Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
ЛУНЬОВА ГАННА ГЕННАДІЇВНА
РОЛЬ Т-ХЕЛПЕРНОЇ ЛАНКИ ІМУНІТЕТУ
В РЕАКЦІЇ ВІДТОРГНЕННЯ АЛОГЕННОГО
ТРАНСПЛАНТАТА НИРКИ ЛЮДИНИ
14.03.08 - імунологія та алергологія
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Київ –
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано в Інституті урології АМН України
Наукові консультанти: доктор медичних наук, професор Драннік Георгій Миколайович, завідувач лабораторією імунології Інституту урології АМН України
доктор медичних наук, професор Баран Євген Якович, завідувач відділом трансплантації нирки Інституту хірургії та трансплантології АМН України
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Лісяний Микола Іванович, завідувач відділу нейроімунології Інституту нейрохірургії АМН України
доктор медичних наук Базика Димитрій Анатолійович, заступник генерального директора з наукової роботи Наукового центру радіаційної медицини АМН України
доктор медичних наук Самбур Марина Борисівна, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та імунології Інституту отоларингології ім.О.С.Коломійченка АМН України
Провідна установа: Інститут фтизіатрії і пульмонології ім.Ф.Г.Яновського АМН України, лабораторія імунології, м. Київ
Захист дисертації відбудеться 29.01.2004 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті ім.О.О.Богомольця, МОЗ України (010023, м. Київ, вул. Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (м.Київ, вул.Зоологічна, 1)
Автореферат розісланий 11.11.2003 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук С.Г.Свирид
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Завдяки успіхам клінічної трансплантології, в останні три десятиріччя операція пересадки донорської нирки стала загальноприйнятим методом лікування хворих на хронічну ниркову недостатність (ХНН).
Поширення ХНН є дуже значним і становить 100-250 нових хворих на 1 мільйон населення за рік; 2/3 з них за відсутності адекватного лікування вмирають протягом року [Возіанов О.Ф. із співавт., 2000]. Особливість полягає не стільки у високому поширенні захворювань нирок, скільки в тому, що серед хворих переважають особи молодого віку з тривалим латентним перебігом основного захворювання. Термінальна стадія ХНН є основним показанням до трансплантації нирки. Доля пересадженого органа, безумовно, залежить від умов його функціонування в організмі реципієнта. Провідну роль у вирішенні цієї проблеми відіграють питання передтрансплантаційної підготовки реципієнтів з метою створення умов для найкращого приживлення трансплантата й профілактики посттрансплантаційних ускладнень. Основним ускладненням післяопераційного періоду є відторгнення трансплантата, що виникає внаслідок генетично зумовлених антигенних розбіжностей між донором і реципієнтом [Драннік Г.М., 1999].
Імунологічна природа реакції несумісності тканин визначає важливу роль імунологічних досліджень у комплексі заходів, кінцева мета яких –запобігти відторгненню трансплантованого органа. Імунна система розглядається як тонко збалансована сіть імунокомпетентних клітин, які взаємодіють між собою шляхом безпосереднього контакту і з участю розчинних медіаторів. Зміни цього взаємозв`язку при патологічному стані характеризуються імунологічним дисбалансом, тобто кількісним і функціональним дефектом окремих ланок імунної системи і, передусім, Т-лімфоцитів, що мають імунорегулюючі властивості [Ярилін О.О., 1999]. Відомо, що популяція CD4+ Т-лімфоцитів-хелперів складається принаймні з двох субпопуляцій: Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів (Тх1 та Тх2). Різниця між цими двома субпопуляціями полягає перш за все в їхній здатності продукувати різні цитокіни, які, у свою чергу, визначають подальший “сценарій” розвитку імун-ної відповіді: клітинний або гуморальний. Розуміння ролі Т-лімфоцитів-хелперів в реакції відторгнення трансплантата має важливе фундаментальне значення. Крім цього, відповідь на питання “який тип Т-лімфоцитів-хелперів активується і наскільки після пересадки нирки?” має суттєве практичне значення. Вона дозволяє розробити нові підходи до прогнозування реакції відторгнення ниркового алотрансплантату. Проте складність післяопераційного періоду, що вимагає призначення імуносупресивної терапії, зумовлює також інші ускладнення: розвиток пухлинних і значний спектр інфекційних захворювань. Запобігти цим ускладненням або знизити ступінь ризику їх розвитку можливо лише за умови виконання оптимальних протоколів імуносупресивної терапії. У клінічній трансплантології перелік імуносупресивних препаратів розширився до двох десятків. Переважно використовуються сандимун-неорал, програф, селсепт, сиролімус, мізорибін, бреквінар, ОКТ-3 тощо. Використання одночасно двох-трьохкомпонентної і більше терапії з різними точками дії призводить до блокування різних етапів реакції відторгнення, але при цьому немає чітких уявлень про напрямок взаємодії цих препаратів, а саме синергічний, адитивний чи антагоністичний. Експериментальні дослідження “in vitro” взаємодії сучасних імуносупресивних препаратів, а також їхній вплив на функцію Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів і продукцію інтерлейкінів, дозволить оптимізувати підходи до імуносупресивної терапії.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Робота виконувалася в Інституті урології АМН України в межах тем плану МОЗ України: “№ держреєстрації 0193015785; шифр теми 1.12/068 Розробити нові критерії індивідуального підходу до імуносупресії циклоспорином на підставі вивчення продукції й чутливості клітин реципієнта до лімфокінів для поліпшення діагностики і лікування кризу відторгнення ниркового алотрансплантату”, “№ держреєстрації 0198000487; шифр теми ВК.21 Вивчити у хворих з нирковим трансплантатом функцію Т-лімфоцитів-хелперів І та Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу для з`ясування механізмів імуноадаптації реципієнтів до алогенного органа”, “№ держреєстрації 0196013013; шифр теми ВК.13 Розробити наукову методику підготовки реципієнтів, селекції трансплантаційної пари та раціональної терапії хворих у посттрансплантаційному періоді після повторної пересадки нирки”, а також плану Інституту урології АМН України “№ держреєстрації 0101002182; шифр теми ІН.5 Розробити алгоритм формування індивідуальної імуносупресивної терапії для реципієнтів ниркового трансплантата на підставі вивчення механізмів взаємодії сучасних супресантів та їх впливу на функцію Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів in vitro (експериментальні дослідження)”. У всіх цих наукових темах дисертантка була співвиконавцем.
Розроблені методи імуномоніторингу реципієнтів і нові підходи до оптимізації протоколів імуносупресивної терапії впроваджені в практику роботи відділу трансплантації нирки Інституту хірургії та трансплантології АМН України, відділення трансплантації нирки Донецького обласного клінічного територіального медичного об`єднання.
Результати досліджень використовуються в лекціях і на практичних заняттях студентів на кафедрі клінічної імунології та алергології з курсом дитячої клінічної імунології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.
* Велика вдячність співробітникам лабораторії імунології Інституту урології АМН України за допомогу в роботі.
Матеріали та методи дослідження. Клінічний матеріал цієї роботи базується на аналізі історій хвороби 149 пацієнтів, які перебували на лікуванні у відділенні трансплантації нирки Інституту урології та нефрології АМН України у період 1994-2000 р.р., а також даних виконаних досліджень та робіт in vitro. Усі пацієнти перебували на програмному гемодіалізі у зв`язку з термінальною стадією хронічної ниркової недостатності (ХНН). Дослідження функції Т-хелперів І та ІІ типів за продукцією ІЛ-2, ІНФ-g, ІЛ-4 та ІЛ-10 лімфоцитами периферичної крові здійснювали в групі з 66 пацієнтів з термінальною стадією ХНН, яка була зумовлена розвитком хронічного гломерулонефриту у 53 пацієнтів, аномалією розвитку сечовидільної системи і сечокам`яною хворобою у 13 пацієнтів, у двох з 13 мав місце також хронічний пієлонефрит. Групу хворих склали 24 жінки і 42 чоловіки віком 16-54 роки. Всі пацієнти були потенційними реципієнтами і входили до “аркуша чекання” донорського органа. 20 реципієнтам було виконано первісну трансплантацію алогенної трупної нирки на клубові судини, 12 реципієнтам виконано повторну трансплантацію органа. Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб.
Для визначення концентрації інтерлейкіну-10, інтерлейкіну-4 та ІНФ-g ми виконували твердофазний імуноферментний метод з використанням наборів “IL-10, Immunotech” (Франція), “ProCon IL-4” ООО, “Протеїновий контур” (С.-Петербург, Росія) та “Interferon gamma [(h) INF-g] human” фірми “Biotrak”, Amersham Pharmacia Biotech UK Limited) відповідно. Оптичну щільність вмісту комірок визначали за допомогою фотометра для мікропланшет “Stat Fax 303” (США).
Дослідження індивідуальної чутливості імунокомпетентних клітин до субоптимальних і оптимальних доз циклоспорину А проведено в групі 22 потенційних реципієнтів до пересадки алогенної нирки. Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб.
У моделях in vitro вивчалась індивідуальна чутливість імунокомпетен-тних клітин потенційних реципієнтів до субоптимальних (1 мкг/мл) й оптимальних (5 мкг/мл) доз циклоспорину А в реакції бластної трансформації лімфоцитів, яку здійснювали радіометричним методом і виражали як індекс стимуляції (ІС) у відповідь на ФГА і мітоген лаконосу (МЛ – RWM).
Вивчення інтерлейкіну-2-продукуючої функції лімфоцитів реципієнтів до й після алотрансплантації нирки проведено в групі 32 пацієнтів з термінальною стадією ХНН, яких лікували гемодіалізом і яким було виконано пересадку ниркового алотрансплантату. Контрольну групу склали 10 здорових донорів крові.
Для визначення інтерлейкін-2-продукуючої здатності мононуклеарів периферичної крові використано метод, заснований на здатності ІЛ-2 від-новлювати блоковану гідрокортизоном проліферативну відповідь тимоцитів мишей на конковалін-А (КонА). Рівень інтерлейкіну-2 визначали за вклю-ченням Н3-тимідину індикаторними клітинами, зокрема тимоцитами мишей лінії BALB у присутності супернатанту, що містить ІЛ-2. Кількість інтер-лейкіну-2 виражали в одиницях активності (ОД акт/мл) з допомогою пробіт-аналізу. За стандарт використовували рекомбінантний ІЛ-2 (МНТК “Біоген” Інституту біоорганічного синтезу АН Латвії) у концентрації 10 Од/мл.
Дослідження корелятивного зв`язку інтерлейкін-2-продукуючої функції лімфоцитів з експресією рецепторів до ІЛ-2 та антигенів гістосумісності ІІ класу проведено нами в групі 22 потенційних реципієнтів з термінальною стадією ХНН, що чекали на трансплантацію трупної нирки. Контрольну групу у цьому дослідженні склали 20 практично здорових осіб. Визначення кількості клітин, що несуть рецептори до ІЛ-2 та DR-антигенів здійснювали з допомогою методу флюоресцентного аналізу, використовуючи моноклональні антитіла і проточний цитометр FACSCAN (“Becton Dickinson”, США).
Вивчення впливу пептидного комплексу нирок на продукцію ІНФ-g мононуклеарами периферичної крові виконано нами в групі, до складу якої увійшли 14 реципієнтів з термінальною стадією ХНН, 7 реципієнтів у ранньому посттрансплантаційному періоді із задовільною функцією алогенної нирки та 8 волонтерів.
Проводили дослідження дії пептидного комплексу нирок у концентраціях 0,05 мкг/мл та 0,5 мкг/мл на продукцію ІНФ-g лімфоцитами периферичної крові з використанням набору “Interferon gamma [(h) INF-g] human” фірми “Intero, Ltd” та фотометром “Stat Fax 303” (США).
Дослідження спрямованості взаємодії імуносупресивних препаратів in vitro проведено нами в групі 15 хворих з термінальною стадією ХНН і 15 волонтерів.
З цією метою ми використовували рівняння середньої дії, або медіанного ефекту, що описував Chou Т.С., та яке припускає точний підхід до аналізу співвідношення між дозою та ефектом окремих ліків, а також їх комбінацій. Принцип базується на припущенні того, що дія кожних ліків зв`язана з їх дозою у відповідності з рівняннями:
де fa є елементом системи, на який здійснювався вплив, а fu - елемент, на який ліки у дозі D не справили впливу. Dm - доза, яка здійснює 50% впливу (середню дію), аm - коефіцієнт Хілла, що описує сигмоподібність кривої “доза-ефект”.
Розпізнавання лімфоцитами антигенів та обмін сигналами з іншими клітинами імунної системи є умовами прояву активації лімфоцитів –процесу, на якому базуються практично усі імунологічні реакції, прояви імунної відповіді. Передумовою виконання функцій лімфоцитами завжди служить їх проліферація.
Ми аналізували ступінь імуносупресивної дії препаратів на лімфоцити периферичної крові in vitro з урахуванням їх проліферативної відповіді на мітогени –ФГА та анти СД3-моноклональні антитіла.
План експерименту складався з послідовних етапів:
перший –розведення стандартних розчинів обраних нами імуносупресивних препаратів для експерименту;
другий –виділення лімфоцитів з гепаринізованої венозної крові й дослідження ступеня імуносупресії кожної дози препаратів окремо. Для подальшого етапу відбирали ті дози кожного препарату, які призводили до інгібування проліферації лімфоцитів у діапазоні 50-100%;
третій етап –in vitro на лімфоцити одночасно діяли обидва імуносупресивні препарати у тих дозах, які давали рівної сили ефект супресії, потім ми міняли комбінацію доз препаратів для досягнення вираженої імуносупресивної дії, одночасно намагаючись знизити дози препаратів.
Для вимірювання клітинної проліферації ми використали колориметричний метод, заснований на здатності мітохондріальних ферментів живих клітин відновлювати тетразолієву сіль ММТ до ММТ-формазану.
Потім одержані дані використовували у побудові кривих “доза-ефект” для кожного препарату. Для цього на осі абсцис відкладали концентрації в мг/мл, а на осі ординат –рівень інгібіції проліферативної відповіді лімфоцитів (у %), що відповідає кожній концентрації препаратів і розраховується за вказаною вище формулою.
Для того, щоб оцінити дію у сполученні двох препаратів, спочатку ми аналізували ті дози, які окремо справляли однаковий ефект, а потім у різних пропорціях по всьому діапазону доз.
Взаємодію двох препаратів оцінювали коефіцієнтом сполучення КСх:
де сполучені Д1 та Д2 - це дози препаратів першого і другого (1 та 2), необхідні у суміші, щоб справити дію х (це рівень інгібіції), а тільки Д1 та Д2 –це дози тих же препаратів відповідно, необхідні для здійснення такої ж дії х, якщо їх використовувати окремо (не в суміші).
Якщо величина КС не перевищувала 1,0, тобто КС < 1,0, то ми могли припустити, що імуносупресивні препарати справляли при взаємодії синергічний ефект; при КС = 1,0 –адитивний ефект і при KC > 1,0 –антагоністичний ефект взаємодії.
Алотрансплантацію нирки здійснювали з урахуванням сумісності донора й реципієнта за еритроцитарними антигенами, резус-фактором, результатами перехресної проби на лімфоцитотоксичність. HLA-фенотип донора та реципієнта визначали типуванням лімфоцитів периферичної крові з допомогою стандартного мікролімфоцитотоксичного тесту.
Реципієнтам пересаджували нирки від трупних донорів з періодом теплової ішемії від 10 до 45 хвилин. Трансплантат зберігали протягом 8-22 годин за допомогою гіпотермічної безперфузійної консервації розчином інтрацелюлярного типу (розчин Коллінза).
Перед вилученням нирок проводився їх попередній фармакологічний захист в організмі потенційного донора.
У післяопераційному періоді пацієнти одержували трикомпонентну імуносупресивну терапію (ІСТ): циклоспорин А (ЦсА) (сандимун), азатіоприн (Аз), преднізолон (Пр). ЦсА призначали у дозі 7 мг/кг маси тіла на добу перорально відразу після операції. У випадку розвитку олігоанурії дозу ЦсА знижували до 3 мг/кг на добу з наступним підвищенням до вихідних рівнів за відсутності постішемічної гострої ниркової недостатності трансплантата. Надалі дозу ЦсА корегували індивідуально відповідно до показників моніторування концентрації препарату у сироватці крові реципієнтів із розрахунку оптимальної –-250 нг/мл. Преднізолон у першу добу призначали в дозі 1,5-2,0 мг/кг на добу, потім знижували до 0,5 мг/кг на добу, а потім до мінімальних доз, які були б спроможні підтримувати у реципієнтів толерантність до трансплантата. Азатіоприн пацієнти одержували з першої доби у дозі 1,5-2,0 мг/кг на добу з наступним зниженням до 0,5 мг/кг/доба. У період розвитку клінічної картини гострого кризу відторгнення призначали ударні дози імуносупресантів: 250-500 мг/кг на добу метилпреднізолону залежно від кількості лейкоцитів у периферичній крові протягом 3-7 днів. З серпня 1998 року хворим у післяопераційному періоді призначали селсепт у дозі 2 г на добу. Поряд з селсептом до протоколу ІСТ входив сандимун у дозі 6 мг/кг тіла на добу з наступною корекцією дози і преднізолон у початковій дозі 1,5-2,0 мг/кг з поступовим зниженням її до 20 мг на добу у кінці 2 тижня після операції.
В основі діагностики реакції відторгнення ниркового трансплантата були клінічні прояви та лабораторно-інструментальні показники. Найбільш важливими і такими, що часто зустрічаються, були дані: підвищення температури тіла, зниження діурезу, підвищення артеріального тиску, збільшення розмірів й ущільнення трансплантата, зміни в аналізах крові і сечі, а також функціонального стану пересадженого органа, зміни в імунному статусі реципієнта.
Імунологічні дослідження здійснювали 2-3 рази на тиждень: а) протягом раннього післяопераційного періоду; б) у випадку розвитку реакції відторгнення трансплантата; в) на фоні інфекційних і запальних посттрансплантаційних ускладнень; г) також із задовільно функціонуючим алогенним органом через 2, 4 та 6 місяців після операції.
Всі цифрові показники, одержані під час досліджень, оброблялися методом варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента-Фішера. Основною метою таких математичних підходів є оцінка найбільш імовірного значення необхідної величини, визначення помилки обчислення і можливості її появи. Достовірність різниці між показниками, які порівнювалися, визначалася з допомогою критерію Стьюдента. За мінімальний поріг достовірності брали значення p<0,05. Статистична обробка цифрових даних здійснювалася з використанням комп`ютера IBM PC/AT і програм Data Base 4.24; Harvard Graphic 2.3; Fox Graph.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
У роботі відбиті дослідження функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів у реципієнтів ниркового алотрансплантату. Ці дослідження проведені для обгрунтування нашої тактики посттрансплантаційного моніторингу.
* Передусім нами було вивчено інтерлейкін-2-продукуючу здатність лімфоцитів периферичної крові у реципієнтів до і після трансплантації алогенної нирки.
Більшість хворих на термінальну стадію хронічної ниркової недостатності до пересадки мали знижену продукцію ІЛ-2 порівняно з пацієнтами контрольної групи (здорові особи), що обумовлено розвитком уремії. У посттрансплантаційному періоді лише під час розвитку гострої реакції відторгнення відзначена достовірна різниця динаміки рівня ІЛ-2. Так, у групі пацієнтів з кризами відторгнення, що купіруються, і наступною стабільною функцією трансплантата відзначено зниження рівня продукції ІЛ-2 на 35-50% порівняно з фоновим рівнем, і воно відбувалося незалежно від величини показника продукції ІЛ-2 до пересадки. В групі реципієнтів з необоротними реакціями відторгнення рівень ІЛ-2 залишався без змін, а іноді й збільшувався в середньому на 10-20%. Ці дані дозволили нам зробити висновок, що коли у реципієнтів з відторгненням, яке розвивається, після початку антикризової терапії рівень цитокіну не знижувався, то це було ознакою необоротності гострої реакції відторгнення. Причиною цього може бути те, що функція Т-лімфоцитів-хелперів І типу не повною мірою інгібується при проведенні стандартної імуносупресивної терапії з базовим препаратом –циклоспорином А. В механізмі дії останнього головним є пригнічення продукції ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами, при цьому препарат не руйнує імунних клітин. Як і у випадку розподілу пацієнтів на стероїдчутливих і резистентних, ми розподілили потенційних реципієнтів на чутливих і резистентних до циклоспорину А, що важливо для тактики післяопераційної терапії. У ранньому посттрансплантаційному періоді у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата відбувалося зниження продукції ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами на 65% порівняно з доопераційним рівнем. У реципієнтів з оборотними реакціями відторгнення рівень продукції ІЛ-2 залишався майже без змін, тобто таким, як після купірування кризу. Ми визначили, що не існує тісного зв`язку між дотрансплантаційною величиною показника ІЛ-2 та ризиком розвитку гострої реакції відторгнення. Тільки динамічне дослідження рівня продукції ІЛ-2 дає можливість уже в найбільш ранні строки припустити характер розвитку гострої реакції відторгнення (ГРВ) трансплантата.
* Ми також виявили зв`язок між HLA-фенотипом, продукцією ІЛ-2 та експресією ІЛ-2Р+-клітин. У групі хворих, в яких була виявлена продукція ІЛ-2 на 8,8 од.акт. вища, ніж у середньому по групі, і на 8,5 од.акт. вища, ніж у контрольній групі, найбільш достовірно часто зустрічались антигени гістосумісності HLA-А2 (50%), DR7 (50%) та DR2 (64%). У пацієнтів, в яких експресія ІЛ-2Р+-клітин була в 2,2 рази вищою, ніж у середньому по групі, ці антигени зустрічались, але з іншою частотою А2 (50%), DR7 (43%), DR2 (72%). У вісьмох хворих обидва показники були підвищеними й вісім з них мали в HLA-фенотип антиген DR2.
Отже, проведені дослідження дозволили зробити висновок, що у хворих з ХНН у дотрансплантаційному періоді визначається підвищена експресія рецепторів до ІЛ-2, що, за умови високої продукції ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами І типу і наявності в HLA-фенотипі DR2-антигену, може бути фактором ризику гострої реакції відторгнення.
* Ми дослідили також особливості продукції ІНФ-g Т-хелперами І типу у реципієнтів до і після алотрансплантації нирки. Для з`ясування резервних можливостей продукції ІНФ-g лімфоцитами реципієнтів ми здійснювали активацію клітин міногеном –ФГА, після чого визначали рівень продукції ІНФ-g у них.
У групі реципієнтів до алотрансплантації спонтанна продукція ІНФ-g відповідала показникам контрольної групи (26,1+2,2 пг/мл), а індукована була значно нижчою і в 78% обстежених - нижчою за рівень 100 пг/мл, що свідчило про відсутність резервних можливостей Т-хелперів І типу продукувати ІНФ-g. Це можна пояснити впливом уремії у пацієнтів, а також комплексом медикаментозної терапії та лікувальних процедур (гемодіаліз, плазмаферез), які впливають на імунну систему і фактори міжклітинної кооперації. У зв`язку з тим, що ІНФ-g є одним з основних медіаторів ефекторної ланки імунної відповіді на трансплантат, ми віднесли до групи ризику розвитку ГРВ реципієнтів з підвищеними показниками продукції ІНФ-g Тх1-клітинами.
У реципієнтів, що перенесли розвиток гострої реакції відторгнення, незважаючи на ударні дози імуносупресивної терапії (метилпреднізолон у дозі 250-500 мг/кг на добу), спонтанна продукція ІНФ-g зростала більше, ніж удвічі –втричі порівняно з доопераційним рівнем, а індукована, разом з тим, дещо знижувалась –до 44,2+5,6 пг/мл. У реципієнтів, в яких на фоні ударних доз ІСТ рівень спонтанної продукції ІНФ-g становив не вище, ніж 35,1 пг/мл, а індукованої –,2 пг/мл, мали місце оборотні реакції відторгнення, а потім трансплантати функціонували стабільно. Підвищені показники спонтанної продукції ІНФ-g –понад 100 пг/мл, асоціювались з розвитком необоротної реакції відторгнення з наступною трансплантатектомією. ІНФ-g посилює активацію цитотоксичних Т-лімфоцитів і посилює імунну реакцію, що триває, шляхом регулювання експресії як HLA, так і костимулюючих молекул на паренхіматозних клітинах трансплантата й АПК.
Аналізуючи рівень продукції ІНФ-g у хворих у ранньому післяопераційному періоді (1,5-2 місяці) при стабільній функції алогенної нирки, виявили, що спонтанна продукція становила 21,7+1,5 пг/мл, тобто відповідала рівневі контрольної групи й доопераційному рівневі. Показник індукованої продукції ІНФ-g знизився порівняно з результатами, одержаними до пересадки і у період розвитку ГРВ з наступним купіруванням, і становив 32,6+1,9 пг/мл. У пацієнтів при стабільній функції алогенної нирки на фоні підтримуючих доз ІСТ відзначався низький рівень продукції ІНФ-g, що може бути одним з факторів пригнічення факторів відторгнення. Отже, наші дослідження функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І типу підтвердили їхню участь у патогенезі гострої реакції відторгнення трансплантата. Показники імунологічної фази конфлікту дають можливість більш ранньої діагностики ускладнення ще до появи морфологічних критеріїв кризу. Ця обставина дозволяє рекомендувати для імуномоніторингу дослідження продукції Т-хелперами І типу ІЛ-2 та ІНФ-g. На нашу думку, інформативним діагностичним критерієм ГРВ є підвищення спонтанної продукції ІНФ-g у 2-3 й більше разів. Про необоротність імунного конфлікту можуть свідчити доопераційні (фонові) показники продукції ІЛ-2, що зберігаються, і рівень ІНФ-g –пг/мл і понад. Стабільна функція трансплантата характеризується зниженням рівнів ІЛ-2 та ІНФ-g на фоні здійснюваної імуносупресивної терапії.
Нами також виявлено фактор ризику розвитку гострої реакції відторгнення –наявність у реципієнтів у HLA-фенотипі антигену DR2 у поєднанні з вираженими експресією рецепторів до ІЛ-2 та продукцією ІЛ-2 Т-лімфоцитами-хелперами І типу у доопераційному періоді.
** Для того, щоб з`ясувати цитокіновий профіль, який сприяв би зниженню клітинної імунної відповіді, ми дослідили особливості функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу реципієнтів.
** При дослідженні ІЛ-4 продукуючої здатності лімфоцитів у пацієнтів до трансплантації було виділено дві групи: з високим і низьким рівнем секреції цитокіну. У 60% випадків рівень продукції був значно підвищеним і становив 553+62 пг/мл, а індукована стимуляція лімфоцитів ФГА не призводила до посилення їхньої активності і практично не відрізнялась від величини спонтанної –+48 пг/мл (p<0,5). У 40% пацієнтів значення спонтанної продукції ІЛ-4 становили 65+18 пг/мл, а індукованої 78+20 пг/мл (p<0,5). У 2 пацієнтів з 15 ми виявили можливість додаткової продукції ІЛ-4 Т-хелперами ІІ типу у відповідь на мітоген, що визначається як резерв реагування. Коли вичерпані резервні можливості клітин реагувати на додатковий антигенний стимул, то цей факт може розглядатися як сприятливий фактор для успішної трансплантації. Підтвердженням може служити те, що всі ці хворі були виписані із задовільною функцією трансплантата, і лише у двох з високими потенційними можливостями реагування Тх2 клітин відбулася втрата трансплантата.
Ретроспективний аналіз даних після трансплантації у хворих показав, що у передкризовий період (за 5 діб) відзначалася тенденція до збільшення активності як спонтанної, так і індукованої ІЛ-4 продукції, і становили в середньому 8% від показників раннього післяопераційного періоду. У момент клінічної маніфестації гострої реакції відторгнення спостерігалося значне зниження активності Тх2 (p<0,05), про що свідчать низькі рівні ІЛ-4. У випадку, коли у хворого відсутній резерв реагування Тх2 клітин додатковою продукцією ІЛ-4, то криз купірувався, а якщо резерв реагування залишався більшим, то криз купірувати не вдавалося. Ми не могли одержати доказів, що підвищена активність ІЛ-4 до трансплантації передрікає ризик гострої реакції відторгнення алотрансплантату. У той же час на підставі індивідуального аналізу можна відзначити, що збереження високого рівня ІЛ-4 після пересадки порівняно з вихідним є несприятливим фактором і корелює з розвитком необоротної реакції відторгнення.
** Нами було проведено дослідження продукції ІЛ-10 Т-лімфоцитами-хелперами ІІ типу для з`ясування його ролі в патогенезі посттрансплантаційних ускладнень і вдосконаленні тактики післяопераційного моніторингу. У хворих з ХНН відзначено достовірне підвищення спонтанної та індукованої секреції ІЛ-10 Тх2 клітинами порівняно з контрольною групою –,6+21,6 пг/мл та 94,4+14,7 пг/мл (p<0,05). Відзначимо, що у хворих до пересадки в 55% випадків стимуляція клітин мітогеном не призводила до підвищення кількості ІЛ-10, тобто можна припустити відсутність резервних можливостей Тх2 виробляти ІЛ-10.
Отже, високі показники ІЛ-10 у хворих з ХНН свідчать про активацію Тх2, причиною якої, можливо, є багатократні гемотрансфузії. Враховуючи думку, що ІЛ-10 має імуносупресивні властивості, хворі з низькими показниками його продукції можуть входити до групи ризику розвитку гострого кризу відторгнення, а високі цифри можуть свідчити про те, що ці хворі схильні до значної дії імуносупресивної терапії і їм може загрожувати розвиток інфекційних ускладнень.
Дані, що відбивають продукцію ІЛ-10 у хворих у різні періоди після пересадки нирки, свідчать, що на третю добу після операції, за наявності функції ниркового алотрансплантату, рівень спонтанної й індукованої продукції достовірно знизився порівняно з доопераційним –,1+3,2 пг/мл та 52,1+2,6 пг/мл (p<0,05). При індукованій оцінці показників виявили, що різке зниження продукції ІЛ-10 було відзначено у хворих з високими фоновими показниками. В середньому по групі відзначали зниження показника в 1,5-2 рази порівняно з доопераційним рівнем. Можна припустити, що на продукцію ІЛ-10 великий вплив справляє імуносупресивна терапія, механізм дії якої спрямований на пригнічення проліферації Т-лімфоцитів-хелперів. Обстеження хворих під час розвитку гострої реакції відторгнення показало пригнічення спонтанної продукції ІЛ-10, яка в середньому становила 25,6+3,2 пг/мл. Однак при цьому рівень індукованого ІЛ-10 практично не змінився порівняно з показниками у ранньому післяопераційному періоді 44,6+5,3 пг/мл. При маніфестації гострої реакції відторгнення хворим призначали болюсні внутрішньовенні вливання метипреду у дозі 250-500 мг/кг/доба.
У хворих з показниками ІЛ-10, що досягають нормальних величин на фоні ГРВ й ударної імуносупресії (не нижче за 20 пг/мл –спонтанної і 62 пг/мл –індукованої продукції), реакції відторгнення були оборотними, і надалі трансплантат функціонував стабільно. Низькі показники продукції цитокіну –менші від 15 пг/мл –призводили до необоротних реакцій відторгнення. Відомо, що при пересадці нирки основними ускладненнями посттрансплантаційного періоду є інфекційні, які можуть бути причиною летального наслідку реципієнта.
Враховуючи те, що Тх2 відповідають за гуморальний імунітет, нами було вивчено продукцію ІЛ-10 у хворих у період інфекційних ускладнень. З 14 обстежених хворих у 5 відзначені цитомегаловірусна й герпетична інфекції. Аналіз даних показав підвищену продукцію спонтанної та індукованої продукцій ІЛ-10 при інфекційних ураженнях –,8+2,1 пг/мл та 84,8+4,2 пг/мл, які перевищували такі у період гострої реакції відторгнення ниркового трансплантата (p<0,05). Можна припустити, що на фоні імуносупресивної терапії здійснюється блокування Тх1 та активуються лімфоцити Тх2, які відповідають за гуморальну імунну відповідь, спрямовану на пригнічення інфекційних агентів в організмі реципієнта. Враховуючи той факт, що показники продукції ІЛ-10 лімфоцитами Тх2 у період розвитку реакції відторгнення трансплантата і у період маніфестації інфекції достовірно відрізняються, можна використати визначення рівня продукції ІЛ-10 для диференційної діагностики посттрансплантаційних ускладнень і включити до імунологічного моніторингу. Аналізуючи функцію Тх2 у реципієнтів із задовільно функціонуючим трансплантатом через 1,5-2 місяці після операції, напередодні виписки з стаціонару, виявили високі показники спонтанної та індукованої продукцій ІЛ-10 порівняно з групою здорових осіб і фонових значень до пересадки 127,7+10,6 пг/мл та 173,7+12,4 пг/мл (p<0,05) на фоні підтримуючих доз імуносупресантів, що, з нашої точки зору, є проявом спрямованої реверсії імунної відповіді. Разом з тим, привертає увагу той факт, що у частини наших хворих розвинулась реакція відторгнення, що не купірується, на фоні зниженої продукції ІЛ-10. Це свідчить про існування певної частини реципієнтів, чиї Т-лімфоцити чутливі до дії циклоспорину і кортикостероїдів у плані продукції ІЛ-10.
**Ми також вивчали особливості продукції ІЛ-10 у реципієнтів до і після повторної трансплантації нирки. Середній показник спонтанної продукції ІЛ-10 до пересадки становив 102,4+26,2 пг/мл, що порівняно з контрольною групою –,4+5,4 пг/мл –було достовірно вище (p<0,05).
Рівень індукованої продукції ІЛ-10 під впливом продигіозану у реципієнтів до повторної операції перебував у межах від 46,51 пг/мл до 362,63 пг/мл, а середнє значення становило по групі 122,7+64,4 пг/мл, що перевищило цей показник у контрольній групі –,2+9,8 пг/мл. Причому у 47,3% випадків у пацієнтів продукція цитокіну не перевищувала значення 90 пг/мл. Показники індукованої продукції ІЛ-10 свідчать про резервні можливості Т-хелперів ІІ типу секретувати цей цитокін.
Після повторної операції у 12 пацієнтів на фоні трьохкомпонентної імуносупресивної терапії значення спонтанної та індукованої продукції ІЛ-10 становили 24,2+5,3 пг/мл та 39,6+7,1 пг/мл. Ці дані порівняно з доопераційним їх рівнем були достовірно нижчими (p<0,05). Оцінка індивідуальних показників продукції ІЛ-10 визначила варіабельність значень, однак у деяких реципієнтів були виявлені особливості, які визначалися зростанням рівнів продукції ІЛ-10 у 4-5 разів порівняно з доопераційним рівнем. При розвиткові гострого кризу відторгнення трансплантата спостерігалося відносне зниження (р=0,05) показників спонтанної та індукованої продукції ІЛ-10 відносно їх доопераційного рівня, так і значень продукції цитокіну у пацієнтів із задовільною функцією трансплантата. Отже, проведені нами дослідження функціональної активності Т-хелперів ІІ типу у пацієнтів з термінальною стадією ХНН перед пересадкою алогенної нирки виявили високий рівень продукції ІЛ-4 на фоні зниженої здатності Тх2-клітин продукувати цей цитокін у відповідь на додатковий антигенний стимул. Продукція ІЛ-10 у пацієнтів з ХНН була достовірно вищою за показники в групі здорових осіб, що свідчить про пригнічення ситнезу цитокінів Тх1-клітин, зниження активності макрофагів, в тому числі продукції запальних цитокінів.
У посттрансплантаційному періоді збереження у реципієнтів високих показників активності ІЛ-4 і зниження рівня ІЛ-10 нижче, ніж 20 пг/мл на фоні здійснюваної пульс-терапії глюкокортикоїдами, є прогностично несприятливими факторами для трансплантованого органа в плані неефективного купірування реакції його відторгнення. Показники продукції ІЛ-10 вищі, ніж 100 пг/мл, визначались у реципієнтів зі стабільно функціонуючим трансплантатом, що розглядалося нами як фактор, що сприяє розвиткові толерантності до пересадженого органа. Нами також виявлено достовірну відмінність рівня продукції ІЛ-10 у період розвитку реакції відторгнення трансплантата і при маніфестації інфекційного процесу. Наведені дані дозволяють рекомендувати дослідження функціональної активності Тх2-лімфоцитів у посттрансплантаційному моніторингу реципієнтів.
Ё Вирішити проблему імуноадаптації реципієнта можливо при використанні оптимального й індивідуального протоколу імуносупресивної терапії. Останнє десятиріччя відзначається арсеналом імуносупресивних препаратів, який все більше розширюється.
Перед початком виконання трансплантації нирки у спеціалістів виникають надзвичайно важливі питання:
- який протокол імуносупресивної терапії буде здійснюватися після операції і на якій підставі прийнято рішення?
- як запобігти ускладненням, що є наслідком інтенсивної імуносупресії, і як продовжити максимально виживання як реципієнта, так і трансплантата?
Багатоманітність наявних імуносупресивних препаратів для використання в клінічній трансплантології дозволяє зробити значні перестановки в імуносупресивних протоколах. Центри частіше лояльні до своїх власних протоколів, які часто розробляються в результаті місцевого досвіду. Внаслідок того, що зростання гострого відторгнення виникає у перші дні, тижні й місяці після трансплантації (фаза індукції) і знижується після цього (фаза підтримування), імуносупресія має бути оптимально зваженою у цей ранній період. Для довгострокового лікування, як правило, знижують дози препаратів. Найбільш небезпечні побічні ефекти імуносупресії: гостра реакція відторгнення органа, нефротоксичність препарату, розвиток інфекційного процесу й утворення злоякісних новоутворень. Наявність безлічі потужних імуносупресивних препаратів іноді спокушає лікарів-практиків на використання комбінацій небезпечної кількості багатьох із них. У цій ситуації необхідно на одну чашу ваг покласти механізм дії кожного препарату та його здатність знижувати частоту епізодів кризів відторгнення, а на іншу чашу –економічну ефективність курсу лікування. Імуносупресія повинна підлягати моніторингові й розглядові на всіх стадіях посттрансплантаційного лікування.
У наш час у створенні імуносупресивного протоколу передусім вирішується питання: який препарат з групи інгібіторів кальцинейрину для конкретного хворого буде в протоколі базовим препаратом? Інакше кажучи, необхідно віддати перевагу циклоспорину (сандимуну-неоралу) або такролімусу (прографу). Ці препарати становлять основу сучасної трансплантаційної імуносупресії.
Друге питання при складанні протоколу стосується вибору “додаткового препарату”. “Додатковими” називають ті препарати, які використовуються в поєднанні з інгібітором кальцинейрину для посилення дії імуносупресивного протоколу, що визначається зниженням частоти епізодів гострого відторгнення. В деяких центрах який-небудь додатковий препарат використовують з метою профілактики, починаючи відразу ж після операції, а інші центри використовують їх лише у випадку розвитку кризу відторгнення. У більшості центрів азатіоприн замінили на селсепт через його здатність скорочували кількість епізодів кризу відторгнення. Азатіоприн, як і селсепт, є антиметаболітами й інгібують метаболізм пурину, але селсепт робить це більш вибірково, через інгібування ферменту –інозин-монофосфат-дегідрогенази.
Ми розробили нові у вітчизняній трансплантології напрямки оптимізації імуносупресивної терапії, засновані на експериментальних дослідженнях.
Ё На першому етапі досліджень у моделях in vitro вивчалися проліферативна відповідь та експресія HLA-DR-рецепторів імунокомпетентних клітин реципієнтів під впливом субоптимальних -
мкг/мл (1у) та оптимальних –мкг/мл (5у) доз ЦсА.
Дослідження експресії HLA-DR-антигенів на В-лімфоцитах продемонструвало, що цей показник у межах норми. Якщо у здорових донорів цей показник становив 7,92+1,3%, то у хворих з ХНН –,54+0,9%. Слід підкреслити, що індивідуальний аналіз продемонстрував коливання рівня вираженості антигенів ІІ класу на В-клітинах. Так, у деяких хворих відзначено дуже низьку експресію –,09% (Л-за), 1,52% (Я-ко), 1,80%
(С-к), в інших –дуже високу: 16,87% (Т-к), 27,93% (П-ря), 31,71% (Б-ль).
Вивчення представництва DR-антигенів на Т-лімфоцитах показало, що цей рівень також не відрізнявся як від норми (до 5%), так і від показників у групі здорових донорів, і становив відповідно 5,55+0,66% та 4,43+0,98% (p>0,05). Дослідження останніх років засвідчили, що за певних умов активовані Т-лімфоцити здатні експресувати ці HLA-DR антигени. Більшість авторів визнали, що 5% Т-клітин DR-позитивні, і це у наступному нашому аналізі прийнято за “норму”. Медуніцин Н.В. та співавтори навіть вважають, що DR+ Т-клітини (з коливаннями 3-12%) можуть бути антигенпредставляючими, поряд з такими, що не належать до розряду імунокомпетентних, як ендотеліальні клітини. Можна зробити висновок про те, що активація Т-клітин у хворих перед алотрансплантацією нирки не виходить за межі припустимої норми.
Активація В-лімфоцитів, що визначається за числом Leu 23-клітин, у хворих з ХНН була підвищеною. Якщо в нормі цей показник звичайно не повинен перевищувати 5%, то у потенційних реципієнтів він становив 8,59+4,2%, а у здорових донорів 2,29+0,83% (p<0,05). Відзначено коливання цього показника від 1,96 до 21,80%.
Отже, дослідження з допомогою моноклональних антитіл продемонстрували, що рівень експресії антигенів гістосумісності ІІ класу й активації Т-лімфоцитів у потенційних реципієнтів, що чекали на пересадку нирки, не відрізняється від норми, тоді як має місце підвищення ступеня ранньої активації В-лімфоцитів, що несуть Leu 23-антигени.
Нами вивчався вплив циклоспорину А на проліферативну активність клітин і ступінь експресії DR-антигенів. Дослідження з вивчення реакції бластної трансформації (РБТ) у відповідь на мітогени показали, що середній рівень індексу стимуляції на ФГА у хворих з ХНН становив 1,9+0,6, на МЛ –,6+0,7, що значно нижче, ніж рівень у здорових осіб (3,8+0,3). Індивідуальний аналіз даних виявив значну варіабельність показників від 0,87 (А-ко) до 3,2 (К-ка, П-на, Ш-ук) на ФГА й від 1,0 (Б-с) до 5,0 (Р-ко) на МЛ. Відзначено, що у 50% обстежених ІС у відповідь на мітогени був нижчим за 1,5, що свідчить про зниження проліферативної активності лімфоцитів у хворих. Під час аналізу даних з використанням моделей in vitro з ЦсА (1у та 5у) показано, що у 88% випадків відзначався інгібуючий ефект на проліферацію клітин. Як слід було чекати, субоптимальна доза ЦсА викликала менш виражену супресію лімфоцитів з використанням обох мітогенів. Рівень супресії від вихідного становив у середньому 20-30%. Використання оптимальної концентрації препарату дало ефект більш вираженого характеру, досягаючи 70-80% інгібіції. Порівняльний аналіз даних показав, що виражене пригнічення РБТ було відзначено у хворих з вихідним високим показником ІС і спостерігалося у 51% обстежених. Екзогенний ЦсА пригнічує ДНК-РНК транскрипційний процес і у такий спосіб впливає на проліферативний механізм Т-клітин. Вважаємо, що названих вище хворих можна віднести до групи низького ризику розвитку відторгнення після трансплантації, оскільки у цих потенційних реципієнтів спостерігається висока чутливість Т-клітин до імуносупресії препаратом. Можливо, хворим з високими фоновими рівнями необхідно призначати ЦсА за кілька днів до пересадки нирки і, таким чином, запобігати розвиткові реакції відторгнення. Важливо відзначити, що 37% хворих з ХНН мали низький відсоток супресії на ЦсА (близько 30%), і фонові показники ІС були дуже низькими (нижчими за 1,2). Мабуть, у цьому випадку має місце виснаження резервних можливостей Т-клітин, оскільки на фоні слабкої відповіді Т-клітин на мітогени, зумовленої імуносупресією, викликаною уремією й лікувальними заходами (гемодіаліз, гемотрансфузії, гемосорбція тощо), ефект інгібіції ЦсА не виражений.
З одного боку, цих потенційних реципієнтів можна віднести до групи невисокого ризику розвитку відторгнення після пересадки нирки, з другого –послаблення імунної системи до операції і стандартна (тобто не індивідуалізована) імуносупресивна терапія в посттрансплантаційному періоді можуть створити несприятливий фон для розвитку інфекційних ускладнень і загибелі хворих.
Нами виявлено, що у 2 хворих з 22 обстежених в системі in vitro відзначений ефект, зворотний тому, на який чекали, тобто після додавання ЦсА (1у та 5у) була відзначена стимуляція РБТ на мітогени. Так, у хворого М-на стимуляція була вищою за вихідну на 14%, у Б-ус –%. Мабуть, таких хворих можна віднести до розряду нечутливих до ЦсА. Ці результати викликають припущення про те, що, як у випадку розподілу хворих на гормон-чутливих і гормон-резистентних, можна розподілити потенційних реципієнтів на чутливих або резистентних.
Індивідуальний аналіз засвідчив, що у деяких хворих під впливом ЦсА відбулося суттєве зниження експресії DR-антигенів з 16,55 до 8,2 (К-ко), з 10,4 до 4,56 (А-в), з 31,71 до 0,11 (Б-ль), з 16,87 до 3,06 (Т-к), з 13,05 до 4,05 (Т-ва). В окремих хворих була відсутня реакція імунокомпетентних клітин на ЦсА в умовах in vitro. Проте частіше це були хворі, в кого експресія антигенів ІІ класу на імунокомпетентних клітинах була невисокою.
Вважаємо, що дослідження рецепторного апарату клітин у динаміці дії ЦсА в умовах in vitro продемонструвало позитивну дію препарату на експресію HLA-антигенів, бо відзначено зниження їх високого рівня, що є фактором ризику розвитку більш вираженої реакції відторгнення.
Одержані дані продемонстрували різну чутливість хворих з ХНН до алотрансплантації до циклоспорину А. Виявлено ЦсА-чутливих (88%) і ЦсА-резистентних (12%) потенційних реципієнтів на підставі проліферативної активності Т-лімфоцитів на мітогени, що становить важливий момент при індивідуальному тестуванні хворих щодо чутливості до препарату перед пересадкою і при подальшій імуносупресивній терапії у постранплантаційному періоді.
Ё Для оптимізації протоколів імуносупресивної терапії, які включають комбінацію кількох препаратів, ми досліджували спрямування імунофармакологічної взаємодії препаратів.
Відмітною особливістю пропонованого підходу є спроба створення індивідуального протоколу імуносупресивної терапії для кожного реципієнта з урахуванням оптимальних комбінацій препаратів та їх доз. Це досягається внаслідок експериментальних досліджень проліферативної активності і цитокінової продукції лімфоцитів реципієнтів під впливом in vitro імуносупресивних препаратів. У перших експериментах ми зупинили свій вибір на сандимуні-неоралі і дексаметазоні. Сандимун є базовим препаратом у сучасних протоколах імуносупресії клінічної трансплантології, а дексаметазон –препарат кортикостероїдного ряду, який використовується для посилення дії першого. Комбіноване використання цих двох препаратів дозволило призначити їх у меншому дозуванні з одержанням того ж імуносупресивного ефекту. Цей емпіричний факт підтверджено тривалим клінічним досвідом. Ми ж використали цю комбінацію препаратів для підтвердження слушності підходів у визначенні спрямованості взаємодії імуносупресивних препаратів. Сандимун (циклоспорин А) є циклічним поліпептидом і має здатність специфічно пригнічувати початкові етапи активації Т-клітин, що призводить до зниження продукції цитокінів, а саме інтерлейкіну-2 (ІЛ-2), і у такий спосіб перешкоджає визріванню специфічних Т-кілерів (СD8+-клітин). Сандимун-неорал відрізняється від сандимуну більш вираженою прямо пропорційною залежністю ефекту циклоспорину від його дози і більш постійним профілем абсорбції. У зв`язку з цим сандимун-неорал знайшов широке застосування у клінічній трансплантології.
Дексаметазон є синтетичним глюкокортикостероїдом. Відзначається високою активністю, більш тривалою дією. Препарат характеризується вираженим імуносупресивним ефектом, що досягається гальмуванням продукції ІЛ-1 та ІЛ-2, а також зниженням експресії продуктів головного комплексу гістосумісності на мембрані лімфоцитів.
Для приготування стандартних розчинів сандимуну-неоралу за розчинник використовували суміш етанолу і твіну 80 у співвідношенні 80%:20%. Розчинюючи капсулу 100 мг сандимуну-неоралу в 1 мл вказаної суміші, одержували концентрацію препарату 100 мг/мл. Наступні концентрації: 50 мг/мл, 25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 6,25 мг/мл, 3,125 мг/мл,1,56 мг/мл –одержували шляхом розведення живильним середовищем RPMI-1640.
Концентрації дексаметазону: 4 мг/мл, 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл –одержували також шляхом розведення живильним середовищем RPMI-1640 одного мл ампульного розчину, який містить 4 мг дексаметазону фосфату у вигляді натрієвої солі.
Здатність дексаметазону й сандимуну-неоралу інгібувати проліферацію трансформованих лімфоцитів, стимульованих ФГА, широко варіювала серед волонтерів та реципієнтів. З 15 лише у 3 волонтерів мали місце єдині корелятивні зв`язки. У решти відзначалася виражена індивідуальна відповідь на дози препаратів окремо і в суміші. Це, на наш погляд, пов`язано з використанням волонтерами та реципієнтами різних фармакологічних препаратів, які могли вплинути на індивідуальну чутливість лімфоцитів.
Ми виявили виражену синергічну комбіновану взаємодію між дексаметазоном і сандимуном-неоралом у співвідношенні 1 мг/мл до 12,5 мг/мл і 2 мг/мл до 12,5 мг/мл, при цьому КС мав значення від 0,38 до 0,75 внаслідок інгібіції проліферативної відповіді в діапазоні 87-90%.
Використання синергічного ефекту між імуносупресивними препаратами дозволяє зменшити дозу, тим самим зменшуючи токсичність, але зберігаючи одночасно біологічний ефект –ефект імуносупресії.
Математичний розрахунок коефіцієнта сполучення можна застосувати до імуносупресивних препаратів, і при його розрахунку ми дійшли важливого висновку, що взаємодія сандимуну-неоралу з дексаметазоном може мати синергічний ефект.
Цікаво, що ці висновки співвідносяться з існуючим клінічним досвідом: кортикостероїди посилюють ефект сандимуну. Дані, одержані in vitro і статистично оброблені, можуть мати клінічні екстраполяції і служити для оптимізації імуносупресивної стратегії. Вважаємо за можливе робити якісь висновки лише за умови індивідуального дослідження проліферативної відповіді лімфоцитів кожного індивідуума при дії імуносупресивних препаратів окремо та в їх комбінації.
Ё Хоча користь від циклоспорину була незаперечною, невдовзі клініцисти визнали, що йому властива здатність викликати як гостру, так і хронічну нефротоксичність. Остання обставина примусила дослідників ввести додатково до протоколів імуносупресивної терапії мікофенолат мофетил. У клінічних випробуваннях він давав однакове виживання пацієнта і трансплантата і був ефективнішим додатковим препаратом, ніж азатіоприн, завдяки своїй здатності скорочувати частоту епізодів кризу відторгнення, якщо його використовувати з циклоспорином.
Новий препарат селсепт (Cell-Cept), який є морфоліно-етиловим ефіром мікофенолової кислоти і пригнічує утворення пуринів за рахунок інгібіції іонозин-монофосфат-дегідрогенази, а також експресію адгезивних молекул, що призводить до блокування проліферації Т і В-лімфоцитів, продукції антитіл і генерації цитотоксичних Т-лімфоцитів. Азатіоприн і селсепт є антиметаболітами й інгібують метаболізм пурину, але селсепт робить це більш вибірково шляхом інгібування ензиму іонозину-монофосфатдегідрогенази. Селсепт показаний для профілактики і лікування гострої реакції відторгнення трансплантата.
З серпня 1998 року у відділенні трансплантації нирки Інституту урології і нефрології АМН України розпочато застосування селсепту в групі хворих після трансплантації нирки. Препарат було призначено 18 хворим з первинним нирковим трансплантатом у дозі 2 г/доба. Всі хворі поряд з селсептом одержували імуносупресивну терапію сандимуном у дозі 6 мг/кг маси тіла на добу з наступною корекцією оптимальної дози препарату в крові (200-300 нг/мл), а також преднізолон з початковою дозою 1,5-2 мг/кг з постійним зниженням її у кінці 2-го тижня до 20 мг на добу. При розвиткові гострої реакції відторгнення призначалася пульс-терапія метилпреднізолоном по 250-500 мг/доба протягом 3-7 днів. Результати проведеного дослідження показали, що включення селсепту до схеми трикомпонентної імуносупресивної терапії замість азатіоприну дозволило зменшити частоту кризів відторгнення трансплантованої нирки з 63,6% до 36,4%. Заміна азатіоприну селсептом стала ефективним засобом лікування ранніх кризів, які були рефрактерними до болюсних введень глюкокортикоїдів.
Для більш обгрунтованих висновків знадобилися подальші дослідження цієї проблеми. Нас цікавила ситуація, що мала місце у реципієнтів, в яких не вдалося купірувати криз відторгнення. На нашу думку, одним із головних напрямків для вирішення цього питання було вивчення спрямованості взаємодії сандимуну з селсептом на проліферативну відповідь лімфоцитів конкретного реципієнта. Метою дослідження було вивчення in vitro спрямованості взаємодії сандимуну-неоралу з селсептом на проліферативну реакцію, стимульовану ФГА, лімфоцитів волонтерів та реципієнтів.
Капсулу селсепту 250 мг розчиняли в суміші 0,1 мл диметилсульфоксиду і 0,9 мл середовища RPMI-1640, одержували концентрацію препарату 250 мг/мл. Концентрації 125 мг/мл, 62,5 мг/мл, 31,25 мг/мл, 15,63 мг/мл, 7,8 мг/мл, 3,9 мг/мл, 1,95 мг/мл –одержували шляхом розведення стандартного розчину препарату живильним середовищем RPMI-1640. Аналізувався ступінь імуносупресивної дії препаратів та їх комбінації на лімфоцити з допомогою реакції бласттрансформації лімфоцитів периферичної крові на ФГА. Концентрації препаратів, що призводили до 50% інгібування проліферативної відповіді лімфоцитів на ФГА, варіювали у діапазоні: для сандимуну-неоралу –-100 мг/мл; для селсепту –,25-250 мг/мл. При індивідуальному аналізі волонтерів та реципієнтів ми розподілили їх на три групи за ступенем вираженості інгібіції проліферації лімфоцитів. Коли досліджували дію двох препаратів у сполученні, то до аналізу були включені препарати у рівноцінних і різних пропорціях по всьому діапазонові доз. Ми детально аналізували ті результати взаємодії in vitro сандимуну-неоралу і селсепту, які свідчили про рівень інгібіції проліферації лімфоцитів, стимульованих ФГА, в діапазоні 50-100%. У десяти випадках комбінації доз препаратів рівень інгібіції проліферативної відповіді становив від 62% до 90%. При розрахунку коефіцієнта сполучення (КСх) у трьох випадках він становив 1, що відбивало адитивність взаємодії сандимуну-неоралу і селсепту.
Всі інші шість випадків комбінації досліджуваних препаратів призводили до ефекту антагонізму, що підтверджував коефіцієнт сполучення –понад 1.
Сандимун-неорал демонстрував з селсептом ефект взаємодії: cинергічний –%, антагоністичний –%, адитивний –%. Проте виявлення певних доз препаратів, які давали б синергічний або адитивний ефекти у комбінації, вимагає індивідуального аналізу дії на лімфоцити кожного волонтера або реципієнта.
Результати вивчення спрямованості взаємодії сандимуну-неоралу і селсепту in vitro дають підстави для розуміння можливого індивідуального клінічного ефекту селсепту як “додаткового”препарату з метою профілактики гострого кризу відторгнення ниркового трансплантата.
Ё У трансплантаційних центрах 70% імуносупресивних протоколів засновані на циклоспоринові, а решта –на такролімусі (прографі). Однак програф може бути використаний у випадках трансплантації нирки як додаток до препаратів для купірування відторгнення у пацієнтів з двома та більше епізодами, незважаючи на терапію циклоспорином. У деяких реципієнтів виникає мутація циклофіліну, який або не може зв`язати циклоспорин А, або після зв`язування його не може деактивувати кальцинейрин. Диференційна експресія й активність циклофіліну і зв`язуючого FK506 протеїну –імунофіліну –є підставою для застосування FK506 у пацієнтів, які не реагують на циклоспорин-А-терапію. Використання препаратів з токсичним ефектом у протоколах імуносупресивної терапії може бути оптимізоване сполученням ліків, що діють синергічно при низьких дозах. Потенційною перевагою цих протоколів є те, що вони могли б зберігати імуносупресивну ефективність, зводячи, водночас, до мінімуму коротко- і довготривалу нефротоксичність. Для застосування конкретних сполучень препаратів обов`язковим є дослідження фармакологічної взаємодії імуносупресивних препаратів in vitro. Ці завдання ми реалізували у відношенні сандимуну-неоралу та прографу. Ми вивчили ступінь інгібіції проліферативної відповіді лімфоцитів на мітогени –ФГА й анти-СD3-моноклональні антитіла і продукції інтерлейкіну-2 при взаємодії сандимуну-неоралу і прографу in vitro.
Капсулу прографу –мг розчиняли в метанолі і потім концентрацію препарату 1 мг/мл розводили комплексним живильним середовищем, одержуючи концентрації препарату: 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,063 мг/мл. Сандимун-неорал і програф продемонстрували різні криві, що відбивають рівень інгібіції проліферації лімфоцитів при дії різних доз вказаних препаратів. Стимуляцію проліферативної відповіді здійснювали з використанням двох мітогенів: фітогемаглютиніну й анти-СD3-моноклональних антитіл. При цьому характер кривих “доза-ефект” прографу мав більш пласку криву при стимуляції проліферації як ФГА, так і анти-СD3. За таких же умов крива “доза-ефект” сандимуну-неоралу була більш гіперболічно вираженою.
Інгібіція проліферативної відповіді на ФГА у діапазоні 50-85% досягалася кількома дозами прографу: 1 мг/мл та 0,5 мг/мл. Сандимун-неорал у дозах 100 мг/мл робив пригнічення проліферативної відповіді на ФГА у діапазоні 80-99%, а решта доз препарату призводили до ефекту інгібіції у межах 32-45%.
Ці дані також підтверджено після логарифмічного перетворення рівняння середнього ефекту.
Сандимун-неорал і програф продемонстрували помітно відмінні коефіцієнти зниження лінії (m) після стимулювання ФГА та анти-СD3.
Прографові властива набагато більша ефективність, ніж сандимуну-неоралу для досягнення 50% інгібування: дози прографу були втричі меншими, ніж сандимуну-неоралу при стимулюванні проліферативної відповіді ФГА і в 300 разів меншими при стимулюванні анти-СD3-моноклональними антитілами.
Експерименти з двома препаратами виконувалися з метою вивчення здатності сполучень сандимун-неорал/програф інгібувати проліферацію лімфоцитів.
Якщо ефекти інгібування нижчі за 40%, спостерігався синергізм, а у клінічно значущому діапазоні інгібування –-95% - між прографом і сандимуном-неоралом існував стійкий антагонізм. Необхідно відзначити, що під час численних досліджень проліферативної відповіді лімфоцитів під впливом різних імуносупресивних препаратів дослідники встановили оптимальний діапазон інгібіції 55-95%, при якому чітко виражений клінічний ефект будь-яких імуносупресивних препаратів. А рівень інгібіції менший за 50% викликає, як правило, сумнівний клінічний ефект. Отже, більшу увагу ми приділили тим дозам препаратів, які у сполученні давали клінічно значущий діапазон інгібування: 55-95%. Так само, в умовах активації анти-СD3, різні пропорції сполучення сандимуну-неоралу і прографу продемонстрували менше інгібування, ніж передбачалось ефектом змішування (додатковим) кожного препарату окремо. Аналіз середнього ефекту показав антагонізм по всьому діапазону інгібування.
Окремо програф і сандимун-неорал інгібували продукцію ІЛ-2 дозозалежним способом у межах вузького діапазону доз.
Програф давав 50% інгібування інтерлейкіну при дозах у 12,5 разів менших, ніж сандимун-неорал. Ступінь інгібіції, що досягався при застосуванні препаратів у сполученні, був постійно меншим, ніж той, на який очікували від результатів застосування окремо кожних ліків.
При використанні аналізу середнього ефекту було підтверджено антагоністичну взаємодію прографу і сандимуну-неоралу in vitro у низьких дозах: всі значення КСх, одержані в експериментах, перевищували 1,0.
У цих дослідженнях інгібуючу взаємодію імуносупресивних препаратів ми розраховували кількісно шляхом порівняння дії ліків окремо і в комбінації (сполученні) після лінійного перетворення їх відношень “доза-ефект”. У проведених дослідженнях виявлений фармакологічний антагонізм сандимуну-неоралу по відношенню до прографу. Цей ефект підтверджений у всіх моделях: інгібування проліферативної відповіді лімфоцитів in vitro, інгібіція продукції ІЛ-2 in vitro. Було встановлено, що додавання до культури одного й того ж окремого препарату забезпечувало потужніший інгібуючий ефект, порівняно з додаванням рівної кількості іншого препарату. In vitro такий антагонізм був особливо відчутним у межах клінічно важливого діапазону інгібування –-95%. Синергізм натомість виявлявся у клінічно незначних ситуаціях, а саме при рівнях інгібування нижчих за 40% і обмежених пропорціях “препарат-комбінація”.
У проведеній роботі було використано модель для вивчення взаємодії ліків, яка надає найбільш достовірну інформацію для клініцистів, тобто досліджувався ефект на повний діапазон доз і ретельно аналізувалися дані із застосуванням рівняння середнього ефекту. Кількісні параметри взаємодії препаратів можуть служити підставою для підбору оптимальної комбінації агентів у протоколах імуносупресивної терапії. У цих дослідженнях сандимун-неорал продемонстрував фармакологічний антагонізм по відношенню до прографу в інгібуванні проліферації лімфоцитів in vitro та інгібіції продукції ІЛ-2 in vitro.
Таким чином, виявлений антагонізм між препаратами не дозволяє використовувати сполучення прографу і сандимуну-неоралу для зниження їх доз і, разом з тим, зменшення їх токсичних ефектів.
Ё Ми вивчали вплив пептидного комплексу нирок на продукцію ІНФ-g лімфоцитами Тх1 типу здорових осіб, хворих з термінальною стадією ХНН до і після алотрансплантації донорської нирки. Встановлено, що у здорових осіб пептидний комплекс нирок у концентрації 0,05 мкг/мл здійснював імуносупресивний вплив на функціональну активність Тх1-клітин, що призводило до достовірного зниження секреції ІНФ-g. У пацієнтів з ХНН до трансплантації не виявлено впливу субоптимальної дози ПК (0,05 мкг/мл) на секрецію ІНФ-g Тх1-лімфоцитами, а при використанні ПК –,5 мкг/мл відзначено супресорний вплив порівняно з контрольною групою. Найбільш виражена інгібіція відзначалась у пацієнтів з підвищеними показниками продукції ІНФ-g. У реципієнтів алогенної нирки у ранньому посттрансплантаційному періоді (1-2 місяці після операції) зі стабільно функціонуючим органом і на фоні трьохкомпонентної імуносупресивної терапії рівень ІНФ-g був значно нижчим від доопераційного. Під впливом ПК нирок у дозі 0,5 мкг/мл вироблення цитокіну не змінювалось. Блокада рецепторного апарату мембрани лімфоцитів, можливо, здійснюється через вплив імуносупресивних препаратів на механізми, шляхом яких реалізуються ефекти пептидів.
У наших дослідженнях взаємодії імуносупресивних препаратів ми розраховували оптимальні дози математично, порівнюючи дію ліків окремо і в комбінації після лінійного перетворення їх відношень “доза-ефект”. Враховуючи все викладене вище, ми вважаємо, що результати нашої роботи зможуть бути певним внеском у розуміння механізмів патогенезу реакції відторгнення ниркового алотрансплантату і шляху її імунокорекції.
ВИСНОВКИ
Поліпшено результати пересадки алогенної нирки в клініці шляхом оптимізації діагностики реакції відторгнення трансплантата на підставі вивчення особливостей функціонування субпопуляцій Т-хелперів периферичної крові реципієнтів, а також розробки нового підходу до комбінованої імуносупресивної терапії.
1. Встановлено, що стан імунітету хворих на термінальну стадію ХНН до трансплантації алогенної нирки характеризується підвищенням функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу та зниженням активності Т-лімфоцитів-хелперів І типу.
. Виявлені особливості інтерлейкін-продукуючої функції
Т-лімфоцитів-хелперів І типу у реципієнтів алогенної нирки:
- у період розвитку реакції відторгнення трансплантата на фоні ударних доз ІСТ зростає спонтанна продукція ІНФ-g у 2-3 рази порівняно з доопераційним рівнем;
- у реципієнтів з необоротними реакціями відторгнення рівень спонтанної продукції ІНФ-g досягав 100 пг/мл і більше, а рівень продукції ІЛ-2 відповідав доопераційному рівневі або підвищувався на 10-20%;
- у реципієнтів з оборотними реакціями відторгнення й наступною стабільною функцією трансплантата рівень спонтанної продукції ІНФ-g становив не вище, ніж 35,0 пг/мл та індукованої –не вище, ніж 60 пг/мл, а також відбувалося зниження продукції ІЛ-2 на 35-50% порівняно з доопераційним рівнем;
- у ранньому післяопераційному періоді (1,5-2 місяці) у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата рівень продукції ІЛ-2 знижувався на 65% порівняно з доопераційним рівнем; також знижувався показник індукованої продукції ІНФ-g і становив 32,6+1,9 пг/мл за незмінної динаміки спонтанної продукції ІНФ-g.
3. Виявлені особливості інтерлейкін-продукуючої активності
Т-лімфоцитів-хелперів ІІ типу у реципієнтів алогенної нирки:
- у реципієнтів з необоротними реакціями відторгнення, незважаючи на здійснювану антикризову ІСТ, зберігався високий порівняно з вихідним рівень продукції ІЛ-4 Тх2-клітинами і низький рівень продукції ІЛ-10 –менший від 15 пг/мл;
- у реципієнтів з оборотними реакціями відторгнення знижувалась продукція ІЛ-4, і показники продукції ІЛ-10 становили: спонтанної –не нижчі від 20 пг/мл, індукованої –не нижчі від 62 пг/мл;
- у реципієнтів із задовільною функцією трансплантата у ранньому післяопераційному періоді (1,5-2 місяці) відзначався низький рівень продукції ІЛ-4 Тх2-клітинами –+25 пг/мл, тоді як на фоні підтримуючих доз ІСТ виявлялися високі показники спонтанної й індукованої продукцій ІЛ-10: 127+10,6 пг/мл та 173,7+12,4 пг/мл відповідно, що забезпечувало толерантний стан до трансплантата.
. Виявлені особливості функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів дозволяють своєчасно діагностувати розвиток гострої реакції відторгнення й прогнозувати її оборотність, що сприяє виконанню адекватної тактики ведення реципієнтів у посттрансплантаційному періоді.
. При схожості первісної клінічної симптоматики достовірно вищий рівень продукції ІЛ-10 (46,8+2,1 пг/мл –спонтанної та 84,8+4,2 пг/мл –індукованої) відзначався при інфекційних ускладненнях порівняно з періодами розвитку гострої реакції відторгнення трансплантата (25,6+3,2 пг/мл –спонтанна продукція та 44,6+5,3 пг/мл –індукована), що дозволяє вважати цей показник додатковим критерієм у диференційній діагностиці цих ускладнень.
. У 80% потенційних реципієнтів з підвищеною експресією рецепторів до ІЛ-2 у поєднанні з високою продукцією ІЛ-2 виявлено в HLA-фенотипі DR2-антиген, що свідчить про зв`язок високої активності ІЛ-2-ланки імунітету з системою гістосумісності і дозволяє віднести таких пацієнтів до групи ризику гострої реакції відторгнення.
. У потенційних реципієнтів встановлена індивідуальна чутливість до циклоспорину А на підставі змін проліферативної активності
Т-лімфоцитів на мітоген під впливом препарату, що дозволило циклоспорин-А-резистентних реципієнтів віднести до групи ризику розвитку реакції відторгнення трансплантата.
. При дослідженні in vitro напрямку взаємодії імуносупресивних препаратів з використанням рівняння середньої дії виявлено:
- синергічну взаємодію між сандимуном-неоралом і дексаметазоном, що співвідноситься з існуючим клінічним досвідом;
- виявлені ефекти від синергізму до антагонізму при взаємодії сандимуну-неоралу і селсепту, що дає підставу для розуміння клінічного ефекту селсепту як “додаткового” імуносупресивного препарату;
- виявлено “фармакологічний” антагонізм сандимуну-неоралу до про-графу, що не дозволяє рекомендувати поєднання цих препаратів у низьких дозах з метою зменшення їх токсичних ефектів при проведенні ІСТ.
9. При вивченні впливу пептидного комплексу нирок у дозі 0,5 мкг/мл на продукцію ІНФ-g Тх1-клітинами реципієнтів in vitro визначено супресорний вплив препарату у реципієнтів до операції, а після неї за стабільної функції трансплантата відсутність впливу пептидного комплексу на продукцію ІНФ-g.
Перелік основних наукових статей, опублікованих з теми дисертації
1. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Калинина Н.А., Баран Е.Я. Влияние циклоспорина А на рецепторы и пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток реципиентов аллогенной почки // Лабораторная диагностика. –. - №2. –С. 24-28.
. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Лиховид Н.П., Калинина Н.А. Интерлейкин-2 (ИЛ-2) продуцирующая функция лимфоцитов и экспрессия рецепторов к ИЛ-2 у больных с хронической почечной недостаточностью перед аллотрансплантацией почки // Лабораторная диагностика. –. - №3. –С.18-21.
. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Калинина Н.А., Дриянская В.Е. Взаимосвязь HLA-фенотипа с продукцией ИЛ-2 и экспрессией рецептора к ИЛ-2 у потенциальных реципиентов аллогенной почки // Імунологія та алергологія. –, №1-2. –С.77-81.
. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Баран Е.Я., Порошина Т.В., Калинина Н.А. Интерлейкин-4 продуцирующая функция лимфоцитов у больных с аллотрансплантированной почкой // Лабораторная диагностика. –, №3. –С.78-82.
5. Порошина Т.В., Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Дриянс- кая В.Е., Баран Е.Я. In vitro продукция интерлейкина-2 (ИЛ-2) лимфоцитами периферической крови больных до и после аллотрансплантации почки // Імунологія та алергологія. –, №1. –С.73-76.
6. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Родионов Н.Л. Интерлейкин-10 продуцирующая функция лимфоцитов у пациентов с аллотрансплантированной почкой // Архив клинической и экспериментальной медицины. –. –Том 9, №2. –С.270-274.
7. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Баран Є.Я., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Родіонов М.Л. Функціональна активність лімфоцитів Т-хелперів ІІ типу (ТХ2) у реципієнтів з алотрансплантованою ниркою // Трансплантологія. –. –Том 1, №1. –С.105-107.
8. Баран Є.Я., Руденко А.В., Драннік Г.М., Родіонов М.Л., Луньова Г.Г., Зограб’ян Р.О., Кругликов В.Т., Калініна Н.А. Перебіг післятрансплантаційного періоду при повторних алотрансплантаціях нирки (АТН) // Трансплантологія. – 2000. –Том 1, №1. –С.111-115.
9. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Баран Е.Я., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.И. Интерлейкин-10 (ИЛ-10) продуцирующая функция лимфоцитов –критерий диагностики посттрансплантационных осложнений у реципиентов с аллогенной почкой // Лабораторная диагностика. –, №4. –С. 14-18.
10. Дранник Г.Н., Лунева А.Г., Калинина Н.А., Баран Е.Я., Порошина Т.В., Фесенкова В.И. Продукция g-интерферона (g-ИНФ) Т-хелперами I типа у реципиентов до и после трансплантации почки // Архив клинической и экспериментальной медицины. –. –Том. 10, №3. –С. 305-308.
11. Драннік Г.М., Кайдашев І.П., Луньова Г.Г., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.І. Особливості продукції g-інтерферону (g-ІНФ) мононуклеарами периферичної крові під впливом пептидного комплексу нирок // Проблеми екології та медицини. –. –Том 5, №3-4. –С. 55-57.
. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Папаки-на В.С. Метод определения направленности взаимодействия иммуносупрессивных препаратов // Лабораторная диагностика. –. - №4. –С. 47-51.
13. Drannik G.N., Lunova A.G., Baran Ye.Ya., Poroshina T.V., Kalinina N.A. Cytokine producing function of type II T-helpers in transplanted kidney patients // Transplantation Proceedings. –. –V.33. –P. 2352-2354.
. Луньова Г.Г. Вивчення взаємодії низьких доз прографу і сандимуну-неоралу на продукцію ІЛ-2 лімфоцитами волонтерів in vitro // Трансплантологія. – 2002. –Том 3, №1. –С. 86-88.
. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Дриянская В.Е., Порошина Т.В., Фесенкова В.И. Особенности интерлейкин-2 (ИЛ-2) и интерлейкин-4 (ИЛ-4) продуцирующей активности лимфоцитов периферической крови реципиентов в иммуноадаптации почечного аллотрансплантата // Проблеми екології та медицини. –. –Том 6, №1-2. –С.20-23.
16. Лунева А.Г., Дранник Г.Н., Калинина Н.А., Порошина Т.В., Зограбьян Р.А., Папакина В.С., Баран Е.Я. Исследование характера взаимодействия сандиммуна неорала с селлсептом in vitro // Імунологія та алергологія. –. - №1. –С. 12-16.
. Лунева А.Г. Антагонистическое взаимодействие низких доз прографа и сандиммуна-неорала in vitro // Імунологія та алергологія. –. - №2. –С. 25-29.
. Луньова Г.Г. Показники продукції інтерлейкіну-2 і проліферативної відповіді лімфоцитів в оцінці взаємодії імуносупресивних препаратів // Лабораторна діагностика. –. - №3. –С. 14-20.
. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Баран Є.Я., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.І, Зограб`ян Р.А. Функція Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів (Тх1 та Тх2) у механізмі імуноадаптації реципієнтів до ниркового трансплантата // Трансплантологія. –. - Том 3, №2. –С. 85-91.
. Патент України №43664А від 17.12.2001 року за заявою “Спосіб діагностики гострої реакції відторгнення ниркового трансплантата” (співавт. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Баран Є.Я., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Фесенкова В.І.).
. Патент України №51133А від 15.11.2002 року за заявою “Спосіб імуносупресивної терапії у посттрансплантаційному періоді” (співавт. Драннік Г.М., Луньова Г.Г., Калініна Н.А., Порошина Т.В., Папакіна В.С.).
Анотація
Луньова Г.Г. Роль Т-хелперної ланки імунітету в реакції відторгнення алогенного трансплантата нирки людини. –
Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук
за спеціальністю 14.03.08 –імунологія та алергологія. –
Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, Київ, 2003.
У дисертації представлені шляхи оптимізації діагностики реакції відторгнення ниркового алотрансплантату, засновані на вивченні у реципієнтів особливостей функціональної активності Т-лімфоцитів-хелперів І та ІІ типів за продукцією ними ряду основних медіаторів-інтерлейкінів (ІЛ-2, ІЛ-10, ІЛ-4), інтерферону-g (ІНФ-g). Обстежено й проаналізовано стан 149 реципієнтів, з яких 54 виконано первісну трансплантацію, а 12 –вторинну трансплантацію алогенної нирки. Проведено 2804 імунологічних дослідження реципієнтів, виконано 2390 експериментів in vitro. Визначено закономірність продукції медіаторів у реципієнтів до і після пересадки нирки з урахуванням особливостей посттрансплантаційного періоду, на підставі чого розроблено алгоритм моніторингу. Показано, що однією з головних умов спрямованої імуномодуляції Т-хелперів периферичної крові реципієнтів є індивідуалізація протоколів імуносупресивної терапії. Проведено аналіз експериментальних даних з вивчення взаємовпливу імуносупресивних препаратів (сандимуну-неоралу, селсепту, дексаметазону, прографу) на функціональну активність імунокомпетентних клітин. Аналіз експериментів здійснювався за рівнянням середньої дії, внаслідок чого встановлені коефіцієнти сполучення, що характеризують синергічну, адитивну та антагоністичну взаємодію імуносупресивних препаратів. Результатом досліджень став новий підхід у підборі імуносупресивних препаратів та їх доз.
Ключові слова: нирковий алотрансплантат, Т-хелпери І типу, Т-хелпери ІІ типу, інтерлейкін-2, 4, 10, інтерферон-g, коефіцієнти сполучення взаємодії імуносупресивних препаратів.
Аннотация
Лунева А.Г. Роль Т-хелперного звена иммунитета в реакции отторжения аллогенного трансплантата почки человека. –
Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.08 –иммунология и аллергология. –
Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Киев, 2003.
В диссертации представлены пути оптимизации диагностики реакции отторжения почечного аллотрансплантата, основанные на изучении у реципиентов особенностей функциональной активности Т-лимфоцитов-хелперов I и II типов по продукции ими ряда основных медиаторов-интерлейкинов (ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-4), интерферона-g (ИНФ-g). Обследовано и проанализировано состояние 149 реципиентов, из которых 54 выполнена первичная трансплантация, а 12 –вторичная трансплантация аллогенной почки. Проведено 2804 иммунологических исследования реципиентов, выполнено 2390 экспериментов in vitro. Определена закономерность продукции медиаторов у реципиентов до и после пересадки почки с учетом особенностей посттрансплантационного периода. В период развития реакции отторжения трансплантата на фоне антикризовой ИСТ возростала спонтанная продукция ИНФ-g в 2-3 раза по сравнению с дооперационным уровнем. У реципиентов с необратимыми реакциями отторжения уровень спонтанной продукции ИНФ-g достигал 100 пг/мл и более, сохранялся по сравнению с исходным высокий уровень продукции ИЛ-4 Тх2-клетками и низкий уровень продукции ИЛ-10 - меньше 15 пг/мл, а уровень продукции ИЛ-2 соответствовал дооперационному уровню или повышался на 10-20%. У реципиентов с обратимыми реакциями отторжения уровень спонтанной продукции ИНФ-g составлял не выше 35 пг/мл, а индуцированной –не выше 60 пг/мл, а также происходило снижение продукции ИЛ-2 на 35-50% по сравнению с дооперационным уровнем и снижалась продукция ИЛ-4, и показатели продукции ИЛ-10 составляли: спонтанной –не ниже 20 пг/мл, индуцированной –не ниже 62 пг/мл. У реципиентов с удовлетворительной функцией трансплантата через 1,5-2 месяца после трансплантации почки уровень продукции ИЛ-2 снижался на 65% по сравнению с дооперационным уровнем, также снижался показатель индуцированной продукции ИНФ-g и составлял 32,6+1,9 пг/мл при неизменной динамики спонтанной продукции, и отмечался низкий уровень продукции ИЛ-4 Тх2-клетками –+25 пг/мл, тогда как определялись высокие показатели спонтанной и индуцированной продукций ИЛ-10: 127+10,6 пг/мл и 173,7+12,4 пг/мл соответственно. На основании выявленных закономерностей разработан алгоритм мониторинга. Показано, что одним из основных условий целенаправленной иммуномодуляции Т-хелперов периферической крови реципиентов является индивидуализация протоколов иммуносупрессивной терапии. Проведен анализ экспериментальных данных по изучению взаимовлияния иммуносупрессивных препаратов (сандиммуна-неорала, селлсепта, дексаметазона, прографа) на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Анализ экспериментов проводился по уравнению среднего воздействия. Было установлено: синергическое взаимодействие сандиммуна-неорала и дексаметазона, что соотносится с существующим клиническим опытом; выявлены эффекты от синергизма до антагонизма при взаимодействии сандиммуна-неорала и селлсепта, что дает основание для понимания клинического эффекта селлсепта как “дополнительного” иммуносупрессивного препарата; выявлен “фармакологический” антагонизм сандиммуна-неорала к прографу, что не позволяет рекомендовать одновременное использование этих препаратов в низких дозах с целью уменьшения их токсических эффектов при проведении ИСТ. Результатом исследований явился новый подход в подборе комбинаций иммуносупрессивных препаратов и их доз.
Ключевые слова: почечный аллотрансплантат, Т-хелперы I типа,
Т-хелперы II типа, итерлейкины-2, 4, 10; интерферон-g, коэффициенты сочетания взаимодействия иммуносупрессивных препаратов.
Summary
Lunova A.G. T-helper immunity link role in kidney allotransplant rejection of man –
Manuscript.
Dissertation for the Doctor’s Degree in Medical Sciences
specializing in 14.03.08 –immunology and allergology. –
National Medical University named after A.A.Bogomolets, Kyiv, 2003.
The dissertation presents the optimization ways of kidney allograft rejection diagnostics based on studying recipients“ peculiarities of T-lymphocyte-helpers type I and II functional activity in accordance with their producing a number of mediator-interleukines (IL-2, IL-10, IL-4, g-interferon (g-INF). 149 recipients have been examined and analysed, 54 of which have primarily undergone transplantation, 12 - have undergone secondary allograft transplantation. 2804 immunological examinations of recipients have been performed, 2390 experiments have been carried out in vitro. The order of mediator production in recipients prior and after kidney transplantation taking into account the peculiarities of posttransplantation period, basing on which the algorithm of immune monitoring was developed. It has been shown that one of the main conditions of direct recipients peripheral blood T-helper immunomodulation is the individualization of immune-suppressive therapy protocols. Experimental data on examining interaction between immunosuppressive drugs (sundimmun-neoral, сell-cept, dexamethazone, prograf) have been analysed for the functional activity of immunecompetent cells. The experiments have been analysed in accordance with median effect equation, due to, which interaction factors have been determined, which characterize synergistic, additive and antagonistic interaction of immunesuppressive drugs. As a result of the research a new approach to immune-suppressive combinations and their dozes has been forend.
Key words: kidney allograft, type I T-helpers, type II T-helpers, interleukines-2, 4, 10, g-interferon, combination factors of immunesuppressive drugs interaction.