2 Производными чего являются порфирины:

а) лизина и пролина; б) аланина и глутамина; в) янтарной кислоты и глицина; г) ацетил-КоА и оксалоацетата; д) глицерина и ЖК; е) карбамоилфосфата и орнитина; ж) нуклеотидов?

3 Уробилиноген не может быть производным от:

а) гемоглобина; б) каталазы; в) флавопротеида; г) цитохрома С; д) пероксидазы; е) хлорофилла; ж) ДНК; з) пиридиннуклеотида?

4 Назовите белки сыворотки крови:

а) фибриноген; б) альбумины; в) криоглобулины; г) глобулины; д) Cреактивный белок; е) проконвертин; ж) проакселерин; з) ЛДГ?

5 Где синтезируется альфа и бета-глобулины:

а) костный мозг; б) селезенка; в) кишечник; г) лимфоузлы; д) печень; е) почки; ж) кишечник; з) мышцы?

6 Предшественниками гема гемоглобина являются:

а) уропорфириноген-III; б) протопорфириноген-IX; в) копропорфириноген-III; г) копропорфириноген-I; д) вердоглобин; е) протопорфирин; ж) биливердин; з) уропорфириноген-I?

7 Порфирия связана с дефицитом активности:

а) фенилаланин-аминолиазы; б) гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы; в) гем-синтетазы; г) ДАЛК-синтетазы; д) энтерокиназы; е) АРС-азы; ж) метилтрансферазы; з) карбамоилфосфатсинтетазы?

8 При биосинтезе порфирина первой стадией является реакция:

а) конденсации двух молекул порфобилиногена; б) конденсации гли и сукцинил-CoA; в) образования протопорфирина; г) конденсации двух молекул ДАЛК; д) образования уропорфириногена-III; е) образования протопорфириногена-IX?

9 Билирубин глюкуронид характеризуется тем, что он:

а) возрастает при неонатальной гипербилирубинемии; б) обычно находится в желчных протоках; в) жирорастворим; г) водорастворим; д) светочувствителен; е) токсичен; ж) не токсичен?

10 При обструкции желчных протоков отмечается:

а) значительное увеличение содержания конъюгированного билирубина в крови; б) снижение содержания конъюгированного билирубина в крови; в) увеличение содержания неконъюгированного билирубина в крови; г) снижение содержания неконъюгированного билирубина в крови; д) низкая экскреция холестерина; е) снижение уровня билирубин-глюкуронида в фекалиях; ж) увеличение уровня билирубин-глюкуронида в фекалиях; з) увеличение содержания липидов в фекалиях; и) снижение содержания липидов в фекалиях?

11 Когда уменьшается содержание железа в крови:

а) железодефицитная анемия; б) уремия; в) маточные кровотечения; г) онкозаболевания; д) диарея; е) рвота?

12 Для какой из желтух характерно повышение конъюгированного билирубина в крови:

а) гемолитическая; б) болезнь Жильбера; в) обтурационная; г) паренхиматозная; д) болезнь Криглера-Найяра; е) болезнь Ротора; ж) болезнь Дубина-Джонса; з) физиологической желтухе?

13 Содержание ферритина в сыворотке крови снижается при:

а) железодефицитных анемиях; б) анемиях беременных; в) воспалительных процессах; г) коллагенозах; д) онкозаболеваниях; е) желтухах?

14 Когда возрастает содержание железа в сыворотке крови:

а) гемохроматоз; б) гемолитическая анемия; в) талассемия; г) гепатит; д) эмфиземе легких; е) онкозаболевания; ж) инфаркт миокарда; з) гиповитаминоз В12?

15 Патологическое действие высоких концентраций билирубина сводится:

а) к активации процесса свертывания крови; б) угнетению процесса свертывания крови; в) разобщению окисления и фосфорилирования; г) повышению проницаемости биологических мембран; д) инициации гемолиза; е) деструкции гепатоцитов; ж) инициации перекисных процессов?

16 Наибольшей токсичностью обладает:

а) неконъюгированный билирубин; б) свободный билирубин, связанный с альбумином; в) конъюгированный билирубин; г) билирубин конъюгированный, связанный с фосфолипидами?

17 Печень здорового человека не пропускает в общий круг кровообращения поступающие из кишечника:

а) мезобилиноген; б) желчные кислоты; в) фосфолипиды; г) триацилглицерины; д) холестерин и его эфиры; е) глюкозу; ж) стеркобилиноген; з) индол?

18 Водорастворимыми и обнаруживаемыми в моче фракциями билирубина и его производных являются:

а) бета-, гамма- и дельта-изомеры свободного билирубина; б) альфа-изомер свободного билирубина; в) глюкурониды билирубина; г) стеркобилиноген; д) мезобилиноген (уробилиноген)?

19 Глюкуронидированию в печени подвергаются:

а) билирубин; б) стероидные гормоны; в) катехоламины; г) холестерин; д) желчные кислоты; е) НЭЖК?

20 Основными органами синтеза порфиринов являются:

а) костный мозг; б) печень; в) почки; г) легкие; д) тонкий кишечник; е) миокард; ж) головной мозг; з) кишечник?

21 Накопление при порфириях уропорфириногена I и копропорфириногена I вызывает:

а) поражение кожи; б) гемолиз эритроцитов; в) увеличение селезенки; г) выделение мочи красного цвета; д) воспалительный процесс в почках; е) остеопороз?

22 Для надпеченочной желтухи характерно повышение:

а) неконъюгированного билирубина в крови; б) конъюгированного билирубина в крови; в) уробилиногена в моче; г) стеркобилиногена в кале; д) желчных пигментов в моче; е) желчных пигментов в крови?

23 Для обтурационной желтухи характерно повышение уровня:

а) общего и свободного билирубина крови; б) стеркобилиногена мочи; в) общего и связанного билирубина крови; г) мезобилиногена в моче; д) общего и связанного билирубина в крови, ахоличном стуле; е) свободного билирубина в крови?

24 Для паренхиматозной желтухи характерно увеличение содержания:

а) общего и свободного билирубина крови; б) стеркобилиногена в моче; в) общего и связанного билирубина в крови; г) уробилиногена в моче; д) общего, связанного билирубина крови; е) свободного билирубина крови; ж) билирубина в моче?

25 При печеночной порфирии наблюдается:

а) повышение чувствительности кожи к свету; б) поражение нервной системы в виде полиневритов; в) поражение мышечной системы; г) желтушная окраска слизистых оболочек и склер; д) зуд кожных покровов?

26 Всасыванию железа в кишечнике способствует:

а) воздействие HCl желудочного сока; б) гастроферрин; в) лактоферрин; г) аскорбиновая кислота; д) танин?

27 Где депонируется железо:

а) в миоглобине; б) в гемоглобине; в) в трансферрине; г) в ферритине; д) в протопорфиринах эритроцитов?

28 При каких состояниях повышается в крови содержание IgG:

а) хронические заболевания печени; б) подострые и хронические инфекции; в) коллагенозы; г) гастроэнтеропатии; д) ожоги (начальная стадия); е) онкозаболевания; ж) паразитарные заболевания; з) ожоги (восстановительная стадия)?

29 Какой белок плазмы крови является транспортной формой железа в организме:

а) транскортин; б) трансферрин; в) ферритин; г) лактоферрин; д) церулоплазмин; е) апоферритин; ж) гаптоглобин; з) гемоглобин?

30 Какой белок плазмы крови специфичен для злокачественных опухолей печени:

а) гаптоглобин; б) церулоплазмин; в) трансферрин; г) 1-фетопротеин; д) 2-макроглобулин; е) антитрипсин; ж) факторы роста; з) проконвертин?

31 При каких заболеваниях увеличивается концентрация общих гликопротеидов в сыворотке крови:

а) туберкулез легких; б) острые неспецифические пневмонии; в) инфаркт миокарда; г) инфекционный гепатит; д) микседема; е) болезнь Иценко-Кушинга; ж) ожоговая болезнь; з) онкозаболевания?

32 Какой из анионов плазмы является доминирующим по своему количественному содержанию:

а) хлорид-ион; б) HCO3-; в) H2PO4-; г) HPO42-; д) протеинат-ион; е) SO42-; ж) нитраты; з) карбонаты?

33 Гипернатриемия обусловливается:

а) резким ограничением введения жидкости (водный голод); б) увеличением введения внутрь или парэнтерально натрия; в) гиперфункцией коры надпочечников; г) синдромом усталости клеток; д) длительным приемом мочегонных средств; е) отравлением солями тяжелых металлов; ж) гипофункцией коры надпочечников?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1. Определение содержания гемоглобина
в крови

Принцип метода. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетон-циангидрином окрашенный комплекс гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина.

Ход работы. Опытная проба: 0,02 мл крови приливают к 5 мл трансформирующего раствора (разведение крови в 251 раз), хорошо перемешивают, оставляют стоять 10 минут, после чего измеряют на колориметре при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы (трансформирующий раствор или вода).

Экстинкцию стандартного раствора измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Расчет содержания гемоглобина (в мг%) производят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида, или по формуле

Hb = (Еоп / Ест)КС  0,01,

где Еоп – экстинкция опытной пробы;

Ест – экстинкция стандартного раствора;

С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, равная 59,75 мг%;

К – коэффициент разведения крови;

0,01 – коэффициент для пересчета мг% в г/л (в СИ).

Содержание гемоглобина в крови по норме: у женщин – 12–14 г% (120–140 г/л); у мужчин – 13–16 г% (130–160 г/л).

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Лабораторная работа № 2. Определение общего билирубина в сыворотке крови (метод Иендрашика и Клеггорна)

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окраски продукта взаимодействия билирубина с диазореактивом малиново-красного цвета. Неконъюгированный билирубин вступает в "непрямую" реакцию с диазосмесью – после диссоциации белкового комплекса, которая достигается прибавлением к сыворотке кофеинового реактива. При этом определяется концентрация "общего" билирубина. По разности концентраций "общего" и "прямого" билирубина определяют содержание "непрямого".

Ход работы. Готовят две пробирки (контрольную и опытную). Составляют реакционную смесь по схеме:

Проба	Сыворотка крови, мл	Кофеиновый реактив, мл	Дистиллир. вода, мл	Диазосмесь, мл
Опытная	1	3,5	–	0,5
Контрольная	–	3,5	1	0,5

Диазосмесь готовят (в количестве, достаточном для всей учебной группы), смешивая 10 мл диазореактива II (0,5 %-го раствора нитрата натрия) с 0,3 мл диазореактивом I (готовится в лаборатории кафедры).

Содержимое опытной и контрольной проб хорошо перемешивают, ставят на 20 мин в темноту, затем колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (длина волны 500–560 нм) против контроля. Если в пробах развивается слабая окраска, то перед колориметрией содержимое обеих пробирок подщелачивают, добавляя в них по 3 капли 30 %-го раствора NaOH. При этом цвет раствора переходит в зеленый, а при большой концентрации билирубина – в синий; часто наблюдается исчезновение мути.

Расчет производят по калибровочному графику.

При оформлении работы в протокол вносят принцип метода, результат колориметрии и расчет. Отмечают пределы колебаний концентрации билирубина в норме.

Клинико-диагностическое значение. Билирубин образуется в организме в результате естественного распада в клетках ретикулоэндотелиальной системы (печень, селезенка) гемоглобина и других гемопротеидов (цитохромы, каталаза и др.). Билирубин относится к группе желчных пигментов, является токсическим веществом и обезвреживается в гепатоцитах. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком. В печени происходит процесс обезвреживания по схеме

УДФ-глюкуроновая кислота

Билирубин  Билирубин-глюкуронид.

глюкуронилтрансфераза

Образующиеся при этом глюкурониды билирубина хорошо растворимы в воде, секретируются в просвет желчного капилляра и выводятся из организма по желчевыводящим путям.

В сыворотке крови содержится две фракции билирубина, вместе составляющие "общий" билирубин:

неконъюгированный (непрямой, токсичный, свободный, водонерастворимый, существует в виде комплекса с альбумином),

конъюгированный (билирубин глюкуронид, прямой, нетоксичный, связанный, водорастворимый).

Содержание билирубина в крови в норме составляет 0,5–1,2 мг% (8,5–20,5 мкмоль/л в единицах СИ), причем 75 % приходится на долю неконъюгированного. Определение его уровня в крови является важным диагностическим тестом. Так, при различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия – увеличение концентрации билирубина до 30–35 мг% (512,5 – 600,0 мкмоль/л) и более.

Дифференциальная диагностика различных видов желтух осуществляется на основании исследования содержания фракций билирубина в крови, а также особенностей клинического течения заболевания и др.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 65–71, 434–436, 458–464; 1998. С. 78–85, 503–508, 585, 591–599.
Строев Е. А. Биологическая химия. М.: Медицина, 1986.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 227–228, 428–437.

Дополнительная

Уайт А. и др. Основы биохимии. Т. 3. М.: Мир, 1981. С. 1218–1301.
Федоров Н. А. Нормальное кроветворение. М.: Медицина, 1975.
Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1. С. 52–62, 356–372.
Зилва Дж. Ф., Пэннел Д. Клиническая химия в диагностике и лечении. М.: Медицина, 1986.
Руководство по клинической лабораторной диагностике. Т. 3. Клиническая биохимия / Под ред. М. А. Базарновой. Киев, 1991.

Занятие 30

Биохимия почек в норме и при патологии

Цель занятия: изучить особенности метаболизма почек и биохимическую основу их основных функций в норме и при патологии. Научиться определять основные физико-химические параметры мочи в норме и при патологии.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение и функции, особенности кровоснабжения почки нефрона.
Механизм образования мочи.
Механизмы действия гормонов – альдостерона, вазопрессина, натрийурического фактора.
Метаболизм и механизм действия витамина D.
Принципы и механизмы регуляции кислотно-основного состояния (КОС).
Метаболизм углеводов, липидов и аминокислот.
Механизмы регуляции уровня глюкозы в крови, глюконеогенез.

Студент должен уметь:

Проводить титрометрический анализ.

Структура занятия

Теоретическая часть

Основные функции почек.
1. Экскреторная функция почек. Строение нефрона, особенности его кровоснабжения. Механизм образования мочи (фильтрация, реабсорбция, секреция). Механизм активного транспорта глюкозы, аминокислот. Нарушение процессов фильтрации, реабсорбции и секреции. Общие свойства мочи в норме и при патологии (суточное количество, цвет, прозрачность, плотность, pH и др.). Органические (мочевина, мочевая кислота, креатинин, креатин, пигменты, аминокислоты, пептиды, гормоны) и неорганические (натрий, калий, кальций, магний, аммиак, хлориды, фосфаты, сульфаты, бикарбонаты) компоненты мочи в норме и при патологии. Патологические компоненты мочи (кровь, белок, сахар, билирубин, аминокислоты).
  1. Клиренс, его определение и диагностическое значение.
2. Гомеостатические (неэкскреторные) функции почек. Роль почек в регуляции:

а) объема циркулирующей крови, внеклеточной жидкости, артериального давления. Ренин-ангиотензиновая система. Вазопрессин. Механизмы действия диуретиков;

б) баланса электролитов. Роль альдостерона в регуляции работы Na/K-АТФазы. Механизмы транспорта H+, Na+, K+, Ca++, Cl-, HCO3-. Почки и метаболизм витамина D. Почечные камни;

в) кислотно-основного состояния. Механизмы ацидогенеза, аммониогенеза;

г) уровня глюкозы в крови. Особенности глюконеогенеза в почках;

д) эритропоэза.

Метаболическая гетерогенность почечной ткани. Особенности углеводного, липидного и белкового обменов в почке. Почка как орган катаболизма биологически активных веществ.
1. Нарушение обмена при острой и хронической почечной недостаточности.
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторная работа.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Определение клиренса характеризует:

а) концентрационную способность почек; б) клубочковую фильтрацию; в) транспорт электролитов; г) канальцевую секрецию; д) кислотно-основное состояние; е) количество функционирующих клубочков; ж) объем циркулирующей крови; з) интенсивность метаболизма почки?

2 Содержание каких компонентов сыворотки крови характеризует нарушение выделительной функции почек:

а) электролитов; б) мочевины; в) креатинина; г) гамма-глобулина; д) “средних” молекул; е) глюкозы; ж) кетоновых тел; з) жирных кислот; и) С-пептида; к) альбумина; л) адреналина; м) гаптоглобина?

3 При каких заболеваниях наблюдается внепочечная ретенционная азотемия:

а) гломерулонефрит; б) почечная недостаточность; в) пиелонефрит; г) нефротический синдром; д) опухоли простаты; е) инфаркт миокарда; ж) тиреотоксикоз; з) атеросклероз; и) гепатит; к) кариес; л) цирроз печени; м) анемия?

4 При каких заболеваниях наблюдается гиперурикемия:

а) острый гломерулонефрит; б) хронический гломерулонефрит; в) лейкемия; г) почечно-каменная болезнь; д) подагра; е) рахит; ж) инфаркт миокарда; з) анемия?

5 В каких случаях наблюдается продукционная азотемия:

а) тяжелые инфекционные заболевания; б) гломерулонефрит; в) почечная недостаточность; г) нефролитиаз; д) злокачественные опухоли; е) инфаркт миокарда?

6 При каких заболеваниях наблюдается абсолютная ретенционная внепочечная азотемия:

а) опухоли мочевого пузыря; б) почечной недостаточности; в) гломерулонефрите; г) острой желтой атрофии печени; д) перитоните; е) пневмонии; ж) перелом костей?

7 Глюкозурия наблюдается при:

а) сахарном диабете; б) почечном диабете; в) стрессовых состояниях; д) гиперинсулинизме; е) синдроме Иценко-Кушинга; ж) почечной недостаточности; з) гломерулонефрите; и) острой атрофии печени; к) перитоните; л) пневмонии?

8 Когда отмечается повышение экскреции катехоламинов с мочой:

а) феохромоцитома; б) бронхиальная астма; в) гипертермия; г) стенокардия покоя; д) гиподинамия; е) гломерулонефрит; ж) почечная недостаточность; з) нефролитиаз; и) злокачественные опухоли; к) инфаркт миокарда?

9 Когда снижается экскреция с мочой 17-кетостероидов:

а) болезнь Аддисона; б) адреногенитальный синдром; в) гиперплазия коры надпочечников; г) опухоли коры надпочечников; д) болезнь Иценко-Кушинга; е) стрессовые состояния; ж) инфаркт миокарда; з) сахарный диабет?

10 Способностью растворяться в воде и выделяться через почечный фильтр с мочой обладают:

а) глюкурониды билирубина; б) -изомер билирубина; в) -изомер билирубина; г) -изомер билирубина; д) -изомер билирубина?

11 При каких заболеваниях (состояниях) отмечается относительная азотемия:

а) холера; б) тяжелые инфекционные заболевания; в) камни мочевых путей; г) гломерулонефрит; д) почечная недостаточность; е) хроническая сердечная недостаточность; ж) глистная инвазия; з) неукротимая рвота?

12 При каких состояниях наблюдается ретенционная почечная азотемия:

а) почечная недостаточность; б) камни мочевыводящих путей; в) нефротический синдром; г) опухоли мочевого пузыря; д) цирроз печени; е) инфаркт миокарда; ж) полиартрит?

13 В каких случаях наблюдается увеличение содержания индикана в крови и моче:

а) начальные стадии развития почечной недостаточности; б) длительные запоры; в) непроходимость кишечника; г) гангрена легких; д) гипертоническая болезнь; е) почечно-каменная болезнь; ж) сахарный диабет; з) дерматит?

14 В каких случаях возникает резко выраженная миоглобинурия:

а) краш-синдром (разможжение тканей); б) тромбоэмболии легочной артерии; в) гипоксия; г) цирроз печени; д) болезнь Аддисона; е) инфаркт миокарда; ж) полиартрит?

15 Какие изменения выявляются при краш-синдроме (длительном раздавливании тканей):

а) снижение диуреза; б) азотемия; в) миоглобинурия; г) увеличение активности в сыворотке крови КФК; д) увеличение активности в сыворотке крови АСТ; е) увеличение активности в сыворотке крови ЛДГ; ж) снижение уровня мочевины?

16 С каким состоянием проводят дифференциальную диагностику миоглобинурий:

а) гемоглобинурия; б) билирубинемия; в) железодефицитная анемия; г) протеинурия; д) азотемия; е) гематурия?

17 Появление миоглобинурии при инфаркте миокарда наблюдается:

а) через 2,5–3 часа; б) через 8 часов; в) на следующие сутки; г) через неделю; д) на 2–3-ю неделю; е) не появляется?

18 В регуляции объема внеклеточной жидкости участвуют системы:

а) ренин-ангиотензин-альдостероновая; б) гипоталамус-вазопрессин; в) гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников; г) калликреин-кининовая; д) симпато-адреналовая; е) гемостаза?

19 Гипоосмолярный синдром обусловлен наличием:

а) гипонатриемии; б) гипоальбуминемии; в) избыточной секреции АДГ; г) гиперсекрецией альдостерона; д) голодании; е) сахарного диабета; ж) гипертиреоза; з) гиперпаратиреоидизма; и) рвоты; к) диареи?

20 Ацидогенез в почках активируется при:

а) алкалозе; б) гиперосмолярности крови; в) гиперхлоремии; г) гиперкапнии; д) гипокалиемии; е) гиперкалиемии; ж) пневмонии; з) рвоте; и) диарее; к) гиперкортицизме?

21 Диуретики тиазидового ряда, действуют путем: а) увеличения выведения хлоридов; б) увеличения выведения бикарбонатов; в) уменьшения выведения бикарбонатов; г) усиления реабсорбции калия; д) увеличения выведения натрия; е) ингибирования реабсорбции натрия; ж) ингибирования реабсорбции хлоридов?

22 Диуретики – ингибиторы карбангидразы могут вызвать развитие метаболического ацидоза вследствие увеличения:

а) выведения хлоридов; б) выведения сульфатов; в) выведения бикарбонатов; г) реабсорбции натрия; д) активности ГНГ; е) реабсорбции калия; ж) выведения натрия; з) реабсорбции хлоридов?

Лабораторная работа. Анализ мочи с помощью тест-полосок корпорации "Байер"

Данные тест-полоски позволяют определить в одной пробе исследуемой мочи 10 показателей: pH мочи, содержание глюкозы, билирубина, уробилиногена, белка, кетоновых тел, нитритов, эритроцитов, лейкоцитов и удельный вес (плотность) мочи.

Реактивы и оборудование: химический стакан, моча, тест-полоска, индикаторная цветная шкала (стандарт), лист белой бумаги, часы с секундной стрелкой.

Ход работы. В сухой чистый химический стакан набирают свежую (находящуюся при комнатной температуре не более одного часа после сбора пробы), хорошо перемешанную нецентрифугированную мочу. Затем быстро опускают в него тест-полоску таким образом, чтобы все реагентные зоны были полностью погружены в мочу. Через 2 с тест-полоску вынимают, удаляя избыток мочи путем соприкосновения полоски с краем стакана и протягиванием ее в таком положении снизу вверх под углом приблизительно 45 градусов.

Примечание – не прикасаться к аналитической зоне тест-полоски руками и не допускать попадания на нее прямых солнечных лучей, влаги и т. п.

Затем помещают тест-полоску на лист белой бумаги в горизонтальное положение и визуально сравнивают цвет реагентных зон на тест-полоске с цветной шкалой стандарта.

Временные границы полуколичественного анализа мочи с помощью тест-полосок

Показатель

Время определения, c

Содержание глюкозы

” билирубина

” кетоновых тел

Удельный вес (плотность)

Содержание белка

” эритроцитов

” уробилиногена

” нитритов

” лейкоцитов

До 60

” 60

120

Примечание – Возможное изменение окраски реагентных зон, происходящие после 2 мин от начала анализа, не имеет диагностического значения.

Качественный результат тестирования по всем параметрам тест-полоски, за исключением содержания лейкоцитов, можно получить через 1–2 мин. Для получения полуколичественного результата анализа следует точно соблюдать время по каждому параметру.

Можно провести исследование пригодных для тестирования полосок при помощи анализатора мочи "КЛИНИТЕК" (в случае наличия такового), строго соблюдая инструкцию по эксплуатации данного прибора (количественный анализ).

Определение индивидуальных показателей

Вначале целесообразно определить цвет, прозрачность и запах мочи.

1 Определение pH мочи

Принцип метода. Реагентная зона содержит 2 индикатора кислотности, которые способны изменять свою окраску при определенной pH среды: 0,2 % метилового красного; 2,8 % бромтимолового синего и 97 % нереактивных элементов. Диапазон чувствительности лежит в пределах pH = 5,0 … 8,5.

Метиловый красный – основной индикатор [интервал pH перехода окраски красной (более кислая среда) в желтую (более основная среда) – 4,2–6,3]:

Бромтимоловый голубой – кислый индикатор [интервал pH перехода окраски желтой (более кислая среда) в синюю (более основная среда) – 6,0–7,6]:

Клинико-диагностическое значение. В норме кислотность мочи зависит от пищи. При обычной диете она имеет слабокислую реакцию (pH = 5 … 7). Это обусловлено тем, что в процессе обмена образуются преимущественно кислые вещества (нелетучих кислот), удаление которых происходит через почки. Причем для сохранения щелочного резерва плазмы крови (NaHCO3) в основном выделяются эпителием канальцев более кислые соли (NaH2PO4, KH2PO4, NH4Cl и т. п.) и кислоты (H2CO3, молочная, ацетоуксусная, гидроксимасляная). Обычно за сутки с мочой выделяется от 40 до 75 мэкв кислот. При преобладании в рационе мясной пищи реакция мочи сдвигается в кислую сторону, при преобладании растительной (овощная диета) или приема соды, щелочных минеральных вод – в щелочную. В щелочной моче преобладают Na2HPO4, K2HPO4, NaHCO3, KHCO3.

Реакция мочи изменяется при патологических состояниях. Кислая моча отмечается при голодании, сахарном диабете (в основном за счет кетоацидоза), лихорадочных состояниях, подагре (гиперурикурия). Щелочная моча бывает при рвоте (потеря Н+ с содержимым желудка), приеме некоторых препаратов (питьевая сода и т. п.), воспалении мочевого пузыря (цистит), пиелите, что связано с повышением уреазной активности патологической микрофлоры:

Карбамидамидогидролаза

СО(NН2)2 + Н2О	СО2 + 2NН3
Мочевина	Уреаза, КФ 3.5.1.5	Защелачивание мочи

2 Определение содержания глюкозы в моче

Принцип метода. Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4) окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода.

Перекись водорода при участии фермента пероксидазы тут же реагирует с иодидом калия, вызывая коричневое окрашивание:

2KJ + H2O2  J2 + KOH.

Состав реагентной зоны: глюкозооксидаза – 2,2 %; пероксидаза хрена – 1,0 % (сопряженные ферментные системы); иодид калия (хромоген) – 8,1 %; буфер (для создания оптимума pH действия ферментов) – 69,8 %; нереактивные элементы – 18,9 %. Границы чувствительности, т. е. минимально определяемая концентрация – 75–125 мг/дл (4–7 ммоль/л). Физиологические концентрации не учитываются – проба отрицательна. Положительна при концентрации глюкозы в моче выше 5,5 ммоль/л. Цвет реагентной зоны изменяется от зеленого до коричневого. Диапазон чувствительности: 5,5 – больше или равен 111 ммоль/л, 1 – больше или равен 20 г/л.

Примечание – При высокой концентрации в моче глюкозы окрашивание реагентной зоны может быть неравномерным. В этом случае оценку следует проводить по наиболее темному тону. Чувствительность реакции снижается при увеличении удельного веса мочи и может зависеть от колебания температуры. Высокая концентрация аскорбиновой кислоты (и других восстанавливающих веществ) и/или кетоновых тел при низкой концентрации глюкозы может привести к неправильному (ложноотрицательному) результату, а присутствие производных фенолфталеина и сульфофталеина – к ложноположительному.

Клинико-диагностическое значение. В моче здорового человека глюкоза присутствует в виде следов (не более 0,4 г/л) и не определяется обычными химическими реакциями, так как она практически полностью реабсорбируется в проксимальных канальцах нефронов. В этом процессе принимают участие ферменты Е1 гексокиназа (глюкокиназа) и E2 щелочная фосфатаза:

Повышение концентрации глюкозы в моче – глюкозурия. Различают 2 группы глюкозурий: гипергликемические и нормогликемические. В случае гипергликемических глюкозурий увеличение содержания глюкозы в моче связано с повышением ее концентрации в плазме крови. Почечный порог для глюкозы составляет приблизительно 9,9 ммоль/л. Среди гипергликемических глюкозурий выделяют физиологические и патологические.

Физиологические:

Алиментарная – при приеме пищи, богатой углеводами.
Эмоциональная – при психоэмоциональном напряжении (связана в основном с повышенной стимуляцией адреналином мобилизации гликогена печени, а также с инициацией кортикостероидами процессов глюконеогенеза).
При воздействии некоторых лекарственных препаратов: преднизолона, кофеина (повышение концентрации внутриклеточной цАМФ приводит к активации каскадного механизма мобилизации гликогена).

Патологические:

Нарушения эндокринной регуляции углеводного обмена – сахарный диабет, синдром Иценко-Кушинга (увеличение концентрации глюкокортикоидов и, как следствие, усиление глюконеогенеза – стероидный диабет), акромегалия (интенсификация контринсулярных эффектов соматотропного гормона), феохромоцитома (избыточная продукция катехоламинов), тиреотоксикоз (гиперфункция тиреоидных гормонов).
Поражения центральной нервной системы – инсульты, травмы, опухоли головного мозга, энцефалиты.
Недостаточность продукции инсулина поджелудочной железой (опухоль, операция, панкреатит).
Болезни печени – гепатиты, цирроз, гемохроматоз.
Заболевания сердечно-сосудистой системы – гипертонический криз, инфаркт миокарда.
Интоксикации – воспаление легких, инфекции, диспепсии новорожденных, ожоги, отморожения, наркоз, лечение глюкокортикоидами и адренокортикотропином.

Нормогликемическая глюкозурия связана в основном с нарушением реабсорбции глюкозы в почечных канальцах. Причины:

Интоксикации ртутью, угарным газом, стрихнином, хлороформом, эфиром, морфином, флоридзином, кодеином, снотворными препаратами (например, барбитуратами), алкоголем (в последних случаях эффект связан с гипервосстановленностью пиридиновых коферментов).
Гломерулонефрит, хронический пилонефрит, нефросклероз, диабетический гломерулосклероз, врожденные тубулопатии (синдром Фанкони); беременность; почечный диабет (наследственная патология, связанная с генетически обусловленным изменением активности ферментов реабсорбции глюкозы в почечных канальцах).
Патологические процессы самой почечной ткани – хронический нефрит с проявлением нефротического синдрома при острой почечной недостаточности, вторичный почечный диабет.

3 Определение содержания билирубина в моче

Принцип метода. Диазониевая соль 2,4-дихлоранилина образует с билирубином азобилирубин – комплекс, окрашенный в лиловый цвет.

Состав реагентной зоны: 0,4 % диазониевой соли 2,4-дихлоранилина; 37,3 % – буфер; 62,3 % – нереактивные элементы. Границы чувствительности – 0,4–0,8 мг/дл (7–14 мкмоль/л).

Примечание – большое количество аскорбиновой кислоты в моче может привести к неправильному негативному результату.

Клинико-диагностическое значение. В норме моча содержит минимальные количества билирубина, не выявляемые обычными качественными пробами. Моча, содержащая желчные пигменты, будет иметь желтовато-коричневый или зеленый цвет. Незначительная билирубинурия (в виде щелочных солей) указывает на раннюю стадию заболевания печени. Значительное увеличение билирубина в моче связано с обтурационными желтухами ( например, закупорке желчного протока), а также с прогрессирующими паренхиматозными желтухами. Увеличение идет в основном за счет прямого билирубина. Непрямой билирубин появляется в моче при значительных поражениях почек.

4 Определение уробилиногена в моче

Принцип метода. Уробилиноген при взаимодействии с пара-диметиламинобензальдегидом образует комплексное соединение розового цвета – уробилиногенальдегид.

Состав реагентной зоны: 0,2 % пара-диметиламинобензальдегида; 99,8 % – нереактивные элементы.

Границы чувствительности – 0,2 мг/дл (3,2 мкмоль/л). Диапазон чувствительности: 0,2–8 мг/дл (3,2–131 мкмоль/л).

Примечание – Ложный позитивный результат может быть вызван реакцией с аминосалициловой кислотой и сульфанил-мочевиной; ложное окрашивание наблюдается и в присутствии бензойной кислоты. Ложный негативный результат может быть вызван формалином. Реактивность теста увеличивается с повышением температуры. Оптимум температуры 22 … 26 °C.

Клинико-диагностическое значение. У здоровых людей концентрация уробилиногена в моче составляет от 0,2 до 1,8 мг/дл. С 2 мг/дл начинается область патологии.

Уробилиноидурия наблюдается при:

паренхиматозных заболеваниях печени (гепатиты, циррозы, отравления, лихорадочные состояния, сопровождающиеся токсическим поражением печени) вследствие потери печенью способности задерживать и разрушать уробилиноген, всосавшийся из кишечника;
гемолитических состояниях (гемолитическая желтуха, гемоглобинурия, рассасывание больших кровоизлияний, обширные инфаркты миокарда) из-за избыточного поступления билирубина во внепеченочные желчные пути и кишечник, где он восстанавливается бактериями в уробилиноген, который всасывается в тонком кишечнике и через venus portae попадает в печень, где в норме разрушается до три- и дипирролов (пропент-диопента и мезобилилейкана);
кишечных заболеваниях, связанных с усиленной реабсорбцией желчных пигментов слизистой оболочкой кишечника (энтероколиты, запоры).

Отсутствие в моче уробилиногена при повышенном содержании билирубина указывает на обтурационную желтуху.

5 Определение содержания белка в моче

Принцип метода. При взаимодействии альбумина с бромфеноловым голубым образуется комплекс зелено-голубого цвета, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна содержанию альбумина.

Состав реагентной зоны: 0,3 % тетрабромфенолового голубого; 97,3 % – буфера; 2,4 % – нереактивных элементов.

Границы чувствительности – 15–30 мг/дл.

Диапазон чувствительности – 30 и больше или равно 2000 мг/дл (0,30 –больше или равно 20 г/л).

Примечание – Данный тест характеризует в основном содержание в моче альбумина. Глобулин, тела Бенс-Джонса, микропротеины выявляются слабее. Негативный результат наличия белка не исключает его присутствия. Сильно щелочная моча или растворение в моче антисептиков и средств дезинфекции, например хлоргексидина, может вызвать неправильный позитивный результат.

Клинико-диагностическое значение: В нормальной моче содержатся лишь следы белка (представлен главным образом уромукоидом – продуктом функционирования почечной ткани), не выявляющиеся обычными химическими методами. Появление белка в моче – протеинурия – свидетельствует о нарушении баланса между процессами его фильтрации и реабсорбции.

Виды протеинурий: преренальная, ренальная (клубочковая и канальцевая), постренальная, смешанная.

Причины протеинурий:

Преренальной: повышенное артериальное давление, сердечная декомпенсация; функциональные протеинурии, обусловленные:

а) усиленным распадом белков тканей при физической нагрузке, психо-эмоциональном напряжении, стрессорном состоянии;

б) повышенным гемодиализом, связанным с увеличением активности ренина в плазме.

Ренальной клубочковой (гломерулярной): усиление проницаемости базальной мембраны почечного фильтра (из-за уменьшения содержания в ней сиалогликопротеинов при врожденном нефротическом синдроме и при атаке протеазами нейтрофилов; из-за снижения отрицательного заряда на мембране, например, при сахарном диабете). Гломерулярная протеинурия встречается и при других патологических состояниях, сопровождающихся поражением почек: токсикозе беременных, амилоидозе, инфекционных и злокачественных заболеваниях, гломерулонефрите, нефропатиях.
Ренальной канальцевой (тубулярной) – тубулярные и интерстициальные нефропатии, нефрозы (нарушение реабсорбции – энергозависимого процесса, происходящего путем эндоцитоза белка с образованием эндосом, сливающихся с лизосомами, где идет протеолиз, и образовавшиеся аминокислоты через базальную мембрану тубулоцитов возвращаются в кровоток).
Смешанной ренальной – хронический пиелонефрит, диффузный абактериальный интерстициальный нефрит, хроническая почечная недостаточность при хроническом гломерулонефрите.
Постренальной (вызванной патологией мочевыводящих путей) – воспалительная экссудация, когда в мочу попадают слизь, кровь, гной из мочевыводящих путей.

6 Определение содержания кетоновых тел в моче

Принцип метода. Кетоновые тела образуют с нитропруссидом натрия комплексные соединения оранжево-красного (щелочная среда) и вишневого (при подкислении) цвета:

Состав реагентной зоны: 7,1 % – нитропруссида натрия; 92,9 % – буфера (ацетатного).

Граница чувствительности – 5–10 мг/дл (0,5–1,0 ммоль/л). Диапазон чувствительности – 0,05–1,6 г/л (0,5–16 ммоль/л).

Примечание – Неправильный позитивный результат может возникнуть в сильнопигментированных пробах мочи или при наличии L-дофа-продуктов обмена в моче.

Клинико-диагностическое значение. Кетоновые тела в нормальной моче встречаются в самых ничтожных количествах. Появление небольшой концентрации кетонов в моче может быть вызвано физическими нагрузками, голоданием, недостаточным углеводным питанием (кетогенная диета), во время беременности или при занятии профессиональным спортом. Часто кетоны можно определить в моче до того, как повысится их концентрация в сыворотке крови (из-за действия физико-химических и физиологических механизмов коррекции нарушений кислотно-основного состояния) – ранняя диагностика. Значительная кетонурия наблюдается при сахарном диабете (недостаточность потребления глюкозы тканями приводит к активации альтернативных энергопродуцирующих метаболических путей: липолиза, бета-окисления жирных кислот; и синтеза других транспортных форм субстратов энергообмена – кетоновых тел); увеличении концентрации контринсулярных гормонов (акромегалия, стероидный диабет и т. п.); тиреотоксикозе (повышение расхода углеводов); подпаутинных кровоизлияниях в мозг; черепно-мозговых травмах; возбуждении ЦНС; болезни Гирке. В раннем детском возрасте продолжительные заболевания желудочно-кишечного тракта (дизентерия, токсикоз) могут привести к кетонурии в результате голодания и истощения.

7 Определение содержания нитритов в моче

Принцип метода и клинико-диагностическое значение. Принцип тестирования основан на том, что при патологии мочевыводящих путей находящиеся в них бактерии (граммотрицательные микробы) превращают нитраты мочи в нитриты. Розовые пятна или уголки не стоит воспринимать как позитивный результат. Если же возникает легкое окрашивание всей реагентной зоны в розовый цвет, то это указывает на существование характерных бактерий (более 106 микробов/мл). Интенсивность окрашивания не пропорциональна количеству бактерий, и негативный результат не является показателем полного отсутствия бактерий.

Состав реагентной зоны: 1,4 % пара-арсаниловой кислоты; 1,3 % 1,2,3,4-тетрагидробензохинолин-3-ола; 10,8 % буфера; 86,5 % нереактивных элементов.

Границы чувствительности – 0,06–0,10 мг/дл (13–22 мкмоль/л) NO2-.

Примечание – Ложный негативный результат может возникнуть если: 1) время нахождения мочи в мочевом пузыре менее 4 часов (поэтому для анализа рекомендуется брать утреннюю мочу, т. к. чем больше время нахождения мочи в мочевом пузыре, тем точнее результат анализа); 2) возбудитель инфекции мочевыводящих путей действует непроизводительно; 3) в силу особенностей питания в моче мало нитратов. Ложнонегативный результат также может быть при высоких концентрациях в моче аскорбиновой кислоты и одновременном низком содержании нитритов.

8 Определение содержания эритроцитов в моче

Принцип метода. Основан на том, что гемоглобин эритроцитов, обладая пероксидазной активностью, разлагает диизопропиленбензона дигидропероксид с выделением атомарного кислорода, который окисляет 3,5,3',5'-тетраметилбензидин в соединение зеленого цвета:

Состав реагентной зоны: 6,8 % диизопропиленбензона дигидропероксида, 4 % – 3,5,3',5'-тетраметилбензидина, 48 % – буфера; 41,2 % – нереактивных элементов.

Границы чувствительности – 0,015–0,062 мг/дл Hb.

Диапазон чувствительности – 10–200 эритроцитов/мкл.

Для свободного гемоглобина реагентная зона окрашивается равномерно в зеленый цвет. Целые (неповрежденные) эритроциты появляются на реагентной зоне в виде зеленых точек.

Примечание – Повышенный удельный вес или повышенная концентрация белка может снизить реактивность теста.

Клинико-диагностическое значение: В норме кровь в моче отсутствует. Появление крови с форменными элементами в моче – гематурия; появление в моче кровяных пигментов (гемоглобина и метгемоглобина) – гемоглобинурия. При гематурии моча непрозрачна, имеет красноватый оттенок; при гемоглобинурии моча чаще окрашена в кофейно-бурый цвет. В случае гематурии и гемоглобинурии в моче содержится белок. Гематурии подразделяются на почечные и внепочечные. Почечная гематурия – основной симптом острого нефрита (сопровождается гемоглобинурией). Внепочечные гематурии связаны с воспалительными процессами и травмами мочевых путей (мочевые камни, рак мочевого пузыря, цистит). Гемоглобинурия отмечается при отравлении гемолитическими ядами, тяжелых инфекциях, ожогах, при которых происходит разрушение (гемолиз и связанная с ним гемоглобинемия) эритроцитов.

9 Определение содержания лейкоцитов в моче

Принцип метода. Переход окраски индикаторной зоны от бежевой через серую к сиреневой и далее фиолетовой свидетельствует о пропорциональном увеличении числа лейкоцитов в моче, соответствующим шкале [15 (следы) – 70 – 125 – 500 лейкоцитов/мкл].

Состав реагентной зоны: 0,4 % производного пиррола аминокислотного; 0,2 % соли диазония; 40,9 % буфера; 58,5 % нереактивных элементов.

Границы чувствительности – 5–15 лейкоцитов/поле.

Диапазон чувствительности – 15–500 лейкоцитов/мкл.

Примечание – Повышенная концентрация глюкозы, щавелевой кислоты, медикаментов (цефалексин, цефалотин, тетрациклин) приводит к ослаблению реакции. Сильно окрашенные пробы мочи могут повлиять на цвет реагентной зоны. Иногда у пациентов женского пола позитивный результат может быть вызван примесями вагинальных выделений в моче.

Клинико-диагностическое значение. В норме моча не содержит лейкоцитов (до 10 в одном микролитре). Лейкоциты мочи представлены главным образом нейтрофилами, но могут быть обнаружены эозинофилы и лимфоциты. Увеличение числа лейкоцитов в моче (лейкоцитурия) до очень больших количеств (пиурия) свидетельствует о воспалительных процессах в почках и мочевыводящих путях (туберкулез почки, пиелиты, циститы, пиелонефриты).

10 Определение плотности мочи

Принцип метода. Тест основан на pKs (показатель эмпирической константы высаливания) – изменении различных электролитов в зависимости от концентрации (определяющей ионную силу) ионов в моче.

Состав реагентной зоны: 2,8 % бромотимолового голубого; 97,2 % поли-(метил-, винил-, эфир-малеиновой кислоты натриевая соль).

Диапазон чувствительности – 1,000–1,030 г/л. Изменение окраски от сине-зеленой через морскую, зеленую, защитную, травяную, хаки до охристой.

Примечание – При уровне pH мочи выше 6,5 результат увеличивается на 0,005. Повышенное значение плотности может быть вызвано присутствием небольшого количества (1–7,5 г/л) белка в моче.

Клинико-диагностическое значение: Плотность мочи в норме колеблется в широких пределах (1,002–1,035 г/л). Она зависит от количества растворенных в ней веществ и количества выделяемой мочи, с одной стороны, и от соотношения количества жидкости, поступившей в организм и выведенной из организма внепочечными путями (потоотделение, диарея и т. п.) – с другой.

Плотность мочи дает представление о приблизительном количестве о растворенных в ней веществ. Ориентировочно расчет плотного остатка (в г/л) получают, умножив 2 последние цифры (сотые и тысячные доли единицы) относительной плотности на коэффициент 2,6. В норме с мочой выделяется 50–75 г/сут плотных веществ. (В норме чем больше объем выделяемой мочи, тем меньше ее плотность и наоборот).

Изостенурия – выделение мочи с постоянной плотностью, равной плотности первичной мочи (1,010 г/л) – свидетельствует о почечной недостаточности. Постоянно низкое значение плотности мочи – гипоизостенурия – указывает на нарушения концентрационной функции почек (хронический нефрит, первично или вторично сморщенная почка). При несахарном диабете резко снижается плотность мочи, что связано с нарушением обратной реабсорбции воды.

При лихорадочных состояниях, общем венозном застое отмечается увеличение плотности и уменьшение объема выделяемой мочи. Сахарный диабет приводит к несоответствию между количеством мочи (наблюдается полиурия) и ее плотностью, повышенной из-за присутствия больших концентраций глюкозы и кетоновых тел.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ. Оформление результатов исследования проводится по следующей форме:

Клинический анализ мочи.

Ф. И. О. исследуемого ________________________ Пол______ Дата анализа____________

Показатель	Результат анализа	Вывод
	качественного	(полу) количественного
Цвет	Оценка цвета	Насыщенность	В данной графе результат анализа сравнивается с нормальными величинами, и в случае несоответствия норме на основе клинико-диагностического значения дается предварительная оценка возможных причин патологии
Прозрачность	Оценка прозрачности	Степень прозрачности
Запах	Наличие / отсутствие	Характер запаха
Плотность	-	г/л
Реакция мочи	Кисл./нейтр./осн.	pH
Содержание глюкозы	+, –	Здесь указываются конкретные величины содержания вещества в случае положительной пробы и нижняя граница чувствительности в случае отрицательной пробы
Содержание белка	+, –
Содержание билирубина	+,–
Содержание уробилиногена	Норма или выше нормы
Содержание кетоновых тел	+, –
Содержание нитритов	+, –
Содержание эритроцитов (Hb)	+, –
Содержание лейкоцитов	+, –

Общий вывод. Делается запись об освоении данного метода анализа и предположительный диагноз, поставленный на основе полученных результатов анализа мочи.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 473–487; 1998. С. 608–624.
Николаев А. Я. Биохимия. М.: Высшая школа, 1989. С. 358–368.

Дополнительная

Уайт А. и др. Основы биохимии. Т. 3. М.: Мир, 1981.
Наточин Ю. В. Основы физиологии почки. Л.: Медицина, 1982.
Почки и гомеостаз в норме и при патологии. М.: Медицина, 1987.

Занятие 31

Биохимия печени. Обмен ксенобиотиков

Цель занятия: изучить особенности метаболизма печени и биохимическую основу ее основных функций в норме и при патологии. Научиться определять активность щелочной фосфатазы сыворотки (плазмы) крови.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Клеточный состав печени, строение и функции гепатоцита.
Особенности кровоснабжения печени и печеночной балки.
Функциональная гетерогенность гепатоцитов.
Метаболизм и механизм действия витаминов и гормонов.
Метаболизм углеводов, липидов и аминокислот.
Механизмы регуляции уровня глюкозы в крови.
Микросомальное окисление.
Механизмы регуляции гемостаза.
Принципы энзимодиагностики.

Студент должен уметь:

Работать на колориметре.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Общая характеристика печени как органа гомеостаза. Клеточный состав печени. Метаболическая гетерогенность гепатоцитов.
2. Роль печени в углеводном обмене (синтез и распад гликогена, глюконеогенез), функциональные пробы, характеризующие роль печени в углеводном обмене (сахарная кривая, нагрузка глюкозой, фруктозой, галактозой).
3. Роль печени в липидном обмене (переваривание и всасывание, синтез ТГ, ФЛ, ХС, ЛП, кетоновых тел). Состав и функции желчи. Печеночные камни, их состав и механизм образования. Функциональные пробы, характеризующие роль печени в липидном обмене (липидный спектр, содержание общих липидов, ТГ, ХС, ФЛ, кетоновых тел).
4. Роль печени в азотистом обмене (синтез белков плазмы, регуляция пула аминокислот, синтез мочевины, обмен билирубина). Механизм развития печеночной комы. Функциональные пробы, характеризующие роль печени в азотистом обмене (электрофореграммы белков плазмы крови, содержание свободных аминокислот, пробы на гемокоагуляцию – протромбиновый индекс и др., аммиак, мочевину, билирубин).
5. Роль печени в гормональном гомеостазе – метаболизм гормонов в печени. Функциональные пробы, характеризующие роль печени в развитии вторичного гиперальдостеронизма.
6. Основные пути метаболизма ксенобиотиков:

а) транспорт в крови и через мембраны;

б) гидроксилирование и микросомальная ДЦ и др. реакции;

в) конъюгация (роль ФАФС, УДФГК, АМ, ацетил КоА и др.).

Пробы на детоксикацию (амидопириновая и др.).
1. Энзимодиагностика заболеваний печени:

а) гепатоцеллюлярных – альдолаза, ЛДГ, АСТ, АЛТ, ГДГ;

б) холестатических – ЩФ, 5-нуклеотидаза, холинэстераза, ГГТП, ЛАП.

Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторная работа.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 При каких заболеваниях отмечается повышение тимоловой пробы:

а) острый ревматизм; б) хронический гепатит в стадии обострения; в) хронический гепатит вне стадии обострения; г) желчно-каменная болезнь; д) цирроз печени; е) хронический гастрит; ж) инфаркт миокарда; з) острая пневмония?

2 При каких заболеваниях наблюдается снижение уровня мочевины в крови:

а) острая желтая атрофия печени; б) подагра; в) обтурационная кишечная непроходимость; г) гемолитическая желтуха; д) брюшной тиф; е) гломерулонефрит; ж) гипертоническая болезнь?

3 Какие биохимические параметры характеризуют воспалительный процесс при заболеваниях печени:

а) белковые фракции;	д) содержание мочевины;
б) активность трансаминаз;	е) содержание электролитов;
в) тимоловая проба;	ж) содержание билирубина?
г) содержание холестерина;

4 Активность щелочной фосфатазы сыворотки крови повышается при:

а) рахите; б) остеомаляции; в) остеопорозе; г) мышечной дистрофии; д) панкреатите; е) раке простаты; ж) регенерации кости; з) инфаркте миокарда?

5 Активность кислой фосфатазы сыворотки крови повышается при:

а) остеосаркомах; б) инфаркте миокарда; в) лейкозах; г) язвенной болезни желудка; д) костном туберкулезе; е) пневмонии; е) раке простаты; з) переломах кости?

6 Активность АЛТ сыворотки крови повышается при:

а) механической желтухе; б) холангите; в) остром гепатите; г) инфаркте миокарда; д) мышечной дистрофии; е) рахите; ж) пневмонии; з) панкреатите; и) раке печени; к) язве желудка?

7 При каких заболеваниях возрастает активность фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы сыворотки крови:

а) острый гепатит; б) мышечная дистрофия; в) дерматомикоз; г) инфаркт миокарда; д) острые респираторные инфекции; е) пневмония; ж) атеросклероз; з) ларингит; и) холангит; к) пиелонефрит?

8 Активность фруктозо-1-фосфатальдолазы сыворотки крови повышается при:

а) гемолитической анемии; б) функциональной гипербилирубинемии; в) циррозе печени (неактивная фаза); г) вирусном гепатите; в) циррозе печени (активная фаза); д) уремии?

9 Какие тесты характеризуют антиоксидантную систему организма:

а) уровень -токоферола; б) уровень C-реактивного белка; в) уровень гамма-глобулинов; г) уровень общих липидов; д) уровень церулоплазмина; е) активность АЛТ; ж) активность АСТ?

10 Основными антиоксидантами организма являются:

а) -токоферол; б) убихиноны; в) витамин K; г) холестерин; д) НЭЖК; е) аскорбат; ж) ионы Са++; з) витамин А; и) стеркобилиноген; к) гамма-глобулины?

11 Ферментами, ингибирующими процесс ПОЛ являются:

а) липоксигеназа; б) ксантиноксидаза; в) NADРH-зависимая микросомальная диоксигеназа; г) супероксиддисмутаза; д) глутатионпероксидаза; е) каталаза?

12 Для надпеченочных желтух характерно увеличение в плазме крови:

а) уровня неконъюгированного билирубина;

б) уровня билирубин-глюкуронидов;

в) уровня желчных кислот; г) активности трансаминаз; д) уровня липидов; е) уровня лактата?

13 Для печеночной желтухи характерно повышение уровня:

а) неконъюгированного билирубина;	д) стеркобилиногена в кале;
б) билирубин-глюкуронидов;	е) стеркобилиногена в крови;
в) уробилиногена в моче;	ж) желчных кислот в моче?
г) уробилиногена в крови;

14 Какой из синдромов поражения печени характеризуется одновременным увеличением активности щелочной фосфатазы и гамма-глутамилтранспептидазы, повышением уровня холестерина, ЛПОНП, ЛПНП и общего билирубина:

а) цитолиза;	г) печеночно-клеточной недостаточности;
б) холестаза;	д) тотальной печеночной недостаточности?
в) воспалительный;

15 Какой из синдромов поражения печени характеризуется увеличением активности АЛТ, фруктозо-1 фосфатальдолазы, ЛДГ и содержания билирубина:

а) цитолиза;	г) печеночно-клеточной недостаточности;
б) холестаза;	д) тотальной печеночной недостаточности?
в) воспалительный;

16 Какой из синдромов патологии печени характеризуется уменьшением активности холинэстеразы, содержания холестерина, протромбина и увеличением концентрации билирубина:

а) цитолиза;	г) печеночно-клеточной недостаточности;
б) холестаза;	д) тотальной печеночной недостаточности?
в) воспалительный;

17 Какой из синдромов патологии печени характеризуется положительной тимоловой пробой, умеренной гиперпротеинемией, гиперглобулинемией, увеличением уровня фибриногена:

а) цитолиза;	г) печеночно-клеточной недостаточности;
б) холестаза;	д) тотальной печеночной недостаточности?
в) воспалительный;

18 Где синтезируется альфа-глобулины и белки гемостаза:

а) костный мозг; б) селезенка; в) кишечник; г) лимфоузлы; д) печень; е) тимус?

19 Где синтезируются часть бета- и гамма-глобулины:

а) костный мозг; б) селезенка; в) кишечник; г) лимфоузлы; д) печень; е) тимус?

20 При каких состояниях увеличивается активность гамма-глутамилтранспептидазы:

а) гемолиз; б) обтурация желчевыводящих путей; в) отравление барбитуратами; г) острые инфекции; д) хронический гастрит; е) реактивные гепатиты алкоголиков; ж) язвенная болезнь желудка?

21 Активность холинэстеразы крови понижается при:

а) хронических гепатитах; б) циррозе печени; в) вирусном гепатите; г) остром панкреатите; д) механической желтухе; е) инфаркте миокарда?

22 При патологии каких органов наблюдается снижение уровня факторов свертывающей системы крови:

а) заболевания почек; б) болезни печени; в) заболевания легких; г) болезни суставов; д) болезни поджелудочной железы; е) диарея; ж) сердечная недостаточность?

23 При каких заболеваниях становится положительным показатель тимоловой пробы:

а) паренхиматозный гепатит;	д) острая пневмония;
б) острая желтая атрофия печени;	е) острые вирусные инфекции;
в) острый панкреатит;	ж) инфаркт миокарда;
г) гемолитическая анемия;	з) желтушный цирроз печени?

24 Какие изменения характерными для печеночной комы:

а) гипопротеинемия; б) повышение уровня аммиака в крови; в) нарушение синтеза мочевины; г) увеличение количества альбумина; д) уменьшение количества альбумина; е) повышение уровня фибриногена; ж) гипергликемия; з) гипогликемия?

25 Синдром холестаза характеризуют такие показатели, как:

а) активность трансаминаз; б) активность холинэстеразы; в) активность щелочной фосфатазы; г) уровень билирубина; д) уровень общего белка; е) активность кислой фосфатазы; ж) активность лейцинаминопептидазы (ЛАП); з) билирубин мочи; и) активность гаммаглутамилтранспептидазы (ГГТП)?

Лабораторная работа Определение активности щелочной фосфатазы сыворотки крови

Принцип метода: щелочная фосфатаза расщепляет в глициновом буфере п-нитрофенилфосфат с образованием п-нитрофенола и фосфата. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного п-нитрофенола.

Ход работы.

Вносят реагенты в пробирки согласно таблице.

Отмерить	Опытная проба	Контрольный раствор
Рабочий реагент	1,00	1,00
Нагревать при температуре 37C в течение 5 минут
Сыворотка или плазма	0,02	-
Тщательно перемешать и инкубировать при температуре 37C в течение 15 минут
Раствор ингибитора	5,00	5,00
Сыворотка или плазма	-	0,02

Тщательно перемешать и измерить величину экстинкции опытной пробы против контрольной пробы на фотоэлектроколориметре в интервале длин волн 400-420 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Окраска раствора устойчива в течение 30 минут.

Расчет активности ЩФ произвести по калибровочному графику.

Клинико-диагностическое значение.

Нормальные величины для взрослых: 30-90 Ед/л (0,5-1,5 мккат/л).

Активность щелочной фосфатазы сыворотки крови увеличивается при костных заболеваниях, связанными с пролиферацией остеобластов, и заболеваниями, сопровождающимися явлениями холестаза (механическая желтуха, холангит, лекарственные и алкогольные гепатиты, первичный билиарный цирроз печени, абсцесс печени, опухоли и метастазы). У детей активность щелочной фосфатазы резко возрастает при рахите. Снижение активности ЩФ наблюдается при гипофосфатемии, нарушении роста костей, накоплении радиоактивных веществ в костях.

Принцип метода.

Ход работы

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т. Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 427–437; 1998. С. 551–564.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 411–426.

Дополнительная

Клиническая биохимия / Под ред. М. А. Базарновой. Киев, 1986.
Хашен В. Очерки по патологической биохимии. М.: Медицина, 1978.
Зилва Ф. Пэннел П. Клиническая химия в диагностике и лечении. М.: Медицина, 1988.

Занятие 32

Контрольное по разделу «Биохимия крови, почек
и печени»

Цель занятия: контроль усвоения вопросов пройденного раздела “Биохимия крови, почек и печени”.

Контрольные вопросы

Функции крови.
Кровь. Основные физико-химические константы крови (pH, pCO2, pO2, плотность, осмолярность). Их изменения при патологии.
Плазма крови, ее количественный и качественный состав. Содержание общих липидов, триглицеридов, холестерина, глюкозы, белка, мочевины, мочевой кислоты, натрия, калия, кальция, хлора, магния, бикарбонатов норме и при патологии.
Белки плазмы крови, их классификация. Характеристика их отдельных представителей. Методы фракционирования.
Изменение белкового спектра при патологии.
Основные небелковые компоненты крови. Остаточный азот, его происхождение, диагностическое значение.
Понятие о КОС. Принципы регуляции КОС.
Механизмы регуляции КОС – физико-химические и физиологические.
Классификация нарушений КОС.
Причины и механизм развития метаболического ацидоза.
Причины и механизм развития респираторного ацидоза.
Причины и механизм развития метаболического алкалоза.
Причины и механизм развития респираторного алкалоза.
Физиологические механизмы коррекции нарушений КОС.
Лабораторная диагностика и оценка нарушений КОС (показатели КОС, электролиты крови, pH мочи) на примере метаболического и респираторного ацидоза.
Общая характеристика эритроцита. Особенности метаболизма. Минеральный состав эритроцитов.
Характеристика мембран эритроцитов. Антиоксидантная защита. Глутатион, его строение, функции.
Hb, его строение, свойства.
Производные Hb, виды Hb. Аномальные Hb.
Сравнительная характеристика Hb и миоглобина.
Дыхательная функция крови, ее регуляция. Роль 2,3-ДФГК. Виды гипоксии, аноксия. Нарушение обмена при гипоксии.
Обмен хромопротеидов. Переваривание и всасывание.
Биосинтез гема (до порфобилиногена), его регуляция.
Распад Hb в клетках РЭС.
Обмен билирубина в печени.
Превращение билирубина в ЖКТ.
Лабораторная диагностика желтух (гемолитической, паренхиматозной, обтурационной).
Метаболизм железа (всасывание, транспорт в крови, депонирование).
Особенности метаболизма лейкоцитов. Биохимическая основа фагоцитоза.
Особенности метаболизма тромбоцитов.
Строение и особенности кровоснабжения нефрона. Механизм и биохимические основы образования мочи в отдельных частях нефрона: фильтрация, реабсорбция, секреция.
Нарушение процессов фильтрации, реабсорбции, секреции и их лабораторная диагностика.
Механизм активного транспорта глюкозы, аминокислот.
Общие свойства мочи в норме и при патологии (суточное количество, цвет, прозрачность, удельный вес, pH и др.).
Органические компоненты мочи (мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, креатин, креатинин, гормоны); неорганические (Na+, К+, Ca2+, Мg2+, NH3+, фосфаты, сульфиты, HCO3-) в норме и при патологии.
Патологические компоненты мочи (кровь, белок, сахар, билирубин). Причины их появления и диагностическое значение.
Клиренс в норме и при патологии. Его диагностическое значение.
Гомеостатическая функция почек. Роль почек и механизм регуляции:

- объема циркулирующей крови (ОЦК) и артериального давления;

- баланса электролитов;

- КОС (механизмы ацидо- и аммониогенеза);

- уровня глюкозы в крови (особенности глюконеогенеза в почках);

- уровня биологически активных веществ;

- эритропоэза.

Метаболическая гетерогенность почечной ткани. Особенности липидного, углеводного и белкового обменов почечной ткани.
Нарушение обмена при острой и хронической почечной недостаточности.
Почечные камни, их состав, причины и механизм возникновения.
Клеточный состав печени. Метаболическая гетерогенность гепатоцитов.
Печень как главный орган гомеостаза. Особенности липидного, углеводного и белкового обмена печени.
Роль печени в углеводном обмене.
Функциональные пробы, характеризующие роль печени в углеводном обмене.
Роль печени в липидном обмене. Механизм развития жировой инфильтрации и дегенерации печени.
Функциональные пробы, характеризующие роль печени в липидном обмене.
Роль печени в азотистом обмене. Механизм развития печеночной комы.
Функциональные пробы, характеризующие роль печени в азотистом обмене.
Роль печени в регуляции КОС.
Роль печени в регуляции уровня биологически активных веществ и функциональные пробы, характеризующие эту роль.
Роль печени в гормональном гомеостазе – метаболизм гормонов. Общая схема метаболизма гормонов в печени.
Основные пути метаболизма ксенобиотиков.
Пробы на детоксикацию.
Энзимодиагностика заболеваний печени – гепатоцеллюлярных и холестаза.
БИОХИМИЯ НЕРВНОЙ, МЫШЕЧНОЙ
И СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНЕЙ,
МИОКАРДА И ЛЕГКИХ

Занятие 33

Биохимия мышечной ткани и миокарда

Цель занятия: изучить особенности метаболизма мышечной ткани и миокарда, биохимическую основу мышечного сокращения. Изучить биохимическую основу острой и хронической сердечной недостаточности. Научиться определять содержание макроэргических соединений мышечной ткани (АТФ и креатинфосфата).

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Морфо-функциональную характеристику мышечной ткани.
Саркомер, миофибриллы, мембранный аппарат мышечной ткани.
Понятие «моторная бляшка», систему Т-трубочек, триады.
Сократительный аппарат гладких мышц.
Метаболизм и механизм действия "вторичных" посредников.
Реакции энергетического обмена и его регуляцию.
Механизмы электрогенеза в мышечной ткани.
"Весельный" механизм мышечного сокращения.
Механизмы нейро-гуморальной регуляции мышечного сокращения.

Студент должен уметь:

Проводить качественные реакции на фосфат, колориметрический анализ.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Основные функции мышечной системы (движение, стимуляция метаболизма и вегетативных функций). Ограничение двигательной активности (гипокинезия). Основные элементы патогенеза гипокинетического синдрома.
2. Особенности метаболизма мышечной ткани, обеспечивающие ей относительную автономию.
  1. Наличие эндогенного запаса субстратов энергетического обмена (гликоген, ТГ). Особенности их обмена.
  2. Наличие запаса макроэргов. Метаболизм креатинфосфата (синтез и распад). Характеристика креатинфосфокиназы.
  3. Своеобразный набор ферментов стабилизирующих уровень АТФ (креатинфосфокиназа, аденилаткиназа, ферменты цикла пуриновых нуклеотидов, АМФ-дезаминаза). Особенности дезаминирования аминокислот.
  4. Наличие депо кислорода. Строение и характеристика оксимиоглобина.
  5. Своеобразный набор белков и их характеристика: миозин, актин (G, F), тропомиозин, тропонин (I, T, C).
  6. Наличие дипептидов (карнозин, ансерин), их строение и биологическая роль.
  7. Наличие депо Ca2+, особенности метаболизма Ca2+ в мышечной ткани, характеристика саркоплазматического ретикулума.
3. Особенности энергообразования в мышечных волокнах. Типы мышечных волокон, их морфо-функциональная характеристика. Особенности метаболизма миокарда.
4. Пути утилизации АТФ в мышечной ткани (миозиновая АТФ-аза, ионные АТФ-азы, биосинтезы и др.).
5. Роль мышечной ткани в межорганном обмене субстратами: циклы – глюкозо-лактатный (цикл Кори) и глюкозо-аланиновый (цикл Фелига).
6. Особенности метаболизма миокарда.
7. Теория мышечного сокращения. Механизм электромеханического сопряжения (роль АЦ, мембран саркоплазматического ретикулума, ионов Ca++, кальмодулина, белков мышечной ткани, АТФ-аз). Механизм расслабления. Механизм образование ригорного комплекса (трупное окоченение).
8. Особенности сокращения гладкой мускулатуры.
9. Механизм развития сердечной недостаточности. Адаптивные изменения структуры и метаболизма миокарда при хронической сердечной недостаточности. Биохимическое обоснование лечения сердечной недостаточности:

а) препараты, увеличивающие сократимость миокарда (сердечные гликозиды, их механизм действия, ингибиторы фосфодиэстеразы, Са-сенситезаторы и др.)

б) препараты, уменьшающие нагрузку на миокард (вазодилятаторы и др.)

в) препараты, блокирующие нейро-эндокринную регуляцию миокарда (бета-адреноблокаторы и др.)

г) препараты, улучшающие метаболизм миокарда (коронаролитики, субстраты энергетического обмена, рибоксин, фосфокреатин, антигипоксанты, антиоксиданты, анаболики, Ca2+ антагонистов и др.).

Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторная работа.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Диагностическим критерием заболеваний мышечной системы является уровень выделения с мочой:

а) аминокислот; б) мочевины; в) мочевой кислоты; г) аммонийных солей; д) креатина; е) креатинина; ж) глютатиона; з) тионеина?

2 При каких заболеваниях увеличивается экскреция креатина с мочой:

а) обтурационная желтуха; б) острый гепатит; в) закупорка мочевых путей; г) значительные оперативные вмешательства; д) прогрессирующая мышечная дистрофия; е) инфаркт миокарда; ж) пневмония; з) акромегалия; и) сахарный диабет; к) гипертиреоз?

3 При каких состояниях увеличивается концентрация креатинина в сыворотке крови:

а) прогрессирующая мышечная дистрофия; б) опухоли мочевых путей; в) кишечная непроходимость; г) гломерулонефрит; д) острый панкреатит; е) цирроз печени; ж) диарея; з) акромегалия; и) сахарный диабет; к) гипертиреоз?

4. Гипокальциемия обнаруживается у больных, страдающих:

а) рахитом; б) хронической почечной недостаточностью; в) закупоркой желчевыводящих путей; г) гипопаратиреоидизмом; д) метастазами рака в костную ткань; е) гипотиреозом; ж) сахарным диабетом; з) дефицитом магния; и) циррозом печени; к) алкоголизмом?

5 Гипокалиемия клинически проявляется в виде:

а) снижения тонуса гладкой и скелетной мускулатуры; б) усиления рефлексов; в) появления вялых параличей; г) расширения сердца; д) усиления перистальтики кишечника; е) общей слабости; ж) гиперкинезов; з) пареза кишечника; и) тахикардии; к) брадикардии?

6 Накопление молочной кислоты в организме происходит при:

а) полном прекращении кровообращения (клиническая смерть); б) сердечно-сосудистой недостаточности; в) кровопотере; г) гипоксии; д) усиленной мышечной работе; е) гипероксии; ж) диарее; з) гиповитаминозе В1?

7 Что является характерным для мышечной дистрофии:

а) креатинемия; б) кетонурия; в) глюкозурия; г) креатинурия; д) креатининурия; е) аминацидурия; ж) фосфатурия; з) гипераммонемия?

8 При каких заболеваниях повышается концентрация миоглобина в крови:

а) хроническом гепатите; б) инфаркте миокарда; в) пневмонии; г) туберкулезе легких; д) остром панкреатите; д) остром холецистите; е) краш-синдроме; ж) пиелонефрите?

9 Для диагностики инфаркта миокарда в первые 6–8 часов после приступа целесообразно исследовать плазму крови на:

а) содержание тропонина; б) уровень миоглобина; в) активность креатинкиназы; г) активность АСТ; д) активность гамма-глутамилтранспептидазы; е) активность АЛТ; ж) активность амилазы; з) активность аргиназы?

10 Для диагностики инфаркта миокарда в первые сутки после приступа целесообразно исследовать плазму крови на:

а) изоферменты ЛДГ; б) миоглобин; в) альдолазу; г) АСТ; д) аргиназу; е) изоферменты КФК; ж) АЛТ; з) щелочную фосфатазу; и) кислую фосфатазу; к) тропонин Т?

11 Какие тесты целесообразно исследовать на 2–3-е сутки после инфаркта миокарда:

а) креатинфосфокиназа (КФК); б) бета-оксибутират ДГ; в) гамма-глутамилтрансфераза; г) изоферменты АСТ; д) изоферменты ЛДГ; е) церулоплазмин; ж) изоферменты КФК; з) АСТ; и) АЛТ; к) амилаза?

12 Активность каких ферментов информативна на 4–6-е сутки после инфаркта миокарда:

а) креатинфосфокиназы; б) холинэстеразы; в) гамма-глутамилтрансферазы; г) изоферментов АСТ; д) изоферментов ЛДГ; е) церулоплазмина; ж) изоферментов КФК; з) АСТ; и) ЛДГ; к) бета-оксибутират ДГ?

13 При каких заболеваниях увеличивается концентрация креатинина в крови:

а) остром бронхите; б) значительных оперативных вмешательств; в) сахарном диабете; г) обширных травмах; д) хроническом гастрите; е) инфаркте миокарда; ж) хроническом гломерулонефрите?

14 Специфичными для скелетной мышечной ткани ферментами являются:

а) фруктозомонофосфат-альдолаза; б) аргиназа; в) алкогольдегидрогеназа; г) креатинфосфокиназа; д) бета-оксибутират ДГ; е) BB изоформы КФК; ж) MВ изоформы КФК; з) MM изоформы КФК; и) амилаза; к) ЛДГ1 и ЛДГ2; л) ЛДГ4 и ЛДГ5?

15 Специфичными для миокарда ферментами являются:

16 Какой из ферментных тестов отражает процессы репарации после инфаркта миокарда:

а) креатинкиназа; б) АСТ; в) гамма-глутамилтранспептидаза; г) холинэстераза; д) церулоплазмин; е) лейцинаминопептидаза; ж) амилаза; з) ЛДГ?

17 Появление миоглобина в крови при инфаркте миокарда отмечается через:

а) 2,5–3 часа; б) 8 часов; в) 24 часа; г) 48 часов; д) неделю; е) 0,5–1 час?

18 Наиболее ранний срок появления миоглобина в моче при инфаркте миокарда (через):

а) 1,5–3 часа; б) 8 часов; в) 24 часа; г) 48 часов; д) неделю; е) 2–3 недели?

19 Для диагностики каких заболеваний исследуют содержание миоглобина в сыворотке крови:

а) инфаркта миокарда; б) вирусного гепатита; в) гемолитической анемии; г) патологии костной ткани; д) пневмонии; е) язвы желудка; ж) постгеморрагической анемии; з) ожоговой болезни; и) сахарного диабета I типа; к) краш-синдрома?

20 Фосфорилированная форма креатина в мышцах является:

а) источником неорганического фосфата для образования АТФ; б) компонентом цикла Фелига; в) одним из факторов электромеханического сопряжения; г) важным источником макроэргов; д) компонентом цикла Кори; е) переносчиком цитрата через мембрану митохондрий; ж) транспортной формой макроэргов в кардиомиоците?

21 Что из указанного включается в биосинтез креатинфосфата:

а) пиридоксальфосфат; б) АТФ; в) метионин; г) цистеин; д) валин; е) NADP; ж) аргинин; з) триптофан; и) АМФ; к) глицин; л) биотин; м) аскорбат?

22 Мышечные клетки, инкубированные с 3H-тимидином, быстрее аккумулируют радиоактивную метку:

а) в митохондриях; б) рибосомах; в) гяРНК; г) гладком ЭПР; д) ядре; е) аппарате Гольджи; ж) лизосомах; з) шероховатом ЭПР?

Лабораторные работы

Лабораторная работа №1. Количественное определение макроэргических соединений мышц (АТФ и креатинфосфата)

В мышечной ткани содержится два основных макроэргических соединения – АТФ и креатинфосфат. Основным путем образования АТФ в тканях является окислительное фосфорилирование, осуществляемое в процессе тканевого дыхания. Креатинфосфат образуется в мышце при участии АТФ в состоянии покоя (см. уравнение) и является транспортной и резервной формой макроэргического фосфата при активной мышечной работе.

Принцип метода. Метод основан на количественном определении (по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты) макроэргического фосфата в молекулах АТФ и креатинфосфата, который легко отщепляется при непродолжительном гидролизе в кислой среде (так называемый лабильно связанный фосфор).

Определение содержания неорганического фосфора в пробах мышечного экстракта, до гидролиза и после него, дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, макроэргических соединений мышцы.

Ход работы. Работа состоит из 5 этапов:

1 Экстракция органического фосфата. 0,5 г мышечной кашицы помещают в пробирку, стоящую в ледяной бане, и добавляют в нее 5 мл охлажденного 3 %-го раствора ТХУ. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой для экстрагирования АТФ и креатинфосфата в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в мерную пробирку, стоящую в ледяной бане. Остаток мышечной кашицы в пробирке заливают 5 мл дистиллированной воды, продолжают экстракцию в течение 5 мин на холоде. Полученный экстракт фильтруют в ту же мерную пробирку и доводят общий объем до 10 мл дистиллированной водой.

2 Гидролиз органического фосфата. В две пробирки отбирают по 0,5 мл безбелкового фильтрата. Первая пробирка – контрольная, вторая – опытная. В опытную пробирку добавляют 1 мл 1 М раствора HCl. Закрывают фольгой и помещают в кипящую баню на 10 мин для гидролиза фосфорных связей. Затем раствор охлаждают и добавляют 1 мл 1 М раствора NaOH. В контрольную пробирку (без предварительного кипячения) добавляют 1 мл 1 М раствора NaOH и 1 мл 1 М раствора HCl. В опытную и контрольную пробирки добавляют из бюретки по 7,5 мл дистиллированной воды для получения объема 10 мл.

3 Проведение качественной реакции. Дальнейшие процедуры обязательно проводят одновременно с опытной и контрольной пробами. Из обеих пробирок отбирают по 0,8 мл жидкости, переносят в две другие пробирки, содержащие по 5 мл активного буфера, затем добавляют по 0,5 мл 1 М раствора молибдата аммония, 0,5 мл 1 %-го раствора аскорбиновой кислоты. Содержимое каждой пробирки быстро перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре точно 10 мин.

4 Фотометрия окрашенного комплекса. Контрольную и опытную пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (длина волны 670 нм) против воды. В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфор представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и фосфатных солей, присутствующих в тканях. В контрольной пробе – только фосфатные соли.

5 Расчет содержания макроэргических фосфорных соединений. Из величины оптической плотности, найденной для опытной пробы, вычитают величину оптической плотности, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора в пробе находят по калибровочному графику.

Расчет. Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора (в мг) на 100 г сырой ткани, учитывая разведение:

x = А  3,3  400 100,

где x – содержание (мг/100 г) макроэргических соединений в перерасчете на 1 мг АТФ в 100 г сырой ткани;

А – содержание АТФ в пробе, мг;

3,3 и 400 – коэффициенты перерасчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 504–517; 1998. С. 645–660.

Дополнительная

Бэгшоу К. Мышечное сокращение. М.: Мир, 1985.
Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2. С. 332–351.
Уайт А. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981. Т. 3. С. 1400–1424.
Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 2. С. 254–274.

Занятие 34

Биохимия нервной системы

Цель занятия: изучить особенности метаболизма нервной ткани, биохимическую основу ее функционирования в норме и при различных патологических состояниях. Научиться определять активность холинэстеразы сыворотки крови.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Особенности строения и функции нейрона и нейроглии.
Строение и функции синапса.
Метаболизм глюкозы, липидов и аминокислот.
Метаболизм этанола и гидрофобных ксенобиотиков.
Низкоэнергетические состояния, причины и механизм развития.
Строение, локализацию и функции ионных АТФ-аз (Na/K, Са и др.).
Биофизические механизмы возникновения и проведения потенциалов.

Студент должен уметь:

Выполнять качественные реакции на активность ферментов биологических жидкостей.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Общая характеристика метаболизма и химического состава мозга.
2. Особенности метаболизма в мозге:

а) углеводов (гликолиз, пентозный цикл, ЦТК), роль инсулина в метаболизме мозга;

б) макроэргов (АТФ и креатинфосфата);

в) белков, их состав, специфические белки нервной ткани S-100, белки миэлина, тубулин, факторы роста нервов и др. Олиго- и полипептиды нервной ткани – ансерин, карнозин, гомокарнозин, либерины, статины, вещество P, кальцийнейрин и др., их функции. Энкефалины, эндорфины, их природа, механизм действия и физиологическая роль;

г) аминокислот, роль дикарбоновых аминокислот – глу и асп в метаболизме мозга (цикл Робертса, цикл пуриновых нуклеотидов – реакции, ферменты, субстраты, физиологическая роль);

д) нуклеиновых кислот;

е) липидов – липиды миэлина, особенности биосинтеза и роль холестерина.

Основные функции нейронов:

а) электрогенез (механизм электрогенеза);

б) метаболизм (синтез и распад) медиаторов, типы медиаторов. Краткая характеристика (синтез, биохимические и физиологические эффекты, распад) – ацетилхолин, катехоламины, серотонин, дофамин, ГАМК, ГОМК, аминокислоты, гистамин. Состояние медиаторного обмена в норме и при некоторых патологических состояниях (паркинсонизм, шизофрения, маниакальные состояния, депрессии и др.);

в) строение синапса, механизмы синаптической и аксональной передачи. Понятие об аксональном транспорте и его физиологической роли;

г) биохимические механизмы памяти.

Особенности метаболизма мозга при гипоксии.
1. Биохимические механизмы действия на мозг алкоголя, наркотиков (опиоиды, кокаин, ЛСД-25 и др.) и гидрофобных токсических соединений. Биохимические механизмы развития алкоголизма, наркоманий и токсикоманий.
2. Понятие о гематоэнцефалическом барьере.
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторная работа.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Основным источником аммиака в ткани мозга является реакция (напишите реакции):

а) дезаминирования асп; б) дезаминирования глу; в) дезамидирования асн; г) дезамидирования глн; д) дезаминирования АМФ; е) дезаминирования АТФ; ж) трансаминирования; з) распада нуклеиновых кислот?

2 В каких случаях увеличивается активность холинэстеразы в сыворотке крови:

а) нефротический синдром; б) инфекционный гепатит; в) бронхиальная астма; г) миома матки; д) инфаркт миокарда; е) отравление фосфорорганическими веществами; ж) травма мозга; з) отек мозга; и) гипертоническая болезнь?

3 Активность холинэстеразы сыворотки крови понижается при:

а) инфаркте миокарда; б) отравлении фосфорорганическими инсектицидами; в) отравлении боевыми фосфорорганическими веществам; г) панкреатите; д) язвенной болезни желудка; е) вирусном гепатите; ж) токсическом гепатите; з) отравлении миорелаксантами; и) гемолитической анемии?

4 Развитие печеночной комы при тяжелом вирусном гепатите связано главным образом:

а) с нарушением синтеза альбумина; б) дисглобулинемией; в) увеличением содержание в крови аммиака; г) снижением содержание в крови глюкозы; д) увеличением содержание в крови билирубина; е) повышением осмолярности крови; ж) кетоацидозом?

5 Какие из указанных реакций обезвреживания аммиака характерны для ткани мозга (напишите реакции):

а) восстановительное аминирование -кетоглутарата; б) амидирование глу; в) амидирование асп; г) аминирование ИМФ; д) дезаминирование АМФ; е) амидирование белков; ж) орнитиновый цикл?

6 Какие из указанных ферментов участвуют в реакциях инактивации биогенных аминов:

а) холинэстераза; б) моноаминооксидаза; в) оксидазы D-аминокислот; г) оксидазы L-аминокислот; д) цитохром Р450; е) катехол-o-метилтрансфераза; ж) глютатионпероксидаза; з) супероксиддисмутаза?

7 Наркотическое действие алкоголя связано:

а) с ингибированием Са каналов; б) гиперпродукцией NADH; в) торможением первого комплекса дыхательной цепи; г) торможением третьего комплекса дыхательной цепи; д) ингибированием сукцинатдегидрогеназы; е) продукцией эндогенных медиаторов торможения; ж) дефицитом эндогенных медиаторов торможения; з) ингибированием цитохромоксидазы; и) активацией сукцинатдегидрогеназы?

8 Наркотическое действие гидрофобных веществ связано:

9 Тормозным медиатором нейронов спинного мозга и ствола мозга является:

а) ГАМК; б) ГОМК; в) глу; г) глн; д) гли; е) таурин; ж) гистамин; з) эндорфины; и) серотонин; к) белок S-100?

10 Главным тормозным медиатором нейронов головного мозга является:

а) ГАМК; б) ГОМК; в) глу; г) глн; д) гли; е) таурин; ж) гистамин; з) эндорфины; и) серотонин; к) белок S-100?

11 Антагонистом серотониновых рецепторов мозга является:

а) ЛСД-25; б) алкоголь; в) кокаин; г) теофиллин; д) резерпин; е) новокаин; ж) стрихнин; з) аммиак?

12. Антагонистом рецепторов норадреналина в мозге является:

а) ЛСД-25; б) алкоголь; в) кокаин; г) теофиллин; д) резерпин; е) новокаин; ж) стрихнин; з) аммиак?

13 В везикулах пресинаптических адренэргических нервных окончаний находятся:

а) связанный норадреналин; б) серотонин; в) АТФ; г) свободный норадреналин; д) хромогранин; е) дофамингидроксилаза; ж) ГАМК; з) моноаминооксидаза?

14 Антагонистом глициновых рецепторов спинного мозга является:

а) ЛСД-25; б) алкоголь; в) кокаин; г) теофиллин; д) резерпин; е) новокаин; ж) стрихнин; з) аммиак?

15 Для паркинсонизма характерно:

а) увеличение содержания в мозге дофамина;

б) резкое снижение содержания в мозге дофамина;

в) резкое снижение содержания в мозге норадреналина;

г) резкое увеличение содержания в мозге норадреналина;

д) ингибирование сукцинатдегидрогеназы;

е) увеличение содержания в мозге серотонина?

16 Тормозное действие медиатора ГАМК связано:

а) с ингибированием Са каналов;

б) гиперпродукцией NADH;

в) торможением первого комплекса дыхательной цепи;

г) торможением третьего комплекса дыхательной цепи;

д) ингибированием сукцинатдегидрогеназы;

е) продукцией эндогенных медиаторов торможения;

ж) гиперполяризацией постсинаптической мембраны;

з) ингибированием цитохромоксидазы;

и) увеличением проводимости для ионов Сl-?

Лабораторная работа Ингибирование активности холинэстеразы сыворотки крови прозерином

Принцип метода. Основан на том, что при гидролизе ацетилхолина холинэстеразой происходит подкисление среды за счет накопления уксусной кислоты:

Холинэстераза

СН3-СO-О-СН2-СН2-N(СН3)3 + H2O  НО-СН2-СН2-N(СН3)3+ СН3-СОO- + Н+,

которую можно обнаружить по изменению окраски в присутствии индикатора – бромтимолового синего. В нейтральной среде этот индикатор сине-зеленый, а в кислой он имеет красную окраску. В присутствии антихолинэстеразного препарата – прозерина, а также инсектицидов или других фосфорорганических соединений, которые ингибируют активность холинэстеразы, расщепления ацетилхолина не происходит, и индикатор не меняет своей окраски.

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,2 мл 0,1 %-го раствора бромтимолового синего и по 0,2 мл 0,1 %-го раствора ацетилхолина (предварительно нейтрализованного NaOH). В одну из пробирок (контрольную) добавляют 3 капли 0,05 %-го раствора прозерина.

В каждую пробирку вносят по 0,02 мл крови, содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при температуре 38 °C на 15–20 мин. По истечении этого времени наблюдают изменение окраски в опытной пробе и сохранение исходной окраски в контрольной.

Клинико-диагностическое значение. В организме человека существует два типа холинэстераз:

а) ацетилхолинэстераза (АХЭ), которая встречается преимущественно в мозге, эритроцитах, мышцах, нервах; это высокоспецифический фермент, катализирующий гидролитическое расщепление ацетилхолина на холин и уксусную кислоту;

б) холинэстераза (ХЭ), которая содержится в основном в печени, поджелудочной железе и плазме крови. ХЭ обладает более широкой субстратной специфичностью, т. е. расщепляет ацетилхолин и другие эфиры холина.

Определение активности АХЭ сыворотки и тканей имеет большое клинико-диагностическое значение.

Сывороточная ХЭ представляет собой высокомолекулярный гликопротеид, связанный в крови с альбумином. Функция этого фермента выяснена недостаточно. Предполагают, что ХЭ плазмы крови выполняет защитную функцию, предотвращая накопление и распространение ацетилхолина по тканям, при попадании его в кровяное русло.

В норме активность ХЭ сыворотки крови колеблется в широких пределах – 160–340 мкмоль/(мл ∙ ч). При патологических состояниях ее активность чаще всего снижается. Значительное снижение активности ХЭ сыворотки крови отмечается при заболеваниях печени, гипотиреозе, суставном ревматизме, инфаркте миокарда, ожогах, а также отравлениях различными фосфорорганическими соединениями.

Угнетение активности ХЭ в сыворотке крови наблюдается значительно раньше проявления других симптомов интоксикации.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 488–503; 1998. С. 625–644.
Уайт А. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981. Т. 3. С. 1425–1465.

Дополнительная

Ашмарин И. П. и др. Элементы патологической физиологии и биохимии. М.: МГУ, 1992.
Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 3. С. 287–381.

Занятие 35

Биохимия соединительной ткани

Цель занятия: изучить особенности метаболизма соединительной ткани, биохимическую основу ее функционирования в норме и при различных патологических состояниях.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение соединительной ткани.
Классификацию видов соединительной ткани.
Структурную организацию белковой молекулы.
Биосинтез и процессинг белка.
Химическую модификацию молекулы белка (реакции гидроксилирования и др.).
Строение, свойства и метаболизм ГАГ.

Студент должен уметь:

Проводить исследование на фотоэлектроколориметре.

Структура занятия

Теоретическая часть
1. Краткая характеристика соединительной ткани (СТ).
2. Особенности строения СТ. Функции СТ. Характеристики и функциональное значение и особенности метаболизма клеточных элементов СТ (фибробласты, тучные, плазматические клетки и др.)
3. Особенности строения и функциональное значение волокнистых структур СТ.
  1. Коллагеновые волокна. Особенности аминокислотного состава, первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур. Тропоколлаген. Биосинтез и процессинг коллагена (гидроксилирование, ограниченный протеолиз, гликозилирование). Роль аскорбиновой кислоты в процессинге коллагена. Катаболизм коллагена.
  2. Эластичные волокна. Особенности аминокислотного состава, первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур. Строение десмозина и изодесмозина, их роль в образовании эластичных волокон. Метаболизм (синтез и распад) эластичных волокон.
  3. Строение ретикулиновых волокон. Гликозаминогликаны (ГАГ). Строение, свойства и функциональная роль. Метаболизм ГАГ и факторы, влияющие на метаболизм ГАГ (инсулин, витамин A, соматотропин).
4. Протеогликаны, строение, свойства, роль в поддержании тургора тканей, балансе катионов, воды, обмене биологически активных веществ и др.
5. Структурная организация межклеточного матрикса. Неколлагеновые структурные гликопротеиды – фибронектин, его строение, свойства и функциональная роль. Базальная мембрана, ее строение, свойства и функциональная роль.
6. Хрящевая ткань, химический состав и особенности метаболизма.
7. Костная ткань, химический состав, структура и формирование кости. Метаболизм костной ткани и факторы, влияющие на ее метаболизм (витамин D, кальцитонин, паратгормон, витамин A, инсулин, соматотропин). Механизм минерализации кости.
8. Зубы, химический состав и особенности метаболизма. Механизм развития кариеса.
9. Изменение СТ при старении, заживлении ран, гиповитаминозе C, коллагенозах, синдроме Элерса-Данлоса-Черногубова и латиризме.
Практическая часть
1. Решение задач.
2. Лабораторная работа.
3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1 Выберите признаки, характерные для соединительной ткани:

а) преобладание глобулярных белков;

б) преобладание фибриллярных белков;

в) наличие большого количества липопротеидов;

г) преобладание межклеточного вещества над клеточными элементами;

д) наличие большого количества протеогликанов;

е) преобладание клеточных элементов над межклеточным веществом?

2 Выберите аминокислоты, преобладающие в коллагене:

а) пролин; б) метионин; в) оксипролин; г) аспартат; д) глицин; е) лизин; ж) глутамин; з) оксилизин; и) десмозин; к) валин?

3 Какие из перечисленных ниже особенностей правильно характеризуют коллаген:

а) полноценный пищевой белок;

б) частично гидролизуется протеазами желудочно-кишечного тракта;

в) составляет до 50 % общего количества белка в организме;

г) является основным структурным белком организма;

д) при старении уменьшается его количество;

е) в коже и костях, стенках сосудов, базальных мембранах содержатся различные типы коллагеновых молекул;

ж) в составе коллагена отсутствует лиз, оксилиз, гли;

з) в составе коллагена преобладают ала, сер, три, цис;

и) при старении увеличивается его количество?

4 Укажите правильный порядок этапов биосинтеза и процессинга коллагена (например, а  б  … и т. д.):

а) фибриллогенез (формирование фибрилл);

б) гидроксилирование про и лиз;

в) образование альдегидов и поперечных связей;

г) образование проколлагена (образование спирали, прекращение гидроксилирования);

д) гликозилирование;

е) образование коллагеновых волокон;

ж) отщепление N- и C-концевых фрагментов;

з) трансляция?

5 Чем обусловлена высокая прочность коллагеновых волокон:

а) множеством ковалентных связей внутри молекулы тропоколлагена;

б) формированием третичной структуры коллагена;

в) взаимодействием протеогликанов с коллагеновыми фибриллами;

г) гидрофобными связями между молекулами тропоколлагена;

д) особым расположением пептидных цепей в тропоколлагене;

е) наличием гидратной оболочки;

д) гликозилированием коллагена?

6 Напишите реакции гидроксилирования цепи препроколлагена. Укажите фермент и кофакторы.

7 Как и почему изменится с возрастом суточная экскреция с мочой о-про?

8 Какие последствия может иметь недостаток витамина С в организме:

а) снижение активности пролилгидроксилазы фибробластов;

б) уменьшение прочности структуры коллагена;

в) повышение количества оксипролина в коллагене;

г) снижение количества оксипролина в коллагене;

д) уменьшение скорости гликозилирования коллагена;

е) увеличение количества водородных связей между полипептидными цепями коллагена;

ж) уменьшение количества водородных связей между полипептидными цепями коллагена;

з) увеличение количества ковалентных связей внутри молекулы тропоколлагена;

и) уменьшение количества ковалентных связей внутри молекулы тропоколлагена?

9 При синдроме Элера-Данлоса (тип VII) отмечается деформация суставов и искривление позвоночника, что обусловлено недостаточностью Nконцевой проколлагенпептидазы, в связи с чем:

а) изобразите схему строения проколлагена;

б) на схеме укажите место действия проколлагенпептидаз;

в) какой из этапов процессинга коллагена нарушен при этом заболевании?

10 Возникающая при гипервитаминозе D3 деструкция костной ткани обусловлена и сопровождается:

а) усиленным образованием в печени 25-ОН D3;

б) усиленным образованием в почках 1,25-ОН D3;

в) усиленным образованием в почках 25-ОН D3;

г) усиленным образованием в печени 1,25-ОН D3;

д) гиперкальциемией;

е) гипокальциемией;

ж) гиперкальциурией и образованием почечных камней;

з) гипокальциурией и образованием почечных камней;

ж) гиперфосфатемией;

з) гипофосфатемией;

и) гиперфосфатурией и образованием почечных камней;

к) гипофосфатурией и образованием почечных камней?

11 Возникающая при гипервитаминозе D3 деструкция костной ткани обусловлена и сопровождается:

а) усилением катаболизма коллагена; б) усилением биосинтеза коллагена; в) усилением катаболизма эластина; г) гиперэкскрецией с мочой оксипролинсодержащих пептидов; д) усилением биосинтеза эластина; е) усилением катаболизма альбумина; ж) усилением биосинтеза альбумина; з) гиперэкскрецией оксипролина с мочой?

12 При гиперпаратиреозе отмечается:

а) увеличение экскреции с мочой оксипролина; б) гиперкальциемия; в) увеличение экскреция с мочой кальция; г) нарушение функции почек; д) гипертензия; е) одышка; ж) язвенная болезнь; з) гипертонус мышц; и) гиперсекреция гастрина; к) мышечная слабость?

13 При старении возрастает ригидность связок, сухожилий, уменьшается тургор тканей. Укажите возможные причины этого явления:

а) увеличение числа поперечных связей между молекулами тропоколлагена; б) уменьшение числа поперечных связей между молекулами тропоколлагена; в) уменьшение соотношения основное вещество/волокна; г) снижение способности межклеточного вещества связывать воду; д) увеличение количества протеогликанов в межклеточном матриксе; ж) увеличение соотношения основное вещество/волокна; з) увеличение количества эластина; и) уменьшение количества эластина?

14 Кортикостероиды угнетают склерозирование тканей за счет:

а) ингибирования деления фибробластов; б) активации деления фибробластов; в) торможения образования мРНК проколлагена; г) активации синтеза гликозамингликанов; д) нарушения утилизации глюкозы фибробластами; е) ингибирования синтеза ДНК; ж) активации липолиза; з) активации глюконеогенеза?

15 Системная склеродермия – заболевание, при котором увеличивается синтез коллагена, развивается фиброз кожи и внутренних органов.

А. По какому компоненту мочи можно судить об интенсивности обмена коллагена и как он изменяется при этом заболевании?

Б. Как изменится этот показатель при лечении такого больного кортикостероидами?

16 Подберите соответствующие пары для объяснения причин изменения структуры коллагена:

а) изменение первичной структуры коллагена; б) нарушение четвертичной структуры коллагена; в) снижение активности пролилгидроксилазы; г) снижение активности лизиламинооксидзы; д) гиповитаминоз С; е) мутации ДНК фибробластов; ж) дефицит Cu2+; з) гиповитаминоз А?

17 Выберите положения, правильно характеризующие эластин:

а) является фибриллярным белком; б) способен к обратимому растяжению; в) является глобулярным белком; г) располагается в стенках крупных сосудов, обеспечивая их упругие свойства; д) преобладает в структуре крупных сухожилий; е) основной белок белой соединительной ткани; ж) расщепляется протеазами желудочно-кишечного тракта; з) основной белок желтой соединительной ткани; и) участвует в образовании рубцовой ткани; к) богат оксипролином и оксилизином?

18 В составе эластина преобладают следующие аминокислоты:

а) ала; б) гли; в) вал; г) глу; д) о-про; е) норлейцин; ж) и-лей; з) про; и) цис; к) лей?

19 Покажите преимущественное распределение коллагена и эластина в следующих структурах:

а) коллаген; б) эластин; в) сухожилия; г) желтая затылочная связка; д) стенка аорты; е) кости?

20 Какие компоненты необходимы для проявления активности пролингидроксилазы:

а) кислород; б) витамин B6; в) Fe2+; г) витамин С; д) NADP+; е) -кетоглутарат; ж) цитохром Р-450; з) Cu2+?

21 Какие из компонентов необходимы для проявления активности лизилоксидазы:

а) кислород; б) витамин B6; в) Fe2+; г) витамин С; д) NADP+; е) -кетоглутарат; ж) цитохром Р-450; з) Cu2+?

22 Из предложенных утверждений выберите те, которые правильно характеризуют последствия недостаточности лизилоксидазы:

а) нарушается синтез десмозина; б) увеличивается количество растворимого коллагена; в) уменьшается прочность эластина; г) уменьшается прочность аорты; д) в эластине увеличивается количество лизина и снижается количество десмозина; е) увеличивается количество растворимого эластина; ж) возрастает экскреция с мочой оксипролинсодержащих пептидов?

23 Выберите положения, правильно характеризующие фибронектин:

а) является липопротеидом; б) является гликопротеидом; в) имеет доменную структуру; г) является простым белком; д) имеет несколько центров связывания; е) является металлопротеидом; ж) связывается с проколлагеновыми фибриллами и гликозаминогликанами; з) находится в митохондриальном матриксе и на рибосомах; и) регулирует сродство гемоглобина к кислороду?

24 Фибронектин является фактором, связывающим коллагеновые волокна, протеогликаны, клетки. Какими свойствами это объясняется:

а) располагается внутри клеток; б) располагается в межклеточном пространстве; в) является простым белком; г) является поливалентным белком; д) имеет центры связывания фибробластов, коллагена и протеогликанов; е) располагается на поверхности клеток; ж) находится в крови; з) депонирует часть железа?

25 Какие свойства злокачественных клеток изменятся из-за снижения на их поверхности количества фибронектина?

26 Выберите положения, правильно характеризующие структуру и биологическую роль протеогликанов:

а) основным компонентом являются гликозаминогликаны; б) белок составляет 5–10 % от массы протеогликанов; в) белок составляет 20–30 % от массы протеогликанов; г) составляют основную массу межклеточного матрикса соединительной ткани; д) регулируют сродство гемоглобина к кислороду; е) связаны со структурными белками соединительной ткани; ж) образуют гелеобразные структуры?

27 Изобразите схему строения протеогликановых агрегатов. Укажите составные компоненты.

28 Укажите, какие компоненты образуются при гидролизе:

а) хондроитин-4-сульфата; б) гиалуроновой кислоты; в) гепарина; г) глюкуроновая кислота; д) глюкуронат-2-сульфат; е) N-ацетилглюкозамин; ж) N-ацетилгалактозамин-4-сульфат; з) N-ацетилглюкозамин-6-сульфат?

29 Как повлияет длительное введение кортизона экспериментальным животным на выведение оксипролина с мочой?

30 Изменится ли скорость потребления кислорода (тканевого дыхания) кости в фазу ее активной регенерации? Аргументируйте свой ответ.

Лабораторная работа Модифицированный метод количественного определения сиаловых кислот в сыворотке крови

Принцип метода. Метод основан на том, что при добавлении ТХУ к сыворотке крови происходит мягкий гидролиз гликопротеидов, приводящий к отщеплению сиаловых кислот, которые вступают в реакцию с уксусно-сернокислым реактивом с образованием окрашенного соединения буровато-розового цвета. Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации сиаловых кислот.

Ход работы.

1-й этап – гидролиз гликопротеидов. В сухую центрифужную пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови и прибавляют 1 мл 10 %-го раствора ТХУ. Смесь перемешивают, пробирку закрывают фольгой и помещают в кипящую баню точно на 5 мин для выделения сиаловых кислот в свободном виде. Вынув из бани, пробирку охлаждают в холодной воде со льдом. Смесь центрифугируют или очень аккуратно фильтруют, сливая раствор по стеклянной палочке на маленький бумажный фильтр. Если проводили центрифугирование, то надосадочную жидкость сливают в сухую пробирку.

2-й этап – проведение цветной реакции. В одну пробирку (опытную) отмеривают 0,4 мл супернатанта или фильтрата, в другую (контрольную) – 0,4 мл дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 5 мл уксусно-сернокислого реактива, закрывают фольгой и помещают на 30 мин в кипящую баню. После этого пробирки охлаждают и колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (длина волны – 540 нм) в кюветах толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы. Зная оптическую плотность испытуемого раствора, по калибровочной кривой определяют концентрацию сиаловых кислот.

Калибровочную кривую строят с пробами, содержащими 0,05; 0,1; 0,2 и 0,3 мл стандартного раствора сиаловой кислоты (0,5 мг в 1 мл).

Общий объем пробы при построении калибровочного графика доводят дистиллированной водой до 0,4 мл. Затем добавляют во все пробирки по 5 мл уксусно-сернокислого реактива, перемешивают и проделывают все операции, описанные выше. При построении графика на оси ординат откладывают значения оптической плотности, а на оси абцисс – содержание сиаловых кислот в пробах.

Клинико-диагностическое значение. Сиаловые кислоты, или N-ацетилпроизводные нейраминовой кислоты, играют важную роль в организме, прежде всего, как структурные блоки гликопротеидов, являясь концевыми остатками их полисахаридных цепей. Гликопротеины выполняют в организме также опорную, защитную, рецепторную и иммунную функции.

При патологических состояниях организма содержание гликопротеинов существенно изменяется. Особенно заметны эти изменения при воспалительных процессах, сопровождающихся разрушением соединительной ткани, – ревматизме, коллагенозах, некоторых формах новообразований и др. В этих случаях уровень сиаловых кислот в тканях и сыворотке крови резко возрастает и может служить диагностическим тестом для оценки активности патологического процесса.

В норме содержание сиаловых кислот в сыворотке крови составляет в среднем 0,62–0,73 г/л (62–73 мг/дл).

Оформление работы. Дают клиническо-диагностическую оценку полученных результатов, отмечают клиническое значение определения сиаловых кислот.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

Материал лекций.
Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 488–503; 1998. С. 661–678.
Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 399–411.
Уайт А. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1981. Т. 3. С. 1467–1513.

Дополнительная

Ашмарин И. П. и др. Элементы патологической физиологии и биохимии. М.: МГУ, 1992.
Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 3. С. 287–381.

Занятие 36

Контрольное по разделу «Биохимия нервной, мышечной и соединительной тканей,
миокарда и легких»

Цель занятия: контроль усвоения вопросов пройденного раздела “Биохимия нервной, мышечной и соединительной тканей, миокарда и легких”.

Контрольные вопросы

Общая характеристика метаболизма мышечной ткани.
Особенности метаболизма мышечной ткани, характеризующие ее относительную автономию.
Характеристика типов мышечных волокон по механизмам энергообразования.
Особенности метаболизма АТФ в мышечных тканях.
Характеристика и роль специфических белков мышечной ткани (актин G, F, миозин, актомиозин, тропомиозин, тропонины T, C, I и др.)
Роль мышечной ткани в межорганном обмене субстратами.
Теория мышечного сокращения (механизм электромеханического сопряжения).
Особенности сокращения гладкой мускулатуры.
Особенности метаболизма миокарда.
Биохимические механизмы развития сердечной недостаточности.
Биохимическое обоснование лечения сердечной недостаточности. Механизм действия сердечных гликозидов и других кардиотропных средств.
Ограничение двигательной активности (гипокинезия). Основные элементы патогенеза гипокинетического синдрома.
Понятие о гематоэнцефалическом барьере.
Общая характеристика химического состава и метаболизма мозга.
Особенности метаболизма нервной системы (углеводный, липидный, белковый).
Нейромедиаторы, их характеристика и метаболизм.
Биохимические механизмы электрогенеза в нервной ткани.
Механизм синаптической передачи, роль мембран, рецепторов, ферментов и медиаторов.
Особенности метаболизма мозга при гипоксии.
Биохимические механизмы действия на мозг алкоголя, наркотиков (опиоиды, кокаин, ЛСД-25 и др.) и гидрофобных токсических соединений.
Биохимические механизмы развития алкоголизма, наркоманий и токсикоманий.
Общая характеристика и особенности строения соединительной ткани (СТ).
Общая характеристика и особенности метаболизма клеточных элементов СТ.
Характеристика волокнистых структур СТ. Особенности их метаболизма (биосинтез и распад).
Процессинг коллагена в норме и при патологии.
Строение и функции протеогликанов.
Схема биосинтеза гликозамингликанов, их функциональная роль.
Структурная организация межклеточного матрикса.
Неколлагеновые структурные гликопротеиды – фибронектин, его строение, свойства и функциональная роль.
Базальная мембрана, ее строение, свойства и функциональная роль.
Хрящевая ткань, химический состав и особенности метаболизма.
Химический состав, структура и формирование костной ткани.
Метаболизм кости и факторы влияющие на него (витамин D, кальцитонин, паратгормон, соматотропин, эстрогены, андрогены и др.). Механизм минерализации кости.
Зубы, химический состав и особенности метаболизма. Механизм развития кариеса.
Изменение СТ при старении, коллагенозах, заживлении ран. СТ при недостаточности витамина С.

Контрольные вопросы по практическим навыкам по курсу биохимии

Определение активности амилазы по Вольгемуту.
Определение активности АсАТ в сыворотке крови.
Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.
Количественное определение глюкозы в крови орто-толуидиновым методом.
Эмульгирование жиров, механизм.
Количественное определение общих липидов и холестерина в сыворотке крови.
Анализ желудочного сока (определение кислотных фракций).
Качественные реакции на белки.
Количественное определение мочевины в сыворотке крови.
Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом.
Количественное определение витамина C в моче.
Определение гемоглобина в крови.
Количественное определение билирубина в крови.
Определение содержания кальция в моче по методу Сулковича.
Определение патологических компонентов мочи (кровь, глюкоза, белок, кетоновые тела).

ПРИМЕЧАНИЕ

Нормальные величины.

Содержание

6 Биохимия витаминов и гормонов 3

Занятие 24. Витамины 3

Занятие 25. Общая эндокринология. Механизм действия гормонов 13

Занятие 26. Частная эндокринология. Гормоны периферических желез 17

Занятие 27. Контрольное по разделу «Биохимия витаминов и гормонов» 22

7 Биохимия крови, почек и печени 25

Занятие 28. Основы регуляции КОС. Белки крови 25

Занятие 29. Обмен гемоглобина 30

Занятие 30. Биохимия почек в норме и при патологии 38

Занятие 31. Биохимия печени. Обмен ксенобиотиков 54

Занятие 32. Контрольное по разделу «Биохимия крови, почек и печени» 59

8 Биохимия нервной, мышечной и соединительной тканей, миокарда и легких 63

Занятие 33. Биохимия мышечной ткани и миокарда 63

Занятие 34. Биохимия нервной системы 69

Занятие 35. Биохимия соединительной ткани 74

Занятие 36. Контрольное по разделу «Биохимия нервной, мышечной
и соединительной тканей, миокарда и легких». 82

Оглавление

Красный

Желтый

Жёлтый

Синий

Глюкозооксидаза

Глюконовая кислота

Пероксидаза

Коричневый

каневая
жидкость

Клетка канальца

Просвет
почечного
канальца

Глюкоза

Глюкозо-6-фосфат

H2O

H3PO4

АТФ

АДФ

Ацетон

Оранжево-красный комплекс

Нитропруссид натрия

Вишневый комплекс

зеленый

Фосфатаза

-глицерофосфат

Глицерин

1. тематического исследования проблемы методов обучения чтобы приблизиться к ее объективному решению обеспеч
2. Нормы правового регулирования
3. Организация по безопасности и сотрудничеству в Европе ОБСЕ
4. на тему- Основы цифровой печати
5. Сутність, принципи і роль страхування
6. на тему МАНИПУЛЯЦИИ В ОБЩЕНИИ Работу выполнил Студент V курса 12 группы Илизаров К
7. Методические рекомендации по организации и проведению управляемой самостоятельной работы студентов по
8. 2- Не менее 10 МОм
9. МЕТА Фонда Святителя Василия Великого Православный СвятоТихоновский Гуманитарный Университет Олимпиа
10. христианской кончины жизни нашей безболезненной непостыдной мирной и доброго ответа на страшном суде Хри
11. Северная средняя общеобразовательная школа 1 Белгородского района Белгородской области
12. гидросфера Гидросфера имеет огромное значение для жизни и здоровья человечества
13. тематики в 3 классе УМК
14. чистая зона санпропускника для персонала которая состоит из шлюза прихожей холла гардероба
15. Вступление Ермак кто ты Экспедиция Ермака Присоединение Сибири- цели реалии результаты.html
16. Декабристы их цели и программные документы
17. Статья- Синтез и физико-химические свойства магний - алюминиевого сорбента со структурой гидроталькита
18. Тема- Культура і духовне житя України у 19561964 рр
19. Статья- Как мы разбили Хазарский каганат
20. Человек это не слова Человек это поступки Поступки могут быть обыденными заурядными ежедневнообязат

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе