Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Ответы по генетике. (41-45 вопросы)
41. Мутагенез, индуцированный химическими мутагенами – аналогами оснований, интеркалирующими агентами, алкилирующими агентами, активными формами кислорода.
Мутагенез — это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Различают естественный (спонтанный) и искусственный (индуцированный) мутагенез.
Искусственный мутагенез
Искусственный мутагенез широко используют для изучения белков и улучшения их свойств (направленной эволюции(англ.)).
Ненаправленный мутагенез
Методом ненаправленного мутагенеза в последовательность ДНК вносятся изменения с определенной вероятностью. Мутагенными факторами (мутагенами) могут быть различные химические и физические воздействия — мутагенные вещества, ультрафиолет, радиация. После получения мутантных организмов производят выявление (скрининг) и отбор тех, которые удовлетворяют цели мутагенеза. Ненаправленный мутагенез более трудоемок и его проведение оправдано, если разработана эффективная система скрининга мутантов.
Многие химические соединения, встречающиеся в окружающей среде, обладают способностью взаимодействовать с ДНК или с ее низкомолекулярными предшественниками и вызывать мутации. Некоторые вещества изначально являются реакционноспособными мутагенами, непосредственно соединяющимися с ДНК и изменяющими ее химическую структуру, другие, так называемые промутагены , для превращения в мутагены претерпевают метаболическую активацию под действием ферментативных систем организма. Химические мутагены используют как дополнительный метод в селекции растений для расширения генетического разнообразия видов и форм растений и как специфические стимуляторы роста и развития организмов. В настоящее время разработана достаточно надежная теоретическая база, позволяющая с успехом применять химические и другие мутагенные факторы для повышения уровня генетического разнообразия культурных растений. С помощью мутагенов можно разорвать сцепленно наследуемые признаки, преодолеть нескрещиваемость между отдаленными формами и стерильность собственной пыльцы, решить задачи, не поддающиеся разрешению при использовании других методов селекции. В ряде случаев возникают совершенно новые формы и признаки, не встречающиеся в природе, что позволяет расширить естественное разнообразие форм культурных растений . В зависимости от дозы мутагенов возникают различные виды мутаций: генные (точечные микромутации), хромосомные (структурные) и геномные. Наибольший выход положительных мутаций при дозах мутагенов, которые не оказывают угнетающего действия на рост и развитие растений. Более грубые типы нарушений, вызванные высокими дозами мутагенов, как правило, индуцируют отрицательные неадаптивные мутации, которые отбраковывают отбором. При использовании более низких доз мутагенов индуцируются микромутации, затрагивающие изменение отдельных признаков: продуктивность, изменение качества, раннеспелости, некоторых биохимических показателей организма. Именно генные микромутации служат основным материалом при естественном отборе. Они составляют самую большую долю всех наследственных изменений и являются необходимой предпосылкой ускорения эволюции. Химические мутагены в малых дозах вызывают различные стимулирующие эффекты, модификации не генетического характера. В последнее время стимуляционная селекция широко применяется в селекции и в производстве. В результате стимуляции некоторых сельскохозяйственных культур химическими мутагенами повышается урожайность в 2—3 раза. В отличие от действия ростовых стимуляторов ауксинов, гиббереллинов, цитокининов, действующих на этапах вегетативного роста, стимулирующий эффект химических мутагенов после обработки семян более ранний. Химические мутагены действуют на первые этапы эмбриональной детерминации в развивающихся семенах и тем самым стимулируют основные созидательные градиенты растений. Впервые индуцированные мутации были получены отечественными генетиками Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым в 1925 г. при облучении дрожжей излучением радия. В 1927 г. американский генетик Г. Мёллер выявил мутагенное действие рентгеновских лучей на дрозофиле, а в 1928 г. Л. Стадлер описал мутагенное действие рентгена на ячмень.
В 1930-ых гг. был открыт химический мутагенез . В 1932 г. В.В. Сахаров, а в 1934 г. М.Е. Лобашев и Ф.А. Смирнов показали, что некоторые химические вещества (йод, уксусная кислота, аммиак) способны индуцировать мутации у дрозофилы. В 1939 г. С.М. Гершензон установил, что чистая ДНК является сильным мутагеном . В течение 1940-ых гг. было доказано, что сильными мутагенами могут быть самые разнообразные вещества: этиленимин (И.А. Рапопорт, СССР), азотистый иприт (Ш. Ауэрбах и Дж. Робсон, Великобритания).
На ход М. оказывают значительное влияние различные внешние факторы. Так, частота мутаций, индуцируемых ионизирующими излучениями, возрастает при поступлении в клетку кислорода и падает при его недостатке, например, если облучение происходит в атмосфере азота (см. Кислородный эффект). Некоторые вещества подавляют М. (см. Антимутагены). Например, введение в клетку аденозина или гуанозина тормозит мутагенное действие аналогов пуриновых азотистых оснований; фермент каталаза снижает мутагенный эффект ионизирующих излучений и т. д. При действии некоторых химических мутагенов мутации могут возникать как сразу, так и спустя известное время, иногда через несколько клеточных поколений.
(про мутагенез в общем см в вопросе 41)
Особенности действия физических мутагенов
К физическим мутагенам относятся: ионизирующее излучение (альфа–, бета–, гамма–, нейтронное и рентгеновское излучение), коротковолновое ультрафиолетовое излучение, СВЧ–излучение, действие экстремальных температур.
Действие ионизирующего излучения основано на ионизации компонентов цитоплазмы и ядерного матрикса. При ионизации возникают высокоактивные химические вещества (например, свободные радикалы), которые различным образом действуют на клеточные структуры. Рассмотрим наиболее изученные механизмы мутагенного воздействия ионизирующего излучения.
1. Непосредственное воздействие частиц с высокой энергией на ДНК, которое приводит к ее разрывам: одиночным (под воздействием гамма-квантов, рентгеновских лучей) или множественных (под воздействием альфа-частиц, нейтронного излучения). Это универсальный механизм возникновения хромосомных перестроек на всех стадиях клеточного цикла, но он действует очень грубо – обычно клетки теряют способность к нормальному делению и погибают. К разрывам ДНК приводит и ультрафиолетовое облучение.
2. Опосредованное воздействие ионизирующих факторов связано с нарушением структуры ферментов, контролирующих репликацию, репарацию и рекомбинацию ДНК. Этот механизм наиболее эффективно действует на синтетической стадии интерфазы. При больших дозах мутагенов клетки погибают. (Поскольку раковые клетки делятся непрерывно, то облучение является универсальным средством подавления развития метастазов при онкологических заболеваниях – непрерывно делящиеся раковые клетки более уязвимы, чем медленно пролиферирующие или непролиферирующие нормальные клетки.)
Опосредованное воздействие ионизирующих факторов индуцирует самые разнообразные генные и хромосомные мутации. При опосредованном действии ионизирующих факторов их мутагенный эффект может быть снижен с помощью специальных веществ – радиопротекторов. К радиопротекторам относятся различные антиоксиданты, взаимодействующие с продуктами ионизации. В то же время, мутагенный эффект может быть усилен, например, высокая температура повышает мутагенный эффект радиации.
3. Особенности мутагенного действия ультрафиолетовых лучей. ДНК интенсивно поглощает жесткий ультрафиолет с длиной волны ≈ 254 нм. Основным продуктом является образование нуклеотидных димеров: два нуклеотида, расположенных рядом в одной цепи ДНК, «замыкаются» сами на себя, образуя пары «тимин–тимин» и «тимин–цитозин». При репликации ДНК напротив такой пары в достраивающейся цепи могут стать два любых нуклеотида, т.е. принцип комплементарности не выполняется. Ультрафиолетовый свет – это сравнительно мягкий мутаген , поэтому его широко используют в селекции растений, облучая проростки.
4. Особенности мутагенного действия экстремальных температур. Собственный мутагенный эффект экстремальных температур не доказан. Однако очень низкие или очень высокие температуры нарушают деление клетки (возникают геномные мутации). Экстремальные температуры усиливают действие других мутагенов , поскольку снижают ферментативную активность репарационных систем.
Ионизирующие излучения действуют на нуклеиновые кислоты непосредственно, ионизируя и активируя их атомы. Это приводит к разрывам углеводно-фосфатного остова молекулы и водородных связей между комплементарными нитями ДНК, образованию «сшивок» между этими нитями, разрушению азотистых оснований, особенно пиримидиновых. Прямое действие ионизирующей радиации на хромосомы и содержащуюся в них ДНК обусловливает почти линейную зависимость между дозой облучения и частотой вызываемых облучением генных мутаций и нехваток (малых делеций); однако для тех типов хромосомных перестроек, которые возникают в результате двух разрывов хромосомы (более крупные делеции, инверсии, транслокации и др.), зависимость между дозой облучения и их частотой имеет более сложный характер. Мутагенное действие ионизирующих излучений может быть и косвенным, т. к. прохождение их через цитоплазму или питательную среду, в которой культивируются микроорганизмы, вызывает радиолиз воды и возникновение свободных радикалов и перекисей, обладающих мутагенным действием. Ультрафиолетовое излучение возбуждает электронные оболочки атомов, что вызывает различные химические реакции в нуклеиновых кислотах, приводящие к мутациям. Из этих реакций наибольшее значение имеют гидратация цитозина и образование димеров тимина, но известную роль в М. играют также разрыв водородных связей между нитями ДНК и образование «сшивок» между этими нитями. Ультрафиолетовые лучи плохо проникают во внутренние ткани организма, и их мутагенное действие проявляется только там, где они могут достигнуть генетического аппарата (например, при облучении вирусов, бактерий, спор растений и т. п.). Наиболее мутагенны ультрафиолетовые лучи с длиной волны от 2500 до 2800 А, поглощаемые нуклеиновыми кислотами. Лучи видимого спектра подавляют мутагенный эффект ультрафиолетовых лучей (см. Фотореактивация).
Спонтанный мутагенез, т.е. процесс возникновения мутаций в организме в отсутствие намеренного воздействия мутагенами, представляет собой конечный результат суммарного воздействия различных факторов, приводящих к повреждениям генетических структур в процессе жизнедеятельности организма.
Причины возникновения спонтанных мутаций можно разделить на:
• экзогенные (естественная радиация, экстремальные температуры и др.);
• эндогенные (спонтанно возникающие в организме химические соединения-метаболиты, вызывающие мутагенный эффект; ошибки репликации, репарации, рекомбинации; действие генов-мутаторов и антимутаторои; транспозиция мобильных генетических элементов и др.).
Организм человека за год поглощает в среднем 0,095 рад энергии ионизирующих излучений, поступающих от естественной радиации (у-излучение Земли, космические лучи, радиоактивные элементы земной коры и атмосферы такие, как радон, углерод С , калий К40 и др.). Эта доза зависит от высоты над уровнем моря и географической широты. Кроме того, радиация выше в районах, где есть выходы на поверхность первичных пород. У человека доля мутаций, индуцированных естественной радиацией составляет до 25%, а у дрозофилы —лишь 0, 1% всех спонтанных мутаций.
Относительно УФ-излучения выше уже было указано, что оно практически не играет никакой роли в возникновении мутаций в половых клетках эукариот, не обладая достаточной проникающей способностью. В то же время, у одноклеточных организмов и вирусов под действием ультрафиолета образуется значительная часть спонтанных мутаций.
Замечено, что в высокогорных, а также арктических условиях растительность представлена преимущественно полиплоидными формами, так как резкие перепады температур в период вегетации растений ведут к увеличению частоты спонтанных геномных мутаций. Увеличение температуры окружающей среды на каждые 10 °С увеличивает частоту мутаций в 5 раз.
Основным источником спонтанных мутаций служат эндогенные факторы, приводящие к повреждению генов и хромосом в процессе нормального клеточного метаболизма. Результат их действия — ошибки генетических процессов репликации, репарации и рекомбинации.
Ошибки репликации:
• таутомерные переходы азотистых оснований приводят при репликации к спонтанным транзициям и трансверсиям;
• ошибки в работе ДНК-полимераз обусловливают некомплементарное встраивание 1 на 100000 вновь синтезирующихся нуклеотидов. Корректорская 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз снижает эту частоту до 1 на 10000000000;
• химические модификации оснований (например, при встраивании 5-метилцитозина происходит замена GC - AT, т.к. 5-метилцитозин при последующей репликации может образовывать водородные связи с аденином).
Ошибки репарации:
• например, мутации в гене uvrD, отвечающем за репарацию одноцепочечных разрывов при УФ-облучении Е.сой\ в сотни раз повышает частоту спонтанных транзиций AT — GC.
Ошибки рекомбинации:
• в результате неравного внутригенного кроссинговера в мейозе происходят вставки либо выпадения оснований.
К эндогенным факторам спонтанного мутагенеза относится и мутагенная активность специальных элементов генома: генов-мутаторов и эндогенных метаболитов. Так генетическая стабильность большинства генов определяется не только особенностями их строения, но и уровнем общей мутабильности клетки, контролируемой генами-мутаторами и антимутаторами, которые по-видимому, задействованы в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. К классу эндогенных метаболитов относятся спонтанно возникающие химические соединения, вызывающие мутагенный эффект. Например, при заживлении физических травм у растений, образуются каллусные клетки, которые в норме отсутствуют, при этом индуцируется синтез дополнительных ферментов и метаболитов, необходимых для заживления раны. Если в каллуснои ткани возникают почки, то часть побегов из этих почек оказываются полиплоидными, т.е. метаболиты каллуснои ткани способны вызывать геномные мутации. Мутагенным эффектом обладают и свободные радикалы, возникающие при перекисном окислении липидов клеточных мембран.
Среди структурных факторов, определяющих эндогенные механизмы мутагенеза, можно выделить такие;
• наличие прямых и обратных повторов вблизи места перестройки;
• высокая концентрация CpG-динуклеотидов;
• наличие внегенных последовательностей ДНК, гомологичных фрагментам структурного гена;
• мобильные элементы генома.
Два первых фактора реализуются в процессе репликации ДНК хромосом, третий — в процессе рекомбинации.
Вследствие скользящего нарушения спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней цепей ДНК при репликации нередко образуются петли. Их формирование обусловлено наличием в первичной структуре ДНК прямых и инвертированных повторов, идентичных повторяющихся последовательностей, структур шпилечного типа, квазипалиндромных последовательностей и симметричных элементов генома (например, CTGAAGTC). Эти петли либо исчезают в результате репарационного процесса (и тогда возникают делеции), либо сохраняются и приводят к дупликациям и ин-серциям; при этом сформировавшиеся изменения закрепляются в последующих циклах репликации. Именно в последнем случае возможно появление мутации экспансии.
Возникновение мутаций зависит от особенностей первичной структуры ДНК в месте перестройки, и ряд исследователей полагают, что повышенной эндогенной мутагенностью обладают вообще все последовательности ДНК, находящиеся в состоянии изгиба (bens DNA). Именно такая конформационная структура ДНК свойственна: промоторным частям генов, местам начала репликации (origins of replication), месгам контакта хромосом с ядерным матриксом, т.е. тем участкам ДНК, на которые воздействуют топоизомеразы, участвующие в процессах репликации, транскрипции, рекомбинации, в том числе, и негомологичной (незаконной). Результатом последней могут быть не только внутри генные мутации, но и крупные структурные перестройки хромосом (транслокации, инверсии и др.).
Наиболее распространенные спонтанные нарушения ДНК в ходе репликации и репарации - потеря оснований и дезаминирование, к которому особенно чувствительны цитозиновые остатки. В настоящее время показано, что у позвоночных почти половина всех цитозиновых остатков в ДНК метилирована в 5-м положении, в областях повторов 5'-CpG-3'. При дезаминировании 5-метилцитозин превращается в тимин. При последующей репликации возникший в результате деза-минирования ошибочный вариант (T-G) либо корректируется (C-G), либо приводит к мутациям типатранзиций; (T-G) или (С-А). Гены, имеющие в своей структуре большой процент CpG-оснований, спонтанно мутируют по типу транзиций особенно часто. Таковы, например, ген фенилаланингидроксилазы у больных фе-нилкетонурией, гены факторов VIII и IX свертывания крови и др.
Еще одна существенная причина эндогенного мутагенеза — наличие псевдогенов -тесно сцепленньгх с генами гомологичных последовательностей ДНК. В мейозе результатом такой структурной особенности может быть неравная гомологичная рекомбинация и, как следствие - генная конверсия, сопровождающаяся делениями, дупликациями и другими перестройками. Так, очевидная ключевая рольошибок рекомбинации вэтио-логии нарушений структуры была установлена при анализе гигантского по размерам (2,2 млн, п.н.) гена дистрофина, мутации которого (в 60% случаев являющиеся делециями) ведут к миопатии Дюшенна. Подавляющее большинство этих делеций, захватывающих один или несколько соседних экзонов, сосредоточено в двух «горячих» районах. Наблюдаемая частота внутригенных рекомбинаций почти в 4 раза выше, чем можно предполагать, исходя из размеров генадистрофина. В одной из этих «горячих» точек (интрон 7) недавно обнаружен кластер транспозоноподобных повторяющихся последовательностей. Единичные пока наблюдения свидетельствуют о реальном перемещении этих элементов по типу конверсии и об их интеграции в структурные гены аденозиндезаминазы, аполи-попротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмодулина.
Ген-антимутатор (antimutator (gene)) - Ген, противоположный по действию гену-мутатору, т.е. ген, обусловливающий снижение частоты мутирования; мутаторное либо антимутаторное действие может оказываться аллелями одного и того же гена (например, ген 43 фага Т4).
(подробнее в учебнике стр 260)
Репарация — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физическими или химическими агентами. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (напр., пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации.
Основные типы повреждения ДНК
Каждая из систем репарации включает следующие компоненты:
У бактерий имеются по крайней мере 2 ферментные системы, ведущие репарацию — прямая и эксцизионная.
Прямая репарация наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.
Эксцизионная репарация (англ. excision — вырезание) включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.
Системы репарации ДНК обеспечивают точность воспроизведения и сохранения генетической информации .
Репаративные механизмы, которые использует клетка для поддержания стабильности информации, заложенной в ДНК универсальны - функциональная, а иногда и структурная гомология элементов, образующих эти механизмы, прослеживается от бактерий до человека.
Чем сложнее клетка, тем большее количество структурных и регуляторных генов и их продуктов участвуют в процессах репарации ДНК, хотя принципиальная схема конкретного процесса, как правило, остается неизменной.
Репаративные механизмы образуют сложную сеть, сплетенную функциональными связями или заимствованиями структурных элементов, которая обеспечивает баланс между стабильностью информации в ДНК и ее эволюционной изменчивостью.
Обратимся к схеме, представленной на рис. 2 . Точность воспроизведения ДНК и передачи информации, в ней заложенной, обеспечивается двумя матричными процессами - репликацией и транскрипцией ДНК.
Хотя ДНК-полимераза обладает корректирующей активностью, репликация не абсолютно точна, и, если возникают неспаренные основания, то системы коррекции оснований исправляют ошибку.
Если в ДНК появляются одно- и двунитевые разрывы, то в действие вступает гомологичная рекомбинация , которая за счет сестринских обменов точно восстанавливает целостность ДНК. Однако рекомбинация - это "тяжелая артиллерия", и предназначена она более всего для изменчивости . При поступлении в клетку ДНК, которая лишь частично гомологична ДНК клетки, вероятна ее интеграция в геном с помощью гомологичной рекомбинации. На страже точности этого процесса стоит система корекции неспаренных оснований с длинным ресентезируемым участком (ДКНО), которая прерывает рекомбинацию, если гомология взаимодействующих молекул ДНК излишне несовершенна. Более того, ДКНО ликвидирует большинство рекомбинационных застроек на уровне онДНК, если они нарушают комплементарность спаривания нуклеотидов. Тем самым ДКНО снижает частоту рекомбинационных обменов в ДНК. Так система ДКНО отстаивает стабильность генома и его видоспецифичность. Наследственные нарушения клеточных репаративных систем у человека приводят к тяжелым врожденным аномалиям и/или предрасположенности к развитию раковых заболеваний.
Большой интерес представляют данные о возрастных изменениях репарации различных типов повреждений ДНК . В исследованиях Газиева и соавт. [ Газиев ea 1981 ] было обнаружено, что в клетках старых (18-22 мес.) мышей линии А/Не и СЗН/Sn уровень не ингибированного оксимочевиной синтеза (репаративный синтез) в 2 раза ниже, чем у молодых (1-5-2 мес.). При у-облучении мышей разного возраста репаративный синтез увеличивается в 2-3 раза по сравнению с контролем. Авторы установили, что дело не в снижении активности ферментов репарации ДНК, поврежденной радиацией, а в степени доступности для ферментов этих повреждений ДНК в составе хроматина клеток. Об этом же свидетельствует и возрастное снижение релаксируемости нуклеоида ядер печени мышей при сравнении молодых и старых уф-облученных животных [ Газиев ea 1981 ].
Было показано, что радиационная повреждаемость ДНК стволовых клеток кишечного эпителия мышей разных линий и возраста примерно одинакова, однако скорость репарации этих повреждений с возрастом снижается. Способность диплоидных фибробластов человека к репарации индуцированных уф-излучением однонитевых разрывов ДНК достоверно снижается с увеличением возраста донора (см. [ Anisimov ea 1987 ]). В ряде работ оценивалось влияние возраста донора на интенсивность внепланового синтеза ДНК в клетках человека, подвергнутых in vitro УФ-облучению. Лэмберт и соавт. [ Lambert ea 1979 ] нашли отрицательную корреляцию между возрастом и величиной внепланового синтеза ДНК в лейкоцитах периферической крови 58 здоровых субъектов 13- 94 лет. Авторы отметили сильные индивидуальные колебания этой величины. Было обнаружено также ослабление индуцированного УФ-светом репаративного синтеза в лимфоцитах человека с возрастом и в глубокой старости.
При старении может изменяться не только структура генов, но и направление их функционирования. С возрастом в соматических клетках накапливаются не только мутации, но и хромосомные перестройки [ Vijg ea 1990 ]. Полагают, что изменения хроматина могут играть главную роль в связанных с возрастом изменениях регуляции экспрессии генов [ Medvedev ea 1984 ]. С увеличением возраста не отмечено изменений стехиометрии большинства гистонов, однако имеются сообщения об изменениях строения подвида гистона HI [ Medvedev ea 1984 ]. Ацетилирование гистонов , которое, предположительно, изменяет взаимодействие гистон-ДНК и делает ДНК более доступной для разного рода воздействий, снижается по мере старения на 30-70%.
Большинство повреждений ДНК репарируется, но не все. Так, у крыс происходит 105 окислительных повреждений ДНК в день в расчете на клетку. Когда скорость репарации не достигает скорости индукции повреждений, отмечается увеличение спонтанных повреждений ДНК с возрастом [ Vijg ea 1990 ]. Точная оценка способности организма восстанавливать специфические повреждения затруднена и часто бывает ошибочной. В большинстве исследований возможного снижения репаративной активности ДНК с возрастом были использованы способы, с помощью которых оценивается фаза синтеза ДНК при эксцизионной репарации. Главный вывод из этих работ, полученный преимущественно на культуре клеток, состоит в том, что эффективность репаративных систем ДНК не снижается с возрастом [ Likhachev ea 1990 ]. Однако нельзя исключить, что при старении репарационные системы ДНК становятся более подверженными ошибкам, приводящим к усилению индукции мутаций [ Anisimov ea 1993 , Vijg ea 1990 ]. В любом случае определенная степень несовершенства является главной чертой системы репарации ДНК, на что указывало как фактическое накопление повреждений ДНК, так и изменение последовательности ДНК.
(подробнее в учебнике стр 168)
Мобильные генетические элементы (МГЭ, подвижные элементы, транспозируемые элементы, транспозоны и т.д.) повсеместно распространены в живой природе от плазмид, фагов и бактерий до высших животных и растений (Хесин, 19S4; Berg, Howe, 1989). Будучи нестабильными по своей локализации в геномах, они создают мощный источник изменчивости генов, систем их управления и геномов (Lambert et al., 1988). Будучи сами последовательностями нуклеотидов, они тоже подвержены эволюции. Поэтому МГЭ выступают и как факторы эволюции содержащих их геномов, и как эволюционирущие объекты.
В настоящее время МГЭ найдены у бактерий (включая их фагов и плазмид), низших грибов, насекомых, растений, животных и многих других объектов (Хесин, 1984; Berg, Howe,1989). Число известных семейств МГЭ, вероятно превышает 100. У хорошо изученных объектов найдены многие десятки семейств МГЭ: например у дрозофилы их число, вероятно, достигает 50 (Berg, Howe, 1989; Charlesworth, Langley, 1989). Некоторые семейства относятся к умеренным повторам, имея десятки-сотни копий на геном, другие - к повторам высокой множественности (Alu у человека - 5—6 млн копий на геном (Fa-Ten-Kao, I985)). В сумме МГЭ различных семейств могут составлять значительную часть генома (до 10% у дрозофилы (Finnegan, 1985; Ананьев, 1989)). МГЭ нестабильны, т.е. с определенной вероятностью способны к транспозициям и исключению из отдельных позиций генома (табл.1).
МГЭ способны к воспроизведению в клетке либо через репликацию ДНК, либо через прямую и обратную транскрипцию (ретротранспозоны).
В случаях, когда МГЭ не содержит генов, выполняющих клеточных функции, их часто считают "эгоистическими ДНК". Транспозиции обычно связаны с размножением копий МГЭ. В своей структуре МГЭ содержат гены транспозиции (ферментов-транспозаз - Тп-3, Тп-5 (Хесин, 1984)) и др., ревертаз - ретропозоны (Ананьев, 1989). Поэтому фактически они являются отдельными репликонами. В некоторых случаях синтез транспозазы репрессируется при избыточной ее концентрации по механизму отрицательной обратной связи (Тп-3 (Хесин, 1984), Р-фактор дрозофилы (Engels, 1989)).
МГЭ содержат также разнообразные функциональные сайты - знаки пунктуации и управления (промоторы, терминаторы, операторы, репликаторы, энхансеры, регуляторные сайты теплового шока (Хесин, 1984; Шахмурадов и др., 1986; Капитонов и др., 1987)), которые существенны для окружающих участков генома.
Инсерции МГЭ в кодирующие зоны генов приводят к нарушению или резкому изменению их функций. Это связано с прямым нарушением генов и с влиянием знаков пунктуации (промоторов, терминаторов и др.,) на процессы считывания. Доля таких мутаций особенно велика у прокариот, которые имеют высокую плотность кодирования информации в геноме (Ратнер, 1985). Инсерции МГЭ в некодирующие области (спейсеры, интроны, фланговые участки др.) приводят к более "мягким" последствиям: усилению или ослаблению активности близлежащих генов, изменению их регуляции и т.п. Такие последствия преобладают у высших эукариот, у которых кодирующая часть генома составляет ~3-5%. Показано также, что среди видимых мутаций у дрозофилы и других объектов наиболее значительную долю составляют не замены нуклеотидов, а именно инсерции МГЭ (Rubin, 1983; Sankaranarayanan, 1988; McDonald, 1989) (табл. 2).
Мобильные генетические элементы (МГЭ, MGE, Mobile genetic elements) — это последовательности ДНК, которые могут перемещаться внутри генома.
В состав МГЭ входят:
Согласно определению, мобильные генетические элементы ( МГЭ ) эукариот представляют сегменты ДНК, которые могут изменять свое местоположение в пределах генома. МГЭ распространены повсеместно и составляют существенную часть геномной ДНК многих изученных организмов. Так, геном кукурузы на 50 % состоит из транспозонов, а в геноме человека, при их общем уровне содержания 30 % насчитывается свыше 4 млн. отдельных копий [9]. Перемещаясь случайным образом, мобильные генетические элементы существенно влияют на структуру генетического материала хозяина и имеют фундаментальное значение в формировании генетической изменчивости. Считают, что транспозиционная активность МГЭ вызывает до 80 % спонтанных мутаций и является основной причиной их возникновения [5]. Однако МГЭ могут выполнять и ряд полезных функций в геноме хозяйской клетки. Унаследованные эукариотами от прокариотических эубактерий, МГЭ прошли с ними долгий путь эволюции и стали незаменимыми при выполнении таких функций как V(D)J рекомбинация в клетках иммунной системы млекопитающих, поддержание теломер у дрозофилы и процесс репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей [9]. В клетке, в свою очередь, возникли приспособления, направленные на генетический контроль процесса транспозиции и снижение вредных последствий от незапланированных перемещений МГЭ , наиболее значимым и глобальным из которых можно считать механизм метилирования ДНК [13].
В нормальных условиях уровень перемещений отдельных копи МГЭ незначителен и в среднем составляет 10–4-10–5 на геном за поколение, но в определенных условиях скорость транспозиций мобильных элементов может увеличиваться на несколько порядков, что ведет к индуцированному усилению их воздействия на геном хозяина. Причины возрастания уровня транспозиций могут обусловливаться или генетическими механизмами, как в случае гибридного дисгенеза у Drosophila melanogaster, или действием неблагоприятных (мутагенных) внешних факторов. В настоящее время накоплен большой фактический материал, показывающий, что ионизирующее излучение вызывает повышение транспозиционной активности МГЭ и увеличение количества их копий в геноме разных организмов [6]. С учетом современных представлений о структурно-функциональных отношениях МГЭ с геномом хозяина это позволяет предположить важную роль индуцированной активности мобильных элементов в формировании генетических реакций на действие ионизирующей радиации [3].
Немаловажным является тот факт, что транспозоны, являясь высоко интегрированными генетическими элементами, используют для своей активации механизмы генерализованной реакции клетки на неблагоприятные факторы. Транспозиционная активация различных групп МГЭ может происходить как по механизму транскрипционной активации, так и в ответ на индукцию одно- и двунитевых разрывов ДНК. Показано, что при радиоиндуцированной активации МГЭ дрозофилы из группы ретротранспозонов участвуют транскрипционные факторы теплового шока и NF-kB [1, 8]. Активация ретротранспозонов с помощью этих факторов может быть обусловлена присутствием в их структуре последовательностей ДНК, гомологичных консенсусным последовательностям промоторов генов теплового шока и генов раннего ответа [1, 8]. Еще одним механизмом, ответственным за изменение активности МГЭ , является метилирование ДНК. Как показано на растениях и млекопитающих, неблагоприятные условия (холодовой стресс) ведут к деметилированию ДНК и повышению активности МГЭ [7, 12]. Таким образом, МГЭ используют для собственной активации такие механизмы контроля генной экспрессии, как транскрипционные факторы и метилирование ДНК, а также восприимчивы к разрывам ДНК.
Возможно, что при перемещении некоторые МГЭ выполняют функцию модификаторов генетической экспрессии количественных и адаптивных признаков [2]. Многочисленными экспериментами на дрозофиле показана корреляция ряда количественных признаков с изменением сайтов локализации МГЭ . Известны случаи, когда отбор на снижение адаптивных признаков приводил к изменению сайтов локализации МГЭ , а отбор на повышение уровня приспособленности вел к предпочтительному встраиванию мобильных элементов в места прежней локализации [2]. В таком случае возникает предположение о возможной роли МГЭ в процессах генотипической адаптации к действию ионизирующих излучений. На лабораторных популяциях D. melanogaster, имеющих длительную историю содержания в условиях повышенного радиационного фона, показано ступенчатое снижение радиочувствительности при ступенчатом повышении уровня облучения [11]. Было установлено, что чувствительность к радиации контролируется тремя дискретными генетическими факторами, поведение одного из которых напоминает перемещение мобильного элемента [11]. Данные, свидетельствующие об изменении транспозиционной активности МГЭ , получены также при исследовании показателей синдрома гибридного дисгенеза у хронически облучаемых лабораторных линий дрозофилы с различиями по содержанию МГЭ в геноме [4].
Способность МГЭ активироваться при действии широкого спектра неблагоприятных факторов вследствие нарушения генетического гомеостаза, по-видимому, определяется регуляторными свойствами самих элементов. Наличие сложного механизма регуляции транспозиций позволяет мобильным генетическим элементам использовать для активации множество различных внутриклеточных сигналов.
Можно выделить несколько наиболее значимых последствий активации мобильных генетических элементов в ответ на облучение. К ним, прежде всего, относится многократное увеличение количества повреждений ДНК. В то время, как непосредственное повреждение ДНК немедленно репарируется или фиксируется в качестве стабильной мутации , мобильные элементы формируют циклы инсерций и эксцизий долгое время после активации, что может быть причиной возникновения генетической нестабильности. На фоне генетической нестабильности, в свою очередь, могут проявляться такие радиобиологические реакции, как гормезис, адаптивный ответ или радиационно-индуцированное старение [3]. Кроме того, при встраивании в определенные сайты, МГЭ изменяют экспрессию широкого спектра количественных признаков, что может обусловливать изменение приспособительных характеристик облученных популяций [2, 11]. Также одним из последствий транспозиций является возникновение генетических перестроек, таких как транслокации, инверсии, крупные инсерции и делеции, имеющих большое эволюционное значение [10]. И, наконец, мобильные элементы выполняют в геноме ряд жизненно-важных для хозяина функций, в том числе репарацию двунитевых разрывов ДНК у дрожжей и восстановление поврежденных концов хромосом у дрозофилы [9]. Можно ожидать, что при действии облучения будет происходить изменение этих функций.
Другим аспектом рассматриваемой проблемы является возможная роль мобильных генетических элементов в формировании радиационно-индуцированных реакций в диапазоне малых доз облучения как специфических факторов индукции генетической нестабильности [3]. Увеличение уровня транспозиций в ответ на неблагоприятное воздействие имеет линейный характер зависимости от дозы [1], что позволяет предположить дозо-зависимое влияние мобильных элементов на функциональное состояние генома. В то время, как в диапазоне больших доз облучения транспозиции вызывают множественные повреждения генетического материала и гибель клеток, в диапазоне малых доз активация МГЭ может играть роль триггерного механизма, который запускает сразу несколько процессов и обеспечивает поливариантную реакцию живой клетки в ответ на действие неблагоприятного фактора [3].
Таким образом, в клетке существуют механизмы поддержания динамического равновесия между уровнем спонтанной активности мобильных генетических элементов, приводящей к нарушениям структуры генома, и генетически-контролируемыми перемещениями, имеющими важные генетические функции. Радиационно-индуцированное нарушение этих механизмов может иметь самые серьезные последствия как на молекулярно-генетическом, так и на организменном уровне.