Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
ПАЛІЙ Анфіса Євгеніївна
УДК 582.736.3:547.596/597:582
ТРИТЕРПЕНОВІ І ФЕНОЛЬНІ СПОЛУКИ
MELILOTOIDES CRETACEA (M. BIEB.) SOJAK
03.00.04 –біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата
біологічних наук
Київ –
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду –Національного наукового центру УААН
Науковий керівник: доктор технічних наук, професор, академік УААН
Єжов Валерій Микитович,
директор Нікітського ботанічного саду –
Національного наукового центру УААН
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Паршикова Тетяна Вікторівна,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач кафедри фізіології та екології рослин
доктор біологічних наук
Курчій Богдан Олексійович,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
старший науковий співробітник відділу росту і
розвитку рослин
Провідна установа: Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного
НАН України, м. Київ
Захист відбудеться “ 15 ” травня 2006 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “ 10 ” квітня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Стероїди відіграють значну роль в гормональній регуляції росту і розвитку як тварин, так і рослин. Фізіологічна дія цих речовин в регуляції фізіолого-біохімічних процесів у тварин добре відома. Серед стероїдів рослинного походження найвищу біологічну активність мають брасиностероїди, які приймають активну участь у рості і розвитку рослин. Хоча вивченню брасиностероїдів в останні роки приділяється значна увага, інформація в літературі щодо їхнього синтезу і вмісту в рослинах, а також практичного застосування є фрагментарною. Речовини тритерпенової і фенольної природи здавна привертали увагу дослідників, перш за все, як ефективні фармакологічні препарати (Машковский, 1999; Hostettmann, Marston, 1995). Так, для тритерпеноїдів характерні протизапальна, алелопатична (Waller et al., 1993), антимікробна (Osbourn, 2003), інсектицидна (Tava, Odoradi, 1996), заспокійлива, імуностимулююча і антиоксидантна (Деканосидзе и др., 1984; Малыгина и др., 2003), а також протиракова (Behboudi et al., 1999) і гемолітична (Oh et al., 2000) дії.
Інший важливий клас біологічно активних речовин –флавоноїди, які проявляють Р-вітамінну, судинорозширювальну, спазмолітичну, гіпотензивну, антиоксидантну та антимікробну дії (Хаджай, 1970). Зокрема встановлений негативний вплив флавонолів на грампозитивні бактерії, флавонів і халконів – на стафілокок. Антимікробна дія відзначалася у антоцианів, ізофлавонів і катехинів (Бандюкова и др., 1987).
Терпенові й фенольні сполуки приймають активну участь в регуляції росту і розвитку рослин. Зокрема фенольні сполуки відіграють важливу роль в зміцненні клітинних оболонок, а терпенові як в стабілізації мембран рослин (Goad, 1991; Rohmer, 1988), так і руйнуванні мембран фітопатогенів (Osbourne et al., 1998).
Незважаючи на велику кількість фармацевтичних препаратів, пошуки нових речовин є актуальним завданням в зв’язку із явищем привикання. Одним із шляхів вирішення цієї проблеми є пошук необхідних речовин у рослинах. Раніше показана біологічна активність екстрактів Melіlotoіdes cretacea (M. Bіeb.) Sojak (Щербановский, Нилов, 1967; Фадеев, Голубев, 1984). Проте, хімічна природа біологічно активних речовин із цієї рослини не була встановлена. Враховуючи важливу роль цитованих вище класів сполук, нами досліджено кількісний і якісний вміст потенційно біологічно активних речовин із рослин M. cretacea.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися у відділі біотехнології і біохімії рослин Нікітського ботанічного саду –Національного наукового центру з 2000 по 2003 р. у рамках науково-дослідної теми "Збереження різноманіття, пошук і ефективне використання біологічних ресурсів у природних і антропогенних ландшафтах на півдні
2
України", № держреєстрації 0101U007189 (здобувачем досліджувались якісний, кількісний вміст тритерпенових і фенольних сполук, їх біологічна активність).
Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було виділити та ідентифікувати потенційні біологічно активні речовини (тритерпеноїди і флавоноїди) із різних органів рослини Melіlotoіdes cretacea (M. Bіeb.) Sojak.
Для досягнення цієї мети були поставлені таки головні задачі:
- виділити та провести скринінг на біологічну активність речовин сумарних екстрактів із коренів, листків, стебел і квіток M. cretacea протягом вегетації;
- ідентифікувати та встановити хімічну структуру тритерпеноїдів і флавоноїдів в сумарних екстрактах;
- дослідити біологічну активність речовин, отриманих хроматографічними методами.
Об'єкт дослідження. Біологічно активні речовини M. cretacea.
Предмет дослідження. Тритерпеноїди і флавоноїди M. сretacea та їх антибіотична і рістрегулююча активність.
Методи досліджень. Екстракція речовин різними розчинниками, паперова, тонкошарова і колоночна хроматографії, рідинна хроматографія високого тиску, якісний хімічний аналіз речовин, спектроскопія, метод біотестів, метод дифузії бактеріальних культур в агар з використанням стандартних дисків.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено кількісний і якісний вміст тритерпеноїдів і флавоноїдів різних органів M. cretacea. Встановлено, що корені містять найбільшу кількість тритерпеноїдів, а квітки флавоноїдів. Серед тритерпеноїдних сполук ідентифіковано олеанолову кислоту. Виявлено антимікробну активність (відносно грампозитивних і грамнегативних бактерій) тритерпенових глікозидів із коренів і флавоноїдів із квіток. Вперше із квіток M. cretacea виділено сім сполук флавоноїдної природи, серед яких ідентифіковано п’ять. Показана інгібіторна дія тритерпенів та водних екстрактів із коренів на тест-об’єкти (салат, крес-салат та редька).
Практичне значення одержаних результатів Досліджено нове джерело отримання природних сполук антимікробної і регулюючої ріст рослин дії.
Особистий внесок здобувача Особистий внесок здобувача полягає в аналізі наукової літератури, в розробці методологічних підходів щодо вирішення поставлених завдань, виконанні експериментальної роботи, встановленні якісного і кількісного вмісту тритерпенових і фенольних сполук. Дисертантом узагальнено експериментальні дані з використанням методів статистики. Разом з науковим керівником сформульовано основні положення і висновки дисертації, проведено вибір об'єктів досліджень і визначено структуру дисертаційної роботи.
3
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися й обговорювалися на I Міжнародному семінарі "Лесные биологически активне ресурсы" (Хабаровск, 2001), Міжнародній науковій конференції "Сучасні проблеми інтродукції рослин та збереження біорізноманіття екосистем" (Чернівці, 2002), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Фізіологія рослин та екологія" (Дніпропетровськ, 2003), Міжнародній молодіжній конференції "Проблемы интродукции растений, сохранение биоразнообразия и рациональное использование растений в сельском хозяйстве" (Ялта, 2004), Всеукраїнській науково-технічній конференції студентів, аспірантів і молодих учених "Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики" (Севастополь, 2005)
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей у фахових наукових виданнях, 5 тез у матеріалах конференцій.
Структура і зміст дисертації. Дисертація містить 124 сторінки друкованого тексту і складається із вступу, 3 розділів, заключної частини, висновків, списку літератури (194 найменування).
ОБ’ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили на листках, стеблах, коренях й квітках рослини Melіlotoіdes cretacea (M. Bіeb.) Sojak. Рослинну сировину відбирали на околицях с. Малого Садового Бахчисарайського району і с. Морське Судакського району Криму. Узагальнена схема досліджень приведена на рис. 1.
Тритерпенові глікозиди після випаровування спирту із сумарного екстракту обробляли бензолом, хлороформом і н-бутанолом. З н-бутанольної фракції розчинник відганяли під вакуумом і залишок очищували на колонці із силікагелем (Деканосидзе и др., 1982). Аналіз глікозидів виконували методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках "Sіlufol". Детектування агліконів і тритерпенових глікозидів здійснювали 25%-ним спиртовим розчином фосфорновольфрамової кислоти. Олеанолову кислоту ідентифікували хроматографічно шляхом порівнювання з чистими речовинами відомої структури.
Флавоноїди екстрагували з попередньо знежиреної (петролейним ефіром і хлороформом) рослинної сировини 70% етанолом. Етанольний екстракт випаровували до водного залишку, з останнього флавоноїди екстрагували н-бутанолом (Гринкевич, 1983). Кількісний вміст фенольних сполук визначали за допомогою реакції Фоліна-Чіокальтео (Гержикова, 2002), ідентифікацію фенольних сполук проводили методами високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) (Стыскин и др., 1986), двомірної паперової хроматографії (Теслов, 2000), диференційної УФ-спектроскопії (Литвиненко и др., 1972) та якісними хімічними реакціями.
Рістрегулюючу дію сумарної фракції тритерпеноїдів, а також водного екстракту коренів визначали методом біотестів (Гродзинський, 1991). Тест-об’єктами слугували редька (Paphanus sativus var. radiculatus L.) сорт “Рубін”, крес-салат (Lepіdіum satіvum L.) і салат (Lactuca sativa L.) сорт “Кучерявець”.
Антибактеріальну активність водних і етанольних екстрактів, сумарних фракцій тритерпеноїдів, флавоноїдів, а також індивідуальних флавоноїдів оцінювали за діаметром зон пригнічення росту таких тест-об'єктів: Staphylococcus albus, Staphylococcus cіtreus, Streptococcus anhaemolіtіcus, Nesseria meningitides, Nesseria flava, Salmonella kauffmani, Shіgella flexnerі (Лабинская, 1978). Бактеріальні культури вирощували на агаризованих живильних середовищах у чашках Петрі за загальноприйнятими у мікробіологічних дослідженнях методами.
Статистичну обробку одержаних результатів проводили з використанням критерію Стьюдента, ймовірними вважали зміни, де Р<0,05 (Менчер, Земшман, 1986). Основні статистичні розрахунки проводили з використанням програм Mіcrosoft Excel і Statіstіca.
Рис. 1. Загальна схема проведення досліджень
5
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Динаміка кількісного і якісного вмісту тритерпеноїдів на протязі вегетації M. cretacea
Аналіз вмісту речовин в водному і етанольному екстрактах коренів, листків, стебел, і квіток M. cretacea показав, що в екстрактах з коренів присутні речовини тритерпенової природи, а в етанольному екстракті надземних органів і квіток –тритерпенові глікозиди, фенольні кислоти, флавоноїди. Сумарний вміст тритерпенових глікозидів становив у коренях M. cretacea 25 мг/г сухої речовини, у надземних органах –мг/г у фазі цвітіння.
Дослідження вмісту тритерпеноїдів в етанольних екстрактах з листків, стебел і коренів M. cretacea показало, що в період активного вегетативного росту спостерігався низький вміст агліконів і глікозидів; в подальшому їх концентрація зростала, досягаючи максимуму під час цвітіння (липень), і на етапі закінчення вегетації знову знижувалась. За вмістом речовин тритерпенової природи корені й наземна частина рослини значно відрізнялись, при цьому в листках і стеблах переважали полярні сполуки. Тритерпеноїди коренів M. cretacea представлені 16 сполуками, листків –, стебел –і квіток –. Загалом протягом вегетації в надземній частині рослини відзначається високий вміст тритерпенових глікозидів (69,76% від сумарного вмісту тритерпеноїдів), а в коренях –агліконів (36,24%).
Хроматографічно виявлені речовини тритерпенової природи позначено буквами латинського алфавіту в міру збільшення їх полярності (рис. 2).
а в
Рис. 2. Хроматографічний розподіл тритерпеноїдів M. cretacea в фазі цвітіння: 1) корені; 2) листки; 3) стебла; 4) квітки; 5) олеанолова кислота. Системи розчинників: а –бензол-ацетон (4:1); в –хлороформ-метанол-вода (70:30:6). Умовні позначки кольорів плям:
Сполуки тритерпенової природи, що мають низьку полярність, було віднесено до групи агліконів (мелілотоїдогеніни А ... F); ті що мають більшу полярність і характерні реакції, віднесено до групи тритерпенових глікозидів (мелілотоїдозиди G ... S). Протягом усієї вегетації в коренях і надземній частині були присутні мелілотоїдогеніни B і D, мелілотоїдозіди H, M, N. Для надземної маси і коренів M. cretacea характерна максимальна кількість мелілотоїдогеніну D і мелілотоїдозиду М (період цвітіння).
Тритерпенові глікозиди коренів M. cretacea
Методами ТШХ і ВЕРХ визначено шістнадцять речовин тритерпенової природи в екстрактах коренів M. cretacea. Сумарну фракцію тритерпеноїдів розділили екстракцією розчинниками різної полярності і колоночною хроматографією на фракції А ... F, G ... L, M ... P. За даними ТШХ-аналізу, фракції А...F –суміш неполярних агліконів близьких за хроматографічною рухливістю, фракція G...L містить монозиди і біозиди, що мають середню полярність; фракція M...P –полярніші тріозиди і тетразиди.
У повному кислотному гідролізаті сумарної фракції тритерпеноїдів присутні мелілотоїдогеніни A ... F і моносахариди –арабіноза, ксилоза, глюкоза, галактоза і рамноза. При хроматографічному порівнянні вільних агліконів і агліконів, одержаних у результаті гідролізу з чистими речовинами відомої структури, встановлено, що мелілотоїдогенін В є олеаноловою кислотою.
Встановлено, що в рослинах M. cretacea, зібраних одночасно у західному і східному Криму якісний, кількісний вміст тритерпеноїдів збігається. Оскільки в західному і східному районах Криму M. cretacea і види роду Melіlotus albus і Melіlotus offіcіnalіs входять до складу одних і тих рослинних угруповань, склад тритерпенових глікозидів цих видів відомий (Ходаков, Акимов, 1996), з метою уточнення можливих філогенетичних відносин між ними на наступному етапі проведено оцінку вмісту тритерпенів M. cretacea, M. albus і M. offіcіnalіs. Виявлено, що корені M. cretacea відрізняються великим розмаїттям речовин тритерпенової природи і до їх складу входять полярніші сполуки (мелілотоїдозиди N...P). Олеанолова кислота в M. albus і M. offіcіnalіs відсутня. Соясапогенолу В, присутнього у коренях представників роду Melіlotus, у M. cretacea не знайдено. Таким чином у складі тритерпенових глікозидів M. cretacea і видів роду Melіlotus подібності не виявлено, що свідчить про віддаленість цих таксонів.
Фенольні сполуки M. cretacea
В період вегетативного росту в цілій рослині містилось 5 мг/г сухої речовини фенольних сполук, у період цвітіння –мг/г, у період плодоносіння –мг/г. В коренях були слідові кількості фенольних сполук. Максимальну кількість цих речовин виявлено в квітках (84 мг/г). Корені,
7
стебла, листки і квітки M. cretacea істотно відрізняються за кількісним і якісним вмістом фенольних сполук (таблиця 1). Максимальний вміст цих сполук відмічено в квітках. Фенольні сполуки стебел і листків в основному представлені фенольними кислотами і незначною кількістю флавонолів. Серед фенольних сполук листків і стебел M. cretacea хроматографічним аналізом і кольоровими реакціями ідентифіковано хлорогенову кислоту і флавоноїд рутин. В той же час у етанольному екстракті переважали флавоноїди.
Таблиця 1
Сумарний вміст фенольних сполук в органах M. cretacea на різних стадіях вегетації
Флавоноїди квіток M. cretacea
Хроматографічним розподілом сумарної фракції флавоноїдів квіток M. cretacea виявлено сім сполук, які дали позитивну цианідінову реакцію. Виявлені речовини позначено буквами латинського алфавіту (в міру збільшення їх полярності) як речовини А ... G (таблиця 2). Дані аналізу ВЕРХ показали, що у спиртовому екстракті переважали С і Е речовини, при цьому А речовина представлена найменшою концентрацією.
Детальніший розподіл сумарної фракції флавоноїдів із квіток зроблено методом двовимірної хроматографії. При цьому виявлено сім речовин флавоноїдного характеру, шість з них за хроматографічною поведінкою були віднесені до глікозидів.
В повному кислотному гідролізаті сумарної фракції флавоноїдів квіток M. cretacea ідентифіковано один аглікон і два вуглеводи: глюкозу і рамнозу. Аглікон попередньо за хроматографічною поведінкою і якісними реакціями охарактеризовано як кверцетин.
За допомогою реакцій з діазотованою сульфаніловою кислотою, хлорокисом цирконію, а також диференційної УФ-спектроскопії визначено місця приєднання вуглеводних радикалів і положення фенольних оксигруп. Шляхом поетапного гідролізу з’ясовано послідовність приєднання моносахаридів.
За змінами у спектрах глікозидів і агліконів, зумовленими іонізуючими і комплексоутворювальними реактивами, встановлено, що в речовинах В, D, E, містяться оксигрупи у положеннях 5, 7, 3′, 4′, а вуглеводний компонент знаходиться у Сположенні; у речовині С містяться оксигрупи в положеннях 5, 3, 3′, 4′, а вуглеводний компонент знаходиться у С.
Таблиця 2
Деякі фізико-хімічні властивості флавоноїдів квіток M. cretacea
Примітка.
Система І: н-бутанол : оцтова кислота : вода (4:1:5); система ІІ: 15% оцтова кислота
9
Отже, у складі флавоноїдів квіток M. cretacea ідентифіковано п’ять сполук (рис. 3).
Рис. 3. Структури флавоноїдів квіток M. cretacea
1) речовина А; 2) речовина В ; 3) речовина С; 4) речовина D; 5) речовина E.
Речовина A: λmax (етанол) 368, 257 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 109 хв. За результатами УФ-спектроскопії з комплексоутворювальними й іонізуючими добавками та порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як 3,5,7,3´4´-ïентагідроксифлавон (кверцетин). Це узгоджується з даними, одержаними М.Т. Ікрамовим і ін. для Lathyrus pratensis (Икрамов и др.., 1990). Дані кислотного гідролізу й УФ-спектроскопії речовин В –G дали змогу зробити висновок, що всі вони є глікозидами, похідними кверцетину.
Речовина В: λmax (етанол) 360, 256 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 74 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин і глюкоза. За результатами порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як кверцетин-3-O-глюкозид (ізокверцитрин), що узгоджується з даними, одержаними А.Л. Казаковим та співр. для Onobrychis tanaitica і O. аrenaria (Казаков и др., 1981).
Речовина С: λmax (етанол) 360, 258 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 81 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин і рамноза. За результатами порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як кверцетин-7-O-глюкозид (кверцеміритрин). Це узгоджується з даними, одержаними Н.Н. Гужевою та ін. для Astragalus lagurus (Гужева и др., 1983).
Речовина D: λmax (етанол) 360, 256 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 58 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин, глюкоза і рамноза. За результатами порівняння з чистою речовиною відомої структури ідентифікували як кверцетин-3-Oглюкозил-рамнозид (рутин). Це узгоджується з даними Половинки А.Е і Шостаковської Н.Г. одержаними для Caragana aurantica (Половинка, Шостаковская, 1987).
Речовина E: λmax (етанол) 358, 256 нм; час утримання за даними ВЕРХ Rt = 62 хв, у кислотному гідролізаті наявні кверцетин і глюкоза. За результатами порівняння з чистою речовиною ві-
10
домої структури ідентифікували кверцетин 3-O-глюкозил-глюкозид, що узгоджується з даними В.Н. Ковальова, Л.М. Сірої одержаними для Glycine hispida (Ковалев, Серая, 1985).
За результатами фізико-хімічних досліджень ми припускаємо, що речовини F і G глікозидовані по 3- і 7-атому вуглецю кверцетину.
Біологічна активність сумарних препаратів тритерпенових глікозидів і флавоноїдів M. cretacea
Наступна частина наших досліджень була присвячена вивченню потенційної біологічної активності препаратів тритерпенових глікозидів і флавоноїдів із M. cretacea. Нами встановлено, що малополярна фракція тритерпенових агліконів мала невисоку антимікробну активність, у зв'язку з її слабкою розчинністю у воді, дослідження проводили з сумарною фракцією глікозидів, що мають середню і високу полярність.
Дослідження рістрегулюючої активності сумарної фракції тритерпеноїдів і водного екстракту з коренів M. cretacea показало, що тритерпенові глікозиди негативно впливають на проростання насінь і зріст коренів проростків редьки, крес-салату і салату (таблиця 3).
Таблиця 3
Вплив сумарної фракції тритерпенових глікозидів і водного екстракту з коренів M. cretacea на проростання насіння редьки, крес-салату і салату
Відсоток пророслого насіння був незмінним протягом всього експерименту в дослідах з редькою і крес-салатом. Інша картина спостерігалася при вивченні впливу сумарної фракції тритерпенових глікозидів на проростання насінь салату. У всіх варіантах досліду проростання насіння починалося через 48 годин. При цьому в контролі відсоток пророслих насінь перевищував 70%, а в
варіантах, оброблених речовинами із сумарної фракції тритерпеноїдів був майже в два рази менше. Через 72 години у обробленого насіння кількість пророслих насінин збільшилася.
Відсоток пригнічення росту коренів проростків залежить як від концентрації тритерпенів, так і від тривалості їхньої дії. Наприклад, для крес-салату рістінгібуючий ефект тритерпеноїдів до закінчення досліду зменшувався, тоді як для редьки і салату –збільшувався.
При обробці насіння тест-об'єктів водним екстрактом коренів M. cretacea виявлено його негативний вплив на проростання насіння редьки, салату і крес-салату, але в меншій мірі порівняно з розчинами сумарної фракції тритерпеноїдів (таблиця 4) Для редьки і крес-салату чіткої залежності проростання насіння від концентрації водного екстракту із коренів не виявлено: протягом усього періоду дослідження відсоток пророслих насінин не змінювався. У дослідах із салатом відсоток проростання насіння змінювався протягом трьох діб. Не виявлено чіткої залежності проростання насіння і росту коренів проростків від концентрації препарату.
Таблиця 4
Вплив сумарної фракції тритерпенових глікозидів і водних екстрактів з коренів M. cretacea на ріст коренів проростків салату, крес-салату і редьки
Таким чином тритерпенові глікозиди проявляли значну рістрегулюючу активність на проростання насіння і ріст коренів досліджених рослин.
В широкому діапазоні концентрацій виявлено негативний вплив екстрактів з різних органів M. cretacea на культури бактерій S. albus, S. cіtreus, S. anhaemolіtіcus, N. meningitides, N. flava, S. kauffmani, S. flexnerі (Рис. 4).
а в
Рис. 4. Діаметр (мм) зон пригнічення росту бактеріальних культур: а) водними, в) спиртовими екстрактами різних органів M. сretacea 1. S. albus, 2. S. citreus, 3. S. anhaemoliticus, 4. N. meningitides, 5. N. flava, 6. S. kauffmani, 7. S. flexneri
Біологічна активність (еквівалентних концентрацій препаратів в перерахунку на суху речовину) спиртових екстрактів була у два рази вищою ніж дія водних. Найбільшу антимікробну дію на бактеріальні культури виявлено для екстракту з коренів рослини.
Дослідженням антимікробної дії сумарної фракції тритерпенових глікозидів в концентрації 1,0 мг/см виявлено високу інгібіторну активність препарату як для грампозитивних так і для грамнегативних бактерій (рис. 5). Найбільше пригнічення росту колоній бактерій екстрактом тритерпеноїдів відмічено у S. albus і S. flexneri. Значно слабшою була дія у варіантах з N. flava. В концентраціях 0,5 мг/смбактерицидний ефект був в два рази меншим. В нижчих концентраціях дія препарату була незначна або відсутня.
а в
Рис. 5. Діаметр (мм) зон пригнічення росту бактеріальних культур: а) сумарною фракцією тритерпеноїдів коренів M. cretacea в) сумарною фракцією флавоноїдів квіток M. cretacea у концентрації 1,0 мг/см. 1. S. albus, 2. S. citreus, 3. S. anhaemoliticus, 4. N. meningitides, 5. N. flava, 6. S. kauf-fmani, 7. S. flexneri
Сумарна фракція флавоноїдів M. сretacea в концентрації 1,0 мг/см виявила найбільшу пригнічуюючу дію на ріст бактеріальних культур. Найвища ефективність препарату відмічена в культурах S. albus (78,4% відносно ампіциліну), S. citreus і S. anhaemoliticus. В той же час гальмування росту S. kauffmani було 52,3%.
Антибактеріальна активність кверцетину і його глікозидів з квіток M. cretacea була на 30% нижчою в порівнянні з сумарною фракціею флавоноїдів (у адекватних концентраціях). Найбільше пригнічення росту бактеріальних культур обумовлювали рутин і кверцетин 3-O-глюкозил-глюкозид. Максимальна антимікробна активність щодо S. albus і S. citreus (відповідно 69% і 67% відносно ампіциліну). Найменш активним був кверцетин (35,1% відносно ампіциліну).
Таким чином, для виділених нами препаратів встановлена рістрегулююча дія на проростання насіння і ріст коренів проростків редьки, крес-салату і салату. Для цих речовин також встановлена антимікробна дія щодо патогенних бактерій S. albus, S. cіtreus, S. anhaemolіtіcus, N. meningitides, N. flava, S. kauffmani, S. flexnerі.
ВИСНОВКИ
Вперше досліджено кількісний і якісний вміст тритерпеноїдів і флавоноїдів в різних органах рослини Melilotoides cretacea протягом вегетації. Максимальне накопичення тритерпенових глікозидів виявлено в період цвітіння в коренях, а флавоноїдів у квітках рослин.
Із семи виділених з рослини флавоноїдів ідентифіковано п'ять: кверцетин, кверцетин-3-О-глюкозид, кверцетин-7-О-глюкозид, кверцетин-3-О-глюкозил-рамнозид, кверцетин-3-О-глюкозил-глюкозил. Кверцетин-7-О-глюкозид і кверцетин-3-О-глюкозил-глюкозид присутні в рослинах у найвищих концентраціях. Серед фенольних сполук ідентифіковано фенольні кислоти і рутин. Із виявлених 19 сполук тритерпенової природи ідентифіковано олеанолову кислоту.
Показана рістрегулююча активність тритерпеноїдів M. cretacea на модельних об'єктах (салат, крес-салат і редька).
Встановлена антибактеріальна дія тритерпенових глікозидів щодо грампозитивних (Staphylococcus albus, S. cіtreus, Streptococcus anhaemolіtіcus) і грамнегативних (Nesserіa menіngіtіdes, N. flava, Salmonella kauffmanі, Shіgella flexnerі) бактерій. Антимікробна дія спиртових екстрактів з коренів зумовлена наявністю тритерпенових сполук, а для спиртової витяжки з квіток як тритерпеноїдів, так і флавоноїдів.
Проведені дослідження дозволяють віднести рослину M. сretacea до перспективних джерел природних фармакологічних препаратів.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Палий А.Е., Губанова Т.Б., Ежов В.Н., Фадеев Ю.М., Кинтя П.К. Оценка биологической активности суммарного экстракта тритерпеноидов Melilotoides cretacea // Бюллетень ГБС. –. –Вып. 186. –С. 226–. (Здобувач спланував досліди, брав участь в збиранні експериментального матеріалу, його аналізі і написанні статті)
Палий А.Е., Сластья Е.А., Ежов В.Н. Сезонная динамика накопления тритерпенов Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak // Вестник биосферного заповедника “Аскания Нова”. –. –№5. –С. 87–. (Здобувач спланував досліди, брав участь в збиранні експериментального матеріалу, його аналізі і написанні статті, сформулював висновки).
Палий А.Е. Тритерпеновые и фенольные соединения Melilotoides cretacea // Труды Никит. ботан. сада. –. –Т. 123. –С. 98–.
Палий А.Е. Фенольные соединения Melilotoides cretacea // Бюл. Никит. ботан. сада. –. –Вып. 87. –С. 101-103.
Палий А.Е. Сравнительный анализ состава тритерпеновых гликозидов родов Melilotoides и Melilotus // Вісник Запорізького державного університету. –. –№1. –С. 173–.
Кочкарева (Палий) А.Е. Тритерпеновые гликозиды Melilotoides cretacea // Современные научные исследования в садоводстве: Материалы VIII международной конференции по садоводству (11–сентября 2000 г.) Ч. 3. –Ялта, 2000. –С. 36–.
Кочкарева (Палий) А.Е., Фадеев Ю.М. Биологический потенциал тритерпеновых гликозидов Melilotoides cretacea // Лесные биологически активные ресурсы: Материалы международного семинара (19–сентября 2001г.) –Хабаровск: ККБ-ХКЦПЗ, 2001. –С. 308.
Кочкарева (Палий) А.Е., Фадеев Ю.М., Ежов В.Н. Тритерпеновый состав и систематическое положение Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak // Сучасні проблеми інтродукції рослин та збереження біорізноманіття екосистем: Матеріали міжнародної наукової конференції (10–вересня 2002 р.). –Чернівці: Рута, 2002. –С. 55.
Палий А.Е. Тритерпеновые соединения Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak // Фізіологія рослин та екологія: Матеріали науково-практичної конференції (23–квітня 2003 р.). –Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2003. –С. 21.
Палий А.Е. Рострегулирующее и аллелопатическое действие тритерпеновых соединений корней Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak // Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика, биофизика 2005”: Материалы Всеукраинской научно-технической конференции (4–апреля 2005 г.). –Севастополь, 2005. –С. 142–.
АНОТАЦІЯ
Палій А.Є. Тритерпенові і фенольні сполуки Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 –біохімія. –Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2006.
Дисертацію присвячено дослідженню біологічно активних речовин Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak. Встановлено, що у всіх частинах рослини присутні тритерпенові глікозиди. Максимальна кількість тритерпенів M. cretacea накопичується в коренях у період цвітіння. Виявлено 19 речовин тритерпенової природи, серед яких ідентифіковано олеанолову кислоту. У стеблах і листках виявлено фенольні кислоти і рутин, а в квітках –флавоноїди. Із семи присутніх у рослині флавоноїдів ідентифіковано п'ять: кверцетин, кверцетін-3-O-глюкозид, кверцетін-7-O-глюкозид, кверцетін-3-O-глюкозіл-рамнозид (рутин), кверцетин-3-O-глюкозіл-глюкозид.
Виявлено, що тритерпеноїди M. cretacea мають різні види біологічної активності: антибактеріальна активність відносно грампозитивних і грамнегативних бактерій, і рістінгібуюча (негативно впливають на проростання насінь і ріст коренів проростків тест-об'єктів).
Показано, що M. cretacea можна вважати перспективним джерелом кверцетину та його глікозидів і тритерпенів з високою біологічною активністю.
Ключові слова: тритерпени, флавоноїди, Melilotoides cretacea, біологічна активність.
АННОТАЦИЯ
Палий А.Е. Тритерпеновые и фенольные соединения Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak. –Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 –биохимия. –Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2006
Диссертация посвящена исследованию биологически активных веществ Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak. Впервые определено качественное и количественное содержание тритерпеноидов и флавоноидов корней, стеблей, листьев и цветков M. cretacea в течение вегетации. Установлено, что M. cretacea содержит 19 веществ тритерпеновой природы, 16 из которых присутствуют в корнях. Максимальное количество тритерпенов накапливается в корнях растения в период цветения (25 мг/г сухого вещества). Из корней M. cretacea выделен суммарный препарат тритерпеновых гликозидов, который разделен на три фракции: малополярная (агликоны), средней полярности (монозиды и биозиды) и высокой полярности (триозиды и тетразиды). Среди тритерпеновых гликозидов растения идентифицирована олеаноловая кислота и моносахариды: арабиноза,
16
ксилоза, глюкоза, галактоза и рамноза. Установлено, что у растений M. cretacea, собранных в западном и восточном Крыму качественное и количественное содержание тритерпеноидов совпадает, в то же время не обнаружено сходства в качественном составе тритерпеновых гликозидов M. cretacea и видов рода Melilotus, что свидетельствует об удаленности этих таксонов друг от друга.
В надземной части M. cretacea обнаружены тритерпеноиды, но доминирующее положение занимают вещества фенольной природы. Максимальная концентрация фенольных веществ обнаружена в цветках –мг/г сухого вещества. В стеблях и листьях обнаружены фенольные кислоты и рутин, а в цветках –флавоноиды. Из семи присутствующих в растении флавоноидов идентифицированы пять: кверцетин, кверцетин-3-O-глюкозид, кверцетин-7-O-глюкозид, кверцетин-3-O-глюкозил-рамнозид (рутин), кверцетин-3-O-глюкозил-глюкозид.
Выявлено, что тритерпеноиды M. cretacea обладают различными видами биологической активности. Суммарная фракция тритерпеноидов и водные экстракты корней M. cretacea уменьшают всхожесть семян и задерживают линейный рост корней проростков тест-объектов.
Определение антибактериальной активности суммарных фракций тритерпеновых гликозидов и флавоноидов показало их высокую эффективность в отношении как граммположительных, так и грамотрицательных бактерий. Высокой антибактериальной активностью обладают спиртовые экстракты корней и цветков растения, содержащие тритерпеновые и фенольные соединения.
Показано, что Melilotoides cretacea можно считать перспективным источником кверцетина, гликозидов кверцетина и тритерпенов с высокой биологической активностью.
Ключевые слова: Тритерпены, флавоноиды, Melilotoides cretacea, биологическая активность.
SUMMARY
Paliy A.E. Triterpene and phenol compounds of Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak. –Manuscript.
Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 03.00.04 –biochemistry. –Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2006.
Dissertation is devoted to the investigations of biological active substances of Melilotoides cretacea (M. Bieb.) Sojak. It was determined that triterpene glycosides are present in all parts of plant. The most amount of triterpenes in M. cretacea is accumulated in the roots of plant during the period of flowering. It was discovered exposed 19 substances of triterpene nature in M. cretacea. Among them oleanolic acid was identified. Phenol acids and rutin were found in the stems and leaves, and flavonoids were found in the flowers. Among seven flavonoids which was extracted from the plant. Five of them
were identified: quercetin, quercetin-3-O-glucoside, quercetin-7-O-glucoside, quercetin-3-O-glucosyl-rhamnoside (rutin), quercetin-3-O-glucosyl-glucoside.
It is shown that triterpene compounds of M. cretacea have different kind of biological activity: antibacterial activity to the Gram-positive and Gram-negative bacteria and growth inhibitory activity (have negative influence on seeds germination and germs roots growth of the test-objects).
We concluded that M. cretacea is a perspective source of quercetin and glycosides of quercetin and triterpenes with high biological activity.
Key words: triterpenes, flavonoids, M. cretacea, biological activity.
Підписано до друку 05.04.06 р. Формат 60х84 1/16
Ум. друк. арк. 0,7. Наклад 100 прим. Зам. № 211
Друкарський цех Никітського ботанічного саду-
Національного наукового центру.
НБС-ННЦ, смт. Нікіта, м. Ялта, АРК, 98648