Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Методическое указание к лабораторной работе № 1-3
по дисциплине Пищевая микробиология
для студентов 2 курса 260800
Технология продуктов общественного питания
Уфа 2012
Лабораторная работа № 1
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ
В учебных заведениях не разрешается работать с живыми патогенными микроорганизмами. Необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора. Кроме того, работа с сапрофитными бактериями в ряде случаев требует абсолютной стерильности для получения надежных результатов опыта. В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры микроорганизмов. Культуру, содержащую микроорганизмы одного вида, называют чистой. Если в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она носит название смешанной.
Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней. Поверхность столов и пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом. В основном рабочем помещении находятся аппаратура, посуда и реактивы. Столы имеют подводку электроэнергии и снабжены газовыми горелками. Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, бокс, моечную, холодильную комнату, термостаты или термостатированные комнаты для выращивания микроорганизмов, помещение для хранения культур и т.д.
Подготовка микробиологической лаборатории к работе
Для того чтобы снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях, в лабораторных помещениях применяют различные способы дезинфекции. Слово «дезинфекция» означает обеззараживание, то есть уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды.
Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ, в качестве которых чаще всего используют 2 - 3%-ный раствор соды (бикарбоната натрия), 3 - 5%-ный раствор фенола (карболовой кислоты) или лизола (препарат фенола с добавлением зеленого мыла), 0,5 - 3%-ный водный раствор хлорамина и некоторые другие дезинфектанты.
Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30-60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха - облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Ультрафиолетовые лучи обладают слабой проникающей способностью, поэтому в зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 мин до нескольких часов. Необходимо иметь в виду, что ультрафиолетовые лучи могут вызвать тяжелые поражения глаз. Поэтому при работе с бактерицидными лампами нужно строго следить за тем, чтобы ни прямые, ни отраженные ультрафиолетовые лучи не попадали в глаза. В небольших помещениях при включенной бактерицидной лампе находиться нельзя.
Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%-ные (по объему) растворы изопропилового или этилового спиртов. В лаборатории не разрешается курить, хранить и употреблять еду, напитки, жевательную резинку. Работать следует в халатах.
Правила работы с культурами микроорганизмов
В лаборатории микроорганизмы выращивают в питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрацы и чашки Петри. Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Перед посевом следует тщательно надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают маркером на стекле или на наклеенной этикетке. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, когда пересевают культуры микроорганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, пользуются стерильной пипеткой. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, например 3 - 5%-ный водный раствор фенола или 2%-ный раствор хлорамина, не касаясь ею окружающих предметов.
Все манипуляции при посеве следует проводить около пламени горелки (но не в пламени). Нельзя делать резкие движения и ходить около лица, работающего с чистой культурой, так как движение воздуха увеличивает вероятность случайного ее загрязнения.
2. Методы стерилизации питательных сред и посуды
Стерилизация является одним из важнейших и необходимых прие-мов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов. Различают термическую и холодную стерилизацию. Способы термической стерилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Методы холодной стерилизации: стерилизация фильтрованием, газообразными средствами, ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений.
Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяется в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.
Стерилизация питательных сред насыщенным паром под давле-
нием (автоклавирование)
Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспе-
чивает особую эффективность данного способа (табл. 1).
Таблица 1 Температура насыщенного пара при разных давлениях
|
Давление |
Температура, °С |
|
|
нормальное, атм |
кПа |
|
|
1,0 |
101,32 |
100 |
|
1,5 |
151,98 |
111 |
|
2,0 |
202,65 |
121 |
|
2,5 |
251,20 |
128 |
|
3,0 |
299,75 |
134 |
При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121 °С. Стерилизацию текучим паром под давлением осуществляют в автоклавах. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление, в который помещают стерилизуемый материал на специальную подставку. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. По окончании времени стерилизации автоклав открывают, когда давление в нем сравняется с атмосферным. Преждевременное открывание крана автоклава недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала.
К работе с автоклавом допускаются только подготовленные лица!
Подготовка сред к стерилизации. При автоклавировании 3 - 5 % жидкости теряются в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию. Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками с бумажными колпачками. Стеклянные, резиновые, корковые и другие пробки завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой.
Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111-138 °С, т.е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; а выше 138 0С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 атм.Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются, прежде всего, их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 1 5 - 3 0 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поэтому их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 °С в течение 2 или 1 ч при 170 °С. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см. После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2 - 3 сут в термостате при 30 0С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.
Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация
Она применяется для сред, портящихся под действием температур выше 100 °С. Тиндализацию осуществляют текучим паром а автоклаве с незавинченной крышкой. Среды прогревают несколько раз по 10 - 15 мин. Между прогреваниями среды ставят в термостат при температуре 3 0°С н а 8 - 1 2 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100 °С, прогревают более осторожно при 60 - 80°С через каждые 8 - 1 2 ч 4 - 5 дней подряд.
Однократный прогрев материала при температуре ниже 100°С известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности. Пастеризацию проводят при 60-80°С 10 - 30 мин. Этот процесс используют в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина, пива и др.
Стерилизация стеклянной посуды. Основным способом стерилизации стеклянной посуды является обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не выше 180 ° в течение 1 - 3 ч (табл. 2). При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухожаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных для стерилизации и обеспечивающих автоматическое поддержание необходимой температуры.
Таблица 2
Время, необходимое для стерилизации стеклянной посуды сухим жаром
|
Температура, °С |
Время, мин |
|
140 |
180 |
|
150 |
150 |
|
160 |
120 |
|
170 |
60 |
Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. После этого ее загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный надежный прогрев стерилизуемого материала. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80 °С, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться.
Стерилизация инструментов и приборов. Мелкие металлические инструменты - петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели - стерилизуют прокаливанием в пламени (т.е. нагреванием докрасна) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при посевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.
Стерилизация облучением В микробиологической практике используют ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см.
УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ.
Цель работы: Изучить устройство светового биологического микроскопа и освоить правила работы с ним. Ознакомиться с различными видами микроскопии. Приобрести навыки по приготовлению фиксированных препаратов дрожжей.
Оборудование, материалы: Микроскоп; бактериологические петли; предметные стекла; спиртовка; иммерсионное масло; фильтровальная бумага; промывалка; дрожжи Sascharomyces, 96 %-ный этиловый спирт.
2.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2.1.1 Устройство микроскопа и правила работы с ним
Микроскоп (от греч. micros – малый и scopio – смотрю) – это оптический прибор, состоящий из трех основных частей: механической, оптической и осветительной.
Устройство микроскопа
Схема светового биологического микроскопа представлена на рис. 1.
Механическая часть или штатив состоит из ножки, основания, тубусодержателя, предметного столика, монокулярной насадки (тубуса), револьверного устройства, рукоятки грубой фокусировки (макрометрического винта), рукоятки тонкой фокусировки (микрометрического винта).
Тубус – зрительная труба микроскопа. В верхнее отверстие тубуса свободно вставляется окуляр, на нижнем конце тубуса находится вращающееся вокруг своей оси револьверное устройство (револьвер), в которое ввинчиваются объективы. Вращая револьвер, можно быстро сменить объективы во время работы с микроскопом, подводя любой объектив под тубус. Объектив должен быть центрирован, т.е. установлен на оптическую ось микроскопа. Для этого револьвер поворачивают вокруг своей оси до появления щелчка.
Предметный столик служит для размещения на нем изучаемого препарата. Препарат закрепляют на столике зажимами (клеммами). В центре предметного столика находится отверстие для прохождения лучей света и освещения препарата. В некоторых конструкциях микроскопа предметный столик может передвигаться с помощью винтов, расположенных по периферии предметного столика. Это дает возможность рассмотреть препарат в различных полях зрения.
Рукоятки грубой и тонкой фокусировки (макро- и микровинты) служат для перемещения тубуса вверх и вниз, что позволяет установить его на необходимом расстоянии от препарата. При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается, а при вращении против часовой стрелки – поднимается. При вращении макрометрического винта объектив ориентировочно устанавливается на фокус, т.е. на то расстояние от препарата, при котором он делается видимым. Оборот макровинта позволяет переместить тубус на 20 мм. Микрометрический винт служит для точной установки на фокус. Полный оборот его перемещает тубус на 0,1 мм. С микровинтом следует обращаться очень осторожно: допустимо вращение микровинта не более чем на 180 0С в ту или иную сторону.
Оптическая часть является наиболее ценной частью микроскопа. Она состоит из объективов и окуляра.
Окуляр (от лат. oculus – глаз) состоит их двух плосковыпуклых линз, заключенных в общую металлическую оправу. Верхняя линза – глазная (увеличивающая), нижняя – собирающая. Расстояние между линзами равно полусумме их фокусного расстояния. У окуляров с большим увеличением
|
1 – окуляр 2 – монокулярная насадка (тубус) 3 – револьверное устройство 4 - объектив 5 – предметный столик 6 - конденсор 7 – корпус коллекторной линзы 8 – патрон с лампой 9 - шарнир 10 –рукоятка перемещения кронштейна конденсора 11– рукоятка тонкой фокусировки (микрометрический винт) 12 – рукоятка грубой фокусировки (макрометрический винт) 13 - тубусодержатель 14 – винт для крепления насадки |
Рис. 1 Схема устройства светового биологического микроскопа
фокус короче, поэтому меньше и длина окуляра. Между линзами имеется диафрагма, ограничивающая поле зрения и задерживающая краевые лучи света. Отечественные микроскопы снабжены тремя сменными окулярами, увеличение которых указано на корпусе окуляра (х7; х10; х15).
Объективы ввинчиваются в гнезда револьверного устройства и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя (фронтальная) линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе только исправляют недостатки полученного изображения (явления сферической и хроматической аберрации) и называются коррекционными.
В гнезда револьверного устройства ввинчиваются четыре объектива, увеличение которых указано на корпусе объектива (х8; х20; х40; х90 или 100). Каждый объектив характеризуется своим фокусным расстоянием (расстоянием между предметным стеклом и фронтальной линзой): объектив х8 имеет фокусное расстояние около 9 мм, объектив х40 – 0,65 мм, объектив х90 – 0,15 мм.
Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные.
При работе с сухими объективами (х8, х20, х40) между фронтальной линзой и препаратом находится воздух. В этом случае лучи света проходят среды с различными показателями преломления (покровное стекло, воздух), часть их отклоняется и не попадает в объектив.
При работе с иммерсионными объективами (х90 или х100) для устранения светорассеяния расстояние между фронтальной линзой объектива и препаратом заполняют иммерсионным (кедровым) маслом, показатель преломления лучей света которого близок к показателю преломления лучей света, проходящего через стекло.
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, если в работе используют окуляр х15, а под тубусом находится объектив х90, то увеличение рассматриваемого с помощью микроскопа объекта составит х1350.
Осветительная часть микроскопа состоит из двухлинзового конденсора, ирис-диафрагмы и патрона с низковольтной лампочкой накаливания, питающейся через понижающий трансформатор от сети напряжения 120…220 В.
Конденсор служит для лучшего освещения препарата. Он собирает световые лучи в пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат. С помощью рукоятки для перемещения кронштейна конденсора его можно перемещать вверх и вниз, благодаря чему меняется угол сходимости лучей и, следовательно, степень освещения объекта. Чем выше положение конденсора, тем лучше освещен препарат.
Ирис-диафрагма располагается под конденсором и служит для регулировки потока света, поступающего в конденсор. Она состоит из металлических серповидных пластинок. Расширить или сузить отверстие диафрагмы можно с помощью специального рычажка. При вращении его по часовой стрелке отверстие ирис-диафрагмы увеличивается и, следовательно, увеличивается степень освещения объекта.
При работе с иммерсионными объективами степень освещения препарата должна быть максимальной, поэтому шторку ирис-диафрагмы открывают, а конденсор поднимают в крайнее верхнее положение.
При работе с сухими объективами, как правило, рассматривают неокрашенные объекты. Для достижения контрастности конденсор опускают вниз, а отверстие ирис-диафрагмы уменьшают.
Правила работы с микроскопом
Отбор проб чистых культур бактерий и дрожжей, которые вырастают на поверхности плотной среды в виде мазеобразного налета или в жидкой среде ведут в следующей последовательности:
Зажигают спиртовку.
Пробирку с культурой помещают в левую руку между большим и указательным пальцами в наклонном положении. Поверхность с налетом микроорганизмов должна быть обращена вверх и хорошо видна.
Петлю держат вертикально в пламени горелки и прокаливают докрасна, затем наклоняют и обжигают примыкающую к ней часть петледержателя.
Мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают к ладони наружную часть ватной пробки, вынимают ее из пробирки и держа в таком положении, не касаясь окружающих предметов.
Края открытой пробки обжигают в пламени горелки.
Осторожно вводят стерильную петлю в пробирку с культурой и охлаждают ее о стенки пробирки или прикоснувшись к питательной среде, свободной от микроорганизмов. Немного отстранив пробирку с культурой от пламени горелки, легким движением осторожно отбирают небольшое количество микробной массы с поверхности среды или каплю жидкости с клетками. Вынимая петлю из пробирки, следят за тем, чтобы отобранный материал не касался стенок и петля не оказалась над пламенем горелки.
Снова обжигают в пламени горелки край пробирки, затем, легким круговым движением, обжигают ватно-марлевую пробку и закрывают пробирку.
Пробирку с культурой ставят в штатив, а извлеченный материал используют для приготовления препарата.
Клетки микроорганизмов, оставшиеся не петле, сжигают в пламени горелки.
Отбор чистых культур микроскопических грибов ведут с использованием препаровальной иглы в той же последовательности, что и отбор одноклеточных организмов. Из пробирки отбирают кусочек мицелия, слегка погружая иглу в питательную среду таким образом, чтобы не нарушить структуру мицелия.
Фиксированными считают клетки микроорганизмов, в которых прерваны жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура.
Для получения фиксированных препаратов важно правильно подготовить предметные стекла. Они должны быть чистыми и тщательно обезжиренными. Для этого стекла, бывшие в употреблении, выдерживают 1-2 часа в хромовой смеси (в 1 л воды вносят 50 г бихромата калия и 100 г технической серной кислоты), после чего ополаскивают теплой водой и спиртом. Можно также кипятить стекла в течение 15 мин. в растворе соды или мыльной воды. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые, медленно высыхающие пузырьки. Берут стекла пинцетом или аккуратно за грани, так как пальцы оставляют на поверхности жирные пятна.
Приготовление фиксированных препаратов ведут в следующей последовательности:
На середину чистого обезжиренного предметного стекла стерильной петлей наносят небольшую каплю воды. В нее вносят исследуемый материал, отобранный по методике, описанной в разделе 2.2.1. Полученную суспензию равномерно распределяют по поверхности стекла тонким слоем таким образом, чтобы препарат распределился на площади примерно 2…3 см2.
Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе.
Производят фиксацию мазка. Для этого стекло с высохшим мазком проводят 3-4 раза над пламенем горелки той стороной, где мазок отсутствует. Цель фиксации:
умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными (что особенно важно при работе с патогенными микроорганизмами);
зафиксировать (закрепить) мазок на стекле (чтобы они не смывались при окрашивании);
улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки лучше адсорбируют на своей поверхности различные красители.
Приготовление фиксированных препаратов из естественных мест обитания микроорганизмов проводится так же, как и из чистых культур.
Помимо термической обработки, применяют также фиксацию химическими веществами: погружают предметное стекло с мазком в мензурку с 96 %-ным этанолом на 15-20 мин, с ацетоном на 5 мин, со смесью 96 % -ного этанола и 40%-ного формалина (соотношение 95:5) на 2 мин. и др.
простыми методами
Фиксированные препараты нельзя рассмотреть под микроскопом, так как они являются бесцветными и пропускают световые лучи. Поэтому их окрашивают, используя простые или сложные методы.
При окрашивании фиксированных мазков простыми методами используют один краситель (фуксин, краска Муромцева, генцианвиолет, метиленовая синь и др.).
Последовательность окрашивания мазка простыми методами следующая:
На фиксированный препарат наносят несколько капель красителя таким образом, чтобы он покрывал всю поверхность мазка и выдерживают в течение определенного времени. Так, при окраске фуксином на мазок наносят несколько капель красителя и выдерживают его на мазке 2…3 мин. При окрашивании препарата из кефира на него краску Муромцева наносят на мазок через полоску фильтровальной бумаги на 3…5 мин.
Краску смывают с мазка слабой струей до бесцветной смывной воды. При этом стекло держат в наклонном положении над лотком.
Мазок подсушивают фильтровальной бумагой, которую осторожно прикладывают к стеклу, и досушивают на воздухе.
На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100.
На 1 объем жидких дрожжей взять 3-5 объемов воды. Смесь энергично взболтать и оставить на 1 мин.
Из верхнего слоя дрожжевой жидкости стеклянной палочкой перенести небольшую каплю на предметное стекло. Накрыть покровным стеклом и слегка прижать его сухим концом стеклянной палочки для удаления пузырьков воздуха. Препараты рассмотреть под микроскопом при увеличении в 500—1000 раз (объективы Х40 и Х90).
4.Написать отчет о проделанной работе.
Микроскопирование препаратов дрожжей позволяет следить за их состоянием и размножением. Молодые и зрелые дрожжи крупнее состарившихся. Оболочка у них едва заметна, вакуоли отсутствуют или очень малы. Они имеют большое количество почкующихся клеток. О старении культуры дрожжей можно судить по следующим признакам: их оболочка имеет вид утолщенного ободка, строение цитоплазмы зернистое, присутствуют капельки жира.
Оформление и анализ результатов исследований
В отчете студенты должны кратко законспектировать теоретических материал. Наблюдаемые под микроскопом картины нужно зарисовать. Под рисунками необходимо указать увеличение и подписать название изучаемого объекта.
Контрольные вопросы
Каково устройство биологического микроскопа?
Из каких частей и механизмов состоит механическая часть микроскопа?
Назовите основные характеристики микроскопа.
Что понимают под разрешающей способностью микроскопа? Как она определяется?
Что составляет оптическую систему микроскопа?
Объективы бывают сухие и иммерсионные. Что это значит?
Как определяется общее увеличение микроскопа?
Что входит в состав осветительной системы микроскопа?
Как следует настроить осветительную систему при работе с иммерсионным объективом?
Какие существуют правила работы с микроскопом?
Какие особенности устройства и принципы работы темнопольного, фазово-контрастного, люминесцентного и электронного микроскопов?
Чем определяется четкость получаемого изображения?
Перечислить основные правила работы с микроскопом.
Как проводится отбор проб чистой культуры микроорганизма?
Перечислите основные этапы приготовления фиксированного окрашенного препарата.
Лабораторная работа 2
МЕТОДЫ АНАЛИЗА МИКРОФЛОРЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Определение числа клеток микроорганизмов высевом
на питательные среды
В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут или растут крайне медленно. Это важно помнить при анализе таких естественных субстратов, как почва, вода и т.п.
Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенного методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных единицах - так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ). Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
Приготовление разведений. Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl (физрастворе). В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.
Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды - это 1-е разведение, 10-1.
Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку, получают 2-е разведение (10-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции. Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.
Посев. Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом. Перед посевом поверхностным способом (рис. 4) разливают расплавленную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушивать для удаления конденсационной воды. Среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2-3 суток крышками вниз.
После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2-4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило 0,1; 0,5 или 1,0 мл) исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до (48-50)°С агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующих образом.
Рис 4. Схема приготовления разведений и рассева суспензии
микроорганизмов шпателем
По 1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2-4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15-20 мл расплавленной и остуженной до (48-50)°С плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет, чашки Петри в перевернутом виде помещают в термостат.
Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего рассмотрения колонии микроорганизмов диагностические среды рекомендуется осветлять.
Подсчет выросших колоний. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2-15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую посчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.
Лучшим разведением следует считать, когда при высеве в чашке Петри вырастает от 30-50 до 100-150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросшее при высеве из разведения на одной чашке. Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
, (1)
где М - количество клеток в 1 мл; а - среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V — объем суспензии, взятый для посева, в мл; 10n — коэффициент разведений.
Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений). Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений исследуемого субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата.
Таким образом, определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата. Разведения исходной суспензии готовят, как и для чашечного метода.
Посев и регистрация результатов. Стерильную среду предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4-5 последних, причем каждое разведение высевают в 3-5 повторностях (параллельных пробирках). Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют.
3.1 Качественно-количественный учет микрофлоры почвы
Цель работы. Освоить метод посева проб почвы на питательные среды, метод определения количества микроорганизмов в почве и выделения чистых культур бактерий из проб почвы.
Материалы и оборудование. Весы, ступка, резиновые перчатки,
колба со стерильной дистиллированной водой, пипетки на 10 мл и 1 мл, стерильные пробирки, колба вместимостью 250 мл, чашки Петри с МПА.
Ход выполнения работы
1. Приготовьте суспензию почвы. Для этого отвесьте 10 г почвы и перенесите навеску в стерильную ступку, добавьте 2 - 3 мл стерильной воды и разотрите до пастообразного состояния.
2. Полученную пробу почвы (10 г) перенесите в стерильную колбу,
содержащую 90 мл стерильной воды, размешайте в течение 5 мин и дайте отстояться 30 мин. Это первое разведение исследуемой пробы почвы.
3. Приготовьте ряд последующих 10-кратных разведений этой пробы в пробирках в зависимости от предполагаемой численности микроорганизмов в пробе. Для приготовления каждого последующего разведения используйте новую пипетку.
4. Полученные разведения в объеме 0,1 мл посейте (на каждое разведение по 2 - 3 чашки):
на МПА для определения общего числа бактерий;
5. Равномерно распределите каплю инокулята на поверхности агара,
покачивая чашку, и оставьте на 30 мин для адсорбции при комнатной температуре.
6. Засеянные чашки Петри через 30 минут переверните вверх дном и
поместите в термостат при температуре 28 - 37 °С для выращивания мезофильной микрофлоры. Количество бактерий на МПА учитывайте через 1 - 5 сут.
7. Учитывайте количество колоний следующим образом: дно чашки
Петри маркером разделите на равные секторы, учтенные колонии отмечайте точками на стекле. Подсчитайте среднее число колоний на чашке.
Результаты работы внесите в табл. 1.
Таблица 1
Качественно-количественный учет микрофлоры почвы
|
Номер пробы |
Общее число бактерий |
|
1 |
|
|
2 |
3.2 Количественный учет бактерий в пробах воды.
Определение титра и индекса кишечной палочки.
Цель работы. Освоить методы отбора проб воды, их посева и определения бактериальной загрязненности воды.
Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, бак-
териологические петли, спиртовка, стерильные чашки Петри с МПА и сре-
дой Эндо, исследуемые пробы воды, столик для окрашивания препаратов,
промывалка с водой, красители для окраски по Грамму; термостат с температурой 37 °С.
Ход выполнения работы:
Микробиологическое исследование воды
Отбор проб
1. Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем.
2. Отберите пробы воды в стерильные флаконы: а) пробу водопроводной воды; б) пробу из отрытого водоема (ручей, ключ, пруд). До начала занятия (посева) пробы можно хранить не более 3 ч при температуре не выше 4 °С.
2. Приготовьте ряд последующих 10-кратных разведений отобранных проб в пробирках, в зависимости от предполагаемой численности микроорганизмов в пробе. Для приготовления каждого последующего разведения используйте новую пипетку.
3. Полученные разведения в объеме 0,1 мл посейте (на каждое разведение по 2 - 3 чашки):
а) на МПА для определения общего числа бактерий;
б) на среду Эндо для учета БГКП (бактерии группы кишечной палочки или энтеробактерии).
4. В чашки Петри с МПА и средой Эндо внесите по 0,1 мл последнего и предпоследнего разведений, равномерно распределите каплю инокулята на поверхности агара, покачивая чашку, и оставьте на 30 мин для адсорбции при комнатной температуре.
5. Засеянные чашки Петри через 30 мин переверните вверх дном и поместите в термостат при температуре 28 - 37 °С для выращивания мезофильной микрофлоры. Количество бактерий учитывайте через 1-2 сут.
8. Учитывайте количество колоний следующим образом: дно чашки
Петри маркером разделите на равные секторы, учтенные колонии отмечай
те точками на стекле. Для определения титра подсчитайте среднее число
колоний на чашке и умножьте на разведение.
9. Для подтверждения принадлежности к БГКП из колоний, выросших на среде Эндо, приготовьте фиксированные мазки, окрасьте их по Граму, промикроскопируйте. Грамотрицательные бактерии протестируйте по биохимическим свойствам с системой индикаторной бумажной (СИБ) для идентификации энтеробактерий.
10. Подсчитайте количество колоний кишечной палочки на 1 мл воды
по формуле (1).
11. Результаты запишите в табл. 11.
Таблица 11
Количественный учет бактерий в пробах воды
|
Номер пробы |
Общее число бактерий в 1 мл воды |
Коли-титр |
3.3 Определение бактериальной обсемененности воздуха
Цель работы. Освоить определение бактериальной обсемененности
воздуха методами оседания.
Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри с МПА, термостат с температурой 37 С.
Определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей.
Ход выполнения работы
1. Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см3 мясопептонного агара или среды для определения КМАФАнМ или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на развернутую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была открыта полностью.
2. Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 370С, а со средой Сабуро – в течение 2-3 суток при 250С.
3. Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроорганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха.
Формула Омелянского:
Х = а×100×5×100 / ST,
где а – число выросших в чашках колоний (среднее из двух);
S – площадь чашки Петри, см2;
Т – время экспозиции, мин;
100 – пересчет площади чашки на 100 см2;
5 – время экспозиции по Омелянскому, мин;
100 – пересчет на 1 м3 воздуха.
4. Полученные результаты запишите в табл. 3.
Таблица 3
Определение бактериальной обменности воздуха
|
Номер пробы |
Общее микробное число в воздухе |
СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ
МИКРООРГАНИЗМОВ РАЗНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП
Для объективности оценки качества и безопасности пищевых продуктов определяющее значение имеет выбор способа культивирования и эффективность идентификации производственной и посторонней микрофлоры.
При идентификации микроорганизмов учитывают:
морфолого-цитологические признаки. К ним относятся строение, форма и размеры клеток, их взаимное расположение, тинкториальные свойства (особенности при окрашивании различными красителями), способность к образованию спор и капсул, подвижность, наличие жгутиков, образование в клетках некоторых включений, особенности размножения;
физиолого-биохимические признаки. При изучении физиолого-биохимических признаков устанавливают отношение микроорганизмов к различным источникам углерода и азота, потребность в кислороде, температурные границы роста, солеустойчивость, чувствительность к антибиотикам, ферментативные тесты;
культуральные признаки. К таким признакам относятся особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
К настоящему времени разработано несколько способов культивирования микроорганизмов на средах: периодическое, непрерывное культивирование и культивирование иммобилизованных клеток.
Наиболее распространен способ периодического культивирования. При данном способе инокулят вносится в питательную среду, которая содержит заданное количество всех необходимых питательных веществ. При этом ни один из существенных компонентов питательной среды не поступает в систему в процессе культивирования, т.е. это закрытая система. Периодическое культивирование возможно как поверхностных культур (на поверхности твердой питательной среды), так и глубинных культур (в жидкой питательной среде). При внесении микроорганизмов в питательную среду их рост прекращается тогда, когда содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды достигает минимума или в среде накапливаются продукты метаболизма, ингибирующие рост микроорганизмов.
Второй способ культивирования микроорганизмов - рост в непрерывной культуре. Все компоненты питательной среды постоянно поступают в систему и выводятся из нее. Это открытая система осуществляется только в глубинной культуре, чаще всего аэрируемой.
Третий - культивирование иммобилизованных клеток. Клетки микроорганизмов прикрепляются (иммобилизуются) на каких-либо инертных носителях. Питательная среда постоянно поступает в систему и выводится из нее, т.е. это тоже открытая система.
Для выделения микроорганизмов определенных физиологических групп предложена техника так называемых «накопительных культур». Техника накопительных культур основана на использовании элективных методов культивирования, т.е. создания таких условий выращивания бактерий, которые будут максимально благоприятны для развития микроорганизмов определенной физиологической группы, а другие организмы в этих условиях развиваться не могут или их рост будет незначителен.
Подбирая определенный состав питательной среды и параметры культивирования инокулируют среду смесью, содержащей микроорганизмы, выдерживают некоторое время при оптимальной температуре, рН и аэрации, в результате чего получают обогащенную накопительную культуру. Последовательные пересевы на такую же элективную среду предотвращают рост сопутствующей микрофлоры. О получении накопительной культуры свидетельствуют помутнение среды, получение осадка, пленки, выделение газообразных веществ.
Для роста микроорганизмов существенное значение имеет не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы неодинаковы.
Активная кислотность среды. Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше растет при рН, близком к 7,0. В случае необходимости рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (HCl. H2SO4), щелочей (NaOH, KOH) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2CO3, NaHCO3).
Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки в больших количествах. Значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных анаэробов. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствии кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для некоторых из них кислород токсичен. Такие микроорганизмы называются облигатными анаэробами.
Температура. Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируют. У мезофиллов температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 370С, у термофилов он значительно выше - от 38 до 450С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5-100 С. Отклонения температуры культивирования от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов, поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах, где поддерживается постоянная температура.
Свет. Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов, однако естественное освещение для этих целей используется крайне редко, т.к. его трудно контролировать. Как правило, фототрофы выращивают в люминостатах.
Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в доступной для клетки форме, т.е. жидкой фазе. Доступность воды в субстрате для роста микроорганизмов выражают величиной активности воды:
(аw): аw=Р/Р0,
где Р – давление пара над раствором, мм рт.ст; Р0 – давление пара чистой водой при данной температуре, мм рт.ст.
Микроорганизмы могут расти на средах, где аw=0,99-0,61.
Рост культур на различных средах
Рост в жидких средах. При выращивании в жидких средах микроорганизмы вызывают их помутнение, образуют осадок, кольцо, «островки» пленки или цельную пленку. Рост в виде пленки характеризует способность клеток объединяться в мицелиальные структуры (дрожжи, плесени). Пленка может быть тонкой тусклой, иногда сморщенной и всползающей на стенки пробирки, или блестящей, влажной при длительном культивировании. У микроорганизмов, образующих истинный мицелий, формируется толстая прочная пленка, которая впоследствии может превращаться в слизистую массу.
Рост на агаризованных средах. Выращенные на агаризованных питательных средах культуры по консистенции могут быть пастообразными, маслянистыми, слизистыми, рыхлыми, крошащимися, тянущимися, волокнистыми, кожистыми. Цвет штриха зависит от образования некоторых пигментов, как внутриклеточных, так и выделяющихся в среду культивирования.
Метод культивирования на стекле. Расплавленный картофельно-глюкозный агар наливают в чашку Петри и в него, зажав пинцетом, опускают и быстро вынимают стерильные предметные стекла. Покрытые пленкой среды стекла помещают на стеклянную подставку в другой чашке Петри. Посевы делают тонкими штрихами: по три на каждой пластине параллельно короткой стороне стекла или по одному вдоль длинной стороны стекла. Стерильные покровные стекла накладывают на штрихи так, чтобы под ними не было пузырьков воздуха и чтобы часть штриха оставалась свободной. На дно чашки наливают стерильную воду, чтобы избежать пересыхания слоя среды на пластине. Через 6 суток инкубирования при 25оС нижнюю поверхность стекла очищают от среды и микроскопируют. Образование мицелия и псевдомицелия наблюдают в анаэробных (под покровным стеклом) и аэробных (вне стекла) условиях.
Метод пластинок Далмау (в модификации Уикерема). В чашки Петри разливают картофельно-глюкозный агар и подсушивают для избавления от конденсата. Затем в верхней части агаровой пластинки наносят длинный штрих негустой дрожжевой суспензии. В нижней части пластинки с двух сторон делают еще два точечных посева. Центральную часть штриха и одну из точек накрывают стерильными покровными стеклами. Через 6 суток инкубирования при 25оС готовые препараты исследуют под микроскопом.
Культуральные признаки основных видов
микроорганизмов, влияющих на качество продуктов
Пищевые продукты во время хранения подвергаются порче в результате попадания и развития в них различных сапрофитных микроорганизмов. Видовой состав микроорганизмов весьма разнообразен: гнилостные бактерии, микрококки, молочнокислые, маслянокислые, уксуснокислые, пропионовокислые бактерии, плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты.
Наряду с сапрофитами в продуктах могут содержаться патогенные и условно-патогенные микроорганизмы – возбудители зооантропонозных болезней, пищевых токсикоинфекций и токсикозов.
Гнилостные микроорганизмы развиваются в продуктах, а также в кишечнике человека и животных. Они вызывают распад белков с образованием токсичных продуктов распада, что может привести к возникновению различных пороков пищевых продуктов: неприятный запах, ослизнение. Употребление таких продуктов приводит к острым пищевым отравлениям. К гнилостным бактериям относят аэробные спорообразующие и неспорообразующие палочки, спорообразующие анаэробы, факультативно-анаэробные неспорообразующие палочки.
Аэробные спорообразующие палочки. Типичные представители - палочки цереус, грибовидная, капустная, картофельная и сенная.
Палочка цереус (Вас. cereus) - это грамположительная палочка длиной 8 мкм, шириной 0,9-1,5 мкм, подвижная, образует споры (рис.5). Отдельные штаммы этого микроорганизма могут формировать капсулу. Может развиваться и при недостатке кислорода воздуха.
Рис. 5. Грибовидная палочка (Вас. cereus):
а - клетки; б - колония
На поверхности МПА вырастают крупные колонии с изрезанными краями, некоторые штаммы выделяют розово-коричневый пигмент; на кровяном агаре вокруг колоний наблюдается резко очерченная зона гемолиза. При развитии микроорганизм образует нежную пленку, пристеночное кольцо, равномерное помутнение и хлопьевидный осадок на дне пробирки.
Все штаммы интенсивно растут при рН (9-9,5), при рН (4,5-5) прекращают свое развитие. Могут развиваться при концентрации поваренной соли в среде 10-15 %, сахара - до 30-60 %. Оптимальная температура развития (30-32)°С. Палочка свертывает и пептонизирует молоко, быстро разжижает желатин, способна образовывать ацетилметилкарбинол, утилизировать цитратные соли, ферментировать мальтозу и сахарозу. Некоторые штаммы расщепляют лактозу, галактозу, инулин, арабинозу, глицерин.
Капустная палочка (Вас. megatherium) - это грамположительная палочка длиной 3,5-7 мкм и шириной 1,5- 2 мкм. Она располагается одиночно, попарно или цепочками, подвижна, образует споры, капсул не формирует. На МПА вырастают колонии серо-белого цвета, гладкие, блестящие с ровными краями. Капустная палочка вызывает помутнение МПБ с образованием незначительного осадка. Микроб чувствителен к кислой реакции среды. Оптимальная температура развития 25-30оС. Палочка быстро разжижает желатин, свертывает и пептонизирует молоко, вызывает гемолиз эритроцитов, гидролиз крахмала. На средах с глюкозой и лактозой микроб дает кислую реакцию. При развитии капустной палочки выделяются сероводород, аммиак, но индола не образуется.
Б
Рис. 6. Картофельная палочка (Вас. mesentericus):
а - клетки; б - колония
Картофельная палочка (Вас. Mesentencus) - это грубая грамположительная палочка с закругленными концами, длиной 1,6-6 и шириной 0,5-0,8 мкм (рис. 6), образует споры, капсул не формирует, подвижна. Картофельная палочка на МПА образует сочные, с морщинистой поверхностью слизистые колонии серо-белого цвета с волнистыми краями. Микроб разжижает желатин, свертывает и пептонизирует молоко, вызывает гидролиз крахмала, выделяет при развитии сероводород, индола не образует, не ферментирует глюкозы и лактозы.
Сенная палочка (Вас. subtilis) - это грамположительная короткая палочка с закругленными концами длиной 3-5, шириной 0,6 мкм, иногда располагается цепочками, образует споры, капсул не образует, подвижна. На МПА вырастают сухие бугристые колонии серо-белого цвета. При росте в МПБ появляется сухая, морщинистая беловатая пленка; бульон сначала мутнеет, а затем становится прозрачным. Микроб чувствителен к кислой реакции среды. Оптимальная температура развития 37оС. Может развиваться и при (5-20)оС.
Палочка характеризуется высокой протеолитической активностью: разжижает желатин и свернутую кровяную сыворотку, свертывает и пептонизирует молоко, выделяет аммиак, иногда сероводород, но не образует индола, вызывает посинение лакмусового молока и гидролиз крахмала, разлагает глицерин, дает кислую реакцию на средах с лактозой, глюкозой, сахарозой. Аэробные неспорообразующие палочки. К этой группе микроорганизмов относятся чудесная, флуоресцирующая, синегнойная палочки.
Флуоресцирующие бактерии (рис. 7) характеризуются высокой ферментативной активностью: разжижают желатин и свернутую кровяную сыворотку, свертывают и пептонизируют молоко; большинство их штаммов способны расщеплять клетчатку и крахмал.
При развитии они образуют сероводород и аммиак, не выделяют индола, глюкозы и лактозы не ферментируют. Бактерии вызывают посинение лакмусового молока. Многие штаммы флуоресцирующих бактерий продуцируют ферменты липазу, лецитиназу; дают положительную реакцию на каталазу, цитохромоксидазу, оксидазу. Флуоресцирующие бактерии – сильные аммонификаторы.
Рис. 7. Флуоресцирующая палочка (Ps. Fluorescehs)
Синегнойная палочка (Ps. aeruginosa) - это грамотрицательная небольшая палочка длиной 2-3, толщиной 0,6 мкм, спор и капсул не формирует, подвижная. На МПА вырастают расплывчатые, непрозрачные, окрашенные в зеленовато-синий или бирюзово-синий цвет колонии. Цвет колоний обусловлен образованием пигментов (желтого - флуоресцина и голубого - пиоцианина). Микроб вызывает помутнение МПБ и выделяет пигменты, иногда на поверхности среды появляется пленка. Пигменты растворимы в хлороформе. Как и все гнилостные бактерии, синегнойная палочка чувствительна к кислой реакции среды, оптимальная температура ее развития 37 °С. Микроб быстро разжижает желатин и свернутую кровяную сыворотку, свертывает и пептонизирует молоко, вызывает посинение лакмусового молока, образует аммиак и сероводород, но не выделяет индола.
Синегнойная палочка обладает липолитической способностью. Она дает положительные реакции на каталазу, оксидазу, цитохромоксидазу (эти свойства присущи представителям рода псевдомонас). Некоторые штаммы микроорганизма расщепляют крахмал и клетчатку, но не ферментируют лактозы и сахарозы.
Спорообразующие анаэробы. К спорообразующим анаэробам относят палочки путрификус и спорогенес.
Палочка путрификус (Cl. putrificus) – это грамположительная палочка длиной 7-9 и шириной 0,4-0,7 мкм, иногда формирует цепочки, образует довольно термоустойчивые споры, превышающие диаметр вегетативной формы, капсул не образует, подвижная. Колонии на МПА имеют вид клубка волос, непрозрачные, вязкие, при росте в МПБ вызывают его помутнение.
Протеолитические свойства микроорганизма ярко выражены: разжижает желатин и кровяную сыворотку, свертывает и пептонизирует молоко. Палочка путрификус образует сероводород, аммиак, индол; вызывает почернение мозговой среды, на кровяном агаре вокруг колоний образуются зоны гемолиза; характеризуется липолитической активностью, но не обладает сахаролитическими свойствами.
Палочка спорогенес (Cl. sporogenes) - это крупная палочка с закругленными концами длиной 3-7 и шириной 0,6-0,9 мкм. В мазках она располагается одиночно или формирует цепочки. Палочка спорогенес быстро образует споры, которые сохраняют жизнеспособность после 30-минутного нагревания на водяной бане, а также после 20-минутного выдерживания в автоклаве при 120°С, капсул не образует. Микроб подвижный, грамположительный. На МПА вырастают мелкие вначале прозрачные колонии, по мере старения культуры они становятся непрозрачными. Оптимальная температура роста микроорганизма 37°С, но может расти и при 50 ° С. Палочка спорогенес обладает очень сильной протеолитической активностью: вызывает гнилостный распад белков с образованием газов; разжижает желатин и свернутую кровяную сыворотку, свертывает и пептонизирует молоко. Микроорганизм образует сероводород, разлагает с образованием кислоты и газа галактозу, мальтозу, декстрин, левулезу, маннит, сорбит, глицерин.
Факультативно-анаэробные неспорообразующие палочки. К ним относят палочку протея обыкновенного (Proteus vulgaris) и кишечную палочку (Escherichia coli).
Палочка протея (Рг. vulgaris) обладает полиморфностью, т.е. может образовывать нити длиной 1;2-3 и шириной 0,5-0,6 мкм. Спор и капсул не формирует. Палочка обладает активной подвижностью (перитрихи), грамотрицательна (рис. 8). При посеве материала, содержащего палочку протея, в конденсационную воду свежескошенного агара (метод Шукевича) через несколько часов отмечается роение микроба, ползучий рост (Н-форма). Поверхность МПА покрывается тонкой нежной, прозрачной пленкой. Посев по методу Шукевича широко применяют в диагностических лабораториях при выделении палочки протея из объектов внешней среды и продуктов. Этот микроорганизм сбраживает глюкозу с образованием кислоты и газа, но не ферментирует лактозы и маннита. Расщепляет мочевину, разжижает желатин, выделяет сероводород, образует индол, сбраживает мальтозу.
Рис. 8. Палочка протея обыкновенного (Pr. Vulgaris)
Кишечная палочка (Е. coli) - это короткая (длина 1-3, ширина 0,5-0,8 мкм), полиморфная, грамотрицательная, не образующая спор, подвижная палочка (рис. 9). Хорошо растет на простых питательных средах: на МПА - колонии прозрачные, с серовато голубым отливом, легко сливающиеся между собой. В МПБ микроорганизм дает обильный рост при значительном помутнении среды, образует пристеночное кольцо, пленка на поверхности бульона обычно отсутствует. На плотной дифференциально-диагностической среде Эндо, содержащей лактозу, кишечная палочка образует плоские красные колонии с темным металлическим блеском. Не разжижает желатина, не дает роста на средах, содержащих лимонную кислоту или ее соли, свертывает молоко, расщепляет пептоны с образованием аминов, аммиака, сероводорода, индола, обладает высокой ферментативной активностью по отношению к лактозе, глюкозе и другим сахарам, а также спиртам.
Рис. 9. Кишечная палочка (Е. coli)
Грибы. В природе насчитывается более 100 тыс. видов грибов (рис 10). В основном это сапрофиты, микроорганизмы не развиваются на живых существах. Плесневые грибы и многие виды дрожжей могут быть возбудителями пороков пищевых продуктов.
Плесневые грибы. Они являются постоянными обитателями внешней среды, на поверхности субстрата образуют ползучие, стелющиеся, бархатистые, пушистые, войлокообразные колонии, которые сливаются в сплошной налет. Наиболее благоприятные условия для развития плесневых грибов - свободный доступ кислорода и кислая реакция среды. Они могут развиваться при влажности окружающей среды 10-15%, рН 1,5-11, температуре до -11°С (из рода мукоровых), высоком осмотическом давлении, а отдельные виды плесневых грибов - при ограниченном доступе кислорода. Плесневые грибы обладают ферментативной активностью (протеолитической, липолитической и др.), вызывают глубокий распад белков и белковых веществ, разлагают жиры до жирных кислот и альдегидов. При их развитии на мясе происходит его ослизнение и плесневение, сопровождающиеся химическими превращениями, которые обусловливают изменение его запаха и вкуса. Снижается товарный вид мяса.
|
а |
б |
в |
г |
Рис. 10. Морфологические особенности грибов различных классов:
а - Mucor; б - Penicillium; в - Aspergillus; г - Alternaria
Дрожжи. Это факультативные анаэробы, лучше развиваются в кислой среде, оптимальная температура роста 20-30° С, но многие из них способны развиваться и при -10 °С. Вегетативные формы дрожжей погибают при 60-65°С, а споры - при 70-75 °С. Дрожжи распространены во внешней среде, откуда попадают на продукты. Различные виды дрожжей сбраживают большинство углеводов (глюкозу, лактозу, сахарозу, декстрозу, мальтозу). Микроорганизмы рода микодерма (Mycoderma), не сбраживающие углеводов, получили название пленчатых дрожжей. Клетки пленчатых дрожжей имеют вытянутую форму. Эти дрожжи широко распространены в природе, попадая на продукты, вызывают их порчу. Так, развиваясь на мясе, дрожжевые клетки используют молочную кислоту, изменяют рН мяса, а также портят его товарный вид. При расщеплении жиров образуются свободные жирные кислоты, что ведет к прогорканию продукта. Многие дрожжи обладают липолитической способностью. Гнилостной порчи эти микроорганизмы не вызывают, но в результате плесневения и ослизнения мяса сокращаются сроки его хранения в охлажденном и замороженном состоянии.
Актиномицеты. Большинство видов актиномицетов хорошо развиваются при 25-30 °С, для патогенных видов температурный оптимум составляет 37-40°С. Актиномицеты широко распространены в природе - это одни из многочисленных гнилостных микроорганизмов. Они способны вызывать гниение белковых субстратов, гидролиз жира. Развиваясь на мясе при -2-3°C , актиномицеты придают ему неприятный землистый запах.
Микрококки. Семейство микрококки (Micrococcaceae) включает роды: микрококкус (Micrococcus), стафилококкус (Staphylococcus), capцина (Sarcina). Кокки этого семейства обычно имеют форму шара. Большинство представителей семейства микрококкацее - аэробы и факультативные анаэробы. Небольшое число видов относится к облигатным анаэробам. Микроорганизмы семейства микрококкацее широко распространены в природе. Наряду с сапрофитными обнаруживаются и патогенные виды, которые могут вызвать различные патологические процессы в организме человека и животного, а также быть причиной пищевых отравлений. Микрококки - строгие аэробы в отличие от стафилококков. На МПА образуют средней величины круглые белого, желтого или розового цвета колонии. Встречаются также различные оттенки от красного до оранжевого цвета. Большинство сапрофитов выделяют розовый и желтый пигменты. Оптимальная температура развития 20-25° С. Многие виды могут развиваться при 5-8°С. Микрококки характеризуются высокой устойчивостью к соли и сахару, относятся к пептонизирующим микроорганизмам. Некоторые виды разлагают жир и придают продукту прогорклый вкус.
Микробактерии. Мелкие палочки неправильной формы, при окрашивании метиленовым синим наблюдается зернистость. Палочки развиваются при 15-35° С; оптимальная температура роста 30 °С: Эти микроорганизмы являются наиболее устойчивыми к высокой температуре из всех известных бесспоровых бактерий.
Маслянокислые бактерии. Представляют собой палочки цилиндрической формы, длиной от 5-7 до 7-12 мкм и толщиной 0,5-1,5 мкм (рис. 11). Бактерии подвижны, образуют споры (клостридии), капсул не образуют. Споры выдерживают кипячение 1-2 мин, не погибают при пастеризации. Маслянокислые бактерии по Граму красятся положительно, содержат гранулезу (крахмалоподобное вещество), являются анаэробами. Оптимальная температура развития бактерий 30-35°С, минимальная 8-10, максимальная 45 °С. Характерными признаками этих бактерий являются бурное газообразование при развитии, неприятный запах масляной кислоты. Маслянокислые бактерии сбраживают молочный сахар и расщепляют соли молочной кислоты. При этом образуются масляная, уксусная, пропионовая, муравьиная кислоты и небольшое количество спирта (этилового, бутилового, пропилового). Маслянокислые бактерии способны усваивать белковый, аминокислотный и аммонийный азот, а некоторые виды - даже азот воздуха. Они чувствительны к кислой реакции среды.
Рис. 11. Маслянокислые бактерии
Уксуснокислые бактерии. Уксуснокислые бактерии представляют собой палочки, не образующие спор, подвижные (встречаются и неподвижные), располагаются одиночно или цепочками. Это строгие аэробы. Оптимальная температура развития бактерий 30°С. Колонии уксуснокислых бактерий вырастают только на поверхности питательной среды, на жидких питательных средах они образуют пленку (на поверхности свернувшегося молока появляется оранжевое кольцо). При доступе воздуха бактерии легко окисляют спирт в уксусную кислоту. Возбудителями уксуснокислого брожения являются бактериум ацети (Bact. aceti), бактериум орлеанзе (Bact. orleanse) и др.
Задание 1. Изучить морфологию микроорганизмов в предложенных вариантах накопительного субстрата.
Вариант 1. Накопительная культура картофельной палочки Bacillus subtilis, полученная следующим образом: очищенный картофель нарезают ломтиками, помещают в чашки Петри и прогревают 10 мин при температуре 100оС в стерилизаторе (инактивируются все вегетативные клетки микроорганизмов), после чего помещают в термостат на 2-3 дня при температуре 25-30оС. На картофеле прорастают споры и образуется крепкая морщинистая пленка, при микроскопировании которой видны подвижные палочки длиной до 4-5 мкм, часто соединенные в цепочки.
Вариант 2. Накопительная культура уксуснокислых бактерий, полученная следующим образом: в пробирку со стерильным молоком, подкисленным до рН 5,5-5,8, вносят петлей кефирную закваску, выдержанную 48 ч. при комнатной температуре. Получение биомассы выражается в свертывании молока и образовании желтого кольца на поверхности сгустка.
Вариант 3. Накопительная культура маслянокислых бактерий (род Clostridium), полученная следующим образом: в большую пробирку или колбу на 50 мл помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, заливают водопроводной водой (расстояние до пробки 2-3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80оС в течение 10 мин в водяной бане, после чего помещают в термостат при температуре 37оС.Через 1-2 суток в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Для микроскопирования берут культуральную жидкость со дна пробирки, вблизи ломтиков картофеля.
Задание 2. Изучить биохимические методы идентификации бактерий в предложенных вариантах накопительного субстрата:
а. Изучить способность к ферментации углеводов методом «пестрого ряда».
Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода, индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.
При определении способности микроорганизмов к ферментации углеводов в пронумерованный ряд пробирок с разным количеством лактозы засевают одинаковое количество накопительной культуры (1 микробиологическая петля). Результаты оценивают через 72 ч.
б. Изучить способность бактерий к расщеплению белков.
Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие у культуры протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом на среду КМАФАнМ. При положительном результате наблюдают ее разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты - аммиак, индол и сероводород - сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.
Пробирки со средой после засева культуры ставят в термостат на 37оС на 72 ч. По истечении этого времени отмечают разжижение среды вокруг укола петлей.
в. Изучить способность микроорганизмов к образованию аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев на среду КМАФАнМ, и между ее поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.
Рекомендуется поместить лакмусовую бумажку в вариант засева по пункту б) для избежания дублирования засева.
г. Определить пектолитическую активность.
Исследуемые бактериальные культуры засевают «медальонами” на поверхность полноценной питательной агаризованной среды, содержащей ионы Са2+, с нанесенным на нее пектиновым гелем. После инкубирования в течение 72 ч при 37оС продукцию пектолитических ферментов регистрируют по образованию лунок на поверхности геля.
Контрольные вопросы
Лабораторная работа № 4
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ЗЕРНОМУЧНЫХ
ИЗДЕЛИЙ И МЕТОДОВ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ
КАРТОФЕЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ХЛЕБА
Особенности технологии приготовления хлеба
Печеный хлеб – продукт, получаемый выпечкой разрыхленного закваской или дрожжами теста, приготовленного из всех видов ржаной и пшеничной муки. Он составляет значительную часть пищевого рациона человека и является одним из основных источников углеводов и растительного белка.
Пищевая ценность хлеба довольно высока и зависит от сорта муки и рецептуры теста. В среднем в хлебе содержится 5,5-9,5 % белков, 0,7-1,3 % – жиров, 1,4-2,5% – минеральных веществ, 3,9-4,7 % - воды, 42-50 % - углеводов. Биологическая ценность хлеба невелика. В печеном хлебе без обогатителей содержание таких незаменимых аминокислот, как лизин, метионин, треонин и триптофан недостаточно. Поэтому введение в рецептуру хлеба белковых обогатителей (молоко, сыворотка, соя), содержащих большое количество этих аминокислот, способствует повышению пищевой ценности хлеба. В простом по рецептуре хлебе мало жира. Однако хлеб почти на 38 % обеспечивает потребность организма в растительных жирах и на 25 % в фосфолипидах. Хлеб из муки высоких сортов содержит жира значительно меньше, чем из обойной.
За счет хлебных изделий человек почти полностью покрывает потребность в железе, получает значительную долю марганца и фосфора. Существенным недостатком минерального комплекса хлеба является малое содержание кальция и неблагоприятное соотношение его с фосфором и магнием. В хлебе в недостаточном количестве содержится калий, хром, кобальт и некоторые другие элементы. Повышение минеральной ценности хлеба является также актуальной проблемой. Хлеб богат витаминами Е и покрывает около 1/3 потребности в витаминах В6, В9 и холине, но беден витаминами В2 и В3. Достаточно высоким содержанием витаминов В1, В2 и РР характеризуется хлеб из муки низких сортов.
Усвояемость хлеба зависит во многом от его органолептических свойств – внешнего вида, структуры пористости, вкуса и аромата. Белки хлеба усваиваются на 70-87, углеводы – на 94-98, жиры – на 92-95 %. Чем ниже сорт муки, тем ниже усвояемость этих веществ.
По мере повышения сорта муки уменьшается влажность хлеба, возрастает содержание белков, усвояемых углеводов и увеличивается энергетическая ценность хлебных изделий. Наиболее низкая энергетическая способность у хлеба из обойной муки. Более ценны по калорийности и усвояемости хлебные изделия из муки высших сортов.
Высокая усвояемость веществ хлеба объясняется тем, что он имеет пористый, эластичный мякиш, в котором белки находятся в оптимальной степени денатурации, крахмал клейстеризован, сахар растворен, жиры эмульгированы, оболочечные частицы зерна набухшие и размягченные. Такое состояние веществ и пористая структура мякиша делают их легкодоступными для действия ферментов пищеварительного тракта человека.
Сырьё, применяемое в хлебопечении, делят на основное и вспомогательное. К основному сырью относят муку, соль и дрожжи. В хлебопечении ржано-пшеничного хлеба используют ржаную муку разных сортов и пшеничную муку первого и второго сортов. Воду используют питьевую. Для улучшения вкуса и консистенции теста добавляют 1-2 % соли. Хлебопекарные дрожжи вызывают спиртовое брожение сахаров теста, в результате чего образуются спирт и углекислый газ. При брожении углекислый газ разрыхляет хлебное тесто и придает ему пористую структуру.
Все существующие и используемые в промышленности традиционные способы приготовления теста для заварных сортов хлеба можно разделить на трех- и четырехфазные. При трехфазном способе приготовления тесто замешивают с использованием осахаренной заварки и традиционной ржаной биологической закваски, чаще густой.
При приготовлении теста в четыре стадии существующие способы можно классифицировать следующим образом:
- опарный;
- на заквашенной или сброженной заварке;
- с применением термофильной заквашенной заварки.
Следует отметить, что для подкисления теста, опары или заквашенной заварки при выработке заварных сортов хлеба по традиционной технологии можно использовать, в основном, только густые закваски.
Требования к качеству ржано-пшеничного хлеба
Качество хлеба оценивают органолептически (по внешнему виду, состоянию мякиша, вкусу и запаху) и по физико-химическим показателям (влажности, кислотности, содержанию сахара, жира, пористости). Форма изделий должна соответствовать их наименованию, быть нерасплывчатой, без боковых наплывов. Поверхность гладкая, без трещин, окраска корок равномерная, небледная и неподгоревшая.
Состояние мякиша изделий характеризуется его пропеченностью, промесом, пористостью, эластичностью и свежестью. У пропеченных изделий мякиш сухой, нелипкий, невлажный на ощупь, без комочков и следов непромеса, эластичный, нечерствый и некрошливый. Пористость объективно определяют как отношение объема пор мякиша к общему объему хлебного мякиша, выраженное в процентах. Пористость ржано-пшеничного хлеба – 46-62 %. Мякиш с хорошей эластичностью у остывшего хлеба быстро приобретает первоначальную форму после продавливания.
Свежие изделия имеют сухую корку с ровной поверхностью, мякиш однотонный, эластичный, мягкий, вкус и запах, свойственные названию изделий, без признаков горечи, посторонних привкусов и запахов. Массовая доля влаги в ржано-пшеничном хлебе 45-50 %. Кислотность ржано-пшеничного хлеба – 7-11°Н. Пористость ржано-пшеничного хлеба – 49-62%.
Различают дефекты внешнего вида, мякиша, дефекты вкуса и запаха. Дефекты внешнего вида – неправильная форма хлеба, трещины, надрывы на корке, горелая или бледная корка, отсутствие глянца на ней. Дефекты мякиша - непромес, отставание корки от мякиша, закал, крошливость, неравномерная пористость и непропеченность мякиша. Дефекты вкуса – излишне пресный, кислый, солёный, горький – возникают при нарушении рецептуры.
Болезни хлеба вызывают микроорганизмы.
Картофельная болезнь вызывается картофельной палочкой, содержащейся в муке. Мякиш такого пшеничного хлеба имеет неприятный запах и темную, тягучую массу. Такой хлеб не пригоден к употреблению.
Меловая болезнь вызывается дрожжевыми грибами, и в мякише образуются белые пятна, которые преобразуются в порошок, похожий на мел.
Плесневение хлеба возникает при длительном и неправильном хранении. На хлебе появляется белая, черная или зеленая плесень, которая придает ему неприятный вкус и запах.
Физиолого-биохимические свойства возбудителя
картофельной болезни хлеба
Картофельная палочка широко распространена в природе, особенно в картофеле, куда она попадает из почвы. Картофельная палочка вызывает «тягучую» болезнь хлеба, которая наносит большой экономический ущерб пищевой промышленности и потребителям.
Bac. mesentericus образует очень стойкие центральные споры, которые выдерживают нагревание при 100оС в течение 6 ч. Это грубая палочка с закругленными концами, подвижна, споры ее совпадают размерами с поперечным размером клетки.
На питательной среде Bac. mesentericus образуют слизистые колонии матового или сероватого цвета с волнистыми краями и радиальной складкой, отходящей от центра. Отдельные штаммы выделяют серо-бурый или коричневатый пигмент, они вызывают слабое помутнение или появление пленки на питательной среде. В жидкой среде на поверхности образуется морщинистая беловатая пленка.
Бактерии чувствительны к кислой реакции среды, поэтому актуальным направлением пищевой промышленности является разработка технологий получения заквасок для хлебопекарной промышленности, с применением микроорганизмов, обладающих антагонистическим действием по отношению к картофельной палочке. Все способы подавления размножения бацилл основаны на биологических принципах. С этой целью применяются также консерванты: соли пропионовой, молочной и уксусной кислот, а также бромат калия и др.
Бактерии относятся к классу гнилостных, они аэробны, обладают протеолитической активностью, т.к. выделяют ферменты класса протеаз, разлагая белки с выделением дурнопахнущих веществ. Палочки восстанавливают нитраты до нитритов, имеют высокую каталазообразующую способность, активно гидролизируют крахмал (что делает мякиш хлебобулочных изделий липким и тянущимся), свертывают и пептонизируют молоко, при разложении белка выделяют сероводород.
Причинами развития картофельной палочки в хлебобулочных изделиях являются:
- сильное обсеменение муки спорами картофельной палочки в результате плохой очистки и мойки зерна на мельнице, а также при несоблюдении режимов хранения муки и зерна, особенно при повышении температуры воздуха в летнее время года;
- обсемененность оборудования или помещения хлебозавода зараженной мукой, при несоблюдении санитарных режимов обработки на предприятии;
- нарушение режимов и условий вторичной переработки хлеба: сушка брака при низкой температуре, приготовление сухарной крошки из зараженного хлеба, поступление большого количества брака из торговой сети;
- нарушение технологических параметров при производстве и реализации хлеба: кислотности, влажности, пропеченности, режима хранения хлеба в экспедиции хлебозавода и торговой сети.
Изучение особенностей возбудителя и источников его попадания в зерномучные изделия позволят разработать новые способы и рекомендации по предупреждению развития данного заболевания и меры по ликвидации его последствий.
Влияние стартовых культур на формирование
качества хлебобулочных изделий
Ржаные закваски предусматривают культивирование дрожжевых клеток и молочнокислых бактерий до определенной кислотности, в процессе которого инактивируется активная α-амилаза. В случае густой консистенции закваски соотношение дрожжей и бактерий составляет 1:60 или 1:80, в жидкой – 1:40.
В жидких заквасках создаются лучшие условия для жизнедеятельности дрожжей, чем в густых. В жидкой среде ниже кислотность, меньше концентрация продуктов обмена, угнетающих дрожжевые клетки. В густых заквасках преобладают дрожжи вида S. minor, устойчивые к высокой кислотности среды, в жидких заквасках преобладают дрожжи вида S. cerevisiae.
Приготовление закваски с использованием чистых культур бродильной микрофлоры получило широкое распространение. При этом в закваске создается оптимальное технологическое соотношение микроорганизмов, обеспечивающее высокую бродильную активность, устойчивую кислотность и большое содержание ароматобразующих веществ, что, в целом, улучшает качество хлеба.
Микрофлора заквасок, приготовленных без использования чистых культур, содержит большое количество посторонних микроорганизмов – это может быть решающим негативным фактором при протекании биохимических процессов. При регулировании жизнедеятельности бродильной микрофлоры учитывают физиологические особенности вносимых культур и влияние на них факторов внешней среды – температура, влажность, кислотность среды, количество заварки, качество муки, микробиологическое состояние сырья и воды, а также санитарное состояние на предприятии.
В ржаных заквасках представлены дрожжи и кислотообразующие бактерии. Дрожжи в ржаных заквасках встречаются даже тогда, когда их не вносят в первую фазу разводочного цикла приготовления закваски. В этом случае проявляются дрожжи, попавшие в закваску с мукой, водой или из воздуха и размножившиеся в закваске, которая представляет собой благоприятную среду.
В ржаных закваске и тесте должны быть созданы условия, при которых количество кислотообразующих бактерий во много раз превышало бы количество дрожжевых клеток.
Наряду с дрожжами Saccharomyces cerevisiae и некоторым количеством отдельных разновидностей диких дрожжей в ржаных заквасках встречаются и дрожжи Saccharomyces minor. Они сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, но не сбраживают мальтозы. Однако по распространенности, скорости размножения и интенсивности брожения в ржаных заквасках и тесте основную роль играют все же дрожжи Saccharomyces cerevisiae, адаптированные к повышенной кислотности теста и его кислотообразующей микрофлоре.
Дрожжи сахаромицеты, в основном выполняют роль разрыхлителей теста, оказывая существенное влияние на объем готового хлеба и пористость мякиша. Сбраживаясь, углеводы муки образуют углекислый газ и спирт, а также ряд побочных веществ: уксусный альдегид, бутиловый, изобутиловый, изоамиловый спирты, органические кислоты – молочная, янтарная, винная, щавелевая и некоторые другие вещества, придающие хлебу специфический вкус и аромат.
Первые исследования кислотообразующей бактериальной микрофлоры ржаных заквасок были проведены М.Ф. Поповым, А.М. Пасвик, В.Л. Олемянским, Кнудсеном, Шульцем, Г.Л. Селибер и рядом других исследователей.
Некоторые исследователи отрицают сколько-нибудь значительную роль кислотообразующих бактерий ржаного теста в его разрыхлении. Разрыхление теста, по их мнению, целиком обеспечивается углекислым газом, выделяемым в тесто дрожжами.
Большинство исследователей, не отрицая большой роли дрожжей в разрыхлении теста, отмечают и существенную роль в этом процессе кислотообразующих и газообразующих бактерий. М.Ф. Попов, В.Л. Омелянский, Г.Л. Селибер показали в лабораторных условиях, что ржаное тесто может быть удовлетворительно разрыхлено и в результате приготовления на культурах одних кислотообразующих и газообразующих бактерий. Работы в этом направлении велись не только в лабораторных, но и в производственных условиях Е.А. Гладковой и П.М. Плотниковым, М.И. Княгиничевым и З.И. Шмидт.
Специфическая для ржаных заквасок и теста кислотообразующая микрофлора состоит из бактерий, относящихся к группам – истинных, гомоферментативных, молочнокислых бактерий, образующих в качестве основного продукта молочную кислоту и незначительное количество летучих кислот. К ним относятся L.plantarum, L.delbruckii, L.casei и другие. Эти бактерии в заквасках и тесте играют роль кислотообразователей. Неистинные, или гетероферментативные молочные бактерии, образуют наряду с молочной кислотой значительное количество летучих кислот и газа, в основном диоксида углерода, а также незначительное количество спирта. Сюда относятся L.brevis, L. fermenti, L.pastorianus, L.buchneri и другие. Данные бактерии играют существенную роль в разрыхлении ржаного теста – основное количество уксусной кислоты и углекислого газа, образовано именно ими.
Молочнокислым бактериям принадлежит ведущая роль в брожении ржаных полуфабрикатов, поскольку молочная кислота существенно влияет на физические свойства ржаного теста. Кислотность способствует набуханию и пептизации белков ржаной муки, за счет чего увеличивается вязкость теста и возрастает его газоудерживающая способность. Кроме того, повышение кислотности закваски подавляет активность α-амилазы, что предотвращает накопление в тесте декстринов, делающих мякиш ржаного хлеба излишне липким и заминающимся.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии участвуют в разрыхлении теста, эта особенность была использована при попытке разработать способ получения ржаного хлеба на густых заквасках без применения дрожжей.
Молочнокислые бактерии оказывают большое влияние на вкус и аромат ржаного хлеба, обусловленные соотношением молочной и уксусной кислот. Это соотношение называется коэффициентом брожения. Молочная кислота придает ржаному хлебу приятный кисловатый вкус, а летучие кислоты – специфический аромат. Кроме летучих кислот определенное влияние на аромат хлеба оказывают органические ди- и трикарбоновые кислоты. По данным М.И. Княгичева и П.М. Плотникова в ржаном хлебе из обойной муки содержится около 60 % молочной кислоты, 32 % летучих кислот и 8 % органических кислот. Из общей суммы летучих кислот в ржаном хлебе на долю уксусной приходится 38- 65 %, на долю пропионовой 28-52 и муравьиной 1,16-10,7 %. Большую роль в образовании ароматического комплекса хлеба играют карбонильные соединения. К ним относятся: альдегиды (ацетальдегид, бензальдегид, изовалериановый, коричный, сиреневый), ванилин, оксиметилфурфурол, ацетоген, диацетил, диоксиацетон, фурфурол.
Гомо- и гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют в процессе брожения в хлебе различные продукты. Гомоферментативные виды образуют до 10 % летучих кислот, гетероферментативные в 2-3 раза больше (13-34)%.
Гомоферментативные культуры образуют меньше органических ди- и трикарбоновых кислот, но несколько больше летучих карбонильных соединений. Гомоферментативные виды, как правило, являются более сильными кислотообразователями.
Установлено, что хлеб на густых заквасках с применением одних гомоферментативных видов молочнокислых бактерий лишен специфического аромата, поэтому вкус его кажется несколько «пустым».
Развитие только гетероферментативных культур способствует большему накоплению уксусной кислоты, которая придает хлебу резкий запах и более кислый вкус. Наиболее хороший хлеб по вкусу и аромату получается при совместном применении гомо- и гетероферментативных штаммов кислотообразующих бактерий в соотношении 1:2.
Г. Шпикер, детально изучивший влияние различных видов молочнокислых бактерий на качество хлеба, пришел к заключению, что хлеб с типичным вкусом и ароматом получается на густых заквасках только при применении гетероферментативных видов L.brevis, L.fermenti, L.buchneri. Хлеб на чистых культурах термофильных бактерий L.delbruckii и L.leichmannii малоприятен и безвкусен, что объясняется неблагоприятным режимом ведения закваски. Использование вида L.plantarum в качестве чистой культуры дает хлеб с нежным вкусом, но малоароматный, так как бактерии данного вида не образуют летучих кислот. Относительно хуже других образцов получается хлеб с применением гомоферментативного вида L.casei. По мнению Шпикера, этот вид неспецифичен для ржаных заквасок.
Основную роль в брожении густых заквасок играют виды L.plantarum, L.brevis и L.fermenti.
Жидкие ржаные закваски по видовому составу кислотообразующей микрофлоры мало отличаются от густых. В них обнаружены те же виды бактерий: L.plantarum, L.brevis, L.fermenti, L.casei и в единичных случаях L.buchneri и L.delbruckii. Однако в брожении жидких заквасок виды L.fermenti и L.casei играют существенную роль наряду L.brevis и L.plantarum. По-видимому, температура жидких заквасок (32-35)оС оказывает благоприятное воздействие на виды L.casei и L.fermenti, для которых оптимум температуры лежит выше 30оС.
Изучение кислотообразующей микрофлоры полуфабрикатов из ржаной муки позволяет внести ясность в вопрос о роли отдельных видов молочнокислых бактерий. Это имеет значение при подборе специфических культур для каждой технологической схемы приготовления хлеба.
Специфичной для молочнокислых бактерий является также выработка антибиотиков, играющих роль антагонистов по отношению к посторонней микрофлоре в полуфабрикатах и обеспечивающих стойкость хлеба при хранении.
Весьма эффективным способом изменения состава и свойств бродильной микрофлоры ржаных заквасок является изменение температуры культивирования. Установлено, что повышение температуры заквасок от 25 до 40оС форсирует кислотонакопление в заквасках, одновременно повышая долю молочной кислоты к общей кислотности теста, поскольку создаются благоприятные условия для развития и жизнедеятельности бактерий.
Установлено, что специфичные для ржаного теста кислотообразующие бактерии при более или менее длительном культивировании почти полностью вытесняют неспецифичную микрофлору муки. Основным фактором, в данном случае, является высокое содержание молочной кислоты.
В ВСГТУ было изучено влияние заквасок бифидо- и пропионовокислых бактерий на качественные показатели хлеба и хранимоспособность. Количество жизнеспособных клеток в заквасках на чистых культурах и бакконцентратах в конце ферментации составляет 109 к.о.е. в 1 см3 . Качественная характеристика закваски представлена в таблице 6.
Из данных таблицы 6 видно, что заварка содержит достаточно высокое количество жизнеспособных бактерий – 109 к.о.е. и обладает высокой кислотностью. В результате проведенных в ВСГТУ исследований установлено, что оптимальной дозой закваски бифидобактерий для ферментации заварки является 10%. Продолжительность ферментации 6 часов.
Таблица 6. Качественная характеристика закваски
|
Показатели |
Характеристика |
|
Массовая доля влаги, % |
65-70 |
|
Кислотность, оН |
6-7 |
|
Кол-во клеток жизнеспособных, к.о.е./г |
109 |
|
Содержание бактерий группы кишечной палочки в 0,1 г продукта |
Не допускается |
Таким образом, подбор культур в закваске и регулирование биохимических и микробиологических процессов позволит формировать хлеб с желаемым вкусом и ароматом.
Задание 1. Провести первичную оценку хлеба на признаки микробиологической порчи. Описать органолептические показатели хлеба и сделать соответствующие выводы.
Методика выполнения задания.
Первичную оценку степени поражения хлеба плесенями и микроскопическими грибами проводят с применением органолептических методов. При подозрении хлеба на микробиологическую порчу его подвергают лабораторному исследованию.
Оценка внешнего вида. Доброкачественный хлеб должен иметь правильную форму, равномерно поджаренную корку, без трещин, подгорелостей, без частиц золы, угля. Состояние мякиша, вкус и запах его устанавливают при разрезании пяти караваев. Мякиш на разрезе равномерно пористый, без закала и очагов не промешанной муки, соли. Хорошо пропеченный хлеб при разрезе не прилипает к ножу, при надавливании образуется ямка, которая быстро выравнивается. Цвет мякиша однородный.
Эластичность мякиша определяют путем надавливания на него пальцами на глубину не менее 1 см. Эластичность признают «хорошей» при полном восстановлении деформации мякиша, «средней» – при почти полном восстановлении деформации мякиша и «плохой» – при заминаемости мякиша. Эластичность мякиша определяют путем надавливания на него пальцами на глубину не менее 1 см. Эластичность признают «хорошей» при полном восстановлении деформации мякиша, «средней» – при почти полном восстановлении деформации мякиша и «плохой» – при заминаемости мякиша.
Вкус хлеба должен быть приятным, свойственным данному виду и сорту, без горечи, посторонних привкусов. При разжевывании не должен ощущаться хруст на зубах.
Запах - приятный, свойственный данному виду хлеба, без затхлости и посторонних запахов.
При осмотре караваев, оценке вкуса обращают внимание на признаки бактериального или грибкового поражения.
При развитии картофельной болезни хлеба значительно увеличиваются влажность и кислотность изделия.
Задание 2. Определить влажность представленных образцов хлеба.
Методика определения.
Для определения влажности в четырех местах хлеба вырезают кусочки мякиша общей массой 12-15 г, измельчают ножом, перемешивают и берут две навески по 5 г каждая в заранее высушенные и взвешенные бюксы с крышками, которые в открытом виде помещают в сушильный шкаф, предварительно нагретый до температуры 140°С. Высушивают навески при 130°С в течение 40 мин. Затем бюксу закрывают и переносят в эксикатор для охлаждения, после которого ее взвешивают. Исследования проводят параллельно в двух взятых навесках. По разнице между массой до и после высушивания определяют процент содержания воды в хлебе по следующей формуле:
|
Х=а-b/a • 100, |
где X — искомая влажность, %; а и b — масса навески до и после высушивания, г.
Задание 3. Определить кислотность представленных образцов хлеба.
Методика определения.
Кислотность хлеба выражают в градусах Неймана, под которыми понимают количество миллилитров 0,1 н. раствора щелочи, необходимой для нейтрализации кислот в 100 г хлеба. Для определения кислотности из мякиша хлеба вырезают небольшие кусочки и отвешивают на технохимических весах с точностью до 0,01 г навеску в 25 г. После тщательного измельчения ее переносят в сухую колбу или банку объемом до 500 мл с хорошо пригнанной пробкой, добавляют по частям 250 мл подогретой до 60°С дистиллированной воды. Вначале около 1/4 взятой воды вливают в колбу с хлебом и растирают мякиш шпателем для получения однородной массы, а затем добавляют оставшуюся воду, закрывают колбу пробкой и энергично встряхивают в течение 2-3 мин. Смесь оставляют стоять при комнатной температуре на протяжении 1 мин, после чего жидкий слой сливают в сухую колбу через два слоя марли. В последующем отбирают в две колбы пипеткой 50 мл отстоявшейся жидкости (без осадка), прибавляют по 2-3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и титруют из бюретки 0,1 н. раствором едкого натрия до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение минуты. Кислотность хлеба рассчитывают по формуле:
X=a∙V∙100 / pH10,
где X - кислотность в градусах; а - количество мл 0,1 н. щелочи, пошедшей на титрование V мл отстоя; H - объем отстоя, взятого для титрования, мл; р - масса навески хлеба, г.
Результат выражают средним арифметическим двух определений с расхождением в параллельных анализах не более 0,3°Н.
|
Кислотность доброкачественного хлеба, не более, оН |
12 ржаной |
2,5 - 4,0 пшеничный |
Задание 4. В предложенных образцах хлеба провести пробу на аммиак.
Методика определения.
При разложении клейковины накапливаются аммонийные соли, которые обнаруживаются реактивом Несслера. 5 г муки взбалтывают с 20 мл дистиллированной воды и настаивают 30 мин. Взвесь фильтруют через складчатый фильтр. Разные порции фильтрата разливают в две пробирки: в одну из них добавляют 0,5 мл реактива Несслера, во вторую (контрольную) - 0,5 мл 5%-ного раствора КОН. Если в муке началось разложение белков, содержимое пробирки с реактивом Несслера окрасится в желтый или бурый цвет.
Задание 5. В предложенных образцах хлеба провести пробу на свежесть.
В коническую колбу помещают по 2 г хлеба, добавляют 5 мл 10%-ного водного раствора NaOH и настаивают 10 мин. Смесь слегка подогревают (не более 30°С) и прибавляют 5 капель разведенной 1:2 борной кислоты. В доброкачественном хлебе сохраняется запах свежего клейстера, в испорченном - появляется запах сероводорода и триметиламина.
Задание 6. Провести анализ представленных образцов хлеба на присутствие бацилл картофельной палочки.
Для анализа изделий на присутствие Bacillus subtilis var. mesentericus взвешенную навеску массой (10±0,1) г, предназначенную для приготовления разведений, переносят в колбу вместимостью 200-250 мл, постепенно прибавляя стерильный пептонно-солевой раствор в соотношении 10 г продукта – 90 мл раствора. Отстаивают 10 мин, встряхивают и готовят серию последовательных разведений, перенося 1 мл вытяжки в пробирку с 9 мл пептонно-солевого раствора до разведения 105 к.о.е. в 1 см3. Все разведения засевают в чашки Петри и заливают стерильной средой Байд-Паркера.
Пробы оценивают через 72 часа инкубирования, микроскопируют колонии и описывают их особенности.
Контрольные вопросы
картофельной болезни хлеба Bacillus subtilis var. mesentericus.
17
18
32
23
24
33
34
93
94
93
94