Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
1 Определение понятий «капсид», «капсомер», «суперкапсид»
Капсид – компонент вирусной частицы (вириона), белковая оболочка защищающая вирусную нуклеиновую кислоту ДНК или РНК. Капсид имеет строго упорядоченную структуру.
Капсомер – субъединица состоящая из идентичных полипептидных цепей (участок из нескольких белков) которые обеспечивают построение капсида.
Суперкапсид - внешняя оболочка сложных вирусов. Располагается поверх капсида. Состоит из мембранного белка, одного-двух слоев липидов и выростов, состоящих из липо-или гликопротеидов, выполняющих рецепторную функцию. Выполняет защитные функции у вириона, определяет многие характеристики вируса (антигенные свойства, чувствительность к повреждающим факторам и др.).
2 Природа и происхождение вирусов
1 теория ретрогредной эволюции согласно данной теории произошло упрощение организации микроорганизмов вследствие утраты каких либо структур.
2 Вирусы могли быть предшественниками клеточных структур
3 Теория взбесившихся генов. Согласно этой теории вирусы являются производными клеточных нуклеиновых кислот.
3 Кардинальные свойства вирусов
1 Имеют один тип нуклеиновых кислот ДНК или РНК
2 Вирусы - доклеточные организмы, частицей вируса является вирион
3 Отсутствуют автономный обмен веществ
4 Являются облигатными паразитами
5 Обладают специфическим дизъюнктивным или разобщённым способом размножения, бинарного деления нет.
4 Классификация и номенклатура вирусов
Вирусы объединяют в царство Vira, которое подразделено на два подцарства – рибовирусы и дезоксирибовирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока ещё нечётко сформулировано, так же как и обозначение разных видов. В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придаётся типу нуклеиновой кислоты и её молекулярно-биологическим признакам: однонитевая, двунитевая, сегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями. Также при классификации используются данные полученные в результате электронно микроскопических и иммунологических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая организация и т.д.
В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств. Принадлежность вирусов к определённому семейству определяется типом нуклеиновой кислоты, её структурой, а также наличием или отсутствием внешней оболочки.
Пример классификации вирусов: Семейство : poxviride,Подсемейство: poxvirine род:poxvirus
5 Проявление тропизма вирусов.
Тропизм – свойство вирусов действоать на клетки и ткани определённого типа.
По тропизму вирусы делят на:
1 Вирусы животных (например вирус собачьей чумы)
2 Вирусы растений
3 Вирусы бактерий (бактериофаги)
Классификация по тропизму к различным тканям:
1 Пневмотропные – поражающие верхние дыхательные пути
2 Нейротропные преимущественно поражающие ЦНС (энцефалит)
3 Дерматотропные вызывают поражение кожи (оспа ветрянка)
4 Пантропные вирусы которые поражают все или почти все органы и ткани ( натуральная оспа) Вирус герпеса к примеру поражает печень, лёгкие, желудок (язва желудка)
6 морфология и размеры вирионов
Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15-18 до 300-400 нм. Они имеют разнообразную форму: палочковидную, нитевидную, сферическую форму параллелепипеда, сперматозоидную (рис. 5.1). Структура простого вириона - нуклеокапсида - свидетельствует о том, что вирусная нуклеиновая кислота - ДНК или РНК - надежно защищена белковой оболочкой - капсидом. Последний имеет строго упорядоченную структуру, в основе которой лежат принципы спиральной или кубической симметрии. Капсиды палочковидных и нитевидных вирионов состоят из структурных субъединиц, уложенных в виде спирали вокруг оси. При таком расположении субъединиц образуется полый канал, внутри которого компактно уложена молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Ее длина может во много раз превышать длину палочковидного вириона. Например, длина вируса табачной мозаики (ВТМ) 300 нм, а его РНК достигает величины 4000 нм, или 4 мкм. При этом РНК настолько связана с капсидом, что ее нельзя освободить, не повредив последний. Подобные капсиды встречаются у некоторых бактериальных вирусов и у вирусов человека (например, вируса гриппа).
Сферическая структура вирионов определяется капсидом, построенном по принципам кубической симметрии, в основе которой лежит фигура икосаэдра - двадцатигранника. Капсид состоит из асимметричных субъединиц (полипептидных молекул), которые объединены в морфологические субъединицы - капсомеры. Один капсомер содержит 2, 3 или 5 субъединиц, расположенных по соответствующим осям симметрии икосаэдра. В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20 или 12. На рис. 5.1 представлены возможные типы простых вирионов, состоящих из определенного количества капсомеров, изображенных в виде шариков, а также капсомеров увеличивающегося объема. Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 структурных субъединиц, содержат группы из 5 субъединиц - пен-тамеры, или из 6 субъединиц - гексамеры. Нуклеокапсид сложноорганизованных вирионов, называемый «сердцевиной», покрыт внешней оболочкой - суперкапсидом.
7 Ультраструктура вирионов простые и сложно организованные вирусы
Химический состав вирионов
В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кислоты - РНК или ДНК - и белки. У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, первые получают из клеток хозяина, вторые в виде гликопротеидов закодированы в геноме вируса.
Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК разных вирусов колеблется в широких пределах (1 * 106- 1 * 108). Она примерно в 10-100 раз меньше молекулярной массы ДНК бактерий. В геноме вирусов содержится до нескольких сотен генов. По своей структуре вирусные ДНК характеризуются рядом особенностей, что дает возможность подразделить их на несколько типов. К ним относятся двунитевые и однонитевые ДНК, которые могут иметь линейную или кольцевую форму.
Хотя в каждой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, на ее концах имеются прямые или инвертированные (повернутые на 180°) повторы. Они представлены теми же нуклеотидами, которые располагаются в начальном участке ДНК. Нуклеотидные повторы, присущие как однонитевым, так и двунитевым вирусным ДНК, являются своеобразными маркерами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транскрибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном.
Вирусная РНК. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой. Наряду с типичной однони-тевой РНК у ряда вирусов имеется двунитевая РНК. При этом она может быть линейной и кольцевой. В составе однонитевых РНК имеются спиральные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вследствие спаривания комплементарных азотистых оснований. Однонитевые РНК в зависимости от выполняемых ими функций разделяют на две группы
К первой относят РНК, обладающие собностью транслировать закодированную в ней информацию на рибосомы клетки хозяина, т.е. выполнять функцию иРНК. Ее называют плюс-нить и обозначают знаком «+» (позитивный геном). Ко второй группе относят вирусные одноцепочечные РНК, которые не могут функционировать как иРНК, а так же как ДНК служат лишь матрицей для ее образования. Такие РНК называют минус-нить, обозначают знаком «-» (негативный геном). РНК плюс-нитевых вирусов в отличие от минус-нитевых имеют характерные модифицированные концы в виде «шапочки», которые необходимы для специфического узнавания рибосом. Вирусные РНК состоят из нескольких фрагментов (например, РНК вируса гриппа) или представлены нефраг-ментированной молекулой (РНК парамиксовирусов).
У двунитевых как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана в одной цепи. Однако существуют вирусы, у которых информация может быть частично закодирована и во второй цепи. Таким образом, достигается экономия генетического материала. В то же время это указывает на то, что проведение оценки количества генетической информации по молекулярной массе ДНК или РНК может оказаться недостоверной.
Вирусные белки, так же как и белки клеточных организмов, подразделяют на структурные и функциональные. Первые входят главным образом в состав вирусного капсида, вторые представляют собой ферменты, участвующие в процессе репродукции вирусов. Структурные белки у простых вирионов, лишенных суперкапсида, представлены капсидными белками, которые образуют футляр, защищающий нуклеиновую кислоту. Кроме того, в их состав входят белки, несущие «адресную» функцию, заключающуюся в узнавании специфических рецепторов клеток хозяина. Они могут участвовать также в адсорбции вирусов на этих клетках и проникновении в них. У сложных вирионов, имеющих внешнюю оболочку, капсидные белки также выполняют защитную функцию. Однако они не принимают прямого участия в адсорбции вируса и проникновении к клетку хозяина. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных РНК или ДНК. Кроме того, в составе вирионов имеются так называемые «внутренние» гистоноподобные белки, связанные с вирусной нуклеиновой кислотой. Они образуют рибо- или дезоксири-бонуклеопротеиды, которые обладают определенными антигенными свойствами.
Существенной особенностью капсидных белков является строго упорядоченная структура, обеспечивающая построение капсида из субъединиц-капсомеров, состоящих из идентичных полипептидных цепей способных к самосборке. Таким образом достигается экономия генетического материала вируса. В противном случае, для синтеза разных капсидных белков потребовалась бы информация, закодированная в гораздо большем количестве генов.
Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. У многих вирионов они распространяются в виде шиловидных отростков на поверхности суперкапсида. Гликопротеидные шипы обладают антигенными свойствами. Многие из них ответственны за адсорбцию на специфических рецепторах клетки и принимают участие в слиянии с клеточной мембраной, обеспечивая тем самым проникновение вири-она в клетку хозяина. Наряду с упомянутыми соединениями в составе суперкапсида имеются гликолипиды. Липидный и углеводный состав вириона определяется клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками. Липиды стабилизируют структуру сложных вирионов.
8 Значение вирусов
1 Вирусы являются возбудителями инфекционных заболеваний человека (грипп, корь, ветряная оспа, свинка), животных (например собачья чума, птичья оспа), растений.
2 Вирусы являются участниками мутационного процесса
3 Вирусы используются в генной инженерии в качестве в качестве вектора для переноса участка ДНК, что используется при создании вакцин нового поколения (например вакцина против брюшного тифа).
4 Вирусы бактерий (бактериофаги) применяются в диагностике и профилактике для лечения бактериальных инфекций.
9 Структурные вирусные белки их локализация и значение.
Вирусные белки так же как и белки клеточных организмов подразделяют на структурные и функциональные. Структурные белки входят главным образом в состав вирусного капсида. Структурные белки у простых вирионов, лишённых суперкапсида представлены капсидными белками которые образуют футляр защищающий нуклеиновую кислоту. Кроме того в их состав входят белки несущие «адресную» функцию, заключающуюся в узнавании специфических рецепторов клетки хозяина. Они могут могут участвовать также в адсорбции вирусов на этих клетках и проникновение в них. У сложных вирионов имеющих внешнюю оболочку, капсидные белки выполняют защитную функцию. Однако они не принимают прямого участия в адсорбции вируса и проникновения в клетку хозяина. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных РНК и ДНК. Существенной особенностью капсидных белков является строго упорядоченная структура обеспечивающая построение капсида из субъединиц КАПСОМЕРОВ, состоящих из идентичных полипептидных цепей способных к самосборке. Таким образом достигается экономия генетического материала вируса. Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков которые входят в состав гликопротеинов и гликолипидов. У многих вирионов они распространяются в виде шиповидных отростков на поверхности суперкапсида. Гликопротеидные шипы обладают антигенными свойствами, ответственны за адсорбцию на специфических рецепторах клетки и принимают участие в слиянии с клеточной мембраной обеспечивая тем самым проникновение вириона в клетку хозяина.
10 Неструктурные вирусные белки их значение.
Функциональные белки представляют собой ферменты, участвующие в процессе репродукции вирусов. Вирусы содержат в составе капсидов одну или две группы ферментов. К первой относятся белки репликации и транскрипции, ко второй ферменты участвующие в проникновении вирусной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе образовавшихся вирионов (нейраминидаза, лизоцим, АТФ аза). Ферменты вирусов подразделяют на вирионные и вирусиндуцированные. К первым относят ферменты транскрипции и репликации (ДНК и РНК полимеразы), обнаруженные у многих вирусов, АТФ-аза, экзо и эндонуклеазы.
Вирусиндуцированными считаются те ферменты структура которых закодирована в винрусном геноме. Прежде всего это относится к ДНК и РНК полимеразам.
11 Компоненты вирионов в составе клетки хозяина
Можно выделить следующие компоненты: 1 Геном вируса, (нуклеиновая кислота которая после освобождения от оболочки высвобождается и встраивается в геном клетки хозяина), 2 вирусные ферменты (ДНК полимеразы, РНК полимеразы), 3 Вирусные белки которые синтезируются клеткой хозяином.
12. Дисъюнктивный тип размножения его особенности.
При данном типе размножения вирион, попав в клетку хозяина перестает обнаруживаться, нуклеиновая кислота освобождается от оболочки (капсида суперкапсида). Начинается синтез компонентов вириона, т.е его репродукция. Она носит ДИЗЪЮНКТИВНЫЙ характер поскольку компоненты вириона синтезируются в разных частях клетки: белки на рибосомах, нуклеиновые кислоты в ядре или цитоплазме. Вирус использует для этого генетический аппарат клетки, подавляя необходимые ей самой синтетические реакции. Затем после синтеза необходимых компонентов происходит сборка вириона (а точнее нескольких вирионов). Из разных структур клетки происходит транспортировка частей вириона в одно место сборки. При этом вирусные белки и нуклеиновые кислоты имеют свойство узнавать, самопроизвольно соединяться друг с другом. Многие простые вирионы имеют собираются на репликативных комплексах – мембранах ЭПР. У сложных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на репликативных комплексах и продолжается на плазматической мембране клетки хозяина, с наружной стороны которой располагаются суперкапсидные гликопротеиды. Затем гликопротеидные и примыкающие к ним с другой стороны нуклеокапсидные участки образуют выпячивание на поверхности клетки виде почки. После отделения почки содержащий нуклеокапсид и суперкапсидные белки образуются свободные вирионы.
13 Взаимодействие вируса с клеткой. Продуктивный и непродуктивный типы инфекций.
13)Взаимодействие вируса с клеткой хозяина
Взаимодействие вируса с клеткой хозяина - это сложный «ногоступенчатый процесс, который начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжается после их проникновения внутрь клетки. В результате такого взаимодействия мовивается либо продуктивная, либо абортивная, либо интегративная форма клеточной инфекции. При продуктивной форме происходит размножение, точнее, репродукция (лат. reproduce - воспроизводить) вируса, при абортивной - ее нарушение на одном из этапов, при интегративной - интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном.
14 Характеристика продуктивного типа инфекции
Продуктивный тип: Вирус проникает в клетку и даёт в клетке потомство. Это может быть острая вирусная инфекция (Образуется сразу тысячи новых вирионов. Клетка погибает. Происходит аутоинтаксикация) и хроническая вирусная инфекция( В клетке образуются единицы вирусных вибрионов. Клетка разрушается постепенно в течении времени)
Непродуктивный тип: Нет вирусного потомства(явного) Варианты непродуктивной инфекции:
- Вирус заходит в клетку и остаётся в цитоплазме, но не разрушается, иногда он может активироваться и приводить к хронической инфекции
-Вирус сразу внедряется в геном клетки или ч/з некоторое время. Продукции вируса нет. Многие вирусы обладают способностью к трансформации клетки за счёт того что внедряются в определённые участки генома( опухолевые участки)
-Персистирующие вирусы. Эти вирусы попав в организм не вызывают ни каких симптомов, сохраняясь в определённых клетках(пр: вирус герпеса)
15. Репродукция вирусов, её этапы
Как отмечалось выше, вирусы являются самореплицирующейся формой, неспособной к бинарному делению, в отличие от микроорганизмов с клеточной организацией. В 50-х годах было установлено, что размножение, или репродукция, вирусов происходит путем репликации их нуклеиновой кислоты и биосинтеза белков с последующей самосборкой вириона. Этот процесс происходит в разных частях клетки - ядре или цитоплазме, вследствие чего получил название дизъюнктивного, т.е. разобщенного размножения.
Вирусная репродукция представляет собой уникальную форму выражения чужеродной (вирусной) информации в клетках человека и животных, насекомых, растений и бактерий, которая состоит в подчинении клеточных матрично-генетических механизмов вирусной информации.
1-я стадия - адсорбция - характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой гликопротеины клеточной мембраны, содержащей нейраминовую кислоту. Такие рецепторы имеются у ряда клеток, в частности эритроцитов, на которых адсорбируются многие вирусы. Для орто- и парамиксовирусов специфическими рецепторами являются гликолипиды, содержащие сиаловую кислоту (ганглиозиды), для других - белки или липиды клеточной мембраны. Рецепторами вирусов являются так называемые прикрепительные белки, располагающиеся в составе капсидов простых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов) или шипов (гликопротеиновые образования на внешней оболочке орто- и парамиксо-, рабдо-, арено- и буньявирусов). Первый этап адсорбции определяется неспецифическими силами межмолекулярного притяжения, второй - специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов.
2-я стадия - проникновение вируса в клетку хозяина - происходит несколькими путями.
Рецепторно-опосредованный эндоцитоз характеризуется образованием в месте взаимодействия вириона с клеточным рецептором окаймленных пузырьков, в формировании которых принимают участие белки-клатрины.
Виропексис. Этим путем в клетку проникают сложноустроен-ные вирусы. Он заключается в слиянии мембран - вирусного суперкапсида с клеточной или ядерной мембраной. Данный процесс происходит при помощи специального бека слияния - F-белка, который находится в суперкапсиде. В результате виропексиса капсид оказывается в клетке хозяина, а суперкапсид вместе с белком встраивается в ее плазматическую мембрану (вследствие чего клетка приобретает способность сливаться с другими клетками, что приводит к передаче вируса этим клеткам).
Фагоцитоз. Данным путем вирус проникает в фагоцитирующие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу.
3-я стадия - транспорт вируса внутри клетки. Он происходит с помощью внутриклеточных мембранных пузырьков, в которых вирус переносится на рибосомы, эндоплазматическую сеть или в ядро.
4-я стадия - «раздевание» вириона - заключается в их деп-оотеинизадии и освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. «Раздевание, вириона начинается сразу же после его прикрепления к клеточным рецепторам продолжается в эндоцитарной вакуоли и ее слиянии с лизосомами при участии протеолитических ферментов, а также в ядерных порах околоядерном пространстве при слиянии с ядерной мембраной.
5-я стадия называется эклипс-фазой, которая характеризуется исчезновением вириона, поскольку он перестает обнаруживаться при элданой микроскопии. В эту стадию начинается синтез компонентов вириона, т.е. его репродукция. Она носит дизъюнктивный (раздельный) характер, поскольку компоненты вириона синтезируются в разных частях клетки: белки на рибосомах, нуклеиновые кислоты в ядре или цитоплазме. Вирус использует для этого генетический аппарат клетки, подавляя необходимые ей самой синтетические реакции.
Эта стадия начинается с транскрипции и репликации вирусного генома. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержащих вирусов происходит, так же как и клеточного генома, по триаде ДНК- иРНК- белок. Различия касаются только происхождения фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина (например, вирус оспы), имеется собственная вирусспецифическая РНК-полимераза. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре (папова- и аденовирусы, вирусы герпеса), используют содержащуюся там клеточную РНК-полимеразу II или III.
У РНК-содержащих вирусов транскрипция их генома осуществляется несколькими путями:
1. Вирусы с негативным геномом (минус-нитевые), к которым относятся орто-, парамиксо- и рабдовирусы, имеют в своем составе вирусспецифическую РНК-полимеразу или транскриптазу. Они синтезируют иРНК на матрице геномной РНК. Подобный фермент отсутствует в нормальных клетках, но синтезируется клетками, зараженными вирусами. Он находится в составе как однонитевых, так и двунитевых РНК-содержащих вирусов.
2. У вирусов с положительным геномом (плюс-нитевые), к которым относятся пикорна-, тогавирусы и др., функцию иРНК выполняет сам геном, который транслирует содержащуюся в нем информацию на рибосомы клетки хозяина.
3. Особняком стоит группа РНК-содержащих ретровирусов, в составе которых имеется обратная транскриптаза, или ревертаза. Уникальность этого фермента состоит в его способности переписывать информацию с РНК на ДНК. Этот процесс называется обратной транскрипции.
Как отмечалось выше, количество генов в вирусном геноме весьма ограничено. Поэтому для увеличения количества вирусной информации существует своеобразный трансляционный механизм, функционирующий через иРНК, который передает значительно больше информации, чем записано в вирусной нуклеиновой кислоте. Это достигается разными путями, например при транскрипции информации с переписывающихся участков ДНК на иРНК путем сплайсин-г а (вырезание бессмысленных кодонов и сшивание концов), а также при считывании антикодонами тРНК одной и той же молекулы иРНК с разных нуклеотидов. При этом образуются новые триплеты, увеличивающие количество транслируемой информации.
Регуляция транскрипции осуществляется клеточными и вирусспецифическими механизмами. Она заключается в последовательном считывании информации с так называемых «ранних» и «поздних» генов. В первых закодирована информация для синтеза вирусспеци-фических ферментов транскрипции и репликации, во вторых - для синтеза капсидных белков.
Вирусспецифическая информация транслируется на рибосомы клетки хозяина, которые предварительно освобождаются от клеточных белков и собираются в вирусспецифические полисомы.
Репликация вирусных геномов заключается в синтезе молекул ДНК или РНК, которые накапливаются в фондах этих нуклеиновых кислот, использующихся при сборке вирионов.
Репликация вирусной ДНК происходит на обеих нитях при участии клеточной ДНК-полимеразы. У однонитевых вирусов вначале образуется вторая нить (репликативная форма).
Репликация вирусных РНК происходит только при участии того же вирусспецифического фермента, который катализирует транскрипцию вирусного генома. У плюс-нитевых вирусов репликация РНК практически не отличается от их транскрипции. У минус-нитевых вирусов репликация отличается от транскрипции длиной образовавшихся дочерних молекул РНК. При репликации они полностью соответствуют по своей протяженности материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК.
У ретровирусов репликация, так же как и транскрипция ДНК, происходит в составе клеточного генома при участии клеточной ДНК-полимеразы.
6-я стадия - сборка вириона - состоит прежде всего в образовании нуклеокапсидов. Поскольку синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков в клетке происходит в разных ее структурах, необходима транспортировка составных частей вириона в одно место сборки. При этом вирусные белки и нуклеиновые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизвольно соединяться друг с другом. В основе самосборки простых вирионов лежит способность вирусных полипептидов соединяться в капсомеры, которые, располагаясь вокруг осей симметрии, образуют многогранник. В других случаях полипептиды в виде спирали окружают вирусную нуклеиновую кислоту.
Многие простые вирионы собираются на репликативных комплексах мембранах эндоплазматического ретикулума. У сложных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на репликативных комплексах, а затем продолжается на плазматической мембране, с наружной стороны которой располагаются суперкапсидные гликопротеиды. Затем гликопротеидные и примыкающие к ним с другой стороны нуклеокапсидные участки выпячиваются через клеточную мембрану, образуя почку, как это имеет место у орто- и парамиксовирусов, рабдовирусов. После отделения почки, содержащей нуклеокапсид и суперкапсидные белки, образуются свободные вирионы. Они либо через клеточную плазматическую мембрану проходят во внеклеточное пространство, либо через мембрану эндоплазматического ретикулума проникают в вакуоль эндоплазматической сети. При этом мембранные липиды обволакивают почку, вытесняя из нее белки. Многие ДНК-содержащие вирусы, например вирус герпеса, собираются в ядре клетки на ее мембране, где образуются нуклеокапсиды. Затем они отпочковываются в перинуклеарное пространство, приобретая внешнюю оболочку. Дальнейшее формирование вириона происходит в мембранах цитоплазматического ретикулума и в аппарате Гольджи, откуда вирус транспортируется на поверхность клетки.
7-я стадия - выход вирусных частиц из клетки - происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, например пикорнавирусы, аденовирусы и др., вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования, в результате чего в течение длительного времени она сохраняет свою жизнеспособность. Такой путь характерен для вируса гриппа и др.
16 Адсорбция, варианты поступления вируса в клетку, «раздевание» вируса
Адсорбция - характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой гликопротеины клеточной мембраны, содержащей нейраминовую кислоту. Такие рецепторы имеются у ряда клеток, в частности эритроцитов, на которых адсорбируются многие вирусы. Для орто- и парамиксовирусов специфическими рецепторами являются гликолипиды, содержащие сиаловую кислоту (ганглиозиды), для других - белки или липиды клеточной мембраны. Рецепторами вирусов являются так называемые прикрепительные белки, располагающиеся в составе капсидов простых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов) или шипов (гликопротеиновые образования на внешней оболочке орто- и парамиксо-, рабдо-, арено- и буньявирусов). Первый этап адсорбции определяется неспецифическими силами межмолекулярного притяжения, второй - специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов.
Проникновение вируса в клетку хозяина - происходит несколькими путями.
Рецепторно-опосредованный эндоцитоз характеризуется образованием в месте взаимодействия вириона с клеточным рецептором окаймленных пузырьков, в формировании которых принимают участие белки-клатрины.
Виропексис. Этим путем в клетку проникают сложноустроен-ные вирусы. Он заключается в слиянии мембран - вирусного суперкапсида с клеточной или ядерной мембраной. Данный процесс происходит при помощи специального бека слияния - F-белка, который находится в суперкапсиде. В результате виропексиса капсид оказывается в клетке хозяина, а суперкапсид вместе с белком встраивается в ее плазматическую мембрану (вследствие чего клетка приобретает способность сливаться с другими клетками, что приводит к передаче вируса этим клеткам).
Фагоцитоз. Данным путем вирус проникает в фагоцитирующие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу.
«раздевание» вириона - заключается в их деп-оотеинизадии и освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. «Раздевание, вириона начинается сразу же после его прикрепления к клеточным рецепторам продолжается в эндоцитарной вакуоли и ее слиянии с лизосомами при участии протеолитических ферментов, а также в ядерных порах околоядерном пространстве при слиянии с ядерной мембраной.
17. Типы вирусных геномов, особенности генетики вирусов.
Все вирусные геномы являются гаплоидными, т.е. содержат одну копию каждого гена. Исключение составляют ретровирусы, которые обладают диплоидным геномом. Геномы ДНК-вирусов позвоночных представлены одной двуспиральной молекулой за исключением парво- и цирковирусов.
Различные семейства вирусов позвоночных значительно различаются по структуре и функции генома. Основные типы вирусных геномов можно представить следующим образом:
1) двуцепочечной линейной молекулой ДНК с открытыми (герпесвирусы, аденовирусы, иридовирусы) или ковалентно связанными концами (вирусы оспы, асфаровирусы);
2) одноцепочечной линейной молекулой ДНК (парвовирусы);
3) одноцепочечной кольцевой молекулой ДНК (цирковирусы);
4) двуцепочечной кольцевой молекулой ДНК (папилломавирусы, полиомавирусы).
5) частично двуцепочечной кольцевой незамкнутой молекулой ДНК (гепаднавирусы);
6) одноцепочечной молекулой РНК, являющейся мРНК (положительно-геномные вирусы: пикорнавирусы, тогавирусы, флавивирусы, астровирусы, калицивирусы, коронавирусы, артеривирусы, нодавирусы);
7) одноцепочечной единой (рабдовирусы, парамиксовирусы, филовирусы, бор-навирусы) или фрагментированнои (ортомиксовирусы) линейной молекулой РНК, комплементарной мРНК — отрицательно-геномные вирусы;
8) одноцепочечной фрагментированнои кольцевой ковалентно несвязанной отрицательной или двуполярной РНК (буньявирусы, аренавирусы);
9) двуцепочечной линейной фрагментированной молекулой РНК (реовирусы, бирнавирусы);
10) двумя идентичными линейными молекулами плюс-РНК, являющимися матрицами для синтеза ДНК (ретровирусы).
Особенность строения вирусного генома заключается в том, что наследственная информация может быть записана как на ДНК, так и на РНК в зависимости от типа вируса. Мутации у вирусов могут возникать спонтанно, в процессе репликации нуклеиновой кислоты вируса, а также под влиянием тех же внешних факторов, мутагенов, что и у бактерий. Фенотипически мутации вирусного генома проявляются изменениями в антигенной структуре, неспособности вызывать продуктивную инфекцию в чувствительной клетке, чувствительностью продуктивного цикла к температуре, а также изменением формы и размеров бляшек, которые вирусы образуют в культуре клеток под агаровым покрытием.
Свойства вирусов могут изменяться при одновременном заражении несколькими вирусами чувствительной клетки. Причем изменения свойств при таких условиях могут происходить как в результате обмена генетическим материалом, принадлежащим разным вирусам (генетическая рекомбинация и генетическая реактивация), так и в результате процессов, не сопровождавшихся обменом генетического материала (комплементация и фенотипическое смешивание).
Генетическая рекомбинация встречается чаще у ДНК-содер-жащих вирусов. Среди РНК-содержащих вирусов она наблюдается у тех вирусов, которые обладают фрагментированным геномом, например у вируса гриппа. При рекомбинации происходит обмен между гомологичными участками генома.
Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов, имеющих мутации в разных генах. В результате перераспределения генетического материала формируется полноценный дочерний геном.
Комплементация встречается в том случае, когда один из двух вирусов, инфицирующих клетку, в результате мутации синтезирует нефункциональный белок. Немутантный вирус, синтезируя полноценный белок, восполняет его отсутствие у мутант-ного вируса.
Фенотипическое смешивание наблюдается в том случае, если при смешанном заражении чувствительной клетки двумя вирусами часть потомства приобретает фенотипические признаки, присущие двум вирусам, при сохранении неизменности генотипа.
18. Экономия генетического материала у вирусов.
Вирусные ДНК могут быть линейными (как у эукариотов) или кольцевыми (как у прокариотов), однако в отличие от ДНК тех и других она может быть представлена однонитевой молекулой. Вирусные РНК имеют разную организацию (линейные, кольцевые, фрагментированные, однонитевые и двунитевые), они могут быть представлены плюс- или минус-нитями.
Плюс-нити функционально тождественны и-РНК, т. е. способны транслировать закодированную в них генетическую информацию на рибосомы клетки хозяина.
Минус-нити не могут функционировать как и-РНК, и для трансляции содержащейся в них генетической информации необходим синтез комплементарной плюс-нити.
РНК плюс-нитевых вирусов в отличие от РНК минус-нитевых имеют специфические образования, необходимые для узнавания рибосомами. У двунитевых как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов, информация обычно записана только в одной цепи, чем достигается экономия генетического материала.
19. Изменчивость вирусов: модификационная и генетическая
Изменчивость вирусов - изменение фенотипа или генотипа вирусов. Особенностью фенотипической изменчивости вирусов является ее связь с включением в состав суперкапсида липо- и гликопротеидов хозяина. Мутационный процесс у вирусов носит спонтанный и индуцированный характер, он протекает с высокой частотой (особенно у вирусов с РНК-геномом), захватывает многие признаки. Генетические рекомбинации происходят в процессе смешанной инфекции клетки-хозяина. Они возникают в результате физ. интеграции частей разных вирусных геномов (генетическая рекомбинация, перераспределение, реактивация, гетероплоидия) или временного использования одним вирусом белка, кодируемого др. вирусом (комплементация, фенотипическое смешивание).
20. Мутации вирусов, их разновидности.
Нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям, то есть внезапным наследуемым изменениям. Сущность этих процессов заключается в нарушениях генетического кода в виде изменений нуклеотидных последовательностей, их выпадений (делеций), вставок либо перестановок нуклеотидов или пар в одно- и двухнитевых молекулах нуклеиновых кислот. Указанные нарушения могут ограничиваться отдельными нуклеотидами или же распространяться на более значительные участки. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации. Их биологическое значение может быть связано с приобретением или потерей патогенных свойств, а также с приобретением свойств, лишающих их чувствительности к действию защитных механизмов организма-хозяина. Мутации, полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков, приводят к утрате способности к репродукции и иначе известны как летальные мутации. В их основе лежат изменения, приводящие к возникновению бессмысленных кодонов (с нарушением синтеза белковой цепочки) либо к появлению вставок или делеций (с глубокими нарушениями генетического кода). Мутации с потерей способности синтезировать определённый белок или с нарушением его функций, что в определённых условиях может привести к утрате способности к репродукции называют условно-летальными.
Спонтанные мутации возникают под действием различных естественных мутагенов и встречаются с частотой l:10-8 вирусных частиц. Чаще их можно наблюдать у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции.
Индуцированные мутации вызывают различные химические агенты и УФ-облучение (у ДНК содержащих вирусов). Принципиальной разницы в перестройке генома, вызванной спонтанны ми или индуцированными мутациями, нет. Принято считать, что применяемые мутагены лиш увеличивают частоту спонтанных мутаций. При классификации вирусных мутаций используют два разных подхода: их разделяют по характеру изменений генотипа или по изменениям фено типа, наступающим в результате мутаций. Изучение изменений генотипа вирусов проводят редко, так как для этого необходимо детальное изучение их геномов. Чаще проводят изучен» фенотипических проявлений мутаций как более доступных для исследований.
Проявление мутаций вирусов в фенотипе
По фенотипическим проявлениям мутации вируса можно разделить на четыре группы.
• Мутации, не имеющие фенотического проявления, не изменяют свойств вирусов и их выявляют лишь при специальном анализе.
• Мутации, имеющие фенотипическое проявление (например, изменение размеров бляшек, образуемых вирусами в культуре клеток или термостабильность вирусов). Мутации, повышающие или снижающие патогенность, можно разделить на точковые (локализующиеся в индивидуальных генах) и генные (затрагивающие более обширные участки генома).
21) Летальные и условно-летальные мутации у вирусов
Мутации, которые приводят к изменению, но не к утрате функциональной активности фермента, называют условно-летальным и. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять свою жизнеспособность или, наоборот, утрачивать ее. Так, например, ts-мутанты (температур чувствительные) бактерий сохраняют способность к синтезу ферментов функционирующих при 37°С, но утрачивают этот признак при 42°С. В то же время у бактерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих «температурах. Летальные мутации характеризуются полной утратой «особенности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент или ферменты. Чаще всего эти мутации возникают при обширных делениях, захватывающих группу генов, или при других видах хромосомных мутаций. К ним относятся также мутации в генах, несущих информацию о синтезе ДНК-полимераз.
22 Взаимодействия между вирусами генетические и негенетические.
Примером генетического взаимодействие может служить феномен «спасение маркёра» (вида) Если в клетку одновременно попадает несколько вирусов и у них существует несколько мутаций геномов при их репродукции происходит обмен участками генома и один из вирионов становится «здоровым» сохраняя полноценный геном а другие погибают. Таким образом жертвуя собой одни вирионы сохраняют жизнь другому чтобы сохранить вид в дальнейшем.
Примером негенетического взаимодействия может служить взаимоотношение вирусов гепатита Д и гепатита В. Сам по себе гепатит Д не может проникать в клетку так как у него нет соответствующих адгезивных белков. Геппатит В отдаёт гепатиту Д данные белки чтобы тот мог проникнуть в клетку. Когда гепатит Д проникает в клетку то гепатит В представляет гепатиту Д определённые ферменты для репликации (полимеразы). Но когда гепатит Д начинает активно размножаться в клетке он стимулирует её к выработкеэнтерферонов и виру гепатита В погибает. Когда данные вирусы находятся вместе в одном организме заболевание протекает достаточно тяжелее.
Ещё один пример негенетического взаимодействия: Модификация «шуба с чужого плеча». Когда в клетку попадает 2 родственных вируса и когда геном вируса одевается капсидом то каждый вирион может одеться капсидом другого вириона.
23 Влияние вирусов на развитие эмбрионов
В настоящее время установлено, что целый ряд вирусов является причиной внутриутробной эмбриофетопатии, т.е. способен вызывать различного рода патологию как у эмбриона, так и у плода. Существует определенная связь между рождением неполноценных детей и вирусными заболеваниями женщин во время беременности.
Вирусные инфекции матери в период эмбриогенеза представляют большую опасность для плода, так как вирусы, являясь облигантными паразитами, размножаются более интенсивно в клетках, наделенных высоким уровнем метаболизма - в тканях развивающегося эмбриона. При этом вирусная нуклеиновая кислота может включаться в состав клеточного генома, передающего генетическую информацию в аппарат, воспроизводящий клеточный белок, что в конечном итоге приводит к гибели зародыша или нарушению процессов органогенеза и возникновению пороков развития. Инфицирование плода в более поздние сроки не приводит к формированию грубых дефектов развития, однако в этих случаях может произойти нарушение функциональных механизмов дифференцировки клеток и тканей органов. У таких детей после рождения обнаруживаются признаки незрелости органов, снижение сопротивляемости и жизнеспособности, отставание в физическом и умственном развитии.
В настоящее время установлено, что вирусы краснухи, цитомегалии, герпеса, гриппа, полиомелита, ECHO, Коксаки, гепатита А могут вызывать серьезные нарушения в развитии плода и новорожденного. Миксовирусы, аденовирусы, группа вирусов герпеса и паротита могут вызвать заболевания ЦНС.
Смешанные вирусные инфекции, обычно клинически нераспознанные или внешне безобидные (например, цитомегалии и краснуха) для беременной женщины, являются далеко не безразличными для плода. Тяжелые поражения у плода могут иметь место и при легком или инаппаратном течении заболевания у матери и даже в случаях обычного вирусоносительства.
В настоящее время не вызывает сомнений, что одной из ведущих причин недонашивания ребенка может являться вирусная инфекция у матери (острая, хроническая, бессимптомная или латентная). У недоношенных детей пороки развития встречаются в 6-10 раз чаще, чем у доношенных; количество нервно-психических заболеваний и частота умственной отсталости достигают 50%, значительно выше смертность.
Установлено, что тяжесть вирусного заболевания (грипп, корь, паротит и др.), а также сроки беременности играют большую роль в патологии плода: чем меньше срок, тем тяжелее последствия. Считается, что тяжелая инфекция плода для него смертельна, а менее выраженная нередко вызывает уродства, но при этом возможно рождение и нормального ребенка.
Практически для всех вирусов плацента проникаема. В эмбриональных тканях вирусы хорошо размножаются. Эта особенность широко используется вирусологами для культивирования различных вирусов в лабораторных условиях, например, на фибробластах эмбриона человека.
Вирусы в эмбрионе могут вызывать нарушения в хромосомном наборе (хромосомные аномалии), вплоть до разрыва хромосом (так называемый мутагенный фактор), что может обусловить наследственные заболевания, органические изменения ЦНС у новорожденных. Кроме того, в результате поломки генетического кода в молекуле ДНК, вызванной вирусом и имеющей отношение к наследственности, могут возникнуть врожденные пороки развития, рождение детей с врожденными уродствами. Наряду с этим вирусы также вызывают нарушение обмена липидов, нуклеиновых кислот и синтеза белков в организме плода (тератогенное действие), что приводит к гибели последнего и прерыванию беременности. И, наконец, вирусы могут вызывать нарушение органогенеза, что приводит к возникновению уродств. Поэтому первые 3 мес беременная женщина и плод нуждаются не в меньшей охране, чем в сроки, предусмотренные декретным отпуском, т.к. чем меньше срок беременности, тем тяжелее последствия вирусной инфекции для эмбриона и плода.
24)Основные проявления цитопатического действия вирусов:
1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;
2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;
3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;
4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);
5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).
25) Природа телец включений и их диагностическое значение.
Вирусные тельца-включения – образования, состоящие или из скоплений вирусных частиц (вирионов), или из клеточного материала. Они встречаются при многих вирусных инфекциях и представляют собой овальные оксифильные тельца величиной1-10мкм, периферически окруженные светлой зоной – мантией. Их классифицируют по локализации в клетке (внутриядерные, цитоплазматические), составу нуклеиновой кислоты (ДНК-, РНК-содержащие), тинкториальным свойствам (базофильные, оксифильные), гомогенности (аморфные, зернистые и т.д.). Тельца включения локализуются избирательно. При оспе всех видов животных, в том числе птиц, бешенстве, гриппе , парагриппе, чуме крупного рогатого скота, пситтакозе и других болезнях, как правило, развиваются цитоплазматические тельца-включения; при болезни Борна, ринотрахеите крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, везикулярном стоматите, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции и других – ядерные.
С помощью электронного микроскопа установлена структура телец-включений и выявлен ряд других, более тонких морфологических изменений в инфицированных клетках. Во многих случаях включения – это места накопления или образования вирусных частиц, например, тельца Гварнирьери в цитоплазме клеток зараженных вирусом осповакцины; представляют собой фабрики вирионов, а тельца Бабеша-Негри- скопления нуклеокапсидов вируса бешенства. Включения Каудри типа А формируются в ядрах клеток, зараженных вирусом герпеса, представляют собой глыбки маргинального хроматина. Ядерные включения, встречающиеся при аденовирусной инфекции, представляют собой кристаллоподобные скопления вирионов, или, что гораздо реже, - скопления вирусных белков.
Цитоплазматические тельца – включения развиваются при болезнях, вызываемых сравнительно крупными вирусами (оспа, бешенство). Чаще они представленны в виде округлых, овальных, или неправильной формы образований. В пораженной клетке может быть несколько телец – включений различных размеров и форм. Обычно они прилегают к ядру, отодвигая его к периферии или окружая его, и обнаруживаются в хорошо сохранившихся клетках. Для каждого тельца-включения характерна внутренняя структура. Так, тельца Гварнирьери при оспе имеют вид рыхлых, зернистых образований, при бешенстве тельца Бабеша – Негри кажутся плотными,
Большинство телец – включений содержит ДНК, что является специфичным для ДНК – содержащих вирусов. Хорошо изучены включения при следующих вирусных болезнях животных: оспе птиц (тельца Боллингера), бешенстве (тельца Бабеша - Негри), болезни Борна (тельца Дегена и Оста), чуме собак (тельца Лектура), инфекционном ларинготрахеите птиц (тельца Зейфрида), инфекционном гепатите собак,
При одной и той же болезни характер вирусных включений различен, Так при кори накопление цитоплазматических включений кореллирует с накоплением вируса, а внутриядерных – с реакцией клетки на вирус.
Ядерные включения встречаются при инфекциях, вызываемых как относительно крупными вирусами (герпес, болезнь Ауески, ИРТ, ринопневмония лошадей и др.) так и вирусами, имеющими очень мелкие размеры (ящур, гепатит собак). Ядерные включения лучше выявляются в гистологических препаратах, морфологические детали включений видны только при контрастной окраске срезов; форма и размеры их зависят от штаммовых особенностей вируса, а также от методов гистологической обработки материала. Различаютдва типа внутриядерных включений: А и В. Включения типа А – аморфные или округлой формы оксифильные образования, четко отграниченные от базофильной массы ядра; нуклеоплазма находится в состоянии глубокой деструкции; хроматин расположен глыбками на деформированной оболочке ядра. Включения типа А встречаются при ринопневмонии лошадей, ИРТ КРС, ларинготрахеите птиц, болезни Ауески. Включения типа В имеют вид ацидофилных гиалиновых зерен, нуклеоплазма относительно мало изменена. Они преимущественно при болезни Тешена, Аденоинфекции.
При ряде вирусных болезней обнаружение телец – включений имеет диагностическое значение. Многие из них настолько патогномоничны, что обнаружение их, стало основным из экспресс методов диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии лошадей, аденовирусной инфекции и ИРТ КРС. В диагностике гриппа животных, болезни Ауески, ларинготрахеита птиц и других болезней выявление телец включений – вспомогательный метод. На частоту выявления телец – включений, кроме штаммовых различий влияет и возраст животного (у молодых они появляются с большим постоянством) и физиологическое состояние организма.
Внуириклеточные тельца включения при оспе разных видов животных и птиы имеют много общего. Неправильной овальной формы распологаются в цитоплазме, обычно около ядра. Впервые эти включения открыл в 1882 г. Д. Гварнирьери. В 1896 г. Д. Боллингер обнаружил их при оспе кур, а в 1903 г. Боррель при оспе овец. Они обнаруживаются световой микроскопией главным образом в пораженных участках кожи. Причем в одних клетках они бывают единичными, в других – множественными. При окраске гематоксилин – эозином включения обнаруживаются в виде овальных образований величиной, примерно равной величине ядрышка клетки. Центральная их часть эозинофильна, с неровным контурами. Каждое включение по периферии окружено светлой зоной, мантией.
При чуме собак цитоплазматические включения впервые обнаружил Ленц в 1909 г. Они встречаются в глиальных клетках центральной нервной системы, а также в в клетках самых разных органов и тканей. Располагаются преимущественно в цитоплазме клеток, оксифильны, имеют овальную форму и различные размеры.
26) Персистенция. Некоторые вирусы могут переходить в латентное состояние (так называемая персистенция для вирусов эукариот или лизогения для бактериофагов — вирусов бактерий), слабо вмешиваясь в процессы, происходящие в клетке, и активироваться лишь при определённых условиях. Так построена, например, стратегия размножения некоторых бактериофагов — до тех пор, пока заражённая клетка находится в благоприятной среде, фаг не убивает её, наследуется дочерними клетками и нередко интегрируется в клеточный геном. Однако при попадании заражённой лизогенным фагом бактерии в неблагоприятную среду, возбудитель захватывает контроль над клеточными процессами так, что клетка начинает производить материалы, из которых строятся новые фаги (так называемая литическая стадия). Клетка превращается в фабрику, способную производить многие тысячи фагов. Зрелые частицы, выходя из клетки, разрывают клеточную мембрану, тем самым убивая клетку. С персистенцией вирусов (например, паповавирусов) связаны некоторые онкологические заболевания
27. Вирусологические методы исследования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.
Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).
В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.
Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.
В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).
В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.
Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.
Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.
Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.
Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.
Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.
Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.
28. Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.
29. ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ-комплекс методов исследования, позволяющих распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.
Осн. этапами В. и. являются выделение вируса от больных и павших животных (взятие, консервирование, пересылка и подготовка материала, заражение им животных, куриных эмбрионов, культуры клеток); титрование вирусов для определения их кол-ва в исследуемых материалах; культивирование вирусов на восприимчивых домашних и лабораторных животных, особенно на развивающихся куриных эмбрионах и культурах тканей (гл. обр. первичнотрипсинизированных).
30. Методы культивирования вирусов.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование invitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться invitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.
Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.
Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.
Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.
О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.
Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.
31. Индикация вирусов, её варианты
Индикация – обнаружение вирусов. Проводится следующим образом: На культуру клеток вносят вируссодержащий материал и наблюдают как протекает ЦПД. По характеру ЦПД (гомогенизация лизис, образовакние симпласта и т.д) мы можем сделать вывод о наличии вируса и установить его принадлежность к определённому таксону.
32 Методы идентификации вирусов
1 В основном проводятся при помощи иммунных реакций (серологических), реакций взаимодействия между антигеном и антителом.
2 Метод заражения животных. Одному животному вводят вирус а другому вирус + сыворотку. Если у животного которому ввели сыворотку + вирус не проявляется никакого патогенного действия то делают заключение о том какой это вирус. (например вирус энцефалита)
3 Цитопатогенное действие на ХАО (хорион аллантоисная оболочка). Вирус вводится в хорион аллантоисную оболочку (предполагаемый образец), а в другую образец+ сыворотка. И идентифицируют вирус (например оспа или нет).
4. Идентификация вирусов по способности вызывать гемааглютинацию. (например вируса гриппа) К аллантоисной жидкости добавляют сыворотку H2N3 к другой Н1N1 и добавляют взвесь куриных эритроцитов где произойдёт лизис эритроцитов значит тот вирус и содержится.