Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Інститут фармакології та токсикології
Кравець Дмитро Станіславович
УДК 615.3:577.161.3
ТОКСИКОКІНЕТИКА ДИНІТРООРТОКРЕЗОЛУ В УМОВАХ ПРОФІЛАКТИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ СИЛІБОРУ З АЦЕТАТОМ
a-ТОКОФЕРОЛУ
14.03.06 – токсикологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ЛУК'ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук ОВСЯННИКОВА Людмила Михайлівна, Інститут клінічної радіології НЦРМ АМН України, завідуюча лабораторією спеціальних методів дослідження
доктор медичних наук ЖИРНОВ Віктор Валентинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії АН України, завідувач лабораторії молекулярних механізмів клітинної сигналізації
Провідна установа: Інститут екогігієни та токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України
Захист дисертації відбудеться “ 23 ” травня 2001 р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м.Київ, вул.. Ежена Потьє, 14
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м.Київ, вул.. Ежена Потьє, 14
Автореферат розісланий 20 квітня 2001 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01. кандидат біологічних наук Данова І.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Одним з пріоритетних напрямків сучасної токсикології є вивчення, лікування і попередження патологічних станів, викликаних впливом на організм ксенобіотиків хімічної природи. Серед органічних сполук, які широко використовуються в промисловості й сільському господарстві, важливе місце посідають алкілпохідні 2,4-динітрофенолу (2,4-ДНФ), зокрема, динітроортокрезол (ДНОК), промисловий синтез якого щорічно зростає, у тому числі в Донбаському регіоні на Рубіжанському ВАТ “Краситель”. ДНОК відрізняється надто високою токсичністю і небезпекою для осіб, що контактують з ним як в умовах виробництва, так і застосування в різноманітних галузях народного господарства, у тому числі і в аграрному секторі України в якості пестицидного препарату (Р.Магош, 1984; Г. А. Можаев и др., 1998; О. В.Січанова , 1999).
При порушеннях регламентів технології синтезу, правил техніки безпеки, в аварійних ситуаціях можливі як гострі, так і хронічні отруєння хімічними сполуками, у тому числі і ДНОК, що нерідко приводять до летального наслідку. Однак лікування отруєнь цими ксенобіотиками зводиться, як правило, до застосування засобів симптоматичної терапії. Причиною цього є те, що в арсеналі практичних лікарів відсутні високоефективні і доступні патогенетичні засоби лікування та лікарської профілактики отруєнь ДНОК.
У літературі (В.Д.Лукьянчук, 1988) є вказівки на те, що лікувально-профілактичний засіб, який застосовується при ДНОК-інтоксикації повинен в собі поєднувати властивості індуктора монооксигеназної системи і антиоксиданта з мембраностабілізуючим ефектом. Роботами (Л.В.Савченкова, 1991; Г.К.Грызунова, 1993), проведеними раніше в лабораторії кафедри фармакології ЛДМУ, встановлено, що біофлавоноїди мають можливість індукувати монооксигеназну систему печінки. Іншими авторами (А.Н.Венгеровский и др., 1987) виявлена можливість біофлавоноїдів перешкоджати утворенню і накопиченню в печінці первинних і кінцевих продуктів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ), а також їхній вплив на стабілізацію біомембран.
Разом з тим, до нинішнього часу відсутня в повному обсязі інформація про токсикокінетику ДНОК та можливість її модифікації за допомогою засобів детоксикації, які застосовуються з профілактичною метою, що перешкоджає вивченню умов оптимального забезпечення попередження взаємодії між токсичним агентом і чутливими до нього біосубстратами організму в умовах попереднього введення різноманітних препаратів, включаючи біофлавоноїди і антиоксиданти.
Таким чином, викладене вище вказує на необхідність експериментального обґрунтування доцільності застосування біофлавоноїдів у комбінації з антиоксидантами і вивчення їхнього впливу на характер перебігу токсичного процесу, викликаного ДНОК в плані модифікації його токсикокінетики.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в плані основних напрямків наукових досліджень кафедри фармакології ЛДМУ за темою “Експериментальна розробка засобів фармакокорекції екстремальних станів” (№ держ. реєстрації 0198U4009100, 1999-2003 рр.), а також на прохання зацікавлених промислових підприємств (лист керівництва ВАТ “Краситель” м. Рубіжне Луганської області № 15 від 22 січня 1998р.) та організацій (лист начальника відділу №6 Українського НДЦ пожежної безпеки МВС України № 96 від 27 жовтня 1999 р).
Мета і задачі дослідження. Мета роботи - експериментально обґрунтувати необхідність профілактичного застосування біофлавоноїдів і антиоксидантів при гострому отруєнні ДНОК та спроможність цих препаратів модифікувати токсикокінетику отрути на різних етапах її проходження в організмі.
Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:
1. Провести скринінг потенційних лікувально-профілактичних засобів серед біофлавоноїдів, антиоксидантів з різноманітними механізмами дії та ентеросорбентів в умовах гострої (ЛД50) пероральної інтоксикації білих щурів ДНОК.
2. Розробити оптимальний режим дозування комбінації найбільш ефективного біофлавоноїда й антиоксиданту при ДНОК-інтоксикації.
3. Розробити високочутливий спосіб ідентифікації ДНОК в органах і тканинах тварин, отруєних цим ксенобіотиком.
4. Розробити пакет комп'ютерних програм розрахунку хемобіокінетичних параметрів ксенобіотиків на основі лінійних часткових моделей.
5. Дослідити вплив силібору в комбінації з ацетатом a-токоферолу на процеси всмоктування і біотранспорту ДНОК в умовах гострої інтоксикації.
6. Оцінити спроможність комбінації силібору з ацетатом a-токоферолу модифікувати процеси біотрансформації і розподілу по органам і тканинам ДНОК.
7. Визначити інтенсивність екскреції ДНОК з організму під впливом комбінації силібору з ацетатом a-токоферолу при інтоксикації цією отрутою.
Об'єкт дослідження – комбінована лікарська профілактика токсичного процесу, що розвивається в умовах гострого перорального отруєння ДНОК.
Предмет дослідження – дослідження токсикокінетики ДНОК на фоні застосування комбінації силібору з ацетатом a-токоферолу.
Методи дослідження. Використовувався комплексний методичний підхід з притягненням набору токсикологічних, фармакологічних, фізико-хімічних і математичних методів дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше теоретично обґрунтована і експериментально підтверджена ефективність профілактичного застосування комбінації біофлавоноїду силібору з антиоксидантом ацетатом a-токоферолу, а також розроблений оптимальний режим їхнього дозування в умовах гострого отруєння ДНОК.
Розроблений принципово новий методичний підхід до ідентифікації ДНОК в органах і тканинах теплокровних, а також оригінальний пакет комп'ютерних програм розрахунку комплексу хемобіокінетичних параметрів, у тому числі визначення кількісних показників спроможності транспортних білків зв'язувати ксенобіотики.
Отримані та проаналізовані в роботі з використанням математичного апарату факти дозволили встановити закономірності кінетики ДНОК на етапах абсорбції, біотранспорту, розподілу, біотрансформації й екскреції на фоні комбінованої лікарської профілактики гострої ДНОК-інтоксикації. При цьому поширені і поглиблені існуючі уявлення про токсикологію алкільних похідних 2,4-ДНФ та фармакологію біофлавоноїдів, що застосовуються в комбінації з антиоксидантами природного походження.
Визначені шляхи спрямованого використання захисно-адаптаційного механізму організму під впливом токсичних агентів в плані подальшої розробки принципів їх знешкоджування на різних етапах токсикокінетики.
Практична значимість одержаних результатів. Результати окремих фрагментів дослідження впроваджені в практику охорони здоров'я та в роботу наукових закладів України у формі:
– “Методичних рекомендацій по вивченню зв'язування лікарських засобів з білками сироватки крові” (Київ-Луганськ: ІБОНХ НАН України, ЛДМУ МОЗ України.- 1999р.), які використовуються в наукових дослідженнях Інституту екогігієни і токсикології ім. Л. І. Медведя МОЗ України, Державного наукового центру лікарських засобів Держкоммедбіопрому України, Українського інституту ендокринології і обміну речовин АМН України, Луганського державного медичного університету МОЗ України;
– “Методических рекомендаций по компьютерным расчетам фармакокинетических параметров лекарственных средств (линейные частевые модели)” (Киев: Государственный фармакологический центр МЗ Украины. – 2000г.), які використовуються в практичній роботі фахівців в галузі токсико- і фармакокінетики, фармакології, токсикології, що займаються питаннями медико-біологічних іспитів лікарських засобів;
– інформаційних листів про нововведення в системі охорони здоров'я:“Оптимізація фармакотерапії силібором отруєння динітроортокрезолом” (Луганський ЦНТЕІ.- 1998 р., № 50-98), “Визначення динітроортокрезолу в органах та тканинах організму” (Луганський ЦНТЕІ.- 1999 р., №18-99), “Детоксикація організму силібором в комбінації з вітаміном Е на етапі біотранспорту в умовах гострого отруєння ДНОК” (Луганський ЦНТЕІ.- 2000 р., № 17), “Хемобиокинетика динитроортокрезола и ее модификация комбинацией лекарственных средств” (Луганский ЦНТЭИ.– 2000 г., № 36), які впроваджені в роботу токсикологічного, реанімаційного і профпатологічного відділень Луганської обласної клінічної лікарні й Луганської обласної санітарно-епідеміологічної станції.
За матеріалами експериментальних досліджень отримано патент України №33477А від 15 лютого 2001 р. “Спосіб індикації динітроортокрезолу”, а також посвідчення ЛДМУ на раціоналізаторську пропозицію №3185 від 12 листопада 1999 р. “Устройство для упаривания экстрактов биопроб в токе газообразного азота”.
Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології і клінічної фармакології Дніпропетровської і Буковинської державних медичних академій і Української медичної стоматологічнії академії (акти впровадження від 16 лютого, 6 березня і 30 березня 2000 р., відповідно).
Отримані в роботі дані можуть служити експериментальним обґрунтуванням для клінічних досліджень з оптимізації лікарської профілактики та фармакотерапії патології хімічної етіології.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно визначена мета і поставлені задачі, обрані методичні підходи дослідження, здійснено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукових серверів Yandex, Rambler, AltaVista, Aport, а також медичної бази даних Medline мережі Інтернет. Самостійно виконані всі фрагменти експериментальних досліджень і написаний огляд літератури. Статистична обробка, узагальнення і аналіз отриманих даних, розробка основних положень роботи й її висновків зроблені дисертантом особисто. Співавтори виданих робіт, в тому числі методичних рекомендацій, інформаційних листів і патенту України, надавали консультативну допомогу з методичних та теоретичних питань.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися і отримали позитивну оцінку на науково-практичній конференції “Актуальні проблеми екогігієни і токсикології” (Київ, 1998); науковій конференції, присвяченої 75-річчю з дня народження Ю. С. Кагана “Актуальні проблеми токсикології” (Київ, 1999); V національному з'їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації у новому тисячолітті” (Харків, 1999); міжвузівській науково-практичній конференції молодих вчених та студентів “Комп'ютерні технології, фізичні методи лікування”, присвяченій 5-й річниці утворення ЛДМУ (Луганськ, 1999); VIII конгресі світової федерації Українських лікарських товариств (Львів-Трускавець, 2000); 4 Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2000); науковій конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня народження акад. В. П. Філатова (Одеса, 2000); засіданнях Луганського відділення Українського наукового товариства фармакологів (Луганськ, 2000).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових робіт, з них 8 статей, у тому числі 6 в наукових фахових виданнях, 2 методичні рекомендації, 4 інформаційних листа, а також 6 тез доповідей на наукових форумах.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи дослідження”, 7 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку літератури, що включає 123 вітчизняних і 131 зарубіжних джерел і 2 додатків. Робота викладена на 217 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 15 рисунками та 21 таблицею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Токсикокінетичні дослідження проводились на моделі гострої пероральної ДНОК-інтоксикації. Досліди виконані на 870 білих безпородних, а також лінії “Wistar” щурах, масою 160-230 г обох статей після проходження двохтижневого карантину в умовах віварію ЛДМУ з урахуванням “Правил доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)”(1992).
Використані в роботі методичні принципи і прийоми постановки токсико-фармакологічного експерименту виконані у відповідності з існуючими рекомендаціями і вказівками (Ю. В. Бурова., 1992), а також “Методическими рекомендациями по выведению лабораторных животных из эксперимента” (Киев, 1986).
Експериментальною моделлю служив патологічний процес, який розвивається у тварин при внутрішньошлунковому введенні 1% водного розчину натрієвої солі ДНОК виробництва Рубіжанського ВАТ “Краситель” у дозі, відповідній середньосмертельній (ЛД50) і більше. В основу моделювання гострої пероральної ДНОК-інтоксикації покладені результати раніше проведених (В. Д. Лукьянчук, 1988) досліджень. При визначенні величини ЛД50 і її помилки, а також індексу профілактичної ефективності (ІПЕ) препаратів, які вивчаються, застосовували експрес-метод (В. Б. Прозоровский и др., 1978).
У роботі використовували силібор Харківської фармацевтичної фірми “Здоров'я” і ацетат a-токоферолу, виробництва АТ “Київський вітамінний завод”. При розробці оптимального режиму дозування комбінації цих препаратів їх вводили в різних дозах і в різний час до та після надходження ДНОК до організму, а також одночасно з отрутою.
Визначення функції залежності ефекту від доз комбінації препаратів здійснювали засобом двохфакторного експерименту (Е. Е. Рафаэлес и др., 1971) за допомогою спеціально розробленої нами програми, яка дозволяє обчислити коефіцієнти поліному вигляду:
Y=a0+a1d1+a2d2+a11d12+a22d22+a12d1d2, де
Y – виживання (%); d1 – доза силі бору (мг/кг);
d2 –доза a-токоферолу (мг/кг).
Аналіз цієї залежності й обчислення оптимальних доз проводили шляхом максимізації отриманої нелінійної функціональної залежності графічним способом з використанням стандартної програми Math Engine V. 2.001.
Оптимальний час введення комбінації препаратів, яка вивчається, проводили шляхом інтерполяції отриманих в досліді даних ефективності останніх (% виживання) на квадратичну функцію з наступним її математичним аналізом і обчисленням її точки екстремуму прирівнюванням похідної першого порядку до нуля (В. Б. Прозоровский и др., 1978).
Збір сечі у лабораторних тварин проводили за допомогою обмінних камер після попереднього водного навантаження (5% від маси тіла щурів). Збір жовчі здійснювали під наркозом (70 мг/кг тіопентала натрію внутришньочеревинно) шляхом дренування загального жовчного протока полівініловим катетером діаметром 1 мм. Кал попередньо висушували при температурі 60оС без доступу повітря протягом 4 годин.
Кількісний вміст ДНОК в крові, сечі і жовчі оцінювали за способом, описаним О. Н. Буркацькою (1978), а у внутрішніх органах і мускульній тканині визначали за розробленим нами способом.
Токсикокінетичні параметри ДНОК – максимальна концентрація в біосередовищі (Cmax), час досягнення максимальної концентрації в біосередовищі (tmax), константа швидкості елімінації (kel), константа швидкості екскреції (kex), константа швидкості абсорбції (k01), константи швидкостей переходу (kij), період напівелімінації (t1/2), період напівабсорбції (t1/2,a), період напіврозподілення (t1/2,a), початкова концентрація, яка здається (С0), період напіввиведення (t1/2,ex), об'єм розподілення (Vd), загальний об'єм розподілення (Vb), питомий об'єм розподілення (Dd), стаціонарний об'єм розподілення (Vss), стаціонарна концентрація (Css), загальний кліренс (Clt), площа під кінетичною кривою графіка залежності концентрації від часу (AUC), середнього часу перебування ксенобіотика в організмі (MRT)) розраховували в межах одночасткової моделі, одночасткової моделі зі всмоктуванням, двухчасткової моделі, а також двухчасткової моделі зі всмоктуванням за розробленою нами комп'ютерною програмою з використанням прийому розрахунку їхньої величини, описаному в літературі (В. Н. Соловьев и др., 1980; Л. Е. Холодов и др., 1985; В. Г. Зиньковский, 1998). Основні фармакокінетичні параметри ДНОК розраховували на основі функції залежності концентрації від часу в логарифмічних координатах.
Кількісні показники зворотнього комплексоутворення ксенобіотика, що досліджується, визначали методом рівноважного діалізу (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984). Параметри, які характеризують процес зворотнього зв'язування – константу асоціації (kасс) і число місць зв'язування (N), розраховували за спеціально написаною нами комп'ютерною програмою.
Розробку всіх використаних комп'ютерних програм проводили на мові Turbo Pascal V. 7.0 із застосуванням стандартних модулів (DOS, Crt, Graph, Printer) (В. В. Фаронов, 1998; А. В. Фролов, 1993; Л. Скэнлон, 1991).
Для більш коректного судження про вплив засобів профілактики ДНОК-інтоксикації, що вивчаються, на процеси біотранспорту отрути сироватковими білками нами вперше введений індекс підвищення споріднення (ІПС), який обчислювали як відношення kасс при введенні препаратів, що вивчаються до ДНОК до kасс білків сироватки інтактних тварин.
Про стан детоксикуючої системи печінки в умовах експерименту, що вивчаються, судили за активністю НАДФ-залежної монооксигеназної гідроксилюючої системи печінки. З цією метою нами вивчалися процеси N-деметилювання амідопирину, про інтенсивність яких судили по виведенню з сечою його основних метаболітів (4-аміноантипірину, N-ацетил-4-аміноантипірину) (О.В. Леоненко, 1981). Стан знешкоджуючої функції печінки оцінювали за тривалістю тіопенталового сну, який вводили внутрішньочеревинно в дозі 70 мг/кг.
Усі використані в роботі одиниці вимірів приведені у відповідність з міжнародною системою одиниць (СІ) (Г. Липрет, 1980). Отримані цифрові значення оброблені статистично за допомогою критерію t Ст'юдента (Ю.И. Иванов, 1990), який вираховували на ЕОМ Celeron 466 MHz за допомогою написаної нами програми, а також непараметричного критерію Фішера для чотирипільної таблиці (Е. В. Гублер, 1966).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Токсикометричними дослідженнями встановлено, що ЛД50 ДНОК складає 48,7±7,7 мг/кг (43,0ё55,0), що згідно ГОСТу 12.1.007-76 дозволяє його віднести до II класу токсичності – до групи високотоксичних сполук.
У скринингової серії досліджень вивчались біофлавоноїди, антиоксиданти та ентеросорбенти, теоретичною основою для вибору яких стали дані літератури (В. Д. Лукьянчук, 1988), а також результати досліджень, які отримані в лабораторії нашої кафедри (Л. В. Савченкова, 1991; О. В. Січанова, 1999). На розробленій експериментальній моделі гострого отруєння ДНОК білих щурів встановлено, що з 19 вивчених препаратів найбільш високу і вірогідно значущу (P<0,025) профілактичну активність виявляють біофлавоноїд силібор (+83,4%), антиоксидант ацетат a-токоферолу (+50,0%) і особливо їх комбінація (+100,0%). У той же час протекторні властивості вивчених ентеросорбентів (вугілля активоване, карболонг, ентеросорбент СКН, поліпефан) при гострій пероральній ДНОК-інтоксикації тварин значно нижчі, ніж при застосуванні силібору та ацетату a-токоферолу.
Комплексні фармакометричні дослідження по розробці оптимального дозового режиму комбінованого застосування силібору з ацетатом a-токоферолу дозволили встановити, що найбільш високу детоксикуючу активність препарати виявляють при їх введенні в дозах 140,65 мг/кг і 21,52 мг/кг, відповідно за 70 хв до початку надходження ДНОК до організму. При цьому ІПЕ складає 1,88, а при роздільному введенні біофлавоноїду і антиоксиданту –1,49 і 1,19, відповідно.
Токсикокінетичним дослідженням передувала розробка високочутливого метода визначення ДНОК в органах і тканинах тварин, оскільки раніше існувала методика визначення цієї отрути тільки в крові і сечі, яка описана О. М. Буркацькою (1978).
Принцип запропонованого нами методу, пріоритетність якого захищена Патентом України, полягає в попередній обробці гомогенатів органів і тканин розчином хімопсину та інкубації протягом 8-12 год при температурі 37±0,5 оС з наступним спектрофотометруванням при довжині хвилі 440 нм.
З метою оптимізації, в плані підвищення точності обчислень і зменшення їхньої трудомісткості, а також підвищення швидкості розрахунків токсікокінетичних параметрів ДНОК на різних етапах його проходження в організмі, включаючи визначення показників, які характеризують процеси оборотнього комплексоутворення отрути з білками сироватки крові, розроблений оригінальний пакет комп'ютерних програм на основі лінійних часткових моделей, який дозволяє в оперативному режимі розраховувати наступні кінетичні параметри: максимальну концентрацію ксенобіотику в біосередовищі, час досягнення максимальної концентрації ксенобіотику в біосередовищі, константу швидкості елімінації, константу швидкості екскреції, константу швидкості абсорбції, константи швидкостей переходу, період напівелімінації, період напівабсорбції, період напіврозподілу, уявну початкову концентрацію, період напіввиведення, об'єм розподілу, загальний об'єм розподілу, питомий об'єм розподілу, стаціонарний об'єм розподілу, стаціонарну концентрацію, загальний кліренс, площу під кінетичною кривою, а також константу асоціації комплексу “ліганд-білок” та число місць фіксації білковою молекулою ксенобіотику (N).
Комплексне вивчення токсикокінетики ДНОК в умовах профілактичної фармакокорекції гострої ДНОК-інтоксикації силібором в комбінації з ацетатом a-токоферолу показало, що вже на першому етапі – абсорбції, застосування цих засобів реалізується півторакратним зниженням константи швидкості абсорбції токсиканта в системний кровообіг і таким же збільшенням періоду його напівабсорбції, наслідком чого є зменшення в 1,75 рази максимальної концентрації отрути і зниження його біодосягненості на 16% (див. рисунок і табл. 1).
Рисунок. Динаміка рівня ДНОК у крові отруєних щурів на фоні введення силібору в комбінаії з ацетатом a-токоферолу.
Таблиця 1
ОСНОВНІ ФАРМАКОКІНЕТИЧНІ ПАРАМЕТРИ, ЯКІ ХАРАКТЕРИЗУЮТЬ КІНЕТИКУ ДНОК (ЛД50) В РАМКАХ ЦЕНТРАЛЬНОЇ КАМЕРІ В КОНТРОЛІ ТА ПРИ ПРОФІЛАКТИЧНОМУ ЗАСТОСУВАННІ СИЛІБОРУ З a-ТОКОФЕРОЛОМ (n=8)
Параметри Контроль(ДНОК) [Силібор + б-токоферол]+ДНОК
k01, год-1 1,77±0,31 1,15±0,46*
t1/2, a , год 0,39±0,003 0,60±0,008*
Cmax, мкг/мл 75,60±38,21 43,13±2,46*
С0, мкг/мл 105,37±12,25 83,62±8,77*
tmax, год 3,0 3,0
F, % 87,41±5,46 71,38±3,67
kex, год-1 1,99±0,28 3,24±0,36*
t1/2, год 27,56±1,51 12,36±1,47*
ClR, л/год 45,76±3,51 159,47±2,36*
kel, год-1 0,03±0,001 0,06±0,001*
Vd, л 0,87±0,2 0,57±0,02*
MRT, год 40,00±3,24 17,86±2,68*
AUC, мг·год·мл-1 2358,31±57,25 1153,97±32,47*
Примітка: *- P<0,05 в порівнянні з контролем.
При кількісному оцінюванні біотранспорту ДНОК під впливом засобів лікарської профілактики, що вивчаються, встановлене значне підвищення афінітету сироваткових білків до пестициду з одночасним збільшенням зв'язувальної ємності протеїнів і величини ІПС (див. табл. 2). Ці дані повною мірою узгоджуються з розробленою О.І. Луйком і В. Д. Лук'янчуком (1984) концепцією про взаємодію ксенобіотиків з сироватковим альбуміном як про спеціалізований еволюційно-обумовлений механізм захисту від низькомолекулярних сполук, який включає елементи розпізнання, конформаційної адаптації й фіксації молекул ліганду.
Особлива увага приділялася вивченню центрального етапу токсикокінетики ДНОК – біотрансформації. Доведено, що попереднє введення комбінації потенційних засобів лікарської профілактики приводить до активації реакцій I і II фаз біотрансформації, про що свідчить інтенсивність екскреції з сечою метаболітів використаного тест-препарату амідопірину – 4-аміноантипірину і N-ацетіл-4-аміноантипірину, відповідно. Крім того, індукуюча цитохром Р-450 активність препаратів, які вивчаються, на моделі ДНОК-інтоксикації підтверджена при визначенні тривалості тіопенталового сну, який вірогідно знижується. Ці дані узгоджуються з результатами раніше проведених в лабораторії нашої кафедри В. Д. Лук'янчуком та Л. В. Савченковою (1996) досліджень, згідно яких біофлавоноїд кверцетин, який є одним з найважливіших компонентів силібору, володіє вираженою спроможністю індукувати ферменти детоксикації. Не виключене також запобігання силібором конверсії цитохрому Р-450 в його неактивну форму – цитохром Р-420.
Таблиця 2
КІЛЬКІСНІ ПОКАЗНИКИ ЗВОРОТНОГО ЗВ'ЯЗУВАННЯ ДНОК З БІЛКАМИ СИРОВАТКИ КРОВІ НА ФОНІ ЗАСТОСУВАННЯ СИЛІБОРУ, a-ТОКОФЕРОЛУ ТА ЇХ КОМБІНАЦІЇ (n=7)
Показники Контроль (без препарату) Силібор a-Токоферол Силібор + a-токоферол
kасс, моль-1 1,11x106 3,46x106 1,14x106 5,32x106
N 8 18 9 23
ІПС — 3,13 1,03 4,81
Аналіз параметрів, що характеризують розподіл ДНОК по органах і тканинах щурів, отруєних цією речовиною на фоні комбінованої фармакопрофілактики, дозволяє стверджувати, що силібор з ацетатом a-токоферолу мають виражену спроможність модифікувати характер і ступінь розподілу отрути в організмі в бік зниження швидкості і кількості його нагромадження в біосередовищах, що також свідчить про надто високу детоксикуючу активність препаратів в умовах експерименту, що вивчаються.
Результати досліджень параметрів заключного етапу токсикокінетики ДНОК (див. табл. 1), які характеризують процес його екскреції, показують, що профілактика гострої ДНОК-інтоксикації реалізується істотною інтенсифікацією процесів екскреції отрути з сечею, жовчю і калом, що слід розцінювати як один з механізмів детоксикації організму за рахунок підсилення силібором у комбінації з a-токоферолом природних шляхів занешкоджування попередженням токсичної поразки ДНОК видільних систем організму.
Враховуючи, що на даному етапі токсикокінетики процеси детоксикації не обмежуються лише екскрецією, а включають і метаболічну ланку, це дозволить в сукупності судити про елімінацію отрути, нами були визначені параметри, які характеризують цей процес (kel, t1/2, ClR). Встановлено, що під впливом силібору в комбінації з a-токоферолом відбувається прискорення “зникнення” отрути з печінки в 2,25, нирок – в 1,82, а легень і серця – в 1,28 рази.
Таким чином, вивчення закономірностей модифікації токсикокінетики ДНОК в умовах застосування комбінації силібору з ацетатом a-токоферолу з метою профілактики гострого перорального отруєння цим токсичним агентом дозволило встановити, що в реалізації механізму протекторної детоксикуючої дії цих препаратів важлива роль належить їхній спроможності корегувати характер проходження отрути в організмі, ключовим компонентом чого є підсилення природних шляхів знешкоджування організму від токсиканта головним чином на етапі його біотранспорту і біотрансформації, що істотно відображається на процесах розподілу і елімінації ДНОК.
ВИСНОВКИ
1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове рішення наукового завдання, що визначається експериментальним обґрунтуванням доцільності і ефективності застосування з профілактичною метою біофлавоноїду силібору з антиоксидантом ацетатом a-токоферолу в умовах гострого отруєння ДНОК, що реалізується спроможністю цих засобів істотно модифікувати токсикокінетику отрути на всіх етапах його проходження в організмі, а саме: абсорбції, біотранспорту, розподілу, біотрансформації і екскреції.
2. У скринінгових дослідженнях на моделі гострого отруєння ДНОК (ЛД50-ЛД99) білих щурів встановлено, що з 19 вивчених препаратів різних фармакологічних груп найбільш високу профілактичну активність виявляють біофлавоноїд силібор, антиоксидант ацетат a-токоферолу і особливо їх комбінація, що проявляється віддаленням терміну загибелі тварин, підвищенням їх виживання (на 100%), більш сприятливим перебігом клінічної картини інтоксикації.
3. Найбільш виражену профілактичну ефективність в умовах ДНОК-інтоксикації силібор з ацетатом a-токоферолу реалізують у дозах 140,6 мг/кг і 21,5 мг/кг, відповідно, при внутрішньошлунковому введенні за 70 хв до початку надходження отрути в організм тварин. Індекс профілактичної ефективності складає 1,88.
4. Розроблено високочутливий і легковідтворюваний спосіб визначення ДНОК в органах і тканинах організму шляхом використання протеолітичного ферменту - хімопсину, що дозволяє проводити діагностику гострих і хронічних отруєнь, а також контролювати ефективність лікувально-профілактичних засобів.
5. Розроблено оригінальний пакет комп'ютерних програм математичних розрахунків комплексу хемобіокінетичних параметрів на основі лінійних часткових моделей, у тому числі і кількісних показників оборотного комплексоутворення ксенобіотиків з сироватковими білками, який дозволяє підвищити швидкість математичних розрахунків та підвисити їх точність.
6. Профілактичне застосування силібору в комбінації з ацетатом a-токоферолу зменшує константу швидкості абсорбції при одночасному збільшенні періоду напівабсорбції отрути (в 1,5 рази) на тлі зниження його максимальної концентрації в крові (в 1,75 рази) і біодосягненності (на 16%), що свідчить про модифікуючий вплив цих препаратів на токсикокінетику ДНОК вже на першому етапі - абсорбції.
7. Афінітет сироваткових білків у відношенні ДНОК під впливом силібору і ацетата a-токоферолу складає 3.46·106 моль-1 та 1,14·106 при числі місць зв'язування (N), рівному 18 і 9, відповідно, проти 1,11·106 моль-1 (N=8) у контролі. Застосування силібору в комбінації з ацетатом a-токоферолу потенціює комплексоутворювальну активність протеїнів сироватки крові (kасс=5,32·106 моль-1), збільшуючи їх зв'язувальну ємність до 23. При цьому величина індексу підвищення споріднення отрути транспортними білками складає 4,81, що в 1,54 рази і в 4,67 рази більше в порівнянні з роздільним введенням силібору і a-токоферолу, відповідно.
8. Профілактичне застосування силібору в комбінації з ацетатом a-токоферолу при отруєнні ДНОК сприяє зниженню швидкості нагромадження отрути в печінці, нирках, серці, легенях і м'язах (в 1,4–2 рази), істотно посилюючи при цьому реакції першої і другої фаз біотрансформації ксенобіотиків, в тому числі і алкілдинітрофенолу, підсилює процеси елімінації ДНОК, включаючи його екскрецію з різними біосередовищами (сеча, жовч, кал).
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.
1. Січанова О.В., Кравець Д.С. Вплив силібору на модифікацію хемобіокінетики дінітроортокрезолу // Ліки.- 1999.- №2.- С. 86-89. (Внесок – 75%).
2. Лукьянчук В.Д., Кравец Д.С. Метод определения динитроортокрезола в органах и тканях // Современные проблемы токсикологии.- 1999.- №4.- С. 39-40.
3. Кравец Д.С. Разработка дозового режима комбинированного применения силибора с ацетатом a-токоферола при интоксикации динитроортокрезолом // Український медичний альманах.- 1999.- Т.2, №4.- С. 73-75.
4. Лук'янчук В.Д., Кравець Д.С. Вплив силібору, ацетату a-токоферолу та їх комбінації на комплексоутворювання сироваткових білків з динітроортокрезолом // Ліки.- 2000.- №5.- С.83-85.
5. Кравец Д. С. Оптимизация методических приемов расчета параметров хемобиокинетики с помощью прикладных программ для ЭВМ // Український медичний альманах.- 2000.- Т3., №1.- С. 90-92.
6. Кравец Д.С., Левицкий Е.Л., Сичанова Е.В. Токсикология динитрофенольных соединений и лечение вызванных ими отравлений (обзор) // Современные проблемы токсикологии.- 2000.- №3.- С. 16-20. (Внесок – 65%).
8. Лукьянчук В.Д., Кравец Д.С.. Характеристика биотранспорта динитроортокрезола на фоне применения средств комбинированной детоксикации. // “Актуальные проблемы медицины труда и экологии Донбасса”: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию НИИ медико-экологических проблем Донбасса и угольной промышленности (сборник статей).- Донецк.- 2000.- С.179-180.
9. Пат. 33477 А Україна, МКІ А 61 К 5/0205. Спосіб індикації динітроортокрезолу / В.Д.Лук'янчук, Д.С.Кравець, Б.М.Гур'янов, Л.В.Савченкова; Бюл. №1; Заявл. 25.02.1999; Опубл. 15.02.2001.
10. Методичні рекомендації по вивченню зв'язування лікарських засобів з білками сироватки крові // О.І.Луйк, В.Д.Лук'янчук, Д.С.Кравець, О.А.Коробков.- Київ-Луганськ: ІБОНХ, ЛДМУ, 1999.- 20с.
11. Методические рекомендации по компьютерным расчетам фармакокинетических параметров лекарственных средств (линейные частевые модели) // Н.Я.Головенко, В.Д.Лукьянчук, О.В.Жук, В.Г.Зиньковский, Д.С.Кравец, М.С.Жук.- Киев: Государственный научно-экспертный центр лекарственных средств, 1999.- 70с.
12. Кравец Д.С. Расчет фармакокинетических параметров ксенобиотиков с помощью ПЭВМ. // “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”: Матеріали V національного з'їзду фармацевтів України. - Харків. - 1999.- С. 679-680.
13. Кравец Д. С. Токсикокинетика динитроортокрезола в условиях острого отравления // “Актуальные проблемы токсикологии”: тезисы докладов научной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения член-корреспондента НАН, АМН Украины, профессора, доктора медицинских наук Ю.С.Кагана.- Киев.- 1999.- С.46-47.
14. Лукьянчук В.Д., Сичанова Е.В., Кравец Д. С. Антидотно-лечебная активность биофлавоноидов при отравлении ДНОК. // “Актуальные проблемы токсикологии”: тезисы докладов научной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения член-корреспондента НАН, АМН Украины, профессора, доктора медицинских наук Ю.С.Кагана.- Киев.- 1999.- С.57.
15. Кравець Д.С. Вплив комбінації силібору з вітаміном Е на характер розподілу динітроортокрезолу в організмі // Тези доповідей VIII конгресу Світової Федерації Українських лікарських товариств.- Львів-Трускавець.-2000.-С.450.
16. Кравец Д., Болгов Д. Разработка прикладных компьютерных программ расчета параметров комплексообразования ксенобиотиков с транспортными белками // 4 Міжнародний конгрес студентів і молодих вчених. - Тернопіль.-2000.- С.103-104.
17. Равновесный диализ как базовый метод фармакокинетики на этапе биотранспорта /Лукьянчук В.Д., Кравец Д.С., Бибик Е.Ю., Болгов Д.М., Коробков А.А./ Тези доповідей наукової конференції офтальмологів, присвяченої 125-річчю з дня народження акад. В.П.Філатова. - Одеса. - 2000.- С. 396-398.
18. Оптимізація фармакотерапії силібором отруєння динітроортокрезолом /В.Д.Лук'янчук, В.І.Путінцев, Січанова О.В., Д.С.Кравець, Л.Л.Пинський// Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я № 50-98. - Луганськ, 1998. – 3 с.
19. Кравець Д.С. Визначення динітроортокрезолу в органах та тканинах організму // Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я №18-99. - Луганськ, 1999. – 3 с.
20. Кравець Д.С. Детоксикація організму силібором в комбінації з вітаміном Е на етапі біотранспорту в умовах гострого отруєння ДНОК// Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я №17. - Луганськ, 2000. – 3 с.
21.Кравец Д.С. Хемобиокинетика динитроортокрезола и ее модификация комбинацией лекарственных средств // Информационный листок о нововведении в системе здравоохранения №36. - Луганск, 2000. – 4 с.
АНОТАЦІЇ
Кравець Д. С. Токсикокінетика динітроортокрезолу в умовах застосування комбінації силібору з ацетатом a-токоферолу. - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеню кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.06 – токсикологія. - Інститут фармакології і токсикології АМН України, Київ, 2001.
Дисертація присвячена вивченню токсикокінетики алкілпохідного 2,4-динітрофенолу – ДНОК, в тому числі її модифікації при застосуванні комбінації засобів лікарської профілактики ДНОК-інтоксикації біофлавоноїдом силібором з ацетатом a-токоферолу.
Проведені скринінгові дослідження показали, що в умовах гострого (ЛД50) перорального отруєння пестицидом найбільш високу захисну активність виявляє силибор (83,4%) і ацетат a-токоферолу (50,0%). Комбіноване введення цих препаратів реалізується підсиленням протекторних властивостей препаратів. Дослідженнями по розробці оптимального дозового режиму застосування комбінації силібору з a-токоферолом за допомогою двохфакторного експерименту встановлене, що ці захисні засоби виявляють найбільшу детоксикуючу активність при їхньому введенні в дозах 140,64 та 21,52 мг/кг, відповідно, за 70 хвилин до початку надходження ДНОК до організму.
Вивчення токсикокінетики ДНОК в умовах комбінованого застосування силібору з ацетатом a-токоферолу з метою профілактики гострого отруєння цим токсичним агентом дозволило встановити, що в реалізації механізму протекторної детоксикуючої дії цих препаратів важлива роль належить їх спроможності корегувати характер проходження ДНОК в організмі, ключовим компонентом чого є посилення природних шляхів детоксикації організму, головним чином на етапах його біотранспорту та біотрансформації, що істотно впливає на процеси розподілення та елімінації ДНОК.
Ключові слова: токсикокінетика, динітроортокрезол, силібор, комбінація, б-токоферол.
Кравец Д.С. Токсикокинетика динитроортокрезола в условиях комбинированного применения силибора с ацетатом a-токоферола .- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.06 – токсикология.- Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению токсикокинетики алкилпроизводного 2,4-динитрофенола – ДНОК, в том числе ее модификации при применении комбинации средств лекарственной профилактики ДНОК-интоксикации биофлавоноидом силибором с ацетатом a-токоферола.
Проведенные скрининговые исследования показали, что в условиях острого (ЛД50) перорального отравления пестицидом наиболее высокую защитную активность оказывает силибор (83,4%) и ацетат a-токоферола (50,0%). Комбинированное же введение этих препаратов реализуется усилением протекторных свойств, что проявляется повышением не только выживаемости животных, но и значительным улучшением течения интоксикации. Исследованиями по разработке оптимального дозового режима комбинированного применения силибора с a-токоферолом с помощью двухфакторного эксперимента установлено, что эти защитные средства проявляют наибольшую детоксицирующую активность при их введении в дозах 140,64 и 21,52 мг/кг, соответственно, за 70 мин до начала поступления ДНОК в организм, что соответствует индексу профилактической эффективности, равному 1,88.
С целью оптимизации проведения токсикокинетических исследований специально разработан высокочувствительный метод идентификации ДНОК в органах и тканях, чувствительность которого 0,5 мкг/г. Кроме того, разработан оригинальный пакет компьютерных программ на основе линейных частевых моделей, позволяющий рассчитывать комплекс хемобиокинетических параметров, включая показатели обратимого комплексообразования с сывороточными белками токсикантов, лекарств и других ксенобиотиков. Также впервые предложен индекс повышения сродства, позволяющий дать оценку влияния изучаемого потенциального средства детоксикации на связывающую способность транспортных протеинов по отношению к токсиканту.
Комплексное изучение токсикокинетики ДНОК в условиях профилактической фармакокоррекции острой ДНОК- интоксикации силибором в комбинации с б- токоферолом показало, что уже на этапе всасывания реализуется детоксикационная активность этих препаратов. Так, последние снижают константу скорости абсорбции яда в кровь в 1,5 раза и в такой же степени повышают период его полуабсорбции, в результате чего снижается Сmax в 1,75 раза и биодоступность на 16%.
Анализ параметров обратимого комплексообразования ДНОК сывороточными протеинами позволил установить, что на фоне применения силибора с ацетатом б-токоферола происходит увеличение константы ассоциации комплекса “белок - лиганд” по сравнению с контролем почти в 5 раз с одновременным увеличением числа мест связывания с 8 до 23, что также является одним из звеньев механизма детоксикации организма биофлавоноидом в комбинации с антиоксидантом.
Особое внимание было уделено изучению процессов биотрансформации. Экспериментально установлено, что предварительное введение комбинации средств профилактики ДНОК-интоксикации активирует течение реакций первой и второй фаз биотрансформации, кроме того подтверждена индуцирующая цитохром Р-450 активность изучаемой комбинации лекарственных препаратов.
Исследования, направленные на изучение характера распределения ДНОК по органам и тканям, позволили установить, что силибор в комбинации с ацетатом б-токоферола обладают выраженной способностью снижать скорость накопление яда и его количество во всех биосредах организма.
Результаты исследования параметров заключительного этапа токсикокинетики ДНОК, характеризующих процесс его экскреции показали, что в условиях комбинированной профилактики силибором с ацетатом б-токоферола острой интоксикации этим пестицидом происходит интенсификация его экскреции с мочой, желчью и калом. Наряду с этим установлено также, что под воздействием средств лекарственной детоксикации происходит усиление процессов элиминации яда из печени в 2,25, почек в 1,82, а лёгких и сердца – в 1,28 раза.
Ключевые слова: токсикокинетика, динитроортокрезол, силибор, комбинация, б-токоферол.
Kravets D.S. Toxicokinetics of dinitroortocresole in conditions of the combined application sylibore with acetate a-tocopherole.- Manuscript.
This dissertation is designed for obtaining a scientific degree: “Candidate in Medical Sciences”, speciality – Toxicology (14.03.06).- Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences, Kyiv, Ukraine, 2001.
The dissertation is devoted to studying toxicokinetics alkil-2,4-dinitrophenole (DNOK), including its updatings at application of a combination of means of medical preventive maintenance DNOK-of an intoxication biophlavonoide sylibore with acetate a-tocopherole.
Carried spent screening researches have shown, that in conditions sharp (LD50) per oral poisonings with pesticide show the highest protective activity sylibore (83,4 %) and acetate a-tocopherole (50,0 %). The combined introduction of these preparations is realized by amplification protector properties of preparations. Researches on development optimum dose a mode of application of a combination sylibore with б-tocopherole with the help of two-factorial experiment it is established, that these protective means show the greatest detoxicant activity at their introduction in dozes of 140,64 and 21,52 mg/kg, accordingly, for 70 minutes prior to the beginning of receipt DNOK in an organism.
Studying of toxicokinetics DNOK in conditions of the combined application sylibore with acetate a-tocopherole with the purpose of preventive maintenance of a sharp poisoning by this toxic agent has allowed to establish, that in realization of the mechanism protector detoxic actions of these preparations the important role belongs to their opportunity correction character of passage DNOK in an organism, the key component of that is amplification of natural ways detoxication an organism, mainly at stages of its biotransport and biotransformation, that significally influences processes of distribution and elimination DNOK.
Key words: toxicokinetics, dinitoortocresole, sylibore, combination, б-tocopherole.