Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
73
Последние несколько лет характеризуются большим потоком исследований, в которых разрабатываются или используются системы генетической трансформации клеток млекопитающих индивидуальными прокариотными или эукариотными генами. Попытки изменения генотипа и фенотипа клеток животных с помощью изолированной ДНК предпринимались, начиная с 40-х гг. 20 века, однако убедительные доказательства возможности такой трансформации были получены сравнительно недавно в связи с развитием тонких методов анализа ДНК с помощью рестриктаз и секвинирования, а также техники молекулярного клонирования генов.
Методы генетической трансформации существенно расширяют возможности исследования фундаментальных генетических процессов в эукариотных клетках. С помощью них получены новые данные о регуляции экспрессии генов, контроле природных процессов генетической рекомбинации, репликации и сегрегации ДНК, механизмах злокачественной трансформации клеток и роли клеточных онкогенов.
Принципиально новые возможности по сравнению с традиционными методами мутагенеза и селекции открываются благодаря новой технологии в области биоконструирования, т.е. создания новых типов клеток и организмов с нужными комбинациями признаков. Прежде всего это относится к получению культивируемых вне организма клеточных линий, в которых выражаются гены, кодирующие полезные для человека белки: гормоны, ферменты, антигены. Хотя многие эукариотные гены удается заставить работвть в бактериях, при этом не всегда получаются полипептиды, обладающие нужной биологической активностью. Большие возможности открываются также для разработки новых методов лечения (соматической коррекции) наследственных заболеваний, а также ненаследственных болезней. Полноценный вариант последнего может вводится или непостредственно в организм, или через пролиферирующие вне организма клетки, например, костного мозга.
Наиболее реальными нам представляются следующие подходы к интродукции в геном животных чужеродного гена:
Первый подход разработан Клайном. Клетки костного мозга были трансформированы геном дегидрофолатредуктазы, обеспечивающим устойчивость к метотрексату.
Учитывая, что в нормальном состоянии они весьма чувствительные к этому соединению, авторы культивирования in vitro трансформированные стволовые клетки в его присутствии и т.о. отбрали клетки, включившие в геном чужеродный ген и получившие благодаря этому устойчивость к метотрексату. Далее эти клетки ввели в костный мозг и по ряду признаков ( хромосомный маркер, устойчивость к метотрексату) показали, что данный ген функционировал в организме животного. Интродукцию гена проводили с помощью ДНК, осажденной фосфатом кальция. Перспективы введения чужеродной ДНК в клетки костного мозга этим методом имеют ряд ограничений, обусловленных прежде всего низкой частотой трансформации – в среднем одна из 105 клеток. Стволовые клетки составляют менее 0,01% от всех клеток костного мозга, м при использовании 10-20 мл костномозговой жидкости ( 106 стволовых клеток) для внедрения чужеродного гена только одна стволовая клетка может иметь новый ген. Более высокий процент возможно получить при введение гена в составе дефектного вируса, например, ретровируса, что обеспечивает большую частоту передачи чужеродного гена.
Второй подход был опробирован на примере гена препроинсулина крыс. Животным внутривенно вводили ген в составе липосом, что обеспечивало частичную защиту ДНК от нуклеаз. Оказалось, что уровень глюкозы в крови крыс снизился почти в 2 раза, а радиоиммунологически было обнаружено увеличение количества инсулина в ней. Синтез последнего у животных продолжался в течение 10 ч и происходил в селезенки и печени. Предварительный анализ показал, что при этом, по-видимому. Происходит интеграция введенного таким способом гена. Авторы полагают, что после разработки более совершенных способов, обеспечивающих интеграцию вводимого гена, станет возможным получение стабильной генетической трансформации взрослых млекопитающих. Однако для данного подхода, как и для предыдущего. Наиболее трудной задачей является создание эффективной системы регуляции введенного в организм гена, подобной или идентичной нормальной регуляции его активности.