Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Было осуществлено проектирование трех генетических конструкций – mb, mbb и mzz.В состав всех конструкций входила нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Mam12 магнетосом M.magnetotacticum. Генетическая конструкция mb содержала нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный полипептид, в котором бактериальный белок Mam12 соединен C-концом через глицин-сериновый шарнир с одним доменом B IgG-связывающего белка A, в Mbb - с двумя доменами B, разделенными глицин-сериновым линкером, и в Mzz - с двумя доменами Z (синтетическими аналогами домена B белка А S. aureus) [Nilsson, B., Moks, T., Jansson, B., Abrahmse´n, L., Elmblad, A., Holmgren, E., Henrichson, C., Jones, T.A., Uhle´n, M., 1987. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. Protein Eng. 1, 107–113.] Глицин-сериновый шарнир считается необходимым для независимого фолдинга доменов гибридных белков [CСЫЛ].
Все конструкции были получены с помощью ПЦР лигазных интермедиатов (Рис.). Итоговые ПЦР-фрагменты гидролизовали рестриктазами NdeI и XhoI и клонировали по соответствующим сайтам в экспрессионный вектор pET23a(+)(ССЫЛ), обеспечивающий высокий выход гетерологично экспрессируемых белков и шестигистидиновую метку.
Рекомбинантными плазмидами (pET23a(+)/mb, pET23a(+)/mbb, pET23a(+)/mzz) трансформировали E. coli штамм XL-1Blue. Скрининг полученных клонов проводили методом ПЦР с использованием плазмидных праймеров, по результатом которого был отобран клоны, несущие искомые вставки.
Далее проводили секвенирование вставки в полученных рекомбинантных плазмидах.
Методом автоиндукции [] была проведена экспрессия полученных генетических конструкций. На Рисунке ХХХ приведены результаты анализа экспрессии полученных генетических конструкций. Из представленных данных следует, что экспрессия генетической конструкции mb приводит к появлению на электрофореграмме полосы белка с молекулярным весом около 21 кДа, конструкций mbb и mzz - около 26 кДа, что соответствует расчетной массе модифицированных белков мембраны магнетосом.
Для определения локализации целевого белка в клетке было проведено фракционирование клеточного лизата штамма-продуцента. Были исследованы фракции растворимых, нерастворимых и мембранных белков (Рис.).
Наличие в составе химерных белков на C-концах дополнительной шестигистидиновой последовательности позволило использовать металло-хелат аффинную хроматографию (МХАХ) на Ni-NTA агарозе []. Для выделения целевых белков и оптимизации условий МХАХ была использована мембранная фракция. Для солюбилизации гибридных белков, а также поддержания белков в растворимом виде использовали ионный детергент лаурилсаркозил. Десорбцию целевого белка проводили, понижая pH элюирующего буфера, одновременно повышая концентрацию имидазола. В результате уже на этой стадии получали очищенные препараты белков Mb, Mbb и Mzz (Рис).
Далее с полученными белковыми фракциями был проведен Western-блоттинг с антителами к шестигистидиновой метке, по результатам которого было показано, что произошла экспрессия именно целевых белков (Рис).
Выход очищенного белка Mb составил 33 мг, белка Mbb – 35,1 мг, Mzz – 36 мг на 1 литр культуры.
Исследование активности модифицированных белков.
Для определения способности гибридных белков связывать Fc-фрагмент антител проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) по схеме (Рис. 28). Полученные данные представлены……(Рис. 28)
Определение константы связывания гибридных белков с антителами.
Специфичность взаимодействия определяли путем вычисления константы диссоциации комплекса гибридного белка с антителом. Исследование проводили по методу, предложенному Loomans (E.M.G. Loomans, A.J.M. Roelen, H.S. Van Damme, H.P.J. Bloemers, T.C.J. Gribau, W.J.C. Schielen. 1995. Assessment of the functional affinity constant of monoclonal antibodies using an improved enzyme-linked immunosorbent assay // J. Immunol. Methods. 184. 207 – 217)
В условиях данного эксперимента, на сорбционную поверхность наносили 1 мкг каждого гибридного белка. После чего добавляли кроличьи антитела против Fc-фрагмента антител мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. (рис)
В результате величина константы в системе Mb-Ат составила 4,83 нМ, Mbb - 1,69 нМ, Mzz - 1,44 нМ.