Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
32
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
УДК 57.08 : 535.37 : 582.261
CТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ МАРКЕРИ АДАПТАЦІЇ МІКРОВОДОРОСТЕЙ ПРИ ДІЇ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН
03.00.12 –фізіологія рослин
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, членкор
УААН МУСІЄНКО Микола Миколайович,
Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, завідувач кафедри фізіології та
екології рослин
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор МУСАТЕНКО
Людмила Іванівна, Інститут ботаніки імені
М.Г.Холодного НАН України, завідувач відділу
фітогормонології
доктор біологічних наук, професор ГОЛОВКО
Ераст Анатолійович, Національний ботанічний
сад імені М.М.Гришка НАН України, завідувач
відділу алелопатії
доктор біологічних наук ТАРАНОВА Людмила
Анатоліївна
Провідна установа: Донецький національний університет Міністерства
освіти та науки України
Захист відбудеться “24 ” лютого 2003 р. о 14 годині
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, Київ, проспект акад. Глушкова, 2, корпус 12 (біологічний факультет), ауд. 215.
Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64, спецрада Д26.001.24, біологічний факультет.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “ 23” січня 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук, професор Брайон О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи
Водорості є основними первинними продуцентами органічних речовин, кисню та утилізаторами вуглекислого газу водних екосистем як континентальних водних об’єктів, так і Світового океану. Завдяки високому фотосинтетичному потенціалу вони синтезують до 74% органічних речовин водних екосистем або 24% сумарної продукції земної кулі (Considine, 1984; Саут, Уиттик, 1990). Разом з тим щорічно об’єми споживання поверхнево-активних речовин (ПАР) та їх попадання у водні об’єкти істотно збільшуються. Так, наприклад, якщо прийняти рівень споживання синтетичних ПАР у 1985р. за 100%, то у 2000 р. темпи зростання їхнього використання в різних галузях коливались від 116 до 750% (Поверхностно-активные …, 1989; Савин и др., 1991; Остроумов, Федоров, 1999; Остроумов, 2001). Це й обумовлює збільшення частоти випадків значного перевищення гранично допустимих концентрацій (ГДК) вмісту ПАР у природних водах. Створені завдяки успіхам хімії синтетичні ПАР (СПАР) поступово перетворюються в стрес-фактор водного середовища, що істотно впливає на функціональну активність не лише водоростей, але й інших гідробіонтів.
Не зважаючи на це механізми дії ПАР на життєдіяльність водоростей, зміни фотосинтетичної активності, водного обміну, шляхи формування стійкості останніх не з’ясовані.
Успішному розв’язанню даної проблеми в значній мірі заважає відсутність інформаційних маркерів експрес-виявлення початкових етапів дії ПАР на клітини водоростей. Мало відомі реакції на контакт з ПАР основних структурних компонентів та функціональних показників у представників різних систематичних відділів водоростей залежно від фізіологічного стану клітин. Обмежена також й інформація щодо значення в процесах стійкості до ПАР їх метаболічних характеристик, особливостей виживання мутантних організмів та їх адаптації до дії ПАР. Це й обумовило проведення комплексу досліджень, які склали основу даної роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами, проектами. Дисертаційна робота виконувалася у рамках бюджетних тем кафедри фізіології та екології рослин Київського національного університету імені Тараса Шевченка, проектів Фонду фундаментальних досліджень України де дисертант була виконавцем тем: “Забруднення навколишнього середовища поверхнево-активними сполуками як фактор регуляції росту та продуктивності водоростей” (N 0197U017067); “Дослідження структурно-функціонального стану мікроводоростей під впливом присутніх у воді поверхнево-активних речовин” (N 0102U004059); “ Екзогенна індукція адаптивних реакцій для стабілізації продуктивності зернових культур в несприятливих екологічних умовах” (N 0197U003136); “Адаптивні реакції рослин в системі моніторингу агро- та фітоценозів за умов дії факторів довкілля та антропогенного забруднення” (N 01БФ036-02); спільного гранту уряду України та Фонду цивільних досліджень та розвитку США (CRDF) “Вплив поверхнево-активних речовин на адгезію та сорбцію важких й благородних металів клітинами мікроводоростей” (UB1-320) Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, проекту INTAS N 99-0130 “Особливості зміни біорізноманіття фітопланктону під дією екологічних факторів” Інституту Південних морів НАН України.
Мета і задачі дослідження. Головною метою досліджень було з’ясування механізмів формування стійкості мікроводоростей до впливу стрес-факторів водного середовища (на прикладі природних та штучних ПАР), визначення маркерів процесів, що лежать в основі формування адаптивного потенціалу клітин, виживання та збереження їхньої продуктивності.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:
Об’єкт дослідження –біопродуктивність й фізіологічний стан природних популяцій та промислово цінних культур водоростей за умов дії поверхнево-активних речовин.
Предмет дослідження –структурно-функціональні маркери формування стійкості та адаптації мікроводоростей в антропогенно забрудненому ПАР водному середовищі й можливості їх практичного використання;
Методи дослідження –системний підхід до вивчення фізіологічної реакції мікроводоростей з різним комплексом фоточутливих пігментів й кількісна оцінка показників функціональної активності організмів за умов дії поверхнево-активних речовин як стресових факторів за допомогою фізіологічних (диференціальної флуорометрії, лазерної кореляційно-допплерівської спектрометрії, КХЧ-діелектрометрії), біохімічних, люмінесцентно-мікроскопічних та статистичних методів.
Визначені основні захисні реакції мікроводоростей на вплив ПАР. До них належать посилення негативного таксису у здатних до активного руху видів; утворення кулеподібних формувань трихом, зовні покритих шаром слизу; наявність загострених виростів клітинної оболонки, що осаджують міцели ПАР на менш життєво важливих частинах поверхні клітин; формування щільних багатоклітинних плівок та агрегатів в моноклітинних суспензіях мікроводоростей. З’ясовано, що у виживанні водоростей під впливом стресових факторів виключно важливу роль відіграють екзогенні слизові полісахариди, що формують навколо клітин захисні оболонки. Істотне значення в посиленні деструктивного впливу ПАР на клітини водоростей має негативний електрокінетичний заряд поверхні клітин (дзета-потенціал), що прискорює контакт клітин, в першу чергу, з катіонактивними ПАР (КПАР).
Доведені вперше факти впливу ПАР на ступінь гідратації внутрішньоклітинних структур та форми води у водоростей. На клітинах 16 видів та штамів прокаріотних й еукаріотних водоростей різного фізіологічного стану вивчено особливості прояву реакції. Встановлено, що стан і особливості гідратації внутрішньоклітинних структур є основним регулятором фотосинтетичних і метаболічних процесів у водоростей та маркером взаємодії ПАР з клітинами останніх.
Вперше встановлено, що характер впливу ПАР на життєдіяльність фітопланктону залежить від інтенсивності сонячної інсоляції. Збільшення останньої в межах від 10 до 130 Вт/м підсилює негативний вплив ПАР на ріст, розвиток та фотосинтетичну активність водоростей тим сильніше, чим вищий рівень освітлення.
Показано, що негативна реакція водоростей на сонячне опромінення, особливо в роки високої активності Сонця, реєструється не лише в поверхневій плівці води (для водоростей нейстону), але й на глибині до 0,1-0,2 м водної товщі залежно від прозорості води та її кольору. Однією з причин зазначеної негативної реакції на високий рівень сонячного випромінювання є зміни в стані світлочутливих пігментів, в першу чергу, хлорофілу а та гідрофобного комплексу клітинних структур.
Вперше дослідженні процеси фотовицвітання хлорофілів прокаріотичних та еукаріотичних клітин водоростей під впливом ПАР. Присутність КПАР у воді значно посилювала процеси фотовицвітання водоростей й пригнічувала їхню фотосинтетичну активність. Більшу стійкість до фотовицвітання виявила пігментна система еукаріотичної водорості (Chlorella) в порівнянні з прокаріотами (Microcystis, Anabaena).
Вперше одержані генетично трансформовані клітини р.Anabaena PCC 7120 стійкі до сильнодіючих мембранотропних КПАР. Серед одержаних ГТК виділені форми стійкі до впливу катаміну в концентраціях до 10 мг/л.
Підібрані умови інтенсивного культивування ГТК (оптимальне поживне середовище, тип і концентрації антибіотиків, що зберігають асептичність культури), досліджені особливості їх морфогенезу і росту.
Доведено, що життєдіяльність водоростей пов’язана не лише з прямою дією ПАР на функціонування біологічних мембран й фотосинтетичну активність, але й з наявністю у воді важких металів зі змінною валентністю (зокрема, Cr+). З’ясовані нами механізми спільного впливу важких металів із змінною валентністю та ПАР є новим напрямком досліджень впливу водного середовища на функціонування екосистем та формування їхньої біологічної продуктивності і можуть бути запропоновані для технології видалення ПАР із стічних вод за рахунок іммобілізованих клітин найбільш резистентних видів зелених та діатомових мікроводоростей. Потребують перегляду діючі нормативні акти, що регулюють рівні гранично допустимих концентрацій ПАР у водоймах. В реальних умовах вони недооцінюють загрозу, яку становлять речовини з поверхневою активністю для фотосинтезуючого ланцюга водних екосистем.
В числі метаболітів водоростей виявлені біологічно активні речовини, які мають значну перспективу різноманітного використання (Патенти на винахід N 13945 від 17.04.1996 р. та N 27446 від 17.04.2001 р.).
Теоретичні розробки даної проблеми включені до підручників “Фізіологія рослин” та “Фотосинтез”, використовуються при викладанні нормативних курсів “Фізіологія рослин”, “Біохімія рослин” та спецкурсів “Фізіологія та біохімія нижчих рослин”, “Індустріальний фотобіосинтез”, “Стійкість рослин”.
Особистий внесок автора. Дисертантом особисто здійснені інформаційний пошук та аналіз літературних даних, розроблені робочі гіпотези, обґрунтована методологія постановки дослідів, виконані експериментальні дослідження, проведені інтерпретація та узагальнення одержаних результатів, підготовлені друковані праці.
Результати деяких підрозділів отримані безпосередньо автором при консультативній допомозі проф. Брайона О.В. –підрозділ 6.4, д-ра Куритц Т. (Окриджська Національна лабораторія, США) –підрозділ 5.5; д. ф.-м. н. Щеголевої Т.Ю. (Інститут радіофізики та електроніки НАН України) –підрозділ 4.2. Цитологічні дослідження виконані разом з д. б. н. Поповою А.Ф. (Інститут ботаніки НАН України). Результати спільних досліджень представлені у відповідних спільних публікаціях. Кваліфіковану допомогу у визначенні видового складу фітопланктону та його кількісних характеристик систематично надавала старший інженер Пахомова М.Н. (Інститут гідробіології НАН України).
Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на 8-му Міжнародному симпозіумі по фототрофних прокаріотах (Урбіно, Італія, 1994); Міжнародному симпозіумі з фармакології (Мілан, Італія, 1995); 1-й, 2-й Міжнародних конференціях “Прогрес в науці про рослини, їх вирощуванні та регуляції росту” (Мосонмадьяровар, Угорщина, 1996, 1998); 3-му, 4-му, 5-му Міжнародних симпозіумах по забрудненню довкілля в Центральній та Східній Європі (Варшава, Польща, 1996, 1998; Прага, Чехія, 2000); 10-му з’їзді Українського ботанічного товариства (Полтава, 1997); практичному семінарі НАТО “Біорізноманіття органічних ксенобіотиків” (Єсенік, Чехія, 1997); 4-й Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вода –проблеми та рішення” (Дніпропетровськ, 1998); Міжнародній конференції “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998); наукових читаннях, присвячених 100-річчю відкриття подвійного запліднення у покритонасінних рослин професором С.Г.Навашиним (Київ, 1998); конференції молодих дослідників “Сучасна екологія та проблеми сталого розвитку” (Львів, 1999); 2-й Міжнародній конференції “Актуальні проблеми сучасної альгології” (Київ, 1999); Міжнародній конференції “Озерні екосистеми: біологічні процеси, антропогенна трансформація, якість води” (Мінськ, Бєларусь, 1999); Міжнародній конференції “Фізіологія рослин –наука III тисячоліття” (Москва, Росія, 1999); 4-му Європейському семінарі “Біотехнологія мікроводоростей” (Бергольц-Рейбрюке, Германія, 2000); 10-му Міжнародному симпозіумі по фототрофних прокаріотах (Барселона, Іспанія, 2000); 5-й Всеросійській конференції по водних рослинах “Гідроботаніка-2000” (Борок, Росія, 2000); практичному семінарі НАТО “Інноваційні можливості для відновлення забруднених територій” (Прага, Чехія, 2001); Симпозіумі по використанню мікроводоростей та насіннєвих рослин в системі рослина –грунт (Мосонмадьяровар, Угорщина, 2001); 3-му з’їзді Гідроекологічного Товариства України (Тернопіль, 2001); конференції “Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть” (Тернопіль, 2002); 15-му Міжнародному симпозіумі по рослинних ліпідах (Оказакі, Японія, 2002); 8-му з’їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002); Міжнародній конференції “Фотосинтез й продуктивність рослин” (Київ, 2002).
Публікації. Результати досліджень представлені у 49 друкованих роботах, що включають монографію у співавторстві, 21 статтю у профільних вітчизняних і зарубіжних виданнях, 2 патенти на винаходи у співавторстві та 25 публікацій з матеріалами і тезами доповідей у збірках вітчизняних та закордонних з’їздів та конференцій.
Об’єм та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 271 сторінці машинописного тексту й складається зі вступу, інформаційної частини, що містить огляд літератури (1 розділ), експериментальної частини (5 розділів), узагальнення, висновків, списку цитованої літератури (407 джерел). Робота містить 80 рисунків та 69 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНІ РЕЧОВИНИ Й ДЖЕРЕЛА ЇХНЬОГО НАДХОДЖЕННЯ У ВОДНІ ОБ’ЄКТИ
Узагальнено інформацію щодо використання ПАР у виробництві, масштабів їх надходження у навколишнє середовище та концентрацій у воді. На прикладі 16 різних галузей промисловості дається перелік технологічних процесів, де застосовують ПАР з наступним скиданням відпрацьованих стоків у водні об’єкти. Лише по місту Києву використовується більше 25 композицій миючих засобів вітчизняного й зарубіжного виробництва з високими діючими дозами (до 16 г/л й вище).
Окремо розглянуті питання поведінки ПАР у воді, методи моніторингу, а також їхнього впливу на формування якості природних вод.
На підставі узагальнення сучасної літератури розглянуто вплив ПАР на життєдіяльність водоростей, а також процеси самоочищення природних вод за активною участю багатьох гідробіонтів.
Проведений аналіз ситуації свідчить про актуальність й гостроту проблеми взаємодії ПАР з клітинами мікроскопічних водоростей, оскільки стабільність найбільш поширених СПАР у воді коливається від 3 до більше ніж 30 діб, а біологічне руйнування відбувається в межах від 35 до максимум 92%. Враховуючи, що на одного мешканця України припадає в середньому в 12-15 разів менше води, ніж на території колишнього СРСР в цілому (Природа, 1987), виникає необхідність глибоких досліджень взаємодії фотосинтезуючих клітин з ПАР та з’ясування факторів, що визначають глибину та напрямок цих процесів.
ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктами досліджень були альгологічно чисті (15 видів) й бактеріально чисті (2 штами та їх мутанти) культури водоростей, а також фітопланктон водосховищ Дніпра й низки малих річок його басейну. Культури водоростей відрізнялися між собою набором фоточутливих пігментів та інтенсивністю фотосинтезу, а саме:
- синьозелені водорості-прокаріоти (Cyanophyta), які в останні роки відносять до фототрофних Cyanobacteria (Определитель бактерий Берджи, 1997). Однак далеко не всі фахівці з цим погоджуються (Кондратьева, 1975, 1992, 2002; Костяев, 2001). З фізіологічного боку ці організми важливі тим, що вони першими на Землі почали здійснювати аеробний фотосинтез при наявності лише хлорофілу а;
- зелені водорості –еукаріоти (Chlorophyta), що фотосинтезують, як і всі вищі рослини, за участю хлорофілів a та b;
- діатомові водорості (Васіllariophyta), здійснюють фотосинтез за участю хлорофілів а та с;
- червоні водорості (Rhodophyta) як рослини, що мають хлорофіли а та d.
В дослідах було використано об’єкти, отримані з колекції культур водоростей лабораторії мікробіології біологічного науково-дослідного Інституту Санкт-Петербурзького університету, Інституту гідробіології НАН України, Окриджської Національної лабораторії (США) та кафедри гідробіології МГУ ім. М.В.Ломоносова. З синьозелених - Anabaena PCC 7120 (б/ч), Anabaena PCC 7120 (генетично трансформовані мутанти, б/ч); Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk., HPDP-66; Nostoc muscorum Ag. (Elenk.), HPDP-22; Nostoc sp.; Nostoc punctiforme (Kuetz.) Hariot.(б/ч - Ок Ридж, США); Oscillatoria limosa Ag., Str. Kov.8715; Spirulina platensis (Nordst.) Geitl., HPDP-60; з зелених - Chlamydomonas reinhardtii Dang. (Ок Ридж, CША); Ankistrodesmus fusiformis Corda, Chlorella vulgaris Bejer., Str.Larg 3, HPDP-3; Chlorella vulgaris Bejer., HPDP-19; Dunaliella salina Teod., HPDP-11; Dunaliella salina Teod., HPDP-12; Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., HPDP-10; Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz., HPDP-13; з червоних –Porphyridium cruentum (Ag.) Nag., HPDP-22.
Культури водоростей вирощували на селективних поживних середовищах при температурі 20 ± 2оС та освітленні 6,6-7,4 Вт/м (тривалість чергування світла й темряви –/12 годин). Для Microcystis aeruginosa, Ankistrodesmus fusiformis використовували середовище Фитджеральда N11, для представників роду Scenedesmus –середовище Успенського, для Dunaliella salina –середовище Артарі, для Spirulina platensis –середовище Зарукка, для представників Anabaena –середовище Аллена-Арнона, для Porphyridium cruentum –середовище Йохнес (Каталог, 1991). Для дослідів брали культуру на логарифмічній та стаціонарній фазах росту.
Крім культур, використовували природні популяції водоростей (фітопланктон) в складі якого розвивались представники Bacіllariophyta, Сhlorophyta, Euglenophyta, Cyanophyta та поодинокі організми інших типів водоростей.
В процесі роботи вивчався вплив 9 ПАР різної хімічної природи:
- катіонактивні (КПАР) –катамін (алкілдиметилбензиламоній хлорид), етоній;
- аніонактивні (АПАР) –лаурилсульфат, сульфанол;
- неіоногенні (НПАР): превоцел Е, стеарокс –, синтамід;
- природні (ППАР) –міристинова (тетрадеканова) та альгінова кислоти.
Використані концентрації ПАР підбирались в залежності від реальних перевищень у воді їх ГДК, що реєструвались в природних водах різних водних об’єктів згідно даних Державних водних кадастрів та наших аналітичних визначень з використанням індикатора Азур 1 (Калениченко, 1987, 1996).
Підрахунки клітин водоростей та ідентифікацію видового складу водоростей здійснювали за допомогою камери Горяєва (для культур) та камери Нажотта (для природного матеріалу) на мікроскопах МБИ-1, МБИ-6. Для ідентифікації видового складу водоростей використовували загальноприйняті визначники: для Cyanophyta (Cyanobacteria) –Голлербах и др., 1953; Берджи, 1997; Bacillariophyta –Топачевский, Масюк, 1960; Бухтиярова, Вассер, 1999; Chlorophyta–Царенко, 1990; Царенко, Петлеванный, 2001; для різних відділів Топачевский, Масюк, 1984. Для дослідження зразків природної води при необхідності використовували концентрування фітопланктону –фільтрацію крізь мембранні фільтри (Синпор 3, 4).
Інтенсивність росту клітин мікроводоростей визначали: а) за зміною чисельності та біомаси лічильно-об’ємним методом у фіксованих 40%-ним формаліном пробах води за Топачевским, Масюк, 1984; б) концентрацією хлорофілу а; в) приростом сухої ваги.
Розміри поверхні (мкм) та об’єму клітин мікроводоростей (мкм) розраховували за відповідними формулами (Knutsen, Lien, 1981; Брянцева, 1999) після вимірів розмірних характеристик клітин з допомогою окуляр-мікрометра.
Контроль пігментного комплексу водоростей здійснювали за змінами вмісту хлорофілу а екстрактним та безекстрактним методами. При застосуванні екстрактного спектрофотометричного методу виміри концентрації пігментів проводили на СФ-46 з відповідними рекомендаціями робочої групи ЮНЕСКО (Мусієнко та ін., 2001). Для безекстрактного визначення застосовувався метод диференціальної флуорометрії нативних клітин водоростей з використанням Planctofluorometer FL 300 3M, розробки Красноярського університету (Гольд и др., 1984, 1993, 1996). Паралельно визначали DF (різницю інтенсивності флуоресценції до й після внесення симазину, як інгібітора електронного транспорту фотосинтезуючих клітин). Цей показник давав характеристику рівня життєздатності клітин або величину їх потенціальної фотосинтетичної активності.
Оцінку фотовицвітання клітин водоростей проводили за допомогою люмінесцентного мікроскопу МЛ-2, використовуючи варіант падаючого світла (через об’єктив), відфільтрованого зі спектру лампи ДРШ-250 світлофільтром ФС-1 (lmax = 430 нм).
Швидкість руху клітин водоростей (мкм/с) та їх енергетичний потенціал (ум. од.) визначали з допомогою лазерного кореляційно-допплерівського спектрометра (Власенко и др., 1992; Пономаренко, Паршикова, 2001).
Стан води та гідратацію внутрішньоклітинних структур водоростей визначали методом КХЧ-діелектрометрії в міліметровому діапазоні радіохвиль (Щеголева, 1983; Щеголева и др., 2000; Паршикова и др., 2001). При внесенні зразка в хвилепровід вимірювали зміни параметрів стоячої хвилі: 1) зміщення мінімуму останньої –DL; 2) зміни подвоєного мінімум –DX. Ці параметри використовуються для обчислення комплексної діелектричної проникності. Завдяки малим об’ємам для вимірювання (об’єм відповідної камери 0,005 мл) , а також короткотривалості проведення аналізу (2-3 хв.), дослідження виконувалися не лише в багатьох повторностях, але й з великою кількістю зразків. На останні діяли різні фактори (тривалість освітлення, темрява, різні концентрації ПАР) в реальному часі й умовах неруйнуючого контролю.
Одержання генетично трансформованих клітин Anabaena PCC 7120 Kutz. здійснювали за методом Wolk et al., 1988, з використанням УФ-опромінення та введення плазмід, виділених з Escherichia coli. Для подальшого захисту мутантів від бактеріальної контамінації нами були експериментально визначені концентрації антибіотиків: еритроміцину (25 мкг/мл) та неоміцину (400 мкг/мл поживного середовища).
Для визначення цитологічних змін у водоростей під впливом ПАР клітини фіксували 2,5% розчином глютарового альдегіду на фосфатному буфері, рН 7,4 (2 год. при кімнатній температурі). Постфіксацію здійснювали 1% OsO в тому ж буфері при 4оС 2 год. (Popova, 1999). Фіксовані зразки зневоднювали в серії спиртів зі зростаючою концентрацією та включали в ЕПОН-812. Ультратонкі зрізи клітин отримували на ультрамікротомі LKB-8800 (LKB, Швеція), контрастували ураніл-ацетатом та розчином цитрату свинцю за Reinolds, 1976. Зрізи аналізували на електронному мікроскопі 1200 EX (JEOL, Японія).
Експериментальна частина даної роботи виконувалась в період з 1991 по 2002 рр.
Математичне опрацювання одержаних результатів здійснювали з використанням методів статистичного аналізу (Лапач и др., 2000). Висновки робили на підставі критерію Стьюдента при довірчій імовірності Р= 0,95.
СТІЙКІСТЬ ВОДОРОСТЕЙ ДО ДІЇ ПОВЕРХНЕВО АКТИВНИХ РЕЧОВИН В СЕЗОННОМУ АСПЕКТІ
Дослідження проводились на природних зразках води з Дніпра (Київська ділянка Канівського водосховища) та з Кременчуцького водосховища в районі Канівського природного заповідника. У фонових (вихідних зразках) дослідної води, яка відбиралась для експонування в присутності ПАР за методом мікрокосмів, різноманіття мікроскопічних водоростей коливалось в межах від 21 до 51 одиниць представлених видів. Вихідна чисельність клітин водоростей залежно від сезону змінювалась від 695 до 36462 тис. кл/л, біомаса від 0,2 до 4,7 мг/л. Сумарний вміст хлорофілу а у фоновій воді складав від 3,7 до 16,3 мкг/л. Тривалість контакту водоростей з ПАР в експериментах коливалась в межах від 24 до 288 годин з контролем їх стану через кожну добу по всіх досліджуваних показниках.
Встановлено, що внаслідок контакту з ПАР різноманіття водоростей, показники їх чисельності, біомаси та потенційної фотосинтетичної активності істотно відрізнялися не лише в порівнянні з фоновою (вихідною водою), але й від контрольних варіантів.
Показано, що навіть за прийнятих рівнів ГДК присутності у природній воді КПАР (в межах 0,012-0,5 мг/л) порушується нормальний розвиток планктонних водоростей. КПАР не лише гальмували їх ріст, повністю припиняли фотосинтетичну активність, але й спричиняли відмирання організмів. Водорості різних систематичних відділів істотно відрізнялися за адаптаційною здатністю до негативної дії КПАР. Найкраще зберігали свою життєздатність й темпи приросту діатомові водорості (представники рр. Melosira, Stephanodiscus). Однак збільшення концентрації КПАР до 10 й 20 ГДК та тривалості контакту погіршувало ситуацію й викликало відмирання організмів цих родів.
Аналогічні досліди з фітопланктоном в присутності АПАР свідчать, що за характером свого впливу на життєдіяльність водоростей представники АПАР виявляють слабший альгіцидний ефект, ніж КПАР. Проте при попаданні у воду навіть в концентраціях близьких до різних ГДК, а тим більше при перевищенні останніх, вони негативно впливають на ріст та функціональну активність водоростей. Рівні пригнічення росту фітопланктону під впливом АПАР для різних в систематичному відношенні видів водоростей істотно відрізняються й в середньому складають в порівнянні з контролем не менше 2-3 разів для досліджених АПАР.
Найбільш стійкими до дії АПАР виявилися діатомові водорості, які інтенсивно розвивалися навіть при збільшенні концентрації діючих реагентів до 10 ГДК. За стійкістю водоростей до АПАР представників різних відділів можна розташувати в такому порядку: діатомові > зелені > синьозелені.
Цікаво, що до цього часу діатомові водорості, незважаючи на їх широке розповсюдження в природних умовах й високу продуктивність, в технологічному напрямку як компоненти штучних систем не привертали увагу дослідників. Одержані нами дані свідчать, що при наявності АПАР в низьких концентраціях в присутності діатомових водоростей поверхнево-активні сполуки взагалі зникали з води. При високих концентраціях АПАР (в межах 10-40 разів перевищення ГДК) водорості також тривалий час зберігали свою життєздатність й істотно зменшували концентрацію детергентів. Одним з найближчих завдань для практичної реалізації відповідної біотехнології для різних типів води є підбір найбільш продуктивних для цієї мети видів й штамів саме діатомових водоростей. По-друге, виключно важливе значення має розробка методів оптимального використання їхньої здатності до утворення кремнеземних структур та особливостей природної іммобілізації на останніх органічних сполук, а також адгезії на субстратах.
Щодо перевірених представників найбільш поширених АПАР (лаурилсульфат, сульфанол) можна зазначити, що негативність їх впливу на життєдіяльність водоростей посилювалась при збільшенні концентрації й часу контакту (від 24 до 96 годин й більше). У всіх випадках функціональний стан водоростей погіршувався тим сильніше, чим вищою була концентрація детергенту.
Суттєвих відмін реакції водоростей планктону на присутність синтетичних ПАР у різних за видовим складом їх угрупуваннях залежно від сезону року (весняний, весняно-літній, типово літній, літньо-осінній фітопланктон) нами не виявлено. У виживанні водоростей після контакту з ПАР більш істотну роль, ніж сезон року, відігравали видові особливості організмів як в будові клітин, так і в здатності до адаптації в несприятливих умовах навколишнього середовища.
Внесення в воду НПАР (превоцел Е, стеарокс та їх суміші) як в межах ГДК (0,03-0,5 мг/л), так і особливо у випадках їх перевищення, негативно впливало на розвиток фітопланктону навіть при наявності окремих НПАР у дослідній воді. Це свідчить про те, що прийняті нормативи гігієнічних та рибогосподарських ГДК для превоцелу та стеароксу 6 (в межах 0,5-0,1 мг/л) не гарантують для природних популяцій водоростей здійснення нормальних ритмів функціонування. Варіанти з НПАР відрізнялись від контролю за темпами приросту водоростей. Зміни ростових процесів та рівня життєздатності останніх були тим істотнішими, чим більшими були концентрація НПАР та тривалість контакту клітин водоростей.
Певну специфічність в дії різних видів природних ПАР вдалось встановити при порівнянні чутливості до них водоростей різних систематичних відділів. Відмічено, що на початку контакту водоростей з міристиновою кислотою (в концентрації 0,1-10 мг/л), а також синтамідом (0,3-3,0 мг/л) досліджені ПАР як окремо, так і в сумішах виявляли стимулюючий вплив на ріст та розвиток водоростей, в першу чергу, діатомових. Менш стимулюючий ефект відмічено для зелених й синьозелених.
З ряду досліджених НПАР в меншій мірі на розвиток водоростей впливав, порівняно з контролем, синтамід, як окремо, так і в суміші з міристиновою кислотою. При збільшенні часу контакту з НПАР до 120-240 годин темпи ростових процесів також знижувались спочатку вдвічі, а далі тим сильніше, чим довше взаємодіяли системи.
Приймаючи до уваги, що в складі стічних вод різні типи НПАР поступають у водойми щоденно, навіть при більш різноплановій дії їх на життєдіяльність водоростей, цю групу ПАР також слід віднести до істотних антропогенних факторів, які обумовлюють негативні зміни у формуванні фотосинтезуючого ланцюга водних екосистем.
Особливий вплив мають ПАР в регуляції морфогенезу водоростей та в формуванні їхніх цитологічних характеристик. Це питання досліджувалось на прикладі як рухливих водоростей, так і нерухливих форм. Об’єктами дослідження були: з Cyanophyta –Oscillatoria limosa Ag., O. neglecta Lemm., O. planctonica Wolosz., які здійснюють активні ковзаючі та коливальні рухи, а також Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. Для останньої був характерним “скачковидний” рух, що нагадував поведінку спіралі, яка після стискання “плигала” на досить істотну відстань. З Chlorophyta об’єктами досліджень були Сhlamydomonas reinhardtii Dang. та Dunaliella salina Teod. З нездатних до активного руху форм були використані Сhlorella vulgaris Bejer. та Nostoc muscorum Ag.
Застосування лазерно-доплерівської спектроскопії свідчить, що в присутності ПАР активно рухливі форми водоростей намагаються виходити з зони контакту з ними. Ніби одержавши “хемосигнал” від поверхнево-активної сполуки, клітини Chlamydomonas reinhardtii мобілізують свій енергетичний потенціал й на 30-40% підвищують швидкість руху (рис. 1).
Рис. 1. Зміни енергетичного потенціалу та швидкості руху клітин Chlamydomonas reinhardtii Dang під впливом КПАР (катаміну).
Оскільки в умовах замкненого в колбі об’єму рідини повністю уникнути контакту з міцелами ПАР клітинам водорості не вдається, ефект реакції проявляється короткотерміново. При наявності в спеціалізованій кюветі зон чистої води Chlamydomonas reinhardtii активно концентрується саме на цих ділянках. Негативний хемотаксис активно проявляють й інші здатні до руху клітини водоростей.
Проаналізувавши за “Атласом сапробних організмів” перелік стійких до органічного забруднення води видів природних популяцій водоростей, ми пересвідчились в тому, що найбільш високим індексом сапробності характеризувалися саме рухливі форми. В даному разі здатність до активного виходу з забрудненої ділянки водної маси допомагає виживати саме цим представникам різних видів водоростей.
Встановлено, що під впливом КПАР істотно змінюється площа поверхні клітин водоростей та їх об’єм. Це є наслідком набрякання клітин, яке відбувається тим інтенсивніше, чим вища концентрація КПАР діє на клітини. При зниженні чисельності останніх реєструється значне збільшення об’єму клітин (рис. 2). Наприклад, при концентрації КПАР в межах ГДК об’єм клітин збільшився за рахунок розбухання в 2-3 рази, при 3 мг/л КПАР –в 3-20 разів, при 5 мг/л –в 17-30 разів.
Рис. 2. Вплив катаміну на зміну площі поверхні клітин Chlamydomonas reinhardtii.
Зміни морфологічних та фізіологічних показників водоростей під впливом КПАР свідчать про істотний негативний вплив детергента на мембрани організмів. Це й обумовлює падіння фотосинтетичної активності, зниження інтенсивності первинного синтезу органічних речовин та виділення кисню у водних екосистемах. Факти набрякання клітин в забруднених СПАР водоймах слід також враховувати при моніторингу розвитку фітопланктону за показниками біомаси.
При дослідженні цитологічних змін було встановлено, що при обробці Chlamydomonas reinhardtii розчином катаміну (КПАР) в концентраціях від 1 до 5 мг/л відмічається посилення вакуолізації клітин (до 50%). Як результат істотної вакуолізації, ядро в більшості клітин тісно оточено вакуолями (рис. 3а), а при високій концентрації спостерігались численні випадки злиття декількох вакуолей. Перинуклеарний простір нерідко мав незначні еввагінації зовнішньої мембрани. При всіх концентраціях КПАР відмічалась висока активність апарату Гольджі. Особливо високі концентрації ПАР вносили істотні зміни в структуру хлоропластів. Розмір хлоропласта сильно збільшувався, мабуть завдяки значному розбуханню й звивистості тилакоїдів (рис. 3б). Відмічаються часті випадки злиття тилакоїдів внаслідок чого формуються зони з порушеною структурою. Суттєві зміни спостерігаються і в піреноїді, його електронна щільність істотно знижується, в ньому відмічені тільки залишки білкової частини піреноїда у вигляді гранулярних структур. Амілогенна обкладка представлена лише трьома вузькими крохмальними зернами.
Рис. 3. Фрагменти клітин Chlamydomonas reinhardtii Dang. (катамін, а –концентрація 2 мг/л, б –мг/л).
Встановлені структурно-функціональні зміни клітин водоростей віддзеркалюють складні адаптивні реакції клітин у відповідь на негативну дію КПАР і є ознакою не лише пригнічення її, але й пояснюють причини виникнення летального ефекту.
ГІДРАТАЦІЯ ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИХ СТРУКТУР ВОДОРОСТЕЙ ЯК МАРКЕР ЇХНЬОГО СТАНУ ТА ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ
З сучасних методів, що дозволяють одержувати унікальну інформацію відносно стану водної компоненти клітин та структурно-функціональних змін їх в біологічних об’єктах нами була застосована КХЧ-діелектрометрія в міліметровому діапазоні радіохвиль (Щеголева и др., 2000). Наші дослідження за цією методикою є пріоритетними оскільки раніше вміст води в клітинах мікроскопічних водоростей характеризувався за загальною вологістю при визначенні сухої ваги. На прикладі культур мікроскопічних водоростей (представників Сyanophyta, Chlorophyta, Rhodophyta) залежно від календарного віку, стадії розвитку, фізіологічного стану, фотосинтетичної активності, умов освітлення) визначалася діелектрична проникність в діапазоні дисперсії вільної води при довжині хвилі 7,56 мм.
Вперше нами було показано, що клітини водоростей різного систематичного положення, навіть вирощені в ідентичних умовах і взяті для досліду на однакових фазах росту (логарифмічній, стаціонарній), характеризуються видовою специфічністю гідратного оточення клітинних структур. Зміни стану клітинної води у одного й того ж виду відмічені в залежності від фази росту та календарного віку культури.
Встановлено, що інтенсивно фотосинтезуюча культура містить максимальну кількість вільної (незв’язаної) води. У стаціонарній фазі росту клітини синьозелених водоростей також відрізнялися за станом й вмістом різних форм води. Видовою специфічністю фонових діелектричних параметрів відрізнялися й представники зелених та червоних водоростей (рис. 4). За кількісними показниками діелектричних параметрів виділялась водорість Chlamydomonas reinhardtii Dang., яка активно змінювала напрям та швидкість руху й уникала контакту з несприятливими хімічними факторами, одночасно збільшуючи енергетичний потенціал.
Порівняння величин співвідношення діелектричних параметрів на логарифмічній та стаціонарній стадіях росту показало, що досліджені культури за цими показниками чітко відрізнялись (рис. 5), що давало можливість оцінювати потенціальний рівень їх максимальної продуктивності.
Рис. 4. Діелектричні параметри стану води нативних клітин зелених та червоних водоростей.
Рис. 5. Зміна діелектричних параметрів мікроводоростей на логарифмічній фазі росту відносно стаціонарної фази.
В подальших дослідженнях вивчали вплив КПАР на діелектричні параметри водоростей різних систематичних груп. Одержані дані свідчать, що діелектричні показники стану води клітин водоростей чутливо реагують на зміну умов існування організмів. У випадку контакту клітин з КПАР гідратне оточення клітинних структур зменшувалось. Цей процес по-різному відбувався на світлі й в темряві. Під впливом контакту з КПАР істотно змінювався вміст вільної води в клітинах. Зміни були тим істотнішими й несумісними з нормальною життєдіяльністю клітин, чим вищою була концентрація та довшою тривалість контакту з КПАР.
Рис. 6. Зміни гідратного оточення клітинних структур (DL) та кількості вільної води (DХ) в культурі Microcystis aeruginosa у логарифмічній фазі росту через 3 та 24 години контакту з КПАР.
В цілому, характер змін гідратації внутрішньоклітинних структур водоростей як в нормі, так і під впливом різноманітних факторів дає чітке уявлення про динаміку цих процесів. Це дозволяє апаратурно без руйнування клітин проводити експрес-оцінку функціонального стану хлорофілвмісних організмів, визначати тенденції подальшого розвитку технологічного процесу їх вирощування, рівня продуктивності як в системах індустріального фотосинтезу, так й у водоймі.
Характер змін гідратації внутрішньоклітинних структур мікроводоростей за станом води (вільна/зв’язана) є чутливим інформативним експрес-маркером контролю функціональних процесів в організмах для оптимізації їх росту в різних умовах, а також при проведенні моніторингу за розвитком природних популяцій водоростей .
Метод КХЧ-діелектрометрії був застосований й у дослідженнях по вивченню взаємодії мікроводоростей з ПАР в присутності важких металів (на прикладі Сr+). Раніше було доведено (Карамушка, 1991; Гладышев, 1999; Грузина и др., 2000), що поведінка у воді ПАР і акумуляція металів водоростями залежать від електрокінетичного заряду поверхні й трансмембранного потенціалу клітин. В зв’язку з цим нами з’ясовувались окремі питання взаємодії тест-культури водорості з ПАР в присутності у середовищі Cr+. Як видно з табл. 1, за темпами приросту хлорофілу а Chlorella vulgaris Beijer. при додаванні солі хрому розвивалася досить інтенсивно. При додаванні КПАР приріст хлорели був нижчим контрольного варіанта. Ще більш суттєвими темпами зниження вмісту хлорофілу відрізнявся варіант із спільним внесенням солі хрому й КПАР. На кінець експерименту клітини водорості за цих умов повністю гинули, хоча хлорела, як відомо вважається еврібіонтним організмом і здатна виживати не лише в різних умовах земного існування, але й в космосі.
Таблиця 1
Зміна вмісту фотосинтезуючих пігментів у хлорели за різних умов хімічного навантаження (в мкг/л хлорофілу а)
|
Дата |
Контроль |
Cr+ 1,8 мг/л |
КПАР 3 ГДК |
Cr+ 1,8 мг/л + КПАР, 3 ГДК |
|
15.04.99 |
,5 ± 4,1 |
,3 ± 3,2 |
,1 ± 2,3 |
,3 ± 3,6 |
|
16.04.99 |
,4 ± 3,3 |
,7 ± 3,8 |
,8 ± 1,9 |
,6 ± 2,3 |
|
20.04.99 |
,0 ± 7,1 |
,5 ± 3,4 |
,7 ± 2,1 |
,7 ± 1,1 |
|
27.04.99 |
,1 ± 10,4 |
,9 ± 6,2 |
,4 ± 1,4 |
,9 ± 0,9 |
|
07.05.99 |
,1 ± 11,2 |
,4 ± 4,1 |
,9 ± 1,3 |
,8 ± 1,3 |
|
14.05.99 |
,9 ± 12,0 |
,7 ± 4,4 |
,7 ± 1,2 |
,5 ± 0,8 |
|
20.05.99 |
,3 ± 14,2 |
,0 ± 6,1 |
,6 ± 1,4 |
,9 ± 0,4 |
|
27.05.99 |
,3 ± 14,6 |
,0 ± 12,3 |
,4 ± 0,9 |
,7 ± 0,02 |
|
04.06.99 |
,5 ± 12,2 |
,1 ± 11,4 |
,9 ± 0,8 |
,3 ± 0,03 |
КПАР, внаслідок наявності позитивно заряджених іонів, взаємодіє з біополімерами клітин, що мають на поверхні негативний z-потенціал. Це пошкоджує біологічні мембрани й здатність клітин до фотосинтезу різко падає. Одночасно істотно змінюється гідратація внутрішньоклітинних структур водоростей, що корелює з погіршенням їхнього стану й відмиранням. Отже, присутність у воді КПАР посилює токсичність хрому, який взятий самостійно у аналогічній концентрації менш істотно гальмує темпи росту хлорели.
ОСОБЛИВОСТІ БУДОВИ МІКРОВОДОРОСТЕЙ, ЯКІ ОБУМОВЛЮЮТЬ ЇХ ВИЖИВАННЯ В ПРИСУТНОСТІ ПАР
Проведена оцінка стійкості виживання клітин різних видів водоростей в присутності КПАР свідчить, що відміни в цьому процесі реєструються не лише на рівні систематичних відділів, але й в межах близьких видів. Навіть в присутності найбільш негативно діючого КПАР в різних дослідах виживали окремі види водоростей. Наприклад, в дослідах з катаміном серед 21 виду виявлених у фоновій воді водоростей планктону 6 видів виявились стійкими до впливу КПАР, як стрес-фактора й продовжували вегетацію, 4 види характеризувались меншою стійкістю, оскільки виживали не при всіх концентраціях. Серед резистентних видів 6 мікроводоростей належали до Bacillariophyta (представники рр. Asterionella, Cyclotella, Stephanodiscus, Melosira, Synedra), 2 –до Сhlorophyta (представники рр. Scenedesmus, Micractinium), 1 –до Dinophyta (Glenodinium quadridens Klebs).
В присутності АПАР з 17 знайдених у природній воді видів виживало 14. З них 7 були відмічені при розгляді дії КПАР. З незгаданих раніше представників фітопланктону необхідно назвати Ankistrodesmus angustus Bern. sensu Korsch., Didymocystis lineata Korsch., Tetrastrum staurogeniaeforme (Schrod.) Lemm., Coelastrum sphaericum Nag., 2 представників р. Pediastrum Meyen. (P. boryanum (Turp.), P. simplex Meyen.), Anabaena flos-aquae (Lyngb.) Breb.
При контакті з різними типами НПАР з 18 представлених у вихідній воді видів не виживало 4 (22,2%), а саме Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs., Asterionella formosa Hass., Stephanodiscus subtilis, Pediasrum simplex Meyen.
З’ясовуючи причини різної стійкості водоростей планктону до впливу ПАР, ми проводили порівняльний аналіз морфологічних особливостей будови клітин, трихом, колоній та ценобіїв організмів, їхніх клітинних оболонок, а також визначали процес формування шару екзогенних слизових полісахаридів. З метою ілюстрації особливостей пристосувань водоростей до виживання в різних умовах цей розділ роботи ілюстровано 26 мікрофотографіями, виконаних як автором дисертації, так й люб’язно наданих для обговорення та порівняння результатів професором Дж.Ландом (Великобританія), професором Ф.Хіндаком (Словаччина), а також взяті з відповідних джерел літератури (Царенко, 1990). Унікальні кольорові мікрофотографії різних видів водоростей дозволили повніше пояснити одержані нами результати дослідів. При цьому важливо відмітити, що практично усі види водоростей, що виживали у воді після контакту з різними стрес-факторами з числа СПАР, широко представлені не лише в Україні, але й віднесені до видів-космополітів у складі альгофлори Білорусі (Михеева, 1999).
Підводячи підсумки представленим матеріалам, можна виділити наступні основні адаптаційні пристосування водоростей до виживання в несприятливих умовах навколишнього середовища, в тому числі й в присутності у воді різних типів СПАР. По-перше, важливу роль у формуванні стійкості й виживання мікроводоростей відіграють загострені вирости клітинних оболонок, які виступаючи над поверхнею клітин першими реагують з ПАР й осаджують їх міцели на функціонально менш важливих частинах клітини.
По друге, не менш істотну роль відіграють також екзогенні слизові полісахариди, що мають величезну адсорбційну поверхню й здатність до іонообмінних реакцій. Не виключено, що у кращому виживанні діатомових водоростей в забрудненому СПАР середовищі відіграє важливе значення й фактор іммобілізації біоорганічних сполук на їх кремнеземних скелетах.
По-третє, особливий інтерес становить й та обставина, що планктонні водорості несуть на своїй поверхні електричний заряд з відповідною густиною –електрокінетичний потенціал (z-потенціал). При взаємодії клітин водоростей з ПАР відбувається електрокінетична реакція їх від’ємно зарядженої поверхні з позитивно зарядженими іонами, в першу чергу, катіонактивних ПАР. Кількість позитивно заряджених іонів, необхідних для нейтралізації одиниці площі поверхні водорості, залежить від щільності заряду.
Одним із шляхів формування стійкості мікроводоростей до впливу ПАР можуть бути розробка та вдосконалення методик отримання генетично трансформованих клітин. Одержані нами мутантні клітини штаму Anabaena PCC 7120 відрізнялись за забарвленням, вмістом хлорофілу а, розмірами плівок “обростань”, характером їх росту, стійкістю по відношенню до використаним для очистки антибіотикам (еритроміцин, неоміцин). В присутності антибіотиків водорості характеризувались більш високими рівнями мінімальних (129,7 проти 116,4 мкг/л для еритроміцину) середніх (148,6 проти 137,1 мкг/л) та максимальних (186,4 проти 164,2 мкг/л) показників вмісту хлорофілу а в порівнянні з вихідним штамом. Темпи приросту хлорофілу а в мутантах, очищених еритроміцином, поступалися отриманим з використанням неоміцину. Концентрація біомаси в порівнянні з вихідною в культурі з еритроміцином збільшувалась в 4,1-5,3 рази, а в культурі з неоміцином –у 3,6-4,2 рази. Суттєвою морфологічною відміною мутантів від вихідного штаму можна вказати лише відсутність гетероцист та спор у трихомах. Серед отриманих генетично трансформованих клітин нами були виділені форми, стійкі до впливу катаміну (КПАР) в концентраціях 0,1-5 мг/л і навіть до 10 мг/л. Можна передбачати, що отримані культури Anabaena, що мають більш високі можливості до виживання можуть бути застосовані як в системах очистки стічних вод, так й для альгалізації забруднених ПАР грунтів.
ВПЛИВ СОНЯЧНОГО СВІТЛА НА ВЗАЄМОДІЮ ВОДОРОСТЕЙ
З ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИМИ РЕЧОВИНАМИ
Значення світла в житті фотосинтезуючих організмів загальновідоме. В останні роки значну увагу почали звертати на зміни розвитку водоростей в зв’язку із активностю Сонця (Чижевский, 1976; Акsyonov, 1993; Энергия, природа и климат, 1997; Евстафьева и др., 2002). Проведені дослідження свідчать (табл. 2), що при прозорості води межах 1,5-2,0 м й більше в роки активного Сонця (1994, 2001) інтенсивність розвитку фітопланктону на плесах Київського та Канівського водосховищ значно поступалася більшості річок, що в них впадали й характеризувалися меншою прозорістю води (0,55-0,85 м). Однією з причин цього феномену був процес фотовицвітання фотоситезуючих пігментів. Збільшення інтенсивності освітлення водної товщі в роки активного Сонця змінювало не лише рівень кількісного розвитку водоростей але й співвідношення домінуючих систематичних груп фітопланктону. Перевагу в процесах адаптації до цих умов мали еукаріотичні водорості, що фотосинтезували за участю хлорофілів a та b.
Таблиця 2.
Концентрація хлорофілу а у водоростях планктону Київського й Канівського водосховищ Дніпра та їх приток в роки активного Сонця (серпень)
|
Об’єкт дослідження |
1994 р. |
р. |
||
|
конц. хл. a, мг/м3 |
DF |
конц. хл. а, мг/м3 |
DF |
|
|
Київське водосховище |
6,1 ± 2,4 (n = 33) |
,25 ± 0,03 (n = 47) |
,1 ± 1,1 (n = 12) |
,23 ± 0,02 (n = 36) |
|
Верхній Дніпро (район Комарина) |
17,4 ± 4,3 (n = 4) |
,51 ± 0,08 (n = 5) |
,3 ± 3,1 (n = 4) |
,57 ± 0,07 (n = 6) |
|
р. Прип’ять |
11,0 ± 2,5 (n = 5) |
,43 ± 0,11 (n = 16) |
,1 ± 2,8 (n = 5) |
,51 ± 0,08 (n = 9) |
|
р. Тетерів |
33,6 ± 2,3 (n = 3) |
,45 ± 0,09 (n = 13) |
,6 ± 2,9 (n = 7) |
,40 ± 0,12 (n = 8) |
|
р. Ірпінь |
22,2 ± 1,3 (n = 4) |
,52 ± 0,09 (n = 7) |
,5 ± 2,9 (n = 4) |
,52 ± 0,04 (n = 6) |
|
Канівське водосховище |
14,6 ± 2,5 (n = 38) |
,30 ± 0,03 (n = 16) |
,4 ± 0,6 (n = 20) |
,28 ± 0,03 (n = 28) |
|
р. Десна |
15,9 ± 1,1 (n = 5) |
,50 ± 0,09 (n = 16) |
,3 ± 2,2 (n = 5) |
,50 ± 0,07 (n = 6) |
|
р. Козинка |
38,1 ± 3,4 (n = 3) |
,37 ± 0,10 (n = 14) |
,8 ± 1,7 (n = 4) |
,39 ± 0,08 (n = 5) |
|
р. Стугна |
9,0 ± 1,2 (n = 4) |
,48 ± 0,08 (n = 5) |
,0 ± 1,5 (n = 4) |
,48 ± 0,08 (n = 5) |
|
р. Бобровиця |
10,5 ± 1,3 (n = 4) |
,35 ± 0,11 (n = 4) |
,3 ± 0,9 (n = 5) |
,43 ± 0,12 (n = 5) |
|
р. Красна |
16,0 ± 0,9 (n = 3) |
,65 ± 0,09 (n = 11) |
,2 ± 1,4 (n = 4) |
,54 ± 0,03 (n = 7) |
На виживання водоростей в різних умовах освітлення істотно впливала також присутність у воді різноманітних ПАР, особливо КПАР. В присутності останнього в мікрокосмах, що знаходились на природному режимі сонячного освітлення зменшення кількості хлорофілу а на перших етапах їх експонування відбувалось більш інтенсивно, ніж при затіненні. Аналогічна реакція водоростей на режим освітлення зареєстрована й при адаптації до умов існування за характером приросту. Присутність КПАР у воді специфічно впливала на виживання й розвиток водоростей різних систематичних груп залежно від умов освітлення (рис. 7-9). Значно впливали на ріст та розвиток водоростей залежно від умов освітлення й АПАР та НПАР, а також альгінова кислота (табл. 3), яка виявила істотний альгіцидний ефект й проявила себе як регулятор фотосинтетичної активності водоростей.
Рис. 7. Зміни біомаси зелених водоростей в присутності ПАР залежно від режиму освітлення.
Рис. 8. Зміни біомаси діатомових водоростей в присутності ПАР залежно від режиму освітлення.
Рис. 9. Зміни біомаси синьозелених водоростей в присутності ПАР залежно від режиму освітлення.
Таблиця 3
Зміни ступеню життєздатності та потенційної фотосинтетичної активності водоростей в присутності ПАР залежно від режиму освітлення
|
Варіанти досліду |
Chlorophyta |
Bacillariophyta |
Cyanophyta |
Загальна |
|
Вихідний показник DF |
,28 ± 0,03 |
,22 ± 0,02 |
,18 ± 0,02 |
,32 ± 0,03 |
|
Після 24 годин контакту з КПАР |
||||
|
1. Контроль (світло) |
0,19 ± 0,02 |
,15 ± 0,02 |
,15 ± 0,02 |
,20 ± 0,04 |
|
2. Контроль (тінь) |
0,38 ± 0,04 |
,29 ± 0,04 |
,24 ± 0,03 |
,42 ± 0,02 |
|
3. + 3 ГДК АПАР (світло) |
0,18 ± 0,02 |
,17 ± 0,01 |
,14 ± 0,03 |
,31 ± 0,06 |
|
4. + 3 ГДК АПАР (тінь) |
0,22 ± 0,02 |
,18 ± 0,06 |
,16 ± 0,03 |
0,27 ± 0,03 |
|
5. + 3 ГДК НПАР (світло) |
0,26 ± 0,03 |
,22 ± 0,02 |
,16 ± 0,02 |
,22 ± 0,03 |
|
6. + 3 ГДК НПАР (тінь) |
0,31 ± 0,01 |
,24 ± 0,0 |
,23 ± 0,0 |
,40 ± 0,02 |
|
7. Альгінова к-та (світло) |
0,22 ± 0,07 |
,15 ± 0,04 |
,14 ± 0,03 |
,21 ± 0,04 |
|
8. Альгінова к-та (тінь) |
0,32 ± 0,02 |
,22 ± 0,02 |
,24 ± 0,0 |
,36 ± 0,01 |
Вивчення процесів фотовицвітання хлорофілів водоростей під впливом світла за швидкістю процесу, кількісним вмістом та змінами потенційної фотосинтетичної активності клітин, свідчить (рис. 10) про різну чутливість пігментних комплексів в присутності КПАР.
Рис. 10. Швидкість фотовицвітання пігментів у одноклітинних водоростей в присутності КПАР
Доведено, що фотовицвітання пігментів водоростей –це складний багатофункціональний процес реакції на світлове збудження хлорофілу й функціонування багатьох метаболічних ланцюгів клітини. В першу чергу, воно стосується міцності зв’язку хлорофіл-ліпідного комплексу, як передумови нормальної роботи хлорофілів в процесі фотосинтезу, що доведено нами раніше (Липницкая, Паршикова, 1992). Внаслідок цього не виключена поява похідних фосфатидилхоліну, який здатний активізувати в 10-12 разів 5-ліпоксигеназу, а отже подальше окиснення ліпідних компонентів й вивільнення хлорофілу а, який інтенсивно флуоресціює разом з фікоціаніном С особливо у синьозелених водоростей.
Отже, рослинні клітини різного систематичного положення в процесі еволюції створили ряд захисних бар’єрів, які допомагають їм виживати в мінливих й далеко не завжди сприятливих умовах довкілля. Є підстави вважати, що зменшення міцності зв’язку хлорофіл-білково-ліпідного комплексу клітини в умовах високого рівня світлового опромінення також можна розглядати як адаптацію до виживання. Звільнений хлорофіл за рахунок збудження сильно флуоресціює, випромінюючи частину енергії, яка б могла викликати надмірне перезбудження пігментів, посилення фотолізу води, нагромадження зайвого кисню в клітинах, виникнення вільнорадикальних процесів й подальшого пероксидного окиснення ліпідів та інших компонентів клітин. Шкода від цих процесів для життєдіяльності клітин була б значно більшою, ніж видалення назовні зайвої енергії збудженого світлом хлорофілу.
БІОПРОДУКТИВНІСТЬ ТА ФІЗІОЛОГІЧНИЙ СТАН МІКРОВОДОРОСТЕЙ ЗА УМОВИ ДІЇ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ СПОЛУК (Узагальнення)
Аналіз фактичних даних з фізіології мікроскопічних водоростей, а саме структурних характеристик, особливостей водного режиму, фотосинтезу, росту й розвитку, стійкості до стрес-фактору (на прикладі ПАР) свідчить, що характер адаптаційних реакцій, швидкість їх прояву та глибина деструктивних змін відрізняються у здатних до активного руху й нерухомих клітин (рис. 11).
При контакті з міцелами ПАР підвищується проникність біологічних мембран, що обумовлює їх набрякання й подальше руйнування клітинних структур. Швидкість прояву деструктивних змін залежить від хімічної природи ПАР (для катіонактивних процес відбувається дуже швидко, для аніонактивних й неіоногенних повільніше). В обох випадках масштаби негативності наслідків залежить від концентрації діючої ПАР й тривалості контакту. Наприклад, збільшення об’єму та площі поверхні клітин при концентрації КПАР в межах ГДК досягає від 2 до 30 раз, для АПАР –-4 рази, для НПАР –-2,5 рази. Активно рухливі клітини при внесенні в середовище ПАР, різко підвищуючи швидкість руху (на 30-40%) та змінюючи його напрям уникають контакту з міцелами ПАР, концентруючись в шарах чистої від них води.
Одержані дані пояснюють факт підвищення індексу сапробності у здатних для руху клітин водоростей. Рухлива клітина завдяки наявності відповідних фото- та хеморецепторів “відчуває” гетерогенність природної води. Як відомо (Massalski, 2002), вода насичена колоїдними мікрофібрилами біологічного походження, між якими є, прошарки води без них. При відборі останньої для відповідного гідрохімічного аналізу ми беремо незрівнянно більший її об’єм в порівнянні з тим, який оточує мікроскопічну клітину. Це й дає нам підставу відносити подібні організми до форм з високим рівнем сапробності й здатних виживати в забрудненому середовищі.
При відсутності можливості уникнути контакту з ПАР, особливо за дії високих концентрацій, виникають суттєві пошкодження життєво важливих органел фотосинтезуючих клітин. Найсуттєвіші деструктивні зміни спостерігаються у хлоропластів, наслідком чого є зменшення вмісту хлорофілу а та падіння фотосинтетичної активності. Важливо відмітити, що одночасно спостерігається помітне підвищення синтетичної активності апарату Гольджі, яке можна розглядати як прояв однієї із захисних реакцій клітини.
Під впливом ПАР найпомітніші зміни встановлені в ступені гідратації внутрішньоклітинних структур й співвідношення вільної та зв’язаної води. На нашу думку, це є наслідком посиленої вакуолізації клітин під впливом ПАР.
Нездатні до активного руху клітини водоростей відповідають на контакт з ПАР більш швидкими змінами проникності мембран з комплексом подальших негативних змін у структурно-функціональних показниках. Під впливом ПАР у них також змінюється гідратація внутрішньоклітинних структур, співвідношення форм вільної та зв’язаної води, зменшується вміст хлорофілів, активізуються процеси їх фотовицвітання й падіння потенціальної фотосинтетичної активності.
Важливо відмітити, що наявність ПАР у воді підвищує токсичність інших хімічних сполук. Це було доведено нами для важких металів зі змінною валентністю (на прикладі Cr+).
Негативну реакцію на присутність ПАР у воді виявляють й природні популяції водоростей, особливо в умовах високого рівня освітленості водної товщі. Це можна пояснити тим, що світло змінює поляризацію біологічних мембран й підвищує їх чутливість до дії ПАР.
В процесі еволюції у фотосинтезуючих клітин водоростей сформувався ряд захисних пристосувань, до яких ми відносимо: утворення шару екзогенних полісахаридів, наявність загострених виростів клітинної оболонки, що осаджують міцели ПАР на менш життєво важливих частинах поверхні клітин, формування щільних багатоклітинних плівок та агрегатів. Ця здатність водоростей можливо, й була однією з перших спроб формування багатоклітинних організмів. Не виключено, на нашу думку, що ці “агрегати” прокаріотних фотосинтетиків передували утворенню водоростево-бактеріальних матів, які розглядають як пристосування до виживання в екстремальних умовах (Герасименко, 2001; Paerl et al., 2000).
Проведені нами дослідження показали, що для підвищення стійкості клітин водоростей до дії ПАР можуть бути використані генетично трансформовані клітини. Вдалося отримати стійкі клітини для Anabaena PCC 7120, підібрати для них оптимальне поживне середовище, режим освітлення, концентрації антибіотиків для підтримання аксенічності культур. Подальші роботи в цьому напрямку перспективні, враховуючи негативні зміни, які викликає попадання ПАР в оточуюче середовище.
ВИСНОВКИ
1. Хімічні речовини з поверхневою активністю як природного (альгінова, миристинова кислоти) так і синтетичного походження впливають не лише на якість природних вод, але й діють негативно на структурно-функціональні показники клітин водоростей внаслідок чого припиняється ріст, гальмується розвиток, зменшується біологічне різноманіття й фотосинтетична активність мікроводоростей, як основних першопродуцентів кисню й органічних речовин у водних екосистемах.
2. Проведена порівняльна оцінка стійкості до дії ПАР водоростей представників ряду систематичних відділів, які найчастіше зустрічаються в басейні Дніпра свідчить, що досліджені види можна розташувати в такій послідовності: Сhlorophyta + Euglenophyta > Bacillariophyta > Cyanophyta > Dinophyta > Chrysophyta .
Це дозволить підбирати найбільш ефективні за продуктивністю види водоростей для використання в іммобілізованих системах біологічної очистки стічних вод від ПАР, проводити попередню експрес-біоіндикацію та біотестування якості природних вод за ступенем забруднення їх ПАР.
3. Причиною виживання мікроводоростей в присутності ПАР та підвищення індексу сапробності у рухливих клітин водоростей є наявність чутливих рецепторів негативного хемотаксису. Це дозволяє організмам істотно збільшувати швидкість та енергетику руху, змінювати його напрям й переходити на ділянки з більш чистою водою.
4. До комплексу еволюційних адаптацій клітин мікроскопічних водоростей можна віднести: здатність до руху (для джгутикових), а також форм, що ковзають по субстрату, здійснюють осциляційні коливання та “стрибки” (наприклад, Oscilatoriales, деякі види р. Anabaena); утворення кулеподібних формувань трихомів, покритих зовні шаром слизу (у представників рр. Phormidium, Nostoc); наявність загострених виростів клітинної оболонки, що осаджують міцели ПАР на менш життєво важливих частинах поверхні клітин (зелених водоростей з рр. Scenedesmus, Ankistrodesmus, Micractinium, Cosmarium та інші, у діатомових з р. Asterionella, Cyclotella, Stephanodiscus тощо); формування щільних багатоклітинних плівок та агрегатів в моно клітинних суспензіях мікроводоростей.
. Встановлено значення негативного електрокінетичного заряду поверхні клітин (z-потенціал). Він посилює контакт клітин з ПАР й мембранотропну активність останніх як фактора поляризації й руйнування біологічних мембран, інших структур клітин, обумовлюючи їхню вакуолізацію (до 50% об’єму клітини).
6. Внаслідок дії ПАР в клітинах підсилюється синтетична активність апарату Гольджі, знижується електронна щільність піреноїду. Серед органел найбільші деструктивні зміни відмічені у хлоропластів: злипання фотосинтетичних мембран, підвищення звивистості тилакоїдів та їх розбухання.
7. Доведено, що основні шляхи порушення функціональної активності клітин водоростей зумовлені прямим та опосередкованим впливом ПАР на життєдіяльність нативних клітин. Пряма дія ПАР змінює ступінь гідратації клітинних структур, форми води, а також стійкість хлорофілу до фотовицвітання. Саме ці функціональні показники можуть бути експрес-маркерами ступеню негативного впливу ПАР на життєдіяльність водоростей.
. Опосередкований вплив різноманітних ПАР на життєдіяльність мікроводоростей (на прикладі Cr+) пов’язаний із взаємодією КПАР з металами, які мають змінну валентність. Внаслідок цього токсичність впливу металу на життєдіяльність водоростей посилюється.
9. Характер біоіндикаційних реакцій та ступінь негативного впливу на структурно-функціональні показники клітин водоростей (біологічні мембрани, хлоропласти, ядра тощо) дозволили розташувати ПАР в такій послідовності: КПАР (катамін, етоній) > АПАР (лаурилсульфат, сульфанол) > природні ПАР > НПАР (синтамід, превоцел Е, стеарокс 6).
10. Ефективним засобом підвищення стійкості нативних клітин водоростей до ПАР може бути мутагенез. Доведено, що ГТК одержані за рахунок перенесення плазмід Escherichia coli збільшують свою стійкість до дії ПАР і становлять перспективу для використання в системах нейтралізації останніх.
. Визначені оптимальні умови інтенсивного вирощування ГТК (компоненти поживного середовища, освітлення, температури, концентрації антибіотиків для аксенічних культур).
12. Одержані нові дані щодо механізмів фотовицвітання пігментів в клітинах водоростей різних відділів й показана роль в цьому процесі інтенсивності освітлення. Фотовицвітання пігментів посилюється в нативних клітинах при інтенсивності сонячного світла від 10 до 132 Вт/м.
Список праць, опублікованих за темою дисертації
1. Мусієнко М.М., Паршикова Т.В., Славний П.С. Спектрофотометричні методи в практиці фізіології, біохімії та екології рослин.- К.: Фітосоціоцентр, 2001.- 200 с.
2. Пономаренко С.П., Паршикова Т.В. Использование лазерной корреляционно-допплеровской спектрометрии для экспресс-оценки эффективности стимуляторов роста водорослей // Альгология.- 2001. Т. 11, N 4.- С. 495-501.
3. Паршикова Т.В. Опыт получения мутантов Anabaena штамм РСС 7120 (Cyanophyta), устойчивых к действию поверхностно-активных веществ // Альгология.- 2002. Т. 12, N 4.- С. 399-406.
4. Паршикова Т.В., Веселовский В.А., Веселова Т.А., Дмитриева А.Г. Влияние ПАВ на функционирование фотосинтетического аппарата хлореллы // Альгология.- 1994.- Т. 4, N 1.- С. 38-46.
5. Parshikova T. Changes in Content, Correlation of Fatty Acids and State of Chlorophyll-Protein-Lipid Complex of Native Algae Cells in the Presence of Surfactants // Advances in plant lipid research.- Sevilla: Universidad de Sevilla, 1998.- P. 564-567.
. Паршикова Т.В. Вплив поверхнево-активних речовин на життєдіяльність планктонних водоростей // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”.- 1999.- В. 29.- С. 39-40.
. Паршикова Т.В. Забруднення природних вод ПАР й можливості його біоіндикації // Науковий вісник Українського державного лісотехнічного університету.- 1999.- В. 9.7.- С. 135-140.
. Паршикова Т.В. Взаємозв’язок рухливості мікроводоростей та резистентності їх клітин до дії хімічних факторів // Український бот. журнал.- 2000.- Т. 57, N 6.- С. 658-663.
9. Липницкая Г.П., Паршикова Т.В. Изменение прочности связи хлорофилл-белково-липидного комплекса водорослей под влиянием поверхностно-активных веществ // Гидробиологический журн.- 1992.- Т. 28, N 6.- С. 60-67.
10. Бутович И.А., Паршикова Т.В., Бабенко В.М., Ливарчук Л.В., Харченко О.В., Кухарь В.П. Регуляторная роль фосфолипидов в реакции окисления линолевой кислоты 5-липоксигеназой // Биологические мембраны (РАН).- 1992.- Т. 9, N 6.- С. 611-616.
. Паршикова Т.В. Вплив поверхнево-активних речовин хімічної природи на склад та співвідношення жирних кислот Microcystis aeruginosa Kurz. em. Elenk. // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”.- 2002.- В. 37.- С. 116-121.
. Паршикова Т.В., Сіренко Л.Я., Третяков О.Л. Розвиток фітопланктону у водосховищах та притоках Дніпра в роки високої активності Сонця // Український бот. журн.- 2002.- Т. 59, N 2.- С. 197-203.
. Столєтня О.К., Паршикова Т.В., Вашека О.В. Порівняльна характеристика вмісту кофеїну у деяких вищих та нижчих рослин // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”.- 2002.- В. 36.- С. 43-47.
14. Kuritz T., Sirenko L., Parshikova T., Topchishvili L and Sass A Vedicinal Plant Remedies and Nutraceuticales from Ukraine and Georgia // HerbalGram.- 2001.- N 51.- P. 48-54.
15. Паршикова Т.В., Сиренко Л.А., Щеголева Т.Ю., Колесников В.Г. Экспресс-контроль роста и физиологического состояния микроводоростей // Альгология.- 2001.- Т. 11, N 3.- С. 403-413.
. Могилевич Т.В, Паршикова Т.В., Бабенко В.А., Огий С.А., Кухарь В.П., Бутович И.А. Активация окисления линолевой кислоты 5-липоксигеназой из ячменя под влиянием фосфотидилинозита // Доповіді НАН України.- 1996.- N 7.- С. 120-124.
17. Паршикова Т.В. Влияние ПАВ на рост, размножение и функциональную активность водорослей в культурах и природных популяциях //Эколого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод.- Ярославль: Российская Экологическая Академия, Верхневолжское отделение, Институт биологии внутренних вод им. И.Д.Папанина РАН.- 1996.- С. 161-163.
18. Паршикова Т.В., Могилевич Т.В., Огий С.А., Бутович И.А. Влияние 13-гидроксида линолевой кислоты на рост ячменя (Hordeum vulgare L.) // Физиология и биохимия культурных растений.- 1997.- Т. 29, N 6.- С. 436-441.
19. Паршикова Т.В. Использование люминесцентного анализа для изучения семян рода Gagea Salib. // Интродукция и акклиматизация растений.- 1988.- N 9.- С. 31-34.
. Паршикова Т.В. Влияние синтетических моющих средств на размерные характеристики и функциональную активность синезеленой водоросли Microcystis aeruginosa Kutz. em. Elenk. // Использование сточных вод коксохимической промышленности на земледельческих полях орошения.- Москва: Министерство мелиорации и водного хозяйства СССР, Всесоюзный НИИ гидротехники и мелиорации им. А.Н. Костякова.- 1989.- С. 106-110.
21. Сиренко Л.А., Паршикова Т.В. Влияние ацидификации среды на жизнедеятельность водорослей // Альгология.- 1993.- Т. 3, N 2.- С. 3-18.
. Сіренко Л.Я., Паршикова Т.В. Фізіологія водоростей на межі тисячоліть: короткий історичний нарис, основні досягнення, перспективи розвитку на Україні // Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть.- К.: Фітосоціоцентр, 2001.- С. 303-318.
. Cпосіб одержання хлорофіло-каротинової пасти з репараційно-регенеративними властивостями: Патент України N 96010114 від 11.01.1996 / Л.Я.Сіренко, О.Й.Сакевич, Н.І.Кірпенко, Ю.О.Кірпенко, В.В.Бадзюк, Т.В.Паршикова.- Заявлено 11.01.96; Опубл. 25.04.97, Бюл. N 12.- 3 с.
. Штам синьозелених водоростей Oscillatoria neglecta Lemm. –продуцент біологічно активних речовин з антибластомними та антимікробними властивостями: Патент України N 94043418 від 20.09.1999 р. / Л.Я.Сіренко, Ю.О.Кірпенко, Н.І.Кірпенко, О.В.Романенко, В.М.Панфьоров, Т.В.Паршикова; Заявлено 05.04.1994; Опубл. 15.09.2000, Бюл. N 4.- 5 с.
Матеріали та тези конференцій
25. Parshikova T. Effect of surfactants on the Cyanobacteria // Abstract of VIII Intern. Symp. on Phototrophic Prokaryotes.- Urbino (Italy).- 1994.- P. 106.
. Parshikova T. An Experience of Directed Regulation of Microalgae Biomass Compositions as Valuable Pharmacological Raw Material // Pharmacological Research. Italian Pharmacological Society.- Italy: Academic Press.- 1995.- P. 382.
. Parshikova T. Plant Growth Stimulators in Fugates of Industrial Cultures of Green Microalgae // Proc. Of Progress in Plant Sciences from Plant Breeding to Growth Regulation Conf.- Mosonmagyarovar (Hungary).- 1996.- P.201-206.
28. Musienko N. and Parshikova T. Using Algae for Surfactants Bioindicators // Proc. of 3rd International Symp. and Exhibition of Env. Contam. in Central and Eastern Europe.- Warsaw (Poland).- 1996.- P.35-37.
29. Parshikova T. The interaction of surfactants with living algae cells // Abstract of NATO ASI Conf. Bioavailability of organic xenobiotics in the environment.- Jesenic (Czech Republic).- 1997.- P. 74.
30. Паршикова Т.В. Вплив ПАР на життєдіяльність деяких видів водоростей та виділення з їх клітин органічних речовин // Матеріали 10 з’їзду Українського ботанічного товариства. –Полтава (Україна).-1997.- С. 72-73.
31. Паршикова Т.В. Подбор функциональных биотестов для контроля поверхностно-активных веществ в природных водах // Вода –проблемы и решения.- Днепропетровск: Гамалия.- 1998.- С.65-68.
32. Миронюк В.І., Паршикова Т.В. Експериментальна альгологія на Україні // Матеріали наукових читань, присвячених 100-річчю відкриття подвійного запліднення у покритонасінних рослин професором університету Св. Володимира С.Г.Навашиним.- К.: Фітосоціоцентр.- 1998.- С. 157-160.
33. Рarshikova T.V. Effect of surfactants on the growth and photosynthetic activity of algae // Abstract of 2nd Conf in Plant Sciences from Plant Breeding to Growth regulation. –Mosonmagyarovar (Hungary).- 1998.- P. 103.
34. Паршикова Т. Зміни морфофізіологічних й біохімічних показників у деяких видів водоростей під впливом хімічного забруднення // Матеріали міжнародної конф. Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі.- Львів (Україна). -1998.- С. 227-229.
35. Parshikova T. Surfactants as a factor of reduction in phytoplankton photosynthetic activity // Abstract of IV International Symp. and Exhibition on Environ. Contam. in Central and Eastern Europe.- Warsaw (Poland).- 1998.- P. 142.
. Savenkov S., Yushtin K., Parshikova T., Draga M. Study of procariotic and eucariotic microalgae cells with Mueller matrix polarimetry method // Proc. of International Society for Optical Engineering.- Chernivtsy (Ukraine).- 1999, Vol. 3904.- P. 562-566.
37. Паршикова Т.В. Сравнительная оценка чувствительности различных видов водорослей к действию катионактивного детергента и некоторых металлов // Тези 2 Міжнар. Конф. Актуальные проблемы современной альгологии.- Київ (Україна).- 1999.- С. 109-110.
. Паршикова Т.В. ПАВ –стресс-фактор формирования продуктивности микроводорослей // Тезисы докл. IV съезда общества физиологов растений России.- Т. 1.- Москва.- 1999.- С. 436-437.
39. Паршикова Т.В., Сиренко Л.А. ПАВ в водоеме, их влияние на жизнедеятельность фитопланктона // Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды.- Минск-Нарочь.- 1999.- С. 344-351.
40. Паршикова Т.В., Щеголева Т.Ю., Колесников В.Г. Состояние воды в клетках водорослей и их функциональная активность в различных условиях // Тезисы докладов V Всероссийской конф. По водным растениям “Гидроботаника-2000”. –Борок (Россия).- 2000.- С.66-67.
41. Parshikova T., Ponomarenko S. Experience of using natural regulators of growth (emystime and ivine) for stimulation of microalgae growth in cultivation // Abstract of 4th European Workshop “Biotechnology of microalgae”.- Bergholz-Reihbrucke (Germany).- 2000.- P. 59.
. Parshikova T. Sensitivity of Anabaena PCC 7120 mutant cells to surfactants // Abstract of 10th Intern. Symp. on Phototrophic Prokaryotes.- Barcelona (Spain).- 2000.- P. 148.
. Parshikova T.V. and Musienko N.N. Surfactants as a factor of regulation for microalgae development // Abstract of V International Sym. and Exhibition on Environmental Cont. in Central and Eastern Europe.- Prague (Czech Republic).- 2000.- P. 156.
. Parshikova T. Surfactant as a factor of regulation for microalgae development // CD –proc. of Fifth Intern. Sym. and exhibition on Environ. Contam. in Central and Eastern Europe.- Prague (Czech Republic).- 2000.- 5 p.
45. Parshikova T. Possible Methods for Elimination Surfactants Contamination of Water with Using of Microalgae // Innovative Approaches to the On-Site Assessment and Remediation of Contaminated Sites.- Prague (Czech Republic).- 2001.- P. 51-53.
. Parshikova T. Using of Anabaena PCC 7120 mutant cells, resistant to surfactants // Abstracts of Intern. Conf. Microalgae and seaweed products in plant/soil systems.- Mosonmagyarovar (Hungary).- 2001.- P.41.
47. Паршикова Т.В., Мусієнко М.М. Мікроводорості, як перспективні продуценти цінних жирних кислот // Український біохімічний з’їзд.- Чернівці (Україна).- 2002.- С. 133.
. Parshikova T., Shchegoleva T., Kolesnikov V., Dreval’N. The interrelation between photosynthetic activity of microalgae and state of water structuredness in cells // Abstracts of Inter. conf. “Photosynthesis and Crop Production”.- Kiev (Ukraine).- 2002.- P. 88.
49. Parshykova T. and Musienko N. Endogenic and exogenic interaction of microalgae lipis with surfactants in water environment // Abstracts of 15th Intern. Sym. on Plant Lipids.- Okazaki (Japan).- 2002.- P. 338.
АНОТАЦІЯ
Паршикова Т.В. Структурно-функціональні маркери адаптації мікроводоростей при дії поверхнево-активних речовин.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук зі спеціальності 03.00.12 –фізіологія рослин. –Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2003.
Дисертація присвячена вивченню закономірностей взаємодії клітин мікроводоростей з різним типом фоточутливих систем із речовинами природного та синтетичного походження (ПАР), що у великих об’ємах попадають у водні екосистеми й внаслідок високої поверхневої активності негативно впливають на фотосинтезуючі організми. Об’єктом дослідження були природні популяції водоростей та цінні для промислового вирощування культури (представники родин Cyanophyta, Chlorophyta, Bacillariophyta, Rhodophyta), представлені як активно рухливими формами, так і організмами фітопланктону, що пасивно зависають у воді. Досліджені зміни під впливом ПАР структури (зміни цитоплазматичних мембран, стан хлоропластів, ядер, мітохондрій, вакуолей) та фізіології клітин (інтенсивність росту та розмноження, швидкість руху, енергетичний потенціал його здійснення, зміни об’ємів та площі поверхні внаслідок надходження води), особливості фотосинтезу, водного обміну та стійкості (динаміка вмісту хлорофілу а, потенційної фотосинтетичної активності, зміни стану води та гідратації внутрішньоклітинних структур, процеси фотовицвітання хлорофілу при опроміненні світлом, адаптаційні пристосування клітин до виживання в умовах контакту з ПАР). Вперше розшифровані основні механізми впливу на клітини мікроводоростей 9 видів ПАР різної хімічної природи (катіон-, аніонактивних, неіоногенних та природних). Одержані стійкі до КПАР мутанти Anabaena PCC 7120 й доведена перспектива мутагенезу в виживанні організмів. Дана порівняльна оцінка стійкості до дії ПАР представників основних систематичних відділів (Chlorophyta + Euglenophyta > Bacillariophyta > Cyanophyta > Dinophyta > Chrysophyta).
Встановлено, що стан гідратації внутрішньоклітинних структур (зміни кількості вільної та зв’язаної води) та режим освітлення є ключовими механізмами формування фотосинтетичної активності та рівня життєздатності клітин водоростей.
Ключові слова: водорості, поверхнево-активні речовини, генетично трансформовані клітини, фотосинтез, фотовицвітання клітин, рухливість, стійкість, водний обмін.
АННОТАЦИЯ
Паршикова Т.В. Структурно-функциональные маркеры адаптации микроводорослей к действию поверхностно-активных веществ. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.12 –физиология растений. –Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2003.
Работа посвящена изучению структурно-функциональных изменений в клетках и механизмов взаимодействия микроскопических водорослей, отличающихся по комплексу фоточувствительных пигментов, с поверхностно-активными веществами (ПАВ). Последние в больших объемах и широком ассортименте попадают в водные объекты и негативно влияют на формирование качества природных вод, но и на функциональную активность микроскопических водорослей. Объектом исследования были альгологически и аксенические культуры 17 видов промышленно ценных культур водорослей –представителей Сhlorophyta, Cyanophyta (Cyanobacteria), Rhodophyta, а также водоросли природных популяций из водных объектов бассейна Днепра. Изучались организмы, способные к активному движению и взвешенные в воде.
Впервые установлены изменения под влиянием ПАВ объемов и поверхности клеток, состояния и структуры хлоропластов, ядер, митохондрий, аппарата Гольджи. При контакте с ПАВ отмечена значительная вакуолизация клеток (вакуоли занимают до 50% объема), слияние тилакоидов, уменьшение электронной плотности пиреноида, отсутствие амилогенной зоны вокруг него, повышение активности аппарата Гольджи при повышении концентрации катионных ПАВ. С использованием метода лазерно-допплеровской спектроскопии показано, что с первых минут контакта тест-культуры Chlamydomonas reinhardtii Dang. с КПАВ (катамином) в концентрации 0,1-3,0 мг/л существенно ускоряется движение клеток и изменяется их энергетический потенциал. Этим объясняется формирование высокого индекса сапробности именно у подвижных форм, которые при контакте с ПАВ “включают” хеморецепторы отрицательного хемотаксиса и быстро уходят в зоны более чистой воды.
Впервые исследованы процессы фотовыцветания хлорофиллов прокариотических и эукариотических водорослей. Присутствие ПАВ в воде значительно усиливает эти процессы и угнетает фотосинтетическую активность водорослей тем больше, чем выше действующая концентрация и продолжительнее время контакта с действующим реагентом.
Для неразрушающего зондирования клеток микроскопических водорослей был впервые использован метод КВЧ-диэлектрометрии. Установлено, что состояние гидратации их внутриклеточных структур, обуславливающее изменения соотношения свободной и связанной воды, в совокупности с режимом освещения являются ключевыми механизмами уровня фотосинтетической активности и жизнедеятельности клеток водорослей.
Непрямое влияние ПАВ на клетки микроскопических водорослей связано с их взаимодействием с металлами, имеющими переменную валентность (на примере Cr+) и проявляется в усилении токсичности для тест-культуры хлореллы.
Определены основные адаптационные приспособления клеток к выживанию в условиях контакта с ПАВ, связанные с их строением, интенсивностью образования экзогенных полисахаридов, наличием на поверхности негативного электрокинетического заряда клетки (z-потенциала).
Доказано, что эффективным фактором формирования устойчивости клеток к влиянию ПАВ может быть мутагенез (получение генетически трансформированных клеток водорослей за счет переноса плазмид Е. соli). Указанные мутанты получены, разработана технология их интенсивного культивирования и установлены пределы чувствительности к ПАВ.
Дана сравнительная оценка стойкости к действию ПАВ представителей основных систематических отделов (Chlorophyta + Euglenophyta > Bacillariophyta > Cyanophyta > Dinophyta > Chrysophyta). Впервые показано, что характер влияния ПАВ на жизнедеятельность фитопланктона зависит от интенсивности солнечной инсоляции, увеличение которой с 10 до 130 Вт/м усиливает негативное влияние на рост, развитие и фотосинтетическую активность водорослей тем сильнее, чем выше уровень освещенности. Негативная реакция водорослей на солнечное облучение регистрируется не только в поверхностно пленке воды (для водорослей нейстона), но и на глубине 0,1-0,2 м водной толщи в зависимости от прозрачности воды и ее цветности. К числу причин негативной реакции водорослей на высокий уровень солнечного облучения можно отнести изменения состояния светочувствительных пигментов, в первую хлорофилла а и гидрофобного комплекса клеточных структур, как наиболее важного компонента мембран фотосинтезирующих организмов.
Ключевые слова: водоросли, поверхностно-активные вещества, генетически трансформированные клетки, фотосинтез, фотовыцветание клеток, подвижность, стойкость, водный обмен.
SUMMARY
Parshikova T. V. The structure-functional markers of adaptation for microalgae under surfactant effect.- Manuscript.
Dissertation for the obtaining of the scientific degree (Doctor of Biological sciences). Speciality 03.00.12 –Physiology of plants. Kyiv National University named Taras Shevchenko, Kyiv, 2003.
The dissertation is devoted to studying of regularities the interaction of microalgae cells (with different types of photosensitive systems) and surfactants (with natural and synthetic origin), which are entered into water ecosystems in significant volume. As the objects have been used as well natural algae populations as valuable for industrial photosynthesis the algae cultures from Cyanophyta (Cyanobacteria), Chlorophyta, Bacillariophyta, Rhodophyta. Among them were movable and immovable algae cells. It was investigated the changes in structure of cytoplasmic membrane, state of chloroplasts, nuclei, mitochondria, vacuole and physiology of plant cells (growth intensity and reproduction, speed of motion and its energy potential, changes of volume and surface square under surfactants effect. The peculiarities of photosynthesis, water regime and resistance (dynamics of chlorophyll a content and potential photosynthetic activity, changes of hydration of intracellular structures, processes of chlorophyll photofading under light irradiation), adaptation cells adjustment to survive at the presence of surfactant were analyzed. It was shown the main mechanisms of effect of 9 types of surfactants with different chemical nature (cationic-, anionicactive, nonionogenic and natural). It was received the stability to cationic surfactant the Anabaena PCC 7120 mutant cells and proved the perspectivity of mutagenase in survive of organisms. It was presented the comparative estimation of stability to surfactants for representatives of main systematic groups (Chlorophyta + Euglenophyta > Bacillariophyta > Cyanophyta > Dinophyta > Chrysophyta). The state of hydration the intracellular structure (changes of free and bound water) and regime of illumination are the key mechanisms of formation the photosynthetic activity and level of potential vitality for algae cells.
Key words: algae, surfactants, genetically transformed cells, photosynthesis, photofading of cells, mobility, stability, water exchange.
Критеріями вибору ПАР як діючих реагентів були об’єми та різноманіття використання цих сполук на практиці, а також рівні їхнього фактичного знаходження у природних водах.