Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» |
Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы
С2.Б.11 ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ.
Направление подготовки 111801 Ветеринария
Профиль подготовки
Специализация Ветеринарная фармация
Квалификация выпускника - специалист
Уфа 2013
Лабораторная работа.
Лабораторная диагностика сибирской язвы.
3.1 Цель занятия. Ознакомить студентов со свойствами возбудителя, схемой лабораторной диагностики сибирской язвы, биопрепаратами.
3.2 Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма B. anthracis на МПА, в МПБ, мазки с феноменом “ожерелья”, сибиреязвенная прицепитирующая сыворотка, стандартный антиген, пробирки Уленгута, штативы, пипетки Пастера, сибиреязвенная биопрепараты.
3.3 Теоретический материал.
3.3.1 Сибирская язва. Острое инфекционное заболевание сельскохозяйственных животныхмногих видов, а также человека; характеризуется признаками септицемии или образованием карбункулов, у свиней часто протекает с поражением заглоточных лимфатических узлов.
Возбудитель сибирской язвы – бактерия Bacillus anthracis, род Bacillus.
Материал для исследования. В лабораторию направляют ухо от трупа животного, перевязанное у основания (ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп), или кровь из надреза уха в виде толстого мазка на двух предметных стеклах (чтобы исключить попадание возбудителя на внешнюю среду, место разреза прижигают шпателем); от трупов свиней – заглоточные лимфатические узлы и участки отечной соединительной ткани. Если подозрение на сибирскую язву возникло в ходе вскрытия, его прекращают и на исследование направляют часть селезенки.
Нативный материал помещают в чистую посуду (пробирки, банки). Высушенные мазки кладут в чашки Петри, которые оборачивабт плотной бумагой. На бумаге делают надпись «Мазок не фиксирован!» Посуду с материалом помещают во влагонепроницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись «Верх. Осторожно!» и с сопроводительными документами нарочным направляют в лабораторию.
Микроскопия. Возбудитель представляет собой грамположительные прямые палочковидные бактерии размером (1…1,5)(6…10) мкм, без жгутиков, образует спору и капсулу.
Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, окрашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Гимзы, Ольта и т.д.), а также сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В окрашенных мазках из трупного материала возбудитель обнаруживают в виде крупных грамположительных палочковидных бактерий, располлогающихся одиночно, парами, короткими цепочками. В отдельных случаях, особенно в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые или зернистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий.
Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил материал, дают немедленно по результатам микроскопического исследования.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Факультативный анаэроб, температурный оптимум 35…37С, рН 7,2…7,4. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и инкубируют в аэробных условиях 18…24 ч, а при отсутствии роста – до 48 ч.
На МПА М. аnthracis формирует плоские, матово-серые, шероховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные колонии без отростков. Края колонии R-формы под малым увеличением микроскопа имеют вид локонов, получивших название “львиная грива” (рис. ). В МПБ рост возбудителя характеризуется образованеим на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде; после встряхивания осадок разбивается на хлопья. Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыворотку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуется гладкие колонии S-формы, а в МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды.
В выросших культурах исследуют морфологические и тинкториальные свойства клеток. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают длинные цепочки из грамположительных типичных палочек; в мазках из культур на средах с диффузным ростом находят отдельные или парные палочки (рис. ). На бессывороточных средах бактерии капсулу не образуют, на сывороточных средах возбудитель формирует капсулу, причем клетки в препарате в последнем случае чаще располагаются одиночно или парами.
При значительной контаминации материала посторонней микрофлорой (сырье животного происхождения, объекты внешней среды) посев делают на селективный агар следующего состава: расплавленный МПА – 100 мл, сульфат полимиксина М – 0,5 мл, невиграмон – 0,5 мл, гризеофульвин – 1 мл, моющее средство «Прогресс» - 10 мл, фенолфталеинфосфат натрия – 0,1 мл; перемешивают, разливают по чашкам Петри. Через 18…24 ч культивирования на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри наносят 1…2 мл 25%-го водного раствора аммиака, чашку переворачивают. Колонии B. аnthracis остаются бесцветными, колонии бактерий с фосфатазной активностью розовеют.
Биопроба. Заражение лабораторных животных исходным материалом – обязательный этап, проводимый сразу после поступления материала в лабораторию. Тканевой суспензией заражают подкожно двух белых мышей по 0,2…0,5 мл или морских свинок по 0,5…2 мл. наблюдение ведут в течение 10 сут. При наличии возбудителя животные погибают обычно через 1…3 сут. Павших животных исследуют с выделением культуры возбудителя.
Если в ходе указанных исследований выделена бактерия, типичная для B. аnthracis по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, патогенная для лабораторных животных, то дальнейшие исследования не проводят и диагноз считают установленным.
В случае получения нечетких результатов при вышеизложенных исследованиях проводят дополнительные с целью дифференциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл, и в первую очередь от B. cereus. При этом определяют способность микроорганизма к капсулообразованию путем посева на сывороточные среды, патогенность для лабораторных животных в биопробе, чувствительность к пенициллину, сибиреязвенному бактериофагу, спцифичность к сибиреязвенным люминесцирующим сывороткам, гемолитическую активность, наличие жгутиков.
Тест «жемчужного ожерелья» разработан для определения чувствительности выделенного микроорганизма к пенициллину. В две колбочки (пробирки) с расплавленным МПА (температура 45…50С) добавляют пенициллин из расчета 0,05…0,5 ЕД/мл и переносят в две чашки Петри, в третью чашку наливают обычный МПА. После застывания агара из него вырезают пластинки размером 1,5 см2, которые переносят на предметные стекла и помещают в чашки Петри. На каждую пластинку бактериологической петлей наносят исследуемую 3-часовую бульонную культуру. Чашки выдерживают 1…3 ч в термостате. Затем посевы просматривают под микроскопом с объективом 40 и иммерсионной системой. Перед просмотром зону роста накрывают покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином приобретают шаровидную фоорму, а цепочки – вид «жемчужного ожерелья». Спорообразующие сапрофитные аэробы в аналогичных условиях растут в обычной форме. На агаре без пенициллина сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки из типичных палочек.
Для определения чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу культуру или материал засевают на скошенный МПА, затем на поверхность среды наносят каплю бактериофага в рабочем титре и посевы выдерживают при температуре 37…38С 24 ч. в случае принадлежности культуры к B. anthracis на зоне МПА в зоне нанесения бактериофага остается стерильная зона при наличии роста микроорганизма на остальных участках среды.
Для идентификации B. anthracis методом люминесцирующих антител используют флуоресцирующую адсорбированную сыворотку, не дающую перекрестных реакций с антигенно-родственными сапрофитными бациллами.
Гемолитическую активность исследуемой культуры определяют посевам на 5%-м МПА или в МПБ.
Наличие жгутиков исследуют посевом в 0,3%-й МПА или методом «раздавленной капли».
Если для исследования поступил загнивший материал, который нельзя подвергать обычному бактериологическому исследованию, то диагноз ставят на основании обнаружения антигенов возбудителя в материале при помощи реакции кольцевой преципитации.
Материал экстрагируют физиологическим раствором (соотношение 1:10) путем кипячения в течение 30…40 мин (горячий способ). Экстракцию смеси тканевой суспензии и карболизированного физиологического раствора (соотношение 1:10) можно проводить в течение 16…18 ч при комнатной температуре (холодный способ). Экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют в РП.
Реакцию ставят методом «наслаивания» или «подслаивания». При «наслаивании» в преципитационную пробирку вносят 0,2…0,3 мл преципитирующей сыворотки и осторожно наливают (наслаивают) исследуемый экстракт таким образом, чтобы компоненты не перемешивались. При «подслаивании» в пробирку вначале вносят 0,2…0,3 мл экстракта, затем под него пастеровской пипеткой – равное количество сибиреязвенной приципетирующей сыворотки. Одновременно ставят контроли (см. далее). Реакцию считают положительной, если через 1…2 мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появился тонкий беловатый диск преципитации.
В ветеринарных лабораториях часто исследуют на сибирскую язву в РП кожвенно-меховое сырье. В лаборатоорию доставляют пробы кожвенного сырья в виде небольших квадратиков (или кружков), взятых от шкур в местах, вырез которых не снижает товарной ценности. Эти пробы нанизывают на тонкую проволочку в том порядке, в котором шкуры расположены на складе. Поступившие пробы обязательно стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм 30 мин. Затем пробы измельчают и берут навески: 1г – от парного, мороженого, пресно-сухого и сухосоленого сырья и 2г – от мокросоленого. Пробы заливают экстаргирующей жидкостью (физиологический раствор, содержащий 0,3% кристаллического фенола).
Пробы сырья от всех видов животных экстрагируют холодным способом при комнатной температуре в течение 16…20 ч; пробы от свиных шкур кипятят 30 мин.