Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Вологодская государственная молочно хозяйственная академия
им. Н.В. Верещагина.
Технологический факультет
Кафедра биологической и органической химии
Лабораторная работа по биохимии
Тема «Биохимия крови»
Выполнила: студ. 131/1 гр. Бурыкина Т.П.
Проверила: ст. преп. Лупандина А.С.
Вологда-Молочное
2003 г.
2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
2. 1.1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Метод рефрактометрии основан на определении показателя преломления (числа рефракции).
Показатель преломления зависит от концентрации раствора, а также от температуры и длины волны света
Каждое вещество в смеси обладает показателем преломления, представляющим сумму показателей преломления всех входящих в смесь веществ. Так, показатель преломления сыворотки крови состоит из показателей преломления белков, минеральных ве ществ, воды, холестерина, липидов и других. А так как концент рация белков в сыворотке крови превалирует над концентрацией других составных частей сыворотки, то последними можно пренебречь, и по показателю преломления сыворотки можно косвенно судить о концентрации белков в ней.
Устройство рефрактометров основано на явлении полного внутреннего отражения, происходящего на границе раздела двух сред, одна из которых является более плотной. Рефрактометры имеют две призмы - измерительную и осветительную. Постоянную температуру прибора поддерживают, пропуская воду с температу рой 20°С с помощью ультратермостата, который соединяют с реф рактометром. Длина волны соответствует источнику света, кото рый используется для данного рефрактометра; это может быть од нородный свет натриевого пламени, естественный дневной и свет электролампы (75-100 Вт). При естественном освещении и свете электролампы следствие рассеивания лучей света граница свето тени получается радужная, расплывчатая. Для устранения этого явления служит компенсатор дисперсии.
2. 1.2. ХОД РАБОТЫ
Используют универсальные рефрактометры марок ИРФ-454,
РЛ-2 и РЛ-3.
Перед началом работы производят настройку прибора. Для этого на нижнюю (измерительную) призму наносят стеклянной па лочкой несколько капель дистиллированной воды, не касаясь по верхности призмы во избежание царапин. Верхнюю (осветительную) призму осторожно опускают на нижнюю. Камеру призм соединяют штуцерами с ультратермостатом и пропускают воду с температурой 20°С в течение 10-15 минут. Затем луч света (естественного или от электролампы) направляют в окно осветительной призмы с по мощью зеркала, находящегося под камерой призм. Устанавливают окуляр на резкость, вращая его вдоль оси. В окуляре наблюдают поле светотени (вверху - светлое, внизу - темное), визирные линии и шкалу показателя преломления. С помощью дисперсионного винта устраняют радужную границу, а с помощью регулировочного винта совмещают границу светотени с точкой пересечения визир ных линий. Затем снимают показания со шкалы показателя прелом ления. Освещение шкалы производят отражением луча света от бо кового зеркала.
При правильной установке прибора показатель преломления дистиллированной воды соответствует 1,3328. Если совпадения не происходит, то его добиваются при помощи специального ключа.
Призмы насухо вытирают мягкой тканью. На нижнюю наносят 2-3 капли сыворотки крови. Быстро закрывают верхнюю призму и повторяют всю процедуру измерения. А именно, наблюдая в оку ляр, устраняют радужную границу, совмещают границу светотени с точкой пересечения визирных линий и снимают показания со шкалы коэффициента преломления.
Измерения повторяют 3-5 раз и берут среднее арифмети ческое.
РАСЧЕТ
Среднее значение показателя (коэффициента) преломления переводят в массовую долю белка в процентах, пользуясь таблицей Приложения 1.
2.2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ПО РАЕВСКОМУ
2.2.1.КРАТКАЯ ТЕОРИЯ К РАБОТЕ
Все биохимические процессы в живом организме могут проте кать только при строго определенной концентрации водородных ионов, т.е. при определенной рН среды. Так, допустимые физио логические колебания рН крови должны лежать в пределах 0,05 --0,1 единицы. Смещение рН крови на 0, 5 единицы приводит к аго нии. Постоянство рН среды обеспечивается буферными системами.
Буферность - это явление, при котором устойчиво сохраня ется рН среды в определенных границах при добавлении небольших количеств кислот или щелочей. Иначе говоря, буферность - это кислотно-щелочное равновесие, обеспечивающее постоянство рН жидких сред организма.
Свойствами буферных систем обладают смеси слабых кислот или слабых оснований с их солями.
Каждая буферная система имеет определенную силу, или бу ферную емкость. Это количество кислоты, которое необходимо до бавить к буферной смеси, чтобы изменить рН на единицу. Так, буферная емкость крови настолько велика, что для смещения рН крови на единицу надо добавить кислоты в 320 раз больше, чем к такому же количеству воды.
В живых организмах есть несколько буферных систем, кото рые обеспечивают постоянство рН внутри клеток и во внеклеточ ных жидкостях.
В крови различают плазменные и клеточные (эритроцитарные) буферные системы.
К плазменным буферным системам относятся три: гидрокарбо натная, фосфатная и белковая; к клеточным - эритроцитарная, т.е. гемоглобиновая. Одна из главных плазменных буферных сис тем - гидрокарбонатная. Она состоит из угольной кислоты, явля ющейся донором протонов, и ее натриевой соли, выполняющей функцию акцептора протонов. Физиологическое значение рН крови устанавливается при соотношении компонентов этой пары, равном 1:20. Именно в таком соотношении и находятся компоненты гидро карбонатного буфера в крови :
Н2С03 : НС03- = 1:20
Образующиеся и поступающие в кровь кислоты связываются анионом, образуя слабо диссоциирующую угольную кислоту. В лег ких угольная кислота разлагается на воду и двуокись углерода, который удаляется из легких с выдыхаемым воздухом:
НС03- + Н+ = Н2С03 = Н20 + CO2
Второй компонент гидрокарбонатной буферной системы угольная кислота - нейтрализует попадающие в кровь анионы гидрокси-групп:
Н2С03 + ОН- = Н20+ НС03-
В результате этого рН крови не изменяется ни в том, ни в другом случае.
Следовательно, для поддержания постоянства рН крови необ ходим определенный запас гидрокарбонатов и других щелочнореагирующих веществ, что называется резервной щелочностью крови.
Резервная щелочность (РИ|) крови выражается количеством миллилитров выделяющейся двуокиси углерода на 100 см3 плазмы (объемные проценты), а также может выражаться кислотной ем костью, т. е. количеством миллиграммов щелочи, идущей на нейтрализацию избытка кислоты, которую добавляют к крови. В пос леднем случае расчет ведут на 100 см3 крови и поэтому кислот ная емкость выражается в мг% щелочи.
Определение РЩ имеет диагностическое значение, так как этот показатель может изменяться при многих патологических состояниях животного. В норме после тяжелой работы РЩ умень шается до 50%, но быстро восстанавливается при покое.
Понижение РЩ называется ацидозом, что наблюдается при кетозах, в период лактации у самок, при сердечной недостаточ ности, нарушении функции легких, при рахите и др. При этом в крови накапливается столько кислот, что они не могут быть нейтрализованы буферными системами, и рН крови сдвигается в кислую сторону.
Повышение РЩ называется алколозом. При этом происходит накопление гидрокарбонатов в крови, избыток которых выделяется с мочой. Алколоз развивается при сильной рвоте, гипервентиля ции легких, при отравлении угарным газом, при некоторых инфек ционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой и др.
В Приложении 2 приводится таблица рН и РЩ крови некоторых видов животных в норме.
2.2.2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Методом по Раевскому определяют резервную щелочность кро ви, выраженную в единицах кислотной емкости, т. е. количеством соляной кислоты, затраченной на выделение угольной кислоты из гидрокарбоната натрия, содержащегося в 100 см3 крови:
НС1 + NаНС03 = Н2С03 + NaCl
2. 2. 3. ХОД РАБОТЫ
Берут две пробирки - контрольную и рабочую. В контрольную пробирку вносят 2 см3 4%-ного раствора хлорида натрия, добавляют 1-2 капли 1%-ного водного раствора индикатора ализаринового красного и по каплям 0,01 моль/дм раствора соляной кислоты до появления желтого окрашивания. Это эталонная окраска.
В рабочую пробирку вносят 2 см3 0, 4%-ного раствора хлори да натрия для стабилизации белков, добавляют 0,2 см3 сыворотки крови, 1-2 капли 1%-ного раствора ализаринового красного, и все перемешивают. Полученную смесь титруют из микробюретки 0,01 моль/дм3 раствором соляной кислоты до перехода вишне во-красной окраски в желтую, соответствующую окраске в конт рольной пробирке.
2.2. 4. РАСЧЕТ
РЩ вычисляют по формуле:
(мг%)
где: X -резервная щелочность крови в мг% щелочи (гидроксида натрия);
V -объем 0,01 моль/дм3 раствора соляной кислоты, пошед шей на титрование рабочей пробы, см3;
0,4 - мг NaOH, соответствующее 1 см3 точно 0,01 моль/дм3 раствора соляной кислоты; 0.2 -количество сыворотки, взятое для исследования, см .
2.3.ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ТРИЛОНОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУРЕКСИДА
2. 3. 1. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ К РАБОТЕ
Кальций в организме животных играет важную роль. Основная его масса содержится в костной ткани в виде солей фосфатов и отчасти карбонатов и фторидов. При понижении уровня кальция в крови кальций поступает в нее из костной ткани. В сыворотке крови кальций находится как в связанном состоянии с белками в виде сложных комплексных соединений (около 40%), так и в сво бодном, в виде двухвалентных катионов (Са2*).
Биологическая функция кальция заключается в том, что он понижает возбудимость нервной системы, возбуждает сердечную мышцу, активизирует некоторые ферменты, способствует свертыва нию крови.
Обмен кальция в организме зависит от целого ряда причин: от количества фосфора, от обеспеченности организма витамином Д, от состояния паращитовидной железы и надпочечников, от про дуктивности и физиологического состояния животного. Так, при недокорме, рахите, остеомаляции, родильном парезе, нефрозах и других заболеваниях снижается количество кальция в крови (ги-покальцимия) . Гиперкальцимия - увеличение кальция в крови -наблюдается при гипервитаминозе Д, опухолях костной ткани, ги перфункции паращитовидной железы.
Поэтому концентрация кальция в крови служит показателем состояния обеспеченности животного этим элементом.
Содержание кальция в сыворотке крови разных видов живот ных следующее (мг% - миллиграммов кальция в 100 см3 сыворотки крови:
лошадь - 12-14 овца - 11-12,5
курица - 12-22 собака - 10-12
коза - 23-26 курица - 12-22
корова - 10-13 верблюд - 11-12
свинья - 12-14
2.3.2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Трилонометрический метод определения кальция в крови яв ляется одним из наиболее качественных и эффективных.
Метод основан на способности ионов кальция образовывать прочные комплексные соединения с некоторыми комплексонами. Наиболее распространенным комплексоном является трилон Б (синонимы: комплексен III, хелатон, ЭДТА, версен, селектрон).
Трилон Б - это двунатриевая соль этилендиаминтетрауксус-ной кислоты (ЭДТА), имеющей строение:
Ионы кальция (Са ) образуют с трилоном Б комплексные соли, где кальций связывается главными ковалентными связями с карбок сильными группами и побочными - с атомами азота:
Как и большинство комплексных солей, данная соль хорошо растворима в воде, но бесцветна. Для установления эквивалент ности связанного кальция используют окрашенные индикаторы, ко торые также связывают ионы кальция с образованием окрашенных, но менее прочных комплексных солей. В качестве такого индика тора в данном анализе применяют мурексид.
Мурексид в щелочной среде образует с ионами кальция комп лексное соединение, подобно трилону Б, но окрашенное в красно-фиолетовый или бледно-розовый цвет в зависимости от концентра ции кальция. При добавлении трилона Б, как более сильного комплексона, эта комплексная соль распадается с образованием новой комплексной соли с трилоном Б (см. выше). Связанный му рексид освобождается, приобретая свою сине-фиолетовую или бледно-сиреневую окраску. В момент, когда все катионы кальция будут вытеснены из мурексидного комплекса и связаны трилоном Б, окраска раствора изменится из бледно-розовой в бледно-сире невую. Количество добавленного трилона Б будет эквивалентно количеству кальция в растворе.
2.3.2.ХОД РАБОТЫ
В коническую колбу емкостью 100 см3 помещают 50 см3 дис тиллированной воды, 0,4 см3 9 моль/дм3 гидроксида натрия и на кончике шпателя несколько крупинок мурексида. Жидкость окраши вается в бледно-сиреневый цвет (цвет свободного мурексида).
Половину этой жидкости переносят во вторую коническую колбу такой же емкости.
Первая колба служит эталоном, вторая - рабочая.
В рабочую колбу вносят 1 см3 сыворотки крови и осторожно перемешивают содержимое колбы круговым движением во избежание пенообразования. При этом жидкость окрашивается в бледно-розо вый цвет в связи с образованием кальциево-мурексидного комп лекса. Затем содержимое колбы титруют 0,0036 моль/дм3 раство ром трилона Б из микробюретки до появления бледно-сиреневой (сине-фиолетовой) окраски, одинаковой с эталоном.
2. 3. 3.РАСЧЕТ
Массовую долю кальция вычисляют по формуле:
(мг%)
где: С -массовая доля кальция, мг%;
V -объем трилона Б, пошедший на титрование, см3; 0,072 -количество кальция, соответствующее 1 см3 точно 0,0036
моль/дм3 раствора трилона Б, мг; 1 -объем сыворотки, взятой для анализа, см3.
2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ САХАРА В КРОВИ ФОТОКОЛОРИ МЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
2.4.1.КРАТКАЯ ТЕОРИЯ К РАБОТЕ
В организме человека и животных углеводы играют важную роль, выполняя разнообразные функции. Они служат источником энергии, используются в качестве исходных продуктов для синте за липидов, белков, нуклеиновых кислот, а также являются пластическим материалом клеток.
Организм животного не способен синтезировать углеводы из неорганических веществ и получает их в готовом виде, в основ ном, с продуктами растительного происхождения. В желудочно-ки шечном тракте углеводы перевариваются и всасываются в кровь в виде моносахаридов, в основном это глюкоза.
Глюкоза - постоянная составная часть крови. У разных ви дов животных содержание глюкозы колеблется, но находится в норме на постоянном уровне (мг%):
При некоторых заболеваниях, например, при сахарном диабе те, акромегалии, гипертиреозе, гепатите, циррозе печени содер жание сахара в крови увеличивается, что называется гиперглике мией. Она наблюдается после принятия богатой углеводами пищи. Это алиментарная гипергликемия, которая у здоровых животных исчезает через 1-2 часа. Происходит это потому, что повышение концентрации сахара в крови у здоровых животных приводит в действие систему, приводящую к ее понижению. А именно, повыше ние сахара в крови рефлекторно возбуждает центральную нервную систему, которая передает импульс поджелудочной железе, выра батывающей гормон инсулин. Инсулин способствует усиленному распаду глюкозы в тканях и отложению ее в печени в виде гликогена, что и приводит к понижению уровня глюкозы в крови.
Снижение сахара в крови - гипогликемия - наблюдается в случае усиленной физической и умственной нагрузки и встреча ется реже.
Установление гипер- и гипогликемии имеет большое диаг ностическое значение в клинических исследованиях.
2.4.2.СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Для определения концентрации глюкозы в крови используют колориметрический метод, основанный на определении ослабления интенсивности светового потока после прохождения через окра шенный раствор. Это называется оптической плотностью раство ра, или экстинкцией.
Оптическая плотность зависит от толщины и концентрации окрашенного раствора.
В данной работе в качестве красящего агента применяют пикриновую кислоту, имеющую желтый цвет. В присутствии восста навливающих соединений, таких как глюкоза, нитрогруппы пикри новой кислоты восстанавливаются до аминогрупп. При этом сама глюкоза окисляется до глюконовой кислоты, окисление которой протекает с выделением свободного водорода:
Такое окисление путем дегидрирования протекает только в случае присутствия веществ, связывающих отщепляемый водород, т.е., так называемых, акцепторов водорода. В нашем случае эту роль играет пикриновая кислота:
Образующаяся пикраминовая кислота, как и другие нитрофенолы, дает со щелочами соли, отличающиеся своей интенсивной окраской:
2.4.3. ХОД РАБОТЫ
В пробирку вносят 3,6 см3 дистиллированной воды, 0,4 см3 крови (сыворотки) и 2 см3 раствора 1,2 %-ной пикриновой кисло ты. Смесь встряхивают и фильтруют.
2 см3 фильтрата переносят в пенициллиновый флакон, добав ляют 0,2 см3 20%-ного раствора гидроксида натрия, закрывают пробкой и помещают в водяную баню. Водяную баню доводят до ки пения и кипятят 5 минут. Затем флакон охлаждают вместе с баней и через 20 минут приступают к измерению оптической плотности на фотоэлектроколориметре марки КФК-2.
Параллельно готовят холостую пробу, где вместо крови вно сят 0, 4 см3 дистиллированной воды.
Перед началом работы прибор включают в электрическую сеть и выдерживают 30 минут при открытом кюветном отделении.
Раствор из флакона переливают в кювету длиной 5 мм и по мещают в переднее гнездо кюветодержателя. В заднее гнездо кюветодержателя ставят кювету с холостым раствором.
Оптическую плотность измеряют при длине волны 590 нм и чувствительности колориметра "2" или "3".
Измерения проводят в следующей последовательности:
1.Переводят ручки "Установка 100 грубо" и "Точно" в край нее левое сложение.
2. Заднее гнездо кюветодержателя помещают в световой поток.
3. Крышку кюветодержателя закрывают.
4.Ручками "Чувствительность", "Установка 100 грубо" и "Точно" устанавливают отсчет 100% по шкале коэффициентов про пускания "Т, %".
5.Поворотом ручки кюветодержателя переводят в световой поток кювету с -опытным раствором и снимают показания оптичес кой плотности (экстинкцию) по шкале "Д" в единицах оптической плотности.
6. Измерения проводят 2 раза, рассчитывают среднее арифме тическое значение оптической плотности.
7. По стандартной кривой определяют концентрацию сахара в мг на 100 см3 крови.