Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
26
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА
КОВАЛЬЧУК СВІТЛАНА МИКОЛАЇВНА
УДК 612.172.015.3.014.46-084
ФУНКЦІоНАЛЬНІ ТА МЕТАБОЛІЧНІ ЗМІНИ
міокарда щурів пІд ВПЛИВОМ адріаміцину
03.00.13 –фізіологія людини і тварин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів –2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров’я УкраїниНаукові керівники: доктор біологічних наук, професор
Тимочко Михайло Федорович,
Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров’я України,
завідувач кафедри біологічної хімії
доктор медичних наук, професор
Гжегоцький Мечислав Романович,
Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров’я України,
завідувач кафедри нормальної фізіології
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, Національний медичний університет імені О.О.Богомольця Міністерства охорони здоров’я України, професор кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії
кандидат біологічних наук, Дмитрієва Алла Володимирівна, Інститут фізіології імені О.О.Богомольця Національної академії наук України, старший науковий співробітник відділу фізіології кровообігу
Провідна установа: Київський національний університет імені Т.Шевченка, м.Київ
Захист відбудеться “”липня 2001 р. о “.30”годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського,4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія №333.
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою 79005, м.Львів, вул. Драгоманова,17.
Автореферат розісланий “”червня 2001р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради, кандидат біологічних наук Санагурський Д.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Широке застосування одного з найбільш ефективних антибластомних препаратів антрациклінового ряду –адріаміцину обмежується його побічним впливом на функціональний стан серця (Olson, Mushlin, 1990; Minotti et al., 1996; Boucek et al., 1997). Згідно з експериментальними та клінічними дослідженнями, адріаміцин-індуковані зміни зумовлені структурно-функціональними і метаболічними порушеннями мітохондрій міокарда, які здатні акумулювати адріаміцин у значних кількостях (Горская, Каверинская, 1989; Капелько и др., 1991; Vidal et al., 1996; Gille, Nohl, 1997; Gewirtz, 1999; Serrano et al., 1999). Разом з тим, дані про вплив антрациклінових антибіотиків на систему окисного фосфорилювання мітохондрій серця суперечливі та в основному отримані в дослідженнях іn vіtrо.
Згідно з висновками іншої групи робіт, побічний вплив адріаміцину на серце пов'язаний з порушенням системи перекисних процесів, надмірна активація яких, не контрольована системою антиоксидантного захисту, може викликати низку змін мембранозалежних метаболічних перетворень (Меерсон и др., 1987; Sadzuka et al., 1997; Myers, 1998). Нами було показано, що підтримання перекисно-антиоксидантної рівноваги при дії екстремальних чинників різної природи у значній мірі залежить від рівня та ефективності енергетичного обміну (Тимочко і сп., 1985–). У зв’язку з цим важливим є дослідження характеру регуляторної взаємозалежності перекисних та енергетичних процесів при дії адріаміцину, оскільки на сьогодні не відомо, чи індукція перекисного окислення ліпідів є опосередкованим результатом інших ефектів препарату, чи первинною ланкою порушення метаболічного гомеостазу клітин. Тому встановлення зв’язку між метаболічними змінами у міокарді та крові, з одного боку, та вінцевим кровотоком, насосною і скорочувальною функціями серця, з іншого, є актуальним для виявлення пускових механізмів негативного впливу адріаміцину на серце і розробки шляхів його запобігання.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідних тем “Сучасні підходи до хіміотерапії раку з врахуванням системного впливу пухлини і токсичної дії цитостатиків”, № держреєстрації 0198U000870 (здобувачем проведено експериментальні дослідження впливу протипухлинного препарату адріаміцину на функціональну активність та параметри метаболізму серця), “Оцінка ступеня інтоксикації та адаптаційно-компенсаторного резерву організму за умов впливу різних екстремальних чинників”, № держреєстрації 0100U006846, (здобувачем досліджувались параметри ліпопероксидації, антиокисного захисту та енергетичного обміну при ураженнях різного ступеня складності та вплив за цих умов метаболічних коригуючих чинників).
Мета і задачі досліджень. Метою роботи було охарактеризувати вплив адріаміцину на перекисні та енергетичні процеси міокарда, а також оцінити їх роль у змінах функціонального стану серця щурів.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:
1.Вивчити динаміку функціональної активності серця щурів у ранні строки після дії адріаміцину при різних схемах введення препарату в дозі 15 мг/кг маси, що відповідає терапевтичній дозі антибіотика.
.Дослідити вплив тестової гіпоксичної перфузії на функціональний стан ізольованого серця щурів після курсового введення адріаміцину.
.Провести порівняльний аналіз динаміки перекисних процесів і антиокисної активності мітохондрій серця та сироватки крові щурів у різні строки дії адріаміцину.
.Вивчити вплив адріаміцину на вміст метаболітів окисно-відновних реакцій (молочної і піровиноградної кислот) у крові та функціональний стан мітохондрій міокарда за такими показниками: швидкість окисного фосфорилюванння, сумарний вміст синтезованого АТФ.
Об’єкт дослідження: механізми впливу адріаміцину на серце щурів та зв’язок рівня функціональної активності серця з метаболічними змінами міокарда.
Предмет дослідження: параметри функціонального стану ізольованого перфузованого серця, процеси ліпопероксидації, рівень антиоксидантного захисту та енергетичного обміну мітохондрій міокарда та крові щурів.
Методи дослідження:
У роботі були застосовані наступні методи дослідження:
фізіологічні –перфузія ізольованого серця щурів; визначення параметрів насосної функції, коронарної перфузії, кисневого режиму ізольованого працюючого серця впродовж перфузійного періоду;
біохімічні –спектрофотометричне визначення рівня продуктів перекисного окислення ліпідів, загальної антиокисної активності, вмісту метаболітів окисно-відновних реакцій;
аналітичні –рН-метричне визначення параметрів окисного фосфорилювання мітохондрій міокарда.
Наукова новизна одержаних результатів. Після курсу адріаміцину виявлені 2 типи змін функціонального стану серця: І характеризується зменшенням вихідних показників функціональної активності (І група), ІІ –підвищенням показників активності серця і вінцевого потоку (ІІ група). Зареєстровані групи розрізняються також за їх реакцією на тестове гіпоксичне навантаження. Тварини І групи майже повністю відновлювали рівень показників насосної функції серця і коронарного кровообігу після припинення навантаження, а в ІІ групі спостерігали низький ступінь відновлення основних показників і подальше їх зниження до кінця періоду спостереження, що свідчить про виснаження фізіологічних резервів у цих тварин. Виявлено збільшення негативного впливу як на метаболічні процеси, так і на функцію ізольованого серця при 2-тижневому введенні адріаміцину. З'ясовано, що підвищення рівня перекисного окислення ліпідів у сироватці крові та мітохондріях міокарда після курсового введення адріаміцину фіксується одночасно або раніше, ніж функціональні зміни серцевого м'яза. Проведено дослідження функціонального стану мітохондрій міокарда при дії адріаміцину. Виявлено зниження параметрів окисного фосфорилювання мітохондрій, пов’язане з активацією кінцевих стадій перекисного окислення ліпідів на тлі зниження антиокисного резерву. Вперше проведено порівняльний аналіз динаміки перекисних процесів і антиокисної активності у сироватці крові та мітохондріях серця щурів після курсу адріаміцину. Показано зростання рівня продуктів перекисного окислення ліпідів у сироватці крові та мітохондріях міокарда щурів після введення адріаміцину.
Практичне значення одержаних результатів. Показано, що у відповідь на курсове введення адріаміцину можливі два різні типи функціональної реакції серця, яка передбачає різну тактику коригуючого впливу. Виявлені порушення енергетичних процесів кардіоміоцитів супроводжуються змінами вмісту метаболітів окисно-відновних реакцій у крові, а саме зростанням концентрації молочної та піровиноградної кислот. Подібна динаміка змін перекисних процесів у крові та міокарді свідчить про перспективність застосування показників перекисного окислення ліпідів сироватки крові як ранніх критеріїв ураження міокарда у клінічній практиці. Окремі результати досліджень впроваджені у навчальний лекційний курс кафедри нормальної фізіології ЛДМУ (тема “Сучасні уявлення про механізми гомеостазу”). Метод визначення антиоксидантної активності впроваджено і використовується в експериментальних дослідженнях та клінічній практиці.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором самостійно під керівництвом доктора біологічних наук, професора Тимочка М.Ф., доктора медичних наук, професора Гжегоцького М.Р. Дисертант особисто налагодила ряд методик, зокрема, методику перфузії ізольованого серця щура, вона є співавтором розробленого і застосованого у даній роботі методу визначення антиоксидантної активності біологічного матеріалу. Дисертант провела експериментальні дослідження, статистичну обробку отриманих даних та аналіз результатів. Автор описала та узагальнила отримані результати, сформулювала основні положення роботи, заключення і висновки.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи були винесені на обговорення на XII з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П.Павлова (Львів,1986), VI Всесоюзній конференції по окисленню органічних речовин у рідкій фазі "Окисление - 86" (Львів,1986), II Національному конгресі молодих вчених-медиків України (Київ,1994), Науково-практичній конференції "Актуальні питання використання лабораторних тварин в медико-біологічних дослідженнях" (Чернівці, 1992), I Конгресі світової федерації українських фармацевтичних товариств (Львів,1994), XIV з'їзді Українського фізіологічного товариства ім. І.П.Павлова (Київ,1994), з’їзді онкологів України (Вінниця, 1995), міжнародній конференції з фізіології і біохімії тварин, присвяченій 100-річчю від дня народження проф.Гжицького С.З. (Львів, 2000), VIII Конгресі Світової Федерації Українських лікарських товариств (Львів, 2000).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 19 публікаціях, з яких 6 опубліковані у наукових фахових виданнях, 3 –у збірниках наукових праць, 9 –у матеріалах та тезах конференцій, 1 авторське свідоцтво.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів отриманих даних та їх обговорення, висновків, а також списку використаних джерел із 378 найменувань. Робота викладена на 148 сторінках, ілюстрована 14 рисунками і 22 таблицями.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили на безпородних білих статевозрілих щурах-самцях масою 250 - 300 г.
Тваринам доочеревно вводили адріаміцин (АДМ) у сумарній дозі 15мг/кг маси. Дослідні групи тварин розрізнялися схемами введення антибіотика. За першою схемою адріаміцин вводили щодня протягом семи днів, за другою –через день впродовж двох тижнів; разова доза препарату –мг / кг. Для ін’єкцій використовували адріаміцин, який випускається в ампулах, що містить 10 мг ліофілізованого порошку доксорубіцину гідрохлориду та 50 мг лактози. Враховуючи склад вмісту ампули, контрольним щурам вводили 1% розчин лактози в об'ємі 1 мл / кг маси у режимах, аналогічних схемам введення адріаміцину дослідним тваринам.
Досліджували кров, ізольоване серце, мітохондрії серця щурів. Серце тварин ізолювали під ефірно-каліпсоловим наркозом та перфузували за методом Nееly (1967) розчином КребсаГенселяйта, який містив (у ммоль/л): NаСl 118; КСl 4,7; СаСl 2,5; МgSО 1,2; КHРО1,2; NаHСО 25; Nа-ЕДТА 0,5; глюкоза –; рН 7,4. Розчин оксигенували газовою сумішшю, яка містила (у %): О –; СО 5. Температуру перфузованого розчину підтримували на рівні 37оС. Перфузія серця тривала одну годину і складалася з таких етапів: 20 хвилин –нормоксичні умови перфузії, 20 хв –гіпоксичні, після чого відновлювали початкову оксигенацію розчину. Під час перфузії ізольованого серця щурів реєстрували аортальний систолічний тиск (АТсист.), перфузійний тиск для коронарних артерій (АТперф.), частоту серцевих скорочень (ЧСС). Аортальний (АП) і коронарний (КП) потоки вимірювали безпосередньо на шляху їх відтоку відповідно з аортальної магістралі та легеневої артерії за допомогою мірних бюреток. На основі цих показників розраховували серцевий викид, ударний об’єм (УО), коронарний судиннний опір (КСО) (Ярочкин, Виноградов, 1986 ), роботу серця (W) (Голиков и др., 1988). У пробах перфузату, що надходить до серця, і відходить з легеневої артерії, взятих під вазелінове масло, на апараті Мікро-Аструп визначали рО, на основі чого розраховували артеріо-венозну різницю по тиску (АВРр), коефіцієнт утилізації кисню (КУО), споживання кисню (СпО) (Ярочкин, Виноградов, 1986 ).
Мітохондрії серця виділяли методом дифференціального центрифугування згідно Кеrbеy еt аl,1976. Середовище виділення містило (у ммоль/л): сахарозу – 250, ЕДТА –, тріс-HСl – 5, рН 7,4. Всі операції проводили при охолодженні до температури 0- +4С
Окисне фосфорилювання мітохондрій кардіоміоцитів досліджували рН-метричним методом. Принцип методу полягає в реєстрації змін концентрації водневих іонів, що супроводжують синтез і гідроліз АТФ у мітохондріях (Євтодієнко, 1979; Сhаnсе, 1967). Зміни рН реєстрували за допомогою скляного електроду ЭСЛ-43-07 та іономіру И-115 М. Середовище інкубації містило (у ммоль): сахарозу - 150, тріс HCl 3, КHРО –, КСl –, (рН 7,4). Об’єм відкритої кювети 2 мл, концентрація білку мітохондрій в кюветі 1,5-2 мг/мл, температура інкубації 26С. Суспензію мітохондрій в кюветі перемішували за допомогою магнітного змішувача. Як субстрат окислення використовували сукцинат натрію в концентрації 6 ммоль. Дихання стимулювали додаванням АДФ (200 нмоль). Лінійність і масштаб шкали перевіряли титруванням розчином соляної кислоти відомої концентрації. Всі показники розраховувалися на мг білку мітохондрій, який визначали за методом Лоурі (1951).
Рівень перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в ізольованих мітохондріях серця та сироватці крові оцінювали за вмістом одного з проміжних продуктів ліпопероксидації малонового диальдегіду (МДА), який визначали за методом Тімірбулатова і Сєлєзньова (1981).
Антиокисну активність (АОА) сироватки крові та мітохондріальної суспензії серця щурів оцінювали за індексом загальної антиокисної активності (ІАОА), який визначали розробленим нами методом (Мартинюк, Ковальчук, Тимочко, Панасюк, 1991). Принцип методу полягає у визначенні співвідношення вмісту МДА, перерахованого на одиницю об’єму сироватки або на одиницю маси тканини при активації ПОЛ для двох різних кількостей досліджуваного матеріалу у постійному об'ємі середовища інкубації. В основі методу лежить закономірність, суть якої полягає в тому, що збільшення кількості досліджуваного матеріалу при постійності всіх інших параметрів призводить до зменшення нагромадження перекисних продуктів у перерахунку на одиницю досліджуваного матеріалу. Це пояснюється тим, що кожний ліпідвмісний біологічний матеріал є не лише субстратом окислення, але й має антиокисну здатність, тому у більш концентрованих пробах, ефективність дії ендогенних антиоксидантів є вищою, ніж у розведених.
Вміст молочної та піровиноградної кислот у крові тварин визначали ферментативним методом спектрофотометрично згідно Hоhоrst (1974) та Buсhеr (1974), відповідно.
Статистичну обробку одержаних даних проводили за критерієм Стьюдента. Визначали середнє значення (М), стандартну похибку (m) і коефіцієнт достовірності (р). Опрацювання результатів здійснювали з використанням програмного пакету для персональних комп’ютерів Microsoft Excel та калькулятора “Электроника МК-52”.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для дослідження впливу курсового введення адріаміцину ми застосували комплекс методів, що дозволяють оцінити в мітохондріях кардіоміоцитів і у крові щурів процеси ліпопероксидації, енергетичного обміну та їх взаємозв’язок з функціональною активністю серця. Для характеристики функціонального стану міокарда щурів після закінчення курсу ін’єкцій адріаміцину здійснювали 1-годинну перфузію працюючого серця, яка дає можливість провести тестові навантаження міокарда. Враховуючи, що клінічні прояви АДМ-індукованого пошкодження серця виявляються на пізніх стадіях, ми висунули припущення, що метаболічні та функціональні порушення, які виникають у ранні строки, можуть бути виявлені за допомогою додаткових стресорних чинників, зокрема, використаного нами гіпоксичного навантаження.
Існує декілька схем введення адріаміцину для вивчення механізмів побічного впливу препарату в експериментальних дослідженнях. Нами була обрана схема введення препарату в загальній дозі 15 мг / кг маси протягом двох тижнів. Крім того була застосована схема щоденного введення АДМ впродовж 7 днів, запропонована Капелько та сп. (1986). Як зазначено вище, контролем у наших умовах досліджень слугувала група тварин, які у режимах, аналогічних схемам введення адріаміцину, отримували ін’єкції лактози.
Характеристика функціонального стану ізольованого серця щурів контрольної групи протягом перфузійного періоду. Характер функціональної активності серця щурів контрольної групи (1-ша доба після введення розчину лактози) впродовж перфузійного періоду представлений на рис.1. Стабілізація показників кардіодинаміки спостерігається на 5-тій - 10-тій хв антероградної перфузії та підтримується на цьому рівні у нормоксичний період. Під час гіпоксії зафіксовано зниження параметрів функціональної активності та відновлення її величин на 5-тій хв. реоксигенації (45-та хв. перфузії), яке становить відносно вихідного рівня для серцевого викиду 91,3%, артеріального систолічного тиску –,0%, коронарного потоку –96,1%, роботи – 92,8%. В кінці перфузійного періоду спостерігається достовірне зниження коронарного потоку, серцевого викиду, роботи, зростання КСО.
Вплив семиденного курсового введення адріаміцину на функціональну активність ізольованого перфузованого серця щурів. Після семиденного введення адріаміцину на 1-шу –-тю доби після закінчення ін’єкцій препарату тваринам практично однорідної популяції виявлено два типи функціональної реакції ізольованого перфузованого серця, які позначені як групи АДМ І і АДМ ІІ. Відмінність між групами простежується як на початку перфузійного періоду, так і після гіпоксичного впливу. На 1-шу добу після семиденного введення для групи АДМ І на початку перфузії встановлено достовірно нижчий щодо контролю аортальний потік (на 32,9 %), артеріальний систолічний тиск (на 11,1%), пригнічення роботи серця (на 33,8 %) і підвищення рівня коронарного судинного опору (на 29,4%) (табл.1, рис.2). Зниження серцевого викиду (на 27,6 %) зумовлене сповільненням частоти серцевих скорочень, яка на початковому етапі становить 65,3% від контролю. Найменше виражене було в цій групі тварин зниження коронарного потоку. Проте, при нижчому вихідному рівні параметрів функціональної активності серця у нормоксичний період зафіксоване достовірне відновлення цих показників через 5 хв. після гіпоксичного навантаження (45-та хв. перфузії), яке щодо серцевого викиду становить 95,6 %, роботи –,8 %. У післягіпоксичний період спостерігається тенденція до подальшого зниження досліджуваних функціональних показників серцевого м’яза.
Таблиця 1
Показники функціональної активності ізольованого перфузованого
серця щурів через 1 добу після семиденного введення адріаміцину (Mm)
|
Показники |
Групи |
Тривалість перфузії |
|
5 хв |
хв |
хв |
60 хв |
||
|
АТсист., мм рт.ст. |
контроль (n=9) |
62,20,7 |
,40,8 |
,31,8 |
,21,4 |
|
АДМ I (n=7) |
55,30+1,0 * |
,3+1,8 * |
,0+2,6 * |
,1+3,0 * |
|
|
АДМ II (n=7) |
63,1+2,6 ? |
64,3+0,7 ? |
59,3+1,0 ? |
,0+1,7 |
|
|
АП, мл·хв -1·г-1 |
контроль |
15,2+0,8 |
,1+0,9 |
,4+2,1 |
,1+2,4 |
|
АДМ I |
10,2+0,9 * |
,4+1,0 * |
,8+1,8 * |
,7+1,4 |
|
|
АДМ II |
19,3+ 1,2 * ? |
,7+ 3,4 * ? |
,3+ 1,3 ? |
,2+ 1,7 |
|
|
КП, мл·хв -1·г-1 |
контроль |
10,20,7 |
,80,7 |
,81,2 |
,61,3 |
|
АДМ I |
8,2+2,6 |
,4+2,7 |
,3+1,4 |
,4+1,5 |
|
|
АДМ II |
14,5+0,9 ? |
3,8+0,8 ? |
3,1+1,1 ? |
10,0+2,3 |
|
|
Серцевий викид, мл·хв -1·г-1 |
контроль |
25,41,2 |
,91,4 |
,22,8 |
,73,2 |
|
АДМ I |
18,4+1,8 * |
,8+1,8 * |
,1+1,9 * |
,1+1,9 |
|
|
АДМ II |
33,8+1,9 *? |
,5+,5 * ? |
,4+,4? |
,2+3,9 |
|
|
КСО, кПа·с·см– |
контроль |
48,2+3,4 |
,5+3,2 |
,2+5,8 |
,7+7,8 |
|
АДМ I |
54,2+2,7 |
57,6+2,1* |
57,9+3,1 |
,6+2,7 |
|
|
АДМ II |
33,4+1,1*? |
,7+1,3*? |
,3+1,4*? |
43,5+1,8*? |
Примітка: * - різниця порівняно з контролем достовірна з p<0,05;
? - різниця порівняно з АДМ І достовірна з p<0,05.
Для групи АДМ ІІ характерна значна початкова активація насосної функції серця (табл.1). Зокрема, на 15-тій хвилині перфузійного періоду величина аортального потоку у порівнянні з контролем збільшена на 47,2 %, виконувана серцем робота –на 40,4 %, а порівняно з показниками групи АДМ І ці параметри збільшені в 2,8 і 2,7 раза, відповідно.
Гіпоксичне навантаження у цій групі тварин призводить до глибокого пригнічення функціональної активності серця, достовірно більш вираженого, ніж у контролі та групі АДМ І. Після гіпоксії функціональна активність серця не відновлюється до початкових значень. Так, зменшення аортального потоку після гіпоксичної гіпоксії стосовно догіпоксичного періоду становить 39,7 %, тоді як у контролі - 16,8 %. Аналіз динаміки кисневого режиму ізольованого перфузованого серця щурів усіх груп виявив, що такі показники, як напруженість кисню в перфузатах, що надходять до серця і відходять від нього, а також АВРр, КУО практично однакові в обох групах дослідних і контрольних тварин.
Споживання кисню серцевим м’язом протягом всієї перфузії у групі АДМ І істотно нижче, ніж у контролі та становить на 15-тій хв. 56,3 %, а на 45-й хвилині – 59,7 % від контрольних величин. На відміну від цього, у групі АДМ ІІ на початкових етапах перфузії споживання кисню перевищує контроль на 46,4 %, а після гіпоксії воно зменшується до контрольних значень, однак висока інтенсивність споживання кисню в групі АДМ ІІ не забезпечує відновлення функціональної активності міокарда після гіпоксичного навантаження, що може свідчити про низьку ефективність його використання у метаболічних перетвореннях. Знижений вихідний рівень споживання О серцем тварин групи АДМ І, який ми розцінюємо як більш економний, визначає вищу резистентність ізольованого серця до гіпоксичного впливу, про що свідчить високий ступінь відновлення показників функціонального стану після тестової гіпоксії.
У наступні строки після семиденного введення адріаміцину (4-та - 7-ма доби) спостерігається вирівнювання показників функціональної активності міокарда дослідних щурів обох груп, що виявляється у достовірному зниженні параметрів функціонального стану серця відносно контролю, але менш вираженому, ніж у групі АДМ І у перші доби після курсу антибіотика. Аналіз показників насосної функції, вінцевого кровоплину, споживання кисню серцем на початку перфузії показує, що найнижчий рівень їх величин спостерігається на 3-тю добу після семиденного курсового введення адріаміцину (рис.3). Зниження деяких показників функціональної активності серця у стані спокою у цей період, порівняно з іншими строками, відзначено і у контрольних щурів, що узгоджується з даними літератури відносно особливостей і строків формування перехідних станів при розвитку адаптаційних реакцій. Такий характер змін може бути проявом постстресорної реакції, яка у дослідних тварин поглиблюється доочеревними ін’єкціями адріаміцину.
Перекисні та антиокисні процеси у крові та мітохондріях серця щурів після семиденного введення адріаміцину. Встановлено, що рівень ліпопероксидації у сироватці крові усіх дослідних щурів істотно підвищений порівняно з контролем уже на першу добу після семиденного введення антибіотика (табл.2).
Таблиця 2
Перекисне окислення ліпідів та антиокисна активність сироватки крові щурів після семиденного введення адріаміцину (Mm)
|
Строки дослідження |
Групи тварин |
МДА, мкмоль/мл |
ІАОА, відн.од. |
|
1-ша доба |
Контроль |
142,9412,25 |
,990,04 |
|
Адріаміцин |
227,5411,22* |
1,060,05 |
|
|
4-та доба |
Контроль |
146,4011,20 |
,020,06 |
|
Адріаміцин |
177,2510,87* |
,060,04 |
|
|
7-ма доба |
Контроль |
144,6713,25 |
,030,04 |
|
Адріаміцин |
187,3514,15* |
,080,05 |
Примітка: * - різниця порівняно з контролем достовірна з p<0,05.
При цьому висока інтенсивність ПОЛ утримується протягом усього досліджуваного періоду. Збільшення інтенсивності ліпопероксидації за цих умов відбувається на тлі практично незміненого відносно контролю ІАОА. У мітохондріях серця тварин відзначаються аналогічні зміни ПОЛ і АОА у всі досліджувані терміни після дії курсових ін’єкцій адріаміцину (табл.3).
Таблиця 3
Перекисне окислення ліпідів та антиокисна активність мітохондрій серця щурів після семиденного введення адріаміцину (Mm)
|
Строки дослідження |
Групи тварин |
МДА, нмоль/мг |
ІАОА, відн.од. |
|
1-ша доба |
Контроль |
32,321,93 |
,170,05 |
|
Адріаміцин |
42,182,53* |
1,210,05 |
|
|
4-та доба |
Контроль |
28,333,39 |
,170,08 |
|
Адріаміцин |
39,974,48* |
,240,06 |
|
|
7-ма доба |
Контроль |
31,972,59 |
,170,04 |
|
Адріаміцин |
38,652,43* |
,190,05 |
Примітка: * - різниця порівняно з контролем достовірна з p<0,05.
Таким чином, обидва типи змін функціональної активності серця у відповідь на семиденне курсове введення адріаміцину пов’язані з активацією ПОЛ, не збалансованою системою антиоксидантного захисту, що може бути однією із причин виявлених негативних ефектів цього препарату.
Вплив двотижневого введення адріаміцину на функціональну активність перфузованого серця та рівень перекисного окислення ліпідів у міокарді та крові щурів. Після двотижневого введення АДМ на 1-шу, 3-тю доби після останньої ін’єкції препарату відмінностей у функціональному стані серця щурів дослідної та контрольної груп не зафіксовано. Зміни виявляються пізніше, ніж при попередній схемі введення, на 7-му добу. Ефект введення антибіотика у цей термін дослідження проявляється двояко: відмічене як пригнічення функціональної активності серця у однієї підгрупи тварин, так і підвищення –у другої частини щурів, подібно до виявленого розподілу у перші 3 доби при попередній схемі введення адріаміцину. У тварин групи АДМ І при зниженні насосної функції серця (серцевого викиду, ударного об’єму, роботи) коронарна перфузія істотно не відрізняється від контролю. Для групи АДМ ІІ при початковому підвищенні показників функціональної активності серця відмічено низький ступінь відновлення після гіпоксичного навантаження, що для серцевого викиду становить 55,2%, для роботи –,9%.
При цій схемі курсових ін’єкцій АДМ, метою якої було збереження кумулятивної дії антибіотика при збільшенні тривалості введення, активація ПОЛ у сироватці крові та мітохондріях серця відмічена, починаючи з 1-шої доби після курсових ін’єкцій препарату, тобто раніше, ніж зареєстровані зміни функціональної активності серця. Встановлена аналогічна за характером та ступенем інтенсифікація ПОЛ у крові та мітохондріях серця (табл.4). Істотним є те, що у мітохондріальній фракції серця нагромадження МДА супроводжується достовірним зниженням АОА, на відміну від дослідної групи при 7-денній схемі введення АДМ. Відмінності рівнів антиокисної системи мітохондрій серця щурів контрольної та адріаміцинових груп корелюють із фосфорилюючою здатністю органел. Нами встановлено, що вплив адріаміцину призводить до значного пригнічення окисного фосфорилювання, зокрема, до зниження швидкості окисного фосфорилювання (рис. 4).
Таблиця 4
Перекисне окислення ліпідів та антиокисна активність сироватки крові та мітохондрій серця щурів на 7-му добу після двотижневого введення адріаміцину (Mm)
|
Досліджуване середовище |
Групи тварин |
МДА |
ІАОА, відн.од. |
|
Сироватка крові |
Контроль |
149,3412,01 мкмоль/мл |
1,050,06 |
|
Адріаміцин |
191,7815,06* мкмоль/мл |
1,060,06 |
|
|
Мітохондрії серця |
Контроль |
31,071,52 нмоль/мг білка |
1,230,05 |
|
Адріаміцин |
38,921,91* нмоль/мг білка |
1,050,05* |
Примітка: * - різниця порівняно з контролем достовірна з p<0,05.
Крім того, проведено серію модельних досліджень на мітохондріальних суспензіях кардіоміоцитів контрольних та АДМ-індукованих щурів, у яких визначення рівня МДА та ІАОА проводили при модифікації субстратно-енергетичного потенціалу системи до та після додавання екзогенного АДФ. Вміст МДА у мітохондріальних фракціях обох дослідних груп тварин після функціонального навантаження практично не змінюється відносно вихідного рівня. Вичерпання запасу АДФ у мітохондріях контрольних щурів супроводжується достовірним зменшенням ІАОА від 1,230,05 до 1,090,07 (відн.од.). Відсутність динаміки значно нижчого відносно контролю рівня АОА мітохондрій серця АДМ-індукованих щурів під час функціонального навантаження свідчить, на наш погляд, про виснаження антиокисного резерву цих мітохондрій.
Параметри окисного фосфорилювання мітохондрій кардіоміоцитів щурів. У результаті дослідження параметрів енергетичного обміну мітохондрій серця щурів через 7 діб після двотижневого введення адріаміцину виявлено, що для тварин групи АДМ І характерне значне пригнічення окисного фосфорилювання. У цій групі дослідних щурів Vф становить 38,1 %, АТФ –,3 % від контролю (рис.4). На відміну від цього, у групі АДМ ІІ зниження параметрів окисного фосфорилювання менш виражене і становить порівняно з контролем для Vф –,3 %, АТФ –,1 % відповідно. Встановлене у проведених модельних дослідженнях зменшення антиоксидантного резерву мітохондрій кардіоміоцитів дослідних тварин можна пов’язувати із зниженням потужності окисного фосфорилювання.
Вміст метаболітів окисно-відновних реакцій у крові щурів після двотижневого введення адріаміцину. Індукована адріаміцином активація перекисного окислення ліпідів суттєво змінює співвідношення окисних процесів. Останнє доводить доцільність розширення дослідження спектру параметрів кисеньзалежного метаболізму, зокрема, за рахунок окремих ланок анаеробного і аеробного обміну.
Визначення вмісту метаболітів гліколізу виявило достовірне збільшення концентрації лактату та пірувату у крові всіх дослідних тварин (рис.5). Наростання вмісту молочної та піровиноградної кислот свідчить про активацію гліколітичних реакцій. Підвищення вмісту цих продуктів вуглеводного обміну виявлено і у тканині міокарда. Так, у всіх дослідних тварин вміст молочної кислоти зростає майже вдвічі, а піровиноградної на 21 %. У доступній нам літературі зустрічаються лише епізодичні повідомлення про дослідження гліколізу при курсовому введенні адріаміцину. При цьому зафіксовано збільшення лактату в міокарді у ранні терміни (до однієї доби) та у віддалені періоди (до 6 тижнів) (Kawasaki ,1996).
Таким чином, представлене раніше пригнічення процесів окисного фосфорилювання супроводжуються активацією анаеробних реакцій енергетичного обміну, що виявляється як у тканині міокарда, так і у крові. Така особливість змін різних ланок кисеньзалежного метаболізму може свідчити, що компенсаторне енергозабезпечення функцій міокарда за умов пригнічення аеробної фази метаболізму, зумовлене хронічною дією адріаміцину, реалізується за рахунок активації гліколітичних реакцій.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
На основі проведених досліджень встановлено, що у ранні строки після курсового введення адріаміцину при обох схемах введення препарату зміни функціональної активності серця тварин однорідної популяції проявляються по-різному. У першій групі тварин це виявляється пригніченням функціональної активності серця до навантаження (АДМ І), а у другій групі (АДМ ІІ) значним підвищенням функції серцевого м’яза.
Зміни функціонального стану серця після 7-денного курсу адріаміцину, найбільше виражені на 3-тю добу, очевидно, є компенсованими. Свідченням цього є тенденція до нормалізації насосної функції серця, встановлена при дослідженні змін функціонального стану серцевого м’яза тварин на 5-ий - 7-ий день після останньої ін'єкцій препарату після семиденного введення АДМ.
У групі дослідних тварин з високими вихідними параметрами насосної функції серця відновлення досліджуваних параметрів після гіпоксичного навантаження не зафіксовано. Судячи з порівняльного аналізу рівня функціональної активності серця, споживання кисню міокардом, а також стану метаболічних процесів у групі АДМ ІІ, вихідне збільшення досліджуваних показників не є сприятливим для серцево-судинної системи. Низький ступінь відновлення до вихідного рівня функціональної активності серця після гіпоксичного навантаження у тварин цієї групи свідчить про зниження функціональних резервів серцевого м'яза.
Зниження потужності окисного фосфорилювання мітохондрій кардіоміоцитів у тварин після введення адріаміцину, виявлене у наших дослідженнях, а також зміни інших характеристик енергетичного обміну згідно даних літератури (Sokolove, 1994; Vidal et al, 1996), на нашу думку, є однією з причин пригнічення скоротливої функції серця дослідних тварин. У цих умовах мобілізація анаеробного гліколізу може бути компенсаторною ланкою енергозабезпечення міокарда.
Слід відмітити, що зміни метаболічних процесів, а саме інтенсифікація ПОЛ, зафіксована вже з 1-шої доби після закінчення 2-тижневого курсу препарату, виявляються раніше, ніж зміни функціональної активності серця, які спостерігали на сьому добу, що вказує на показники ліпопероксидації як важливий прогностичний тест.
Виявлена активація ПОЛ у мітохондріях серця та крові щурів, починаючи з першої доби після закінчення курсового введення адріаміцину, є свідченням прооксидантної дії препарату. При цьому підвищення рівня ПОЛ в основному не супроводжується підвищенням активності антиоксидантного захисту. Більше того, достовірне пригнічення АОА, виявлене на 7-му добу після двотижневого введення адріаміцину, корелює із значнішим пригніченням функції серця обох дослідних підгруп у цей термін відносно тварин із 7-денним курсом. При цьому міра активації ліпопероксидації перевищує ступінь індукції антиоксидантного захисту, що також свідчить на користь переважаючого прооксидантного ефекту адріаміцину. Оскільки наростання ПОЛ виявлене при обох типах функціональної активності у відповідь на курсове введення адріаміцину, це може бути свідченням неспецифічного характеру змін процесів ліпопероксидації. При цьому про визначальну роль АДМ-індукованої активації ліпопероксидації як ушкоджуючого фактора мембранозалежних клітинних та субклітинних процесів, виходячи з отриманих даних, однозначно стверджувати не можна. Аналіз даних літератури також показує, що зниження індукованого адріаміцином ПОЛ у деяких випадках не тільки не покращує, але й погіршує функціональний стан серця і зменшує тривалість життя експериментальних тварин (Sridhar et al., 1992). У ряді робіт показано неефективність застосування речовин антиокисної дії в умовах адріаміцинового впливу, що, можливо, пояснюється порушенням оптимального співвідношення між різними компонентами системи антиоксидантного захисту серця та організму в цілому (Dorr, 1996; Kang et al., 1996).
Результати інших наших досліджень також свідчать, що для ефективного запобігання синдрому пероксидації, викликаного дією екстремальних чинників, важливо не лише знизити рівень ПОЛ, але й забезпечити при цьому адекватну потужність енергетичного обміну (Тимочко і сп., 1990-1998). Це в значній мірі визначається ефективністю енергопродукуючих реакцій та в цілому оптимальним співвідношенням про- та антиоксидантних процесів.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети та задач дослідження встановлено, що функціональна реакція міокарда у відповідь на курсове введення адріаміцину залежить від рівня енергозабезпечення та активності антиокисних систем організму.
СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЯ
Ковальчук С.М. Функціональні та метаболічні зміни міокарда щурів під впливом адріаміцину. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 –фізіологія людини і тварин. – Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2001.
У роботі проведено дослідження впливу адріаміцину (АДМ) у ранні строки після закінчення курсового введення препарату на функціональну активність ізольованого перфузованого серця щурів, параметри енергетичного обміну мітохондрій кардіоміоцитів, показники перекисного окислення ліпідів та антиоксидантної активності міокарда та крові, а також вміст молочної та піровиноградної кислот у крові. АДМ вводили доочеревно у разовій дозі 2мг/кг щодня 7 днів, при іншій схемі введення –впродовж 2 тижнів через день. Сумарна доза препарату 15 мг/кг. Після закінчення курсового введення адріаміцину досліджували функціональні характеристики ізольованого перфузованого серця впродовж одногодинної перфузії. Після семиденного введення АДМ, починаючи з 1-ої доби, а після двотижневого введення антибіотика через 7 діб виявлені два типи змін функціонального стану серця на дію препарату: в однієї частини щурів спостерігається пригнічення вихідної функціональної активності серцевого м’яза, в іншої –значна активація функції серця у спокої і зменшення функціональних резервів, виявлене при навантаженні. Встановлено зниження швидкості окисного фосфорилювання та сумарного вмісту АТФ у мітохондріях міокарда дослідних тварин, зростання концентрації лактату і пірувату у крові цих щурів. У всіх дослідних тварин, яким вводили АДМ, починаючи з першої доби, у всі досліджувані терміни відмічена активація перекисного окислення ліпідів як у мітохондріях серця, так і в сироватці крові.
Ключові слова: адріаміцин, ізольоване перфузоване серце, функціональний стан міокарда, перекисне окислення ліпідів, антиоксидантна активність, окисне фосфорилювання, молочна і піровиноградна кислота.
АННОТАЦИЯ
Ковальчук С.Н. Функциональные и метаболические изменения миокарда крыс под влиянием адриамицина. – Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 –физиология человека и животных. Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2001.
В работе проведено исследование влияния адриамицина (АДМ) в ранние сроки после курсового введения препарата на функциональную активность изолированного перфузируемого сердца крыс, параметры энергетического обмена митохондрий кардиомиоцитов, показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности митохондрий миокарда и крови, а также содержание молочной и пировиноградной кислот в крови. АДМ вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 2 мг/кг ежедневно 7 дней, согласно другой схеме введения –на протяжении двух недель через день. Суммарная доза препарата 15 мг/кг. После окончания курсового введения адриамицина исследовали функиональные характеристики изолированного сердца на протяжении одночасовой перфузии. После семидневного введения АДМ, начиная с 1-вых суток, а после двухнедельного введения антибиотика через 7 суток выявлены два типа изменений функционального состояния сердца: у одной части животных наблюдается угнетение исходной функциональной активности сердечной мышцы, в другой –значительная активация функции сердца в покое и уменьшение функциональных резервов, выявленное при нагрузке. Установлено снижение скорости окислительного фосфорилирования и суммарного содержания АТФ в митохондриях миокарда опытных крыс, увеличение концентрации лактата и пирувата в крови этих животных. У всех подопытных животных, которым вводили адриамицин, начиная с первых суток, во все исследуемые сроки отмечена активация перекисного окисления липидов как в митохондриях сердца, так и в сыворотке крови.
Ключевые слова: адриамицин, изолированное перфузируемое сердце, функциональное состояние миокарда, перекисное окисление липидов, антиоксидантная активность, окислительное фосфорилирование, молочная и пировиноградная кислоты.
SUMMARY
Kovalchuk S.M. Functional and metabolic changes in myocardium of rats under adriamycin influence. –Manuscript.
Thesis for receiving a degree of candidate of biological sciences in the speciality 03.00.13. –Human and Animal Physiology. –Ivan Franko Lviv National University, Lviv, 2001.
Research was done of adriamycin influence on functional activity of isolated perfused rat heart, energy metabolism parameters in cardiomyocytes mitochondria, lipid peroxidation and antioxidative activity indices in myocardium and blood as well as lactic and pyruvic acids in blood in early terms after course introduction of the drug. Adriamycin was injected intraperitoneally in a single dose of 2 mg per kg daily during 7 days; according to another scheme it was introduced during a fortnight every other day. Total dose of the drug was 15 mg per kg. After finishing the course introduction functional characteristics of isolated perfused heart were investigated during 1-hour perfusion. Two types of changes in functional state of heart were revealed under influences of adriamycin starting from the 1st day after the 7-day introduction and in 7 days after its fortnight introduction: one part of rats displayed depression of initial myocardium functional state and another showed its considerable activation in normal conditions and decrease of functional reserves, which was revealed under loading. Reduction of oxidative phosphorylation rate and total ATP content in myocardium mitochondria of experimental rats and growth of lactate and pyruvate content in blood of these rats was revealed.
Activation of lipid peroxidation was noted in all experimental animals that received adriamycin in all investigated terms srarting from the 1st day both in mitochondria and in blood serum.
Key words: adriamycin, isolated perfused heart, functional state of myocardium, lipid peroxidation, antioxidative activity, oxidative phosphorylation, lactic and pyruvic acids.
Підписано до друку 29.05.2001 р. Формат 60х901/16
Гарнітура Times New Roman. Умовн. друк арк. 0,9
Наклад 120 прим. Зам. № 4
ПП "Бодлак"
м.Львів, вул. Хоткевича 42/18