Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
210
Трансформація (BHK, L)
Старіння та загибель
Гетероплоїдна клітинна лінія (HeLa, KB)
Ат
+
Еритроцити, навантажені Аг
Рис.6.3. Механізм аглютинації навантажених антигеном еритроцитів за допомогою антитіл.
Рис.5.1. Спрощена схема електронного мікроскопу трансмісійного типу. Магнітні лінзи умовно позначені як скляні.
а – мікроскоп з однією конденсорною лінзою та двоступеневим (за допомогою об’єктивної та проекційної лінз) збільшенням;
б - мікроскоп з подвійною конденсорною
інзою та трьохступе
евим збільшення
.
Нормальна диплоїдна клітинна лінія (WIT-38, MRC-5)
Первинна субкультура
Первинна культура
Нормальна тканина
Неопластична тканина
Тканина ембріону чи дорослої особини
Безперервні, постійні клітинні лінії
Розділ 1. Організація вірусологічних лабораторій.
Зміст
Теоретична частина
Основні правила роботи у вірусологічних лабораторіях
Типи вірусологічних лабораторій
Обладнання вірусологічних лабораторій
Правила роботи в базових вірусологічних лабораторіях
Практична частина
Завдання
Хід роботи
Контрольні запитання
Література
Основні правила організації вірусологічної лабораторії базуються на загальних біологічних властивостях вірусів як неклітинної форми життя.
Віруси є автономними генетичними структурами, які можуть функціонувати та репродукуватися в спийнятливих до них клітинах.
Мають субмікроскопічні розміри, облігатні внутрішньоклітинні паразити.
Ці визначення відображають дві суттєвих властивості вірусів: по-перше, наявність у вірусу свого генетичного матеріалу, який використовує біохімічний апарат клітини-господаря, та, по-друге, існування у вірусів позаклітинної інфекційної фази, яка представлена спеціалізованими частками, або віріонами, які репродукуються під генетичним контролем даного вірусу і слугують для введення геному вірусу в інші клітини. Перша властивість наголошує на внутрішньоклітинний паразитизм вірусу, однак він властивий не лише вірусам. У визначенні вірусів підкреслюється особлива природа паразитизму, який можна назвати паразитизмом на генетичному рівні. Виходячи з цього, по-перше, робота з вірусами має проводитись у стерильних умовах, а по-друге, улаштування сучасної вірусологічної лабораторії має максимально забезпечувати ефективні заходи щодо запобігання виходу вірусів в оточуюче середовище і зараження персоналу та населення вірусними інфекціями.
При роботі у вірусологічній лабораторії треба строго дотримуватися правил асептики та антисептики.
Асептика – система профілактичних заходів та прийомів, які попереджають попадання мікроорганізмів та вірусів з оточуючого середовища в організм людини і досліджуваний матеріал, і спрямовані на створення безмікробних умов для запобігання зараженню. Вона передбачає використання стерильних інструментів та матеріалів, обробку рук, дотримання особливих санітарно-гігієнічних правил та прийомів роботи.
Антисептика – комплекс заходів, спрямованих на хімічне та біологічне знешкодження хвороботворних та інших мікроорганізмів та вірусів, щоб запобігти зараженню при попаданні на ушкоджені і неушкоджені ділянки шкіри та слизових оболонок.
При роботі з вірусвмісним матеріалом необхідно забезпечити виконання таких вимог:
Розподіл вірусів на групи за ступенем їхньої небезпеки для людини дозволяє розділити лабораторії на категорії в залежності від того, з якою групою (чи групами) вірусів ведеться робота в тій чи іншій лабораторії.
Для забезпечення можливості роботи з вірусами, що належать за ступенем небезпеки до різних груп, необхідні універсальні багатопрофільні лабораторії.
Всесвітня Організація Охорони Здоров’я (“Руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях”, 1985) запропонувала розділити вірусологічні лабораторії на 3 категорії: 1) базові лабораторії (основні або загального типу); в зв’язку з конкретними особливостями роботи вони можуть бути обладнаними різними захисними засобами та устаткуванням. Це – лабораторії учбові, служби охорони здоров’я, лікарень, діагностичні лабораторії, університетські лабораторії. В них працюють зі збудниками інфекції ІІІ (віруси лімфоцитарного хоріоменінгіту, грипу, поліомієліту, вісповакцини, енцефаломіокардиту) та IV груп (ентеровіруси, риновіруси, аденовіруси, коронавіруси, реовіруси, віруси парагрипу, епідемічного паротиту, кору, червоної висипки, везикулярного стоматиту, герпесу, вітряної віспи, цитомегалії людини), вірусами рослин та бактерій. 2) Режимні лабораторії (ізольовані) або лабораторії утримання. Це – спеціальні діагностичні лабораторії, де працюють зі збудниками інфекцій ІІ групи, а саме арбовірусами, аренавірусами, які не увійшли в І групу, вірусами сказу (дикий штам) та натуральної віспи, вірусами гепатитів В та С, ВІЛ. 3) Лабораторії особливого режиму (максимально ізольовані) або лабораторії максимального утримання. Це – лабораторії для роботи з особливо небезпечними патогенними вірусами І групи, такими як: віруси геморагічних гарячок Ебола та Марбург (родина філовірусів), Ласса, Хунін та Мачупо (родина аренавірусів).
Незалежно від того, до якої категорії відноситься та чи інша лабораторія, проводиться зонування приміщень з метою групування їх в самостійні зони з однаковими рівнями реально присутніх або потенційно можливих професійних ризиків для розподілення цих зон між собою та ізоляції їх від зовнішнього середовища необхідними бар’єрами. Розподіл приміщень за зонами дозволяє найбільш доцільно проводити їх обеззаражування, цільову санітарну обробку персоналу, обробку використаного спецодягу та інших засобів індивідуального захисту, матеріалів та предметів, що передаються між зонами.
Структура вірусологічної лабораторії визначається завданнями та особливостями її діяльності. Проте існує загальний для всіх лабораторій мінімум вимог, без яких неможливе проведення вірусологічних досліджень.
Вірусологічну лабораторію треба розташовувати в місцях, де відсутня вібрація будинку, яка може привести до неспроможності працювати з мікроскопами, оптичними та аналітичними приладами. Не можна розміщувати лабораторію поблизу димових труб, котелень, місць, де можливе забруднення повітря пилом або хімічно активними газами. Це може руйнувати точні прилади, утруднюючи при цьому проведення досліджень.
Вірусологічну лабораторію слід розташовувати у світлому ізольованому приміщенні з окремими входом та виходом.
Площа лабораторії повинна відповідати санітарній нормі – 14 м2 в середньому на одного працівника. Приміщення повинні бути достатньо просторими для безпечного проведення лабораторних досліджень з шириною проходів до робочих місць 1,5 м (рис.1 (кольорова вклейка)).
В структурі базової вірусологічної лабораторії обов’язковими є такі підрозділи: мийна, стерилізаційна та препараторська кімнати, кімнати для вирощування культур клітин, для серологічних досліджень, віварій. В залежності від умов роботи вірусологічної лабораторії доцільно мати термальні та морозильні кімнати. Мийна кімната площею біля 10 м2, з розрахунку 5 м2 на одного працівника, повинна мати прилади для миття посуду та прання білизни, раковини з гарячою та холодною водою, столи, газові та електричні плити, сушильні шафи. Посуд та інструментарій, забруднені інфекційним матеріалом, миють після обеззаражування дезінфекційними речовинами.
В стерилізаційній кімнаті розташовані дистилятор, автоклав, парові стерилізатори, сушильні шафи та інша апаратура для сушіння та стерилізації посуду, інструментарію, одягу, живильних середовищ, води, буферних розчинів. Для кожного парового стерилізатора за правилами техніки безпеки треба відводити площу 7,5 м2.
Препараторська кімната призначена для зберігання посуду, діагностичних препаратів, хімічних реактивів.
Віварій (приміщення для утримання тварин) повинен мати карантинний відділ, кімнати (ізольовані одна від одної з окремими виходами) для здорових та інфікованих тварин з витяжними шафами, для миття та дезінфекції кліток, інвентаря та спецодягу, приготування кормів, кладову, кремаційну та інші.
Кімнати, призначені для роботи з вірусами, повинні мати добре природне і штучне освітлення. Вікна повинні виходити на північ або бути зробленими з матового або молочного скла, оскільки віруси інактивуються прямим сонячним світлом. Ці кімнати повинні складатися з двох відділень – боксу площею не менше 9 м2 та передбокснику площею біля 4 м2, розділених скляною перегородкою з розсувними, а не на петлях дверима, для економії площі та для того, щоб уникнути коливань повітря та запобігти зайвому попаданню повітря в бокс.
Обладнання вірусологічних лабораторій
Крім устаткування та посуду, який використовується в бактеріологічній та хімічній роботі, у вірусологічних лабораторіях обов’язкова наявність спеціального обладнання (рис. 2-8 (кольорова вклейка)).
Для тривалого зберігання в незмінному стані вірусовмісного матеріалу, розчинів, сироваток, вакцин, антигенів тощо, необхідно мати холодильні установки з інтервалом температури від +4С до -170С. Це – камери глибокого та надглибокого заморожування (-30С, -170С), холодильні камери (-20С), холодильники (+4С), холодильні кімнати з внутрішньою температурою до +4С. Для інкубування курячих ембріонів та культур клітин необхідні термостати (сухоповітряні та водяні). Вірусологічній лабораторії необхідні центрифуги на 1500 – 3000 об./хв. для осадження великих часток подрібненого вірусологічного патологічного матеріалу та трипсинізації тканин. Повна очистка вірусів від баластних речовин та їх концентрація здійснюється за допомогою високошвидкісних центрифуг на 30 000 об./хв. і більше з пристроями для охолодження та створення вакууму в робочій камері.
Для зараження та розтину лабораторних тварин та курячих ембріонів і для відбору вірусовмісного матеріалу потрібний набір різних спеціальних інструментів – шприці різних розмірів (туберкулінові на 1 мл, Люера на 2, 5, 10, 20 мл), голки, шпателі, скальпелі, пінцети анатомічні та хірургічні, ножиці, корнцанги, тощо.
Для подрібнення патологічного матеріалу використовують гомогенізатор тканин, фарфорові ступки з товкачиками.
У вірусологічній лабораторії в достатній кількості повинні бути емальовані відра, тази, металеві бікси, бактеріальні фільтри, скляний посуд (бажано з боросилікатного скла); матраси, чашки Карреля, пробірки Лейтона та інший скляний та пластмасовий посуд для вирощування культур клітин, флакони, склянки, колби різного об’єму зі шліфами та без них, круглодонні та плоскодонні, конічні (Ерленмейєра), круглі (Кольрауша), з патрубками (Бунзена – для відсмоктування, Вюрца – для дистиляції), мензурки, бюретки, фарфорові тиглі, чашки Петрі, градуйовані піпетки різного об’єму (1, 2, 5, 10 мл), піпетки Мора, Пастера, мікропіпетки, флакони з пробками, що загвинчуються та притираються, пробірки хімічні, біологічні, серологічні, бактеріологічні, центрифужні, автоматичні (самплери), ампули різних розмірів, ексикатори, воронки, мірні циліндри.
Для постановки серологічних реакцій необхідні полістиролові планшети. В лабораторіях такого типу повинні бути різні терези: хімічні, аналітичні, торсіонні, центрифужні для зрівноваження пробірок. Необхідним обладнанням є мікроскопи різних типів: біологічний світловий, біологічний інвертований, біологічний бінокулярний, біологічний стереоскопічний, люмінесцентний, електронний.
В лабораторії у достатній кількості мають бути різні металеві та пластмасові штативи для пробірок, гумові пробки з силіконової та звичайної гуми різних розмірів (№№ 11,12,14), олівці або чорнила для скла, фільтрувальний папір, лейкопластир, тощо.
Значна кількість всього описаного обладнання використовується у стерильному вигляді. Для цього згідно різних методів обробки інструментарій та посуд, піддають чистці, миттю, дезінфекції та стерилізації.
Сучасні вірусологічні лабораторії мають необхідні прилади та устаткування для проведення експрес-діагностики вірусних інфекцій, а саме імуноферментного аналізу, імунофлуоресцентного аналізу, імуноелектроблотингу, електронної мікроскопії, імуноелектронної мікроскопії, полімеразної ланцюгової реакції.
Правила роботи в учбових вірусологічних лабораторіях
Практична частина
Контрольні питання та контрольні завдання
Література
Розділ 2. дослідження вірусів людини та тварин
Тема 1: Використання лабораторних тварин у вірусологічних дослідженнях
Зміст
Теоретична частина
Цілі використання лабораторних тварин
Переваги та недоліки застосування лабораторних тварин
Види лабораторних тварин
Індикаторні тварини
Гнотобіотичні тварини
Основні правила утримання тварин та догляду за ними
Етапи роботи з тваринами при виконанні вірусологічного експерименту
Застережні заходи при роботі з інфікованими лабораторними тваринами
Практична частина
Завдання
Матеріальне забезпечення
Хід роботи
Методичні рекомендації
Завдання для самостійної роботи студентів
Контрольні запитання
Словник використаних термінів
Література
Не зважаючи на велике різноманіття експериментальних об’єктів, головними серед них у вірусології залишаються лабораторні тварини, курячі ембріони, культури тваринних та рослинних клітин, рослини-індикатори та бактеріальні культури. Відповідно, при дослідженні вірусів людини та тварин найчастіше застосовуються модельні системи із залученням лабораторних тварин, курячих ембріонів та культур тваринних клітин.
Модельними об’єктами (експериментальними або тест-об’єктами) називаються макроорганізми або культури клітин (в тому числі, мікроорганізмів), чиї властивості є достеменно відомими і постійними для представників одного виду (у випадку культури клітин – штаму, популяції або лінії), що дозволяє їх використовувати для дослідження особливостей патогенів невідомої природи.
Цілі використання лабораторних тварин
У вірусологічних дослідженнях лабораторних тварин використовували раніше і використовують сьогодні з різними цілями:
В організмі експериментально уражених тварин звичайно вірус накопичується, що може бути використано в подальшому для його дослідження. Для виділення вірусів придатні лише ті тварини, в яких зараження призвело до чітких клінічних проявів інфекції, патоморфологічних змін або й загибелі. Таких тварин добирають емпіричним шляхом у ході вивчення кожної вірусної інфекції.
Здавна лабораторних тварин використовують для індикації вірусів у патологічному матеріалі, тобто для постановки біопроби. З цією метою суспензією патологічного матеріалу уражують лабораторних тварин та враховують реакцію на ураження. Часто ознаки присутності вірусу в організмі бувають малоспецифічними, тобто помітно, що вірус є (можна провести індикацію вірусу), але не можна зробити висновок про те, який саме це вірус (не можна провести ідентифікацію збудника). Прикладом можуть слугувати типові симптоми ураження верхніх дихальних шляхів дослідних тварин, які можуть індукуватися як аденовірусами, так і ортоміксо-, параміксо-, герпес-, риновірусами. Однак бувають випадки, коли біопроба супроводжується характерними клінічними проявами, які є специфічними для конкретного захворювання. В такому випадку можна зробити висновок не лише про наявність вірусу, але й про його видову приналежність.
Лабораторних тварин також застосовують в якості індикатора вільного вірусу при постановці реакції біологічної нейтралізації.
В лабораторіях часто є потрібним підтримання вірусів протягом багатьох років в активному стані. По суті, підтримання вірусу є чергуванням пасажів вірусу на живих системах, в тому числі на лабораторних тваринах, та його збереженні в законсервованому стані. При будь-якому способі консервації віруси з тою чи іншою швидкістю втрачають свою активність. Новий пасаж дозволяє її відновити. Під пасажем розуміють зараження чутливої тварини з метою отримання від неї нової популяції вірусу. Такий вірус в подальшому знову зберігають у консервуючих умовах.
При роботі з вірусом потрібно також знати його інфекційний титр, тобто його відносну концентрацію у матеріалі (під титром також розуміють таку мінімальну концентрацію вірусу, яка ще здатна викликати позитивну реакцію у 50% тест-об’єктів). Титр можна визначити за допомогою ураження чутливих модельних об’єктів різними розведеннями вірусовмісного матеріалу. Іншими способами вираження відносної концентрації вірусу є інфекційна доза-50 (ID50), летальна доза-50 (LD50) та деякі інші. Відповідно до визначення титру, ID50 є такою дозою вірусу, яка викликає специфічні прояви інфекційного захворювання у 50% інфікованих дослідних тварин. Аналогічно, LD50 є такою дозою вірусу, що індукує загибель 50% інфікованих дослідних тварин.
Переваги та недоліки застосування лабораторних тварин
При роботі з лабораторними тваринами потрібно знати ряд негативних особливостей їх використання. Порівнюючи їх з двома іншими експериментальними модельними об’єктами вірусологічних досліджень, а саме курячими ембріонами та культурами клітин, слід зауважити, що утримання тварин протягом експерименту (закупівля, годування та ін.) є відносно дорогим.
Крім того, тварини більш трудомісткі в роботі, завдають багато клопоту з утриманням (прибирання, дезінфекція приміщень тощо), при експериментах на тваринах не так швидко одержуються результати дослідів.
Також існує небезпека інфікування обслуговуючого персоналу та створення аварійних ситуацій (укуси, подряпини).
До негативних факторів при роботі з тваринами відноситься незнання епізоотичного минулого тварин, які залучаються до експерименту. Наявність безсимптомних інфекцій у таких тварин може призвести до зменшення або навіть до зникнення чутливості до досліджуваних вірусів, тобто до резистентності, внаслідок явища інтерференції, що ускладнює проведення експерименту. Можливий і протилежний ефект, а саме виникнення явища синергізму в дії двох вірусів (прихованого та досліджуваного), що іноді дає результати, які важко правильно інтерпретувати.
Так, тільки у 10 видів лабораторних тварин, які найбільш часто використовуються у вірусологічних дослідженнях, можуть бути понад 30 природних інфекційних хвороб, небезпечних для людини, причому не тільки вірусної етіології (табл.2.1.).
З латентних інфекцій лабораторних тварин вірусної етіології значне розповсюдження має ектромелія (віспа) білих мишей, збудник якої відноситься до родини поксвірусів. Хвороба проявляється некротичним запаленням лап, а при генералізації інфекції – осередками некрозу в печінці та селезінці. Друга група латентних інфекцій лабораторних тварин – це вірусні пневмонії, збудником яких часто є вірус Сендай, який відноситься до родини параміксовірусів. Третя група вірусних латентних інфекцій – нейроінфекції з такими симптомами як судоми, парези, паралічі. До них відносяться лімфоцитарний хоріоменінгіт білих мишей, енцефаломієліт білих мишей та латентні вірусні енцефаліти інших видів лабораторних тварин. В разі виявлення безсимптомної інфекції у тварин доцільно піддати їх обробці кортизоном.
Таблиця 2.1.
Природні інфекційні хвороби
деяких лабораторних тварин, збудники яких є патогенними для людини
|
Вид тварин |
Назва хвороби |
|
Білі миші |
Сальмонельози, лістеріоз, псевдотуберкульоз, лімфоцитарний хоріоменінгіт |
|
Білі пацюки |
Сальмонельози, псевдотуберкульоз, лістеріоз, геморагічна гарячка з нирковим синдромом |
|
Хом’яки |
Чума |
|
Мурчаки |
Лістеріоз, туберкульоз, псевдотуберкульоз |
|
Кролі |
Сальмонельози, лістеріоз, туляремія, псевдотуберкульоз |
|
Собаки |
Сказ, лептоспіроз, туберкульоз |
|
Кішки |
Сказ, туберкульоз |
|
Мавпи |
Туберкульоз, дизентерія, віспа мавп, гарячка Марбург, вірус В (Herpesvirus simiae), інфекційний гепатит А, сальмонельози, меліоідоз, лептоспіроз, туляремія, сказ, кір, псевдотуберкульоз |
|
Ембріони птахів |
Сальмонельози, віспа курей |
Внаслідок вищенаведених причин, практично в усіх лабораторіях діагностики лабораторні тварини та курячі ембріони поступилися місцем культурам клітин, які набагато простіше утримувати та які надають дослідникам більших можливостей.
Разом з цим, у багатьох видах лабораторних досліджень лабораторні тварини, як і раніше, відіграють головну роль. Так, для деяких вірусів людини, наприклад вірусу гепатиту В, використовуються примати, оскільки для даного вірусу невідомі приклади реплікації ні в організмі інших тварин, ні в культурі клітин. При вивченні онкогенних вірусів широко використовуються хом’ячки, оскільки вони є високочутливими до даних вірусів, які легко викликають утворення пухлин у цих модельних об’єктів, що дозволяє отримати відповідні антисироватки. Новонароджені миші використовуються для виділення вірусів Коксакі та дослідження арбовірусів. Крім цього, експерименти по вивченню механізмів патогенезу та ролі імунної відповіді можуть бути проведені лише на лабораторних тваринах. Нарешті, у зв’язку з надзвичайно широким застосуванням у вірусології серологічних методів дослідження, лабораторні тварини (особливо кролики, миші, пацюки та примати) інтенсивно використовуються для отримання діагностичних антисироваток.
Види лабораторних тварин
Головними критеріями вибору лабораторних тварин у вірусологічний експеримент є їх сприйнятливість до досліджуваного вірусу та безпосередньо мета експерименту. Найчастіше використовуються білі миші, пацюки, мурчаки, кролики та собаки.
Миші. Для вірусологічних досліджень дуже широко використовуються білі миші (альбіноси сірої домашньої миші) інбредних ліній. Останніх одержують в результаті спарювання братів з сестрами, або батьків з дітьми протягом щонайменше 20 поколінь. У таких тварин досягається високий ступінь гомозиготності, вони мають генетичну одноманітність, менш мінливі, високочутливі до певних вірусів. Ці властивості частково закріплені у них генетично, тому на віруси вони реагують досить одноманітно. Вага тварин визначається умовами досліду і коливається в межах 8-18 г . Особливу роль грають новонароджені миші вагою 1-2 г, тільки на них культивують певні віруси (наприклад, ящур, Коксакі). Широкого використання також набули „високоракові” лінії мишей, у яких у 60-95% випадків виникає рак молочних залоз: А (альбіноси), С3Н (сірі), С3НА (темно-сірі), ДВА (блідо-коричневі); та „низькоракові”, у яких спонтанні пухлини молочних залоз зустрічаються дуже рідко: СВА (сірі), BALB (альбіноси), С57Br (коричневі), СС57 (білі).
Пацюки. Дуже цінні лабораторні тварини, стійкіші за мишей до певних інфекцій. Найбільш плодючі серед лабораторних тварин. Використовують білого пацюка (альбіноса сірого пацюка), чорного, тощо. У пацюків теж створені інбредні лінії. Новонароджених тварин використовують в дослідженнях з онкогенними вірусами. Внаслідок сприйнятливості до багатьох вірусних інфекцій пацюки є універсальними тваринами, придатними практично для всіх цілей вірусологічних досліджень.
Хом’яки. Для вивчення вірусів створена інбредна лінія сірійського золотистого хом’яка. При роботі з онкогенними вірусами використовують новонароджених тварин. Цінні лабораторні тварини для дослідження кацерогенезу, викликаного аденовірусною інфекцією.
Мурчаки. У вірусологічних дослідженнях найбільш цінними є гладкошерсті породи мурчаків: голандська, гімалайська, агуті, тощо. Мурчаки голандської породи мають біло-коричнево-чорно-сіре забарвлення шерсті. Шерсть коротка, рівна, гладка, щільно прилягає до тіла. Вони відзначаються плодючістю, швидким ростом та стійкістю до захворювань. Гімалайські мурчаки мають чорне або коричневе забарвлення мордочки, вух та передніх лапок. Мурчаки породи агуті мають шерсть двох відтінків: золотисто-коричневий (золотисті агуті) та сірий (сірі агуті). Мурчаки використовуються з різноманітними цілями у вірусологічних дослідженнях. Вони незамінні при постановці реакції зв’язування комплементу, де використовується їх сироватка (комплемент).
Тхорі. Використовуються в дослідах не дуже часто через стійкість до багатьох вірусів людини та тварин.
Кролики. Основні тварини різноманітних вірусологічних досліджень. Рекомендується працювати в основному з чистопородними тваринами з метою одержання стійких результатів. Існує багато стандартних порід кроликів, які дають можливість великого вибору: Шиншила сріблясто-сірого кольору з блакитним відтінком та коричневими очима; віденський блакитний сизого кольору з блакитним відтінком та темно-блакитними очима; віденський білий білосніжного блискучого кольору та блакитними очима; білий велетень білого кольору та червоними очима; Аляска чорного кольору та коричневими очима; Гавана коричневого кольору. Кролики порід Шампань, російський горностаєвий, короткошерстий та ангорський рідко використовуються у вірусологічному експерименті. Кролі чистих порід більш чутливі до наркозу, серйозних операцій та інфекцій. Використовують кроликів різного віку та ваги в залежності від цільового призначення.
Собаки. У вірусологічних дослідженнях найчастіше використовуються вівчарки, такси, дворняжки, гончі, лайки. Рекомендується використовувати собак міцних, середньої величини з гладким волосяним покривом, спокійного норову.
Кішки. Для вірусологічних досліджень використовують рідко, відбирають кішок короткошерстих порід.
Мавпи. Дуже цінні лабораторні тварини для вирішення ряду теоретичних та практичних питань вірусології. Об’єктами досліджень виступають віруси інфекційного гепатиту А, кору, віспи, імунодефіциту людини та ін. Найчастіше використовують індійських макак-резусів, філіппінських макак та африканських зелених мартишок, рідше – яванських макак, макак лапундер, павіанів, гамадрилів та шимпанзе.
Кури. Серед великої кількості порід курей слід назвати такі: італійська куріпкова (чисто несуча порода, придатна для щеплень, більш стійка і менш вибаглива, ніж леггорн), леггорн (несуча порода, придатна для щеплень), родлендер (чисто несуча порода), віандот (несуча порода), суссекс (несуча порода), світла брама (як донор крові). Слід використовувати чистопородних птахів. Вік курей визначається метою досліджень. Курячі ембріони використовуються для культивування вірусів грипу, парагрипу, віспи курей та ін., для одержання клітинних культур, а дорослі кури - як донори крові для серологічних реакцій, з діагностичною метою, для випробування вакцин, тощо.
Каченята. Використовуються у віці 1-10 днів для постановки біопроби з вірусами, що викликають хвороби качок та каченят.
Коні. Єдина модель при роботі з вірусами інфекційної анемії коней та енцефаломієліту коней.
Свині. Використовують підсвинків у віці 2,5-5 місяців при роботі з вірусами чуми та віспи свиней. Молодих свиней та поросят беруть для біопроби при хворобі Тешена та інфекційного гастроентериту свиней.
Телята. При вивченні ряду вірусних хвороб телят, таких як ентеровірусних інфекцій, використовують тварин у віці від декількох днів до декількох місяців.
Слід сказати, що при виборі лабораторних тварин до вірусологічних експериментів користуються правилом необхідного та достатнього, тобто намагаються вирішувати поставлені задачі найбільш економічно виправданим шляхом. Тому до абсолютної більшості дослідів залучаються миші, пацюки та кролики, рідше хом’яки, мурчаки та собаки. При цьому існують випадки, коли дослідження конкретного вірусу вимагають залучення інших лабораторних тварин, оскільки вищеназвані можуть не бути сприйнятливими до даного вірусного захворювання або ж не відповідати поставленим цілям експерименту.
Так, наприклад, якщо метою дослідження є вивчення патогенезу захворювання, спричиненого вірусом грипу, то для цього цілком достатньо використання пацюків. Коли ціллю є отримання специфічної антисироватки до даного вірусу, то доцільніше використовувати кролів внаслідок їх ефективної імунної відповіді на більшість вірусів та порівняно великого об’єму антисироватки, яку від них можна отримати (хоча і миші, і пацюки теж можуть бути використані з цією метою, але об’єм антисироватки буде у цьому випадку у декілька разів менший). Для постановки реакції зв’язування комплементу доцільно використовувати мурчаків для отримання сироватки, а при вивченні онкогенних вірусів – „високоракових” мишей або хом’яків. При дослідженні дії лікарських речовин для людини найчастіше використовують собак, свиней та мавп внаслідок високої подібності фізіології їх організмів до організму людини.
Крім того, є віруси, дослідження яких можливе лише з участю тих лабораторних тварин, які є господарями відповідних вірусів у природі. До таких тварин відносять собак (вірус чуми собак, вірус сказу), свиней (вірус інфекційного гастроентериту свиней та ін.), коней (вірус інфекційної анемії коней, вірус енцефаломієліту коней), каченят, телят. Разом з цим, цих тварин порівняно рідко застосовують для інших цілей.
Для виявлення вірусів в певному середовищі використовують “сторожові” тварини (sentinel animals), тобто такі, що залишаються у приміщеннях з метою визначення інфекційного агенту. Цілі використання “сторожових” тварин різні. Наприклад, їх вселяють в приміщення (свинарники, скотні двори, пташники) для перевірки відсутності вірусів після ліквідації інфекції та проведеної там дезінфекції. В лабораторіях “сторожові” тварини можуть служити для виявлення втрати (витоку) вірусу. Цей метод виявлення вірусу з використанням “індикаторних” або “детекторних” “сторожових” тварин грає велику роль в епізоотологічних та епідемічних дослідженнях. Для цього сприйнятливих тварин на певний час розміщують в їхньому середовищі існування для природного зараження (через укуси комахами, тощо) і спостерігають за ними. В подальшому їх переводять в лабораторні умови і досліджують. Поза межами вірусологічних експериментів „сторожових” тварин (найчастіше пацюків та кролів) можуть використовувати на хімічних підприємствах з виробництва речовин, небезпечних для життя людини, а також в місцях зберігання хімічної та біологічної зброї масового знищення для виявлення можливого витоку токсичних речовин чи організмів.
Гнотобіоти (гнотобіонти) – це безмікробні тварини, які широко використовуються у вірусологічних дослідженнях за рахунок того, що, по-перше, вони, як правило, вільні від збудників латентних вірусних інфекцій, що перешкоджають результатам досліджень за причиною інтерференції. По-друге, вони більш чутливі до вірусних інфекцій, ніж звичайні тварини. По-третє, вони найбільш стандартні. По-четверте, саме цих тварин доцільно використовувати при виділенні вірусів з нез’ясованими хвороботворними властивостями.
За визначенням Luckey (1967), гнотобіоти – це макроорганізми, які не містять життєздатних мікроорганізмів одного або декількох видів, відомих досліднику. За зовнішнім виглядом гнотобіоти не відрізняються від звичайних тварин. Проте в гнотобіологічних ізоляторах, де утримуються безмікробні тварини, та під час їхнього розтину відсутній специфічний для даного виду тварин запах. Крім того, вони більш стійкі до впливу рентгенівських променів, мають підвищену радіорезистентність. Життєві процеси у безмікробних лабораторних тварин (морфологія, фізіологія, обмін речовин, резистентність, захисна реакція, патологія, тощо) значно відрізняються від таких у звичайних тварин. Найбільш помітні зміни стосуються функцій шлунково-кишкового тракту, де відсутня нормальна мікрофлора, збільшення ваги печінки, нирок, надниркової залози та недорозвинення імунно-захисних механізмів (гіпоплазія та зменшення ваги лімфатичних вузлів та тімусу, відсутність глобулінпродукуючих клітин, майже восьмикратне зменшення кількості імуноглобулінів, тощо). Утворення антитіл або відсутнє, або відбувається в незначній мірі.
Перші вдалі спроби отримати безмікробних тварин належать Нутталю та Тірфельдеру, яким в 1895 році вдалося одержати та утримувати в стерильних умовах мурчаків. В 1912-1913 роках безмікробні курчата, пуголовки та мухи були отримані М.Коенді та Е.Вольманом в лабораторії І.І.Мечнікова. Тривалість життя перших безмікробних тварин була недовга (2-3 тижні) внаслідок недосконалості методики вирощування та неповноцінністю стерильної дієти. Становлення гнотобіології як самостійної галузі біології відноситься до 60-х років ХХ-го століття, коли цих тварин почали отримувати в Японії, Нідерландах, СРСР, Швеції, Бельгії, США, ФРН, Чехословаччині, Франції комерційним шляхом.
На сьогоднішній день безмікробних птахів одержують шляхом інкубації яєць зі стерильною шкаралупою в стерильному інкубаторі. Стерильних ссавців отримують кесаревим розтином вагітних тварин, або видаленням матки (гістеректомія) та вирощуванням “новонароджених” в стерильних ізоляторах. Утримують гнотобіотів в гнотобіологічних ізоляторах з мікрокліматом при наявності двох шлюзів: повітряного (аерошлюз) та рідинного (гідрошлюз). Через шлюзи за допомогою контейнерів в ізолятор вводять посуд, харчі, повітря, воду, хірургічний інструментарій, клітки та всі інші простерилізовані матеріали. Одержаних стерильних тварин тримають на молочно-кислій дієті для наявності певної кишкової флори, яка зберігає їхню специфічну апатогенність. Приміщення гнотобіологічного ізолятору стерилізують газами. Таким чином, отримання та утримання гнотобіотів на всіх етапах роботи здійснюється повністю в стерильних умовах.
За динамікою росту безмікробні тварини діляться на 3 групи:
І – мавпи, поросята, курчата – ростуть краще, ніж звичайні тварини, або однаково з ними;
ІІ – пацюки, миші, собаки, кішки – ростуть нарівні зі звичайними тваринами;
ІІІ – мурчаки, кролики, козенята, ягнята – ростуть гірше звичайних тварин.
Розрізняють два види гнотобіотів: стерильні тварини та гнотофори. Стерильні тварини – це макроорганізми, які не мають ніяких життєздатних мікроорганізмів, які можна виявити. Гнотофори – це макроорганізми, які є носіями тільки одного виду життєздатних мікроорганізмів (моногнотофори в дибіотичній системі), двох (дігнотофори в трибіотичній системі) або декількох (полігнотофори в полібіотичній системі).
Особливе місце серед гнотобіотів займають SPF-тварини (від нім. Spezifisch pathogenfrei), які вільні тільки від патогенних мікроорганізмів. В їхньому організмі є всі необхідні для нормальної життєдіяльності бактерії та віруси, які в сукупності створюють групу так званої резистентної (корисної) мікрофлори. На сьогодні одержані SPF (СПФ)-тварини: пацюки, мурчаки, кролики, поросята, птахи та інші. На відміну від гнотобіотів, які є експериментальною моделлю, СПФ-птахи та свині в ряді країн стали основою для створення племінних та товарних ферм, вільних від інфекційних хвороб.
Основні правила утримання тварин та догляду за ними
Головними вимогами до утримання лабораторних тварин є забезпечення дотримання всіх фізіологічних норм тварин, а також попередження перезараження тварин та розповсюдження інфекції в межах віварію.
До фізіологічних вимог роботи з лабораторними тваринами відносять фізичні параметри мікроклімату приміщень віварію, де утримуються тварини (температура, вологість, повітрообмін, рівень шуму та ін.), розміщення тварин у клітках віварію та годування тварин. Крім того, особлива увага приділяється карантину тварин та профілактиці канібалізму.
Мікроклімат у приміщеннях, де утримуються лабораторні тварини, повинен бути в межах існуючих норм (табл.2.2.) протягом доби незалежно від сезону. Висока температура та мала рухливість повітря в поєднанні з великою вологістю гальмують тепловіддачу і викликають перегрівання організму. При цьому тварини стають мляві, у них зменшується апетит, знижується стійкість до інфекційних та неінфекційних захворювань, гальмується обмін речовин. Негативно впливає на тварин і висока вологість у поєднанні з низькими температурами. Газовий склад повітря приміщень для тварин залежить від санітарно-технічного обладнання, кількості тварин та щільності їх посадки в клітках. При недостатньому повітрообміні в приміщенні зменшується вміст кисню, збільшується вміст вуглекислого газу, аміаку, сірководню, клоачних газів та інших продуктів бродіння та гниття органічних речовин, що негативно позначається на тваринах.
В приміщеннях для утримання тварин не повинно бути шуму від приладів, засобів механізації, голосів, недбалого поводження з інвентарем (допустимий рівень – не більше 70-85 Дб). Як періодичний, так і повсякденний шум негативно позначається на стані здоров’я тварин, впливає на серцево-судинну, нервову та імунну системи, дихання, теплообмін.
У віваріях розповсюджена переважно кліткова система розміщення лабораторних тварин. Для утримання лабораторних тварин використовують клітки різних конструкцій, виготовлених з дерева, скла, алюмінію, жерсті, тонких металевих листів, міцних сортів фанери, плексигласу, пластмас.
Таблиця 2.2.
Показники мікроклімату в приміщеннях для лабораторних тварин
|
Вид тварини |
Температура (°С) |
Максимально допустима концентрація в повітрі |
Кратність повітрообміну (об’єм за годину) |
Освітлення |
|||
|
Межі коливання |
Середнє значення |
аміаку, мг/л |
вуглекислоти, % до об’єму |
витяжка |
приток |
||
|
Миші |
18-26 |
22 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
Напівморок |
|
Пацюки |
20-24 |
22 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
- “ - |
|
Хом’яки |
18-26 |
22 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
- “ - |
|
Мурчаки |
16-23 |
20 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
Денне світло |
|
Кролики |
14-18 |
16 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
- “ - |
|
Собаки |
18-22 |
20 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
- “ - |
|
Кішки |
18-22 |
20 |
0,01 |
0,15 |
8 |
10 |
- “ - |
|
Мавпи |
20-30 |
25 |
0,01 |
0,15 |
10 |
15 |
- “ - |
У вірусологічних дослідженнях найчастіше використовують скляні банки та цільнометалеві клітки завдяки зручності миття та дезінфекції. Незалежно від конструкції кожна клітка обов’язково повинна мати піддон, що виймається, де збираються залишки їжі, калу та сечі. В якості підстилки використовують матеріали, що абсорбують вологу та пристосовуються тваринами для будування гнізд (пісок, полова, сіно, солома, торф’яна крихта, стружка та тирса різного розміру, та ін.).
Дрібних лабораторних тварин та птахів розміщують в клітках на стелажах в 3-4 яруси (перший на відстані 30-70 см від підлоги), дотримуючись рекомендованої густоти посадки, яку обраховують з розрахунку 1 г маси тіла тварини на 1 см3 для клітки (табл.2.3.).
Мурчаків розміщують в звичайних сітчастих металевих клітках по 2-3 тварини. Кроликів бажано утримувати по одному в клітці в прохолодному неопалюваному приміщенні.
Таблиця 2.3.
Густота посадки в клітках лабораторних тварин та птахів
Видтварин |
Мінімальна площа дна клітки на одну тварину, см2 |
Максимально допустима кількість тварин в клітці |
Число тварин на 1 м2 площі підлоги приміщення |
|
Дорослі |
Молодняк |
|||
Миші |
40 |
15 |
65 |
240 |
Пацюки |
150 |
10 |
20 |
100 |
Хом’яки |
100 |
5 |
30-40 |
30-40 |
Мурчаки |
300 |
5 |
5-18 |
5-18 |
Кролики |
2000 |
1 |
3-4 |
3-4 |
Кішок, які часто хворіють лише від одного перебування в обмеженому просторі приміщення клітки, краще тримати в окремих кімнатах, або вольєрах з настінними лавами-лежанками на різній висоті. Собак розміщують по одній в окремих кабінах-боксах, даючи можливість вільно рухатися. Невеликих мавп, як макака-резус, також розміщують по одній в клітках розміром 1,51,51,5м. Великих мавп розміщують в кімнатах-вольєрах.
Важливо зберігати чистоту приміщень, кліток та посуду. Не можна переставляти годівниці, поїлки. Двічі на рік треба проводити повну дезінфекцію приміщення. У випадку епізоотії захворілих тварин ізолюють від здорових і віварій переводять на карантин. Трупи померлих тварин в секційній кімнаті розтинають, вивчаючи патологічний матеріал, а потім разом з підстилкою спалюють в кремаційній печі.
Поняття “карантин” було введено з 14 століття для боротьби з чумою, коли на віддалений острів висаджували на 40 днів екіпажі кораблів, а вже потім доставляли на острів Сицилію (від італ. “каранта” – “сорок”).
Експериментальних тварин розводять у спеціальних розплідниках. Лише невелика їх кількість знаходиться у віваріях при вірусологічних лабораторіях. Ті тварини, що заново надходять у віварій, спочатку витримуються в карантинному відділенні. Під час карантину у тварин можуть проявитися різні захворювання: чи латентні, чи ті, що були в інкубаційному періоді, чи ті, що тварина здобула під час транспортування в результаті переохолодження.
Згідно “Ветеринарному законодавству України”, для тварин встановлюються наступні строки перебування в карантині: для собак – 30 днів, білих мишей та пацюків – 10 днів, всіх інших тварин – 21 день. Для мавп та тварин, які проживають в надто відмінних умовах, строки карантину та адаптації збільшуються до 2-3 місяців. В ці проміжки часу укладається тривалість інкубаційного періоду тих захворювань, на які частіше хворіють тварини.
Тварини повинні забезпечуватися регулярним годуванням та питною водою. Годування повинно бути повноцінним за хімічним складом та достатнім за кількістю. Корм тварин повинен містити всі речовини, необхідні для нормального перебігу процесів життєдіяльності, тобто білки, жири, вуглеводи, мінеральні солі та вітаміни. Для різних видів тварин існують певні кормові норми, раціони та режим годування. При нестачі води порушуються фізіологічні та біохімічні процеси в організмі, затримується ріст, знижується резистентність до інфекцій, виникають патологічні зміни.
Правильна організація повноцінного годування в поєднанні з оптимальними умовами утримання забезпечує добрий загальний стан, ріст, розвиток та розмноження тварин. Вона підвищує стійкість тварин до захворювань, зміцнює їхню імунну систему і, як наслідок, грає значну роль у високоякісному проведенні вірусологічних досліджень.
Нерідко у лабораторних тварин (мишей, пацюків, кролів, тощо) спостерігається канібалізм. Причини його можуть бути різноманітними (табл.2.4.).
Таблиця 2.4.
Причини канібалізму та заходи його профілактики
|
Причини канібалізму |
Заходи профілактики |
|
Поїдання самками новонароджених при перевантаженні приплодом (або при малій кількості молока) |
Частину приплоду пересаджують до іншої самки з малим приплодом |
|
Поїдання приплоду старими самками або тими, які народили вперше |
- “ - |
|
Поїдання приплоду іншими тваринами виду при голодуванні чи дефіциті води (навіть протягом 4-6 год) |
- “ -, вчасне постачання їжі та води |
|
Поїдання самками мертвонароджених |
Своєчасне видалення мертвонароджених з гнізда |
|
Поїдання собі подібних після заміни підстилки в гнізді (зникає природний запах і з’являється незнайомий) |
Частину підстилки потрібно залишати для підтримання запаху |
|
Канібалізм при перенаселенні клітки |
Розселення тварин у декілька кліток |
|
Канібалізм може мати місце при появі на тваринах сторонніх запахів (особистий запах людини, гумових рукавичок, ефіру, йоду, спирту тощо) внаслідок проведення експерименту |
Тварин потрібно брати стерильними інструментами (пінцетом, корнцангом). Для знищення запаху спинку дитинчат змащують камфорою, сечею, вагінальними виділеннями матері. Перед взяттям новонародженого з клітки руки можна обтерти пухом з гнізда, а перед поверненням змастити його та ніс матері етанолом. |
Тварин, які схильні до канібалізму, обов’язково вибраковують з експерименту.
Етапи роботи з тваринами при виконанні вірусологічного експерименту
Залучення будь-яких тварин до вірусологічного експерименту вимагає обов’язкового виконання конкретних кроків. До необхідних етапів роботи з лабораторними тваринами відносять:
Підбір лабораторних тварин
Для вірусологічних досліджень підбирають тварин, які повинні відповідати наступним вимогам:
При виборі віку тварини потрібно мати уяву про поняття “статева зрілість” та “зрілість тіла”. Статева зрілість – це досягнення твариною віку, при якому з’являються і проявляються статеві цикли. Зрілість тіла – це стан тварини, коли скінчився ріст кісток її скелету і формування внутрішніх органів.
В експерименті повинна бути задіяна певна кількість тварин для проведення статистичної обробки результатів (мінімум три).
У конкретному експерименті потрібно використовувати тварин одного визначеного виду і, навіть, певної породи. Для стандартизації умов проведення експерименту бажано використовувати тварин однакового віку, ваги та статі.
Обстеження та підготовка тварин до досліду
Більшість вірусів різних таксономічних груп можуть бути розмежовані одна від одної на основі їхнього спектру патогенності для різних видів тварин або для різних вікових категорій одного й того ж виду тварин, їхньої статі, ваги, тощо. Саме тому при підборі тварин у вірусологічний дослід проводять обстеження їх анатомічних та фізіологічних особливостей для контролю стану тварин.
Спочатку проводять спостереження за поведінкою тварини. Здорова тварина пересувається по клітці, п’є воду, приймає їжу, доглядає за собою згідно її виду та віку. Захворіла тварина пересувається мляво, слабко реагує на зовнішні подразнення і навіть на присутність їжі. Іноді вона, навпаки, бурхливо реагує і може бути агресивною. Таке збудження, якщо воно не є характерною ознакою якогось захворювання, через деякий час змінюється пригніченим станом.
Вік тварин визначають, головним чином, за станом зубів, шерсті та кігтей (пазурів). Наприклад, вік собак визначають за стертими коронками різців (в 5-річному віці) і всіх інших зубів (до 10-12 років). Про вік кроликів, мурчаків, пацюків, мишей можна судити за їх зовнішнім виглядом. У старих тварин шерсть рідка, без блиску, кігті (пазурі) викривлені, очі тьмяні, на зубах коричневий чи жовтий наліт.
Наступним етапом обстеження є огляд зовнішніх ознак тварини. Насамперед звертають увагу на стан волосяного покриву. У здорових тварин шерсть гладка, блискуча, щільно прилягає до тіла. У захворілої тварини шерсть неблискуча, ламка, скуйовджена, іноді набуває жовтуватого відтінку та неприємного запаху. Шкіра здорової тварини гладка, еластична; зібрана в складку, вона швидко й легко розправляється. Шкіра хворої тварини, зібрана в складку, розправляється повільно, іноді вона патологічно змінена. Видимі слизові оболонки у здорових тварин блідо-рожевого кольору, помірно зволожені, а у хворих – молочно-білого, яскраво-рожевого або червонуватого кольору, іноді вкриті серозним або гнійним слизом.
Характеризує стан тварини розміри та маса її тіла. Довжину тіла у великих та середніх тварин вимірюють антропометрами. У собак звертають увагу на їх екстер’єр: форму голови, довжину морди, особливості прикусу зубів, стан мочки носу (у здорових тварин вона завжди волога та холодна), вид шиї, спини, тощо. Часто роблять проміри окремих частин тіла.
У дрібних гризунів без патології маса щоденно збільшується. У великих тварин вона залежить від віку, годування, умов утримання та стану здоров’я. Тварину перед початком експерименту зважують 2-3 рази з інтервалом у 3-5 днів. Тварин, у яких маса тіла не збільшується, в експеримент не беруть. Встановити масу тіла тварин необхідно також для обчислення дози зараження, тому що вона вимірюється кількістю вірусу на одиницю ваги тіла. Крім того, є віруси, продуктивна інфекція яких призводить до зміни ваги тіла тварин. Тварин, які знаходяться в умовах тривалого експерименту, зважують 1 раз в 7-10 днів в одну і ту ж пору доби до прийняття їжі.
Наступним етапом підготовки тварин до експерименту є вимір температури тіла, який здійснюється методом ректальної термометрії. Цей показник змінюється протягом доби (вранці температура нижча), тому треба міряти температуру в один і той же час. На температуру впливають пора року та вік тварини. У дрібних лабораторних тварин у віці до 1 місяця температура тіла відповідає температурі зовнішнього середовища, коливання якої змінює температуру тіла. Не можна вимірювати температуру тварин зразу ж після їх транспортування, тому що в них в результаті цього розвивається так звана “транспортна хвороба”, яка супроводжується підвищенням температури тіла, слабкістю, адинамією. Через декілька годин ознаки її зникають і показники температури повертаються до норми. Крім того, у собак ця незвична процедура може викликати емоційний шок, результатом якого є підвищення температури тіла. В таких випадках тварину треба заспокоїти і через 20-30 хв. знову зробити термометрію. Для проведення термометрії медичний, ветеринарний або дитячий термометр зберігається в дезінфекційному розчині (10%-й розчин лізолу або денатурований спирт). Перед використанням його струшують, обтирають ватою та змащують ділянку, яка буде вводитися, вазеліном або несолоним жиром. Термометр вводять легким обертаючим рухом в просвіт прямої кишки на певну глибину: наприклад, мурчакам – на 3,5 см, собакам – на 3-4 см. Для дотримання цієї умови на скляний стовпчик одягають обмежувач – гумове кільце. Значне підвищення температури у собак, кроликів та мурчаків легко виявити, якщо доторкнутися рукою до вух та носу тварин.
Закінчивши огляд тварини та обстеження її поведінки, потрібно перевірити функціонування окремих систем життєдіяльності організму тварини.
Для цього підраховують частоту та тип дихання, його ритмічність. Частоту дихання у тварин встановлюють шляхом підрахунку числа вдихів та видихів протягом 1 хв. На неї впливають вік, темперамент, вагітність, температура та вологість повітря, ступінь наповнення шлунково-кишкового тракту, збудження, тощо. У всіх тварин дихання змішаного грудочеревного типу. Патологічні процеси можуть змінювати тип дихання на грудний або на черевний.
Серцево-судинну систему обстежують, аналізуючи характер пульсу, серцевий поштовх, межі та тони серця, ритм серцевих скорочень. Пульс підраховують шляхом пальпації протягом 1 хв.
Основі показники нормальної життєдіяльності різних видів тварин наведені в таблиці 2.5.
Маркування лабораторних тварин
При виконанні вірусологічних досліджень виникає необхідність мітити тварин для їх подальшого впізнання протягом експерименту. Запропоновано цілий ряд методичних прийомів мічення, а саме: татуювання, використання радіопередавачів, мічених атомів, різнокольорових фарб, тощо.
Таблиця 2.5.
Основні показники нормальної життєдіяльності різних видів тварин
|
Вид тварини |
Частота пульсу за 1хв. |
Число дихальних рухів за 1хв. |
Коливання нормальної температури (C) |
Вага дорослої тварини, |
Тривалість життя, роки |
|
Мавпа Собака Кішка КроликМурчак Пацюк Миша Хом’як |
140-240 (60-70) 90-140 120-180 140-360 250-355 286-500 520-780 120-220 |
15-30 10-30 20-30 50-100 80-130 110-150 140-210 110-140 |
37,5-39,0 37,5-39,0 38,0-39,5 37,7-39,8 37,3-39,5 37,5-39,5 37,0-39,0 |
5-30 30-40 3,5-4,5 2,5-6,0 0,5-1,0 0,3-0,45 0,02-0,05 0,15-0,18 |
дуже варіює 12-20 11-15 8-12 7-8 3-4 2-3 1-5 |
Для кольорового маркування за методом Тойффеля потрібний тільки один барвник для позначки 1 000 тварин. Подумки треба уявити спину тварини, розділену на 9 рівних частин, утворених трьома поздовжніми та трьома поперечними смугами. Ліва смуга використовується для позначення сотень, середня - для позначки десятків, а права - одиниць. Позначки у вигляді плям та смуг наносяться за певною схемою (рис.2.4, 2.5).
Загальним недоліком методів кольорового позначення є нестійкість барвників під час тривалих дослідів – вони знебарвлюються. Найкращим є пікринова кислота, що тримається на шерсті тварин протягом 2-3 місяців.
|
Рис.2.1. Компостерні щипці для таврування вушних раковин тварин. |
Наркоз тварин
Перед зараженням тварин застосовують загальний наркоз або місцеве знеболювання. Для наркозу мишей, хом’яків, мурчаків, тхорів, курей, кроликів та собак використовують ефір та хлороформ, для пацюків та котів – ефір (внаслідок того, що вони погано переносять хлороформ). Техніка введення наркотизуючих речовин полягає в інгаляції в замкненому просторі, або ж безпосередньо змоченим ватно-марльовим тампоном поблизу носової чи ротової порожнини.
Перед ефірним наркозом собакам та іншим великим тваринам необхідно заздалегідь ввести анальгетик для зняття переднаркотичного збудження, наприклад, 1%-й розчин пропафеніну в дозі 0,2 мл на 1 кг живої ваги інтрамускулярно. Через 30 хв інтравенозно вводять тіопентал в кількості 20 мг на 1 кг живої ваги.
Для більш тривалого наркозу (30-45 хв) можна використовувати 10%-й розчин хлоралгідрату. Метод введення для мурчаків – інтраперітонеальний у дозі 0,5 - 0,75 мл, для курей, котів та кроликів – інтравенозний в дозах 0,2-0,4 мл та 3мл, відповідно.
Мавп наркотизують тіопенталом у вигляді 5%-го розчину інтрамускулярно в дозі 1-2 мл на тварину або у вигляді 2,5%-го розчину в кількості 1,5-2 мл на тварину.
Місцеву анестезію проводять 1%-м розчином кокаїну, 5%-м розчином новокаїну по 0,5 г. Для збільшення тривалості анестезії до розчину новокаїну чи кокаїну додають 2-5 крапель розчину адреналіну у концентрації 1:1000. Для анестезії слизових
|
Рис.2.2. Схема нанесення мітки надрізами, насічками та проколами вушних раковин тварин. |
оболонок носа, очей, порожнини рота чи прямої кишки використовують 5%-й розчин кокаїну.
Потрібно пам’ятати, що пацюки погано переносять хлороформ; тхорі – надто чутливі до ефіру, і незначне передозування веде до їхньої загибелі.
При використанні наркотизуючих речовин треба дотримуватися обережності: у дрібних лабораторних тварин після наркозу часто спостерігається набряк легень і загибель.
Депіляція
Тварини, призначені у дослід, повинні бути підготовлені до нього за день. Одним з етапів підготовки тварин є депіляція (епіляція) – видалення волосся зі шкіри, коли це необхідно за умовами експерименту. Депіляцію не можна робити бритвою, тому що після гоління залишаються дрібні ураження шкіри, в які можуть попасти збудники раневих інфекцій.
Для видалення волосся існують різні депіляційні засоби : 30-36%-й водний розчин односірчистого натрію, суміш сірчистого барію та оксиду цинку у співвідношенні 1:2; 10%-на мазь сульфату кальцію на ланоліні; сульфгідрат кальцію; сульфіт стронцію, сірчистий барій та пшеничне борошно у співвідношенні 1:1 з невеликою кількістю води до пастоподібного стану та інші. Вони зберігаються в скляному посуді з притертими пробками. Депілятор змішують з водою до утворення кашоподібної маси, яку наносять дерев’яною лопаточкою на потрібну ділянку шкіри. Через 10-15 хв. її разом з шерстю знімають, оголену шкіру ретельно змивають водою та змащують вазеліном для запобігання сильного подразнення шкіри.
Фіксація тварин
Для уникнення травм (подряпин чи укусів) при проведенні дослідів лабораторних тварин потрібно фіксувати у певному положенні. Для іммобілізації тварин використовують спеціальні станки, циліндри з металу або плексигласу, утримувачі, ящики, де можна закріпити мордочки, лапки або саму тварину, фіксування руками, обгортання рушником, тощо (рис.2.6). Тварину можна фіксувати на спині або на животі.
За відсутності спеціальних пристроїв використовують підручні засоби – корнцанги, пінцети, рушники, рукавички та ін. Мишу беруть рукою, анатомічним пінцетом чи корнцангом за хвіст, а великим та вказівним пальцями іншої руки захоплюють складку шкіри біля потилиці. Пацюка фіксують з допомогою двох корнцангів, захоплюючи шкіру на потилиці одним, а шкіру хвоста іншим і
|
Рис.2.3. Схема нанесення барвників для кольорового маркірування тварин. |
|
Рис.2.4. Схема нанесення фарб на тіло тварини за Тойффелем. |
притиснувши його щільно до столу. Хом’яка ловлять ззаду так, щоб він не бачив руки, охоплюючи його за грудну клітину. Не слід брати його в гнізді – він може укусити. Кроликів беруть за верхню частину шкіри на спині, піднімаючи догори і підтримуючи іншою рукою задню частину тіла. У собак при проведенні досліджень необхідно фіксувати морду міцною вузькою стрічкою, яка зав’язується вузлом на потилиці.
|
Рис.2.5. Маркірування лабораторних тварин за Тойффелем. |
|
Рис.2.6. Фіксація дрібних лабораторних тварин за допомогою циліндру. |
Курей фіксують руками, однією тримають ноги, а другою – крила. Мавп з клітки ловлять сітками. Передні кінцівки зв’язують за спиною. Для захисту від сильних укусів використовують товсті шкіряні рукавички. Потрібно мати на увазі, що мавпи макаки-резуси з Південно-Східної Азії є носіями вірусу В, смертельного для людини, який відноситься до ІІ групи висококонтагіозних небезпечних вірусів.
Зараження лабораторних тварин. Методи.
Вибір методу ураження визначається тропізмом вірусу. Під тропізмом розуміють здатність вірусу реплікуватися в певних типах клітин організму. Віруси, що репродукуються у нервових клітинах, називають нейротропними (наприклад, вірус сказу), у клітинах шкіри – дерматропними (вірус віспи), в клітинах легень та дихальних шляхів – пневмотропними (вірус грипу), в клітинах шлунково-кишкового тракту – ентеротропними (вірус гепатиту А). Віруси, які здатні реплікуватися в декількох типах клітин, називають політропними (вірус інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби – клітини органів дихання та розмноження), а в усіх типах клітин – пантропними (вірус чуми собак). Така класифікація вірусів за тропізмом називається класифікацією вірусів людини та тварин за Хюбнером.
Знаючи тропізм вірусу, матеріал вводять в органи, які містять чутливі до даного вірусу клітини (табл.2.6.). Наприклад, вірус грипу вводять в дихальні шляхи інтраназально (через ніс), вірус віспи у шкіру – субкутанно, кутанно або перкутанно (підшкірно, внутрішньошкірно та нашкірно, відповідно), вірус сказу у мозок – інтрацеребрально. Пантропні віруси швидше поширюються по організму при їх введенні внутрішньовенно або внутрішньочеревинно. Якщо тропізм вірусу невідомий, то використовують декілька груп тварин для ураження різними методами.
При цьому в залежності від способу зараження тварини одним і тим самим вірусом використовується різний об’єм вірусовмісної суспензії (табл.2.7).
Таблиця 2.6.
Зв’язок тропізму вірусу зі способом ураження чутливого організму
та видом патологічного матеріалу
|
Група вірусів за тропізмом (класифікація за Хюбнером) |
Приклад вірусу |
Метод ураження |
Вид патологічного матеріалу |
|
Пневмотропні |
Віруси грипу, парагрипу, аденовіруси, риновіруси |
Інтраназальний (аспіраційний) |
Носоглоткові змиви Шматочки легенів та бронхів* |
|
Нейротропні |
Вірус сказу, віруси герпесу |
Інтраспінальний Інтрацеребральний Субокципітальний |
Кров Спинномозкова рідина Шматочки головного та спинного мозку і периферичних нервів* |
|
Дерматропні |
Віруси віспи, вісповакцини, герпесу |
Перкутанний Кутанний Інтракутанний Субкутанний Інтравенозний Інтрамускулярний |
Ділянки шкіри та слизової оболонки Кров Вміст пустул та везикул |
|
Ентеротропні |
Ентеровіруси, вірус гепатиту А |
Оральний Ректальний Безпосередньо в шлунок Інтраперітонеальний |
Фекалії Сеча Блювотні маси Шлунково-кишковий тракт з печінкою, селезінкою, жовчним міхуром та підшлунковою залозою* |
|
Пантропні |
Вірус чуми собак, вірус поліомієліту |
Інтравенозний Інтракардіальний Інтрамускулярний Оральний Інтраназальний Інтраперітонеальний Субкутанний |
Кров Змиви носоглотки Спинномозкова рідина Екскрети Секрети Всі органи* |
* - при летальних випадках (секційний матеріал)
Для зниження природної резистентності тварин перед зараженням можна опромінювати рентгенівськими променями (мишей – 300 Р, мурчаків – 250-300 Р, білих пацюків – 120 Р, кроликів – 600 Р) або обробляти кортизоном (5-10 мг/кг). Ці прийоми прискорюють репродукцію вірусів в організмі тварин та полегшують їх виділення та типування.
Вірусовмісний матеріал перед введенням лабораторним тваринам підлягає спеціальній обробці для очистки його від грубих часток.
Таблиця 2.7.
Допустимі дози досліджуваного матеріалу, що вводиться лабораторним тваринам, мл
|
Методи зараження |
Види тварин |
||||
|
Кролики |
Мурчаки |
Білі пацюки |
Білі миші |
Собаки |
|
|
Субкутанний Інтракутанний Інтрамускулярний Інтраперітонеальний Інтравенозний Інтраназальний Інтрацеребральний Інтраспінальний Субокципітальний |
2,0-5,0 0,1 1,0-8,0 5,0-40,0 3,0-10,0 1,0-2,0 0,1-0,4 0,02-0,03 0,5-0,8 |
1,0-3,0 0,1 1,0-4,0 1,0-15,0 0,5-2,0 0,3-2,0 0,05-0,2 0,02-0,03 0,3-0,5 |
1,0-3,0 0,05 0,5-5,0 0,5-5,0 0,5-2,0 0,05-1,0 0,03-0,2 0,02-0,03 0,03-0,5 |
0,1-0,5 0,02 0,25-0,5 0,5-1,0 0,5-1,0 0,03-0,05 0,02-0,05 0,02-0,03 0,3-0,5 |
2,0-5,0 0,5 3,0-5,0 10,0-20,0 0,5-10,0 2,0-5,0 0,5-0,8 0,02-0,03 0,5-0,8 |
Шматочки органів попередньо подрібнюють в гомогенізаторах, в банках зі скляними бусами, в фарфорових чи скляних ступках, потім емульгують, а в ряді випадків і екстрагують. Із розтертих органів готують 10%-ну (чи іншої концентрації) суспензію на фізіологічному розчині з додаванням 10%-ї нормальної сироватки (або без неї), бульйону чи буферного розчину. Приготовану суспензію тканин центрифугують протягом 10-15 хв при 3000-4000 об/хв, і надосадову рідину використовують для зараження лабораторних тварин. При забрудненні досліджуваного матеріалу бактеріальною мікрофлорою його фільтрують через бактеріальні фільтри, що затримують бактерії, чи додають антибіотики: пеніцилін та стрептоміцин у співвідношенні 1000 ОД на 1 мл інфекційної рідини. Можна додавати і антисептичні речовини (0,25-0,3%-й розчин фенолу, мертиолят натрію 1:10 000, тощо). Слід мати на увазі, що фільтрація матеріалу через бактеріальні фільтри знижує кількість вірусів внаслідок сорбційних властивостей фільтрів, фільтрацію здійснюють тільки за достатньої кількості вірусовмісного матеріалу.
Потрібно зауважити, що ураження тварин може здійснюватися з різними цілями (накопичення вірусів, пасування, титрування, одержання вакцин, тощо). У всіх вищевказаних випадках введення вірусовмісного матеріалу називається ураженням лабораторних тварин, при цьому найчастіше вірусний матеріал вводиться тварині одноразово.
Якщо ж метою експерименту є отримання специфічної антисироватки до відповідного вірусу, то в цьому випадку введення вірусовмісного матеріалу називають імунізацією лабораторних тварин, при цьому вірус вводиться багаторазово (для отримання кращої імунної відповіді тварини) і обов’язково за певною схемою. Найчастіше, незалежно від тропізму вірусу, перше введення вірусного матеріалу проводиться внутрішньом’язево або ж підшкірно у декілька ділянок (наприклад, з внутрішнього боку всіх кінцівок тварини), а надалі – внутрішньовенно. Перше введення матеріалу робиться внутрішньом’язево та багатоточково з тієї причини, що це призводить до тривалішого депонування вірусу у місці введення, яке активно стимулює периферичні лімфатичні вузли для вироблення первинної імунної відповіді.
Крім цього, імунізація тварин вірусовмісним матеріалом часто здійснюється з додаванням до суспензії вірусу так званих ад’ювантів – речовин (або їх сумішей), які додатково стимулюють імунну відповідь тварини. У вірусологічній практиці найбільш широко використовуються ад’юванти Фрейнда – повний і неповний. Повний ад’ювант Фрейнда містить різні мінеральні олії та завис інактивованих клітин бактерій Mycobacterium bovis. Його можна вводити лише один раз при першому введенні вірусовмісного матеріалу (так званій першій імунізації). Повний ад’ювант Фрейнда ні в якому разі не можна вводити тварині внутрішньовенно, оскільки це призведе до ураження крові (сепсису) та загибелі тварини. При наступних імунізаціях використовують неповний ад’ювант Фрейнда, який не містить бактеріальних клітин, а тому може вводитися внутрішньовенно.
Головною вимогою при експериментальному зараженні (імунізації) є виконання його в умовах повної асептики. Для цього використовують стерильний інструментарій, а місце введення інфекційного матеріалу звільняють від волосяного покриву (піддають депіляції) і знезаражують 3%-м розчином йоду. Винятком є два природних методи зараження, а саме інтраназальне та оральне. При кожному методі інфікування з порушенням цілісності шкіри рекомендується після зараження повторно дезінфікувати місце ін’єкції.
Інтраназальне (аспіраційне) зараження
Цей метод зараження в ніс здійснюється різними шляхами. Найчастіше використовують методику закапування інфекційного матеріалу шприцом чи піпеткою Пастера в кожну ніздрю сонній тварині, яка знаходиться під наркозом (рис.2.7). При правильно розрахованій дозі наркотичної речовини тварина глибоко втягує (аспірує) матеріал, який попадає в легені. При слабкому наркозі у тварини виникає чхальний рефлекс, тварина поштовхами намагається вивести матеріал з дихальних шляхів, він розбризкується і може інфікувати експериментатора та зовнішнє середовище. При надто глибокому наркозі дихання тварини стає поверхневим, і матеріал погано втягується в ніздрі. У таких тварин може швидко розвинутись набряк легенів, що призведе до їхньої загибелі в першу добу після зараження. Матеріал слід використовувати в малих концентраціях для запобігання виникнення токсичних явищ у тварин.
Друга методика здійснення інтраназального зараження – це введення спеціального зонду з вірусовмісним матеріалом в дихальні шляхи, трахею, бронхи.
Інша різновидність методу зараження в ніс – це інгаляція матеріалу. Дрібних тварин інфікують в спеціальних герметичних камерах, де створюють в повітрі певну концентрацію вірусу. Великих тварин заражають інгаляційно, використовуючи спеціальні герметичні маски. Розмір часток інфекційного матеріалу не перевищує 2 мкм, через це вони проникають в нижні дихальні шляхи, аж до самих альвеол. Остання методика не дуже зручна внаслідок того, що потрібно багато вірусовмісного матеріалу.
|
Рис.2.7. Інтраназальне зараження мишей та пацюків. |
Інтраплевральне зараження
Метод інфікування лабораторних тварин в плевру. Для цього тварину фіксують в положенні на боці для того, щоб використати простір, який утворився, для введення голки, не побоюючись поранити легеню. Затупленою голкою роблять прокол у міжреберний простір.
Зараження лабораторних тварин через травний тракт здійснюється трьома шляхами:
|
Рис.2.8. Оральний спосіб зараження лабораторних тварин через травний тракт. |
Крім цих методів інфікування лабораторних тварин вірусовмісним матеріалом існує значна група методів експериментального зараження, коли введення матеріалу в організм здійснюють, обминаючи шлунково-кишковий тракт.
У вірусологічній практиці існує декілька методів зараження лабораторних тварин, при здійсненні яких об’єктом інфікування є шкіра тварин.
Цей метод інфікування лабораторних тварин вірусовмісним матеріалом, так зване нашкірне зараження, проводять на неушкодженій шкірі тварин. Матеріал втирається в неушкоджену депільовану шкіру стерильним інструментом (кінець стерильної пробірки, фарфоровий товкачик). За даними багатьох дослідників цей метод майже не дає позитивних результатів.
Це – так зване шкірне зараження лабораторних тварин на ушкоджену шкіру, яке здійснюється методом скарифікації. Для цього вибирають ділянку шкіри, яку тварина не може дістати лапами чи кігтями. Для різних тварин вона різна: спина (миші, мурчаки, пацюки, собаки), плантарна поверхня ступні (миші, хом’яки, мурчаки), бік (кролики), живіт (кролики), груди (кури) та сім’яники (кролики).
На вибраній ділянці шкіри роблять депіляцію та оброблюють її 3%-м розчином йоду. Потім роблять подряпини пером Дженнера чи хірургічною голкою до появи крапель лімфи, але щоб вони не кровоточили. На ушкоджену таким чином ділянку шкіри наносять матеріал краплями і втирають скляною паличкою, лопаткою, шпателем або обстриженою зубною щіткою.
Це метод підшкірного інфікування лабораторних тварин. Вибір місця зараження залежить від можливості сформувати складку шкіри на тілі тварини: спина (миші, пацюки, мурчаки, хом’яки, тхорі, кролики), бік (пацюки, хом’яки, мурчаки, кролики), шия (кури), живіт (пацюки, мурчаки, кролики, мавпи), плече (мурчаки, кролики), колінна складка (мурчаки), колінний згин (мурчаки).
Вибрану ділянку шкіри депілюють, оброблюють 3%-м розчином йоду і трохи піднімають пінцетом або двома пальцями. В основу утвореної складки вколюють голку шприца й повільно вводять матеріал. Щоб введений матеріал не вилився назад, потрібно відхилити голку від первинного напрямку трохи вбік під кутом 45°.
Для інтракутанного (внутрішньошкірного) інфікування місце для ін’єкції готують таким же чином, як і при субкутанному. Дуже тонку гостру голку вводять в товщу депільованої шкіри майже паралельно її поверхні так, щоб голка просвічувалася через епідерміс. При введенні матеріалу поверхневий шар епідермісу трохи піднімається у вигляді пухирця, утворюючи т.зв. “лимонну кірку”.
В залежності від виду та розміру тварини існують різні способи інтравенозного інфікування. Матеріал вводять у хвостову бічну (миші, пацюки), гомілкову внутрішню (мурчаки), вушну крайову (кролики, мурчаки), стегнову, ліктьову, яремну (собаки, поросята, вівці, телята, лошаки), підкрильцеву (птахи) вени. Остання знаходиться на внутрішній поверхні крила птахів, і вона рел’єфно виступає при вискубуванні пір’я. Наповнення кров’ю цих судин здійснюється затисненням їх рукою, джгутом або затискачем.
Мишам і пацюкам матеріал найчастіше вводять у бічні вени хвоста, розташовані по обидві сторони хвоста, використовуючи для цього голки з гострим кінцем. Для розширення вен хвіст занурюють на декілька хвилин у гарячу воду (+50-55С) або протирають ксилолом чи бензолом. Голку шприца скосом назовні вводять під гострим кутом у вену нижньої третини хвоста, де шкіра тонша, у напрямку кореня хвоста (рис.2.9). При попаданні голки у вену матеріал легко, без опору виходить із шприца, в місці знаходження кінчика голки під шкірою не з’являється здуття, і вена біліє.
|
Рис.2.9. Інтравенозне зараження миші в хвостову вену. |
Для проведення інтравенозного зараження мурчаків в гомілкову внутрішню вену тварину фіксують спиною догори, ножицями зрізають шкіру за ходом вени вище суглоба і відпрепаровують її від оточуючої тканини. Вище відпрепарованої ділянки вену здавлюють джгутом, вона стає чітко помітною. У білих мурчаків вена добре видима і без зрізання шкіри.
Кроликів заражають інтравенозно в крайову вушну вену, яка проходить по тонкому краю вуха на зовнішній поверхні (рис.2.10). Шерсть вздовж краю вуха за ходом вени вищипують, шкіру дезінфікують. Для набухання вени вухо масажують чи натирають ксилолом і передавлюють у основи. Голку шприца вводять у вену майже паралельно поверхні вуха. Після закінчення ін’єкції вену придавлюють нижче місця уколу і витягують з неї голку. Місце уколу притискують сухою ватою. Зараження проводиться якнайдалі від кореня вуха, тому що при повторних введеннях можлива облітерація судини в місці уколу.
У хом’яка, мурчака та тхора яремні вени майже недоступні для уколів, і необхідне їх хірургічне оголення. Це – складний процес, і тому для таких тварин найчастіше застосовують інтракардіальне зараження – введення матеріалу в серце. Для цього тварину фіксують під наркозом на спині, курей – на боці, намацують серцевий поштовх та визначають місце ін’єкції, яке у різних тварин різне: у миші – 0,5 см над верхівковим поштовхом серця, безпосередньо поблизу краю грудної кістки; у пацюка – 1 см над верхівковим поштовхом серця, в 1-2 мм від краю грудної кістки; у хом’яка – 4-5-й міжреберний простір, в 2-3 мм від краю грудної кістки; у мурчака – 2-й міжреберний простір, в 2 мм від краю грудної кістки; у тхора – межа 3/4 верхньої та 1/4 нижньої частин довжини грудної кістки, в 3 мм від краю грудної кістки; у кроликів – 3-й міжреберний простір, в 3 мм від краю грудної кістки; у курки – 3-4 міжреберний простір на лінії плечелопаткового суглобу та каудального кінця грудної кістки.
|
Рис.2.10. Інтравенозне зараження кроля у вушну крайову вену. |
Голку вводять перпендикулярно поверхні тіла крізь шкіру, проколюючи грудну стінку та серцевий м’яз. На цьому етапі повинна відчуватися пульсація серця, а в голці з’явитися кров. Матеріал повільно вводять голкою безпосередньо в серце. Показником проколу серцевого м’язу є поява крові в шприці при легкому відтягуванні поршня.
Матеріал для інтравенозного та інтракардіального заражень не повинен містити значних за розміром часток та пухирчиків повітря, які можуть викликати емболію судин та раптову загибель тварини.
При цьому методі зараження матеріал вводять голкою майже перпендикулярно поверхні тіла, проколюючи шкіру, підшкірну клітковину та товщу м’язів (мускулатуру) в області шиї, грудей, сідниць або стегна. Легким натиском на поршень інокулюють необхідну кількість матеріалу (рис.11). Місцем ін’єкції у курей є великий грудний м’яз.
Цей метод проводиться шляхом вприскування матеріалу в черевну порожнину. Спочатку тварину спеціально фіксують (тримають або підвішують) головою вниз для того, щоб внутрішні органи та кишечник опустилися до діафрагми. Місце ін’єкції визначають в нижній третині живота вище симфізу, трохи відступаючи від серединної лінії живота. Рукою злегка відтягують лапу тварини, створюючи натяг шкіри та м’язів черевної стінки. В місці проколу стінку живота захоплюють у складку, в основу якої вводять голку на глибину не більше 0,3-0,5 см. Для попередження поранення кишечнику та внутрішніх органів кінець голки повинен бути тупим (сточеним). Спочатку проколюють шкіру та м’язи живота, а потім, натискаючи на голку шприца, очеревину. Проникнення у черевну порожнину відчувається за характерним тріскучим звуком та за зникненням опору черевної стінки. Після витягування голки шкіра зсовується на старе місце, закриваючи отвір в черевну порожнину (рис.2.12). У великих тварин при інтраперітонеальному зараженні роблять невеликий (1-1,5 см) розріз шкіри, в який вводять голку шприца і проколюють очеревину.
Застосовуючи даний метод зараження тварин, треба пам’ятати, що протягом доби до інфікування їх не годують.
|
Рис.2.11. Інтрамускулярне зараження пацюка у внутрішню поверхню стегна. |
Рис.2.12. Інтраперітонеальне зараження миші. |
Цей метод використовують лише при роботі з великими тваринами: кроликами, собаками, тощо. У дрібних тварин він не застосовується за анатомічними показниками: простір між оболонками та мозком надто малий. Тварину під наркозом при цій операції фіксують таким чином. Голову тримають так, щоб між площиною тулуба та шиєю утворився прямий кут, тобто максимально нахиляючи її до грудної клітки. При такому положенні відстань між першим шийним хребцем та черепом збільшується, а зв’язка між ними натягується. На ділянці голови між карковим горбком та остистим
відростком першого шийного хребця шерсть депілюють, шкіру дезінфікують. Прокол роблять на середині відстані між карковим горбком та остистим відростком, точно по середній лінії, тому що відхилення голки в бік може пошкодити венозні синуси.
Для ін’єкції у велику цистерну використовують гостру голку з не дуже скошеним кінцем, тому що зріз голки повинен поміститися між твердою мозковою оболонкою та мозком (відстань між ними 1-2 мм). Щоб під час проходження м’яких тканин отвір голки залишався вільним, в нього встромляють мандрен. Голку вводять на глибину до 0,5 см дуже обережно, щоб не зачепити твердої мозкової оболонки, до відчування проколу цієї оболонки. Якщо при проходженні голки чутний тріск, введення матеріалу потрібно негайно припинити.
При правильному введенні голки в цистерну в її отворі з’являється спинномозкова рідина. Тоді на голку надівають сухий стерильний шприц. За рахунок правильного руху поршня, щоб не знизити різко внутрішньочерепний тиск, в порожнині шприца створюється від’ємний тиск, і в шприц надходить спинномозкова рідина в кількості 0,3-0,8 мл в залежності від виду тварини. Після цього на голку надівають інший шприц з матеріалом для введення, який випускають в тому ж об’ємі.
Інтраспінальне (внутрішньоспинномозкове, люмбосакральне, крижово-поперекове) зараження
Наркотизовану тварину фіксують у положенні з сильно зігнутим хребтом у крижово-поперековій області. Тонкою голкою роблять прокол під кутом 45 в області останнього поперекового та першого крижового хребців трохи справа від середньої лінії.
При цьому методі зараження тварин матеріал вводять або під тверду мозкову оболонку, або безпосередньо в головний мозок, найчастіше в тім’яну область, яка відрізняється тонким кістковим покривом, невеликою кількістю м’язів та відсутністю значних судин.
Великим тваринам (мавпам, собакам, вівцям, свиням, лошакам, тощо) зараження у мозок роблять під наркозом через трепанаційний отвір або проколом кістки черепа, фіксуючи тварину спиною догори. Трепанацію черепа роблять бормашиною, буравчиком, трепаном або свердлом. Шкіру натягають і розрізають скальпелем на 1-2 см паралельно поздовжній осі черепа. Розріз повинен проходити трохи вище лінії, яка з’єднує задні кути очей і на 1-2 мм вбік від середньої лінії черепа, щоб не ушкодити поздовжній венозний синус. Потім розсікають надкісницю і трепанують кістку.
Через утворений отвір (у мурчаків та кроликів близько 2 мм, а у великих тварин трохи більший) під тверду мозкову оболонку вводять голку на глибину від 2 мм (мишам) до 10 мм (мавпам) і, злегка натискуючи на поршень, вприскують матеріал малими порціями, щоб запобігти підвищенню мозкового тиску. Отвір в кістці після ін’єкції закривається зсунутою на місце шкірою, а на розрізи надкісниці та шкіри над трепанаційним отвором накладають шви, стягуючи декількома стібками шовкових ниток.
Кроликам, мурчакам та великим пацюкам при інтрацеребральному зараженні трепанацію черепа можна не робити. Після розсікання шкіри та надкісниці їх відсувають в обидві сторони і стерильною канцелярською кнопкою проколюють черепну стінку. В утворений отвір голкою з шприца вводять матеріал безпосередньо в мозок або під тверду мозкову оболонку (рис.2.13).
|
Рис.2.13. Інтрацеребральне зараження кролика. |
Мишам та невеликим пацюкам черепну коробку проколюють голкою шприца. У більшості тварин ін’єкцію роблять збоку від середньої лінії на половині між верхнім краєм западини ока та зовнішнім слуховим проходом, щоб не пошкодити поздовжній венозний синус. У курей прокол роблять на лінії, яка з’єднує передні краї вушних отворів, в 1-2 мм збоку від середньої лінії.
Зразу ж після ін’єкції у тварин можуть з’явитися шокові явища, які через деякий час зникають.
Кроликів можна заражати без трепанації черепа через орбіту ока, де тонка кістка. Голка повинна бути тонкою, завдовжки 4-5 см із заточеним гострим кінцем. При цьому способі зараження потрібно зафіксувати тулуб кролика і притискувати голову тварини до столу. При проколі шкіру біля місця ін’єкції зсувають, щоб після неї отвір в черепі закрився шкірою, яка повертається на місце. Голку тримають косо по відношенню до середньої лінії, щоб не попасти в орбіту. Такий спосіб менше травмує тварину, і вона переносить цю операцію без наркозу.
Цей спосіб зараження великих тварин використовується рідко. Інфікування проводять в сідничний нерв, фіксуючи наркотизовану тварину на верстаті чи операційному столі спиною догори. Наркоз може бути загальним або місцевим. Тильну поверхню стегна депілюють та дезінфікують. Скальпелем роблять розріз шкіри завдовжки 3-4 см, тупим інструментом розсувають м’язи стегна та оголюють нерв. Під нього підводять тонкі марльові турунди і піднімають нерв з глибини рани, щоб виключити можливість попадання матеріалу, що вводиться тварині, на оточуючі тканини. Тонкою голкою шприца в нерв вводять невелику кількість матеріалу під дуже гострим кутом. Щоб матеріал не вилився з нерву, голку виймають дуже обережно. Після введення матеріалу турунди витягають, розріз шкіри зашивають шовковими нитками або накладають скобки.
Головним чином метод зараження усередину сім’яників застосовують на кроликах. Тварину фіксують на спині, її задні кінцівки розставляють якнайширше одну від одної. Сім’яник зсувають трохи вперед і фіксують між великим та вказівним пальцями.
До даної групи методів інфікування тварин (інфікування в око) відносяться корнеальне, інтракорнеальне, кон’юнктивальне та інтраокулярне зараження. При всіх цих методах матеріал вводять тільки в одне око.
Метод інфікування в передню камеру ока (інтраокулярне зараження) використовують головним чином для великих тварин: собак, кроликів, мурчаків, тощо. Наркотизовану під легким наркозом тварину фіксують спиною догори, на око наносять 2-3 краплі 10%-го розчину новокаїну чи вводять в орбіту шприцом 1-2 мл 2%-го розчину новокаїну на 10-15 хв для анестезії. Після її настання тупим інструментом виводять око з орбіти, тонким очним пінцетом захоплюють кон’юнктиву, щоб іммобілізувати очне яблуко. Голку мінімального діаметру вводять в рогівку ока біля лімбу, не ушкоджуючи райдужну оболонку, і просувають у центральному напрямі до тих пір, поки в отворі голки не з’явиться рідина. Шприцом відсмоктують близько 0,03 мл рідини з передньої камери. Потім, не виймаючи голки з камери ока, насаджують інший шприц з матеріалом для інфікування і вводять його в тому ж об’ємі.
Анестезію ока проводять як і при зараженні в передню камеру ока. Очне яблуко фіксують великим та вказівним пальцями, виводячи його назовні. Обережно скарифікують рогівку гострою голкою або вакциностіллом у вигляді вертикальних та горизонтальних насічок. Матеріал наносять на рогівку і втирають його спочатку стерильним тампоном, а потім повіками.
Зараження в рогівку проводиться на тваринах, підготовка яких здійснюється аналогічно корнеальному зараженню. Матеріал для інфікування вводять обережно, дуже тонкою голкою в 2-3 ділянки рогівки.
Цей метод інфікування тварин в сполучну оболонку ока здійснюється шляхом закапування матеріалу на неушкоджену рогівку.
Контроль за зараженими лабораторними тваринами
Інфікованих тварин розміщують в ізольованому приміщенні віварію. В наступні за ураженням дні ведеться інтенсивне спостереження за тваринами для контролю їх клінічного стану. У випадку розмноження вірусу чутливі до нього клітини звичайно ушкоджуються або гинуть. При значній кількості ушкоджених вірусом клітин порушується функціонування частини або усього відповідного органу, що супроводжується змінами у стані та поведінці тварини. Так, при розмноженні вірусу у клітинах респіраторного тракту спостерігається кашель, хрипи, ускладнення дихання, при реплікації вірусу у клітинах мозку – судоми, парези та параліч.
Постійно спостерігаючи за тваринами, враховують відхилення від норми в їхній поведінці, появу специфічних ознак захворювання, відповідно до інкубаційного періоду, зважують тварин та вимірюють температуру тіла. Строк спостереження за інфікованими тваринами повинен в 2-3 рази перевищувати максимальну тривалість інкубаційного періоду.
Видимі ознаки розмноження вірусу в організмі лабораторних тварин називають клінічними проявами хвороби, а їх появу після експериментального ураження вірусом вважають непрямим доказом розмноження вірусу. При цьому враховують не лише характер викликаних вірусом змін, але й тривалість інкубаційного періоду, яка є характерною для перебігу даного захворювання. Інкубаційний період залежить не лише від властивостей збудника, але і від дози вірусу, яку ввели в організм тварини, і від способу ураження та від стану самого організму. Для подальшої ідентифікації виявленого збудника застосовують серологічні методи.
Нерідко захворювання, спричинене експериментальним ураженням тварини, завершується її загибеллю, що слугує однією з ознак розмноження вірусу. На розмноження вірусу в організмі, окрім клінічних ознак та загибелі тварини, вказують також й видимі зміни самих органів та тканин. Патологоанатомічні ознаки проявляються у зміні кольору, розміру, форми та консистенції органів, а також у появі новоутворень, які не зустрічаються в нормі. Отже загалом, три головні ознаки говорять про наявність вірусу в матеріалі, яким інокулювали лабораторних тварин: симптоми, патологоанатомічні зміни та загибель. Слід мати на увазі, що загибель тварин в перші дні після зараження може бути пов’язаною з травмою чи токсичною дією досліджуваного матеріалу.
Однак при цьому не завжди ці ознаки супроводжують розмноження вірусу в організмі. Наприклад, вірус, виділений з патологічного матеріалу коней, не може легко з клінічними проявами розмножуватися в організмі білих мишей. Протягом першого пасажу лише окремі вірусні частки зможуть знайти для себе чутливі клітини, але їх буде настільки замало по відношенню до цілого органу, що видимих змін усього організму не виникне. Такий пасаж отримав назву сліпого. Уражена тварина, яка не виявила ознак захворювань, піддається евтаназії (умертвінню) через інтервал часу, що відповідає тривалості двох інкубаційних періодів. При цьому відбирається відповідний патологічний матеріал, який, як припускається, містить накопичений вірус. Суспензією з таким чином отриманого матеріалу першого пасажу уражують інших тварин того ж виду. При цьому в організм потрапляє вже більше вірусних часток, здатних викликати продуктивну інфекцію (відбулася часткова адаптація вірусу до нового експериментального господаря). Однак при цьому і при другому пасажі вірусу в організмі тварини також може бути замало для появи видимих змін; тоді і другий пасаж називається сліпим. За тим же принципом здійснюють і третій пасаж, і у випадку появи клінічних ознак хвороби роблять висновок про присутність вірусу у досліджуваному матеріалі.
Аналогічно до цієї схеми проводив дослідження Луї Пастер з вірусом сказу, виділеним від собак. Вірус в нормі викликав швидку загибель собак, оскільки був адаптований до даного господаря. При експериментальному ураженні групи кроликів лише дуже невеликий їх процент гинув після першого пасажу, який, таким чином, вважався сліпим. Після другого і третього пасажів вірус набував здатності ефективно розмножуватися в організмі кроликів, про що свідчив високий відсоток їх загибелі протягом все меншого часу після ураження. При цьому, навпаки, вірус втрачав здатність ефективно реплікуватися в клітинах собак.
Одержання патологічного матеріалу від заражених лабораторних тварин
Правильний відбір та обробка патологічного матеріалу мають дуже велике значення для успішного виявлення вірусу.
Матеріалом для виділення вірусів з інфікованого організму людей та тварин є ті біологічні рідини та тканини органів, де віруси містяться у найбільшій кількості, тобто при цьому треба керуватися тропізмом вірусів. Таким чином, простежується логічний взаємозв’язок між тропізмом вірусу (типом клітин, де він успішно реплікується), методом ураження тварини (введенням вірусовмісного матеріалу саме туди, де є клітини необхідного типу), та патологічним матеріалом, який відбирають від тварини (органами, рідинами і т.п., де накопичився введений вірус) (табл.2.6).
Патологічний матеріал може бути прижиттєвим – одержаним від живої тварини (протягом незавершеного експерименту), та секційним – одержаним після розтину лабораторної тварини (по завершенню експерименту або ж при передчасній загибелі тварини).
Секрети – це специфічні біологічні рідини, що виділяються залозами людини та тварин. Якщо виділення відбувається назовні, це – залози зовнішньої секреції з такими секретами: піт, молоко, слина, жир (сальні залози), шлунковий сік, сім’яна рідина, сперма, жовч, спинномозкова рідина, синовіальна рідина суглобових сумок, плевральна та асцитна рідини. Залози внутрішньої секреції виділяють секрети в кров та лімфу, це – гормони.
Екскрети – це кінцеві продукти обміну речовин, які виділяються організмом назовні за участю нирок, легенів, шкіри, кишечника. Екскретами є: сеча, фекалії, піт, надлишок води, солі, вміст трахей та бронхів (при кашлі), чужорідні речовини та біологічно активні речовини, що утворилися в організмі.
Мазок із глотки беруть стерильним ватним тампоном, торкаючись ним до задньої стінки глотки й шпателем натискуючи на корінь язика. Тампон вміщують у 2-3 мл фізіологічного розчину, сполоскують і віджимають. Одержану суспензію центрифугують при 3000 об/хв протягом 10 хв і деконтамінують. Матеріал зберігають замороженим.
Серозну рідину з пустул не треба додатково обробляти й деконтамінувати. Для виділення вірусів її використовують відразу або зберігають замороженою.
Перед взяттям матеріалу з везикул їх поверхню обробляють ефіром або ацетоном. Вміст везикул відсмоктують шприцом з тонкою голкою та переносять у фізіологічний розчин. Іноді везикули розтинають і збирають їхній вміст ватним тампоном, який потім вміщують у фізіологічний розчин.
Збирання сечі та калу у тварин здійснюють при проведенні балансових досліджень протягом експерименту, застосовуючи або катетер, або спеціальний прилад, який дає можливість роздільного збирання екскрементів. Сечу катетером збирають у стерильну закриту посудину. За необхідністю сечу освітлюють центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 20 хв і деконтамінують, тобто звільняють від домішок супровідної мікрофлори. Для цього додають антибіотики з розрахунку 1000 ОД пеніциліну та 1000 мг стрептоміцину на 1 мл. Зберігають проби сечі замороженими. Кал після відбору поміщають у стерильні флакони з гумовими пробками для щільного закупорювання. Готують 10%-ну суспензію на фізіологічному розчині чи розчині Хенкса. Флакон з пробою калу старанно струшують протягом 3-5 хв, загорнувши його серветкою, змоченою 70%-м етиловим спиртом. Далі матеріал центрифугують (3000 об/хв протягом 20 хв) для звільнення від великих часток. Відбирають надосадову рідину і деконтамінують її. За неможливістю одержати проби калу роблять мазки з прямої кишки. Ректальні тампони змочують фізіологічним розчином і вводять у пряму кишку обертальним рухом, після чого вміщують їх у флакони з фізіологічним розчином. Тампони віджимають, а з одержаної суспензії роблять 10%-ну, як описано вище. Проби калу зберігаються замороженими.
Прижиттєве одержання кісткового мозку методом пункції можливе у всіх видів тварин та птахів. Кістковий мозок у коней одержують з грудини чи клубової кістки шляхом проколу спеціальною голкою, у кроликів – з грудини чи стегнової кістки, у птахів – з колінного суглобу чи верхньої третини плюснової кістки.
Спинномозкову рідину одержують шляхом люмбальної (спинномозкової) пункції. Відбирають певну кількість рідини у стерильний скляний посуд. Якщо немає бактеріальної контамінації, спинномозкову рідину можна використовувати для виділення вірусів без додаткової обробки. Домішки еритроцитів та інших клітинних елементів видаляють центрифугуванням при 1500 об/хв протягом 10 хв.
Взяття крові проводиться з обов’язковим дотриманням правил асептики. Це стосується обробки поверхні шкіри тварини дезінфектантами, використання стерильного посуду та інструментарію, спецодягу експериментатора. Потрібно пам’ятати, що шприц повинен бути сухим, щоб запобігти розчиненню еритроцитів взятої крові (гемоліз).
Спосіб взяття крові залежить від необхідності її кількості: невеликої чи великої. Кров у лабораторних тварин беруть з різних вен, пункцією серця та з сонної шийної артерії шляхом кровопускання.
Невелику кількість крові відбирають з зовнішньої крайової вушної та з хвостової бічної вен у кроликів, пацюків та мурчаків; з кінчиків пальців передньої кінцівки у мишей, пацюків, хом’яків та мурчаків; з гребня та підкрильцевої вени у птахів.
У кроликів, мурчаків, тхорів кров з зовнішньої крайової вушної вени беруть після фіксації тварини. Місце розташування вени змочують спиртом, потім ксилолом, щоб викликати прилив крові у вену. Проте треба слідкувати за тим, щоб залишки ксилолу не попали в кров, яка від цієї речовини гемолізується. Судину здавлюють у основи вуха і роблять надріз або пункцію в залежності від розміру тварини. Голку вводять під гострим кутом майже паралельно вені і обережно просувають у порожнину судини. Якщо кров не витікає, то голку слід повернути навколо поздовжньої вісі і знову просунути вперед чи назад. Місце взяття крові сильно стискати не рекомендується, щоб запобігти попаданню у витікаючу кров тканинної рідини, це може змінити результати досліджень. Також не рекомендується брати повторно кров з однієї й тієї ж судини.
У мишей, пацюків невелику кількість крові беруть з хвостової бічної вени. Операцію виконують під наркозом. Хвіст оброблюють спиртом та ксилолом або занурюють його на 1-3 хв в підігріту до +45°С воду. Потім відрізають кінчик хвоста ножицями чи надрізують судину скальпелем або бритвою. Кров збирають у пробірку або відсмоктують піпеткою Пастера. Після цього рану припікають на вогні або хромовою кислотою з тієї причини, що пацюки гризуть ушкоджений хвіст.
У мавп невелику кількість крові беруть з кінчиків пальців передньої кінцівки шляхом уколу пером Дженнера, скальпелем чи голкою Франка. Скарифікатори для цього не використовуються через їх ускладнену очистку.
У курей кров у незначній кількості беруть з підкрильцевої вени. Для цього птаха фіксують на спині, розпрямляють крило і здавлюють вену. Після обробки шкіри спиртом вену проколюють скальпелем (голку в цю вену важко вводити) і збирають кров. Крім того, кров можна брати також з гребня, проколюючи його або відрізаючи зубець. Для запобігання кровотечі рану після взяття крові припікають або оброблюють хлоридом заліза.
Одержання великої кількості крові здійснюють пункцією серця або беручи з зовнішньої яремної, стегнової, ліктьової, підкрильцевої вен.
Пункцію серця роблять на анестезованих мишах, пацюках, хом’яках, тхорах, мурчаках, кроликах, собаках, мавпах і курях після відповідної підготовки місця пункції як при інтракардіальній ін’єкції.
У мурчаків та кроликів кров беруть з серця у другому та третьому міжребер’ї, відповідно на 1,5 см та 3 см від лівого краю грудини, де відчувається серцевий поштовх. У мишей та пацюків він чутний з лівого краю грудини. Ділянку на грудях депілюють та дезінфікують. Кінчиком пальця знаходять серцевий поштовх. В це місце з лівого краю грудини вколюють голку і спрямовують її перпендикулярно серцю до середньої лінії на глибину 1,5-2 см. Голка повинна подолати опір плеври, перикарду та серцевого м’яза. Якщо голка попала в лівий шлуночок, кров почне поступати в шприц поштовхами. Без загрози для життя тварини у мурчаків можна брати 10-15 мл крові, у кроликів - 25-40 мл, у миші - до 0,5 мл, у пацюка - 2-3 мл. Зразу ж після взяття крові для поповнення кровообігу необхідно ввести інтрамускулярно стерильний підігрітий до +36-38°С фізіологічний розчин (0,85% хлорид натрію) кролику – 20-25 мл, мурчаку – 10-15 мл, миші – 0,5-1 мл, пацюку – 3-5 мл.
Потрібно мати на увазі, що при використанні цього методу взяття крові бувають летальні випадки, особливо у мишей, пацюків, хом’яків та мурчаків.
З зовнішньої яремної вени кров беруть у мурчаків, тхорів, хом’яків, кроликів, овець, собак, кішок та курей. Тварини повинні знаходитися під наркозом (крім курей), вену треба перед взяттям крові оголити. У великих тварин (баран, вівця, кінь, корова) вену не оголюють, а використовують для зупинки кровообігу джгут, над яким і роблять пункцію. Для цього в області нижньої третини шиї в яремному жолобі вистригають шерсть, шкіру дезінфікують. Вище місця уколу накладають гумовий джгут, вводять голку по ходу добре видимої вени. Потім джгут знімають, і кров стікає у підставлену стерильну посудину.
Взяття крові з стегнової вени роблять у мишей, пацюків, тхорів, овець, собак, кішок, мавп при фіксації тварини на спині під наркозом. Після відповідної підготовки операційного поля розрізають шкіру на внутрішньому боці стегна і оголюють судину. У дрібних лабораторних тварин пункція вени неможлива, тому її надрізають, і кров збирають у шкіряний карман. Після тампонади рану закривають.
Кровопускання через шийну артерію можна здійснити у крупних наркотизованих тварин: кроликів, кіз, баранів, тощо. В області шийного судинного пучка вистригають шерсть, дезінфікують шкіру. Збоку від гортані розрізують шкіру, остерігаючись пошкодити яремну вену. Обережно відводять вбік грудинно-ключично-сосковий м’яз, під ним знаходять нервово-судинний пучок, який розділяють і піднімають пінцетом шийну артерію. Стискають її зажимом, надрізають ножицями і вставляють канюлю.
В дослідженнях використовують нерозведену кров, плазму, сироватку, еритроцити, лейкоцити. При необхідності, щоб запобігти зсіданню крові, в абсолютно суху посудину наливають 1/4 частину об’єму 25% розчину сульфату магнію чи 1/2 частину об’єму напівнасиченого розчину сульфату натрію і додають свіжоотриману кров у кількості 3/4 та 1/2 частини відповідно. Використовуються також водні розчини: 20% розчин цитрату натрію чи калію, 10% розчин фториду чи оксалату натрію. З цією ж метою використовують речовини тваринного походження: гепарин, пептон, гірудин, синантрин, тощо. В пробірки, градуйовані на 10 мл, наливають 0,3-0,5 мл одного з вищевказаних антикоагулянтів (консервантів) (табл.2.8) і доливають свіжу кров до мітки. Їх закривають й ретельно перемішують. Треба пам’ятати, що кров з консервантами необхідно досліджувати якнайшвидше.
Одержання сироватки крові
Для одержання сироватки кров збирають в пробірку, не допускаючи її спінювання. Для цього струмок крові, що витікає з судини, слід спрямовувати по стінці пробірки. Зібрану кров залишають на 1 год при кімнатній температурі або в термостаті при +37°С на 20-30 хв. Утворений згусток крові відділяють від стінки пробірки тонкою скляною або металевою паличкою, піпеткою Пастера чи металевим дротиком, обережно обводячи ними по стінці пробірки навколо згустку, і залишають на ніч в холодильнику. Одержану сироватку відсмоктують піпеткою чи шприцом з голкою в стерильний флакон, центрифугують 10-15 хв. при 2000 об/хв, фільтрують через бактеріальні фільтри чи додають антибіотики (по 100-200 ОД пеніциліну та стрептоміцину на 1 мл).
Строки зберігання сироватки визначаються умовами досліду. Звичайно сироватку зберігають на холоді або при температурі від 0 до +4°С в холодильнику, чи заморожуючи (-10-20°С). Для попередження розвитку мікрофлори при тривалому зберіганні сироватки її слід законсервувати, додаючи фторид натрію, тимол (на 10 мл сироватки 5 мг чи 3 мг відповідно), мертиолят натрію, азид натрію, тощо.
Одержання еритроцитів
Для одержання еритроцитів необхідно запобігти зсіданню крові, що здійснюється шляхом використання антикоагулянтів (табл.2.8) або дефібрінуванням з допомогою гладких скляних бус.
Свіжоотриману кров зливають в стерильну колбу з притертою пробкою та скляними бусами, що вкривають дно посудини в два шари. Кількість крові не повинна перебільшувати 1/4 об’єму колби. При взятті крові флакон з бусами необхідно безперервно струшувати з моменту заповнення посудини до повного остигання крові. Приблизно через 20 хв нитки фібрину (білку, що утворюється з білку плазми крові фібриногену під дією ферменту тромбіну) осаджуються на бусинах, а вільну від нього кров переливають в іншу посудину. Остигла дефібринована кров втрачає здатність зсідати. Її фільтрують через стерильну марлю, і еритроцити 3-4 рази відмивають центрифугуванням в ізотонічному розчині хлориду натрію, кожен раз осаджуючи еритроцити по 10-15 хв. при 2000-3000 об/хв. Після останнього відмивання надосадова рідина повинна бути безбарвною і прозорою. З осаду еритроцитів, який приймають за 100%-ну суспензію, готують суспензію відповідної концентрації на 0,85%-му розчині хлориду натрію чи фосфатно-буферному розчині. В такому вигляді еритроцити зберігаються протягом 3-4 днів при +4°С.
Кров у однієї й тієї ж тварини можна брати не частіше двох разів на місяць. Кількість крові, необхідну для приготування 1%-ї суспензії еритроцитів, можна обчислити за формулою:
,
де V4 - об’єм крові, мл;
V1 - об’єм потрібної кількості 1%-ї суспензії еритроцитів, мл;
2х - середній показник вмісту еритроцитів в крові (коефіцієнт);
1 - відсоток потрібної суспензії.
Приклад. Необхідно одержати 250 мл 1%-ї суспензії еритроцитів. За формулою обчислюємо:
Отже, для приготування 250 мл 1%-ї суспензії еритроцитів треба взяти від тварини приблизно 5 мл крові. А для одержання 1%-ї суспензії змішується 1 частина осаду еритроцитів з 99 частинами ізотонічного 0,85%-го розчину хлориду натрію.
Одержання плазми
За звичайних умов рідка частина крові – плазма – швидко зсідає, що обумовлено наявністю в ній білка фібриногену. Запобігти зсіданню крові для одержання плазми можливо за допомогою додавання до неї антикоагулянтів. З цією ж метою поверхню пробірки, в яку в подальшому збиратимуть плазму, покривають шаром парафіну. Для цього в чисті центрифужні пробірки наливають по 0,5 мл розплавленого парафіну, закривають ватними пробками і автоклавують у вертикальному положенні (0,5 атм 20 хв.). Перед використанням пробірки підігрівають і охолоджують при уповільненому обертанні таким чином, щоб парафін не потрапляв на пробки, а рівномірно розподілявся по внутрішній поверхні пробірок.
Для одержання плазми кров у тварин беруть натщесерце під наркозом і поміщають у парафіновані центрифужні пробірки, які центрифугують протягом 15 хв при 2500 об/хв. Надосадова рідина і є плазмою крові.
Таблиця 2.8.
Антикоагулянти
|
Назва |
Приготування та використання |
|
Альсевера розчин |
24,6 г глюкози, 9,6 г лимоннокислого натрію, 5,04 г хлориду натрію та 1200 мл дистильованої води; використовують у співвідношенні 1:1 для крові барана та 1:5 для крові мурчака. В крові, змішаної з рівним об’ємом розчину Альсевера, еритроцити зберігаються при +4°С протягом 10-12 і більше днів. |
|
Гепарин (активність 5000 ОД/мл) |
0,2 мл рідкого гепарину на 100 мл крові, або 0,2 мг сухого гепарину на 100 мл крові |
|
Гепаринат натрію чи калію |
60 мг гепаринату натрію чи калію в 20 мл дистильованої води; 0,1 мл розчину на 2 мл крові в нагріті до +37°С пробірки |
|
Гепаринат літію |
60 мг гепаринату літію в 20 мл бідистильованої води; 0,1 мл розчину на 2 мл крові в нагріті до +37°С пробірки |
|
ЕДТА-натрію |
300 мг натрію етилендіамінтетраацетату в 200 мл бідистильованої води; 0,1 мл розчину на 2 мл крові в прогріті до +37°С пробірки |
|
Оксалат натрію |
300 мг в 20 мл бідистильованої води; 0,1 мл розчину на 2 мл крові в сухі пробірки |
|
Цитрат натрію |
а) 5 г лимоннокислого натрію, 0,85 г хлориду натрію і довести до 200 мл дистильованою водою; 1/3 об’єму цитрату натрію та 2/3 крові; б) 1 частина 3,8% цитрату натрію і 9 частин крові |
|
Цитратно-глюкозна суміш |
4,7 г лимонної кислоти, 16 г тризаміщеного цитрату натрію, 25 г глюкози в 1000 мл бідистильованої води; 1 частина розчину та 4 частини крові |
Одержання лейкоцитів
Суспензію лейкоцитів можна одержати двома способами. В обох застосовуються антикоагулянти. Один із них – за методом Робіно. До 30 мл крові додають гепарин з розрахунку 0,0001 мг на 1 мл крові. Суміш інкубують в похилому положенні під кутом 45° при +37°С до повного осадження еритроцитів. Для підсилення цього процесу додають 3%-ну суспензію полівінілпірролідону з розрахунку 20-40% від об’єму крові. Повністю еритроцити осаджуються протягом 30-40 хв. Надосадову рідину центрифугують при 1500 об/хв протягом 2 хв, при цьому лейкоцити випадають в осад. Після видалення надосадової рідини осад розводять 5 мл фізіологічного розчину (рН 7.0), який додають краплями. Лейкоцити осаджують протягом 30 хв. Осад двічі відмивають фізіологічним розчином. Одержують гомогенну масу лейкоцитів.
Метод одержання лейкоцитів за Ванцетті та Каудіаном заключається в наступному. До 6 мл крові в градуйованій пробірці додають 1,5 мл 3%-ї суспензії гумміарабіку та 1,5 мл 3%-го цитрату натрію нейтральної реакції. Суміш збовтують і залишають на 30-40 хв для осадження еритроцитів. Поверхневий шар знімають і центрифугують при 1000 об/хв протягом 3 хв. Осад одержаних лейкоцитів суспендують у фізіологічному розчині.
Евтаназія
Після закінчення досліду тварин, що залишилися живими, піддають евтаназії, або умертвляють. Евтаназія – це гуманне безболісне умертвіння тварин, що вийшли з експерименту.
Умертвіння тварин здійснюється в спеціальній секційній кімнаті у відсутності інших тварин. Проводити евтаназію потрібно з максимально можливою швидкістю. Тварину умертвляють своєчасно до настання хворобливого стану і до припинення дії наркозу.
Оптимальним методом умертвіння є введення наркотичної речовини в летальній дозі. Так, собак можна умертвити, вводячи їм інтравенозно хлоралгідрат в дозі не менше 0,5 г на 1 кг живої ваги тварини або сульфат магнію 20-40 мл насиченого розчину. Треба пам’ятати, що останній може викликати збудження. Мавпам для умертвіння роблять наркоз 5% розчином тіопенталу, вводячи його або інтрамускулярно в кількості 1-2 мл на тварину (в залежності від її розміру), або інтравенозно в стегнову вену в дозі 1,5-2 мл на тварину (в залежності від ваги тіла). Потім тварину знекровлюють через шийні кровоносні судини.
Дрібних тварин (миші, пацюки, тхорі, кролики, хом’яки, мурчаки, птахи, жаби) допускається піддавати евтаназії шляхом розриву спинного мозку. Для цього тіло тварини утримують однією рукою за потилицю, а другою – за хвіст і швидким коротким рухом розтягують до відчуття обриву нитки. Менш гуманний спосіб – декапітація (відрізання голови). Найпоширеніший метод евтаназії таких тварин з допомогою інгаляційного наркозу ефіром, хлороформом, який здійснюють або в скляній посудині, або в спеціальній камері з кімнатною температурою. Курям відрізають голову або оглушають ударом по голові та перерізають шийні судини. Кроликів слід забивати шляхом повітряної емболії, великих тварин (дорослих собак, свиней, тощо) – за допомогою електричного струму, вводячи електроди в довгастий мозок та крижі. За необхідністю вивчати мозок тварину піддають миттєвому заморожуванню шляхом занурення тварини в рідкий азот.
Для тотального знекровлювання таких тварин, як мурчаки, кролики, собаки, мавпи перерізають сонну артерію. Роблять поздовжній розріз шкіри на шиї, трохи відступаючи від середньої лінії, і оголюють сонну артерію. Відпрепарувавши її від нерва, накладають на неї дві лігатури, тобто перев’язують у двох місцях на невеликій відстані одну від одної. Перерізують артерію між лігатурами. Кінець судини, що йде до серця, оголюють, направляють в стерильну пробірку і знімають лігатуру. Кров повинна струменем поступати в пробірку. Щоб струмінь крові не слабшав, масажують область серця, печінки, селезінки. Для знекровлювання дрібніших тварин (мишей, пацюків, хом’яків) роблять звичайний розріз шиї та шийних судин і збирають витікаючу з рани кров. Курей знекровлюють шляхом відрізання голови.
Розтин лабораторних тварин – порядок та техніка
Перед початком розтину збирають докладний анамнез (вивчають історію хвороби), що дозволяє в процесі розтину виділити головні зміни в організмі тварини, точніше визначити хворобу і вивчити її наслідки.
Труп, призначений для розтину, спочатку піддають зовнішньому огляду, визначаючи вік, масу, будову тіла, угодованість, трупні зміни, стан шкіри та видимих слизових оболонок, поверхневих лімфатичних вузлів, скелетних м’язів, кісток, суглобів. Після цього роблять внутрішній огляд – розтин грудної та черевної порожнин, дослідження вилучених органів, розтин носової та придаткової порожнин, шиї, розтин черепа та хребта, вилучення та дослідження головного та спинного мозку.
Зовнішній огляд трупа починають з визначення віку (за станом зубів), виду, статі, масті, породи, маси, розмірів (довжини та висоти) тіла. Будова тіла буває міцною, пропорційною, та слабкою, непропорційною. При виявленні відхилень в будові тіла відмічають, в чому вони проявляються (викривлення хребта чи кінцівок, тощо). Звертають увагу на форму та розмір живота (збільшений, підтягнутий). Угодованість визначається після зняття шкіри за станом підшкірного жиру та мускулатури. У виснажених тварин жир під шкірою відсутній, чітко виступають ребра, хребет. При ожирінні велика кількість жиру накопичується під шкірою, між м’язами та біля нирок.
При описі трупних змін спочатку звертають увагу на охолодження трупа, яке в значній мірі залежить від пори року: холод прискорює, а тепло уповільнює цей процес. При трупному задубінні відмічають нерухомість та затвердіння скелетної мускулатури, що визначається за рухомістю щелеп та кінцівок в суглобах. При трупному розкладі характерне сіро-зелене забарвлення тканин в області черевних стінок і поява смердючого запаху.
Трупні плями (гіпостази, імбібіція) помітні після зняття шкіри на внутрішній її поверхні, в підшкірній клітковині, в тих частинах трупа, що знаходяться під нею. На відміну від крововиливів плями мають нечіткі межі, бліднуть при натискуванні пальцем.
При огляді шкіри відмічають стан волосяного, шерстяного чи пір’яного (у птахів) покриву: блиск чи тьмяність, скуйовдженість, наявність та характер ділянок без волосся, тощо. Потім звертають увагу на колір, еластичність, цілісність шкіри, наявність на ній ерозій, виразок, рубців, пустул, папул, афт, крововиливів. Далі досліджують шкірні утворення: роги, копита, кігті, гребінь, сережки (у птахів). Вони можуть бути деформованими, різної консистенції, відділятися важко або легко.
Після зовнішнього огляду трупа досліджують природні отвори: рот, очі, анус, клоака, які бувають закриті чи відкриті. Встановлюють стан слизових оболонок – колір, блиск, характер уражень та виділень (кров’янисте, гнійне, пінисте).
При огляді зовнішніх лімфатичних вузлів (підщелепних, заглоткових, поверхневих шийних, пахових) відмічають їхній розмір, консистенцію, колір з поверхні (а подалі й у розрізі), ступінь кровонаповнення.
Внутрішній огляд здійснюють в процесі розтину трупа тварини. Перед розтином трупу надають певного положення. Трупи великих тварин розтинають в боковому лівому (велика рогата худоба) чи правому (коні) положенні, а середніх та дрібних тварин (мавпи, свині, собаки, кішки, кролики, мурчаки, миші, пацюки, кури, тощо) – в спинному положенні.
Розтинати тварин треба якнайшвидше після їхньої загибелі, тому що в трупному матеріалі віруси швидко гинуть через протеоліз.
Для вірусологічних досліджень лабораторних тварин розтинають відповідно до методики патологоанатомічного розтину з суворим дотриманням правил асептики, антисептики та техніки безпеки.
Для того, щоб більш точно визначити забарвлення тканин та органів тварин, трупи розтинають при денному світлі.
В приміщенні для розтину (секційний зал чи спеціальна кімната) необхідно мати дезінфікуючі засоби: для обробки місця розтину – хлорне вапно чи 10%-й розчин їдкого натрію, а для дезінфекції трупів дрібних тварин та рук дослідника – 2-3%-й розчин фенолу та хлораміну, відповідно, чи 70%-й етиловий спирт.
Набір інструментів для розтину буває мінімальним (секційний ніж, ножі для кісток, прямі та зігнуті ножиці, скальпель, хірургічний та анатомічний пінцети, пилка та молоток-сокирка) та повним. Розтин виконують стерильними інструментами.
Перед розтином труп дезінфікують: дрібних тварин занурюють в 2-3% розчин фенолу, тримаючи за хвіст, крупних – змочують шерсть по лінії розрізу 70% етиловим спиртом чи дезінфікуючим розчином. Курей на 20-30 сек. занурюють у 2% розчин карболової кислоти.
Трупи крупних лабораторних тварин фіксують на спеціальних секційних столах, кюветах, пластинах чи дошках, де є пристосування для перешкоджання витоку рідини та фіксації кінцівок і голови.
Трупи дрібних тварин фіксують животом догори, приколюючи ін’єкційними чи одностержньовими (кравецькими) голками кінцівки до дошки (дерев’яної чи з пенопласту) або до кювети з парафіном. Можна використовувати спеціальну дошку з прибитими по кутах цвяхами, до яких прив’язують кінцівки тварини. Робочі поверхні всіх секційних приладів повинні бути покритими папером, насиченим дезінфікуючим розчином.
Основне правило розтину: до трупа можна доторкатися тільки інструментами чи руками в гумових рукавичках.
Розтин середніх та дрібних тварин здійснюють за певними схемами, одна з яких – схема Вагенера (рис.2.14). Розріз шкіри роблять по білій лінії живота від лобкової кістки (симфізу) до шиї. Щоб при цьому не перерізати черевну стінку, пінцетом підіймають шкіру і роблять спочатку поперечний надріз складки шкіри поблизу симфіза, а потім, встромивши одну браншу ножиць в утворений отвір, розрізують шкіру до шиї тварини. Потім лінію розрізу продовжують у напрямі всіх чотирьох кінцівок до пахвової ямки та колінної складки, які треба оголити для досліджень лімфатичних вузлів. Тупим інструментом відпрепаровують шкіру від підшкірної клітковини та мускулатури, відкриваючи клапті шкіри вправо та вліво і приколюючи їх голками за верхні та нижні кути. Щоб уникнути контамінації секційного матеріалу вмістом травного каналу, спочатку роблять розтин грудної порожнини і беруть секційний матеріал перед розтином черевної порожнини.
При розтині грудної порожнини в наддіафрагмальній області роблять поперечний розріз м’язів, пінцетом підхоплюють мечовидний відросток, а ножицями вздовж грудної кістки з двох сторін від неї перерізують ребра. Вирізану грудину разом з ребрами підіймають догори, при цьому утворюється отвір для огляду грудної порожнини. Спочатку досліджують об’єм та консистенцію легень, стан плеври (колір, блиск, тьмяність), наявність крововиливів, вузлів, еластичність, тощо. Далі відмічають форму серця, стан передсердь, шлуночків, епікарду, жирової клітковини, наявність крововиливів. При розрізі порожнин серця досліджують ендокард, міокард, клапани, кількість крові, її колір та ступінь зсідання. Органи та тканини грудної порожнини беруть перед розтином черевної порожнини і поміщають в стерильні флакони.
Розтин черевної порожнини роблять після заміни інструментів на стерильні. Ножицями роблять розріз від мечоподібного відростку під лінією діафрагми по білій лінії живота до лобкової кістки, відкриваючи піддіафрагмальну область і відділяючи стінку живота з обох сторін від реберної дуги. Утворені трикутники черевної стінки відводять в боки і фіксують. Кишечник відтягують пінцетом вліво до тих пір, поки не відкриються селезінка, печінка та нирки. Змінивши інструмент, видаляють органи. Огляд починають з селезінки. Визначають її розміри, краї (гострі чи округлі), колір, форму, консистенцію (щільна, м’яка, пухка), встановлюють наявність некрозів, інфарктів, крововиливів, тощо. При огляді печінки визначають розміри, вид її країв (гострі, тупі), консистенцію (щільна, пухка), колір (коричневий, жовтий, сіруватий), характер поверхні (гладка, зерниста, вузлувата). При обстеженні нирок звертають увагу на їхні розміри, форму, консистенцію, стан капсули, колір. У сечового міхура визначають об’єм, стан серозної оболонки, кількість та колір сечі.
При необхідності видаляють шлунок та кишечник і досліджують їхні відділи, колір, кількість та запах вмісту.
|
Рис.2.14. Розтин грудної та черевної порожнин трупа лабораторної тварини за Вагенером. |
За умов досліду розтинають ротову (роблячи розріз щік між обома щелепами) та носову порожнини, вивчаючи язик, мигдалики, їхню величину, стан слизових оболонок, наявність гнійників. Розрізують глотку та стравохід, визначаючи стан слизових оболонок. Потім розрізують стінку гортані, трахеї та крупних бронхів, відмічаючи характер вмісту (кров’яниста чи піниста рідина, слиз, гній, тощо), стан слизових оболонок. Оглядають щитовидну, паращитовидну та зобну залози.
За необхідністю дослідження центральної нервової системи, а саме головного та спинного мозку, спочатку розтинають черепну коробку, закріпивши тварину в черевному положенні шляхом фіксації передніх кінцівок та голови, шкіру голови та шиї обробляють дезінфікуючим розчином. Розріз шкіри роблять перпендикулярно до вісі тіла за вухами, на потилиці і продовжують зліва та справа уперед до орбіт (рис.2.15).
|
Рис.2.15. Послідовність розтину черепної порожнини тварини. |
Шкіру разом з вухами відпрепаровують і відкидають вперед, оголюючи черепну коробку. Одну браншу ножиць вставляють у великий черепний отвір (чи у вушний отвір) і розрізують кістки черепа зліва та справа в напрямку до орбіт. Потім розрізують кістки черепа між орбітами і видаляють всю вирізану ділянку. Якщо кістки черепа товсті, їх розпилюють в тих же напрямках. Можна розрізи черепа вести від орбіт назад. Головний мозок тварин, який має м’яку консистенцію, видаляють з основи черепа, піднявши його злегка розкритими браншами ножиць і підрізавши черепно-мозкові нерви. Його досліджують з поверхні, потім поздовжнім розрізом розсікають на дві частини. Розтинають і оглядають бокові шлуночки, довгастий мозок, мозочок, амонові роги, смугасте тіло, епіфіз.
Враховуючи, що специфічні для деяких вірусів зміни можуть бути локалізованими в різних відділах головного мозку, роблять відбитки його таким чином. Мозок тварини з розтятої черепної коробки, не ушкоджуючи структури, переносять на аркуш фільтрувального паперу розміром 1010 см, де він достатньо міцно фіксується. Браншами ножиць відрізають по вертикальній площині невеликий шматочок його і кладуть поряд на папір. Потім відрізають наступний шар мозку, який також кладуть поруч і т.д. Взявши в одну руку аркуш паперу з фіксованими на ньому шматочками мозку, другою рукою прикладають зверху до кожного по черзі предметне знежирене скельце, і отримують відбитки.
Для взяття шматочків спинного мозку випилюють окремі ділянки хребта і стерильним металевим стержнем з ватним тампоном виштовхують ділянки спинного мозку в стерильний посуд. Забирати спинний мозок необхідно з шийного, грудного та поперекового відділів. Після зняття твердої мозкової оболонки вивчають спинний мозок з поверхні і на поперечному зрізі. Відмічають чіткість меж сірої та білої речовин, колір, вологість, кровонаповнення, консистенцію, стан міжхребцевих вузлів.
При дослідженні скелетної мускулатури відмічають ступінь її розвитку (атрофія, гіпертрофія), колір, консистенцію, малюнок волокон на поздовжньому розрізі, стан міжм’язевої сполучної тканини.
Оглядаючи кістки, відмічають їхню цілісність, розмір, консистенцію (тверда, м’яка), вид надкісниці, кісткової тканини, кісткового мозку, форму суглобів, характер вмісту суглобової сумки.
Шматочки відібраного секційного матеріалу та органи зберігаються або в законсервованому вигляді у стерильному 50%-му гліцерині на ізотонічному розчині хлориду натрію (рН 7.4-7.6), або в замороженому при –20-70°С стані.
Після розтину тварин і взяття патологічного матеріалу всі інструменти дезінфікують та стерилізують. Трупи тварин, залишки корму та води, підстилку знищують в спеціальних лабораторних крематоріях чи кремаційних печах або піддають автоклавуванню. Металеві клітки та кормушки знезаражують вогнем паяльної лампи чи обливають бензином та обпалюють. Дерев’яні предмети оброблюють гарячими дезінфікуючими розчинами.
Застережні заходи при роботі з інфікованими лабораторними тваринами
Для догляду за лабораторними тваринами допускаються особи, що мають необхідну кваліфікацію і одержали спеціальний інструктаж по техніці безпеки роботи з інфекційним матеріалом. Осіб віком менше 18 років не слід допускати до роботи з інфікованими лабораторними тваринами. Особи, що мають захворювання шкіри чи відкриті рани, можуть бути допущеними до роботи з лабораторними тваринами тільки з дозволу лікаря і за умовою дотримання санітарно-гігієнічних заходів (щільні захисні пов’язки, гумове взуття, тощо).
Особливу увагу слід приділяти заходам особистого захисту від небезпеки зараження. Під час роботи з лабораторними тваринами обслуговуючий персонал повинен бути одягненим згідно існуючим вимогам в спеціальний одяг та непроникне взуття, що легко дезінфікуються. Спецодяг та взуття повинні бути чистими, їх необхідно міняти не рідше одного разу на тиждень. Після використання гумовий одяг та взуття (фартухи, чоботи, рукавички) необхідно зразу ж вимити водою і продезінфікувати. Спецодяг слід використовувати тільки під час догляду за тваринами та їхнього обстеження, зберігати в спеціальних шафах в роздягальні окремо від повсякденного одягу.
Для осіб, що доглядають за лабораторними тваринами, необхідно створити умови для додержання особистої гігієни. В усіх душових кімнатах, а також в боксах, де утримуються тварини, необхідно мати посудини з дезінфікуючими засобами, гарячу та холодну воду, мило, рушник.
Під час роботи з лабораторними тваринами, особливо з птахами, необхідно стежити, щоб в приміщенні не було пилу.
Витягати тварин з кліток, брати їх в руки, проводити фіксацію, зараження, обстеження та умертвіння можуть тільки працівники, що мають досвід роботи в цій галузі. В залежності від виду тварин необхідно застосовувати відповідні допоміжні засоби (пінцети, корнцанги, зажими, тощо) і використовувати певні захисні пристосування (гумові, шкіряні, металеві рукавички, тощо).
До дрібних тварин по можливості не слід доторкатися незахищеними руками.
Під час досліджень з лабораторними тваринами, інфікованими патогенними для людини вірусами, роботу проводять під захисним ковпаком, за захисним екраном, в масці, захисних окулярах, рукавичках, використовуючи дихальні апарати з подачею повітря.
Інструменти, обладнання та прилади, що знаходяться в приміщенні для тварин і можуть бути заражені інфекційними збудниками, небезпечними для людини, слід дезінфікувати, якщо їх за якимись причинами виносять з приміщень для тварин.
Особливу увагу слід приділяти техніці безпеки при розтині трупів інфікованих лабораторних тварин. Щоб застерегти себе та оточуючих від зараження, трупи розтинають в спецодязі – халат темного кольору, прогумований, гумовий чи синтетичний фартух та нарукавники, гумові чоботи чи калоші, гумові рукавички, полотняна шапочка чи марльова косинка.
Перед розтином руки миють з милом, а при наявності на шкірі рук подряпин, тріщин чи задирок їх дезінфікують спиртовим розчином йоду і закривають колодієм чи пластиром. По закінченні розтину руки миють водою та дезінфікують 3%-м розчином фенолу чи хлораміну. Для знищення трупного запаху їх можна обробити 5%-м розчином хлоралгідрату або марганцевокислим калієм в розведенні 1:1000, а потім насиченим розчином щавлевої кислоти.
Спецодяг та інструменти обмивають водою та дезінфікують 3%-м розчином фенолу, хлораміну або креоліну. Приміщення чи робочий стіл після розтину трупів очищують водою і дезінфікують 3-4%-м розчином їдкого натрію. Трупи складають в спеціальну непроникну для рідини тару і піддають біотермічній утилізації.
Лабораторне заняття
Завдання:
Матеріальне забезпечення:
Лабораторні тварини (білі пацюки або миші), разові гумові рукавички, барвники для кольорового маркування тварин (водні розчини пікринової кислоти та фуксину), ефір, вата, ексикатори, пінопластові або парафінові дошки та голки для фіксації тварин, 2% спиртовий розчин йоду, скляні палички, 75% етанол, стерильні шприци на 2 мл з голками, фізрозчин, вата, піпетки Пастера, стерильні інструменти (ножиці, пінцети, корнцанги, скальпелі), склянки для інструментів з дезрозчином, стерильні чашки Петрі для секційного патологічного матеріалу, пакети для сміття (бажано такі, що герметично закриваються), мило, рушник.
Хід роботи:
Методичні рекомендації:
Бажано використовувати одного пацюка на два студенти, оскільки наркотизацію, інтравенозне ураження та розтин тварини зручніше проводити вдвох.
Будь-яка робота з тваринами вимагає дотримання головного правила - до тварини можна доторкатися тільки інструментами чи руками в гумових рукавичках.
При застосуванні пацюків маркування доцільніше проводити після наркотизації внаслідок агресивності тварин або ж навіть після експериментального ураження.
У випадку застосуванні пацюків при їх наркотизації інгаляцією у замкненому просторі можна використовувати лише ефір, але не хлороформ, оскільки останній викликає у цих лабораторних тварин суттєвий набряк легень, що може призвести до їх передчасної загибелі.
Фіксація тварини на дошці може проводитися двома шляхами – вниз та догори черевом, відповідно. Інтравенозне та інтраназальне ураження вимагає фіксації черевом униз, а інтрамускулярне та інтраперітонеальне – черевом догори.
При підготовці шприца до ураження (наборі інокуляту) потрібно пам’ятати, що у випадку інтравенозного ураження у набраній рідині ні в якому разі не повинні бути пухирці повітря. Їх введення у вену спричинює швидку загибель тварини (протягом 1-5 хв) внаслідок повітряної емболії. Від повітря у шприці можна звільнитися, повернувши його вертикально голкою догори, попередньо увіткнувши її у товщу стерильного шматочка вати, загорнутого у паперовий конверт, та злегка натиснувши на поршень. Вата допомагає звільнитися від пухирців повітря, перешкоджаючи при цьому розповсюдженню вірусного препарату зі шприцу. Також при будь-якому методі ураженні потрібно враховувати допустимий об’єм рідини, який можна вводити відповідним способом (табл.2.7).
Перед будь-яким ураженням необхідно депілювати та дезінфікувати відповідну ділянку шкіри. При інтраназальному ураженні потрібно правильно розрахувати час наркотизації, оскільки при слабкому наркозі у тварини виникає чхальний рефлекс, тварина поштовхами намагається вивести матеріал з дихальних шляхів, він розбризкується і може інфікувати експериментатора та зовнішнє середовище. При надто глибокому наркозі дихання тварини стає поверхневим, і матеріал погано втягується в ніздрі. У випадку інтравенозного ураження потрібно розширити бічні хвостові вени пацюка. Для цього іх масажують або тримають декілька хвилин у гарячій воді. Один студент передавлює вену у кореня хвоста, щоб вона набрякла (кров тече у напрямку до кореня). Голку вводять під гострим кутом у напрямку до кореня хвоста. Якщо голка попала в судину, то рідина легко виходить з шприцу, а вена нижче стає прозорішою. Звільнивши вену поблизу кореня, повільно вводять матеріал. Надалі вену знову передавлюють нижче місця ін’єкції, виймають голку, а місце введення матеріалу притискають сухою ватою. При інтрамускулярному ураженні матеріал вводять голкою майже перпендикулярно поверхні тіла, проколюючи шкіру, підшкірну клітковину та товщу м’язів в області стегна. Для інтраперітонеального ураження тварину спеціально фіксують головою вниз для того, щоб внутрішні органи та кишечник опустилися до діафрагми. Місце ін’єкції визначають в нижній третині живота вище симфізу, трохи відступаючи від серединної лінії живота. Рукою злегка відтягують лапу тварини, створюючи натяг шкіри та м’язів черевної стінки. Для попередження поранення кишечнику та внутрішніх органів кінець голки повинен бути тупим (сточеним) або ж голка має бути коротка (від інсулінового шприцу).
При розтині тварин на дошку для фіксації потрібно покласти лист паперу відповідного розміру або більшого, зверху якого фіксують труп тварини. Після розтину тварину загортають у цей папір та викидають у контейнер для трупів або відповідний пакет. Для уникнення контамінації органів спочатку розтинають череп тварини, потім грудну порожнину, потім черевну. На кожному етапі використовують новий набір стерильних інструментів.
Контрольні завдання:
Контрольні запитання:
Література:
Дроздов С.Г., Гарин Н.С., Джиндоян Л.С., Тарасенко В.М. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологических лабораториях. –М., 1987.
Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария В.А. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. –К., 1974.
Каришева А.С., Сюрин В.Н. Руководство по практической вирусологии (справочное пособие). –Кишинев: «Штиинца», 1980.
Лоскутова З.Ф. Виварий. –М.: Медицина, 1980.
Любина А.Я., Неменова Ю.М., Полеес М.Э., Чернобельская Г.М. Руководство к практическим занятиям по технике лабораторных работ. –М., 1988.
Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных. Справочное издание / под ред. Н.И. Архипова. –М., 1984.
Посібник з медичної вірусології / під ред. В.М. Гиріна. –К.: Здоров’я, 1995. -367 с.
Практикум із загальної вірусології / за ред. А.Л. Бойка. –К.: Видавничий центр „Київський університет”, 2000. -269 с.
Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. –М., 1973.
Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник. –М., 1986.
Топчий М.К., Корнюшенко Н.П. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. –К., 1967.
Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. –М.: Агропромиздат, 1989. -287 с.
Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мимс С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. „Биология вирусов животных”. т.1. –М.: Мир, 1977. -447 с.
Luckey T.D. Introduction to gnotobiology // Proceedings of the IX International Congress for Microbiology, Moscow, 1967.
Тема 2. Курячі ембріони та їх використання у вірусології
Зміст
Будова курячого ембріону
Підготовка курячих ембріонів до ураження
Методи експериментального ураження курячих ембріонів
Ознаки розмноження вірусу в курячому ембріоні
Розтин курячого ембріону та отримання вірусовмісного препарату
Практична частина
Мета заняття
Матеріальне забезпечення
Хід роботи
Контрольні завдання
Контрольні запитання
Завдання для самостійної роботи студентів
Література
Вступ
Метод культивування вірусів на курячих ембріонах стали широко застосовувати після того, як Вудруфф та Гудпасчур в 1931р. описали зараження хоріоналантоїсної оболонки курячого ембріону вірусом курячої віспи. В 40-х роках з’явилось багато робіт по культивуванню різноманітних вірусів - віспи, вісповакцини, простого герпесу, лихоманки долини Ріфт, весняно - літнього енцефаліту, Омської геморагічної лихоманки та інших. Було відмічено, що існує деяка вибірковість у вірусів до тоієї чи іншої тканини. Віруси віспи добре розмножувались на хоріоналантоїсній оболонці, вірус паротиту - в амніоні, вірус грипу - в амніоні та в алантоїсній порожнині. Сьогодні майже в усіх вірусологічних лабораторіях проводять роботу на курячих ембріонах, тому що цю експериментальну модель зручно використовувати для:
- виявлення вірусу в патологічному матеріалі;
- первинного виділення вірусу;
- культивування, зберігання та накопичення вірусу в лабораторних умовах;
- титрування вірусів;
- як тест-об’єкт для реакції нейтралізації;
- визначення ефективності противірусних препаратів.
Будова курячого ембріону
Куряче яйце знаходиться в шкаралупі, через пори якої здійснюється газообмін. Під шкаралупою лежить підшкаралупна оболонка. У результаті запліднення в ході дроблення яйцеклітини утворюється три зародкових шари: ектодерма, мезодерма та ентодерма, з яких розвиваються тканини та органи ембріону. Разом з розвитком плоду утворюються екстраембріональні оболонки амніон та хоріон (або серозна оболонка ). Амніон знаходиться безпосередньо біля зародку. Це мішок з рідиною, в якому розташоване тіло ембріону. Амніотична рідина на початку розвитку являє собою фізіологічний розчин солей, який надалі збагачується білком. Кількість амніотичної рідини на 10-11 день розвитку ембріону становить приблизно 1 мл.
Хоріон знаходиться безпосередньо під підшкаралупною оболонкою. На ранній стадії розвитку ембріону з нього утворюється виріст - алантоїс, що є порожнинним органом. У процесі розвитку алантоїс проходить між амніоном та хоріоном і оточує зародок разом з жовтком. Алантоїс розвивається дуже швидко, його максимальний ріст відбувається з 4 -го по 13 -й день розвитку. Оболонка алантоїсу частково зрощується з хоріоном, утворюючи хоріоналатоїсну оболонку (рис. 2.16 ). Це орган дихання зародку, тут розміщені кровоносні та лімфатичні судини. В останні дні розвитку ембріону хоріоналантоїсна оболонка атрофується, повітря поступає через пори шкаралупи і курча починає дихати легенями.
Алантоїсна порожнина - це орган виділення. На початку розвитку він заповнений прозорим фізіологічним розчином, а надалі збагачується уратами та речовинами, які містять азот та фосфор. З 12-13 дня розвитку рідина стає каламутною, а при охолодженні з неї випадає осад сечової кислоти. Кількість алантоїсної рідини досягає 6-8 мл на 11-13 день розвитку і поступово зменшується .
Ембріональні тканини з великою кількістю клітин, що швидко діляться, з високим обміном речовин є дуже сприятливим середовищем для культивування вірусів. Особливо це стосується оболонок ембріону, які багаті клітинами зародкового епітелію. Суттєву роль для розмноження вірусів відіграє жовткова оболонка, що оточує жовток. Він є органом живлення і під час розвитку поступово зменшується. У період з 5-го по 12-й день інкубації курячі ембріони можуть бути використані для ураження вірусами. Ураження в ту чи іншу частини ембріону проводяться в період її максимального розвитку, коли кількість чутливих клітин найбільша (табл. 2.9).
Підготовка курячих ембріонів до ураження.
Ембріони доставляють із інкубатора. У лабораторії ембріони інкубуються в термостаті при температурі 370С і вологості 60-70%. Ембріони розміщують повітряними камерами вверх у штативі. Підготовка курячих ембріонів до ураження включає овоскопування та дезінфекцію шкарлупи, а також відповідну підготовку робочого місця. При овоскопуванні на шкарлупі олівцем помічають: межі повітряної камери, місце розміщення зародка та ділянку безсудинної зони розміром 0,5х0,5 см. Ці відмітки служать орієнтиром при виборі місця введення вірусовмісного матеріалу. Місця ін'єкції обробляють йодованим спиртом.
Методи експериментального ураження курячих ембріонів. Існує кілька методів ураження ембріонів. Найбільш часто використовують ураження в алантоїсну порожнину та в хоріоналантоїсну оболонку, рідше – в амніотичну порожнину та жовтковий мішок і зовсім рідко - в тіло зародка та кровоносні судини хоріоналантоїсної оболонки. Вибір методу залежить від тропізму вірусу, а також цілі ураження. При будь-якому методі ураження вводять 0,1-0,2 мл інфекційного матеріалу.
Ураження в алантоїсну порожнину. При ураженні цим методом добре розмножуються віруси грипу, хвороби Ньюкасла, ринопневмонії коней, везикулярного стоматиту та інші. Існує кілька варіантів методу.
Ембріон фіксують вертикально тупим кінцем вверх. У шкаралупі на 5-6 мм вище межі повітряної камери роблять отвір діаметром 1 мм. Голку вводять паралельно повздовжній вісі на глибину 10-12 мм. Після ін’єкції вірусовмісного матеріалу голку виймають, а отвір в шкарлупі закривають краплею розплавленого стерильного парафіну.
Інший варіант методу полягає в тому, що зроблений у шкарлупі отвір над повітряною камерою використовують лише для виходу частини повітря. Отвір для самого ураження роблять на ділянці безсосудистої зони хоріоналантоїсної оболонки з боку зародка. Голку вводять на глибину 2-3 мм. Вводять вірусовмісну рідину об’ємом 0,1-0,2 мл і закривають отвір парафіном.
Ураження в хоріоналантоїсну оболонку. Цей метод ураження курячих ембріонів використовують частіше для культивування епітеліотропних та пантропних вірусів: віспи, інфекційного ларинготрахеїту птахів, катаральної лихоманки вівці та ін. Ураження може бути виконано через природну або через штучну повітряну камеру.
Для ураження через природну повітряну камеру ембріон розміщують в штативі вверх повітряною камерою і в шкаралупі проти неї вирізають віконце діаметром 15-20 мм. Через нього пінцетом знімають підшкорлупну оболонку, а на оголену ділянку хоріоналантоїсної оболонки (ХАО) наносять 0,2мл вірусовмісної суспензії, отвір закривають лейкопластирем або покривним склом, закріплюючи його парафіном.
Ураження через штучну повітряну камеру застосовують частіше, ніж через природну, тому що таке ураження забезпечує контакт вірусовмісного матеріалу з більшою поверхнею ХАО і як наслідок веде до утворення більшої кількості вірусу. Для ураження ембріону цим методом його поміщають у штатив горизонтально зародком вверх. У шкаралупі роблять два отвори: один невеликий над центром повітряної камери (необхідний для відсмоктування повітря), а інший діаметром 0,2-0,5см збоку, зі сторони зародку. Складність методу полягає в тому, що роблячи другий отвір, необхідно спочатку зняти шматочок шкаралупи, потім, не ушкоджуючи ХАО, зсунути підшкаралупну оболонку в сторону так, щоб через утворений отвір могло пройти повітря. Після цього гумовою грушею через перший отвір відсмоктують повітря з природної повітряної камери. У результаті через боковий отвір повітря заходить в середину, утворюючи штучну повітряну камеру, дном якої є ХАО.
Через боковий отвір на поверхню ХАО наносять інфекційну рідину і отвір закривають лейкопластирем. Перший отвір немає необхідності закривати, так як внутрішній листок
Таблиця 2.9.
Використання курячих ембріонів різного віку для культивування вірусів
|
Вірус |
Ембріони |
Застосування цього способу ураження для |
||||||||
|
Вік, дні |
Місце ін’єкції |
Інкубація |
виділення |
пассажів |
визначення титру |
Отримання АГ |
Проведення реакції нейтралізації |
|||
|
Год. |
С |
Діагностики |
Отримання вакцин |
|||||||
|
Віруси енцефалітів* |
9-12 |
ЖМ, ХАМ |
До смерті |
35-37 |
+ |
+ |
+ |
+ |
||
|
Вірус простого герпесу |
12 |
ХАМ |
72 |
41 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
Вірус грипу А |
10 |
А, АМН, ЖМ |
48 |
36 |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Вірус грипу В |
10 |
А, АМН, ЖМ |
72-96 |
35 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Вірус паротиту |
7 |
АМН, А, ЖМ |
144 |
35 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
Вірус сказу |
6-7 |
ЖМ |
240 |
36 |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
|
Вірус парагрипу 1 |
8 |
АМН |
120-168 |
35 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Вірус парагрипу 2 |
8-10 |
АМН, А |
120-186 |
35 |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Вірус вісповакцини |
12 |
ХАМ |
72 |
37 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
підшкаралупової оболонки при цьому методі ураження не порушується і продовжує виконувати роль бар’єру для мікрофлори оточуючого середовища.
Подальша інкубація ембріонів, уражених цим методом, проводиться в горизонтальному положенні боковим отвором вверх.
Ураження в жовточний мішок. Цим методом користуються найчастіше при роботі з вірусами хвороби Марека, ринопневмонії коней, катаральної лихоманки вівці. Уражають ембріони 5-7- денного, а інколи і 2-3 денного віку (вірус лихоманки долини Риф). Використовують два варіанти ураження.
Перший варіант. Ембріони поміщають у штатив вверх повітряною камерою, в шкаралупі над нею роблять розріз і вводять голку на глибину 3,5 – 4 см під кутом 450С до вертикальної осі в напрямку, протилежному місцю знаходження зародку.
Другий варіант. Ураження здійснюють на горизонтально закріпленому ембріоні, при цьому зародок знаходиться внизу, а жовток над ним. Отвір у шкаралупі закривають краплею розплавленого парафіну.
Ураження в амніотичну порожнину. Для цього методу ураження використовують ембріони 6-10 денного віку. Метод використовується при культивуванні вірусів грипу, н”юкаслської хвороби, ринопневмонії коней та ін. Є два способи ураження.
Закритий спосіб. Яйце поміщають на овоскоп в горизонтальному положенні зародком вверх. Через отвір в шкаралупі над повітряною камерою вводять голку з тупим кінцем в напрямку до зародку. Доказом того, що голка проникла в амніон, є рух тіла зародка в напрямку руху голки.
Відкритий спосіб. Шкаралупу над повітряною камерою зрізають так, щоб утворився отвір діаметром 1,5-2,5 см. Через нього пінцетом знімають підшкорлупну оболонку. Потім анатомічним пінцетом захоплюють ХАО і підтягують до отвору. Притримуючи лівою рукою пінцет з фіксованою в ньому оболонкою амніону, вводять вірусовмісний матеріал. Потім оболонки відпускають, отвір закривають лейкопластирем і ембріон інкубують у вертикальному положенні.
Описані методи найбільш часто використовують в лабораторній практиці. Ураження в тіло зародку та сосуди ХАО застосовують рідко.
Ураження в тіло зародка. Для ураження використовують ембріони 7-12 денного віку. Відомо два варіанти.
Перший варіант. Уражують так, як і в амніон закритим способом, з тією різницею, що беруть гостру голку і на овоскопі показником попадання голки в тіло вважають підпорядкування зародка руху голки.
Другий варіант. Уражують так, як і в амніон відкритим способом: через отвір в шкаралупі підтягують пінцетом тіло зародка. Матеріал вводять в головний мозок чи певні частини тіла. При таких методах ураженнях буває значний процент загибелі ембріонів.
Описані технічні прийоми експериментального ураження курячих ембріонів мають різні варіанти.
Уражені курячі ембріони поміщають до термостату для подальшої інкубації, в процесі якої проходить репродукція внесених вірусів та їх накопичення у відповідних структурах. Температура інкубації ембріонів варіює від 33 до 38 0С в залежності від властивостей вірусу, яким було проведено ураження.
За ембріонами ведуть постійне спостереження, переглядають на овоскопі.
Загибель ембріонів в перші 24 год після ураження частіше обумовлена розмноженням грибів, бактеріальної мікрофлори, внесених в ембріон разом з інокулятом, або травмованих при ураженні. Ця загибель вважається неспецифічною. У більш пізні строки ембріони гинуть у результаті, як правило, розмноження вірусів.
При роботі з вірусом грипу слід пам’ятати, що найбільше накопичення досягається при зараженні розведеним вірусом. Масовані дози дають малий вихід вірусу за рахунок утворення дефектних інтерферуючих часток (феномен фон Магнуса) та іноді призводять до загибелі ембріону. Тому при серійних пасажах вірусу грипу, щоб отримати культуру з високим титром, використовують його розведення в межах 10-3 - 10-4.
Ембріони інкубують до моменту максимального накопичення вірусу. Для кожного вірусу і навіть для штаму цей строк є визначеним і варіює в межах від 2 до 7-8 діб. Потім ембріони охолоджують при 40С протягом 3-4 годин і розтинають.
Ознаки розмноження вірусу в курячому ембріоні.
Показником ураження ембріона вірусом є його загибель у характерні для даного вірусу строки. Друга ознака розмноження вірусу – патологоанатомічні зміни, що з’являються у різних структурах ембріону. Наприклад, ХАО може мати набряк, крововиливи, вузли. Такі зміни спостерігаються при ураженні курячих ембріонів вірусами віспи птахів, інфекційного ларинготрахеїту птахів, хвороби Ауески та іншими. Сам зародок при цьому може відставати у рості і розвитку, тобто з’являється феномен карликовості. Внутрішні органи також можуть мати ознаки розмноження вірусу. Наприклад, набрякла жовто-зеленого або темно-зеленого кольору печінка курячого ембріону є ознакою розмноження в ньому вірусу гепатиту гусей.
Зустрічаються такі віруси (наприклад, штам В1 вірусу н”юкаслської хвороби), які, розмножуючись у курячих ембріонах, не викликають ні їх загибелі, ні патологоанатомічних змін. Виявити такий вірус можливо за рахунок реакції гемаглютинації або імуноферментного аналізу.
Інколи при розтині ембріону не вдається виявити ознаки розмноження вірусу, хоча він і знаходиться у досліджуваному матеріалі. Такий пасаж називають “сліпим”.
Рис.2.16. Будова курячого ембріону та способи його ураження
Розтин курячого ембріону та отримання вірусовмісного препарату.
Розтин курячих ембріонів здійснюють із дотриманням правил асептики.
|
У залежності від тропізму вірусу, яким проводили ураження, вірусовмісним матеріалом можуть бути ХАО, тканини зародку, жовтковий мішок, а також алантоїсна та амніотична рідини. Екстраембріональні (алантоїсна, амніотична) рідини є готовою суспензією вірусів. Перед розтином шкаралупу ембріону обробляють йодованим спиртом. Розтин роблять стерильними інструментами в боксі. Шкаралупу зрізають над повітряною камерою (природною чи штучною), при цьому яйце тримають під нахилом, щоб шкаралупа не впала в середину. Ножиці не повинні торкатись і пошкоджувати оболонку, що знаходиться під повітряною камерою, для цього зріз повинен проходити вище межі повітряної камери. Алантоїсну рідину відбирають пастерівською піпеткою об”ємом до 10 мл, якою проколюють підшкаралупну оболонку і ХАО над тілом зародку (рис.2.17). Амніотичну рідину об”ємом до 1мл відбирають, вводячи піпетку в амніон між головою та тілом зародка під його шиєю (рис.2.18). Хоріоналантоїсну оболонку вилучають таким чином. Спочатку ножицями підрізують оболонку і обережно виймають ембріон разом із жовтковим міхуром та білком в чашку Петрі, отримуючи таким чином деембріоноване яйце. Саму оболонку відокремлюють від шкаралупи і кладуть в стерильну чашку. |
|
Рис. 2.17. Відбір алантоїсної рідини (за Новіковим та ін) Рис.2.18. Відбір амніотичної рідини (за Новіковим та ін) |
Проводять макроскопічні дослідження. Найбільш характерні зміни спостерігають на оболонці у вигляді невеликих, округлої форми непрозорих вогнищ запалення, білуваті, перламутрові бляшки з некротичним центром (рис. 16 (кольорова вклейка)).
Практична частина
Лабораторне заняття
Завдання. Відпрацювати методики ураження курячих ембріонів та культивування вірусів на них. Відпрацювати техніку відбору вірусвмісного матеріалу з курячих ембріонів.
Мета: Ознайомитись з різними методами культивування вірусів на курячих ембріонах та практично оволодіти технікою інокуляції рідини, що містить вірус, та отримати вірус.
Матеріальне забезпечення: 9- та 11-денні курячі ембріони, овоскоп, непатогенний для людини вірус грипу, штативи для фіксації ембріонів, спирт йодований, пробірки, чашки Петрі, піпетки на 2-5 мл, стерилізатори із стерильними інструментами, (шприци на 1мл, пінцети анатомічні, голки ін’єкційні, ножиці), фізіологічний розчин, дезінфікуючий розчин, маркери, таблиці зі схемою курячого ембріону та методами його ураження.
Хід роботи
Контрольні завдання
Контрольні запитання
Завдання для самостійної роботи студентів
Література:
Каришева А.С., Сюрин В.Н. Руководство по практической вирусологии (справочное пособие). –Кишинев: «Штиинца», 1980.
Посібник з медичної вірусології / під ред. В.М. Гиріна. –К.: Здоров’я, 1995. -367 с.
Практикум із загальної вірусології / за ред. А.Л. Бойка. –К.: Видавничий центр „Київський університет”, 2000. -269 с.
Топчий М.К., Корнюшенко Н.П. Руководство к практическим занятиям по вирусологии. –К., 1967.
Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. –М.: Агропромиздат, 1989. -287 с.
Тема 3. Клітинні культури у вірусології
Зміст
Теоретична частина
Класифікація тваринних культур клітин
Одношарові культури клітин
Суспензійні культури клітин
Зберігання культур клітин
Умови культивування клітин in vitro
Поживні середовища
Методи виявлення та ідентифікації вірусів у клітинних культурах
Цитопатична дія
Внутрішньоклітинні включення
Титрування вірусів у одношарових культурах клітин
Практична частина
Лабораторне заняття
Контрольні завдання
Контрольні запитання
Література
Теоретична частина
Методи культивування клітин та тканин тварин in vitro за останні десятиріччя отримали широке розповсюдження в різних областях біології, від клітинної й молекулярної біології до сучасних галузей біотехнології [4]. Клітинні культури у вірусології використовуються для наступних цілей:
Список типів клітин, які в теперішній час можливо культивувати, досить великий. Це елементи сполучної тканини (фібробласти), скелетні тканини (кістки та хрящі), скелетні, серцеві та гладенькі м’язи, епітеліальні тканини (печінка, легені, молочна залоза, шкіра, сечовий міхур, нирки), клітини нервової системи (гліальні клітини та нейрони, хоча останні не мають здатності до проліферації), ендокринні клітини (наднирники, гіпофіз, клітини островків Лангерганса), меланоцити та багато різних типів клітин пухлин.
Класифікація тваринних культур клітин
Класифікація клітин, що культивуються in vitro, пов’язана з певними труднощами. Спочатку тканинними культурами називали експланти цілих фрагментів тканин, вважаючи, що в цих фрагментах, хоча б частково, підтримується гістологічна цілісність. Тепер термін “культура тканини” перетворився на загальне поняття, яке включає в себе як органну культуру, в якій найбільші фрагменти тканини чи цілі ембріональні органи експлантуються зі збереженням тканинної архітектури, так і культури клітин, коли тканини диспергуються механічно, ферментативно чи шляхом спонтанної міграції клітин з експланта, і клітини розмножуються у вигляді суспензії чи моношару клітин, що приєдналися до субстрату.
Органна культура (культура тканин) зберігає міжклітинні взаємодії, протягом тривалого періоду зберігає гістологічне та біохімічне диференціювання та після початкової травми залишається, як правило, в незростаючому рівноважному стані протягом декількох діб і навіть тижнів. Ці культури не завжди здатні до розмноження.
Культури клітин, навпаки, позбавлені структурної організації, втрачають характерну гістотипічну архітектуру та пов’язані з нею біохімічні ознаки і, як правило, не досягають рівноважного стану при відсутності специфічних умов. Клітини в культурах розмножуються, що забезпечує отримання великої маси клітин та їх розділення на ідентичні паралелі. Клітини, що культивуються, можуть бути охарактеризовані, та визначена клітинна популяція, яка може бути збережена шляхом заморожування. Клітини ідентифікують за фенотиповими ознаками, шляхом вирощування в селективному середовищі, фізичним відбором, клонуванням чи генетипово для отримання великої кількості відносно однорідних клітин.
Усі клітинні культури можна поділити на два типи: переживаючі (органні культури, проліферація яких в умовах in vitro досить обмежена або відсутня) та ростучі (здатні розмножуватися в умовах in vitro). Ці типи, у свою чергу, теж мають поділ. Переживаючі органні культури поділяють на ті, що культивуються в рідкому середовищі (можуть існувати до 30 діб і навіть здатні до обмеженої проліферації), та ті, що культивуються на твердому середовищі.
Ростучі культури поділяють на культури фіксованих шматочків тканин, одношарові та суспензійні культури клітин. Культури фіксованих шматочків клітин включають в себе: капельно-плазмені культури, культури, що вирощуються у флаконах Карреля, культури у нерухомих пробірках та в пробірках, що обератаються. У вірусологічній практиці, в основному, використовують два останніх типи культур клітин.
Одношарові культури клітин
Принцип методу одношарових культур клітин полягає у вирощуванні клітин, отриманих, як правило, шляхом ферментативної дезінтеграції на скляній поверхні у вигляді моношару, і базується на явищі адгезії – здатності клітин прикріплюватися до скляної поверхні. До одношарових культур відносять первинні, або первинно-трипсинізовані, диплоїдні, гетероплоїдні та постійні (перещеплювані) культури клітин (рис.2.19.).
Первинна культура клітин (первинно-трипсинізованан культура) – культура, яка походить від клітин та органів, взятих безпосередньо з організму. Для отримання первинних культур клітин використовують різноманітні тканини та органи людини та тварин. Після відповідної обробки їх подрібнюють на фрагменти 1-2 мм та оброблюють протеолітичними ферментами (трипсин, версен), які руйнують міжклтинні зв’язки, внаслідок чого отримують завись окремих клітин, які легко підрахувати.
Культури називають первинними до початку пасування чи субкультивування.
Як правило, культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращим виживанням та більш активним ростом у порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Це відображає більш низький рівень спеціалізації та наявність стовбурових клітин в ембріонах. Отримання первинних культур клітин дорослих тканин (в основному з нирок) та їх розмноження є більш складним завданням, і тривалість життя таких культур, як правило, не велика (максимум 20 генерацій при культивуванні in vitro у порівнянні з 50 генераціями первинних клітин, отриманих з ембріональних тканин). Первинні культури клітин мають різну чутливість до вірусів (табл. 2.10.). Така чутливість визначається типом тканини, з якої була отримана первинна культура, та тропізмом вірусу.
Рис.2.19. Схематичне зображення «розгалуження» клітин, що культивуються, від соматичної тканини
Приклади первинних культур клітин – нирка ембріону людини (рис.2.20), нирка макаки-резус, нирка африканської зеленої мавпи, нирка ембріону свині, фібробласти курячих ембріонів та ін.
З часу отримання субкультури первинна культура отримує назву клітинна лінія. Клітинні лінії можуть мати обмежений час існування in vitro (наприклад, диплоїдні фібробласти людини та тварин), а можуть розмножуватися in vitro необмежено довго (постійні, безперервні або перещеплювані клітинні лінії).
Рис. 2.20. Первинна культура фібробластів людини
Штам клітин – це популяція однорідних клітин (за одним чи декількома маркерами), які зберігають специфічні властивості протягом обмеженого періоду культивування. Штам клітин може походити з первинної культури чи від лінії клітин шляхом селекції чи клонування клітин із специфічними властивостями.
Клоновими лініями, чи клонами, називають культури, вирощені з однієї ізольованої клітини.
Після висіву клітин на поживне середовище вони входять у фазу адаптації, або лаг-період, тривалістю 2-24 години, після якого починається період експоненційного росту (логарифмічна фаза) – кількість клітин збільшується у двічі через правильні проміжки часу (рис.2.21.). У кінці цього періоду клітини досягають правильного моношару і входять у період уповільненого росту чи спокою (стаціонарна фаза чи фаза плато). Якщо на даному етапі культивування не відбудеться перенесення клітин на свіже поживне середовище, то наступає фаза старіння та загибелі клітин. Розмножуючись, клітини розміщуються на поверхні скла і при повному його покритті в один шар контактують одна з одною і перестають ділитися (спостерігається явище контактного гальмування) (Рис 2.19). На склі формується шар товщиною в одну клітинну, тому такі культури клітин називають одношаровими чи моношаровими.
Рис. 2.21. Крива росту клітин у культурі:
1 – лаг - фаза;
2 – фаза експоненційного росту (логарифмічна фаза);
3 – стаціонарна фаза;
4 – фаза відмирання клітин.
Як правило, моношар формується через 3-5 діб. Швидкість його формування залежить від виду тканин, віку донора, якості поживного середовища, посівної концентрації клітин та інших факторів.
Поживне середовище замінюють по мірі його забруднення продуктами життєдіяльності клітин. Моношар зберігає свою життєздатність впродовж 7-21 діб (у залежності від виду клітин та поживного середовища).
Таблиця 2.10.
Чутливість первинних культур клітин до вірусів людини
|
Походження культури клітин |
Віруси |
|
Нирка ембріону людини |
Аденовіруси (1-33), ріновіруси (1-55), вірус кору |
|
Нирка макаки-резус |
Поліовіруси (1-3), ЕСНО (1-9, 11-27, 29-33), Коксакі А (2-4,7-11,13-18,20-24) і В (1-6), грипу А і В, парагрипу (1,2,4), кору, паротиту, реовіруси (1-3), аденовіруси (1-18, 20, 25-33), ротавіруси, цитомегаловірус, вірус гепатиту А. |
|
Нирка африканської зеленої мавпи |
Вірус вісповакцини, поліовіруси (1-3), ротавіруси, арбовіруси (група кліщового енцефаліту), тогавіруси |
|
Фібробласти курячих ембріонів |
Віруси східного, західного та венесуельского кінського енцефаломієліту, вірус лісу Семлікі, Синдбіс, Охотський, віруси вісни, хвороби Ньюкасла |
|
Нирка ембріону свині |
Аденовіруси (1-33), реовіруси, поліовіруси (1-3), вірус грипу А та В, вісповакцини |
Лінії диплоїдних клітин (напівперещеплювані лінії клітин) – це клітинні лінії, в яких, у крайньому випадку, 75% клітин мають каріотип нормальних клітин вихідного типу; такі культури клітин, трансплантовані хом'ячкам, не проявляють онкогенної активності. Диплоїдний набір хромосом не завжди еквівалентний диплоїдному каріотипу, оскільки існують умови, при яких клітина може втрачати один тип хромосом і набувати інший. Це значить, що каріотип клітини змінився, а диплоїдний набір хромосом зберігся. Такі клітини слід вважати “псевдодиплоїдними”. Диплоїдні культури можуть пасуватися багаторазово (диплоїдні штами), витримуючи до 80 популяційних поділів. Слід зазначити, що культури диплоїдних клітин дуже вибагливі до умов культивування, тому їх рідко використовують у вірусологічній практиці. Часто диплоїдні клітинні культури називають напівперещеплюваними культурами клітин.
Приклади диплоїдних культур клітин – WIТ-38 (фібробласти легень людини), MRC-5 (диплоїдні фібробласти людини), ТМ 4 (лінія клітин тестикулярного епітелію миші) та ін.
У випадку, коли клітинна лінія має менш ніж 75% клітин із диплоїдним набором хромосом, говорять про лінію гетеродиплоїдних клітин. Цей термін не означає, що клітини злоякісні чи здатні до необмеженого росту.
Постійна (безперервна, перещеплювана) клітинна лінія – складається із клітин одного типу, що здатні субкультивуватися поза організмом протягом необмеженого числа пасажів. Постійні клітинні лінії отримують із пухлинних або нормальних тканин людини або тварин, які мають змінений (трансформований) каріотип (табл. 2.11.). Використання постійних культур клітин у вірусологічній практиці має певні переваги в порівнянні з первинними та диплоїдними культурами клітин (табл. 2.12.).
На рівні сучасних знань про поведінку клітин, що культивуються in vitro, неможливо визначити точку, коли культура стає стабільною, тобто набуває здатності рости необмежено довго. На основі досліду з фібробластоподібними клітинами людини встановлено, що культура повинна субкультивуватися не менш ніж 70 разів, з інтервалом у три доби, перш ніж її можна вважати безперервною лінією клітин.
У постійних культурах клітин клітини трансформовані. Під трансформацією клітин розуміють незворотні клітинні зміни, які характеризуються зміною ростових властивостей клітин, що культивуються. Трансформація робить клітини „безсмертними” і менш залежними від поживних та “геометричних” факторів росту. Зміни ростових властивостей пов’язані з порушенням транспорту через клітинну мембрану і є однією з адаптивних властивостей, які дозволяють клітинам розмножуватися в умовах, несприятливих для нетрансформованих батьківських клітин. При цьому клітинні мембрани втрачають поверхневий білок (250 кДа) і дещо змінюють антигенні властивості.
Спонтанна трансформація культур клітин нормальних тканин є відносно рідкісним явищем. Частоту таких трансформацій можна збільшити, оброблюючи клітини мутагенами чи деякими вірусами (наприклад, SV-40, вірус Епштейна –Барр та ін.).
Трансформовані клітини можуть утворювати пухлини у імунологічно толерантних тварин. За цією ознакою трансформація інколи неправомірно прирівнюється до злоякісних змін.
На ранніх стадіях культивування клітини залишаються еуплоїдними, тобто мають „правильний” диплоїдний набір хромосом, а пізніше вони стають анеуплоїдними. Іноді деякі з цих анеуплоїдних клітин виживають і продовжують розмножуватися, що призводить до встановлення клітинного штаму. Всі постійні клітинні лінії, на відміну від культур нормальних клітин з обмеженим терміном життя, є зміненими за рядом ознак, головною з яких є “безсмертя”. Здатність до необмежено тривалого розмноження в культурі, як правило, пов’язана з анеуплоїдним каріотипом. Для деяких клітинних ліній (наприклад, ВНК-21), які хоч і мають диплоїдний набір хромосом, каріотип змінений. Інші критерії трансформації (онкогенність, контактне гальмування, вимоги до середовища) проявляються у різних ліній неоднаково. Лінії клітин, які отримані з пухлинних тканин (тобто трансформовані в організмі), часто зберігають спеціалізовані функції (наприклад, здатність продукувати деякі ферменти) протягом більш тривалого часу, ніж клітини, трансформовані в культурі різними методами. Частота отримання постійних ліній у різних видів ссавців неоднакова. Так, наприклад, клітини мишей піддаються спонтанній мутації частіше, ніж клітини людини чи інших ссавців. Указана різниця, можливо, пов’язана з неоднаковою стабільністю каріотипу різних видів тварин.
При взаємодії вірусів з клітинами культури тканин спостерігаються різні зміни, обумовлені рядом факторів. Серед них велике значення має ступінь чутливості клітин культури до вірусу та умови середовища. Постіні культури відрізняються за ступенем своєї чутливості до вірусів. Як правило, для культивування певних вірусів підбирають такі культури, в яких зміни під впливом вірусної інфекції є найбільш виразними (табл.2.13).
Таблиця 2.11
|
Позначення |
Походження |
Ознаки |
||||
|
Вид |
Тканина |
Морфологія |
Ріст у суспензії |
Ефективність висіву, % |
Плоїдність |
|
|
ЗТЗ |
Миша, n=20 |
Ендотелій |
фібробласти |
- |
50 |
Анеуплоїдні |
|
L |
-”- |
Сполучна тканина |
« |
+ |
90 |
« |
|
СНО/КХ |
Китайський хом’ячок, n=11 |
Яєчник |
Епітелій |
+ |
95 |
Псевдодиплоїдні |
|
ВНК 21 |
Золотистий хом’ячок |
Нирка |
Фібробласти |
+ |
20 |
Диплоїдні |
|
BSC |
Макака-резус. n=21 |
-”- |
Епітелій |
- |
Незначна (< 20) |
-”- |
|
МРS |
Миша, n=20 |
Мієлома |
Лімфоїдна тканина |
+ |
0 |
Анеуплоїдні |
|
RPH |
Жаба, n=13 |
Яйцеклітини |
Епітелій |
- |
0 |
Гаплоїдні |
|
HeLa |
Людина, n=13 |
Пухлина шийки матки |
Епітелій |
+ |
95 |
Анеуплоїдні |
Приклади постійних культур клітин: SV-28 – постійна культура нирки новонародженого хом’яка, трансформована вірусом SV-40; MCF–7 -карцинома молочної залози людини; HeLa – карцинома шийки матки людини (рис.2.22.b.); Hep–2 – карцинома гортані людини; КВ – карцинома ротової порожнини людини; RH – нирка ембріону людини; Vero – нирка зеленої мавпи; L - мишачі фібробласти (рис. 2.22.a.); C-1300 – нейрабластома миші; СНЕВ - нирка ембірона свині та ін.
Таблиця 2.12
Переваги та недоліки використання постійних культур клітин
Переваги постійних КК |
Недоліки постійних КК |
|
Здатність до необмеженого розмноження |
Схильність до злоякісного перетворення (малігнізації) |
|
Простота отримання→економія праці та матеріальних затрат |
Швидке зниження чутливості до вірусів, у порівнянні з первинними КК |
|
Можливість попередньої перевірки на присутність латентної вірусної інфекції та сторонньої мікрофлори |
|
|
Забезпечення стандартних умов для розмноження вірусів, в порівнянні з первинними КК (що являють собою популяцію змішаних типів клітин) |
|
|
Широкий спектр чутливості до вірусів, в порівнянні з відповідними первинними КК |
a b
Рис.2.22. Постійні культури клітин:
a – мишачі фібробласти;
b - HeLa
|
Назва культури клітин |
Походження культури клітин |
Віруси |
|
HeLa |
Карцинома шийки матки жінки |
Аденовіруси (1-33), респіраторно-синцитіальний вірус, поліовірус (1-3), ЕСНО (1-9, 11-27, 29,33), Коксакі А (2,3, 7, 18, 21) |
|
Hep-2 |
Карцинома гортані людини |
-„- |
|
KB |
Карцинома ротової порожнини людини |
Аденовіруси, поліовіруси (1), арбовіруси |
|
RH |
Нирка ембріона людини |
Аденовіруси (1-33), респіраторно-синцитіальний вірус, віруси парагрипу |
|
L132 |
Легеня ембріона людини |
Аденовіруси, респіраторно-синцитіальний вірус, коронавіруси, поліовіруси (1-3), ЕСНО |
|
Vero |
Нирка зеленої мавпи |
Коксакі В (1-6), поліовіруси (1-3), арбовіруси, реовіруси, віруси везикулярного стоматиту (ВВС), вісповакцини, простого герпесу (1-2) |
|
L929 |
Фібробласти миші |
Арбовіруси, ВВС |
|
BHK-21 |
Нирка сірійського хом’яка |
Вірус сказу, простого герпесу, аденовіруси (25), реовіруси (3), ВВС |
|
СНЕВ |
Нирка ембріона свині |
Арбовіруси (група кліщового енцефаліту) |
|
MDCK |
Нирка собаки |
Віруси грипу типу а і В, ВВС, вісповакцини, Коксакі В (5), реовіруси (2,3), аденовіруси (4,5) |
Суспензійні культури клітин
Метод культивування клітин у суспензії широко ввійшов у вірусологічну практику у зв’язку з його перспективністю при накопиченні великої кількості клітин. Цей метод затвердив себе у виробництві ферментів та інших продуктів життєдіяльності бактеріальних клітин, проте адаптація клітин ссавців до суспензійних умов має певні труднощі, так як клітини тварин у порівнянні з бактеріальними більш чутливі до фізичних факторів, легше осаджуються, досить вимогливі до складу поживних середовищ і повільніше розмножуються.
Розповсюдженню методу суспензійного культивування сприяло введення ферментативного диспергування тканин тварин і особливо виведення постійних клітинних ліній, які виявилися здатними до необмежено тривалого пасування у суспензійному стані.
Переваги методу культивування клітин у суспензіях:
У зв’язку з цим великого значення набули дослідження штамів клітин, які здатні до тривалого розмноження в суспензійних умовах культивування. Так, були адаптовані багато постійних культур клітин до розмноження в цих умовах (ВНК-21, Hep-2 та ін.). Крім того, потрібно зазначити, що кровотворні клітини краще ростуть у суспензійній культурі.
Запропоновано декілька підходів, які дозволяють культивувати клітини у стані завису: batch-культури (розмноження в суспензії забезпечується безперервним перемішуванням завису в умовах постійності середовища), проточні системи (хемостати, турбідостати), застосування мікроносіїв (сефадекс, силікагель, цитолар та ін.). Культивування на мікроносіях в наш час є досить популярним методом, оскільки дозволяє вирощувати залежні від прикріплення до твердого субстрату клітини (первинні, субкультури, диплоїдні) в умовах суспензії.
Зберігання культур клітин
Для попередження забруднення клітинних культур клітинами інших типів (міжвидове перехресне забруднення), патогенними бактеріями й грибами, а також для попередження виникнення неконтролюємих генетичних змін клітин постає необхідність у їх консервації. При консервації клітин їх, в основному, зберігають в умовах знижених температур від 4 0С до – 78 0С (при зберіганні в умовах сухого льоду) та – 1960 С (при зберіганні в умовах рідкого азоту). При зберіганні клітин в умовах низьких температур може відбуватися їх ушкодження при заморожуванні та відтаванні. Ці ушкодження клітин обумовлені появою внутрішньоклітинних кристалів льоду та осмотичними ефектами. Додавання кріопротекторів (диметилсульфоксид, етиленгліколь, гліцерин та ін.), а також підбір оптимальних швидкостей заморожування та відтавання зводять ушкодження клітин до мінімуму.
Умови культивування клітин in vitro
Перенесення клітин цілісного організму в штучні умови життя припиняє їх існування як одного з чисельних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніш входили. При цьому клітини виходять із під контролю нейрогуморальних факторів організму і набувають таких особливостей, які залежать від самого факту їх існування в штучних умовах. Це проявляється, насамперед, в збільшенні швидкості розмноження клітин у культурі порівняно з їх розмноженням в організмі тварини .
Культивування клітин in vitro залежить від наступних факторів:
Розрізняють природні та штучні (синтетичні та напівсинтетичні) поживні середовища. Природні середовища складаються із суміші сольового розчину (наприклад, розчину Хенкса, Ерла), сироватки крові, тканинного (ембріонального) екстракту, коров’ячої амніотичної рідини та інших компонентів. Кількісний вміст кожного з компонентів в різних сумішах середовищ значно варіює. Цей тип середовищ використовують рідко.
Насьогодні, в основному, використовують штучні поживні середовища. До напівсинтетичних поживних середовищ відносять гідролізати різних білкових продуктів (гідролізат лактальбуміну, гемогідролізат, м’язевий ферментативний гідролізат, амінопептид та ін.). Серед синтетичних поживних середовищ найбільш широко застосовують середовище 199 (табл. 2.14.) та середовище Ігла. До їх складу входить більш ніж 60 компонентів (амінокислоти, вітаміни, компоненти нуклеїнових кислот, джерело ліпідів та вуглеводів, мінеральні солі та ін.).
Таблиця 2.14
Середовище 199 (Морган, Мортон, Паркер; 1950 р.)
|
Амінокислоти |
мг |
Джерела ліпідів |
мг |
|
L–Аргінін-монодихлорид |
70 |
Твін-80 |
20 |
|
L-Гістидин-монодихлорид |
20 |
Холестерин |
0,2 |
|
L-Лізин-монондихлорид |
70 |
Компоненти нуклеїнових кислот |
мг |
|
DL – Триптофан |
20 |
Аденін сульфат |
10 |
|
DL – Фенілаланін |
50 |
Ксантин |
0,3 |
|
DL – Метіонін |
30 |
Гіпоксантин |
0,3 |
|
DL – Серин |
50 |
Тимін |
0,3 |
|
DL – Треонін |
60 |
Урацил |
0,3 |
|
DL – Лейцин |
120 |
Гуанін-гідрохлорид |
0,3 |
|
DL – Ізолейцин |
40 |
Аденозін-трифосфат натрія |
10 |
|
DL – Валін |
50 |
Аденілова кислота |
0,2 |
|
DL – Глутамінова кислота- моногідрат |
140 |
D – Рибоза |
0,5 |
|
DL – Аспаргінова кислота |
60 |
D – Дезоксирибоза |
0,5 |
|
DL – α – Аланін |
50 |
Інші речовини |
мг |
|
L – Пролін |
40 |
Fe (NO3)3x9H2O |
0,1 |
|
L – оксипролін |
10 |
СН3СOONa x 3H2O |
50 |
|
L – Гліцин |
50 |
L – Глутатіон |
0,05 |
|
L – Цистин |
20 |
Глюкоза |
1000 |
|
L – Тирозин |
40 |
L – Глутамін |
100 |
|
L – Цистеїн – гідрохлорид |
0,1 |
Феноловий червоний |
20 |
|
Вітаміни |
мг |
Спирт етиловий |
16 |
|
Нікотинова кислота |
0,025 |
||
|
Амід нікотинової кислоти |
0,025 |
||
|
Піридоксин – гідрохлорид |
0,025 |
||
|
Піридоксаль – гідрохлорид |
0,025 |
||
|
Тіамін – гідрохлорид |
0,01 |
||
|
Рибофлавін |
0,01 |
||
|
Пантотенат кальція |
0,01 |
||
|
Інозит |
0,05 |
||
|
n-Амінобензойна кислота |
0,05 |
||
|
Холін-хлорид |
0,5 |
||
|
Біотин |
0,01 |
||
|
Α – Токоферол-фосфат натрія |
0,01 |
||
|
Фолієва кислота кристалічна |
0,01 |
||
|
Кальциферол |
0,1 |
||
|
Менадіон |
0,01 |
||
|
Вітамін А кристалічний |
0,1 |
||
|
Аскорбінова кислота (вітамін С) |
0,05 |
У всі поживні середовища та деякі сольові розчини для визначення рН додають індикатор – феноловий червоний (в концентрації 0,002 %, яка не має токсичного впливу на клітини та віруси). Додавання індикатора дозволяє визначити момент закислення поживного середовища продуктами метаболізму клітин до рівня, який потребує заміни поживного середовища на нове (рН<7; середовище забарвлюється в жовтий колір). При підвищенні рН розчин набуває червоно-малинового кольору. При нейтральному рН (7,2-7,4) колір середовища жовтогарячий. Для регулювання рН сольових розчинів та поживних середовищ використовують 7,5%-ий розчин бікарбонату натрію та 3%- ий розчин оцтової кислоти.
Усі поживні середовища за функціональним призначенням можна поділити на ростові та підтримуючі. Ростові поживні середовища забезпечують існування та розмноження клітин і містять 2-10 % сироватки крові. Ці поживні середовища застосовують, як правило, в перші дні культивування клітин. Підтримуючі поживні середовища забезпечують життєдіяльність клітин, але не їх розмноження. Вони не містять сироватки крові. Їх використовують для культивування клітин після зараження їх вірусами.
Контамінація культур клітин
Вірусологічні дослідження, які проводяться з використанням клітинних культур, потребують постійного контролю присутності сторонніх мікроорганізмів (контамінантів) – вірусів, бактерій, грибів, мікоплазм та клітин інших клітинних культур. На відміну від організму людини, імунна система якого володіє багатьма різноманітними механізмами захисту від інфекцій, клітини в культурі in vitro захищені лише обережністю роботи дослідника.
Найпоширенішими контамінантами клітинних культур є мікоплазми. І хоча культури первинних клітин не забруднені мікоплазмами, багато ліній і штамів постійних клітин мають таке забруднення. Джерелом мікоплазм можуть бути сироватка тварин, яка частіше за все буває забруднена Acholeplasma laidlawii та Microplasma arginini, а також власне дослідники, оскільки M. hominis, M. рharingis та M. salivarium легко виділяються з порожнини рота та глотки людини. Забруднення культур клітин мікоплазмами не є таким очевидним, як бактеріями. У зв’язку з цим їх своєчасне виявлення – важлива умова підтримання високої якості культури клітин. Крім того, невиявлені та не видалені мікоплазмені інфекції, як і інфекції, викликані іншими контамінантами, можуть змінювати метаболізм клітин, викликати хромосомні порушення, впливати на сприятливість клітин до вірусів, що досліджуються. Особливо це стосується латентних інфекцій.
Попередити розмноження та знищити бактерії, мікоплазми та гриби вдається за допомогою протимікробних препаратів (антибіотики та ін.), які додаються в ростові середовища безпосередньо перед їх використанням. Однак при тривалому культивуванні клітинних культур застосування антибіотиків не бажано. Тому при роботі з клітинами необхідно дотримуватися стерильних умов роботи для запобігання забруднення мікроорганізмами, та проводити адекватні тести для оцінки їх ефективності.
При взаємодії вірусу з клітиною можна виділити такі основні стадії:
Реакція клітин на вірусну інфекцію досить різноманітна. Запропоновано багато способів класифікації реакції клітин на зараження вірусами. Найбільш прийнятою є класифікація вірусних інфекцій на клітинному рівні, що запропонована В.М. Ждановим та А.Г. Букринською (1986). Вірусні інфекції підрозділяються на автономні та інтеграційні.
Автономний – тип вірусної інфекції, при якому вірусний геном реплікується незалежно від клітинного.
Інтеграційний - тип вірусної інфекції, при якому вірусний геном частково або повністю інтегрується з клітинним геномом та реплікується разом з ним.
Продуктивна вірусна інфекція завершується утворенням інфекційного потомства, на відміну від абортивної, для якої не характерне утворення інфекційних часток, або вони утворюються в значно меншій кількості, ніж при продуктивній вірусній інфекції.
Гостра вірусна інфекція – це така форма інфекції, за якої після утворення вірусного потомства клітина або гине, або видужує і не містить вірусних компонентів. При хронічній вірусній інфекції клітини продовжують продукувати вірусні частки або їх компоненти протягом тривалого часу і передають цю здатність спадково. Гостра інфекція, яка завершується загибеллю клітини (лізисом), носить назву цитолітичної, а гостра вірусна інфекція, яка безпосередньо не призводить до лізису клітини, і при якій клітина ще може функціонувати впродовж деякого часу, продукуючи вірусні частки, називається нецитолітичною.
При взаємодії вірусів із клітинами в культурі спостерігаються різні патологічні зміни, які зумовлені рядом факторів:
Патологічні зміни уражених вірусами клітин зумовлені специфічними та неспецифічними процесами. До неспецифічних процесів відносять процеси, обумовлені змінами деяких ланок обміну речовин, зміною проникності цитоплазматичної мембрани, а саме:
Названі зміни відносять до неспецифічної взаємодії вірусів із клітинами, тому що вони не залежать від дози вірусу, розмірів віріонів, типу клітин, характеру утворення включень, тривалості вірусної інфекції.
До специфічних процесів взаємодії вірусу з клітиною відносять:
Існують наступні основні методи індикації (виявлення) вірусів у культурі клітин:
Найбільш широко та часто про розмноження вірусу в культурі клітин роблять висновок за цитопатичним ефектом чи цитопатичною дією (ЦПЕ, ЦПД). ЦПД – це явище, що призводить до руйнування структури клітин під впливом вірусів.
Причини ЦПД:
За терміном виникнення ЦПД поділяють на ранню та пізню. Рання ЦПД виявляється в перші години після інфікування (від 3 годин після інфікування клітинних культур вірусом), спричиняється дією структурних елементів вірусів/ У цей період ще не відбулося проникнення вірусу в клітину. Даний тип ЦПД морфологічно проявляється в порушенні клітинного моношару, заокругленні клітин, відокремленні їх від скла(рис.2.23.а.).
Пізня ЦПД виявляється, коли вірус (чи його геном) потрапляє в клітину і, як правило, на кінцевих стадіях репродукції вірусів у клітині. Пізня ЦПД проявляється в утворенні полікаріоцитів і включень (рис.2.23.b.).
|
. |
|
|
Рис.2.23. Рання та пізня ЦПД при герпесвірусній інфекції
Для характеристики деструктивних змін одношарових культур клітин, що заражені різними вірусами, найчастіше використовується робоча класифікація ЦПД (О.Г. Анджапарідзе, 1962):
1 група. Рівномірно розподілена дрібнозерниста деструкція клітин – виникає при ураженні клітин вірусами поліомієліту, Коксакі, ЕСНО (рис.2.24.a, рис.11.a. (кольорова вклейка)), ЕСМО, віспи, грипу та ін.
2 група. Вогнищева дрібнозерниста деструкція клітин з тяжами незмінених клітин між ними - виникає при ураженні клітин вірусами весняно-літнього енцефаліту, вірус хвороби Ауескі (псевдосказу), спумавірусами (рис.2.24.b) та ін.
3 група. Осередкові скупчення заокруглених клітин, що нагадують грона винограду - виникає при ураженні клітин аденавірусами (рис.12 (кольорова вклейка)).
4 група. Рівномірно-розподілена крупнозерниста деструкція клітин (клітини збільшені у розмірі, заокруглені) - виникає при ураженні клітин вірусом простого герпесу (рис.11.b. (кольорова вклейка)), мавп’ячим вірусом В та ін.
5 група. Утворення гігантських багатоядерних клітин – симпластів та синцитіїв - виникає при ураженні клітин вірусами кору, вісповакцини, герпесу та ін (рис.13 (кольорова вклейка)). При цьому типі ЦПД відбувається розчинення клітинних оболонок, внаслідок чого цитоплазма сусідніх клітин зливається, утворюючи єдине ціле, в якому (в основному по периферії) розташовані ядра клітин.
a b
Рис.2.24. Заокруглення клітин у випадку зараження культури клітин вірусом ECHO (a) та цитопатична дія спумовірусу на клітини (b)
Слід розрізняти термін симпласт та синцитій. Різниця між цими поняттями полягає в тому, що синцитії виникають у результаті часткового злиття цитоплазматичної мембрани клітин, на відміну від повного злиття мембрани при утворенні симпластів. Таким чином, синцитій – це група клітин, які з’єднані між собою протоплазматичними відростками, а симпласти мають загальну масу протоплазми, в якій міститься багато ядер.
При багатьох вірусних інфекціях в клітинах (в ядрі чи цитоплазмі) різних органів та тканин з’являються особливі утворення, які називають тільцями-включеннями. Їх класифікують за локалізацією в клітині, вмістом нуклеїнової кислоти, тинкторіальними властивостями та гомогенністю (гомогенні чи зернисті).
Тільця-включення локалізуються вибірково. Так, цитоплазматичні включення характерні при віспі (тільця Гварнієрі), сказі (тільця Бабеша-Негрі) (рис.14.a. (кольорова вклейка)), грипі, парагрипі, чумі великої рогатої худоби та ін. При ринотрахеїті великої рогатої худоби, ларинготрахеїті птахів, аденовірусній інфекції(рис.14.b. (кольорова вклейка)), герпесвірусній інфекції (тільця Каудрі), ящурі розвиваються включення в ядрі.
По відношенню до барвників включення поділяють на базофільні (фарбуються основними барвниками – азур, піроксин) та ацидофільні або оксифільні включення (фарбуються кислими барвниками – еозин, кислий фуксин).
За своєю природою включення можуть бути місцями утворення вірусних часток (фабрики віріонів – тільця Гварнієрі), скопиченням вірусів (тільця Бабеша – Негрі, поліедри), глибками хроматину (тільця Каудрі).
У лабораторних роботах з вірусами, біофабричному виробництві та у медичній і ветеринарній практиці постійно виникає необхідність визначення кількості вірусів у тому чи іншому матеріалі. Без такого визначення неможливе контрольоване експериментальне ураження вірусами лабораторних тварин, виробництво живих та інактивованих противірусних вакцин та діагностичних препаратів, оцінка активності живих противірусних вакцин, отримання імунних сироваток та багато інших завдань.
Кількість вірусу в будь-якому матеріалі визначають за титром вірусу в цьому матеріалі. Під титром вірусу розуміють вираження його концентрації у матеріалі. Титр вірусу – це кількість вірусу, яка міститься в одиниці об’єму матеріалу.
Титрування вірусів та антитіл до них в одношарових культурах клітин проводиться наступними методами: за ЦПД, методом кольорової реакції (відбувається зміна забарвлення у жовтий колір середовища під впливом продуктів метаболізму неуражених клітин, в той час як у тканинній рідині заражених вірусами клітин зберігається вихідний колір середовища - червоний), методом бляшок (рис.15 (кольорова вклейка)), у реакції гемадсорбції (рис.16 (кольорова вклейка)). Оскільки кількість вірусу неможливо виразити у звичайних одиницях об’єму, маси та ін., застосовують вимір одиниць дії чи одиниць активності (інфекційні, гемаглютинуючі, бляшкоутворюючі одиниці). У випадку прояву інфекційної активності вірусу у вигляді утворення бляшок кількість вірусу може бути виміряна у бляшкоутворюючих одиницях (БУО). 1 БУО – те найбільше розведення вірусу, яке в культурі клітин здатне утворити 1 бляшку.
Для визначення титру вірусу в БУО декілька культур клітин у матрасах заражують точно відміряними однаковими об’ємами дослідного вірусвмісного матеріалу. Потім вираховують, скільки бляшок утворилося в кожному з них і розраховують середнє арифметичне цієї кількості. Воно дорівнює кількості БУО, яке міститься в дозі вірусмісного матеріалу, що вносили в культуру.
T = n/(V x a),
де n – середнє арифметичне кількості бляшок на один матрас; V – об’єм вірусвмісного матеріалу, який вносили в культуру; a - розведення вірусвмісного матеріалу, яке використовували для зараження.
Цей приклад титрування вірусу – спрощений, оскільки він не враховує випадків високої концентрації вірусу в матеріалі, при якій бляшки в культурі клітин можуть зливатися між собою і їх буде важко порахувати. Вважається, що підрахуванню піддаються бляшки, якщо їх кількість не перевищує 50 на матрас. Тому готують декілька розведень досліджуваного матеріалу (звичайно з коефіцієнтом 10) і кожним розведенням в однакових дозах заражують рівні групи культур клітин. Після цього розраховують середнє арифметичне кількості бляшок для кожного розведення, відкидаючи ті, де підрахунок виявився неможливим. Титр вірусу тоді розраховують за формулою
T = (n1 + n2 + n3 +… + nn) / (V x (a1 + a2 + a3 + … + an),
де n – середнє арифметичне кількості бляшок на один матрас; V – об’єм вірусвмісного матеріалу, який вносили в культуру; a - розведення вірусвмісного матеріалу, яке використовували для зараження.
Титрування вірусу в пробірочних культурах передбачає визначення 50% інфекційної дії (за одиницю кількості вірусу приймається така його доза, яка здатна викликати ефект у 50 % заражених тест-об’єктів, ЕД50). Прикладом ЕД50 може бути ЦПД50 (доза вірусу, яка викликає появу цитопатичного ефекту у 50 % заражених клітин в культурі).
Розрахунок дози (розведення) вірусу, яке дає 50%-ий ефект, може бути проведений таким чином:
а) за Рідом та Менчем
lg ЕД50 = lg B – [(b - 50)/ (b - a)] x lg d,
де ЕД50- розведення вірусу, що розраховується; В – розведення, яке дає ефект більше 50 %; b – відсоток, який відповідає розведенню В; а – відсоток, який відповідає розведенню, що дає ефект менше 50 %; d – коефіцієнт розведення.
b) за Кербером
lg ЕД50 = lg D + lgd/2 – lgd Σ (r/n),
де D – найбільше розведення вірусу, яке ще дає 100% - ий ефект; d – коефіцієнт розведення; Σ (r/n) – сума відношень позитивно реагуючих тест-об’єктів до заражених для усіх розведень, що дають ефект від 0 до 100%; r – кількість позитивно реагуючих тест-об’єктів на кожне розведення; n – кількість заражених тест-об’єктів на кожне розведення.
Практична частина
Лабораторне заняття
Завдання: розглянути препарати культури клітин тварин in vitro, ознайомитись з їх морфологічними особливостями та класифікацією. Навчитися визначати тип ЦПД вірусів у культурі клітин.
Матеріальне забезпечення: світловий мікроскоп, забарвлені мікропрепарати первинних, постійних та диплоїдний клітинних культур, забарвлені мікропрепарати клітинних культур з різними типами ЦПД та включень, таблиці, слайди.
Хід роботи
Контрольні запитання
Література
Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков.-М.: Мир., 1983. -263 с., ил.
Букринская А.Г. Вирусология.-М.: Медицина, 1986.-336 с., ил.
Голубев Д.Б., Сомина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии.-Л.: Медицина., 1976.- 224 с.
Культура животных клеток. Методы: пер.с англ../ Под ред. Р. Фрешни.- М.: Мир., 1989.-333 с., ил.
Новые методы культуры животных тканей/ Под ред. Оленова Ю.М.- М.: Мир, 1976.- 255 с., ил.
Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринарии и биотехнологии.-К.: Урожай., 1990.-152 с.
Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии.- 2-е изд., перераб. и доп. –М.: Колос, 2000.- 272 с, ил.
Розділ 3. Віруси бактерій
Зміст
Теоретична частина
Загальна характеристика вірусів бактерій
Практична частина
Методи титрування бактеріофагів
Теоретична частина
Загальна характеристика вірусів бактерій
Бактеріальні віруси (бактеріофаги) являють собою відносно просту біологічну систему і є зручною моделлю для вивчення основних проблем молекулярної біології, молекулярної генетики тощо. Значні успіхи у вивченні механізмів реплікації нуклеїнових кислот, дослідження тонкої структури генетичного матеріалу, молекулярного механізму мутацій, регуляції білкового синтезу та багато інших досягнень сучасної біології пов’язані з застосуванням бактеріофагів як зручних модельних об’єктів. Ця зручність полягає в наступному:
Бактеріофаги є паразитами представників майже всіх груп прокаріотичних організмів: від крихітних Dellovibrios, які самі паразитують на інших бактеріях, до порівняно великих ціанобактерій.
Виділити бактеріофаг можна з різних матеріалів, де могли в даний момент міститись бактерії, на яких даний фаг розмножується. Так, наприклад, дизентерійні та фаги кишкової палички виявляються в стічних водах, грунті, організмах комах та ін. Стафілококові фаги знаходяться в слизу з носа, на шкірі та в виділеннях з ран. Фаги, що уражують фітопатогенні бактерії, виділяють з рослин.
Для первинного виділення бактеріофагів досліджуваний матеріал гомогенізують, звільняються від великих частинок та фільтрують через бактеріальні фільтри. Отриманий фільтрат засівають разом з відомими бактеріями в рідке поживне середовище. Умови інкубації підбирають оптимальними до бактерії, як правило це 370С протягом 14-18 годин. Для видалення залишків бактерій після інкубації проводять низькошвидкісне центрифугування та фільтрування через бактеріальний фільтр. Для виділення фагів з лізогенної культури часто необхідно застосовувати індукцію виходу профагу, як описано нижче.
Бактеріофаги, як і інші віруси, є облігатними внутрішньоклітинними паразитами і розмножуються виключно в клітинах бактерій. Іх розмноження в рідкому середовищі приводить до того, що культура, яка була мутною перед додаванням вірусу, через декілька годин інкубації стає прозорою. На твердих середовищах фаги вивляють за допомого спот-тесту. При цьому на поверхню агару в чашці Петрі засівають культуру, а потім на неї наносять краплину вірусвмісного матеріалу. На місці нанесення матеріалу будуть або окремі негативні колонії, або велика стерильна пляма, в залежності від кількості вірусу в досліджуваному зразку. Для точного визначення титру вірусу застосовують методи титрування бактерофагів за Апельманом ( в рідкому поживному середовищі) та за Граціа (метод подвійних агарових шарів).
Дуже часто виявлені в досліджуваних зразках бактеріофаги являють собою суміш фагів, що відрізняються між собою за біологічними властивостями. Тому після виявлення фага в досліджуваному зразку проводять виділення його “чистої лінії” з подальшим пасируванням даного фагу на чутливій бактерії. В подальшій роботі з даним фагом керуються принципами Д’Ерелля – засновника бактеріофагії. Ці принципи полягають в наступному:
Характер негативних колоній виділених фагів може попередньо вказувати на деякі властивості фагів (рис.3.1.). Так, чисті, прозорі негативні колонії вказують на належність фагів до вірулентної групи, а мутні, з ореолом по периферії можуть говорити про виділення помірних фагів, які здатні переходити в форму профага і лізогенізувати бактеріальні культури. Крім того, розмір негативної колонії незалежно від її характеру, може говорити про розмір вірусних часток, які достовірно вивчають за допомогою методу електронної мікроскопії. Оскільки фаги маленьких розмірів порівняно швидко дифундують в агарі, то в результаті їх діяльності утворюються негативні колонії великого розміру (1,5-10 мм). До фагів цієї групи належать бактеріофаг CΔ та Т1. На противагу цьому, невеликі негативні колонії розміром 1-2 мм утворюются крупними бактеріофагами типу Т2 та Т4.
Загальні властивості фагів зазвичай слугують відображенням властивостей клітини-господаря. Наявність жорсткої клітинної стінки у більшості бактерій потребує особливих механізмів проникнення або виходу вірусів.
Прикріплення фагу до бактеріальної клітини відбувається на клітинній поверхні. Оскільки клітинна поверхня відрізняється у різних бактерій, то існують різні способи взаємодії фагу з бактеріальою клітиною. Так, деякі фаги приєднуються до особливих виростів, так званих L- та F-ворсинок, які приймають участь в процесі кон’югації. Віріони інших фагів зворотньо прикріплюються до джгутиків бактерії і потім сковзаються вздовж них, при чому цьому процесу, швидше за все, сприяють рухи самих джгутиків. На поверхні бактеріальної клітини є специфічні рецептори для бактеріофагів, проте дані про їх природу досить обмежені. Проникнення геному бактеріофагу в клітину супроводжується фізичним відокремленням нуклеїнової кислоти від капсидних білків, які залишаються зовні клітини. Крім нуклеїнової кислоти фага, всередину клітини потрапляє невелика кількість білку та деякі інші речовини, в тому числі олігопептиди та поліаміни.
Оскільки бактеріальні клітини здатні поглинати з середовища вільну ДНК, то і геном фага може проникнути таким чином в клітину. Це явище отримало назву транфекції. Здатність бактерій поглинати молекули ДНК може виникнути як нормальне явище на певних етапах росту, наприклад у В. subtilis. В деяких випадках це явище викликається штучно, як, наприклад, у Е. coli.
Проникнення геному бактеріофагу в чутливу бактерію приводить до розвитку або літичної, або лізогенної інфекції, в залежності від природи фага (іноді бактерії) та умов оточуючого середовища.
При лізогенному типі взаємодії геном фагу в неінфекційній формі передається бактеріальними клітинами з покоління в покоління, причому час від часу в деяких клітинах синтезуються віріони, що лізують ці клітини та виходять в зовнішнє середовище. Лізогенні клітини стають імунними до повторного зараження цим же бактеріофагом і лізогенні культури продовжують нормально рости. Присутність вільних віріонів можна виявити шляхом інфікування індикаторної культури. Бактеріофаги, що здатні переходити в лізогенний стан, називають помірними, фаги, у яких така властивість відсутня – вірулентними. Слід відміти, що навіть помірні фаги при першій інфекції чутливих до них бактерій викликають продуктивну інфекцію у багатьох або навіть всіх клітин. Виникнення лізогенії вимагає серії певних подій. Ймовірність появи лізогенії та продуктивної інфекції варіює у різних фагів та залежить від умов культивування.
Найкраще вивченим серед вірулентних фагів є бактеріофаг Т4, будова якого наведена на рис. . Основні компоненти бактеріофагу Т4: головка, що містить нуклеїнову кислоту (ДНК); відросток – виконує функцію введення генетичного матеріалу в клітину Е.coli; конектор, який поєднує головку бактеріофагу з відростком; базальна пластинка з фібрилами – апарат пошуку, фіксації та подачі сигналу для введення нуклеїнової кислоти в клітину.
Рис.3.1. Будова бактеріофагу Т4.
5.чохол хвостового відростку; 5. базальна пластинка;
6. зубець базальної пластинки; 7. довга фібрила.
8. коротка фібрила.
Життєвий цикл бактеріофагу Т4 став класичним прикладом онтогенезу вірусів. Експеримент, вперше проведений Еморі Елліс та Максом Дельбрюком, дозволив встановити загальну послідовність подій. Клітини E.coli, що активно ростуть, заражали бактеріофагом так, щоб в середньому на одну клітину приходилось по одній фаговій частинці. Протягом двох-трьох хвилин інкубації більшість фагів адсорбувались на клітинах. Всі неадсорбовані фаги потім інактивували, додаючи антифагову сироватку. Через декілька хвилин після цього культуру розбавляли в більше ніж сто разів, щоб зменшити концентрацію антитіл та попередити інактивацію фагового потомства. Через певні проміжки часу в пробах інфікованої культури визначали концентрацію інфікуючих одиниць шляхом висіву проб на чашки з індикаторними бактеріями та підрахунку числа негативних колоній на бактеріальному газоні. Результати даного експерименту графічно представлені на рис.3.2. Протягом 24 хв. після адсорбції бактеріофагу на клітині число інфекційних одиниць в культурі залишалось стабільним. В цей період кожна негативна колонія утворювалась окремою інфікованою клітиною, з якої потомство фага виходило після того, як клітина виявлялась на поверхні агару. Через 24 хв. число інфекційних одиниць починало рости, оскільки деякі інфіковані клітини лізуються та вивільняють бактеріофаги. На 30-й хвилині всі інфіковані клітини були вже зруйновані. Число інфекційних одиниць до кінця досліду приблизно в сто разів перевищувало число інфікованих клітин. З кожної клітини виходило приблизно сто фагових потомків.
Рис.3.2. Одиночний цикл розвитку бактеріофагу Т4.
Першим етапом взамодії бактеріофагу Т4 з клітиною є адсорбція (рис.3.3.). В інтактному стані бактеріофагу довгі фібрили обвиваються навколо відростка таким чином, що їх середня частина підтримується корткими фібрилами, прикріпленими до того місця, де головка з’єднується з відростком. Можливо, при контакті кінців фібрил з рецепторами клітини нитки розправляються і випрямляються. Для цього необхідний L-триптофан як кофактор. Для наступного етапу взаємодії фагу з бактерією необхідне правильне просторове положення базальної пластинки, що забезпечується, очевидно, контактом усіх шести ниток з рецепторами клітини. Слід зауважити, що необернене прикріплення бактеріофагу до клітини і проникнення в неї ДНК відбувається лише на окремих ділянках оболонки (всього їх приблизно 300), де цитоплазма і зовнішні мембрани утворюють міцні контакти, стійкі до м’якого осмотичного шоку.
а б в г
Рис. 3.3. Схема основних етапів адсорбції фагу Т4 на бактерії E.coli.
а – вільна фагова частинка; б – приєднання довгих фібрил до оболонки бактерії; в – фіксація зубців базальної пластинки; г – скорочення хвостового чохла та ін’єкція фагової ДНК в клітину.
Після адсорбції бактеріофагу на клітині відбувається скорочення чохла, яке стимулюється базальною пластинкою, що змінює свою конфігурацію. В процесі скорочення приймають учась всі 144 субодиниці чохла і їх суцільне переміщення призводить до зменшення довжини чохла у 2 рази і збільшення діаметру на 30%. Дистальна частина стержня щільно підходить до цитоплазматичної мембрани і кінець стержня проколює рихлі шари клітинної оболонки, що були зруйновані лізоцимом. На наступному етапі відбувається ін’єкція ДНК в середину бактеріальної клітини.
Рис.3.4. Схема розвитку подій при інфікувані Е.coli бактеріофагом Т4.
Латентний період (період часу між зараженням і лізисом клітини) в стандартних умовах для бактеріофагу Т4 складає 24 хвилини (рис.3.4). Потрапивши в середину бактеріальної клітини, фагова ДНК викликає перебудову обміну речовин зараженої клітини (припиняється синтез бактеріальних РНК, ДНК, білків). Рибосоми клітини-хазяїна модифікуються так, що починають функціонувати на м-РНК фагу ефективніше, ніж на м-РНК хазяїна. В клітині спочатку синтезуються “ранні” білки. Синтезуються наступні ферменти: ДНК-полімераза; ДНК-дезоксирибонуклеаза, що руйнує ДНК клітини-хазяїна; ферменти, що необхідні для утворення 5-оксиметилцитозину та його фосфорилювання. Синтезована ДНК-дезоксирибонуклеаза не діє на ДНК фагу, очевидно тому, шо в ній міститься 5-оксиметилцитозин. Ці ферменти забезпечуть синтез ДНК бактеріофагу. На наступному етапі починається синтез білків. Всі білки віріону та інші пізні білки (наприклад лізоцим) синтезуються більш-менш одночасно, і накопичуючись, утворюють фонд “попередників”. Потім вони прямо та специфічно взаємодіють з іншими молекулами, в результаті чого виникають субструктури, які потім збираються вже в цілі віріони. Збирання віріонів складається з чотирьох основних етапів, що приводять до утворення проміжних структур, які взаємодіють між собою лише у визначених критичних точках.
На останньому етапі взаємодії фагу та клітини накопичений лізоцим (продукт гена е) діє зсередини на пептидоглікановий шар клітини. Лізоцим утворюється в зараженій клітині задовго до початку лізису, але лізис наступає тільки в тому випадку, коли лізоцим отримує доступ до шару пептидоглікану. Для цього необхідна реакція, що ініціюється фагом (продукт гену t). В результаті розщеплення пептидогліканів клітинна стінка бактерії стає дуже тонкою і розривається під дією осмотичного тиску. Відбувається вихід бактеріофагу з клітини.
Типовим прикладом помірних фагів є бактеріофаг . Цей бактеріофаг може переходити з клітини в клітину в процесі інфекції, або передаватись з поколінння в покоління під час розмноження даного бактеріального штаму. В останньому випадку латентний геном фага називається профагом, а клітини, що несуть профаг – лізогенними. Природнім господарем даного бактеріофагу служить штам Е. Coli К12, генетика якого добре вивчена. Саме тому бактеріофаг був вибраний як об’єкт досліджень, направлених на з’ясування природи лізогенії.
Геном бактеріофага представлений дволанцюговою ДНК. Фагова ДНК упакована в білкову оболонку, що представляє собою досить складну структуру та складається з головки та хвостового відростку. Фагова частинка за допомогою хвостового відростку приєднується до клітини, проколює її оболонку та вводить свою ДНК, залишаючи оболонку ззовні.
Подальші події можуть розвиватись двома способами (рис.3.5.). Для одних клітин спостерігається літичний шлях розвитку: різні групи фагових генів включаються та виключаються відповідно до певної програми. ДНК фага інтенсивно реплікується, синтезуються нові білки головки та хвостового відростку, в бактеріальній клітині утворюються нові інфекційні віріони. В решті решт клітина лізується та вивільняє приблизно 100 фагових частинок.
В інших клітинах фагова ДНК лізогенізує клітину-господаря: всі фагові гени, крім одного, виключаються та фагова ДНК, яка отримала назву профаг, стає частиною бактеріальної хромосоми. При поділі бактерії „профаг” пасивно реплікується та передається дочірнім клітинам. Цей процес може повторюватись безмежну кількість разів. Проте, при УФ-опроміненні майже всі лізогенні клітини лізуються та дають потомство фагу .
Як було сказано вище, в лізогенній клітині працює один єдиний фаговий ген, що кодує білок-репресор фагу . Репресор є позитивним та негативним регулятором експресії генів. Приєднуючись до двох операторних ділянок фагу , він вимикає всі інші гени бактеріофагу та експресує свій власний ген.
Рис.3.5. Шляхи розвитку бактеріофага .
Слід зауважити, що одразу після інфікування перші етапи регуляції експресії генів однакові незалежно від способу подальшого розвитку подій. На критичному етапі фаговий регуляторний білок “відчуває” стан клітини-господаря і подальші події направляються по одному з двох шляхів.
На рис.3.6. подана спрощена генетична карта фага . Бактеріальна хромосома у складі віріону є лінійною, але одразу після потрапляння в бактеріальну клітину замикається в кільце. В результаті з’єднання кінців ДНК (cos-сайтів) групи генів лізису та хвостового відростку зближуються. Гени, що кодують білок репресор (CI) та білок, який запускає літичний шлях (Cro), розміщені поруч на хромосомі фагу. Ці гени транскрибуються в протилежних напрямках (рис.3.7.). Точки початку транскрипції цих генів розділені ділянкою 80 пар основ. В цій ділянці розміщені промотори та оператори, з якими з’єднуються білки-регулятори. На рис. . видно, що кожен з генів (c1 та cro) має свій власний промотор. Ці промотори не перекриваються між собою. OR1, OR2 та OR3 – це операторні ділянки, до яких приєднуються c1 та cro, регулюючи таким чином активність обох промоторів. Слід відмітити, що кожна з операторних ділянок перекривається з одним з промоторів, а OR2 перекривається з обома промоторами.
Рис.3.6. Генетична карта бактеріофага .
РНК-полімераза – це фермент, що транскрибує фагову ДНК з утворенням РНК. При зв’язуванні з PR (промотор гену cro), полімераза налаштовується на транскрипцію цього гену (в праву сторону), а при з’язування з PRM (промотор гену c1) транскрибується ген c1 в іншу сторону. В клітині ці два промотора ніколи не бувають зайняті одночасно: в залежності від стану апарату регуляції експресії полімераза зв’язується тільки з одним з них. В присутності репресора полімераза може зв’язатись з PRM, а в присутності Cro – з PR.
Отже репресор, приєднаний до OR2, виключає ген cro, перешкоджаючи зв’язуванню РНК-полімерази з PR. В даному випадку репресор здійснює негатитивну регуляцію. З іншого боку, репресор, приєднавшись до OR2, допомагає РНК-полімеразі зв’язатись та почати транскрипцію з PRM. Ефективність транскрипції збільшується приблизно в 10 разів. Таким чином, білком-репресором здійснюється позитивна регуляція власного гену.
В лізогенізованій клітині репресор завжди зв’язаний з OR1 та OR2, в той час як OR3 зазвичай вільний від репресора. Таким чином, в даній клітині відбувається активний синтез білку репресора. Якщо в клітині дуже висока концентрація білку репресора, то останній приєнується до OR3 і блокує власний промотор. При діленні клітини концентрація даного білку дещо падає. В результаті цього білок-репресор від’єднується з ділянки OR3 і процес транскрипції гену c1 відновлюється. При відсутності зовнішніх впливів ці процеси можуть відбуватись необмежено довго, однак можуть бути призупинені будь-яким індуктивним впливом. Найкращим індуктором в даному випадку є ультрафіолетове опромінення.
Рис.3.7. Схематичне зображення апарату переключення генів у бактеріофагу лямбда.
Мішенню дії УФ-випромінення та інших індукуючих факторів є ДНК. Пошкодження ДНК під впливом опромінення викликає зміну в поведінці бактеріального білку Rec A. Останній стає високоспецифічною протеазою, що розщеплює мономери репресора та інших репресорів. Це призводить до двох наслідків. По-перше, по мірі того як репресор звільняє OR1 та OR2, швидкість його синтезу падає. По-друге, полімераза зв’язується з PR та починає транскрипцію гену cro. Тепер саме білок Cro визначає подальший розвиток подій. Перша синтезована молекула Cro зв’язується з OR3. Це пригнічує подальший синтез білку репресора. Поки ген PR продовжує працювати та ген cro транскрибується, транскрибуються також гени, розмішені зправа від cro. Продукти цих генів необхідні на ранніх етапах літичного циклу. Синтезується все більше білка Crо, поки його конценцентрація не досягне рівня, при якому заблоковуються ділянки OR1 та OR2. Таким чином білок Cro вимикає синтез репресора, та запускає каскад експресії генів, відповідальних за літичний шлях розвитку фагу .
Практична частина
Методи титрування бактеріофагів
Активність бактеріофагу визначають за його властивістю викликати лізис бактеріальної культури в рідких або твердих середовищах і чисельно виражають ступенем максимального розведення, в якому досліджуваний фаг проявив свою літичну дію. Вид середовища, як правило, визначається здатністю певного фагу лізувати культуру в рідкому чи твердому поживному середовищі.
При дослідженні в рідкому середовищі (за Аппельманом) титр фагу– це найбільше його розведення (або найменша кількість), яке повністю стримує (пригнічує) ріст тест-культури в умовах даного досліду.
На твердому середовищі (титрування за Граціа) титр фагу – кількість часток фагу в 1 мл досліджуваного матеріалу.
Титрування фагу за методом Аппельмана
(рідке середовище)
Завдання: опанувати методику титрування бактеріофагів в рідкому поживному середивищі, визначити титр бактеріофагу Т4.
Матеріальне забезпечення: Пробірки з ватно-марлевими пробками, штатив, груші та піпетки (самплери та носики), маркери, поживне середовище (LB), нічна бактеріальна культура, бактеріофаг, термостат.
Хід роботи:
Рис.3.8. Результати титрування бактеріофагів за Апельманом
При титруванні фагу ставлять такі контролі: контроль фагу і середовища на стерильність, контроль тест-культури на її життєву активність.
При правильній постановці досліду в контролі культури відбулося інтенсивне розмноження бактерій і вона стала мутною, що добре видно візуально. Цей контроль дозволяє зробити висновок, що тест-культура, на якій титрували фаг, життєздатна, поживне середовище забезпечує їй оптимальний розвиток в умовах досліду. Виходячи із результатів росту тест-культури в контролі, можна зробити висновок: якщо в пробірках з фагом культура не виросла, то на неї подіяв фаг. Рідина в пробірці з контролем на фаг повинна лишатись прозорою. Це дозволяє зробити висновок, що посуд, середовище і фаг стерильні.
Враховують характер змін в титраційному ряду пробірок від №1 до №7 (рис. ). Ріст культури в пробірках титраційного (дослідного) ряду свідчить про відсутність в них фагу. Визначають титр фагу, тобто його найбільше розведення, яке здатне викликати лізис культури (вміст пробірки в порівнянні з контролем на ріст культури прозорий). Позначається титр фагу степенем розведення фагу з від’ємним знаком, що відповідає порядковому номеру пробірки. Наприклад, якщо в перших чотирьох пробірках титраційного ряду відсутній ріст культури, а в наступних пробірках культура росте, то титр фагу буде 104 фагових частинок на мілілітр (рис. ).
Методичні рекомендації:
Найголовніша вимога при роботі з бактеріями – це стерильність роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією.
При розведенні бактеріофагу необхідно кожного разу брати нову піпетку (носик для самплера). Після додавання фагу в поживне середовище слід ретельно перемішати вміст пробірки. При титруванні фагу об’єм і склад середовища, температура, аерація, кількість бактерій повинні бути однакові. Змінною є тільки кількість внесеного фагу.
Практична робота: Титрування фагу методом агарових шарів
Досить точним методом оцінки активності бактеріофагу є визначення кількості інфекційно-активних одиниць бактеріофагу в одиниці об’єму (титр бактеріофагу). Для цієї мети, як правило, користуються методом агарових шарів, запропонаваним Граціа (1936 р.). Суть методу полягає у тому, що культуру індикаторних бактерій в “м’якому” (0.7%) агарі при 46ОС заражають фагом у відповідному розведенні. Цю суміш виливають на поверхню захоловшого 1.4% поживного агару, дають захолонути верхньому шару агару і ставлять на інкубацію в термостат. На протязі 6-12 годин бактерії розмножуються всередині м’якого шару агару. Низька концентрація верхнього шару сприяє дифузії фагових частинок. В результаті фагові частинки заражають бактеріальні клітини, які знаходяться по сусідству з ними, розмножуються та лізують їх. Фагове потомство інфікує надалі сусідні бактерії, які, в свою чергу, піддаються лізису в результаті появи другого покоління фагу, і так далі. В результаті на бактеріальному газоні утворюються прозорі зони відсутності росту бактерій - негативні колонії або бляшки. Утворення кожної бляшки викликається однією частинкою бактеріофагу. Отже, число негативних колоній може слугувати кількісним показником вмісту інфекційних фагових частинок в досліджуваному розчині.
Рис.3.9. Техніка виконання досліду за методом агарових шарів.
Завдання: опанувати методику титрування бактеріофагів методом подвійних агарових шарів, визначити титр бактеріофагу Т4.
Матеріальне забезпечення: Пробірки з ватно-марлевими пробками, чашки Петрі, штатив, груші та піпетки (самплери та носики), маркери, поживне середовище (LB), агаризоване середовище (0,7% та 1,4%) нічна бактеріальна культура, бактеріофаг, термостат, водяна баня.
Хід роботи:
Облік результатів титрування показує, що при великій концентрації фагу (перші 4 чашки) спостерігається суцільний лізис культур - чашки прозорі. В тих розведеннях фагу, де спостерігається зменшення кількості фагу, з‘являються окремі ізольовані негативні колонії, які можна підрахувати. Кількість негативних колоній знаходиться в оберненій залежності від розведення фагу. Щоб вирахувати кількість фагових часток в 1 мл фаголізату, користуються формулою:
n = y x ,
де: n - кількість фагових часток; y - кількість негативних колоній фага на ч. Петрі; x - розведення фагу.
Наприклад, якщо в ч. Петрі №7 (розведення фагу 107) утворилося 15 негативних колоній, то титр даного фагу буде дорівнювати кількості негативних колоній, помноженій на розведення фагу, тобто 15 107 або 1,5 108 ф/мл.
Методичні рекомендації:
Найголовнійша вимога при роботі з бактеріями – це стерильність роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією.
При розведенні бактеріофагу необхідно кожного разу брати нову піпетку (носик для самплера). Після додавання фагу в верхній агар слід ретельно перемішати вміст пробірки та обережно вилити на поверхню нижнього застигшого та підсушеного агару. Після того, як верхній агар застигає, чашки Петрі ставлять у термостат. Оскільки на кришках чашок збирається конденсат, який при зкапуванні на бактеріальний газон може зпотворювати результати титрування, то чашки Петрі ставлять кришками до низу. При титруванні фагу об’єм і склад середовища, температура, кількість бактерій повинні бути однакові. Змінною є тільки кількість внесеного фагу.
Більш точні результати титрування фагу цим методом отримують тоді, коли визначають кількість частинок фагу в вихідній рідині по декількох розведеннях і визначають їх середнє арифметичне.
Слід зазначити, що підраховувати негативні колонії краще на чашках Петрі, де виросло не менше 5, але не більше 50 негативних колоній, тому що більша та менша кількість негативних колоній дасть неточні результати. Якщо ж на чашках Петрі утворилась велика кількість негативних колоній, то її розділяють на 2, 4, 6 і більше секторів, а потім отриману цифру множать на кількість секторів.
В деяких випадках для виділення фага із лізогенних культур доводиться застосовувати методи індукції профагу (ультрафіолетовим опроміненням або температурою).
Завдання: відпрацювати методику виділення бактеріофагу з лізогенної культири E. coli.
Матеріальне забезпечення: груші та піпетки, чашки Петрі, бактеріальні петлі, маркери, агаризоване середовище (1,4%), бактеріальні культури (E. coli BE та E.coli K12), ультрафіолетова лампа, термостат.
Хід роботи:
Рис. 3.10. Розсів бактеріальної культури методом штрихів.
При вірних контролях (в третьому та четвертому секторі спостерігається ріст бактеріальних колоній) проводять облік результатів. В результаті опромінення помірною дозою ультрафіолету бактерії, що несуть профаг, лізуються та вивільняють в оточуюче середовище велику кількість фагових частинок. В тому секторі, на який висівалась лізогенна культура, будуть відсутні колонії бактеріальних клітин. Нелізогенна культура буде формувати нормальні колонії.
Методичні рекомендації:
Найголовнійша вимога при роботі з бактеріями – це стерильность роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією. Перед нанесенням бактерії на поверхню агару, слід ретельно прожирити мікробіологічну петлю.
Оскільки на кришках чашок збирається конденсат, який при зкапуванні на бактеріальний газон може зпотворювати результати титрування, то чашки Петрі ставлять кришками до низу.
К о н т р о л ь н і п и т а н н я
К о н т р о л ь н і з а в д а н н я
Література
Тема. 1 Способи передачі вірусів рослин. Рослини-індикатори.
Способи передачі вірусів рослин.
Рослини-індикатори
Практична частина
Лабораторне заняття
Мета заняття
Матеріальне забезпечення
Хід роботи
Контрольні завдання
Контрольні запитання
Тема. Способи передачі вірусів рослин.
Рослини-індикатори.
Зовнішня поверхня рослин має захисні шари кутикули та пектину, крім того кожна клітина рослини оточена клітинною оболонкою. На сьогодні не відомо, щоб віруси рослин використовували специфічні клітинні рецептори, як це роблять віруси тварин та бактерій. Віруси рослин використовують порушення механічної цілісності клітинної оболонки, це досягається шляхом передачі вірусу механічно, або за допомогою вектору. Передача вірусів рослин здійснюється за допомогою насіння, вегетативно, переносниками (грибами, нематодами, членистоногими).
Фітовіруси викликають у рослин різні патологічні зміни, тому що вірусна інфекція може зачіпати практично всі сторони життя рослини. Найбільш часто спостерігається зміна забарвлення (пожовтіння, хлороз), відмирання тканин (некроз) або деформація вегетативних органів рослин.
Розрізняють чотири основні типи реакцій рослин на ураження їх вірусом:
Вірусне ураження рослини може проявлятися як системно, так і носити локальний характер (рис.17-20 (кольорова вклейка)).
Локальні ураження проявляються на листку поряд з місцем ураження, це – хлоротичні місцеві ураження, ураження некротичного типу та кільцева плямистість. Симптоми системного ураження поширюються по рослині; серед них затримка росту (карликовість), наприклад викликана вірусом жовтої карликовості ячменю. Крім карликовості рослини, що інфіковані вірусом, можуть мати і інші типи аномального росту, такі як енації, деформації листової пластинки, пухлинні нарости у вигляді бородавок. У порівнянні з листковими пластинками корені і стебла рідше підлягають змінам під впливом вірусної інфекції, проте при зараженні вірусом коротковузля винограду часто спостерігаються фасціації стебел, а вірус деформації пагонів какао викликає здуття на стеблах і коренях цих рослин.
Одним з найбільш розповсюджених симптомів на листках є поява світло- і темно-зелених ділянок, що утворюють мозаїчний візерунок. Границі між темними і світлими ділянками можуть бути або чіткими, або розпливчатими. У залежності від розміщення мозаїчних плям розрізняють прижилкову, міжжилкову, жовту мозаїки.
При деяких вірусних захворюваннях (жовтуха цукрового буряку, ксантоз суниці) характерним є хлоротичне забарвлення листкової пластинки, що зумовлено змінами у хлоропластах. У темно-зелених ділянках листка хлоропласти розміщуються рівномірно, в більш світлих ділянках агрегують, а в самих світлих зливаються і руйнуються. Для деяких груп вірусів показано, що в темно-зелених ділянках міститься значно менше вірусу, ніж у світло-зелених.
Віруси відрізняються по здатності інфікувати різні рослини: кількість сприятливих рослин варіює у різних вірусів. Коло господарів вірусу і симптоми, які вони викликають, є характерними ознаками для даного вірусу і використовуються поруч із іншими для ідентифікації вірусу. Вірусна інфекція проявляється на зовнішньому вигляді рослини, хоча це є відображенням внутрішньоклітинних змін, викликаних вірусом. Симптоми ураження можуть бути різними і залежать від рослини-господаря, тривалості інфекції, штаму вірусу та умов зовнішнього середовища. Наприклад, симптоми захворювання найбільш чітко виражені у рослин, які вирощені при яскравому світлі при помірній температурі. Для ідентифікації вірусів за візуальним симптомами використовують так звані рослини-індикатори.
Рослини-індикатори – це рослини, які дають чітку специфічну реакцію на даний вірус, що легко відрізняється від реакції цієї рослини на інший вірус.
Як індикатори в фітовірусології найчастіше використовують рослини таких родин (таб. 4.1.).
Пасльонові (Solanacea) – Nicotiana tabacum, N. clevelandii, N.glutinosa, N. debneyi, Petunia hybrida, Lycopersicon esculentum, Datura stramonium, Physalis floredana.
Лободові (Chenopodiaceae) – Chenopodium amaranticolor, Ch. quinoa.
Бобові (Fabaceae) - Phaseolus vulgaris, Vicia faba, Vigna sinensis, Melilotus officinalis.
Злакові (Poaceae) - Zea mays.
Гарбузові (Cucurbiaceae) – Cucurbita maxima, Cucumis sativus.
Щирицеві (Amaranthaceae) – Gomphrena qlobosa.
За допомогою рослин-індикаторів можна вирішити такі завдання:
Таблиця 4.1.
Реакція рослин-індикаторів на віруси
|
Вірус |
Рослини-індикатори |
Реакція рослин |
|
Вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) |
Тютюн клейкий – Nicotiana glutinosa L. Тютюн – Nicotiana tabacum L. Дурман – Datura stramonium |
Локальна реакція, некрози Локальна реакція, некрози Локальна реакція, некрози |
|
Х-вірус картоплі (ХВК) |
Гомфрена головчаста –Gomphrena globosa L. Дурман – Datura stramonium L. |
Локальна реакція, некрози В залежності від штаму вірусу – системна реакція, мозаїка Локальна реакція, некрози Комплексна локальна та системна реакції |
|
У-вірус картоплі (УВК) |
Тютюн – Nicotiana tabacum L. Дурман – Datura metel |
Локальна реакція, просвітлення жилок Локальна реакція, смугастість жилок, закручення листків, епінастії |
|
S-вірус картоплі (SВК) |
Тютюн Дебней – Nicotiana debneyi L. Лобода біла – Chenopodium album |
Локальна реакція, некрози Локальна реакція, некрози |
|
М-вірус картоплі (МВК) |
Дурман – Datura metel Тютюн Дебней – Nicotiana debneyi L. |
Локальна реакція, хлоротичні плями на листках. Локальна реакція, коричневі, кільцеподібні некрози |
|
F-вірус картоплі (FВК) |
Лобода різнокольорова – Chenopodium amaranticolor Перець однорічний – Capsicum annuum L. |
Локальна реакця, світлі некротичні плями або кільця Локальна реакція, некрози у вигляді кілець, або системна – просвітлення жилок, деформації листкової пластинки |
|
Вірус плямистого зів’янення томатів (ВПЗТ) |
Петунія – Petunia hybrida Hort Тютюн клейкий – Nicotiana glutinosa L. |
Локальна реакція, некрози Локальна реакція, некрози. Системна реакція |
|
Вірус жовтухи буряків (ВЖБ) |
Лобода – Chenopodium capitatum L. Chenopodium foliosum (Moench Aschers) |
Системна реакція , затримка росту, хлоротичність, просвітління жилок Cистемна реакція, некроз листків, затримка росту, хвилястість листків |
|
Вірус мозаїки яблуні (ВМЯ) |
Огірки – Cucumis sativus L. Квасоля – Phaseolus vulgaris L. |
Локальна реакція, некрози Системна реакція, мозаїка Локальна реакція, некрози |
Оскільки віруси є облігатними паразитами, а термін життя окремої рослини обмежений, то необхідною умовою виживання вірусу є його перехід від однієї рослини до іншої. Враховуючи відсутність у вірусів активного транспорту та масивну кутикулу листку, віруси не можуть проникати через непошкоджену кутикулу. Для вирішення цієї проблеми необхідно або уникнути проникнення через непошкоджену кутикулу (наприклад передача вірусів за допомогою пилку, насіння, вегетативним розмноженням), або використавувати деякі способи передачі, пов”язані з пошкодженням кутикули, що спостерігається при механічній інокуляції рослин та передачі вірусів за допомогою переносників.
Передача за допомогою насіння може відбуватися кількома способами, а саме вірус може знаходитись в середині насіння (наприклад, вірус кільцевої плямистості тютюну, вірус штрихуватої мозаїки ячменю, вірус мозаїки квасолі, вірус кільцевої плямистості сливи та інші) або вірус може знаходиться на поверхні насінневої шкірки (наприклад ВОМ, ВТМ). Передача вірусів в процесі вегетативного розмноження рослин може здійснюватись за допомогою бульб (наприклад, Х-вірус картоплі), цибулин, черенків та ін.
В іншому випадку віруси можуть потрапляти в рослину за допомогою переносників, таких як членистоногі, нематоди та гриби. У свою чергу членистоногі переносники підрозділяються на рівнокрилих (цикадки, білокрилки, попелиці), напівжорсткокрилих (клопи), жорсткокрилих (жуки), трипсів та кліщів. Тип трансмісії вірусів за допогою переносників може характеризуватися станом переносника за персистентністю (стан, при якому переносник залишається інфекційним після того, як залишить джерело інфекції (неперсистентний, напівперсистентний, персистентний) та базуватися на поведінці вірусу у переноснику (циркулятивні та нециркулятивні віруси). Циркулятивні у свою чергу поділяться на пропагативні (віруси здатні до розмноження як у клітинах рослини-господаря, так і в клітинах переносника) та непропагативні (віруси, що циркулюють, але не здатні репродукуватися у векторі, розмножуються тільки в клітинах рослини-господаря). Прикладом нециркулятивних вірусів є вірус гравіровки тютюну, вірус огіркової мозаїки, прикладом циркулятивних вірусів є вірус слабкої плямистості томату, вірус жовттої карликовості ячменю, У-вірус картоплі. Крім того, віруси можуть передаватися через грунт за допомогою таких переносників, як нематоди (вірус кільцевої плямистості тютюну, вірус кільцевої плямистості малини, вірус чорної кільцевої плямистості томату) та мікроскопічні гриби (вірус некрозу огірку, вірус некрозу тютюну, вірус некротичного пожовтіня жилок буряку, моп-топ вірус картоплі, вірус жовтої мозаїки ячменю, вірус мозаїки вівса).
Практична частина
Мета заняття Опанувати методику механічного ураження вірусом рослин-індикаторів різними способами.
Матеріальне забезпечення: здорові рослини тютюну Nicotiana tabacum сорт Імунний 580, дурману Datura stramonium L, лободи Chenopodium amaranticolor, квасолі зичайної Phaseolus vulgaris L.у стадії 4-х справжніх листків; віруси – вірус тютюнової мозаїки, Х-вірус картоплі; абразив – карборунд; скляні палички; 0,5л колби з дистильованою водою; фосфатний буферний розчин рН 7,4; 0,5 -1,0 л стакани з дезрозчином; етикетки для рослин; маркери.
Хід роботи
а б
Рис. 4.1. Способи ураження рослин фітовірусами: а- механічна інокуляція з використанням карбурунду, б – інокуляція уколом в жилку (Кирай З. и др., 1974).
Контрольні завдання
Контрольні запитання
Тема. 2.
Виділення, очистка та концентрування вірусів рослин
Зміст
Теоретична частина
Екстракція вірусів з рослини
Освітлення екстракту органічними розчинниками
Концентрування вірусної суспензії
Практична частина
Лабораторне заняття
Мета заняття
Матеріальне забезпечення
Хід роботи
Контрольні завдання
Контрольні запитання
Завдання для самостійної роботи студентів
Література
Теоретична частина
Виділення та очищення вірусів з інфікованих тварин чи рослин є невід’ємною частиною будь-яких вірусологічних експериментів. Вперше очищений вірусний препарат ВТМ був отриманий у вигляді паракристалів У.Стенлі в 1935 році, за що була присуджена Нобелівська премія.
Чистий вірусний препарат повинен містити віріони відповідного вірусу, ідентичні за розміром, морфологією, хімічним складом, біологічними та фізичними властивостями. Безпосередньо сам процес очищення включає в себе цілий комплекс заходів, спрямованих на виділення віріонів з екстракту тканин організма-господаря. Оскільки віруси відрізняються за своєю будовою, місцем локалізації в організмі та стійкістю до певних хімічних сполук, які використовуються при виділенні, то алгоритми виділення зазвичай різні для різних вірусів. Отримати абсолютно чистий вірус дуже важко, тому необхідна чистота препарату визначається цілями наступних досліджень.
Виділення та очищення вірусів проводиться з наступними цілями:
Зазвичай перед виділенням вірус накопичують на сприйнятливому господарі.
Екстракція вірусів з рослини
Під екстракцією вірусу з рослини розуміється механічне руйнування тканин рослин (клітинних стінок і т.п.) для того, щоб вірус з клітин вийшов у отриманий рослинний сік. Механічне подрібнення тканини може відбуватися декількома шляхами, головними серед яких є перетирання у ступці та подрібнення у гомогенізаторі. Вибір методу гомогенізації залежить від морфології досліджуваного вірусу. Якщо віріони ниткоподібні і великої довжини, то гомогенізатори не можна використовувати, оскільки це може призвести до руйнування віріонів. Перетирання проводиться з додаванням буферного розчину для підтримання постійного значення рН, оскільки при перетиранні вивільняються рослинні ферменти і рН зменшується у кислу сторону. Вибір буферу знову ж таки регламентується досліджуваним вірусом. Для кожного вірусу властиве своє значення ізоелектричної точки (таке рН розчину, при якому урівноважуються позитивні та негативні заряди поверхні віріонів і вони випадають в осад). Тому потрібно підбирати такий буфер для екстракції вірусів, щоб його рН не співпадало зі значенням ізоелектричної точки вірусу. Ізоелектрична точка більшості вірусів рослин знаходиться в кислій зоні, тому для їх екстракції використовують буфери з нейтральною або помірно-лужною реакцією. Найчастіше використовуються фосфатний буфер (рН 7.4), тріс-боратний (рН 8.4), цитратний, карбонатний (рН 9.6), гліциновий, трісовий та ін. Як вже було сказано, при перетиранні рослинних тканин вивільняються рослинні ферменти (поліфенолоксидази, каталази, пероксидази та ін.), які сприяють зниженню рН та безпосередньо руйнують віріони. Тому у буферні розчини рекомендується додавати хелатуючі речовини (наприклад ЕДТА), які інактивують рослинні ферменти. Це дозволяє утримати рН на потрібному рівні (тобто, вірус не випаде в осад при досягненні його ізоелектричної точки) і збільшити загальний вихід вірусу з тканини.
При виділенні вірусів рослин зазвичай наважку рослини розтирають у подвійному об’ємі відповідного буферу. Тобто, наприклад, 50 грамів рослинної тканини перетирають у 100 мл буферу.
Слід також зазначити, що гомогенізація тканини, як і всі наступні операції при виділенні та очищенні вірусів, повинні проводитися на холоді при 0-4˚С. Для цього використовують охолоджений інструментарій, а тканини бажано гомогенізувати в рідкому азоті.
Освітлення екстракту органічними розчинниками
В результаті механічного руйнування уражених тканин отримується суспензія, що містить дуже розбавлений вірус, рештки клітин (мембрани, органели, уламки клітинної стінки та ін.) та пігменти. Тому наступним етапом є очистка первинної суспензії від вищеперерахованих сторонніх компонентів. Більшість з них містить ліпіди, тому використовуються органічні розчинники, які дозволяють розчинити ці ліпідвмісні компоненти, не пошкоджуючи вірус. Після застосування цих розчинників зелені пігменти розчиняються і надалі видаляються, тому вторинна суспензія буде вже не зеленого, а солом’яного кольору і прозора. З цієї причини даний етап і називається освітленням екстракту.
Слід зазначити, що деякі віруси рослин та багато вірусів тварин є складними і містять у своєму складі суперкаписдну оболонку, яка також складається з ліпідів. Тому, якщо досліджуваний вірус є складним, то при очищенні первинної суспензії не можна використовувати органічні розчинники, оскільки це призведе до деструкції віріонів.
Звичайно для освітлення використовують хлороформ або суміш хлороформу з бутанолом з розрахунку 1 об’єм розчинника на 7 об’ємів первинної суспензії. Наприклад, якщо після гомогенізації було отримано, приміром, 140 мл суспензії, то для її освітлення потрібно додати 20 мл органічного розчинника.
Після додавання розчинника отриману суміш інтенсивно струшують протягом 15-20 хв у герметичному посуді для кращого розчинення клітинних компонентів. Надалі суміші дають відстоятися на холоді протягом 10-15 хв. В результаті в суспензії утворюється 2 фази: верхня водна, де міститься шуканий вірус (оскільки вірус не розчиняється в розчиннику), та нижня фаза, що містить органічний розчинник з усіма розчиненими у ньому клітинними компонентами. Відбирається верхня водна фаза з вірусом, а нижня видаляється. Надалі ця фаза центрифугується на низькошвидкісній центрифузі (5-10 тис. об/хв) протягом 15-20 хв для остаточного видалення органічних компонентів. Центрифуга також повинна мати рефрижератор для охолодження. У результаті центрифугування отримується вторинна освітлена суспензія, що містить розбавлений вірус.
Концентрування вірусної суспензії
На наступному етапі потрібно концентрувати розбавлений вірус. Це можна зробити декількома методами, серед яких:
Осадження вірусу в ізоелектричній точці. рН отриманої суспензії доводять до ізоелектричної точки вірусу. В результаті цього вірус починає випадати в осад. Витримавши 1-2 год при даному рН суспензію, її центрифугують на невеликих швидкостях протягом 15-30 хв, вірус утворює осад на дні пробірки. Недоліком методу є порівняно малий вихід вірусу (не всі віріони випадають в осад), а також те, що деякі віруси є чутливими до зміни рН, що може призвести до руйнування віріонів.
Висолювання. Білкова оболонка вірусу має зовні гідрофобні зони (їх наявність зумовлена амінокислотним складом капсидних білків), які впорядковують навколо себе молекули води у розчині буферу. Внесення у суспензію солей у дуже високих концентраціях призводить до того, що іони солі сольватуються (тобто, відтягують на себе вільні молекули води) і гідрофобні зони капсидних білків вірусу втрачають молекули води. Наслідком цього є агрегація віріонів та їх випадання в осад. Для висолювання найчастіше використовуються сульфати та фосфати, наприклад, сульфат амонію. Недоліком методу може бути відсутність в зовнішніх ділянках капсиду гідрофобних амінокислот, і тоді навіть при дуже високих концентраціях солі вірус не випадатиме в осад.
Диференційне центрифугування. На сьогодні цей метод разом з численними модіфікаціями є найбільш уживаним у вірусології. Суть методу полягає у чергуванні циклів низькошвидкісного та високошвидкісного центрифугування. Перший цикл – низькошвидкісний – є, по суті, етапом освітлення первинної суспензії від важких клітинних компонентів (5-10 тис.об/хв, 15-30 хв). Надалі на другому етапі здійснюють високошвидкісне центрифугування (30 тис.об/хв або 100 тис. g, 1-24 год). При цьому все, що є в суспензії (а після першого циклу там має бути мало клітинних компонентів і порівняно багато вірусу), осідає на дно пробірки. Після цього отриманий осад, що містить зконцентрований вірус, розчиняють (ресуспендують) у мінімальному об’ємі буферу, який надалі знову центрифугують на малих швидкостях для видалення не очищених раніше клітинних компонентів. Таким чином, отримується кінцева суспензія вірусу у високій концентрації (вірус з усієї рослини, розтертий, наприклад, у 100 мл буфера, буде зконцентрований до 0.5мл об’єму кінцевої суспензії).
При високошвидкісному центрифугуванні вірусний препарат можна наносити на подушку сахарози для кращого очищення суспензії або ж на градієнт сахарози для розділення суспензії на фази.
Завданння. Оволодіти методикою отримання вірусвмісного матеріалу із хворих рослин.
Матеріальне забезпечення: рослини тютюну Nicotiana tabacum, Datura stramonium L сорт Імунний 580, Datura stramonium L, Chenopodium amaranticolor, Phaseolus vulgaris L. із симптомами вірусного захворювання, фосфатний буферний розчин рН 7,4, штатив з пробірками, лійки, марля, центрифужні пробірки, піпетки на 1-5 мл, ступки з товкачиком, дезінфікуючий розчин, терези з різноважками, низькошвидкісна центрифуга, еппендорфи.
Хід роботи
Контрольні завдання
б) використовуються як для очищення, так і концентрації фітовірусів.
Контрольні запитання
Список літератури
Розділ 5. Використання електронної мікроскопії у вірусологічних дослідженнях.
Зміст
Теоретична частина
Будова електронного мікроскопу
Плівки-підкладинки для препаратів
Методи контрастування вірусів
Практична частина
Хід роботи
Контрольні завдання та запитання
Список літератури
Оскільки однією з особливостей представників царства Vira є те, що вони мають субмікроскопічні розміри, їх неможливо досліджувати за допомогою світлового мікроскопу. Тільки найбільший з вірусів – вірус натуральної віспи, можна побачити під світловим мікроскопом, але неможливо розглянути навіть цей вірус детально. Тільки завдяки використанню електронного мікроскопу можливо детально розглянути морфологію вірусів.
Діагностика вірусів за допомогою ЕМ базується на ідентифікації вірусів за їх характерною морфологією. Головна перевага діагностики за допомогою ЕМ – можливість візуалізовати вірус. Можливо ідентифікувати вірус безпосередньо без попереднього вивчення вірусного агента. Інша перевага методу ЕМ – це швидкість діагностики, препарат може бути розглянутий протягом декільком хвилин після приготування препарату з вірусвмісної рідини. З іншого боку, головний недолік – неможливість дослідити одночасно багато матеріалу. По-друге, для виявлення повинна бути певна концентрація вірусних часточок (приблизно 106 часточок в мл). Деякі віруси, наприклад вірус саркоми Рауса, мають нечітку морфологію, що робить їх детекцію дуже складною. Наприкінець, утримання та обслуговування ЕМ дуже складне та потребує висококваліфікованого персоналу.
Виникнення електронної оптики, зокрема електронної мікроскопії, базуєтья на тьох основних долідженнях в області фізики, які відносяться до 1897-1926 років: відкриття електрону, встановлення хвильової природи матеріальних часточок, що рухаються, та винайдення відхиляючої дії електричних та магнитних полей на заряджені часточки. Ці посилання дозволили Е. Руска та М. Кнолю в 1931 році розробити перший просвічуючий (трансмісійний) електронний мікроскоп (ЕМ, ТЕМ).
В сучасних ЕМ з успіхом використовується ряд конструктивних особливостей, значно полегшуючих їх експлуатацію: зйомка проводиться на фотоплівку, яка знаходиться поза вакуумною системою; в колонку ТЕМ вбудовується телекамера, це дає змогу збільшити контрасність зображення та зменшити інтенсивність електронного пучка; використовуються турбомолекулярні насоси, що дозволяє уникнути забруднення парами масла; запроваджені пристосування, які дозволяють фокусувати пучок електронів на невеликому полі об’єкту; прилади обладнані мікропроцесорами, які дозволяють фокусувати зображення, оптимізувати контрасність та експозицію, зберігати зображення в пам’яті та ін.
Сучасні серійні електронні мікроскопи дозволяють отримувати мікрофотографії з розподільчою здатністю досліджуваних структур до 4,5 А, а в окремих випадках розподільча здатність 2, 35 А. і навіть 1,43 А. Відстань між окремими нуклеотидами в полінуклеотидному ланцюгу складає приблизно 6 А, а період повторення в подвійній спіралі ДНК - 34 А. Здавалося б, первинна та вторинна структури ДНК могли бути досліджені електронномікроскопічно. Однак експериментатори, які працюють в цьому напрямку, стикаються з великими труднощами, і відчутних результатів поки що не досягнуто. Електронна мікроскопія окремих порівняно крупних білкових молекул в ряді випадків дозволила отримати точні відомості про четвертинну структуру молекул.
Всі труднощі, з якими стикаються дослідники, пов’язані з тим, що щільність біологічних об’єктів в декілька разів менше, ніж тих, при дослідженні яких отримують максимальну якість зображення. Для того, щоб отримати зображення макромолекул, їх доводиться контрастувати, вишукуючи для цього різні прийоми. Якість зображення біологічних структур, який досягається таким чином, поки що нижча ніж на мікрофотографіях кристалів або напилених в вакуумі часток металу.
Не дивлячись на великі експериментальні труднощі, електронна мікроскопія біологічних макромолекулл продовжує успішно розвиватися. Дозволяючи використовувати для досліджень звичайні суспензії та розчини препаратів, електронна мікроскопія значно розширила коло можливих досліджень. При дослідженні вірусів, наприклад, застосування удосконалених методів контрастування дозволяє безпосередньо спостерігати форму білкових капсул, розташування та конфігурацію білкових субодиниць, з яких вони складені. Електронна міроскопія дозволяє досліджувати процес ресинтезу вірусів in vitro.
Застосування методу електронної мікроскопії для вивчення будови біологічних макромолекул має велике майбутнє. Запорука цьго - швидке вдосконалення приладів і методів досліджень, зростаючий інтерес, який приділяється розвитку цього напрямку вченими самих різних спеціальностей - біологами, фізиками, хіміками.
Найважливіша характеристика мікроскопу - здатність давати роздільне зображення точок об”єкта, розташованих в безпосередній близькості, називається розподільчою здатністю. Чим менше відстань між двома точками, при якому ці точки ще видно окремо, тим вища розподільча здатність приладу.
Зображення точки, яка світиться, що отримують за допомогою круглої лінзи, завдяки дифракції світла на отворі лінзи представляє собою не точку, а дифракційну картину. Якщо дві точки об”єкта розташовуються поблизу, то кожна з них дає свою дифракційну картину та розподіл інтенсивності є результатом їх додавання. Спостерігати окремо ці дві точки можливо, якщо максимум дифракційної картини зображення однієї з них знаходиться по відношенню до максимуму дифракційної картини сусідньої точки на відстані не ближче, ніж до першого мінімуму дифракційної картини. Можливо показати, що відстань (d) між центральним максимумом та першим мінімумом в масштабах об”єкта дорівнює:
d= (1)
де - довжина хвилі;
n - показник заломлення середовища, в якій знаходиться об”єкт;
- апертурний кут лінзи.
З рівняння (1) витікає, що найбільша розподільча здатність (найменше значення d) може бути досягнута при мінімальній довжині хвилі, в той час як n та повинні бути по можливості більше. В повітрі або в вакуумі n = 1. В умовах використання імерсійного об”єктива (n = 1,4) і , близького до 90, єдиним ресурсом для збільшення розподільної здатності залишається довжина хвилі.
Оскільки людське око найбільш чутливе до жовто-зеленої частини спектру, в світловій мікроскопії користуються світлом з довжиною хвилі 5200-5800 А. В цих умовах (при n= 1) теоретична границя розподілу складає близько 2000 А ( приблизно 1/5 розміру бактеріальної клітини). Використання ультрафіолетової оптики, коли безпосереднє спостерігання вже неможливе, дозволяє досягнути розподілу 1200 А. Таким чином, за межами можливості світлової мікроскопії залишаються дослідження тонкої структури клітин, вірусів, макромолекул.
Збільшити розподільчу здатність мікроскопів дозволило застосування електронів. Як відомо, довжина хвилі () частки, що рухається, може бути підрахована з рівняння
(2)
де h -постійна Планка;
m - маса частки;
v - швидкість частки.
Якщо замінити в в формулі (2) h і m їх числовими значеннями та виразити швидкість v через прискорюючий потенціал V, отримаємо:
. (2”)
При прискорюючій напрузі в електронному мікроскопі 50 кв, відповідає 0,0536 А ( складає 1/100 000 довжини хвилі звичайного зеленого світла), при 80 кв - 0,0418 А та при 100 кв - 0,0370 А. Таким чином, довжина хвилі електронів значно коротша, ніж у видимого світла. Отже, і коло розсіювання завдяки дифракції в цьому випадку буде значно меншим. В цьому є причина ефективності електронного мікроскопу. Теоретично, (див. рівняння 1) при sin =1 електрони з довжиною хвилі 0,04 А змогли б забезпечити розподільчу здатність 0,025 А. Однак магнітним лінзам, за допомогою яких в електронному мікроскопі створюється збільшене зображення, властиві різноманітні аберації, які, як це буде показано далі, при великих апертурних кутах дуже великі. Найкраща розподільча здатність відповідає =10-2 - 10-3 радіан. В цих умовах сучасні електронні мікроскопи здатні забезпечити розподіл до 1,43А. Треба сказати, що розподіл залежить не тільки від приладу, але й від фізичних властивостей досліджуваного об”єкта. Найбільшу розподільчу здатність вдається отримати для кристаличних препаратів.
Висока розподільна здатність електронних мікроскопів відкрила для досліджень велику область, в якій знаходяться відповіді на багато проблем біохімії та біофізики. Межа цієї області завдяки удосконаленню мікроскопів та розробці нових методів препарування в останні роки розширилась до молекулярного рівня, де раніше дослідження проводилися головним чином за допомогою рентгеноструктурного аналізу.
Спрощені схеми шляху електронів та розташування магнітних лінз в мікроскопах просвічуючого типу показані на рис.5.1. В цих приладах пучок електронів проходить через досліджуємий предмет і начебто “просвічує” його. Звичайно лінзи розташовуються одна над одною, формуючи вертикальну колонку, в верхній частині якої знаходиться джерело електронів - електронна гармата. Всередині колони підтримується вакуум 10-4 - 5х10-5 мм рт.ст. Джерело електронів та осі різних лінз мають знаходитися на одній лінії, тому передбачається можливість юстировки приладу.
Електрони, які проходять через речовину об’єкту, змінюють свої траєкторії - розсіюються. Приблизно співвідношення між числом попадаючих на дільницю зразка електронів N та числом тих електронів, що розташовуються на кут більший - N можливо виразити таким чином:
де - густина досліджуваної речовини;
NA -число Авогадро;
A - атомна вага;
Z - атомний номер;
V - прискорююча напруга;
e - заряд електрону;
t - товщина зразку.
Таким чином, число розсіяних електронів збільшується зі збільшенням густини досліджуваної речовини, його атомного номера, товщини зразку та зменшенням енергії електронів.
Практика доводить, що при сучасних методах контрастування біологічних макромолекул оптимальна прискорююча напруга для їх досліджень знаходиться в діапазоні 70-100 кв. При напрузі нижче 70 кв зразок швидше руйнується під впливом електронів, в результаті втрати енергії чатиною електронів при проходженні через об”єкт збільшується хроматична аберація, зменшується розподільча здатність. При напрузі вище 100 кв деталі досліджуваних структур також виявляються гірше через зменшення розсіювання електронів.
Біологічні об’єкти складаються з речовин з малими атомними номерами - водню, вуглецю, азоту, фосфору та ін. Густина для різних біологічних об”єктів складає від 1 до 2 г/см3 . Мінімальна товщина біологічного об”єкту такої щільності, яка виявляється при прискорюючій напрузі в електронному мікроскопі 50 кв, дорівнює приблизно 50 А. Практично не контрастовані частки невеликих вірусів, розташовані на підтримуючій плівці, спостерігаються в електронному мікроскопі в вигляді безструктурних плям, а окремі неконтрастовані молекули нуклеїнових кислот взагалі неможливо спостерігати. Але завдання сучасної електронної мікроскопії в біології - по можливості глибше вникнути в будову клітини та її структурних компонентів, в будову вірусних часточок. В зв”язку з цим біологічні об”єкти необхідно тим чи іншим чином контрастувати.
Поряд з контрастуванням відтіненням металами і використанням широко розповсюдженого методу реплік розроблені специфічні методи контрастування, які застосовуються головним чином в біології. Широке застосування отримав метод вибіркового “фарбування” тканин, тонких зрізів та окремих часток та молекул та молекул солями важких металів, а також метод так званого негативного контрастування.
До специфічних особливостей електронної мікроскопії в біології відноситься також велика ймовірність виникнення артефактів, тобто внесених в структуру об”єкта викривлень його реальної форми. Це пов’язано з одного боку - з процесом фіксації та висушування, з другого - з процесом контрастування. Для виявлення артефактів та попередження їх необхідні ретельний аналіз отриманого зображення, порівняння отриманих даних з результатами інших досліджень.
Плівки-підкладинки для препаратів.
Біологічні макромолекули, для того щоб їх можливо було досліджувати в електронному мікроскопі, розміщуються на тонесеньких плівках-підкладинках. В свою чергу опорою для цих плівок слугують спеціальні сітки, виготовлені з міді електролітичним способом або сплетені з тонкого дроту. Ті ж електрони, які формують зображення досліджених об”єктів, взаємодіють з плівкою-підкладинкою. Тому, якщо товщина плівки відносно велика або матеріал, з якого вона зроблена, сильно розсіює електрони, контрасність зображення розміщеного об”єкту різко погіршується. Матеріал плівки повинен бути механічно міцний, мати значну теплопровідність та стійкість до бомбардування електронами (таб.5.1). Іноді препарати, розташовані на плівці-підкладинці, піддаються спеціальній обробці, в таких випадках до плівки пред”являють додаткові вимоги хімічної стійкості. Слід відмітити ще одну важливу особливість плівок-підкладинок. При дослідженні молекул біополімерів підтримуюча плівка в силу властивостей своєї поверхні (гідрофільність або гідрофобність, наявність заряду) може суттєво впливати на їх конфігурацію. Це необхідно враховувати при виборі підкладинки чи трактовці результатів.
Таблиця 5.1.
Деякі властивості плівок-підкладинок (Атабеков, 1980)
|
Плівка |
Прозорість по відношенню до електронів |
Механічна міцність |
Стійкість до бомбардування електронами |
Хімічна стійкість |
|
Колодієва Формварова Вуглецева Кварцева |
Велика Велика Середня Мала |
Низька Низька Висока Середня |
Низька Низька Висока Середня |
Низька Низька Дуже висока Висока |
Якість зображення об’єкта залежить від товщини плівки-підкладинки. Зменшення товщини плівки зменшує її механічну міцність. Дуже тонка плівка буде розриватися в процесі препарування або під впливом пучка електронів. Тонкими плівками можна користуватися, якщо застосовувати в якості додаткової опори дірчасті плівки, виготовлені з колодію та укріплені шаром вуглецю.
Для приготування плівок використовується 0.1-0.2%-ний розчин формвара (поліфінілформальдегіда). Розчинниками можуть бути діоксан, діхлоретан, хлороформ. Розчин слід готувати за одну добу до використання, зберігати в посуді з притертою кришкою в темному місці, строк придатності до 6 місяців.
МЕТОДИ КОНТРАСТУВАННЯ ВІРУСІВ
Віруси є електронно-оптично прозорими. Контрасність зображення в трансмісійному ЕМ можливо підвищити шляхом зниження прискорюючої напруги, зменшення апертурної діафрагми, збільшення фокусної відстані об’єктивної лінзи. Найбільш єфективним підходом є хімічне контрастування – штучне збільшення електроної щільності ультраструктур. За рахунок осадження електронно-щільних речовин контрастування може бути позитивним – підсилення електронної щільностідосліджеваних структур порівняно з фоном, який оточує об’єкт, та негативним – збільшення електронної щільності фону. В першому випадку електронно-шільні речовини осаджуються на вірусах, в другому вони вводяться в середовище, яке оточує досліджувані об’єкти (вірусні частки, білки, тощо).
Позитиве контрастування.
Для контрастування найчастіше використовуються уранілацетат та цитрат свинцю.
Уранілацетат (УА) реагує головним чином з фосфатними, карбоксильними та аміногрупами та має велику спорідненість до нуклеїнових кислот. Для позитивного контрастування за допомогою УА використовують 2% або насичений розчини у 50, 70 або 100% етанолі чи метанолі. УА добре проникає в тканини тому він частіше використовується для контрастування зрізів тканин, уражених вірусами. Робота з спиртовими розчинами УА має ряд труднощів. За рахунок великої летючості спиртів при довготривалому контрастуванні на зрізах нерідко випадає осад. Окрім того, спиртові розчини УА досить агресивні: вони руйнують деякі плівки-підкладинки. Це особливо ебезпечно при монтуванні зрізів на бленди.
З іонів свинцю для контрастування біологічних об’єктів частіше за все використовується цитрат свинцю (ЦС), рідше гідрооксид свинцю, ацетат та інші солі. ЦС зв’язується з негативно зарадженими компонентами, такими як гідроксильні групи та реагуючі з осмієм частини. В цей процес залучені також фосфатні групи.
Фосфорно-вольфрамова кислота (ФВК) в залежності від рН (більше чи менше 3) забарвлює полісахариди та глікопротеіни, а також нуклеопротеіди та білки.
Метод негативного контрастування.
Негативне контрастування забезпечує отримання високого розподілу при дослідженні біологічних макромолекул та ізольованих ультраструктур. При цьому навкруги вірусу утворюється гомогенний фон речовини високої електронної щільності. Негативний контрастер збільшує контрасність біологічних часточок шляхом інфільтрації пор та нерівностей на поверхні зразку та оточення електронно-прозорого об’єкту електронно-щільним матеріалом: біологічний об’єкт має вигляд як електронно-прозора область на фоні електронно-щільного оточення. Методика проста та не вимагає багато часу. Цей метод рідко використовується для тканинних зрізів.
Розподільча здатність при негативному контрастуванні вища, ніж при позитивному. Границя розподілу визначається розміром часточок висушеного барвника. При використанні фосфорновольфрамової кислоти (ФВК) границя складає приблизно 1,2 нм.
Речовини, які використовуються для негативного контрастування, мають відповідати деяким вимогам (таб. 5.2). По-перше, вони не повинні вступати в реакцію з об’єктом. По-друге, вони повині бути добре розчинними та мати високу електронну щільність. По-третє, мати високу точку плавлення та бути термічно стабільними для попередження сублімації та плавлення під електронним пучком. Речовини, які використовуються для негативного контрастування, наведено в таблиці.
Таблиця 5.2. Речовини, які використовуються для негативного контрастування.
|
Сіль |
Концентрація, % |
Для контастування яких структур використовується |
|
Молібденацетат |
1-3 |
Мембрани, субодиниці ферментів, клітинні фракції |
|
ФВК |
0,5-2 |
Віруси, бактерії, клітинні фракції, зрізи, макромолекули |
|
УА |
0,5-2 |
Віруси, бактерії, клітинні фракції, зрізи, макромолекули |
|
Ураніл-магнезіумацетат |
1 |
Віруси, бактерії, клітинні фракції, зрізи, макромолекули |
|
Уранілоксалат |
0,012 М |
Невеликі макромолекули |
|
Уранілформат |
0,5-2 |
Невеликі макромолекули |
Сутність методу полягає в тому, що біологічний об’єкт занурюють у речовину високої електронної щільності, в результаті чого малоконтрастний зразок стає більш чітким повівняно з оточуючим темним фоном. В цьому випадку отримується негативний ефект (рис.5.2. ). Частіше використовуються 1-2%-ний розчини фосфорновольфрамової кислоти (ФВК) або уранілацетату (2-5%) на дистильованій воді. Розподільча здатність цього методу вища, ніж методу віддтінення, і досягає 12 А.
Рис.5.2. Схема формування зображення об’єкту при негативному контрастуванні (Атабеков, 1980).
А- вид збоку; Б – вид зверху. 1 – об’єкти; 2 – розчин солі важкого металу 3 – підкладка.
Загальна схема негативного контрастування.
Успіх негативного контрастування залежить від того, чи будуть частки агрегувати та наскільки випадково вони розподілені по підкладинці. Барвник може змішуватися з розчином об’єкту до нанесення на підкладинку, або наноситися на підкладинку після адгезії до неї об’єкту. Суспендування зразків в розчині контрастеру дозволяє отримувати різну орієнтацію вивчаємих часточок на підкладинці. При звичайній процедурі негативного контрастування концентрація часточок повинна бути порядка 10-6 – 10-7 на 1 мл. Прі підборі оптимальної концентрації важливо досягти стану, щоб не було наложення часточок одна на одну.
Існують різні способи нанесення зразків на підкладинку.
Метод краплі.
На взяту пінцетом сіточку з підкладинкою наносять краплю зависі об’єкту. Через 1 хв після адсорбції об’єктів на сіточку наносять краплю розчину для негативного контрастування. Надлишок рідини видаляють фільтрувальним папером. Вміщують сіточку в контейнер. Після 15-30 хв зразок може бути досліджений в ЕМ. Можливо змішати завис зразку з барвником (1:1, по краплі) на плівці парафільму, а потім краплю суміші переносять на сіточку з підкладинкою.
Метод флотації.
Сіточку з підкладинкою вміщують на поверхню краплі вірусвмісного матеріалу об’єкту. За 1 хв об’єкт встигає адсорбуватися на поверхні підкладинки. Потім сіточку з об’єктом переносять на розташовану поруч краплю розчину негативного контрастера на 30 с та висушують.
Метод напилення.
Розчин барвника змішують з суспензією об’єкту та напиляють на підкладинку. Але при роботі з патогенними об’єктами (вірусами) така процедура являє собою велику небезпеку для здоров’я працівників. Завис матеріалу зазвичай готують в 1%-ному водному розчині контрастера та за допомогою пульвелізатора або за допомогою піпетки наносять на поверхню сіточки з підкладинкою. Сіточки висихають майже миттєво, та утворюється тонка плівка барвника, яка містить в собі об’єкт.
Контрастування відтіненням
При контрастування за методом відтінення проводиться випаровування металу в вакуумі. Атоми металу розлітаються від місця випаровування по прямолінійним траєкторіям. Якщо під деяким кутом по направленню до пучка часток, що розпилюються, розташувати дослідний об’єкт, то на його поверхні буде осідати шар металу різної товщини. На ділянках, розташованих перпендикулярно до направлення льоту часток, утворюється більш товстий шар. В тих місцях, де об’єкт буде екранувати пучок часток, утворюються “тіні”. Розсіювання електронів для різних ділянок об”єкта є різним, в результаті чого контрастність зображення підвищується. В зв’язку з специфічним явищем утворення тіні кут між направленням часток, що розпилюються, і об’єктом називається “кутом віддтінення”, а сам метод - “методом відтінення”.
Артефакти, які виникають при контрастуванні.
Артефакти утворюються в основному при недостатньому або надлишковому забарвленні структур, у випадку використання старих реактивів та ін. Артефакти часто обумовлені наявністю температури повітря та вологості. Своєрідним артефактом є псевдо негативна контрасність, що іноді виникає при надлишковій обробці зрізів насиченим розчином уранілацетату.
Рис. 5.3. Електронномікроскопічні зображення вірусів, отримані за допомогою негативного контрастування зліва направо: rotavirus, adenovirus, astroviruses, Norwalk-like viruses. (Linda M. Stannard, University of Cape Town)
Практична частина
Хід роботи
1.Чисте предметне скельце швидко занурити в розчин формвара, через 5-10 с скло витягти та підсушити (сушити слід 40-60 с до зникнення запаху розчинника). Плівку, що утворилася на склі, можна виявити, якщо подихати на скло (рис. 5.4.).
2. Отриману плівку підрізати лезом бритви, потім зняти плівку на воду (скло повільно занурити у воду під кутом 450). На плівку викласти сітки і зняти їх за допомогою фільтрувального паперу. Сітки з плівкою висушуються та зберігаються в чашках Петрі.
3. На сітку з плівкою нанести краплю суспензії вірусних часток. Рідину відбирають фільтровальним папером через 30-60 с, сітку висушують.
4. На сіточку нанести краплю контрастуючої речовини і через 1 хв відбирають рідину; після просушування препарат готовий для дослідження.
5. Дослідити препарати в електронному мікроскопі.
6. Визначити розміри вірусних часточок за допомогою отриманих електронномікроскопічних знімків.
За допомогою лінійки виміряти довжину та діаметр вірусних часточок на електронній мікрофотографії. Визначити середнє значення. Порівняти отримане число з лінійкою в кутку фотографії (в 1 см кількість нанометрів). Визначити розміри часточок в нанометрах.
Рис.5.4. Приготування плівок-підкладинок з формвару.
1- предметне скельце; 2 – стаканчик з розчином формвару.
Контрольні завдання:
Контрольні запитання.
Список літератури.
Розділ. 6. Методи діагностики вірусних інфекцій та ідентифікації вірусів
Тема 1. Серологічні методи досліджень
Зміст
Теоретична частина
Реакція гемаглютинації
Серологічні методи дослідження
Імунодифузійні тести
Радіоімунологічний аналіз
Імунофлуоресцентний аналіз
Імуноферментний аналіз
Практична частина
Практична робота №1
Хід роботи
Контрольні завдання та запитання
Практична робота №2
Хід роботи
Контрольні завдання та запитання
Список літератури
Теоретична частина
Реакція гемаглютинації
Можливість використовувати еритроцити різноманітних тварин як індикатори, що дозволяють виявляти різні антигени або антитіла, була продемонстрована в 1902р., коли Р.Крауз та Д.Людвіг вперше показали здатність стафілококів і вібріонів викликати аглютинацію еритроцитів. Г. Херст в 1941р. помітив, що при розтині заражених грипом ембріонів кров, яка витікала з пошкоджених судин, при змішуванні з вірусвмісною алантоїсною рідиною збиралась в конгломерати з червоних кров’яних тілець.
Пізніше було показано, що багато вірусів мають гемаглютинуючі властивості, наприклад, ортоміксовіруси, параміксовіруси, рабдовіруси, поксвіруси, реовіруси, аденовіруси та інші; крім того, було виявлено, що віруси аглютинують не тільки еритроцити курей, але й інших видів птахів та ссавців (курчат, качок, голубів, чайок, морських свинок, собак, людини), завдяки чому цей метод почав широко використовуватись для ідентифікації вірусів.
Принцип реакції гемаглютинації заключається в тому, що аглютинація відбувається за рахунок адсорбції вірусних часток на поверхневих рецепторах еритроцитів різноманітних видів тварин (без участі в реакції специфічних антисироваток). Ця властивість зумовлена взаємодією поверхневих вірусних білків (у простих вірусів це білки капсиду, у складних – гліко- та ліпопротеїни суперкапсиду), які дістали назву гемаглютининів, з поверхневими білками еритроцитів (глікопротеїнами). В результаті такої адсорбції еритроцити склеюються один з одним, що призводить до утворення агрегату, який осідає на дно пробірки чи лунки планшету тонкою плівкою у вигляді перевернутої парасольки (повна аглютинація). Якщо ж реакція не відбулась, тобто в розчині відсутні гемаглютинуючі віруси, то еритроцити осідають на дно щільним осадом. Взаємозв’язок між вірусом та еритроцитами є зворотним і може наступити фаза елюції (звільнення) вірусу за допомогою вірусного ферменту нейрамінідази, яка дисоціює утворені зв’язки. Швидкість елюції залежить від ряду факторів: концентрації солей в розчині, температури, рН середовища. Здатність вірусу елюювати з еритроцитів часто використовують при роботі з вірусом грипу для його очистки та концентрації.
Реакція гемаглютинації (РГА) широко застосовується у вірусологічній практиці як швидкий, технічно простий, дешевий та достатньо надійний метод виявлення гемаглютинуючих вірусів в досліджуваному матеріалі, а також для титрування вірусів.
Умови постановки реакції гемаглютинації залежать від багатьох чинників. Різні типи вірусів, а іноді і штами одного й того ж вірусу відрізняються чутливістю до спектру еритроцитів (гемаглютинуючих видів). Наприклад, до вірусу грипу найбільш чутливі еритроцити курей, людини (0 – групи), морських свинок; до вірусів енцефаліту – еритроцити гусей; до вірусу кору – еритроцити мавп; фітовіруси активно аглютинують баранячі еритроцити. Таку видову приналежність еритроцитів часто використовують для індикації вірусів. У лабораторній діагностиці найчастіше використовують еритроцити птахів, а не ссавців, бо вони швидше аглютинуються і дають чіткий результат. Інтенсивність реакції залежить від температури та виду вірусу. Наприклад, для вірусів грипу та паротиту інтенсивність РГА найбільша при 4 – 220С, для вірусу поліоми – 40С. РГА, як правило, ставлять в ізотонічних розчинах з рН в межах 6,0 – 9,0 (наприклад, 0,85% NaCl). В кислому та лужному середовищах відбувається швидка інактивація гемаглютинуючих властивостей вірусу.
Для реакції використовують завис еритроцитів від 0,25 до 3%, але найбільш оптимальною є 0,5 – 1,5% завис. Для її приготування свіжоотриману кров дефібринують механічно (за допомогою стерильних намистин), або використовуючи антикоагулянти (2,5 – 5% розчин цитрату натрію, Альсевера, гепарину). Дефібриновану кров тричі відмивають центрифугуванням у фізіологічному розчині при 1000-1500 об/хв, а з осаду готують необхідну концентрацію еритроцитів. Зберігаються вони в холодильнику приблизно тиждень. В разі потреби можна використати формалінізовані еритроцити.
Постановка реакції складається з приготування двократних розведень вірусу на фізіологічному розчині і додавання до кожного розведення рівного об’єму зависі еритроцитів. В контролі замість розведення вірусу використовують фізіологічний розчин. Планшет струшують і залишають при певній температурі. Після визначеного часу експозиції враховують результати. За позитивний результат приймають аглютинацію еритроцитів, тобто вони вільно розміщені по дну лунки, а за негативний – компактне осідання еритроцитів у вигляді диска на дно лунки (Рис. 6.1). Позитивну реакцію оцінюють плюсами від одного до трьох відповідно, за інтенсивністю аглютинації.
Те найбільше розведення вірусвмісного матеріалу, з яким аглютинація оцінюється не менше, як на два плюси (воно відповідає приблизно 50 % аглютинованих еритроцитів), містить 1 гемаглютинуючу одиницю (1 ГАО).
1 ГАО 105 БУО (бляшкоутворюючих одиниць) 107 фізичних часток, що виявляються за допомогою електронного мікроскопу.
Рис. 6.1. Врахування результатів реакції гемаглютинації
Імунологічні методи дослідження
Від самого початку досліджень вірусних хвороб постала актуальна проблема їх розпізнавання й діагностики, оскільки були відсутні швидкі та надійні методи. Візуальне спостереження зовнішніх симптомів широко застосовувалось, так як прояв симптомів залежить головним чином від взаємодії вірусу і організму. Але на характер прояву симптомів впливають різноманітні фактори, що ускладнює діагностику. Саме тому було розроблено методи виявлення та використання антитіл (імуноглобулінів) для розпізнавання антигенів, тобто серологічні реакції. Ці методи досліджень, засновані на виявленні антигенної специфічності вірусів, не залежать від взаємовідносин вірусу та організму. Завдяки специфічності антитіла реагують тільки з тими антигенними детермінантами вірусного білку, у відповідь на введення якого вони утворились, або з вірусами, що подібні за антигенною структурою. При контакті специфічних антитіл з антигеном між амінокислотними залишками антигензв’язуючого центру і епітопом антигену утворюються багаточисельні нековалентні зв’язки. В порівнянні з ковалентними зв’язками сили нековалентної міжмолекулярної взаємодії (водневі зв’язки, електростатичні, ван-дер-ваальсові та гідрофобні взаємодії) досить слабкі, однак при великій кількості слабких взаємодій сумарна енергія зв’язування стає значною.
Основна структурна одиниця імуноглобуліну будь-якого класу складається з двох однакових легких і двох однакових важких поліпептидних ланцюгів, що утримуються разом дисульфідними зв‘язками (Рис. 6.2). Від типу важких ланцюгів залежить приналежність молекули імуноглобуліну до того чи іншого класу і підкласу. Так у людини чотири підкласи IgG (IgG 1, IgG 2, IgG 3 та IgG 4). Відомі також два підкласи IgА (IgА 1 та IgА 2), але підкласів IgМ, IgD та IgЕ людини не виявлено.
Рис. 6.2. Структура імуноглобуліну класу G:
Fab-область - варіабельна область молекули імуноглобуліну;
Fc-область – константна область молекули імуноглобуліну.
Переваги серологічних методів – швидкість отримання результатів діагностики в поєднанні з високою специфічністю. Чутливість серологічних реакцій – це найменьша кількість вірусних часток в одиниці об’єму зразка, яку даний метод може виявити. Чутливість (кількісний показник) оцінюється на модельних об’єктах – очищенних препаратах вірусів, соці штучно заражених рослин, мазках-відбитках різних органів та деяких інших. Чутливість та специфічність імунологічних тестів – це основні критерії, за якими оцінюється доцільність їх використання. Підбір відповідного методу і вибір оптимальних умов для протікання реакції антиген-антитіло – одна з важливих задач, яку ставить перед собою спеціаліст.
В даному розділі розглядається ряд традиційних методів імунодіагностики, по використанню яких накопичений великий досвід.
Реакція гальмування (затримки) гемаглютинації (РГГА або РЗГА). Принцип реакції РГГА полягає в тому, що блокований антитілами вірус не може аглютинувати еритроцити. Переваги РГГА – специфічність, простота техніки, швидкість, він не потребує стерильності. Недоліки - реакція можлива тільки з гемаглютинуючими вірусами. Всі сироватки, досліджувані в РГГА, перед роботою прогрівають при 56 – 600С протягом 30хв для видалення неспецифічних інгібіторів. Для РГГА використовують еритроцити тих видів, що і для РГА.
Постановку реакції проводять в два етапи. На першому етапі готують робочу дозу антигену (для вірусу грипу – 4ГАО), перевіряють її правильність за допомогою РГА. Ця процедура необхідна і тому, що чим нижчий титр вірусу, взятого для РГА, тим менші концентрації антитіл він виявляє. Титр в 4ГАО є найнижчим, що дозволяє отримувати достовірну гемаглютинацію, а оскільки в процесі реакції вірус ще двічі розводять, то кількість віріонів буде такою, яка є необхідною для аглютинації всіх 100% еритроцитів (1ГАО вірусу аглютинує 50% 1% зависі еритроцитів). Другий етап - готують серію розведень сироватки в однакових об’ємах в лунках планшету (від 1:10 до 1:1280). На точність виявлення титру антитіл впливає кратність розведень сироватки. До кожного розведення сироватки додають рівний об’єм вірусу в титрі 4ГАО. Суміш витримують певний час при визначеній температурі. В кожну лунку з АГ та АТ додають рівний об’єм 1% зависі еритроцитів. Отже, в пробірці змішують рівні об’єми сироватки крові та суспензії вірусу і після експозиції визначають, чи зберігся в суміші вірус шляхом додавання суспензії еритроцитів. Аглютинація еритроцитів вказує на наявність, а відсутність гемаглютинації – на відсутність вірусу в суміші. Відсутність вільного вірусу в суміші вірус+сироватка розцінюється як ознака взаємодії антитіл сироватки і вірусу. Іншими словами, якщо в сироватці є специфічні антитіла, то вірус втрачає здатність аглютинувати еритроцити і аглютинація відсутня.
Титром антитіл вважають те найбільше розведення сироватки, яке дає повну затримку гемаглютинації.
Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА). Суть реакції непрямої аглютинації в тому, що еритроцити з попередньо адсорбованими антигенами здатні аглютинуватись в присутності гомологічних сироваток (АТ). Еритроцити виконують роль носія зі специфічними детермінантами і склеювання їх відбувається в результаті взаємодії антиген-антитіло та реєструється візуально за характером утворюваного осаду (Рис. 6.3). РНГА дуже чутлива реакція, за її допомогою можна виявити 0,01 мг/мл АГ, а за специфічністю вона наближується до ІФА.
Існує дві модифікації РНГА: 1) адсорбція антигену на поверхні еритроцитів; 2) адсорбція антитіл на поверхні еритроцитів з наступною аглютинацією в присутності гомологічного вірусу.
Облік результатів проводять після осадження еритроцитів в контрольних лунках. За позитивний результат приймають аглютинацію еритроцитів (вони вільно розміщені по дну лунки); за негативний – компактне осідання еритроцитів у вигляді диска на дно лунки.
За титр антитіл в сироватці приймають найбільше її розведення, що викликає аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів.
Реакція зв’язування комплементу (РЗК). Принцип реакції заключається у взаємодії між антигеном і антитілом в присутності комплементу. Індикатором на наявність чи відсутність комплементу у вільному стані в досліджувані суміші антиген-антитіло є гемолітична система, гемоліз якої не відбувається при відсутності комплементу. Якщо в даній системі антиген з’єднується з специфічним антитілом, то комплемент адсорбується цим комплексом і спостерігається затримка гемолізу. У випадку невідповідності антигену та антитіл комплемент включається в реакцію між гемолітичною сироваткою і чутливими еритроцитами, в результаті чого спостерігається гемоліз різної інтенсивності до повного лізису еритроцитів. Таким чином, відсутність лізису означає позитивну реакцію, в той час як повний гемоліз вказує на відсутність в досліджуваній сироватці антитіл до даного антигену.
Як і всі серологічні реакції, РЗК дає оптимальний результат при використанні певних співвідношень компонентів, тому перед постановкою основного досліду необхідно визначити робочі дози основних компонентів реакції, які встановлюються за фактом гемолізу в розведеннях кожного компоненту в присутності індикаторної системи.
Реакція нейтралізації (РН). Принцип реакції нейтралізації полягає в тому, що в пробірці поєднують рівні об’єми сироватки крові та суспензії вірусу і після витримки визначають, чи зберігся в суміші активний вірус. Проводять це шляхом зараження сумішю чутливої до даного вірусу живої системи (біопроба на тест-об’єктах). Відсутність дії вірусу на тест-об’єкт при позитивному контролі розцінюють як свідоцтво нейтралізації біологічної активності вірусу антитілами сироватки і, відповідно, гомологічності антитіл сироватки і антигенів вірусу. При цьому чим більше в сироватці антитіл до взятого вірусу, тим в більш високому розведенні вона ще здатна нейтралізувати певну (стандартну) дозу вірусу. У випадку позитивної біопроби рахують, що нейтралізація вірусу не відбулась, так як сироватка не містить антитіл до взятого вурусу. РН ставлять в двох варіантах: 1) змішують рівні об’єми різних розведень сироватки з постійною дозою вірусу; 2) з’єднують рівні об’єми одного й того ж розведення сироватки (або нерозведену сироватку) із зростаючими дозами вірусу.
Імунодифузійні тести.
Термін „преципітація”, як правило, використовується для визначення реакції взаємодії між розчиненими антигенами і специфічними антитілами. Результат цієї взаємодії - преципітат помітний неозброєнним оком. Цю реакцію відкрив Р. Крауз в 1897р. при вивченні бактеріальних захворювань. З того часу вона широко застосовується при діагностиці бактеріальних і вірусних захворювань, особливо фітовірусних інфекцій. Реакція характеризується високою чутливістю (можна виявити 0,3 - 0,5мкг білку), простотою, її можна виконувати як в лабораторії, так і польових умовах.
Принцип реакції преципітації заключається в утворенні комплексів антиген-антитіло у вигляді решітки. Один з варіантів з’єднання: молекули антигена являються вузлами решітки, а молекули антитіл – зв’язуючими ланцюгами. Оскільки антигени полівалентні, кожна вірусна частка здатна зв’язуватися з антитілами, що несуть два активних центри ідентичної специфічності, утворюючи структуру решітки. З’єднання відбувається за рахунок притягання полярних груп антигенних детермінант і активного центру. Протяжність утвореної решітки залежить від відносних концентрацій реагентів. Видимий преципітат утворюється лише у випадку, коли в розчині міститься велика кількість антигена. Мінімальна кількість вірусу, необхідна для утворення видимого преципітата - 0,1-1,0 мкг. Утворення специфічного осаду може гальмуватися надлишком антигену (вірусу) або антисироватки, тому необхідно проводити їх серійне розведення. Співвідношення реагентів, яке дає швидку преципітацію, називається оптимальним співвідношенням. Для кожного вірусу та антисироватки існує межове розведення, далі якого преципітація не спостерігається.
Досить розповсюдженою з імунодифузійних тестів є реакція кільцепреципітації. Її використовують для визначення титру антисироватки або антигену. Для цього роблять розведення одного з компонентів реакції (антигену або антитіла) та обережно нашаровують інший компонент в певній концентрації. В результаті реакції на межі двох фаз утворюється кільце преципітації, звичайно, при умові специфічності антигену і антитіла. Останнє розведення антигену, при якому ще утворюється кільце преципітації, вважають титром сироватки, і навпаки, останнє розведення сироватки – титром антигену. Реакція супроводжується двома контролями – в кожному один з компонентів заміняється фізіологічним розчином.
Розвиток методів імунодифузії став можливий завдяки використанню гелевих носіїв. Перенесення реакції преципітації між антигеном і антитілом із рідкого середовища (кільцепреципітація, преципітація в пробірках) в гель дозволило досліджувати індивідуально кожну пару антиген-антитіло, так як антиген дифундує назустріч гомологічним антитілам з певною швидкістю. Отже, реакції засновані на здатності до дифузії в гелях антитіл та розчинених антигенів і відсутності такої здатності у комплексу антиген+антитіло, який утворюється при контакті дифундуючих назустріч один одному гомологічних антигену та антитіла. Комплекс антиген+антитіло осаджується в тій ділянці, де співвідношення Аг і Ат є оптимальним, в результаті утворюються смуги преципітації у вигляді мутно-білих ліній в гелі.
Тести, основані на імунодифузії, пов’язані з розділенням суміші антигену та антитіл за розміром часток, коефіцієнтом дифузії і концентраціями реагентів. Ці методи дозволяють одночасно визначати специфічність антисироваток, ступінь антигенної спорідненості між досліджуваними вірусами (Рис. 6.4) та їх штамами, вести контроль за чистотою моноспецифічних сироваток і антигенів та т.д. Чутливість реакцій досягає 50-100 мг/мл.
|
1. Ідентичні епітопи |
|
2. Неідентичні антигени |
|
3. Частково ідентичні епітопи |
Рис. 6.4. Реакція преципітації в гелі: подвійна імунодифузія.
Радіоімунологічний аналіз (РІА)
В 1959 р. Р. Ялоу і С. Берсон розробили кількісний імунологічний метод виявлення інсуліну в плазмі людини з використанням інсуліну, міченого радіоактивним ізотопом йоду (151J). Використання радіоактивних ізотопів в поєднанні з імунохімічними методами досліджень дозволяє реалізувати виключну вибірковість останніх для мінімальних кількостей біополімерів. Особлива перевага радіоімунологічного аналізу – висока чутливість. З його допомогою вдається виявити нанограмові (10-9), а іноді і пікограмові (10-10) рівні антитіл та вірусів. В РІА поєднується специфічність, властива реакціям антиген-антитіло, з чутливістю, яку дає використання радіоактивної мітки.
Радіоімунологічний аналіз базується на законі дії мас, за яким речовина, що визначається, буде конкурувати зі своїм міченим аналогом (антигеном) за обмежену кількість зв’язуючих місць антитіла до досягнення хімічної рівноваги всіх компонентів реакційної суміші.
Принцип методу можна представити наступним чином:
де А1 – вільний мічений антиген; В – специфічне антитіло; А – немічений антиген в дослідному матеріалі; А1В – зв’язаний мічений антиген; АВ – зв’язаний немічений антиген.
Мічений антиген зв’язується зі специфічним антитілом з утворенням міченого комплексу антиген-антитіло. При проведенні РІА проявляється здатність неміченого антигену дослідного матеріалу конкурувати за активні центри антитіл, пригнічуючи зв’язування міченого антигену. Як результат конкурентного пригнічення відношення зв’язаного з антитілом антигену до вільного міченого антигену зменшується при збільшенні концентрації неміченого антигену. Іншими словами, метод базується на здатності антитіл зв’язуватися з міченим радіоактивним ізотопом антигеном та на конкурентному пригніченні цієї реакції неміченим антигеном. Потім, коли цей антиген відділяється від незв’язаного, вимірюється радіоактивність однієї або обох фракцій.
Мітять препарати антигенів як правило радіоактивним 125І. Відомі різні засоби йодування білків: хлораміновий метод, лактопероксидазний, активованим ефіром та інші.
Існує декілька варіантів РІА, з яких в вірусології для практичної мети найчастіше використовують адсорбційний в різних модифікаціях: конкурентний метод (в рідкій фазі) та твердофазні прямий і непрямий методи. Останнім часом РІА використовується все рідше, оскільки пов’язаний з застосуванням радіоактивних ізотопів.
Імунофлуоресцентний аналіз (ІФ)
Імунофлуоресцентний аналіз, або метод флуоресціюючих антитіл, з’явився на початку 40-х років ХХ ст., коли А. Кунс з співробітниками використали здатність до флюоресценції одного з флюорохромів, кон’югували з ним антитіла і показали наявність збудника інфекції в тканинах. З того часу метод отримав значний розвиток і почав використовуватись в різних областях науки.
Особливість цього методу заключається в тому, що імунний комплекс стає видимим в люмінесцентному мікроскопі у випадку, якщо імуноглобулін кон’югується флюорохромом (флюоресцеіном, родаміном та ін.). В результаті ковалентного зв’язку антитіла з флюоресциюючим барвником утворюється нова сполука – флюоресциюючі антитіла. При цьому антитіла зберігають свою основну властивість – специфічність, а флюорохром – здатність до випромінювання світла.
Перевага імунофлуоресцентного аналізу в порівнянні з іншими методами полягає в дослідженні внутрішньоклітинної локалізації антигену (Рис. 20 (кольорова вклейка)).
Розроблені декілька варіантів реакції імунофлюоресценції: прямий, непрямий, сендвіч-метод, модифікація непрямого методу з використанням комплементу та інші (Рис.6.5).
Рис. 6.5. Порівняння різних модифікацій імунофлюоресцентного аналізу.
Імуноферментний аналіз
Початком використання імуноферментних методик у вірусологічних дослідженнях вважають появу перших повідомлень про можливість приєднання ферментів до білків, в тому числі і до імуноглобулінів. Зусилля дослідників зконцентрувались на розробці методів кількісного імунохімічного аналізу, заснованого на використанні антигенів (Аг) та антитіл (Ат), мічених ферментами. На початку 1970-х років був запропонований метод, який поєднує ферментативний та імунохімічний підходи, що призвело до створення імуноферментного аналізу (ІФА), в якому антитіло виступає як специфічний детектор речовини, що визначається, а фермент – як маркер імунохімічної реакції, з допомогою якого візуалізується утворення комплексів.
Методи ІФА розділяються на дві великі групи: твердофазний і гомогенний аналіз. В світовій літературі перший скорочено позначають “ELISA” (від англ. enzyme-linked immunosorbent assay, що означає дослівно “ферментзв’язаний імуносорбентний аналіз”). В цьому методі використовується принцип імобілізації одного із компонентів (антигену або антитіла) на носії. Гомогенні методи аналізу (“ЕМІ”, enzyme multiplay immunotechnic) були розроблені для визначення низькомолекулярних сполук – гаптенів, гормонів, фізіологічно активних сполук. Суть цих методів заключається в тому, що гаптен пришивається ковалентно поблизу активного центру ферменту таким чином, що після його взаємодії з антитілом молекула ферменту втрачає свою каталітичну активність. Додавання в цю систему вільного гаптену призводить до пропорційного збільшення активності ферменту в результаті витіснення антитіл з комплексу. Як ферменти в таких системах використовують лізоцим, малатдегідрогеназу та ін. Це високочутливий тест, який дозволяє виявляти білки, що містяться в кількості декількох нанограм в 1 мл.
Широко ввійшов в практику ІФА – метод фізичної адсорбції антигенів та антитіл на поверхні мікроплат із непористого полістирола. Аналіз проводиться в 5 основних етапів: 1) фізична сорбція антитіл (або антигену) на твердофазний носій; 2) імунологічна реакція: внесення антигену (або антитіл) в ті ж лунки; 3) імунологічна реакція (друге специфічне зв’язування): внесення комплексу кон’югат-фермент, хімічним шляхом зв’язаного з антитілами; 4) ензиматична реакція, коли фермент, діючи на субстрат, сприяє появі забарвленого комплексу; інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену (або антитіла) в лунках; 5) врахування результатів з допомогою приладів – абсорбціометрів, які дозволяють вимірювати оптичну густину продукту ферментативної реакції безпосередньо в лунках імунологічного планшету (рис. 6.6). Таким чином, весь процес ІФА можна умовно розділити на три основні стадії: формування специфічного комплексу антиген-антитіло, введення в нього мітки (імунохімічний процес) і її візуалізація тим чи іншим фізичним способом. Перед постановкою ІФА проводиться робота, яка включає слідуючі етапи: вирощування біологічно чистого матеріалу з моноінфекцією, отримання очищенних вірусних препаратів, приготування антисироваток з високим титром специфічних антитіл, виділення IgG і кон’югування з ферментами.
Рис. 6.6. Основні етапи ІФА.
Кількість адсорбованої речовини на полістиролі залежить від багатьох факторів (температури, рН, іонної сили, часу інкубації, присутності в суміші інших компонентів) і змінюється при їх варіюванні. Зв’язування білку з носієм залежить і від його концентрації, причому сумісний вплив рН та іонної сили найбільш чітко проявляється при більш високих концентраціях білку в розчинах. Зв’язування з полістироловим носієм безпосередньо залежить від часу і температури обробки. Обробка мікроплат яким-небуть інертним білком, наприклад альбуміном або желатином, після їх насичення антитілами дозволяє заблокувати залишкові вільні центри зв’язування, з якими могли б неспецифічно взаємодіяти молекули кон’югату.
Після з’єднання антигену або антитіла з твердим носієм можна проводити реакцію прямого, непрямого, конкурентного і сендвіч-типу (рис. 6.7).
а б
в г
Рис. 6.7. Схематичне зображення різних модифікацій ІФА:
а – прямий ІФА;
б – непрямий ІФА;
в – ІФА в модифікації DAS;
г – ІФА в модифікації TAS .
При прямому варіанті ІФА лунки мікроплат покривають тестуючим антигеном, інкубують, потім надлишок антигену видаляють і додають вірусспецифічне антитіло, кон’юговане з ферментом. Після інкубації надлишок кон’югату видаляють і додають субстрат (хромоген). Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену. Метод потребує мінімальної кількості операцій, незначної витрати реагентів і легко може бути автоматизований.
При непрямому варіанті ферментну мітку вводять не в антивірусні імуноглобуліни, а в антитіла до них. Імунний комплекс Аг-Ат, імобілізований на твердому носії інкубують з антивидовими антитілами, які мають ферментну мітку Ат2-Ф. Головна перевага методу – простота підготовки реагентів. Виключається складна процедура підготовки сироватки – очистка, виділення IgG і зв’язування їх з ферментом; можливе використання неочищенного вірусного препарату.
При використанні сендвіч-методу або його модифікації на тверду підкладку послідовно сорбують первинні антитіла, досліджуваний антиген і вторинні антитіла. У випадку простого варіанту сендвіч-методу ферментна мітка вводиться до складу вторинних антитіл, а при модифікованому методі – вторинні антитіла проявляються комплементарними до них антивидовими ензим-міченими (ЕМ) імуноглобулінами (кон’югатом). Сендвіч-метод з використанням поліклональних антитіл проводять в три стадії інкубації і декілька стадій відмивки. Однак, при використанні моноклональних антитіл, специфічних до різноманітних ділянок антигену, число стадій інкубації та промивання можна скоротити. Останнім часом ця модифікація знаходить все більш широке використання, так як для постановки реакції немає необхідності отримувати специфічні для кожного конкрентного випадку ЕМ антитіла.
Серед методів ІФА можна виділити два типи – це так званий послідовний, або неконкурентний, та конкурентний аналіз.
При конкурентному гетерогенному аналізі присутні в реакційному середовищі зв’язані і не зв’язані з ферментом антигени одночасно вступають в конкурентну взаємодію з імобілізованими на твердому носії антитілами. При інкубації надлишок незв’язанних компонентів відмивають і в систему додають відповідний субстрат.
ІФА дуже зручний, оскільки антигеном у фітовірусології в імуносорбентному тесті може бути свіжий сік рослин, очищені вірусні препарати, гомогенат із насіння або з комах-переносників.
Одна з важливих переваг ІФА – висока чутливість, яка досягається, як правило, за рахунок ферментного кон’югату, збільшення періоду інкубації, особливо на стадії ферментативної реакції, і здійснення такої послідовності етапів, при якій антиген зв’язується з імобілізованими на носії антитілами, а потім взаємодіє з доданими на останній стадії кон’югованими антитілами. Слід відмітити, що збільшення часу інкубації далеко не завжди приводить до підвищення чутливості реакції. В кожному випадку необхідно перевіряти, чи відбувається при більш довготривалій інкубації подальший розвиток забарвлення або її послаблення, особливо у випадку проведення реакції при підвищенній температурі.
Чутливість імуноаналізу залежить від констант зв’язування специфічних антитіл; чим більша константа зв’язування, тим чутливіша система. За чутливість методу ІФА приймається та концентрація антигену (або розведення екстракту рослин, що аналізується), при якому величина оптичної густини продукту ферментативної реакції на 0,2 оптичні одиниці перевищує величину оптичної густини в контрольних лунках.
Постановка сендвіч-методу ІФА:
При аналізі вірусу, що міститься в соці хворих рослин, контролем слугує сік листків здорових рослин. Також в якості контролю враховується неспецифічне зв’язування кон’югату в лунках, в яких антиген замінений на буфер-БСА.
На жаль, сендвіч-метод не дозволяє дати точну кількісну оцінку антигенної спорідненості вірусів однієї групи. Для вирішення цієї задачі використовують модифікацію імуноферментного конкурентного аналізу. Метод заснований на конкуренції між сорбованим на твердій фазі антигеном і конкурентним (спорідненим) антигеном за центри зв’язування антитіл, гомологічних сорбованому антитілу.
Постановка конкурентного варіанту ІФА:
Аналіз проводиться в рівноважному режимі і час його проведення лімітований в основному часом досягнення рівноваги реакції антиген-антитіло. Для досягнення порогової чутливості використовують мінімальну кількість сорбованого антигену і концентрацію антитіл, що забезпечують зв’язування 50% сорбованого антигену при відсутності конкуренту.
Практична частина
Практична робота №1
Завдання: визначити титр вірусу в реакції гемаглютинації.
Матеріальне забезпечення: вірусовмісний матеріал, 1,0-1,5% завись еритроцитів, фізіологічний розчин, планшети з округлими лунками, піпетки, гумові груші, дезрозчин, маркер.
Хід роботи
1. Приготувати 2% завись еритроцитів на фізіологічному розчині.
2. Приготувати в планшеті двократні розведення матеріалу, що містить вірус, на фізіологічному розчині. Для цього до ряду лунок розлити, наприклад, по 0,02 мл фізіологічного розчину. В першу лунку додати 0,02 мл досліджуваного матеріалу (отримали розведення 1:2), перенести з неї 0,02 мл до другої, з неї стільки ж до наступної і т.д. З останньої лунки 0,02 мл матеріалу відібрати в дезінфікуючий розчин.
3. Для контролю до 4-5 лунок поруч з дослідним рядом налити по 0,02 мл фізіологічного розчину.
4. До кожного розведення вірусу і до контролю додати рівний об’єм еритроцитів.
5. Струснути планшет і залишити при 370С приблизно на півгодини.
6. Врахувати результати реакції.
Контрольні завдання:
Занотувати в робочі журнали:
Замалювати в альбоми:
Контрольні запитання:
1. Який механізм РГА?
2. Назвіть фактори, що впливають на ефективність РГА.
3. Що таке титр вірусу в РГА?
4. В чому принцип визначення титру вірусу в ГАО?
Завдання для самостійної роботи:
1. Чим РГА відрізняється від інших методів титрування вірусів?
2. Як можна за допомогою РГА очистити та зконцентрувати вірус грипу?
3. Які переваги і недоліки різних методів титрування вірусів?
Практична робота №2
Завдання: визначити титр вірусу і сироватки в реакції кільцепреципітації.
Матеріальне забезпечення: вірусовмісний матеріал, сироватка, фізіологічний розчин, пробірки, піпетки, гумові груші, дезрозчин, маркер.
Хід роботи
1. Приготувати двократні розведення матеріалу (антигену або антитіла) на фізіологічному розчині. Для цього в 8 пробірок розлити, наприклад, по 2 мл фізіологічного розчину. В першу пробірку додати 2 мл матеріалу (отримали розведення 1:2), перенести з неї 2 мл до другої, з неї стільки ж до наступної і таким чином до 7 пробірки, з якої 2 мл матеріалу відібрати в дезінфікуючий розчин. 8-му пробірку залишити з фізіологічним розчином для контролю.
2. До кожної пробірки, крім 7-ї (контроль на інший компонент) обережно нашарувати рівний об’єм іншого матеріалу, титр якого ми визначаємо.
3. В 7-му пробірку нашарувати фізрозчин та врахувати результати.
Контрольні завдання:
Занотувати в робочі журнали:
Замалювати в альбоми:
Контрольні запитання:
1. В чому принцип реакції кільцепреципітації?
2. Які задачі дозволяє вирішувати ця реакція?
3. Які контролі і для чого супроводжують реакцію?
4. За якими ознаками визначають титр в реакціях преципітації?
Завдання для самостійної роботи:
1. Які преципітаційні тести Вам відомі?
2. В чому переваги та недоліки імунодифузійних тестів?
3. Характеристика методу dot-ELISA та його використання.
4. Що таке антивидові антитіла і з якою метою вони використовуються в ІФА?
5. Чи можливе кількісне визначення антигену за допомогою імуноферментного аналізу?
6. Застосування різних ферментних міток в ІФА.
Список літератури
Тема 2. Застосування полімеразної ланцюгової реакції у вірусологчних дослідженнях
Зміст
Вступ
Обладнання для ПЛР
Компоненти реакції
Параметри температурних циклів
Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК
Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях
Контрольні запитання
Література
Вступ
Більш ніж за 20 років, які пройшли з часу відкриття ПЛР (1983 рік, Кері Мюлліс, Cetus, California) ПЛР знайшла застосування в усіх галузях біології, опубліковано тисячі робіт, в яких використовувалася ця реакція.
ПЛР значно полегшила роботу молекулярних біологів, вірусологів – з її допомогою можливе отримання якої завгодно кількості фрагментів специфічної ДНК.
Зараз жодне молекулярно-біологічне дослідження генів, в тому числі і вірусних, не обходиться без іі застосування. ПЛР використовується не тільки для детекції аномальних генів та вірусів, але і для фундаментальних досліджень в області молекулярної біології. Завдяки ПЛР стало можливим досліджувати віруси, вбудовані в геном клітини-господаря, а також віроіди та вірусоіди. ПЛР дає можливість протягом дня з одієї молекули ДНК отримати 100 млрд. подібних по структурі молекул. Ця реакція дуже проста у виконанні, необхідні лише пробірка, декілька відносно простих реагентів, джерело тепла та охолодження. Препарат ДНК, якій необхідно копіювати, може бути очищеним, а може представляти собою складну суміш біологічних речовин. Як джерело ДНК підходить і біоптат з тканини пацієнта, і тотальна НК з рослин, і одна волосина, і крапля крові, знайдена на місці злочину, і мозок мумії і навіть тіло мамонта, який пролежав 40 000 років у вічній мерзлоті.
Застосування молекулярних методів для діагностики ДНК обмежується їх невисокою чутливістю та часом, який необхідний для аналізу. Так, для визначення нукелїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ з застосуванням радіактивно міченого зонду необхідно, щоб мішень була присутня в препараті в кількості декількох тисяч копій. Нерідко число аномальних (або вірусних) послідовностей в клінічному препараті діагностично значиме, але менше цієї величини, тоді гібридизація може дати псевдонегативний результат. На відміну від цього ПЛР виявляє унікальну нуклеотидну послідовність навіть в одній копії ДНК. На табл.6.1 приведені дані, які дозволяють порівняти метод ПЛР з іншими молекулярно-біологічними методами досліджень.
Таблиця 6.1.
Прівняння ПЛР з іншими молекулярно-біологічними методами.
|
ПЛР |
Блот-гібридизація за Саузерном |
Гібридизація in situ |
|
Чутливість |
1/100 000* |
1/100 |
10 мішеней на клітину |
|
Специфічність |
Висока |
Висока |
Висока |
|
Термін аналізу |
1 доби |
1 тиждень |
1 доба |
|
Можливість клітинної локалізації |
ні |
ні |
так |
*1 копія на 100 000 клітин
Труднощі, з якими стикаються дослідники при дослідженні ДНК, обумовлені самою її природою.
З курсу загальної біохімії та біохімії вірусів відомо, що ДНК - це "тендітні" ланцюги, які побудовані з 4-х типів дезоксирибонуклеотидів: дезоксіаденінтрифосфата (А-аденін), дезоксітимидінтрифосфата (Т-тимин), дезоксігуанінтрифосфата (Г-гуанін), дезоксіцитиднтрифосфата (Ц-цитозин). В послідовності цих основ закодована генетична інформація – триплет нуклеотидів кодує одну амінокислоту. Одиночні ланцюги ДНК зустрічаються рідко, звичайно пари ланцюгів з комплементарними послідовностями утворюють подвійні спиралі, в яких залишки А зв’язані з залишками Т, а залишки Г з залишками Ц (Рис.6.8). Кожний ланцюг складається з цукро-фосфатного остова, вздовж якого перпендикулярно довгій осі подвійної спиралі розташовані основи, які зв’язані водневими зв’язками. Кінці ДНК хімічно відрізняються, один підписують як 5’ (залишок фосфорної кислоти), другий 3’ (цукор). В подвійній спіралі ДНК комплементарні ланцюги антипаралельні, як наслідок, 3’ кінець одного ланцюга зв’язаний з 5’ кінцем іншого.
Рис.6.8. Схематичне зображення молекули ДНК
В клітинах молекули ДНК оточені білками, які забезпечують її більш щільне скручування. Як правило, не вдається виділити ДНК непошкодженою – нитка частіше всього розірвана в випадкових місцях, а це дуже обтяжує подальші дослідження.
В нормальних умовах ДНК являє собою складно побудовану молекулу з 4-мірною структурою. В клітині реплікація вібдувається завдяки ферменту ДНК-полімеразі (рис. 6.9). Вивчені молекули ДНК-полімераз, які виділені з різних вірусів. Вони незначно різняться своєю будовою, але активні центри в них побудовані однаково.
Рис.6.9. Схема добудови подвійного ланцюга ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази.
ДНК-полімерази були відкриті в 1955 році Корнбергом зі Станфордського ун-ту, США. ДНК-полімераза виконує ряд функцій, в тому числі забезпечує репарацію та реплікацію ДНК. Ці ферменти здатні подовжувати короткі олігонуклеотидні затравки, приєднуючи до 3’ кінця наступний нуклеотид, але для цього необхідно, щоби затравки були гібридизовані (зв’язані) з комплементарним ланцюгом ДНК, який називається матрицею. Розчин, в якому відбувається ця реакція, повинен містити нуклеозидтрифосфати (вони використовуються як будівельні блоки). Нуклеотид, який приєднує ДНК-полімераза, комплементарний основі у відповідному положенні матричного ланцюга. Наприклад, якщо це А, полімераза приєднує Т, якщо матричний нуклеотид Г, то фермент приєднує Ц. Багаторазово повторюючи цю реакцію, полімераза може подовжувати 3’кінець праймера, поки не дійде 5’ кінця матриці. В ході репарації та реплікації кожен ланцюг виступає матрицею для синтезу іншого.
Для розуміння механізмів ПЛР необхідно відмітити таку властивість ДНК, яка є основою ПЛР – це можливість ДНК денатуруватися (при плавленні) та ренатуруватися (при відпалюванні). Тобто при нагріванні дволанцюнові молекули ДНК розплітаються та утворюються 2 окремі ланцюги, а при охолодженні відбувається їх ренатурація – знову з’єднуються 2 ланцюги за принципом комплементарності (Рис. 6.10).
Рис. 6.10. Крива плавлення ДНК бактеріофагу Сд (ДНК бактеріофагу Сд в 0,15М NaCl + 0,015M трицитрат Na (рН 7,0).
При денатурації ДНК in vitro, якщо в суміші присутні олігонуклеотидні мішені (які зазвичай менші за матричну ДНК, тому більш мобільні і скоріше будуть приєднуватися до олДНК) буде відбуватися їх комплементарне з’єднання з матричною ДНК, а ДНК-полімераза миттєво починає синтез (добудову) ланцюга на вільному 3’ кінці.
В 70-роках вчені почали вивчати молекули ДНК за допомогою олігонуклеотидних зондів. Олігонуклеотид – це коротка ділянка нуклеотидів, розташованих в специфічній послідовності. У визначених умовах олігонуклеотид специфічно з’єднується з комплементарною послідовністю нуклеотидів на олДНК. Тому штучно синтезовані радіоактивні олігонуклеотиди можуть слугувати зондами для визначення присутності специфічної послідовності нуклеотидів (радіоізотопний метод). З 1983 року синтез олігонуклеотидів (праймерів) став легким та доступним завдяки автоматичним синтезаторам, які присутні зараз в усіх великих молекулярно-біологічних центрах.
Олігонуклеотидні праймери виконують 2 функції:
З одного боку, вони комплементарні визначеній ділянці ДНК, за іх допомогою можливо знайти специфічну ділянку на молекулі, до якої вони приєднаються за принципом комплементарності, а з другого - вони виступають затравками для початку виконання своїх обов’язків ДНК-полімеразою – добудови ділянки ДНК (що вона успішно робить, використовуючи для цього вільні нуклеотиди).
Зараз найчастіше використовується термостабільна ДНК-полімераза, яка попередньо була виділена з бактерії Thermus aguaticus (Tag). Ця бактерія була виділена з гарячих джерел і витримувала температури до 98С. Полімераза, яку використовували в перших експериментах (фрагмент Кленова ДНК-полімерази І E. coli), легко інактивувалася при нагріванні, тому її потрібно було додавати після кожного циклу (раунду реплікації). Полімераза Tag стабільна і активна при високих температурах, тому можливе її додавання один раз на початку ампліфікації. Ще одна перевага Tag полімерази – більш високий оптимум температурного режиму детермінуємої реакції (добудова відбувається при 70-75С), що значно підвищує специфічність, кількісний вихід та можливу довжину синтезованих копій.
Таким чином, до 1983 року були виведені усі посилання для успішного синтезу великої кількості специфічних ділянок ДНК. Для першого досліду з застосуванням ПЛР Кері Міллісом була вибрана ділянка плазмідної ДНК довжиною 25 нуклеотидів та праймери 11 та 13 нуклеотидів. Цей дослід довів, що ампліфікація ділянки ДНК можлива.
Для проведення ПЛР використовують в надлишку олігонуклеотидні праймери, досліджувану ДНК, при цьому утворюється комплекс, та проводять ампліфікацію in vitro. Оскільки праймери гібридизуються з обома ланцюгами ДНК, то і нативна послідовність і синтезовані ПЛР-продукти можуть виступати матрицями для подальших раундів реплікації, в результаті чого число копій унікальної послідовності експоненційно збільшуються (приблизно за формулою 2n , де n число раундів реплікації, які відбулися). Завдяки цьому послідовності, які присутні в досліджуваному матеріалі в мінімальній кількості (одна чи декілька копій) та не виявляються ніякими іншими методами, легко виявляються за допомогою ПЛР. Якщо говорити образно, ПЛР дозволяє знайти "голку в скирді сіна" – всього одну послідовність ДНК, яка присутня в досліджуваному зразку (Рис. 6.11.).
Рис. 6.11. Експоненційне збільшення ділянок ДНК, які утворюються за допомогою ПЛР.
Експоненційне збільшення числа копій послідовності-мішені не тільки забезпечує високу чутливість методу, але й полегшує її виявлення.
Процес ампліфікації складається з повторюючихся циклів температурної денатурації ДНК, відпалу праймерів з комплементарними послідовностями та послідуючою добудовою полінуклеотидних ланцюгів за допомогою ДНК-полімерази. Праймери орієнтовані таким чином, що синтез за допомогою полімерази вібдувається тільки між ними, подвоюючи кількість копій цієї ділянки ДНК (рис. 6.12).
Рис. 6.12. Процес проведення ПЛР (перші декілька циклів ампліфікації).
Після декількох циклів нарощування праймерів, відділення продуктів полімеризації, зв’язування нових праймерів та їх нарощування, довжина ланцюгів ДНК що експоненційно збільшуються (накопичуються) є фіксованою, тому, що їх кінці будуть чітко визначатися 5’кінцями олігонуклеотидних праймерів. Якщо синтезувати праймери, які зв’язуються з більш відділеними одна від одної ділянками, можливо реплікувати молекули більшої довжини.
Обладнання для ПЛР
Реакції зазвичай проводять у 0,2 чи 0,5 мл мікропробірках Епендорф. Обладнання для нагрівання та охолодження може бути зовсім простим, як наприклад набір водяних бань з різною температурою води, якими користувався Керрі Мюлліс, або складним та включати нагрівальний блок, який керується мікропроцесором (Рис. 6.13). Такий блок використовується для автоматичної ампліфікації. Він називається термоциклер, ампліфікатор, або просто ПЛР - машина. Контролюємий комп’ютером блок, розроблений виключно для ПЛР, сьогодні можна придбати у багатьох молекулярно-біологічних фірм.
Рис.6.13 Ампліфікатор на 48 реакцій.
Компоненти реакції.
Для проведення ПЛР необхідні такі складові частини:
Послідовність ДНК, що досліджується, має бути попередньо підготована для аналізу (повинно бути проведено виділення нуклеїнової кислоти з дослідного матеріалу.)
Буферна система має забезпечити оптимальні умови для проведення реакції.
Буфер для ПЛР, при використанні Tag-полімерази , вміщує 50мМ KCl, 10mM Tris-HCl, pH 8,4, 2,5 mM MgCl2 та 100 мкг/мл желатини. При використання комерційних ферментів цей буфер надається разом з ДНК-полімеразою.
Нейтральні розчини dNTP. Краще всього використовувати ліофілізовані порошки і робити з них водні розчини. Обов’язково робити аліквоти в декількох пробірках для можливості часткового використання, зберігати їх при –20С.
Праймери (штучно синтезовані олігонуклеотиди) для ПЛР частіше мають довжину 18-25 нуклеотидів. Можливий синтез і більш довгих затравок, але вони рідко бувають необхідні. Їх можливо синтезувати за допомогою автоматичних синтезаторів ДНК. Кількості олігонуклеотидів, які отримують таким чином (0,2-1 мкмолів) достатні для проведення декількох сотен або тисяч реакцій.
Підбір праймерів – ключова ланка ПЛР, оскільки ними визначається можливість ампліфікації та виявлення необхідної послідовності. ПЛР-ампліфіковані фрагменти ДНК мають різний розмір. Він визначається сумою розмірів праймерів та відстані між їх 3’ кінцями, в більшості випадків
Їх розмір лежить в діапазоні 200-800 нуклеотидів.
Підбір праймерів - процес емпіричний, але відповідність визначеним вимогам збільшує ймовірність отримання працюючих праймерів.
Існують загальні вимоги підбору праймерів:
Дизайн праймерів може базуватися як на нуклеотидному, так і на амінокислотному сиквенсі (вироджені праймери).
В залежності від мети експерименту потрібно або відбирати консервативні ділянки (для дослідження вірусів однієї групи), або уникати їх (для дослідження різних штамів- наприклад, якщо праймери розроблені для одного штаму з родини лютеовірусів, то вони не повинні "помічати" інші штами цієї групи, забезпечуючи при цьому ампліфікацію усіх ізолятів вивчаємого).
Для підвищення чутливості та специфічності можливо використовувати так звані "гніздові" праймери (Nested -PCR). При цьому в ролі матриці виступає ділянка ДНК, ампліфікована в першому раунді реплікації, а в другій реакції застосовуються праймери, які ампліфікують ділянку меншу за попередню і розташовану всередині попередньої. Однак такий метод непридатний для рутинної діагностики, він використовується тільки з дослідницькими цілями.
Параметри температурних циклів
ПЛР передбачає інкубацію зразків при трьох температурах, які відповідають трьом етапам циклу ампліфікації – денатурації, відпалу, добудові.
Звичайно длДНК денатурують шляхом короткочасного нагрівання зразку до 90-95С,
потім проводять відпалювання, охолоджуючи зразок до 40-60С (в залежності від довжени праймера та вмісту ГЦ пар). Цю температуру можливо оцінити за формулою:
4˚С х (Г+С) +2˚С х (А+Т)-3).
За рахунок великого надлишку затравок в реакційній суміші гібридизація відбувається майже миттєво та не вимагає довгої інкубації при температурі відпалювання.
Далі суміш нагрівають до 70-75˚С для синтезу (добудови) затравок. Оптимальна температура для роботи Tag-полімерази – 72С. Час інкубації при цій температурі залежить від довжини ділянки, що ампліфікується (вважається, що Tag -полімераза синтезує послідовність в 1000 нуклеотидів за 1 хв.)
Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК
Для аналізу продукту, отриманого в ПЛР, використовують різні методи, такі як: гель-електрофорез, дот-блот-гібридизацію та блот-гібридизацію за Саузерном. З їх допомогою можливо аналізувати більшість ПЛР-продуктів, але абсолютно достовірні результати можливо отримати тільки сіквенуванням.
Частіше всього для швидкої візуалізації результатів ПЛР використовують гель-електрофорез в агарозному гелі за загальноприйнятими методиками.
Більшість вірусів рослин, а також віруси тварин є РНК вмісними. Чи можливе вивченя НК таких вірусів та ампліфікація ділянок НК?
Так, можливе, з використанням попередньо отриманої її кДНК копії (за допомогою ферменту зворотньої транскриптази – РНК-залежної-ДНК-полімерази). Але це набагато складніший процес, оскільки РНК менш стабільна, ніж ДНК. Для діагностики та вивчення РНК-вмісних вірусів користуються методом ЗТ-ПЛТ (RT-PCR). Модифікації можуть бути найрізноманітніші - від попереднього синтезу кДНК з подальшим ампліфікуванням в різних пробірках, до RT-PCR в одній пробірці, що значно спрощує дослідження та підвищує їх чутливість.
Виявлення та детекція віроідів ті вірусоїдів відбувається за допомогою ПЛР, оскільки це – єдина реакція, за допомогою якої можливе швидке та специфічне їх визначення.
Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях.
ПЛР в молекулярній діагностиці широко використовується для детекції нуклеїнової кислоти з будь-яких організмів та займає найважливіше місце в інструментарії дослідницьких лабораторій. Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) походить зі звичайної ПЛР, використовуючи її швидкість, чутливість, повторюваність, при цьому зменшуючи ризик зовнішньої контамінації. В теперішній час використовується 5 хімічних речовин для детекції ПЛР- продуктів протягом real-time PCR. Ці речовини : ДНК зв’язуючі флюорофори, 5’ендонуклеази, суміжні лінійні та булавковидні (hairpin oligoprobes) олігопроби, флюоресціюючі амплікони, які вивчені детально.
Моніторинг акумуляції ампліконів в реальному часі став можливим завдяки міченню праймерів, проб або ампліконів з флюорогенними молекулами. Цей підхід має переваги над радіоізотопними олігопробами, які обов’язково включають радіактивне випромінення.
Швидкість Real Time PCR підвищується за рахунок зменшення часу циклів, відміни пост-ПЛР детекції та використання флуоресцентних міток і чутливих методів детекції їхнього випромінення. Редукція в розмірі ампліконів може також впливати на швидкість реакції, але зменшення розміру продукту не є необхідним для поліпшення точності ПЛР .
Недоліки вживання Real Time PCR в порівнянні з конвенційним ПЛР включають нездатність моніторингу розміру амплікону без входу в систему, несумісність деяких матриць (детекруємих ДНК) з деякими хімічними флюорогенами та високу собівартість аналізу.
Контрольні запитання.
Література.
ДОДАТОК 1
Словник використаних термінів
“In situ” гібридизація - гібридизація фрагменту ДНК (проба, зонд), міченого радіактивно або флюоресцентно з препаратом хромосом, які підготовані спеціально для подальшого дослідження під мікроскопом. За допомогою методу вдається визначати місцеположення ділянок, комплементарних пробі.
1 БУО (1 бляшкоутворююча одиниця) – те найбільше розведення вірусу, яке в культурі клітин здатне утворити 1 бляшку.
3’-кінцева послідовність - послідовність на 3’-кінці мРНК, яка не транслюється, наступна за термінуючим кодоном.
Абортивна вірусна інфекція – інфекція, для якої не характерне утворення інфекційних часток, або вони утворюються в значно меншій кількості, ніж при продуктивній вірусній інфекції.
Автономний тип вірусної інфекції – вірусна інфекція, при якій вірусний геном реплікується незалежно від клітинного геному.
Ад’юванти - (найчастіше ад’юванти Фрейнда) – група комплексних сумішей, які містять мінеральні олії (неповні ад’юванти) та завис клітин інактивованих мікроорганізмів (повні ад’юванти). Використовуються з метою тривалої іммобілізації вірусвмісного матеріалу у місці введення для вироблення у тварини стійкішого та специфічнішого імунітету.
Ампліфікація - утворення додаткових копій хромосомних послідовностей, що виявляються в хромосомній або позахромосомній ДНК.
Анамнез - відомості про попередній стан хворого.
Антикоагулянти – група речовин, які перешкоджають зсіданню крові.
Антисептика – хімічне та біологічне знешкодження мікроорганізмів та вірусів для запобігання ураженню.
Антисироватка – сироватка, виділена з крові імунізованої тварини, яка містить специфічні антитіла до певного вірусу (антигену).
Асептика – сукупність профілактичних заходів, спрямованих на створення безмікробних умов для запобігання ураженню.
Бактеріофаги – група вірусів здатних розмножуватись тільки в бактеріальних клітинах.
Біологічної нейтралізації реакція – встановлення інактивуючої дії сироватки на вірус, шляхом введення суміші лабораторній тварині.
Блотинг ДНК по Саузерну - процедура переносу денатурованої ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозний фільтр для гібридизації з комплементарними нуклеотидами. (Синонім – саузерн-блотинг).
Бляшка - результат руйнування клітин в місці взаємодії вірусної частинки (в тому числі бактеріофагу) з моношаром клітинної культури.
Вакцина – препарат, який містить інактивований вірус або його компоненти. Вакцини вводять в організми людей та тварин (тобто, проводять вакцинацію або імунізацію) для вироблення у них імунітету (нечутливості) до відповідного вірусу.
Гібридизація - процес утворення гетеродуплексів; інколи мають на увазі утворення комплементарних комплексів між ДНК та РНК.
Гнотобіоти - макроорганізми, які не містять життєздатних мікроорганізмів (вірусів) одного або декількох видів, відомих досліднику.
Гнотофори - це макроорганізми, які є носіями тільки одного виду життєздатних мікроорганізмів (моногнотофори в дибіотичній системі), двох (дігнотофори в трибіотичній системі) або декількох (полігнотофори в полібіотичній системі).
Гостра вірусна інфекція – така форма інфекції, за якої після утворення вірусного постомства клітина або гине абовидужує і не містить вірусних компонентів.
Декапітація – відрізання тварині голови.
Денатурація нуклеїнової кислоти - руйнування дволанцюгових молекул ДНК з утворенням двох комплементарних одноланцюгових полінуклеотидів.
Денатураці я- втрата нативної структури біомолекул.
Депіляція (епіляція) - видалення волосся зі шкіри тварини, коли це необхідно за умовами експерименту.
Диплоїдні клітинні лінії – клітинні лінії, в яких, у крайньому випадку, 75% клітин мають каріотип нормальних клітин вихідного типу; трансплантовані хом’ячкам не проявляють онкогенної активності.
ДНК-полімераза - фермент, що каталізує утворення дволанцюгової ДНК на основі одноланцюгової шляхом синтезу комплементарного ланцюга. Вихідний ланцюг має назву матричного.
Евтаназія - це гуманне безболісне умертвіння тварин, що вийшли з експерименту.
Емболія повітряна – один із поширених способів емболії дрібних лабораторних тварин. Полягає у введенні тварині у кровоносні судини повітря, що спричинює закупорку судин у місцях їх галуження і робить неможливим подальший рух крові судинами. В результаті це призводить до загибелі тварини протягом 1-5 хв, залежно від її розміру та об’єму введеного повітря.
Затравка - коротка послідовність (часто це РНК), що комплементарно взаємодіє з одним із ланцюгів ДНК; утворює вільний 3-ОН-кінець, використовуючи який ДНК-полімераза починає синтез ДНК-ланцюга.
Зв’язування комплементу реакція – встановлення взаємодії антигену з антитілом в присутності комплементу.
Зворотня транскрипція - синтез ДНК на матриці РНК; здійснюється ферментом зворотньою транскриптазою. (Синонім - РНК-залежна ДНК-полімераза, ревертаза).
Ідентифікація вірусу – встановлення таксономічного положення вірусу.
Ізоелектрична точка - це рН розчину, при якому рівноважуються позитивні та негативні заряди поверхні віріонів і вони випадають в осад.
Імунізація лабораторних тварин - введення вірусвмісного матеріалу тварині (обов’язково за певною схемою з урахуванням методу та часу введення) з метою отримання специфічної антисироватки до відповідного вірусу.
Імунність рослин - рослини не уражуються вірусом (синонім – стійкість)
Індикація вірусу – визначення наявності чи відсутності вірусу у досліджуваному матеріалі.
Інокулят – інфекційний вірусвмісний матеріал, який застосовується для ураження (інокуляції).
Інтеграційний тип вірусної інфекції – вірусна інфекція, при якій вірусний геном частково або повністю інтегрується з клітинним геномом та реплікується разом з ним.
Інфекційний титр - така мінімальна концентрація вірусу, яка ще здатна викликати позитивну реакцію (інфекційну, гемаглютинуючу, серологічну тощо) у 50% тест-об’єктів.
Канібалізм – поїдання тваринами особин свого виду, прояв внутрішньовидової конкуренції.
Карантин – сукупність адміністративних та медико-санітарних заходів, спрямованих на перешкоджання поширенню інфекційних хвороб людини, в тому числі вірусних. У вірусологічній практиці полягає в ізоляції тварин з невідомим епідеміологічним минулим або з ознаками захворювання на термін, який у два рази перевищує інкубаційний термін відповідної хвороби.
Карликовість та пригнічення росту – розмір рослини зменшуються внаслідок вкорочення міжвузлів, зменшення листків, плодів та інших частин рослини.
кДНК - одноланцюгова ДНК, синтезована in vitro шляхом зворотньої транскрипції; комплементарна РНК.
Кільцева плямистість – поява хлоротичних або некротичних круглих плям на листках, а іноді на плодах та пагонах.
Комплемент – компонент сироватки крові, який приймає участь в імунній відповіді.
Контамінація – забруднення.
Лізис – розпад клітини, викликаний руйнуванням її оболонки.
Літична інфекція – інфекція, в результаті якої відбувається лізис клітині.
Матриця - ДНК або РНК, які використовуються полімеризуючим ферментом (ДНК- або РНК- полімерази) для синтезу комплементарного ланцюга.
Модельні об’єкти (експериментальні або тест-об’єкти) - макроорганізми або культури клітин (в тому числі, мікроорганізмів), чиї властивості є достеменно відомими і постійними для представників одного виду (у випадку культури клітин – штаму, популяції або лінії). Відомі властивості модельного об’єкту дозволяють їх використовувати для детекції або дослідження особливостей патогенів невідомої природи.
Мозаїка – характеризується чергуванням зон із зеленим та світло-зеленим, жовтим забарвленням, що може зустрічатись як на листках, так і плодах.
Надчутливість рослин – рослини уражуються з утворенням місцевих некрозів, які з”являються внаслідок відмирання клітин біля точки зараження
Некроз – загибель клітин – гіперчутлива відповідь.
Олігонуклеотид - декілька нуклеозидів, з”єднаних фосфодіефірними зв”язками, короткий фрагмент полінуклеотидного ланцюгу, одержаний після розщеплення ферментами або хімічними реагентами. Олігонуклеотиди отримують також шляхом хімічного синтезу.
Оператор – ділянка ДНК, що впізнається специфічними білками-репресорами та негативно регулює транскрипцію структурних генів.
Пасаж - зараження чутливої тварини с метою отримання від неї нової популяції вірусу. Проводиться з метою підтримання інфекційності вірусу.
Пасаж сліпий – явище нездатності вірусу викликати видимі симптоми захворювання після перенесення його з типового господаря до іншого протягом першого пасажу.
Патогенез – зміни клітин, органів, тканин організму під впливом інфекції.
Первинна культура клітин – культура, яка походить від клітин та органів, взятих безпосередньо з організму. Культури називають первинними до початку пасування чи субкультивування.
Переживаючі клітинні культури - органні культури; проліферація яких в умовах in vitro досить обмежена або відсутня.
Підтримуючи поживні середовища - середовища, що забезпечують життєдіяльність клітин, але не їх розмноження.
Плавлення ДНК - втрата двоспіральної структури ДНК під дією температури.
Помірні бактеріофаги – бактеріофаги здатні лізогенізувати клітину та у вигляді профагу знаходитись в середині бактеріальної хромосоми або в стані плазміди.
Постійна (безперервна, перещеплювана) клітинна лінія – клітини одного типу, що здатні субкультивуватися поза організмом протягом необмеженого числа пасажів.
Праймер - оліго- або полінуклеотид, 3кінцева ланка якого використовується ДНК- полімеразою як затравка для приєднання наступної ланки при синтезі ДНК.
Праймери - штучно синтезовані олігонуклеотиди.
Прижиттєвий патологічний матеріал – патологічний матеріал, одержаний від живої тварини (протягом експерименту).
Продуктивна вірусна інфекція – інфекція, що завершується утворенням інфекційного потомства.
Промотор – послідовність нуклеотидів ДНК, що розпізнається РНК-полімеразою як ділянка , з якої починається транскрипція.
Профаг – внутрішньоклітинний стан фага в умовах, при яких його літичні функції пригнічуються.
Репресор – білок або антисмислова РНК, що пригнічують активність генів.
Рослини-індикатори – це рослини, які дають чітку специфічну реакцію на даний вірус, що легко відрізняється від реакції цієї рослини на інший вірус.
Ростові поживні середовища – середовища, що забезпечують існування та розмноження клітин, і містять 2-10 % сироватки корві.
Ростучі клітинні культури – культури клітин, здатні розмножуватися в умовах in vitro.
Секційний патологічний матеріал - патологічний матеріал, одержаний після розтину лабораторної тварини.
Системне ураження рослин – вірус транспортується по всіх тканинах рослини і репродукуються з чітким проявом симптомів захворювання
Сіквенс - визначення послідовностей амінокислот (сіквенс білку) або нуклеотидів (сіквенс НК).
Стерильні тварини - макроорганізми, які не мають ніяких життєздатних мікроорганізмів, які можна виявити.
Титр вірусу – кількість вірусу, яке міститься в одиниці об”єму матеріалу.
Толерантність рослин – вірус транспортується по тканинам рослини, але симптоми захворювання слабо виражені або не виражені зовсім (замасковані)
Транфекція – введення в бактеріальні клітини ізольованих молекул фагової ДНК, що приводить до утворення зрілого фагового потомства.
Тропізм - здатність вірусу реплікуватися в певних типах клітин організму. Віруси, що репродукуються у нервових клітинах, називають нейротропними, у клітинах шкіри – дерматропними, в клітинах легень та дихальних шляхів – пневмотропними, в клітинах шлунково-кишкового тракту – ентеротропними. Віруси, які здатні реплікуватися в декількох типах клітин, називають політропними, а в усіх типах клітин – пантропними (класифікація вірусів людини та тварин за Хюбнером).
Хлороз – пожовтіння зелених тканин внаслідок деградації хлорофілу.
Хронічна вірусна інфекція – така форма вірусноїй інфекції, при якій клітини продовжують продукувати вірусні частки або їх компоненти протягом тривалого часу і передають цю здатність спадково.
ЦПД (цитопатична дія) – руйнування структури клітин під впливом вірусів.
ЦПД50 - доза вірусу, яка викликає появу цитопатичного ефекту в 50 % заражених клітин у культурі.
Штам клітин – популяція однорідних клітин (за одним чи декількома маркерами), які зберігають специфічні властивості протягом обмеженого періоду культивування.
Додаток2
Родини та роди вірусів, які уражують хребетних
Родини та роди вірусів, які уражують безхребетних
Родини та роди вірусів, які уражують рослини
Родини та роди вірусів, які уражують водорості, гриби, дріжджі та протозоа
Родини та роди вірусів, які уражують бактерії
ДОДАТОК 3
Робочі середовища та розчини
Середовище Лурія-Бертані
Триптон 10г
Дріжджовий екстракт 5г
NaCl 10г
H2O 1л
Триптон 10г
Дріжджовий екстракт 5г
NaCl 10г
Агар 7г
H2O 1л
Триптон 10г
Дріжджовий екстракт 5г
NaCl 10г
Агар 15г
H2O 1л
Фосфатний буфер (PBS) 0,1М, рН 7,4
KH2PO4 0,2г
Na2HPO4 x 12H2O 2,8г
KCl 0,2г
Об”єм розчину доводять до 1л дистильованою водою
Розчин А
0,1М розчин лимонної кислоти (М.м. 192,1) 19,21 г/л
(якщо використовують моногідрат лимонної кислоти (М.м 210,14), то 21,01 г/л)
Розчин В
0,1М розчин дигідрат тринатрієвої солі (М.м. 294,12) 29,41г/л
Змішати розчини А та В у співвідношенні згідно таблиці та довести дистильованою водою до 100мл.
|
рН |
3,0 |
3,4 |
3,8 |
4,2 |
4,6 |
5,0 |
5,4 |
5,8 |
6,2 |
|
Розчин А, мл |
46,5 |
40,0 |
35,0 |
31,5 |
25,5 |
20,5 |
16,0 |
11,8 |
7,2 |
|
Розчин В, мл |
3,5 |
10,0 |
15,0 |
18,5 |
24,5 |
29,5 |
34,0 |
38,2 |
42,8 |
Концентравана оцтова кислота 5,8 мл
Н2О довести до 1000 мл
Розчин В
0,1М ацетат натрія
тригідрат ацетата нарія (М.м 136,09) 13,6 г/л
Змішати розчини А та В у співвідношенні та довести дистильованою водою до 100мл.
|
рН |
3,6 |
4,0 |
4,4 |
4,8 |
5,0 |
5,2 |
5,6 |
|
Розчин А, мл |
46,3 |
41,0 |
30,5 |
20,0 |
14,8 |
10,5 |
4,8 |
|
Розчин В, мл |
3,7 |
9,0 |
19,5 |
30,0 |
35,2 |
39,5 |
45,2 |
Гліцин-HCl буфер, 0,1М, рН 2,2-3,6
0,1М гліцин (М.м 75) 7,5 г/л
0,1М HCl
Для приготування розчину змішати 50 мл 0,1М гліцину і згідно таблиці певну кількість 0,1М HCl в залежності від бажаної рН та довести об”єм до 100 дистильованою водою
|
рН |
2,2 |
2,4 |
2,6 |
2,8 |
3,0 |
3,2 |
3,4 |
3,6 |
|
0,1М HCl, мл |
44 |
32,4 |
24,2 |
16,8 |
11,4 |
8,2 |
6,4 |
5,0 |
0,015М Na2CO3 1,59г
0,035М NaHCO3 2,93г
H2O до 1л
Тріс-HCl буфер, 0,05 М, рН 8,0
Тріс – 6,057 г розчиняють в дистильованій воді і доводять рН розчину до 8,0, додаючи 5М HCl. Доводять об”єм розчину до 1 л дистильованою водою.
(NH4)2SO4 190г
Н2О до 250мл
Сольовий розчин Ерла
NaCl 6,8г
KCl 0,4г
CaCl2 x 6H2O 0,39г
MgSO4 x 7H2O 0,1г
Na2HPO4 x 12H2O 0,125г
Глюкоза 1,0г
Феноловий червоний 0,4%-ний 5,0мл
Стерилізують в автоклаві 15 хвилин при 1300 С, величину рН регулюють додаванням NaHCO3 перед використанням розчину
Середовище з гідролізатом на розчині Хенкса
Середовище складається з сольового розчину Хенкса, до якого додають гідролізат лактальбуміну або казеїну.
Сольовий розчин Хенкса:
NaCl 8,0г
KCl 0,4г
CaCl2 x 6H2O 0,276г
MgSO4 x 7H2O 0,2г
КН2РО4 0,06г
Na2HPO4 x 12H2O 0,153г
Глюкоза 1,0г
Феноловий червоний 0,012г
H2O 1л
До сольового розчину додають 5г гідролізату лактальбуміну або казеїну, а потім фільтрують через потрійний складчатий фільтр і стерилізують протягом 15 хвилин в автоклаві при 115 0С.
Середовище Ігла
А) Амінокислоти, мг/л:
L – аргінін-HCl - 17,5
L -цистин- 12,0
L – гістидин-HCl - 8,0
L – ізолейцин 26,0
L -лейцин - 26,0
L – лізин-HCl – 29,0
L - метионін – 8,0
L - фенілаланін – 17.0
L - треонін - 24,0
L - триптафан - 4,0
L - тирозин - 18,0
L - валін - 23,0
Спочатку в 100 мл води з додаванням кількох краплин концентрованої соляної кислоти розчиняють L –цистин та L – тирозин, а потім додають інші амінокислоти
В) Вітаміни, мг/л:
біотин 1,0
холін 1,0
холін-хлориду 1,0
фолієва кислота 1,0
пантотенат кальція 1,8
пірідоксин 1,0
пірідоксаль 1,0
тіамін 1,0
нікотінамід 1,0
нікотінова кислота 1,0
рибофлавін 0,4
Біотин, фолієву кислоту і холінхлорид розчиняють в 50 мл води при додаванні 0,1мл 0,1М NaOH. В інших 50 мл води розчиняють решту речовин. Потім два розчини зливають.
NaCl 6,8
KCl 0,4
CaCl2 x 6H2O 0,1
MgSO4 x 7H2O 0,1
КН2РО4 0,4
Na2HPO4 x 12H2O 0,4
MgCl2 x 6H2O 0,05
Fe(NO3)3 0,001
Глюкоза 1,0
Феноловий червоний 0,005
L-глютамін 0,15
Солі розчиняють в заданій послідовності в 700мл дистильованої води.
Розчини А, В, С змішують і доводять водою до 1000мл і піддають стерильній фільтрації