реферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук Одеса ~ 2003.
Работа добавлена на сайт samzan.net:
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
СІВОЛАП Михайло Юрійович
УДК: 616-002.3-08-039.35:615.015:577.217
ФАРМАКОГЕНЕТИЧНІ АСПЕКТИ
ІНТЕНСИВНОЇ ТЕРАПІЇ
ПРИ ГНІЙНО-СЕПТИЧНИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ
14.03.05 - фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Одеса – 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки України,
Чуєв Петро Миколайович, Одеський
державний медичний університет МОЗ України,
завідувач кафедри анестезіології та інтенсивної
терапії з післядипломною підготовкою
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор ФіліповаТетяна Олегівна,
Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова,
професор кафедри мікробіології
доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Бобирьов Віктор Миколайович, Українська медична стоматологічна академія МОЗ України, м. Полтава
завідувач кафедри експериментальної та клінічної фармакології
Провідна установа:
Інститут фармакології та токсикології АМН України
відділ патологічної фізіології, м. Київ
Захист відбудеться 9.07.2003 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України за адресою: 65026, Одеса, Валіховський пров.,2.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університета МОЗ України (м. Одеса, Валіховський пров., 3).
Автореферат розісланий “5” червня 2003 р
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
к. мед.н, ст.н.сп. Соболєв Р.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Для якісної фармакотерапії як основи інтенсивної терапії при гнійно-септичних захворюваннях важливим є своєчасне визначення виду, штаму збудника і його чутливості до тих чи інших антибіотиків. Провідним компонентом у лікуванні цих процесів є антибактеріальна терапія, ефективність якої істотно залежить від фактора часу (Ерофеев В.В., Лирцман И.В., Поликарпова С.В., 1998).
Для вибору ефективних антибактеріальних засобів важлива інформація про найбільш часті збудникі, що розповсюджені у регіоні при визначеній патології, їхньої чутливості до антибіотиків, а також мікроеволюційного процесу зміни характеру патогенної мікрофлори (Cormican, M., Corbett-Feeney G., et al., 1998).
Виділення й ідентифікація збудників гнійно-септичних захворювань у ранній термін є важливим напрямком медичної мікробіології та фармакології. Останнім часом традиційні методи не задовольняють потреби клініцистів, особливо лікарів відділень інтенсивної терапії по швидкості їхнього проведення і точності діагностики. Штами і види мікроорганізмів традиційно реєструються на підставі морфологічних, біохімічних, культуральних, серологічних і інших даних, що забирає тривалий час на підбір найбільш ефективного антибіотика (Карабак В.И., 2000). Тому актуальним є створення і впровадження нових методів експрес-діагностики, що мають визначні переваги перед існуючими (Panlilio A.L., et al., 1992).
Звертають на себе увагу методики, засновані на детекціі специфічних ділянок ДНК мікроорганізмів. Одним з переваг їх є можливість ідентифікації мікроорганізму в латентному стані до прояву клініки захворювання. Розвиток генної інженерії і біотехнології дозволяє проводити диференціацію збудників і досліджувати їхню антибіотикорезистентність (Кресюн В.Й., Бажора Ю.І., Чуєв П.М., Сіволап М.Ю., 2000).
Засоби, засновані на застосуванні полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) відрізняються можливістю одержання інформації за відносно короткі терміни (4-6 годин) і з високою точністю (до 99%) (Антоненко С.В., Кравченко О.Н., Петренко Е.В., 1999). Приділяється увага методам детекції збудників гнійних захворювань, заснованих на ПЛР-аналізі, як найбільш доцільному в практиці, де фактор часу і точності визначення відіграють головну роль.
Необхідність розподілу клінічних зразків патогенів, що розрізняються в реакції на антибіотики в залежності від рівня генетичних взаємин, затребувала створення чи залучення математичного підходу і комп’ютерних програм. Створюються системи реєстрації, основою яких є можливість визначення розбіжностей між видами і генотипами усередині виду з одержанням нелімітованого джерела геномних маркерів (Календарь Р.Н., 1994) .
Вищезазначене формує новий підхід для розробки схем інтенсивної антибактеріальної терапії на основі полімеразної ланцюгової реакції.
Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Робота є частиною програми “Розробка методів діагностики та оцінки ефективності фармакотерапії специфічних та неспецифічних інфекційно-запальних захворювань на основі молекулярно-генетичних і біофізичних технологій” № 0199U000262. Дисертант є співвиконавцем теми.
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було підвищення ефективності інтенсивної антибактеріальної терапії при гнійно-септичних захворюваннях у дітей шляхом розробки нових підходів до визначення антибіотикорезистентності на основі молекулярно-генетичних особливостей збудника. Для досягнення зазначеної мети вирішувалися наступні задачі:
1. Проаналізувати структуру і динаміку зустрічальності по роках збудників гнійно-септичних захворювань у дітей в Одеському регіоні.
2. Дослідити динаміку антибіотикорезистентності збудників гнійно-септичних захворювань. Проаналізувати ефективність методів визначення антибіотикорезистентності збудників.
3. Вивчити особливості застосування ПЛР-аналізу зі специфічними і неспецифічними (довільними) праймерами для визначення штамів, видів патогенної мікрофлори, частоту її зустрічальності і стійкості до антибіотиків.
4. Установити кореляційну залежність між ділянками ДНК поліморфних ампліконів і антибіотикорезистентністю.
5. Створити банк даних по антибіотикорезистентності патогенних мікроорганізмів, що найчастіше реєструються при гнійно-септичних захворюваннях в Одеському регіоні у дітей за допомогою неспецифічних праймерів.
6. На основі даних ПЛР розробити рекомендації з антибактеріальної терапії при гнійно-септичних захворюваннях.
Об’єкт дослідження: визначення особливостей генома Staphylococcus aureus та Staphylococcus epidermidis у зіставленні з їх антибіотико-резистентністю.
Предмет дослідження: фармакогенетичні особливості Staphylococcus aureus та Staphylococcus epidermidis при гнійно-септичних захворюваннях у дітей.
Методи дослідження: клінічні, бактеріологічні, молекулярно-генетичні і біометричні.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на основі полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами розроблено методи проведення раціональної антибактеріальної терапії, створено банк геномних даних антибіотикорезистентності золотавого і епідермального стафілококів. Показана полігенність систем стійкості досліджених бактерій до лікарських засобів. Доведено, що при встановленні кореляційної залежності між генотипом збудника, визначеного за допомогою довільних праймерів, і стійкості до антибіотиків можна розробляти ефективні схеми антибактеріального лікування . Закладено можливість постійного поповнення бази даних як по збудниках, так і по антибіотиках.
Вперше для клінічного експрес-визначення стійкості мікроорганізмів до антибактеріальних засобів застосовані методи молекулярно-генетичної біометрики. Встановлено можливість визначення антибіотикорезистентності за 4-6 годин з точністю до 99% за отриманими даними і на основі спеціалізованих комп’ютерних програм.
Клінічно доведена ефективність використання розробленого підходу до проведення інтенсивної антибактеріальної терапії у дітей при гнійно-септичних захворюваннях.
Практичне значення отриманих результатів. Висока точність (99%), інформативність, швидкість проведення дослідження (4-6 годин), знижена вартість (за рахунок універсальних праймерів) дозволяють рекомендувати розроблений підхід у практиці лабораторій відділень інтенсивної терапії і хірургічних стаціонарів і для загальнокліничних медичних установ. Використання полімеразної ланцюгової реакції в діагностиці дозволяє підтвердити ефективність проведеної терапії, служити критерієм прогнозу захворювання, диференціювати нозокоміальну інфекцію від госпитальної, визначити патогенність мікроорганізму. Розроблений підхід дозволяє підвищити ефективність антибактеріальної терапії, стабілізувати стан хворих, які знаходяться у відділеннях інтенсивної терапії в середньому на 36 годин меньше, ніж ті, що використовують стандартні клінічні методи визначення антибактеріальної резистентності.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений пошук, аналіз літератури за темою дослідження, проведений аналіз структури збудників гнійно-септичних захворювань і динаміки їх антибіотикорезистентності на протязі трьох років, проведений клінічний аналіз груп досліджених хворих, засвоєні методики ПЛР із довільними і специфічними праймерами, засвоєні програми кластерного аналізу, визначена кореляційна залежність між генотипами збудників і антибактеріальною резистентностю.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлені на ІІІ Міжнародному конгресі “Актуальные вопросы инфектологии в акушерстве и гинекологии” (Одесса, 2000), на Міжнародній науково – практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2002). Робота також повідомлена на засіданні Одеського обласного суспільства анестезіологів. Матеріали дисертації використовуються в лікувально-педагогічній практиці кафедри анестезіології та інтенсивної терапії з післядипломною підготовкою Одеського державного медичного університету, в клінічній практиці Одеської обласної дитячої клінічної лікарні.
Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 6 наукових праць, з них 4 статті у журналах, атестованих ВАК України.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 128 сторінках машинопису, містить вступ, 6 розділів, висновки, список використаних джерел (всього 138 бібліографічних описів, з них 37 вітчизняних та російськомовних, 101 іноземних). Робота ілюстрована 24 таблицями, 15 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Об’єктами дослідження є 2248 зразків збудників гнійно - септичних захворювань, які були виделені від 2117 хворих. Відібрано 106 хворих, інфікованих золотавим стафілококом, і 94 пацієнта, інфікованих епідермальним стафілококом, для проведення клінічного аналізу з порівнянням даних ПЛР-аналізу.
Дослідження проведені в діагностичній лабораторії Одеської обласної дитячої клінічної лікарні і відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центра Української академії аграрних наук і Міністерства освіти і науки України. Проаналізовано дані про лікування хворих у зазначений період у відділеннях: анестезіології, реанімації й інтенсивної терапії, реанімації новонароджених і гнійної хірургії Одеської обласної дитячої клінічної лікарні .
Оцінено і проаналізовано дані, отримані після проведення мікробіологічного дослідження з дослідженням антибіотико-резистентності, а також у зіставленні з клінічними діагнозами в динаміці.
Використано середовища: Ендо, Плоскірєва, вісмут-сульфіт агар, селенітовий бульйон, Клиглера, жовточно-солевий агар, стандартні диференційно-діагностичні середовища для родової і видової ідентифікації - НПФ “Симеста – ВААЛ “ (Одеса). Для одержання антибіотикограми використовували метод дифузії антибіотиків з дисків в агар, застосовуючи диски з антибіотиками фірми “Ranbaxy “ (Індія), НПФ “ Симеста – ВААЛ” (Одеса).
У роботі використані штами: Staphylococcus aureus № 285, Соwаn 1 (продуцент протеїну А), ATTC 25923, 209p; Staphylococcus epidermidis № 287, № 286, № 284, і ін., з яких були виділені ДНК; маркери молекулярної ваги pUC Mix; фланкуючі праймери до даних мікроорганізмів, поставлені відділом молекулярної діагностики і генної дактилоскопії Державного наукового центра Російської Федерації “Гос. НДІ Генетика” (Москва).
Довільні праймери
Р-53 5' - GTC TAA GTC G-3'
P-54 5' - GTT AGG AGA C-3'
P-64 5' - CCG GCA GCA AAA TG-3'
синтезовані на автоматичному ДНК-синтезаторі “Applied Biosystems 380B” цианофосфорамидітним методом (Efcavitch G.,1988).
Після забору нативного матеріалу проводили бактеріологічне дослідження. Приготування матеріалу і його дослідження , визначення антибіотикорезистентності здійснювалися за загальноприйнятою методикою (Акатов А.К., Зуева В.С., 1993). Після ідентифікації золотавого і епідермального стафілококів і одержання даних по антибіотикограмі проводився ПЛР-аналіз.
На наступному етапі паралельно проводився забір матеріалу для проведення мікробіологічного дослідження і ПЛР-аналізу. У роботі використаний набір для детекції коагулазопозитивних штамів S. aureus методом ПЛР, заснований на ампліфікації ділянки (3' –повторювані елементи), що знаходиться в частині гена, який кодує позиції 1513-2188 гена коагулази , (олігонуклеотидні праймери з роботи J.V. Hookey et al., 1998). Для детекції S.epidermidis методом ПЛР, використовували діагностичний набір, заснований на ампліфікації видоспецифічної ділянки довжиною 705 п.н. (олігонуклеотидні праймери з роботи F. Martineau et al. (1998). Електрофоретичні профілі ампліфікованої ДНК кожного зразка оцінювали візуально і кодували бінарно; наявність чи відсутність смуги відзначали “1” чи “0” відповідно. На електрофореграмі поліморфні амплікони позначали відповідно довільним праймерам: р64 – А1, А2 і т.д., р53 – Б1, Б2 і т.д., р54 – В1, В2 і т.д.
При розгляді профілів ДНК клінічних зразків визначалася послідовність поліморфних ампліконів із записом формули. Послідовність поліморфних ампліконів кожного зразка порівнювалася з антибіотикорезистентністю. Проводився добір послідовностей поліморфних ампліконів, характерних тільки для стійких до досліджуваного ряду антибіотиків мікроорганізмів.
При побудові дендрограм із клінічними зразками ДНК мікроорганізмів виділялися субкластери. Проводилося порівняння субкластерів з резистентністю до використаних антибіотиків. Порівнювався генотип, характерний для виділених груп, з антибіотикорезистентностю. Для встановлення генетичних дистанцій за даними поліморфізму продуктів ПЛР використовували метод Нея і Лі (1979). Побудову дендрограми генетичних відносин проводили за допомогою програми “TREES” (1994), що містить підпрограму оцінки генетичних дистанцій “D Value” і підпрограму кластерного розподілу “UPGMA” (Unweigted-Pair-Group Method, 1973) . Математична обробка отриманих даних здійснювалася за допомогою ЕОМ. Вірогідністю середніх значень технологічних показників служили параметричні Т (Ст‘юдента) і F (Фишера) критерії. Т- критерій визначався як відношення різниці вибіркових середніх до своєї помилки, а F- критерій як відношення вибіркових дисперсій (1979).
На завершальному етапі, для порівняння ефективності класичних клінічних методів і запропонованого , проведені і проаналізовані курси антибактеріальної терапії в двох групах хворих: перша (19 дітей) – на основі розробленого підходу, друга (20 дітей) – на основі загальноклінічних методів.
Результати досліджень та їх обговорення. Аналіз даних виявлення збудників гнійних інфекцій свідчить про те, що найважливішу роль у розвитку патологічних процесів грають Staphylococcus aureus і Staphylococcus epidermidis , що мають цілий ряд форм із вираженою антибіотикорезистентностю і приводять до важких ускладнень (Горшевикова Э.В., 1999; Neu H.C., 1992 ).
Потреба у створенні точного і швидкого методу визначення збудника і визначення його антибіотикорезистентності індукує розробку цілого ряду діагностичних напрямків у медицині (Тарасов В.Н., 1987; Sasser M., 1997).
Нові методи, засновані на проведенні полімеразної ланцюгової реакції, що перевищує за своїми характеристиками “золотий стандарт”, дозволяють одержати інформацію не тільки про геном мікроорганізму, а, отже, і про такі його властивості, як патогенність і антибіотико-резистентність (Кресюн В.Й., Бажора Ю.І., Сіволап М.Ю.,2000; Марков И.С., Маркова Е.И., 1999).
Усе вищевикладене і визначило напрямок даної роботи, у котрій ми спробували на основі полімеразної ланцюгової реакції підготувати доступний для практичної охорони здоров’я метод визначення антибіотикорезистентності збудників гнійно-септичних захворювань у дітей, що дозволяє підбирати найбільш ефективний антибіотик, проводити моніторинг у процесі лікування.
Проведені дослідження показали, що пацієнти чоловічої статі (67,5%), більш піддані поразці вищезазначеними мікроорганізмами, а жіночого – 32,5%, що говорить про більшу схильність хлопчиків ураженням гнійно-септичного характеру.
Встановлено, що Staphylococcus aureus частіше викликає остеоміеліт (34%), пневмонію (27%), сепсіс (13%). Staphylococcus epidermidis частіше викликає пневмонії (30%), сепсіс (27%), остеоміеліт (13%).
Аналіз розподілу пацієнтів за ступенем важкості при надходженні в стаціонар продемонстрував, що більшість (58% із Staphylococcus aureus і 63% з Staphylococcus epidermidis ) дітей надійшло у важкому стані. У групі з виділеним Staphylococcus epidermidis у 84% пацієнтів відзначалися помірно виражені порушення мікроциркуляторного русла, що значно більше, ніж у групі з виділеним Staphylococcus aureus (19%). Така ж тенденція простежується при дослідженні пірогенної реакції. Гострий початок захворювання відзначався в групі з виділеним Staphylococcus epidermidis частіше (71%), ніж у групі з виділеним Staphylococcus epidermidis (46%). При захворюваннях, викликаних Staphylococcus epidermidis, відзначається більш високий лейкоцитарний індекс інтоксикації, що свідчить про більшу патогенність даного збудника.
Таким чином, Staphylococcus epidermidis є більш патогенним, ніж Staphylococcus aureus. Представляється необхідним досліджувати структуру захворювання в дитячому хірургічному стаціонарі для визначення ролі зазначених збудників, а також генетичні властивості даних мікроорганізмів для розробки ефективних засобів боротьби з ними.
При трирічному зборі й аналізі показників, визнаючих, як часто зустрічаються патогенні мікроорганізми при гнійній патології, відсоток їхньої чутливості до групи антибактеріальних препаратів, показано, що найбільш важливими представниками мікробної флори у відділеннях гнійної хірургії й інтенсивної терапії Обласної дитячої клінічної лікарні є золотавий (38-45%) і епідермальний (10-18%) стафілококи , кишкова паличка (16-19%), синєгнійна паличка (3,3-6%), клєбсіелла (6-9%). Підвищення чутливості до антибіотиків відбувалося за рахунок зниження помірно стійких бактерій, підвищення резистентності – за рахунок збільшення відсотка стійких мікроорганізмів. Зниження стійкості частіше зв’язано з рідким застосуванням антибіотика в попередні роки. Так, чутливість золотавого стафілокока за три роки до оксациліну виросла з 51,6% до 79,5%, до гентаміцину з 39,3% до 61%, до левоміцетину з 15,8% до 81%, до ампіциліну з 31% до 37%. У епідермального стафілокока в цілому відзначене підвищення резистентності до антибактеріальних засобів. Отримані дані можуть бути використані при складанні схем антибіотикотерапиії.
Проведені дослідження показали, що роль золотавого і епідермального стафілококів у розвитку гнійно-септичних поразок у дітей в Одеському регіоні, проблемність визначення ефективних схем антибіотикотерапії заслуговують на пильну увагу.
Для розробки нових підходів, заснованих на дослідженні генома, ми зупинилися на двох напрямках ПЛР: SSRP, що дозволяє точно визначати геном кожного мікроорганізму, указуючи нам на конкретного збудника і RAPD, що дозволяє досліджувати поліморфізм генома кожного індивідуума в зіставленні з його властивостями, зокрема, зі стійкістю до антибіотиків.
Для швидкого, точного й інформативного дослідження великої кількості зразків ДНК збудників гнійних процесів, адекватної статистичної обробки отриманих даних використовувалися математичні системи, реалізовані у вигляді комп’ютерних програм, заснованих на встановленні генетичних дистанцій і кластерного аналізу.
Через те, що видова приналежність детектується за допомогою спрямованих фланкуючих праймерів, що ідентифікують специфічні даному виду фрагменти ДНК - амплікони, були отримані наступні результати: спостерігається значна внутрішньовидова варіабельність між досліджуваними патогенами, що є результатом мінливості генетичних структур. Порівнюючи генотипи з властивостями збудника можливо знайти кореляційні залежності, що дозволяють, розглядаючи визначений геном, говорити про властивості мікроорганізму (табл. 1).
Отримані послідовності поліморфних смуг на електрофореограмі записані як генотип кожного з досліджених мікроорганізмів і зіставлені з антибіотикограмами. Визначено ряд послідовностей ампліконів, характерних для антибіотикорезистентних мікроорганізмів.
Таким чином, створений банк геномних даних золотавого і епідермального стафілококів, що дозволяє за допомогою таблиць або комп’ютерних програм, при внесенні в них генотипів патогена чи антибіотик визначати резистентність мікроорганізмів до визначеного лікарського засобу. Розглядаючи визначені генотипи, можна зробити висновок, що резистентність до досліджуваних антибіотиків у золотавого і епідермального стафілококів носить полігенний характер, а не визначається яким-небудь одним геном до одного антибактеріального засобу. Сукупна генетична інформація про системи захисту від антибактеріальних засобів специфічна для кожного виду мікроорганізмів.
Таблиця 1.
Генотипи мікроорганізмів, які виявляють антибіотикорезистентність
Широко впроваджуються в практику сучасні технології, засновані на аналізі поліморфізму ДНК, систематизації й класифікації мікроогранізмів (Padidam M., Beachy R.N., Fauquet C.M., 1995). Основою створених систем реєстрації є можливість визначення розбіжності між генотипами даного виду й одержання необмеженого джерела геномних маркерів. Порівняльний аналіз генотипів передбачає: одержання інформації про мінливість досліджуваних генотипів по ряду локусів, підрахування генетичних дистанцій на підставі даних по мінливості, побудову дендрограм, заснованих на даних про генетичну подібність і генетичні дистанції.
Наступним етапом дослідження з’явилася систематизація досліджуваних клінічних зразків золотавого і епідермального стафілококів по групах з вивченням їхніх фармакологічних властивостей на основі кластерного аналізу. Виявлено, що клінічні зразки, які відносяться до одного кластеру, мали загальний генотип і однакову стійкість до визначених антибіотиків (табл. 2). Також було відзначено, що вони виділені від хворих, що знаходилися в один відрізок часу в одному відділенні чи надійшли з одного району.
Таким чином, можна запропонувати варіант для класифікації золотавого і епідермального стафілококів, що показує взаємини між генетичними дистанціями і властивостями збудників. Віднесення мікроорганізму до визначеного субкластеру дозволяє проводити лікування, знаючи, який антибактеріальний засіб показано в кожному конкретному випадку. Час проведення аналізу: виділення ДНК, ампліфікація, электрофорез – займає 4-5 годин.
Пропонується два способи детекції приналежності до тієї чи іншої субкластерної групи: 1) після проведення електрофореза профіль ДНК (електрофореограм ампліфікованих фрагментів ДНК, що мають комплементарні ділянки до відповідних праймерів) у вигляді матриці вноситься в комп’ютер до даних дендрограми розподілу охарактеризованих зразків, включається програма ТRЕЕS, даний зразок займає своє місце в одному із субкластерів; 2) по профілю ДНК (картини розподілу продуктів ампліфікації на електрофорезі з урахуванням молекулярної маси) по шаблону визначається наявність компонентів, по яких будується формула генотипу, використовуючи дані таблиці, знаходиться загальний для субкластера генотип і, таким чином, даний зразок відноситься до того чи іншого субкластеру з характерною антибіотикограмою. Загальна процедура підбора антибіотиків, у порівнянні з існуючими, значно скорочується. Пропонується ефективний спосіб вибору антибіотиків, заснований на даних генетичного аналізу мікроорганізму. Ймовірно, можлива диференціальна діагностика між нозокоміальною і позагоспітальною інфекцією, визначення джерела інфікування на основі кластерного аналізу.
Таблиця 2
Характеристика антибіотикорезистентності по субкластерах
Примітка: (-) – дослідження не проводились.
Для оцінки ефективності проведеної антибактеріальної терапії на основі розробленого експрес-методу визначення антибіотико-резистентності було проведено порівняння результатів лікування в контрольній і основній групах на підставі динаміки клінічних і лабораторних показників. У хворих першої групи (19 дітей) визначення збудника й антибіотикорезистентності і визначення антибактеріальної терапії здійснювалося на основі розробленого методу. У пацієнтів другої групи (20 дітей) діагностика збудника проводилася на основі бактеріологічного методу. Пацієнтам першої групи етіотропна антибактеріальна терапія з обліком даних ПЛР-аналізу призначалася через 6-8 годин. Пацієнтам другої групи з моменту надходження призначалася емпірична антибіотикотерапія з наступною корекцією на п’яту добу (контроль антибіотикорезистентності методом дифузії з дисків в агар).
Рис. 1. Регрес клінічної симптоматики при застосуванні різних методик виявлення патогену і його антибіотикорезистентності
1- гіпертермія;
2- тахікардія;
3- гіпотония;
4- задишка;
5- мікроциркуляція;
6 - всього.
Таким чином, аналіз клінічних спостережень і результатів лабораторних досліджень дозволяє зробити висновок про те, що розроблений нами метод визначення антибіотикорезистентності на основі ПЛР-аналиізу з довільними праймерами доцільний у застосуванні лікарями відділень реанімації й інтенсивної терапії, де фактор часу та точності діагностики відіграє ведучу роль. Даний підхід дає можливість ефективніше застосовувати протимікробні препарати й в інших галузях медицини.
Визначено (рис. 1), що стабілізація стану в пацієнтів першої групи відбулася в середньому на 36 годин раніш, ніж у другій групі, необхідність у наступних курсах антибіотикотерапії в першій групі була 36% на відміну від другої (60% хворих). Побічні ефекти внаслідок антибактеріальної терапії в першій групі склали 22%, у другий -51,6% (табл. 3).
Таблиця 3
Характер і кількість побічних ефектів антибактеріальної терапії
в досліджуваних групах
ВИСНОВКИ
У дисертації показане нове вирішення наукової і практичної проблеми, зв’язаної з раннім і точним визначенням антибактеріальної резистентності збудників гнійно-септичних захворювань. Дослідження внутрішньовидового поліморфізму й інтрамолекулярної гетерогенності ДНК збудників гнійно-септичних захворювань у порівнянні з їх антибіотикорезистентностю дозволило розробити новий спосіб, що дозволяє за 4-6 годин, з точністю до 99%, визначити оптимальну схему використання антибіотиків.
1. За даними аналізу, проведеного в мікробіологічній лабораторії, збудниками, що найбільше часто зустрічаються у відділеннях гнійної хірургії й інтенсивної терапії Обласної дитячої клінічної лікарні, є S. aureus (45%) і S. epidermidis (18%), кишкова паличка (16%), синегнійна паличка (6%), клебсієлла (6%). За останні 3 роки в розвитку гнійно-септичних захворювань у дітей спостерігається тенденція до збільшення питомої ваги золотавого (з 38 до 45%) і епідермального стафілококів (з 10 до 18%). Підвищення чутливості вивчених мікроорганізмів до антибіотиків відбувається, в основному, за рахунок зниження кількості помірно стійких бактерій, а підвищення резистентності – за рахунок збільшення відсотка стійких мікроорганізмів. Зниження стійкості, що спостерігається нами, мікроорганізмів до антибіотиків найчастіше зв’язане зі зменшенням частоти їхнього застосування в попередні роки.
2. Застосовані в медичній практиці методи визначення антибіотикорезистентності збудників гнійно-септичних захворювань дозволяють запропонувати новий метод, заснований на використанні полімеразної ланцюгової реакції, що дає можливість за 4-6 годин визначити збудник, його стійкість до антибіотика з вірогідністю до 99%.
3. За допомогою ПЛР-аналізу зі специфічними і неспецифічними праймерами доведена внутрішньовидова специфічність штамів Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, заснована на варіабельності генетичних структур, тобто комбінації ампліконів. Встановлені фактори є базою для пошуку зв’язку між особливостями генотипів (штамів) мікроорганізмів і таких ознак, як патогенність, антибіотико-резистентність і іншими біологічними властивостями збудників гнійно-септичних захворювань.
4. На основі ПЛР-аналізу встановлена кореляційна залежність між визначеними ділянками ДНК і антибіотикорезистентністю збудників гнійно-септичних захворювань. Отримані дані дозволяють підтвердити положення, що стійкість до досліджуваних антибіотиків у золотавого і епідермального стафілококів носить полігенний характер. Сукупна генетична інформація про системи захисту від антибактеріальних засобів специфічна для кожного виду мікроорганізмів.
5. На основі ПЛР- аналізу з неспецифічними праймерами створений банк даних по антибіотикорезистентності золотавого і епідермального стафілококів, що дозволяє раціонально підбирати найбільш активний антибіотик до даних збудників. Розроблена система дозволяє постійно поповнювати базу даних, а також застосовувати її для інших збудників і антибіотиків.
6. За допомогою ПЛР- аналізу розроблені нові підходи до антибактеріальної терапії при гнійно-септичних захворюваннях, що ведуть до значного скорочення процедури підбора антибіотиків (до 4-6 годин), підвищенню ефективності проведеної інтенсивної антибактеріальної терапії.
7. Отримані результати можуть представляти варіант для таксономії золотавого і епідермального стафілококів, що доцільно для заглибленого вивчення збудників гнійно-септичних захворювань.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Сіволап М.Ю, Кресюн В.Й, Бажора Ю.І., Чуєв П.М. Інтрамолекулярна гетерогенність і внутрішньовидова варіабельність ДНК збудників гнійно-септичних захворювань // Одеський медичний журнал. – 2000. - №2(58). – С.11-14 (участь здобувача: вивчення літератури, проведення лабораторних досліджень, аналіз результатів – 85%).
2. Сіволап М.Ю., Чуєв П.М., Бажора Ю.І., Кресюн В.Й., Яблонська О.М. Характеристика збудників гнійно-септичних захворювань, які виявляються у дитячих хірургічних стаціонарах м. Одеси// Одеський медичний журнал. – 2001. - №1(63). – С.46-51 (участь здобувача: збір і аналіз інформації – 90%).
3. Сіволап М.Ю., Чуєв П.М., Бажора Ю.І., Кресюн В.Й. Генетичні аспекти антибіотикорезистентності збудників гнійно-септичних захворювань// Клінічна фармація. – 2001. - Т. 5. №3. - С. 57-61 (участь здобувача: робота з літературою, проведення лабораторних досліджень, аналіз та узагальнення результатів роботи – 60%).
4. Сіволап М.Ю., Чуєв П.М., Бажора Ю.І., Кресюн В.Й. Можливості вивчення фармакогенетичних особливостей стафілококів на основі інтрамолекулярної гетерогенності ДНК// Ліки – 2002. – № 1-2 – С. 28-34 (участь здобувача: робота з літературою, лабораторні дослідження, біометричні дослідження – 70%).
5. Бажора Ю.І., Кресюн В.Й., Чуєв П.М., Сіволап М.Ю. Молекулярно-генетичний підхід до вивчення поліморфізму збудників гнійно-септичних захворювань // ІІІ Міжнародний конгрес “Актуальні питання інфектології в акушерстві і гінекології”, Одеса. – 2000. – С.48 (участь здобувача: робота з літературою, проведення лабораторного аналізу та узагальнення результатів – 80%)
6. Сіволап М.Ю. Сучасні технології при проведенні інтенсивної антибактеріальної терапії //Міжнародна науково-практична конференція молодих вчених “Вчені майбутнього”, Одеса – 2002. – С 126-127.
АНОТАЦІЯ
Сіволап М.Ю. Фармакогенетичні аспекти інтенсивної терапії при гнійно-септичних захворюваннях. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.05 – фармакологія. – Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2003.
Дисертація присвячена проблемі практичної медицини – вивченню спектра збудників гнійно-септичних захворювань у дітей і розробці нових, високо ефективних підходів для визначення антибіотико-резистентності патогенів. Актуальність тематики обумовлена тим, що гнійно-септичні поразки в дітей, що надходять у важкому стані, вимагають визначення найбільш раціональних схем антибактеріальної терапії в ранній термін з високою точністю.
У роботі проаналізований спектр збудників гнійно-септичних захворювань у дітей, зміна їх антибіотикорезистентності. Недоліки методів діагностики і визначення стійкості до антибіотиків збудників гнійно-септичних захворювань індуктували розробку нових підходів, заснованих на використанні полімеразної ланцюгової реакції, що дає можливість за 4-6 годин визначити патоген, його стійкість до антибіотика з вірогідністю до 99%. Автором на основі ПЛР-аналізу встановлена кореляційна залежність між визначеними ділянками ДНК і антибіотикорезистентностю мікроорганізмів.
На основі ПЛР аналізу розроблені нові підходи до антибактеріальної терапії при гнійно-септичних захворюваннях, що ведуть до підвищення ефективності антибактеріальної терапії.
Ключові слова: антибіотикорезистентність, гнійно-септичні захворювання, інтенсивна антибіотикотерапія, полімеразна ланцюгова реакція.
АННОТАЦИЯ
Сиволап М.Ю. Фармакогенетические аспекты интенсивной терапии при гнойно-септических заболеваниях. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Одесский государственный медицинский университет МОЗ Украины, Одесса, 2003.
Диссертация посвящена проблеме практической медицины – изучению спектра возбудителей гнойно-септических заболеваний у детей и разработке новых, высоко эффективных подходов для определения антибиотикорезистентности патогенов. Актуальность тематики обусловлена тем, что гнойно-септические поражения у детей, поступающих в тяжелом состоянии, требуют определения наиболее рациональных схем антибактериальной терапии в ранние сроки с высокой точностью. Разработка новых методов определения характеристик возбудителей заболеваний на основе изучения их генетических свойств позволяет при помощи полимеразной цепной реакции определять устойчивость к антибактериальным препаратам и использовать полученные данные в рутинной практике врача. В работе проанализирован спектр возбудителей гнойно-септических заболеваний у детей, изменение их антибиотикорезистентности. Проведенный анализ показал, что наиболее важными представителями микробной флоры, с которой приходится сталкиваться в отделениях гнойной хирургии и интенсивной терапии Областной детской клинической больницы, являются золотистый (38-45%) и эпидермальный (10-18%) стафилококки, кишечная палочка (16-19%), синегнойная палочка (3,3-6%), клебсиелла (6-9%). Повышение чувствительности к антибиотикам происходило за счёт снижения умеренно устойчивых бактерий, повышение резистентности – за счёт увеличения процента устойчивых микроорганизмов. Снижение устойчивости чаще связано с редким применением антибиотика в предыдущие годы. Показано, что среди возбудителей гнойных инфекций при наиболее тяжелых поражениях важнейшую роль играют золотистый и эпидерамальный стафилококки, имеющие целый ряд форм с выраженной антибиотикорезистентностью и приводящие к тяжелым осложнениям. Анализ преимуществ и недостатков существующих методов диагностики и определения устойчивости к антибиотикам возбудителей гнойно -септических заболеваний позволил предложить новый подход, основанный на использовании полимеразной цепной реакции с произвольными и фланкирующими праймерами в сочетании с биометрическими программами, дающий возможность за 4-6 часов определить патоген, его устойчивость к антибиотику с достоверностью до 99%. Автором с помощью ПЦР-анализа со специфическими и неспецифическими праймерами показана внутривидовая специфичность штаммов Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, основанная на вариабельности генетических структур, то есть комбинации ампликонов. Для быстрого, точного и информативного исследования большого количества образцов ДНК возбудителей гнойных процессов, адекватной статистической обработки полученных данных использовались математические системы, реализованные в виде компьютерных программ и основанные на установлении генетических дистанций и кластерного анализа. Построение дендрограммы генетических отношений проводили с помощью программы “TREES” , которая содержит подпрограмму оценки генетических дистанций “D Value” и подпрограмму кластерного распределения “UPGMA” (Unweigted-Pair-Group Method). На основе ПЦР-анализа и биометрических программ установлена корреляционная зависимость между определенными участками ДНК и антибиотикорезистентностью микроорганизмов. Ввиду того, что видовая принадлежность детектируется с помощью направленных фланкирующих праймеров, идентифицирующих специфические данному виду фрагменты ДНК - ампликоны, были получены следующие результаты: наблюдается значительная внутривидовая специфичность между исследуемыми патогенами, являющаяся результатом вариабельности генетических структур. Сравнивая генотипы со свойствами возбудителя, возможно найти корреляционные зависимости, позволяющие, рассматривая определенный геном, говорить о свойствах микроорганизма. После проведения ПЦР с произвольными праймерами и определения на электрофореограмме полиморфных ампликонов и обозначения их соответственно произвольным праймерам: р64 – А1, А2 и т.д., р53 – Б1, Б2 и т.д., р54 – В1, В2 и т.д., анализировали полученные данные. Полученные последовательности полиморфных полос записаны в качестве генотипа каждого из исследованных микроорганизмов и сопоставлены с антибиотикограммами. Определен ряд последовательностей ампликонов, характерный для антибиотико-резистентных микроорганизмов. Совокупная генетическая информация о системах защиты от антибактериальных средств специфична для каждого вида микроорганизмов. Автором создан банк данных по антибиотикорезистентности золотистого и эпидермального стафилококков, который позволяет рационально подбирать наиболее активный антибиотик к данным возбудителям. Разработанная система позволяет постоянно пополнять информационную базу как по генотипам возбудителей, так и по антибиотикам, а также применять ее для других целей, таких, как определение источника инфицирования, дифференциации между госпитальной и внегоспитальной инфекцией. На основе ПЦР анализа разработаны новые подходы к антибактериальной терапии при гнойно-септических заболеваниях, ведущие к значительному сокращению процедуры подбора антибиотиков, повышению эффективности проводимой интенсивной антибактериальной терапии, сокращению времени пребывания пациента в стационаре, снижению побочных эффектов от проводимого лечения.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, гнойно-септические заболевания, интенсивная антибиотикотерапия, полимеразная цепная реакция.
SUMMARY
Sivolap M.Yu. Pharmakogenetic aspects of intensive care at purulent - septic diseases. - Manuscript.
Thesis on competition of a scientific degree of the kandidat of medical sciences on a speciality 14.03.05 - Pharmacology. – Odessa State Medical University, Ministry of Public Health of Ukraine, Odessa, 2003.
The thesis is dedicated to problem of practical medicine - analysis of a spectrum of exciters of purulent - septic diseases for children and consist new, highly effective approaches for definition antibiotic resistance of pathogens. The elaboration of new methods of definition of the characteristics of exciters of diseases on the basis of analysis of their genetical properties allows with help of polymerase chain reaction to determine rasistance pathogenes to antibacterial drugs and use the obtained data in routine practice of the doctor.
Activity the spectrum of exciters of purulent - septic diseases for children, antibiotic resistance change them is parsed. On the basis of the PCR the correlation between definite sites NA and antibiotic resistance of microorganisms is established. The obtained data confirm, that the resistance to investigated antibiotics for Golden and Epidermal staphylococcuses has polygenic nature. The cumulative genetical information on protective systems from anti-infectives, is specific to microorganisms.
On the basis of PCR analysis the new approaches to antibacterial therapy are designed at purulent - septic diseases leading to considerable reduction a procedures guard rope of antibiotics, authentic increase of efficiency of spent intensive antibacterial therapy.
Keywords: antibiotic resistance, purulent - septic diseases, intensive antibiotic therapy, polymerase chain reaction.
2. Управление тюнером спутникового телевидения.html
3. Отражение и информация как философские категории
4. История стандартизации и сертификации
5. ленивый и бестолковый Бельгийские специалисты из Vcture Poll решили провести исследование посвященное вес
6. АМЕРИКАНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Учебный год 201314 Факультет ПН ПАСПОРТ тестовых заданий
7. ПРАВИЛА ПО ОХРАНЕ ТРУДА ПРИ РАБОТАХ НА ЛИНЕЙНЫХ СООРУЖЕНИЯХ КАБЕЛЬНЫХ ЛИНИЙ ПЕРЕДАЧИ
8. Курсовая работа- Політичне лідерство в Україні
9. Українські січові стрільці
10. Курсовая работа- Порядок назначения и проведения отбора проб и образцов товаров при осуществлении таможенного контроля
11. Лабораторная работа по курсу общей физики
12. транспортных происшествий практически везде покрываются за счет страхования ответственности владельцев а
13. 2 Расчет на прочность сварных соединений выполненных дуговой сваркой Для большинства сварных конструкци
14. вступают являются объектом регулирования различных норм
15. ПАТОГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ НА ОРГАНИЗМ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
16. Предложить лицу сообщающему об угрозе взрыва или проведении иного преступного акта срочн
17. Арон Раймон
18. ТЕМА ПРОФЕССИОНАЛЬНЫЙ ОТБОР ПЕРСОНАЛА План Организация процесса профессионального психологическог
19. Тема- Устный журнал Режим дня
20. О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ И ТЕРРИТОРИЙ ОТ ЧС ПРИРОДНОГО И ТЕХНОГЕННОГО ХАРАКТЕРА