Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Вирусология. Тема 3
Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия в вирусологии
В люминесцентной микроскопии, используется явление фотолюминесценции т.е. способность объекта светиться при пропускании через него пучка ультрафиолетовых лучей.
Источниками ультрафиолетовых лучей в люминесцентном микроскопе являются ртутно-кварцевые лампы. Для проведения люминесцентной микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, которые должны быть установлены в специальном затемненном помещении. При люминесцентном исследовании перед микроскопией на мазки наносят специальное нефлуоресцирующее масло.
Некоторые объекты, рассматриваемые при люминесцентной микроскопии, могут давать собственную люминесценцию (аутолюминесценцию), как, например, грибки-возбудители микроспории; такие объекты смотрят без всякой дополнительной окраски. Однако бактерии и вирусы аутолюминесценцией не обладают, поэтому мазки надо обрабатывать либо специальными красками (флуорохромы), либо мечеными (флуоресцирующими) антителами. В связи с этим все методы обработки мазков для люминесцентной микроскопии можно разделить на две группы;
Метод флуорохромирования (МФ)
По своей технике этот метод почти ничем не отличается от методов обычной окраски мазков, применяемых при световой, обычной микроскопии. Для этих целей используют анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски называются флуорохромами, а окраска ими - методом флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители, как аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000, 1:10000.
Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах.
В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение в ядрах или цитоплазме пораженных вирусом клеток в виде различных гранул и телец-включений, а если клетка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон.
Метод флуорохромирования широко применяется при диагностике бактериальных болезней, и вирусных – на наличие в исследуемом материале телец-включений.
Методы флуоресцирующих антител (МФА)
МФА основаны на принципе специфического взаимодействия антигена со специфическими антителами.
Антигены – это генетически чужеродные макроорганизму вещества белковой природы, которые при попадении или введении в организм (парэнтерально) обладают способностью вызывать образование специфических антител. В вирусологии антигенами являются возбудители – вирусы и их белки.
Антитела – это специфические белки сыворотки крови макроорганизма (гамма-глобулины), образующиеся в ответ на попадение или введение в организм антигенов и дл борьбы с ними.
Антигены и антитела специфичны друг другу, взаимодействуют друг с другом и in vivo и in vitro. Реакции взаимодействия антигенов и антител можно использовать в диагностических целях. Если мы имеем специально полученные диагностические сыворотки животных-доноров с заведомо известными антителами, то, поставив серологическую реакцию, можно выявить неизвестный, специфичный этим антителам антиген – вирус. И наоборот: если у нас имеется заведомо известный антиген-диагностикум (идентифицированный, убитый или ослабленный вирус), то, поставив с его помощью серологическую реакцию, мы м можем обнаружить специфические этому антигену антитела в сыворотке крови больного животного и, следовательно, диагностировать болезнь.
При постановке МФА используют антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатно-зеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген, специфический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с данным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом. Следовательно, здесь свечение антигена происходит не за счет окрашивания его, а за счёт связавшихся с антигеном специфических окрашенных антител. Таким образом, все МФА являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставят их не в пробирках, а на предметном стекле. В настоящее время налажено производство флуоресцирующих иммунных сывороток и гамма- глобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструкции по применению с указанием титра антител. Их растворяют для использования по мере надобности согласно инструкции, хранят в холодильниках при +4° С. Некоторые флуоресцирующие сыворотки выпускают в жидком виде.
МФА находят широкое применение при диагностике многих вирусных болезней, таких как бешенство, грипп, болезнь Ауески, вирусный гепатит плотоядных, чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др.
Все методы флуоресцирующих антител можно разделить на 2 разновидности:
а) с использованием антивидовой флуоресцирующей
сыворотки или иммуноглобулина (метод Уэллера и Кунса, 1954 г.);
б) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Гольдвассера-Шепарда, 1858 г.).
Прямой МФА. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности и поэтому более широко применяется в практической работе.
Сущность и техника прямого МФА заключается в том, что на предметное стекло с фиксированным на нем мазком, или мазком-отпечатком из вируссодержащего материала наносят 2-3 капли специфической подозреваемому антигену (вирусу) флуоресцирующей иммунной сыворотки, или иммуноглобулина и помещают в чашку Петри с комочком ваты, смоченным водой( влажная камера) и выдерживают в термостате в течение 30-40 минут при 36-37° С, а затем промывают, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой в люминесцентном микроскопе.
Если антиген и антитела специфичны, образуется комплекс «антиген + антитело», который не смывается при промывании мазка, и при микроскопии препарата будет отчетливо видно яркое салатно-зеленое свечение антигена за счет адсорбированных на нем флуоресцирующих антител.
Если же антитела были неспецифичны антигену, находящемуся в мазке, или антигена в мазке вообще не было (от здоровых животных), то свечения антигена не будет, и поле зрения будет темным, потому что антитела не связались с фиксированным мазком и смылись при промывании мазка. Предметные стекла для МФА должны быть тонкие, чистые и хорошо обезжиренные.
К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом методе в лаборатории на каждое вирусное заболевание нужно иметь специфическую флуоресцирующую сыворотку или глобулины, а они пока еще сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.
Рисунок:
Непрямые МФА называются так потому, что флуоресцирующие антитела адсорбируются не на сам вирусный антиген, а на посредника, в качестве которого может быть специфическое вирусному антигену неокрашенное антитело (при антивидовом методе) или комплемент (при антикомплементарном методе).
Непрямой МФА с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки. На фиксированный мазок или отпечаток наносят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) иммунную неокрашенную сыворотку или иммуноглобулин, и выдерживают во влажной камере или термостате при 37°С 30-40 минут, затем промывают буферным раствором и водой. Если в мазке имеется антиген, специфичный антителам сыворотки, образуется комплекс «антиген + антитело» (Аг + Ат), который не смывается при промывании мазка, но и не светится(!) в люминесцентном микроскопе. Поэтому мазок дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулином (антивидовую сыворотку или глобулин получают путем гипериммунизации кроликов или других видов животных сывороткой или глобулинами того вида животньх, на которых получали специфическую для вируса гипериммунную нефлуоресцирующую сыворотку, и такую антивидовую сыворотку обрабатывают флуорохромом, обычно ФИТЦ). Антивидовую флуоресцирующую сыворотку наносят на мазок и выдерживают его во влажной камере при 37° С 30-40 минут, затем промывают водой или буфером и водой, высушивают на воздухе и просматривают мазок. Антитела из флуоресцирующей антивидовой сыворотки, если они специфичны глобулинам неокрашенной иммунной противовирусной сыворотки, адсорбируются на комплексе Аг + Ат; образуется новый комплекс: «Аг (вируса) + At противовирусной неокрашенной сыворотки (они же являются Аг для антивидовой сыворотки) + Ат (флуоресцирующие) антивидовой сыворотки».
При просмотре под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплекс будет светиться ярким салатно-зеленым цветом за счет флуоресцирующих антител антивидовой сыворотки.
Если же на первом этапе обработки компоненты были неспецифичны или не было в мазке антигена, комплекс «Аг+Ат» не образуется и антивидовые флуоресцирующие антитела не
свяжутся, при промывании мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.
Рисунок:
Непрямой МфА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки. Этот метод по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставят реакция на предметном стекле и вместо гемолитической системы используют флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку.
Получают антикомплементарную сыворотку путем гипериммунизации кроликов нативной свежей сывороткой морской свинки (комплемент). У кролика образуются антикомплементарные антитела, которые будут специфичны белкам сыворотки крови морской свинки (комплементу). В реакцию они будут вступать только с сывороткой крови морской свинки, которая является комплементом в РСК. Такую антикомплементарную сыворотку обрабатывают флуорохромом ФИТЦ. Получается флуоресцирующая антикомплементарная сыворотка.
На приготовленный и фиксированный мазок вначале наносят одновременно специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) нефлуоресцирующую иммунную сыворотку и комплемент в рабочих титрах, контактируют в термостате при 37° С во влажной камере 30-40 минут, а затем промывают водой.В случае, если антиген в мазке будет специфичен нанесенным антителам, образуется комплекс «Аг вируса + Ат», на который адсорбируется комплемент и весь этот комплекс «Аг вируса + Ат иммунной неокрашенной сыворотки + комплемент» не смоется, но свечения под люминесцентным микроскопом не будет. Чтобы обнаружить этот комплекс, на мазок дополнительно затем наносят антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и вновь контактируют во влажной камере термостата 30-40 минут, после чего промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микроскопом.
Флуоресцирующие антитела из антикомплементарной сыворотки адсорбируются на комплексе и весь вновь образовавшийся комплекс «Аг вируса + Ат специфической неокрашенной противовирусной сыворотки + комплемент + антикомплементарное Ат» в результате будет ярко светиться салатно-зеленым цветом.
Преимуществом данного метода является то, что при этом методе для диагностики на любое бактериальное или вирусное заболевание достаточно иметь в лаборатории лишь одну антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и наборы специфических гипериммунных неокрашенных сывороток.
3