Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Важнейшим элементом приготовления питательных сред является соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН, обеспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.
Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с последовательно расположенными фильтрующими элементами. Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в отключенный фильтр через заданные промежутки времени. Жидкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых практический интерес представляют термический, радиационный, фильтрационный и отчасти химический.
Термический - самый распространенный, при температурах порядка 120-150оС.
Радиационный - g-излучение, применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации мощных источников этого излучения.
В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты (вещества с ярко выраженным асептическим действием). Основная проблема в этом случае - необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в молочную кислоту.
Мало распространен и метод фильтрации, что объясняется аппаратными трудностями. Метод основан на способности полупроницаемых мембран с крупными порами пропускать жидкую фазу и концентрировать клетки микроорганизмов. В принципе этот метод является идеальным для стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых средств, поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность - наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную стерилизацию их самих. В настоящее время эта проблема решается путем применения термостойких полимеров в производстве мембран.
В заключение заметим, что ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием; сюда относят метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота и др. В этом случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.
Стерилизация питательных сред
Используемые в промышленности среды (как правило, жидкие, комплексные, реже синтетические) стерилизуются тепловым методом (насыщенным паром).
Устойчивость микроорганизмов к тепловому воздействию определяется многими факторами, в частности видовой принадлежностью микроорганизма. Учитывается, что споры гораздо устойчивее к нагреванию, чем вегетативные клетки. На эффективность тепловой стерилизации влияет количество клеток в среде: чем их меньше, тем легче достигается стерилизующий эффект. Из этого следует, что перед стерилизацией необходимо понижать количество микробных клеток в среде.
Определяющее значение при тепловой стерилизации имеют температура и время ее поддержания. Чем выше температура, тем быстрее достигается стерилизующий эффект. Для оценки эффективности процесса стерилизации используют физические (по температуре и давлению пара), химические (по температуре плавления или изменению цвета), микробиологические (с высевом на стандартные среды), биоиндикаторные (с использованием Bacillus stearothermophilus) методы.
При тепловой стерилизации помимо гибели контаминирующих микроорганизмов MOtyr разрушаться термолабильные вещества среды: витамины, ферменты, некоторые аминокислоты. С этим явлением, ухудшающим качество питательных сред, борются, повышая температуру и уменьшая время стерилизации.
Тепловая стерилизация жидкостей выполняется двумя способами: периодическим и непрерывным. При периодическом способе стерилизация происходит в самом ферментере. Одновременно нагревается весь объем жидкости (среды) до температуры стерилизации, которая выдерживается определенное время, после чего понижается до заданной. Этот способ прост и применяется в случае небольших аппаратов. Его недостатки: значительный градиент температуры по объему и «недостерилизация» в тупиках. При непрерывном способе (более прогрессивном и производительном) стерилизация осуществляется в специальных установках.
В результате температуру можно увеличить до 130— 150 °С; при этом время стерилизации уменьшается до 3—10 мин, что положительно сказывается на качестве среды.
Недостатком в данном случае является увеличение протяженности трубопроводов, что повышает вероятность вторичной контаминации.
Существуют два основных способа стерилизации питательных сред – автоклавирование и фильтрование. В первом случае приготовленный раствор разливают в предварительно простерилизованную в сушильному шкафу посуду для культивирования, а затем стерилизуют в автоклаве при давлении 0,75–0,9 атм (температура 110-115°С) в течение 20-25 мин. Можно сначала методом автоклавирования простерилизовать большое количество среды в одном объеме, а затем в ламинарном боксе разлить ее в стерильную посуду для культивирования. Однако, на наш взгляд, последний вариант более трудоемок. Кроме того, при таком способе разлива среды увеличивается вероятность ее инфицирования. Подобная последовательность действий более приемлема при небольшом количестве среды.
Во втором случае используют стерильные фильтры Зейтца, Беркефельда, свечи Шамберлана, мембранные фильтры, незаменимые для приготовления сред с термолабильными компонентами (некоторые стимуляторы роста, витамины, антибиотики, аминокислоты, растительные экстракты), которые разрушаются при авто- клавировании. Фильтрация сред (холодная стерилизация) применяется также для приготовления смесей ферментов и выделения изолированных протопластов, сред с биологически активными компонентами, жидких сред.
Питательные среды, содержащие органические добавки, такие, как кокосовое молоко, картофельный отвар и пр., дезинфицируют путем фильтрования, используя специальные фильтры из диатомовой земли, плавленого стекла или сложных эфиров целлюлозы.
Однако полной стерилизации можно достичь лишь в процессе тиндализации, которую обычно проводят в аппарате Коха. Суть методики состоит в 2-3-кратном нагревании посуды водным паром до температуры 90-100°С с 24-часовыми интервалами. Первое нагревание приводит к уничтожению вегетативных форм, а последующие – к гибели микроорганизмов, которые образовались при температуре 25°С из склероция в перерывах между нагревами.
Тиндализацию также используют для стерилизации питательных сред, содержащих соединения, которые разрушаются при высоких температурах (например, гиббереллины инактивируются при температуре выше 90°С). То же относится и к сахарам, которые карамелизируются при высоких температурах.
Время термической дезинфекции зависит от объема посуды, в которую разлита питательная среда. Пробирки со средой стерилизуют 15 мин при температуре 115°С. Колбы, содержащие 100-500 мл питательной среды, дезинфицируют 30 мин при температуре 121°С и 45 мин при температуре 115°С. Колбы, в которых находится от 500 до 5000 мл питательной среды, стерилизуют в автоклаве в течение 35-40 мин при температуре 121°С и 50 мин при температуре 115°С.