Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ
Генетика изучает наследственность и изменчивость организмов. Клетка — основа строения и жизнедеятельности всех животных и растений, поэтому все явления наследственности и изменчивости могут быть поняты только на основе изучения строения клетки и ее функций. Раздел генетики, который изучает явления наследственности и изменчивости на основе цитологических методов, получил название цитогенетики.
Объектом цитогенетических исследований является клетка и в особенности хромосомы, их морфология, биохимия и физиология. Изучение клетки ведется преимущественно с помощью светового микроскопа.
Для изучения морфологии клетки, помимо обычной световой микроскопии, применяют поляризационную, фазово-контрастную, люминесцентную, ультрафиолетовую микроскопию, что позволяет изучать клетку в живом состоянии, а также определять химический состав клетки в целом и отдельных ее органелл. В последние годы для изучения клетки широко используют электронные микроскопы, позволяющие рассматривать органеллы клетки размером 8—10 А (1 ангстрем равен 0,0000001 мм). Это дает возможность рассматривать предельно мелкие клеточные структуры и даже отдельные молекулы.
№1 практическая работа. Строение генетических структур клетки. Изучение поведения хромосом в процессе клеточных делении.
Задание. Внимательно рассмотреть клетки, находящиеся в интерфазе, профазе, метафазе, анафазе и телофазе, и зарисовать их. Особое внимание обратить на хромосомы.
Материал и оборудование. 1. Препарат с продольными срезами корешков лука или любого другого растения, 2. Микроскоп. 3. Рисовальный аппарат.
Пояснения к заданию. Митоз (кариокинез) — сложный тип деления, протекающий в соматических клетках и являющийся основным способом их размножения. Совокупность процессов, происходящих в клетке между двумя делениями, называется митотическим циклом.
В процессе митоза происходит сначала удвоение, а затем точное равномерное распределение наследственного материала, содержащегося в хромосомах, между двумя вновь возникающими клетками. В результате митоза из одной материнской клетки образуются 2 дочерние. Ядро каждой дочерней клетки имеет, как правило, такой же набор хромосом, какой был в исходной материнской клетке. Разделение же цитоплазмы и ее органелл (пластид, митохондрий, рибосом и др.) между дочерними клетками совершается не с такой правильностью, поэтому дочерние клетки не всегда бывают одинаковыми по размеру, форме и включениям в цитоплазму. Между двумя митотическими делениями клетка растет, функционирует, подготавливаясь к последующему митозу. Это состояние клетки называется интерфазой.
В интерфазе ядро имеет шаровидную или эллипсоидную форму и сравнительно гомогенное строение. В нем бывает хорошо видно одно или несколько ядрышек. В интерфазе идет подготовка клетки к митозу, протекают сложные биохимические процессы: редупликация (удвоение) молекул ДНК, синтез простых белков (гистонов) и других веществ, необходимых для прохождения митотического цикла.
В интерфазе различают 3 периода: G1 (пресинтетический), S (синтетический, на котором происходит синтез ДНК) и G2 (постсинтетический).
В процессе митоза различают 4 последовательно идущие фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу (рис. 1).
Профаза. Различают раннюю и позднюю профазу. На ранней профазе ядро клетки сохраняет тот же вид, что и в интерфазе, но в нем появляются нити хроматинового вещества. В поздней профазе усиливается спирализация хроматиновых нитей, в результате чего они приобретают форму, присущую хромосомам данного вида, становятся более плотными и короткими.
Рис. 1. Митоз в клетках корешка лука:
1-интерфаза; 2,3 — профаза; 4 — метафаза; В — анафаза; 6 — телофаза; 7 — цитокинез.
Каждая хромосома, состоящая из двух хроматид, спирально скрученных и соединенных центромерой, четко проявляется. В конце профазы происходит фрагментация ядерной оболочки и исчезновение ядрышек.
Метафаза. В этой фазе хромосомы концентрируются в центре клетки и располагаются в одной плоскости, образуя так называемую метафазную (экваториальную) пластинку. Центромера каждой хромосомы, скрепляющая обе хроматиды, располагается строго в плоскости экватора клетки, а плечи хромосом бывают вытянуты более или менее параллельно нитям веретена. В метафазе хорошо выявляется число хромосом, форма и строение каждой хромосомы, особенно если рассматривать клетку с полюсов. В метафазе окончательно формируется митотический аппарат— ахроматиновое веретено. Оно состоит из нитей, тянущихся от одного полюса клетки к другому. Нити веретена состоят из фибриллярных белков.
Анафаза. Эта фаза митоза начинается с одновременного деления центромер всех хромосом данной клетки. Сразу же после деления центромер хроматиды каждой хромосомы начинают отталкиваться друг от друга и расходиться к противоположным полюсам клетки. В это время их уже следует называть сестринскими (дочерними) хромосомами. Все сестринские хромосомы начинают двигаться к полюсам одновременно и довольно быстро. В первую очередь отталкиваются центромерные участки хромосом, а затем — конечные участки плеч. Если хромосома по какой-либо причине утратила центромеру, то она не может самостоятельно двигаться к полюсу и нарушает картину нормального течения анафазы. Фрагмент такой хромосомы может сохраниться в клетке только в том случае, если он присоединится к другой хромосоме, имеющей центромеру. Движение хромосом в анафазе происходит при взаимодействии двух процессов: сокращения тянущих нитей веретена, связывающих, хромосомы с полюсами клетки, и удлинения опорных нитей веретена, связывающих оба полюса.
Телофаза. В начале телофазы заканчивается движение хромосом и в клетке начинаются структурные преобразования: дочерние хромосомы деспирализуются и утрачивают видимую индивидуальность. Образуется ядро, окруженное оболочкой, восстанавливаются ядрышки (одно или несколько) в том же количестве, в каком они были в ядре материнской клетки, происходит постепенное разрушение и разделение всего содержимого клетки. Этот процесс образования двух новых клеток называется цитокинезом, или плазмотомией. Он начинается с того, что в экваториальной части материнской клетки утолщаются нити веретена и между ними образуется клеточная перегородка.
Выполнение задания. Изучать фазы митоза лучше всего на постоянных препаратах продольных срезов корешков лука или других растений. Для этой цели корешки фиксируют по Навашину, окрашивают гематоксилином по Гейденгайну. Если нет постоянных микротомных препаратов, можно использовать давленные временные или полупостоянные препараты.
Препарат помещают на столик микроскопа, при объективе Х9 находят соответствующую фазу митоза, затем переводят на объектив Х40 или X90, изучают и. зарисовывают клетки, находящиеся в различных фазах митоза, обращая внимание на состояние ядра, ядерной оболочки, ядрышка, цитоплазмы. Особенно внимательно следует рассмотреть состояние хромосом в каждой фазе митоза.
№2 практическая работа. Знакомство с материалами и оборудованием цитогенетического практикума.
Задание. 1. Ознакомиться с устройством микроскопа. 2. Установить микроскоп в рабочее положение. 3. Освоить работу с иммерсионной системой.
Материал и оборудование. 1. Постоянный препарат. 2. Микроскоп. 3.Осветитель.
Пояснения к заданию. Для проведения цитологических исследований в генетике чаще всего пользуются микроскопами МБР-3, М.БИ-3 или МБИ-6. Для занятий лучше всего использовать микроскопы МБР-1, МБР-3.
К микроскопу типа МБР-3 должен быть придан осветитель ОИ-19, обеспечивающий оптимальное освещение препарата. Микроскоп соединяется с осветителем соединительной планкой.
Осветитель ОИ-19 состоит из корпуса и зажимного устройства, с помощью которого корпус осветителя закрепляется на вертикальной колонке в определенном положении. Источником света в осветителе служит специальная лампочка СУ-61 (8 В, 20 Вт), которая питается .через понижающий трансформатор. Для регулировки накала лампочки в корпусе трансформатора имеется реостат с рукояткой, а для включения тока — выключатель.
Выполнение задания.
1. Установить микроскоп в удобное для работы положение. Бинокулярную насадку привести также в положение, удобное для глаз работающего (сдвинуть или раздвинуть окуляры).
2. Тщательно протереть чистой мягкой тряпочкой и специальной кисточкой все части микроскопа — окуляры, объектив, зеркало и др.
3. Правильно установить объективы в револьвере. Они должны стоять последовательно (Х9, Х40, Х90) по часовой стрелке.
4. С помощью соединительной планки установить осветитель ОИ-19 перед микроскопом и через трансформатор включить его в сеть. Поворачивая корпус осветителя, направить световой поток на плоское зеркало. С помощью зеркала направить свет в объектив.
5. Поместить исследуемый препарат в препаратоводитель и сфокусировать его при объективе Х9.
6. Конденсор микроскопа поднять в верхнее положение и закрыть полевую диафрагму. Отверстие диафрагмы осветителя уменьшить до 1—2 мм. На плоское зеркало положить листок белой бумаги. Перемещая лампочку вдоль оси, добиться четкого изображения нити лампочки на бумаге.
7. Снять бумагу с зеркала и, двигая корпус осветителя, переместить изображение нити лампочки в центр полевой диафрагмы.
8. Слегка перемещая вверх и вниз конденсор, получить резкое изображение диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа (она имеет вид окружности ярко освещенного кружка).
9. Слегка поворачивая зеркало, установить изображение диафрагмы осветителя в центре поля зрения микроскопа. После этого диафрагму осветителя следует немного открыть (диаметр около 1,5 см).
10. Опустить конденсор, .чтобы обеспечить равномерное освещение всего поля зрения.
11. Чтобы определить оптимальный диаметр отверстия полевой диафрагмы, ее вначале нужно закрыть полностью, а затем, глядя в окуляр, слегка приоткрыть, чтобы ее края совпадали с краями задней линзы объектива.
12. Еще раз проверить фокусировку объекта при объективе Х9. Пользуясь препаратоводителем, установить в поле зрения исследуемую часть препарата — клетку с метафазной пластинкой при изучении кариотипа или подсчете хромосом, зародышевый мешок и т. д.
13. Исследовать препарат можно либо при объективе Х40, либо при иммерсионном объективе Х90. В последнем случае сразу после установки соответствующего объектива следует поднять конденсор, чтобы обеспечить лучшее освещение объекта.
14. При работе с иммерсионным объективом Х90 нужно предварительно сфокусировать и центрировать объект при объективе Х40, затем нужно нанести по капле иммерсионного масла на верхнюю линзу конденсора и покровное стекло и установить объектив Х90.
15. После окончания работы с линзы конденсора, объектива микроскопа и препарата иммерсионное масло удаляют чистой тряпочкой, смоченной бензином.
16. Во время перерыва и после окончания работы препарат вынимают, микроскоп устанавливают на объектив Х9 и накрывают чехлом. Осветитель выключают из сети во избежание его перегрева.
№3 практическая работа. Составление картограмм. Вычисление и анализ линейных параметров хромосом.
Задание. 1. Ознакомиться с особенностями морфологической классификации хромосом по Г. А. Левитскому. 2. На постоянном препарате найти хорошие метафазные пластинки и зарисовать хромосомы.
Материал и оборудование. 1. Постоянный препарат поперечного среза корешка ржи или другого растения. 2. Микроскоп. 3. Рисовальный аппарат или окулярная сетка. 4. Окуляр-микрометр. 5. Карандаш. 6. Иммерсионное масло.
Пояснения к заданию. Хромосомы каждого вида растений или животных имеют свои морфологические особенности и определенные размеры. Строение хромосом лучше всего выявляется в метафазе митоза, когда они укорочены и расположены в экваториальной плоскости.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рис. 2. Различные типы хромосом:
1,7 — метацентрические (равноплечие); 2 — субметацентрическая (слабо неравноплечая); 3,4, 5 — акроцентрические (резко неравноплечие); 6 —телоцентрическая; 8 — акроцентрическая со вторичной перетяжкой; 9 — спутничная. Центромеры обозначены светлым кружком.
Г. А. Левитским в 1931 г. разработана методика описания морфологии хромосом. Им же были разработаны способы фиксации, позволяющие выявить морфологические особенности строения хромосом.
Изучение морфологии хромосом, измерение длины каждой хромосомы и ее частей привело Г. А. Левитского к мысли о наличии единого принципа построения хромосом, как бы они не были различны по форме на первый взгляд. Каждая метафазная хромосома имеет вид толстой нити различной длины и обязательно имеет центромеру (кинетохор), к которой прикрепляется нить веретена, осуществляющая в митозе расхождение хроматид к полюсам клетки. Центромера может находиться в разных частях хромосом, но местоположение ее специфично для соответствующей хромосомы данного вида. Центромера делит хромосому на 2 плеча и тем самым определяет ее форму (рис. 2). Если центромера лежит строго посредине, то хромосома называется равноплечей, или метацентрической. Если центромера располагается ближе к тому или другому концу, то хромосомы называются неравноплечими, или акроцентрическими. Разница между длиной плеч может колебаться в довольно широких пределах. Если меньшее плечо представлено ничтожно малым участком хромосомы, ее называют палочковидной, или телоцентрической. Участок плеча хромосомы, расположенный ближе к центромере, называют проксимальным, а отдаленный от центромеры — дистальным. Отношение длины большого плеча. Длине меньшего называют плечевым индексом. Метацентрические хромосомы имеют плечевой индекс 1—1,3, субметацентрические—1,4—1,6, акроцентрические— 1,6 —3 и более.
Рис. 3. Хромосомы скерды зеленой (Crepis capillaris); одинаковыми буквами помечены гомологичные хромосомы.
Кроме положения центромеры, форму хромосомы определяет так называемое вторичное расчленение — наличие на концах хромосом своеобразных придатков различной величины и формы, отделенных от хромосомы вторичной акинетической перетяжкой (ниточкой или стерженьком).
Придаток хромосомы С. Г. Навашин назвал спутником. Спутники сильно варьируют по форме и величине.
Выполнение задания. Удобное растение для изучения строения хромосом — скерда зеленая (рис. 3). Строение хромосом лучше всего изучать у видов, имеющих их небольшое число; из культурных растений — лук, рожь, кормовые бобы, горох и некоторые другие. Для приготовления постоянных препаратов лучше использовать фиксатор Левитского, состоящий из 10%-ного формалина и 1%-ной хромовой кислоты, смешанных в различных пропорциях (7:3; 4:6; 5:5 и т. д.). Эти пропорции для вида растений обычно подбирают эмпирически. Окрашивать препараты лучше всего реактивом Шиффа по Фельгену, но можно также гематоксилином по Гейденгайну, ацетокармином или ацетоорсеином.
Постоянные препараты, приготовленные для изучения морфологического строения хромосом, рассматривают под микроскопом при объективе Х9 и окуляре Х15 и отмечают хорошие метафазные пластинки. Затем при иммерсионном объективе Х90 и окуляре ХЮ с помощью рисовального аппарата или окулярной сетки карандашом рисуют контуры каждой хромосомы. На рисунке следует отметить местонахождение центромеры, а также спутника и акинетической перетяжки (если они имеются). Затем с помощью окуляр;микрометра, цена деления которого заранее определена, измеряют в микронах длину каждого плеча хромосомы, определяют отношение короткого и длинного плеч хромосомы и составляют идиограммы хромосомных наборов изученных видов.
№4-практическая работа. Знакомство с биологией и морфологией дрозофилы. Постановка опытов по скрещиванию дрозофил, различающихся по изучаемым признакам.
Ряд разделов генетики — хромосомная теория наследственности, определение пола, множественный аллелизм, мутагенез и другие разработаны на дрозофиле (плодовой, или уксусной, мухе). Дрозофила — удобный объект для теоретических исследований. Она легко размножается в лабораторных условиях, имеет короткий цикл развития, исключительно плодовита, обладает четко выраженными морфологическими признаками. Благодаря большому числу спонтанных и индуцированных мутантных рас, часто характеризующихся четким проявлением измененных признаков, небольшому числу хромосом она может служить модельным объектом при проведении ряда лабораторных работ со студентами.
Биология развития дрозофилы. Дрозофила— небольшая серая муха, длина тела которой около 3 мм, с ярко красными глазами, с нормально развитыми крыльями, превышающими по длине тело. Питается дрозофила ферментируемыми фруктами или овощами. В лаборатории ее разводят на специальной питательной среде. Яйцо дрозофилы длиной около 0,5 мм, снабжено двумя отростками, при помощи которых оно держится на поверхности среды. Самки откладывают яйца вскоре после оплодотворения. В благоприятных условиях каждая самка откладывает до 50—80 яиц в сутки, а всего в течение 3—4 суток она может отложить более 200 яиц.
В лабораторных условиях личинки появляются из яиц через 20—24 ч после оплодотворения. Личиночный период состоит из трех стадий. Первая и вторая стадии заканчиваются линьками, третья — окукливанием, которое начинается примерно через 4 суток после вылупления из яйца. Первое время после вылупления личинок из яйца они находятся на поверхности среды, затем уходят вглубь, интенсивно питаются, а перед окукливанием покидают среду, перестают питаться и некоторое время ползают по стенкам стаканчика или пробирки. Затем они становятся неподвижными, значительно сокращаются в длину и приобретают характерную для куколки форму. В состоянии куколки они находятся примерно 4 суток.
Рис. 4. Дрозофила: 1 — самка; 2 — самец.
За это время разрушаются личиночные органы и формируются органы взрослой мухи. Только гонады и нервная система не претерпевают разрушения. В конце стадии куколки сквозь оболочку просвечивают темные участки тела, хорошо видны глаза, особенно, если они имеют яркую окраску.
Молодые, только что вылупившиеся мухи, имеют более длинное желтоватое тело, почти лишенное пигмента, короткие, еще не расправленные крылья. Через 8 ч самки уже способны к оплодотворению. Для скрещивания необходимо брать девственных самок, не старше 8 ч после вылупления. Самки начинают откладывать яйца с конца вторых суток и продолжают до конца жизни мухи.
Самки дрозофилы отличаются от самцов по чине и ряду других морфологических признаков (рис. 4). Они обычно несколько крупнее самцов, конец брюшка у них заостренный, в то время как у самца форма брюшка округлая. Последние сегменты брюшка у самок пигментированы значительно слабее, чем у самца. Кроме того, у самцов имеются так называемые половые гребешки в виде ряда крепких хитиновых щетинок на первом членике передних ног. Однако этот признак можно различить только под бинокулярной лупой, поэтому в практической работе ориентируются преимущественно на форму и пигментацию брюшка.
Инвентарь и оборудование, необходимые при работе с дрозофилой.
1. Стаканчики из толстого стекла высотой 5—7 см и диаметром 2,5—3 см. 2. Тонкий глазной пинцет и мягкая кисточка. 3. Молочно-белое стекло размером 5 см X 10 см. 4. Бинокулярная лупа или небольшие настольные лупы различных конструкций с увеличением не менее Х4. 5. Часовое стекло. 6. Капельница для серного эфира. 7. Эфиризатор, или морилка. Эфиризатор может быть специальный любой конструкции, либо — обычный стаканчик, закрытый корковой пробкой с ватным тампоном. 8. Бутыль с небольшим количеством керосина или отходов спирта (1/4 часть ее объема). В эту бутыль выбрасываются ненужные мухи после анализа. 9. Вата для изготовления пробок. 10. Кастрюля и плитка для приготовления питательной среды. 11. Мензурка, весы, карандаш, этикетки, тушь.
Питательные среды и их приготовление. Главные составные части питательных сред для дрозофилы — дрожжи и сахар. В питательную среду обычно добавляют агар-агар. Он придает среде желеобразную консистенцию. Агар-агар должен быть светлым, прозрачным, хорошо очищенным от химических примесей. Ниже приводится ряд наиболее распространенных и доступных рецептов приготовления питательных смесей, рассчитанных примерно на 50 пробирок.
Рецепты наиболее распространенных сред
Изюм 150 г
Агар-агар 6 г
Картофель 200 г
Изюм 150 г
Агар-агар 4г
Дрожжи 30 г
Изюм 25 г
Манная крупа 18 г
Агар-агар 5 г
Сахар 8 г
Дрожжи 40 г
Манная крупа 13 г
Сахар 13 г
Агар-агар 4,5 г
Методика приготовления среди по рецепту III. Дрожжи тщательно растирают и помещают в дистиллированную воду, налитую в алюминиевую кастрюлю или в фарфоровый стакан. Тщательно перемешивая, доводят до кипения. Из изюма предварительно удаляют косточки, тщательно промывают его, растирают в фарфоровой ступке и кладут в кипящую воду с дрожжами.
Смесь варят на слабом огне при тщательном перемешивании в течение 45 мин. Затем в нее засыпают манную крупу и варят еще 25 мин. Агар-агар предварительно замачивают в дистиллированной воде в течение 30—40 мин, после чего кладут в кипящую среду и кипятят 3—5 мин. Если вода выкипит, ее добавляют до первоначального объема. Готовую среду охлаждают до 50—60 °С и разливают в тщательно вымытые и простерилизованные пробирки или стаканчики (примерно на 1 —1,5 см их высоты), покрывают чистой марлей и еще раз охлаждают до комнатной температуры. В таком виде среду можно использовать либо сразу после охлаждения, либо через некоторое время. Хорошо приготовленная среда может храниться в холодильнике 3—4 суток в стаканчиках или пробирках, закрытых ватными пробками.
Перед тем как поместить мух на среду в стаканчики, поверхность среды засевают дрожжами. Для этого свежие дрожжи разводят в дистиллированной воде до консистенции сливок, мягкой кисточкой одну каплю переносят на поверхность среды и дают ей подсохнуть. В приготовленные таким образом стаканчики со средой переносят мух либо для размножения, либо специально подобранные пары для скрещивания. По такой же методике готовят среды и по другим рецептам.
Дрожжи для приготовления сред должны быть обязательно свежими, среда не слишком твердой (молодые личинки не могут проникнуть в глубь твердой среды и погибают) и не слишком жидкой (в жидкой среде могут погибнуть отложенные яйца).
Наркотизация мух. Анализ и подсчет мух, а также отбор девственных самок и подбор родительских пар для скрещивания проводят на матово-белом стекле под лупой после того, как их усыпят серным эфиром.
Для этой цели мух помещают в эфиризатор (морилку) или, если специального эфиризатора нет, в обычную пробирку или стаканчик, в которых размножают мух. К. этому стаканчику подбирают плотную корковую пробку, в нижней части которой делают углубление. В это углубление вставляют плотный ватный тампончик, смачиваемый из капельницы по мере надобности 1—2 каплями серного эфира. Стаканчик с мухами осторожно постукивают об ладонь (мухи при этом собираются в нижней его части), затем осторожно снимают ватную пробку, накрывают стаканчик эфиризатором и опрокидывают так, чтобы стаканчик с мухами был наверху. Легким постукиванием стаканчика о ладонь всех мух переводят в эфиризатор и закрывают его пробкой с ватным тампоном, смоченным одной каплей эфира. Как только заснет последняя муха, их осторожно вытряхивают из эфиризатора на молочно-белое стекло и, пользуясь лупой и мягкой кисточкой, быстро подсчитывают, так как в наркотизированном состоянии они могут находиться только около 5 мин. Если наркотизацию следует продлить, мух накрывают большим часовым стеклом, под которое вкладывают ватный тампон, смоченный одной каплей эфира. Если эти мухи нужны для последующего размножения, их помещают в чистые пробирки с питательной средой, засеянной дрожжами. В одну пробирку для размножения следует помещать 2—3 самки и 3—5 самцов. Для того чтобы сонные мухи не упали на дно пробирки и не увязли в среде, их помещают на чистую стенку стаканчика со средой, и держат стаканчик в горизонтальном положении до тех пор, пока мухи не проснутся.
По окончании работы с мухами их усыпляют и выбрасывают. От большой дозы эфира мухи погибают через 3—5 мин. О их гибели можно заключить по растопыренным кверху и в стороны крыльям и безжизненно вытянутым лапкам.
Всю работу с дрозофилой и результаты наблюдений фиксируют в соответствующем журнале. Форма журнала может быть различной, но в нем должны быть точно зафиксированы дата постановки опыта или размножения линии, основные сведения о родительских парах, взятых для гибридизации, результаты анализа и т. д.
|
Дата |
стаканчика |
Линия или гибридная комбинация |
Результаты анализа |
|
2 февраля |
8 |
Normal (размножение) |
февраля получено 120 мух, из них 60 самок и 60 самцов |
|
14 февраля |
14 |
F1 Normal X vestigial |
1 марта получено 146 мух, вес с нормальными крыльями, 76-самок и 70-самцов |
№5-практическая работа. Анализ результатов моногибридного скрещивания. Генетическая символика скрещиваний. Статистический анализ результатов скрещивания.
Задание. 1. Отобрать виргинных самок. 2. Поставить скрещивание в соответствии с разработанным заданием. 3. Получить F1 и проанализировать его. 4. Поставить на скрещивание мух F1. 5. Получить F2 и проанализировать его.
Материал и оборудование. 1. Стаканчики со средой — по 2 на каждого студента для получения и по 4—6 для получения F2. 2. Соответствующие мутанты и мухи дикого типа. 3. Оборудование, необходимое для работы с дрозофилой.
Пояснения к заданию. Отбор виргинных самок. Для постановки опытов по скрещиванию необходимо в качестве материнских форм брать заведомо девственных (виргинных) самок не старше 10—12 ч после вылупления. С этой целью в пробирках, где идет размножение соответствующих линий мух, удаляют родительские особи и вылупившихся из куколок мух. Через 6—8 ч пробирки или стаканчики просматривают, и если появились молодые мухи, их усыпляют, отделяют самцов от самок, .помещают в отдельные пробирки с питательной средой. Там они могут находиться в течение 2—4 суток. По мере надобности их используют для скрещивания.
Эту работу удобно организовать следующим образом. За 4—8 ч до начала занятий из пробирки удаляют всех мух. Пробирку с куколками ставят в термостат с температурой 24—26 °С на 4—8 ч. Мух, вылупившихся из куколок за этот период, используют для скрещивания,
Желательно в каждом случае ставить реципрокные (прямые и обратные) скрещивания. Гибриды F1, как и обычные линии, размножаются внутри себя без" отбора виргинных самок, поэтому после анализа гибридов F1 самцов и самок помещают в пробирки со ,свежей средой для получения F2. На протяжении всего опыта, а он от момента постановки скрещивания и до получения F2 продолжается 20—24 дня, следует внимательно следить за состоянием мух и обеспечить все условия для их нормального развития.
При проведении моногибридного скрещивания учащиеся должны ознакомиться с первым и вторым законами Менделя, усвоить понятия о генотипе, фенотипе, доминантных и рецессивных признаках, о реципрокных, возвратных и анализирующих скрещиваниях. Для постановки опыта в качестве одной из родительских форм следует взять линию дикого типа (Normal), а в качестве второй родительской формы можно взять одного из мутантов — Lobe, vestigial, cinnabar, ebony, brown, curved и др.
Весьма удобно провести следующие прямые и обратные (реципрокные) скрещивания, позволяющие изучить наследование доминантных и рецессивных признаков: Normal Х Lobe
Lobe Х Normal
vestigial Х Normal
Normal Х vestigial
Выполнение задания.
1. Вначале следует составить схему и определить теоретически ожидаемое наследование признаков в F1 и F2.
2. В соответствии с подобранной комбинацией скрещивания 2—3 виргинные самки поместить вместе с 3—5 самцами в стаканчик со свежей средой.
3. Через 10—12 дней после постановки опыта, когда в стаканчике будет массовое вылупление мух F1, их, следует усыпить и проанализировать. Все они как в прямом, так и в обратном скрещивании будут одинаковыми по признаку формы глаз —глаза у них будут лопастными, как и у доминантного родителя.
4. В каждой комбинации для получения F2 следует провести скрещивание внутри себя. С этой целью среди анализируемых мух F1 отобрать 2—3 самки и 3—5 самцов и поместить в пробирки со свежей средой. В каждой комбинации для получения F2 поставить по 2—3 и более пробирки.
5. Через 10—12 дней в стаканчиках начнется массовое вылупление мух F2. Их следует усыпить в эфиризаторе и проанализировать на матово-белом стекле. При внимательном просмотре отделить и подсчитать мух с лопастными глазами (Lоbе). Затем отделить и подсчитать мух с нормальными глазами. Их будет примерно 1 /2 от общего числа.
6. Одновременно можно провести опыт по возвратному скрещиванию. Для этого в F1 отобрать виргинные самки и поместить их по одной в пробирки вместе с самцами одной из родительских форм (доминантной или рецессивной).
7. При постановке этого опыта предварительно разработать его схему.
8. Через 10—12 дней в стаканчиках начнется массовое вылупление мух. Их поместить в эфиризатор, усыпить и проанализировать по признаку строения глаз.
Анализ мух от возвратного скрещивания F1 с доминантной родительской формой показывает, что все они имеют лопастные глаза, как и мутанты Lоbе. В скрещивании F1 с рецессивной родительской формой (анализирующее скрещивание) 1 /2 часть мух имеет лопастные глаза, а 1 /2 — нормальные. Такой результат скрещивания свидетельствует о том, что мухи F1 гетерозиготны.
Таким же образом могут быть проведены скрещивания и проанализированы гибриды Normal с любым мутантом, у которого соответствующий ген локализован во II, III или IV хромосомах.
№6-практическая работа. Анализ результатов ди- и полигибридных скрещиваний. Решение генетических задач.
Задание. 1. Ознакомиться с основными закономерностями наследования признаков при дигибридном скрещивании, открытыми Г. Менделем. 2. Изучить исходные (родительские) растения по анализируемым признакам. 3. Проанализировать растения гибридов первого поколения и установить характер наследования двух рассматриваемых признаков, выявить доминантные и рецессивные признаки. 4. Проанализировать растения гибридов второго поколения и установить характер наследования изучаемых признаков. 5. Определить с помощью решетки Пеннета. теоретически ожидаемое расщепление в F1. 6. Рассчитать фактически полученное расщепление в F1
Материал. 1. Пять растений материнского и пять растений отцовского сортов. 2. Семена F1. 3. Семена F2.
Пояснения к заданию. Дигибридным называют такое скрещивание, при котором родители отличаются друг от друга по двум парам альтернативных признаков, или в случае, если у гибридов учитываются только 2 пары признаков.
Г. Мендель использовал для дигибридного скрещивания гомозиготные растения гороха, различавшиеся по двум парам признаков: например, окраске и форме семян. Было обнаружено, что при таком скрещивании расщепление по каждой паре признаков в отдельности происходит так же, как и при моногибридном скрещивании— в отношении 3:1, т. е. независимо от другой пары альтернативных контрастирующих признаков. В опыте Г. Менделя, в котором родители отличались по окраске семян и по форме, в F2 соотношение желтых и зеленых семян составило 3:1; отношение числа гладких семян к морщинистым тоже 3:1,
Для гибридологического анализа при дигибридном скрещивании можно использовать те же 2 сорта гороха, которые рекомендованы для анализа гибридов при моногибридном срещивании, т. е. Московский 559, имеющий гладкие зеленые семена, и Неистощимый 195 с морщинистыми желтыми семенами. Можно использовать и другие виды растений: например, многорядные и гладкоостые сорта ячменя Гейтуэй или Паркленд (Канада) и двурядный с зазубренными остями сорт Винер. Как и в случае анализа при моногибридном скрещивании, работа может быть выполнена летом в поле или в лаборатории зимой.
Теоретически ожидаемое расщепление в F2 при дигибридном скрещивании рассчитывают при помощи решетки Пеннета. Для этого следует предварительно выяснить генотип семян F1, от которых мы получаем потомство, а также генотипы родительских форм, использованных для получения семян F1. Если фактор гладкой формы семян обозначим буквой В, морщинистой—буквой b, фактор желтой окраски буквой А и зеленой — буквой а, то генотипы родительских сортов и гибрида будут обозначены следующим образом: Неистощимый 195 — ААbb, Московский 559 — ааВВ, F1 — АаВЬ. Далее необходимо выписать все типы гамет, какие могут образоваться в F1:АВ, Аb, аВ и аb.
Предположим, что у гороха в F1 с равной вероятностью образуются перечисленные выше типы гамет как в мужских, так и в женских генеративных органах.
При построении решетки Пеннета слева по вертикали записывают типы женских гамет, сверху по горизонтали— типы мужских гамет (рис. 5). Все возможные комбинации, которые могут быть при слиянии гамет (оплодотворении), записывают на соответствующих пересечениях. На решетке Пеннета удобно подсчитать число желтых гладких, желтых морщинистых, зеленых гладких и зеленых морщинистых семян. Результат подсчета дает теоретически ожидаемое расщепление по фенотипу семян F2 (отношение 9:3:3:1).
Выполнение задания.
2. Вылущить бобы с растений отцовского сорта, подсчитать число семян; убедиться в том, что все семена зеленые гладкие.
3. Вылущить семена F1 из бобов; убедиться, что все семена одинаковы по окраске (желтые) и по форме (гладкие). Записать в тетрадь, какая окраска и форма семян являются доминантными и рецессивными признаками.
4. Вылущить семена F2 из бобов. Разделить все семена F2 на 4 группы по сочетанию окраски и формы: желтые гладкие, желтые морщинистые, зеленые гладкие, зеленые морщинистые.
5. Сосчитать число семян в каждой группе, установить соотношение между числом семян в группах. Все полученные данные занести в таблицу.
6. Для выяснения поведения каждой пары генов в потомстве дигибрида следует каждую пару признаков учесть отдельно. Так как расщепление по каждой паре признаков происходит в отношении 3:1, можно ожидать, что из общего числа семян F2 (1440) 3/4 будут желтыми и 1/4 зелеными. В нашем примере получено отношение 1075 (желтых) : 365 (зеленых), или 2,94:1, т. е. близкое 3:1. Подсчет числа гладких и морщинистых семян показывает, что и по этому признаку расщепление идет в отношении 3:1 (1080:360).
№7-практическая работа. Количественный анализ наследования признаков методом хиквадрат. Взаимодейтвие неаллельных генов: комплиментарность, эпистаз.
Комплиментарность
Задание. 1. Ознакомиться с понятием о комплементарном взаимодействии генов. 2. Изучить исходные (родительские) растений по рассматриваемому признаку. 3. Установить характер наследования признака у растений F1. 4. Установить характер наследования признака в F2; выявить наличие факта комплементарного взаимодействия генов. 5. Определить соответствие фактически полученного в F2 расщепления теоретически ожидаемому.
Материал. 1. 20—40 растений или главных колосьев ячменя материнского сорта ГБ-18. 2. 20—40 растений или главных колосьев отцовского сорта Вииер. 3. 20—40 растений или главных колосьев гибридов первого поколения (F1). 4. 80—100 и более растений или главных колосьев гибридов второго поколения (F2).
Пояснения к заданию. Обычно при моно- и дигибридном скрещивании наблюдается взаимосвязь аллельных генов. Однако у многих организмов (растений и животных) известны случаи взаимодействия неаллельных генов. Один из типов взаимодействия неаллельных генов — комплементарное действие генов, открытое впервые Бэтсоном и Пеннетом у душистого горошка. Комплементарными называют неаллельные гены, которые при совместном действии в гомозиготном или гетерозиготном состоянии вызывают развитие нового признака, отсутствовавшего у родителей. Например, две белоцветковые расы душистого горошка при их скрещивании дали растения F1 с пурпурными цветками.
Во втором же поколении гибридов (F2), полученного самоопылением F1, наблюдалось расщепление по окраске цветков на пурпурные и белые в отношении 9 : 7. Такой тип наследования был объяснен следующим образом. Предположили, что каждая родительская форма имела лишь один из доминантных неаллельных генов. Их генотипы можно записать как ААЬЬ и ааВВ. Наличие в генотипе обоих доминантных генов как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии определяет появление пурпурной окраски цветков. Так как растения F1 содержат оба доминантных гена (АаВЬ), то они имеют пурпурную окраску цветков. При самоопылении же в F2 происходит расщепление таким образом: 9/]6 имеют оба доминантных гена (А и В), что обусловливает их пурпурную окраску, 6Лб имеют лишь по одному из двух доминантных генов (А или В) и 1/16 имеет лишь рецессивные гены, что обусловливает белую окраску цветков. Таким образом, 7/16 имеют белую окраску цветков.
Такое объяснение проверено и подтверждается анализирующим скрещиванием.
Для анализа комплементарного действия генов можно использовать 2 сорта ячменя — Голозерный безостый 18 (ГБ-18) селекции Л. Е. Ходькова и сорт Винер. Сорт ГБ-18 имет безостый двурядный колос.
При скрещивании ГБ-18 с остистым сортом Винер растения F1 имеют фуркатный колос, у которого вместо остей имеются трехлопастные придатки. В F2 наблюдается расщепление на 9 фуркатных, 3 остистых и 4 безостых.
Задание можно выполнять либо в поле во время летней учебной практики, либо в лаборатории. Для занятий в лаборатории зимой готовят снопики из главных колосьев материнского и отцовского сортов, растений F1 и F2. Для летних занятий растения родительских сортов и гибридов выращивают в гибридном питомнике на рядом расположенных делянках.
Выполнение задания.
1. Осмотреть колосья сорта ГБ-18 и убедиться в том, что колос у них безостый.
3. Осмотреть растения F1 и убедиться, что они фуркатные—вместо остей на цветочных чешуях развиваются трехлопастные придатки.
Комплементарное взаимодействие генов у ячменя
|
Родительские сорта и гибриды |
Проанализировано растений |
Расщепление |
||||
|
Всего |
Фуркатных |
остистых |
безостых |
теоретически ожидаемое |
фактически полученное |
|
|
♀ сорт ГБ-18 |
40 |
0 |
0 |
40 |
- |
- |
|
♂ сорт Винер |
40 |
0 |
40 |
0 |
- |
- |
|
F1 ГБ-18 Х Винер |
20 |
20 |
0 |
0 |
- |
- |
|
F2 ГБ-18 Х Винер |
160 |
86 |
32 |
42 |
9:3:4 |
8,6:3,2:4,2 |
Эпистаз
Задание. 1. Ознакомиться с понятием эпистаз. 2. Изучить родительские растения тыквы по окраске плода. 3. Проанализировать растения F1, по окраске плодов. 4. Проанализировать растения F2, по окраске плодов, установить характер расщепления и определить тип взаимодействия генов.
Материал. 1. 1—2 растения тыквы с белыми плодами. 2. 1—2 растения тыквы с зелеными плодами. 3. 5—10 растений тыквы F1. 4. 20—30 растений тыквы F2,.
Пояснения к заданию. Эпистазом называется такой тип взаимодействия генов, при котором доминантный ген одной аллельной пары подавляет действие доминантного гена другой аллельной пары. При этом ген, подавляющий действие другого гена, называется эпистатичным, а подавляемый—гипостатичным. Если, например, ген А подавляет ген В, то эпистаз можно выразить формулой А>В. Ген А эпистатичен по отношению к гену В, а ген В гипостатичен по отношению к гену А. Пример эпистаза — наследование окраски плодов у тыквы. Она бывает белой, желтой, зеленой и, как предполагают, обусловлена двумя парами генов. Ген, обусловливающий отсутствие окраски (белые плоды), эпистатичен по отношению к генам, обусловливающим как зеленую, так и желтую окраску плодов. При скрещивании белоплодных растений, имеющих генотип WWYY, и зеленоплодных растений, имеющих генотип wwуу, в F1 все растения имеют белые плоды.
В F2, наблюдается расщепление в отношении 12/16 растений с белыми плодами, 3/16 растений с желтыми плодами и 1/16 растений с зелеными плодами. Такое расщепление можно объяснить тем, что в присутствии в генотипе гена W никакая другая окраска плодов у тыквы не проявляется, поэтому растения, имеющие генотипы W-Y, W-yу, имеют белую окраску плодов. У растений, имеющих генотипы wwУУ и wwУ, плоды будут желтыми. Зеленые плоды будут только у растений с генотипом wwуу.
Выполнение задания. 1. Записать число осмотренных родительских растений. 2. Определить окраску плодов у растений F1 и данные записать в табл. 15. 3. Определить на растениях F2, фактически полученное расщепление по окраске плодов и установить тип взаимодействия генов.
Рис. 5. Наследование окраски и формы семян угорох
Р-родители; Ғ1-гибрид первого поколения; Ғ2-гибриды второго поколения; А-ген желтой окраски; а-ген зеленой окраски семян; В-гладкая; b-морщинистая форма семян.
Полученные данные свидетельствуют о независимом наследовании двух пар признаков —окраски и формы семян гороха.
При этом растения гибридов второго поколения при дигибридном скрещивании по форме и окраске семян можно разделить на 4 группы: около 9/6 растений F3 будут иметь желтые гладкие семена, около 3/16 — желтые морщинистые, около 3/16 — зеленые гладкие, 1/16 — зеленые морщинистые. Фактически получено расщепление 9 \ 3 : 3 : 1.
8-практическая работа. Наследование количественных признаков. Полимерия. Аддитное действие генов.
Задание. 1. Ознакомиться с понятием полимерия. 2. Изучить родительские растения по окраске семян. 3. Изучить F1 по окраске семян, установить характер наследования окраски семян, выявить доминантный и рецессивный признаки. 4. Проанализировать F1 по окраске семян, установить характер наследования этого признака.
Рис. 6. Наследование окраски зерна у пшеницы при полимерном взаимодействии геов.
Материал. 1. Одно-два растения материнского сорта. 2. Одно-два растения отцовского сорта. 3. Два-три растения F1. 4. Десять-двадцать растений F2.
Пояснения к заданию. Полимерией называется такое явление, при котором развитие того или иного признака организма обусловлено взаимодействием двух или более доминантных неаллельных генов, оказывающих сходное воздействие на развитие этого признака. Такие гены называются полимерными, или .множественными.
Явление полимерии открыто в 1908 г. шведским генетиком Нильссоном-Эле. Он изучал наследование окраски зерен у гибридов, полученных при скрещивании краснозерных и белозерных форм пшеницы. В F2 он обнаружил в одних случаях расщепление по окраске зерна в отношении 3:1, как при простом моногибридном скрещивании; в других наблюдалось расщепление в отношении 15/16 краснозерных и 1/16 белозерных. Встречались случаи расщепления в отношении 63/64 краснозерных и 1/64 белозерных. Было также отмечено, что в F2 красные зерна не имели единообразной окраски: она варьировала от темно-красной до бледно-красной (рис. 6).
Нильссон-Эле предположил, что расщепление в F2 в отношении 15: 1 объясняется тем, что в формировании красной окраски зерна участвуют 2 однозначных (имеющих сходное действие на развитие признака) доминантных гена, например А1 и А2. Рецессивные же аллели этих генов а1 и а2 обусловливают отсутствие красной окраски, или белую окраску зерен; при этом число доминантных генов в генотипе определяет интенсивность окраски зерен: чем больше доминантных генов в генотипе, тем интенсивнее окраска зерен. Иначе говоря, действие доминантных полимерных генов в данном случае суммируется. Такое взаимодействие полимерных генов называется кумулятивной полимерией. Группы же генов, имеющих кумулятивное действие, называют полигенами.
В рассматриваемом случае наследования окраски зерна у пшеницы при полимерии только 1/16 всех зерен, гомозиготных по обоим рецессивным генам (а1а1а2а2), будет белой, 1/16 (генотип А1А1А2А2)—самой темно-красной, а остальные 14/16 зерен будут иметь различную интенсивность окраски в зависимости от числа доминантных генов в генотипе. В случае, когда расщепление в F2 оказалось 63/64 окрашенных и 1/16 неокрашенных зерен, предположили, что в формировании красной окраски зерна участвуют 3 однозначных доминантных гена. И в этом случае наблюдались все переходы от интенсивно окрашенных зерен до почти совсем белых.
Полимерия может быть некумулятивной, если каждый доминантный полимерный ген в отдельности оказывает такое же действие на развитие признака, как и сумма нескольких доминантных полимерных генов. Такие гены называются олигогенами.
По типу полимерии наследуются такие признаки, как продолжительность вегетационного периода, длина колоса, длина початка кукурузы и другие хозяйственно-важные признаки.
При полимерном наследовании признаков трудно в F2 выявить четко различимые фенотипические группы; получается непрерывный ряд изменчивости по полимерному признаку. Кроме того, изменчивость, которая вызвана полимерными генами, часто трудно отличима от изменчивости, вызванной воздействием внешней среды, что затрудняет изучение полимерии.
Выполнение задания. 1. Обмолотить 1—2 растения сорта Диамант, убедиться в красной окраске зерен, сосчитать их.
2. Обмолотить 1—2 растения сорта Альбидум 43, убедиться в белой окраске зерен, сосчитать их.
3. Обмолотить 2—3 растения F1, сосчитать зерна, убедиться в доминировании красной окраски.
4. Обмолотить 5—10 растений F2, разделить зерна на несколько групп: красные, белые и с промежуточной окраской различной интенсивности. Сосчитать зерна в каждой группе.
Все полученные при выполнении задания данные внести в таблицу.
5. Сделать вывод о наличии или отсутствии полимерного наследования.
№9-практическая работа. Моделирование репликации ДНК и процессов транскрипции и трансляции у прокариот в норме и в различных типов генных мутации.
Мутациями называют внезапные наследственные изменения у отдельных особей, в результате которых организм приобретает новые признаки и свойства. Мутационные изменения могут затрагивать самые разнообразные признаки и свойства организмов.
Мутации могут быть спонтанными, возникающими в природе, и индуцированными, вызванными воздействием различных факторов, называемых мутагенами. Различают следующие типы мутаций:
1. Генные мутации — наследственные изменения, ведущие к появлению новых аллелей и не связанные с цитологически доказуемыми перестройками хромосом.
2. Хромосомные мутации — изменения структуры хромосом вследствие их разрывов и перестроек.
3. Геномные мутации — кратные изменения целых хромосомных наборов (полиплоидия) или изменения числа хромосом в них (анеуплоидия).
4. Плазменные мутации — изменения цитоплазматических наследственных компонентов.
Задание. 1. Ознакомиться с различными методами получения мутаций у растений. 2. Обработать мутагеном семена ячменя сорта Вйнер.
Материал и оборудование. 1. Семена ячменя сорта Винер. 2. Мутаген этиленимин. 3. Вытяжной шкаф. 4. Сосуд для обработки семян мутагеном.
Пояснения к заданию. Для успешного получения мутаций важно подобрать оптимальные для процесса мутирования условия (вид мутагена, его доза, физиологическое состояние организма и т. д.). Повышенные дозы мутагенов (как физических, так и химических) снижают долю хозяйственно-ценных мутаций. Оптимальные дозы мутагена специфичны не только для различных видов растений, но и. для отдельных сортов.
Чаще всего воздействуют мутагеном на семена. Первое поколение растений, полученное от обработанных любым мутагеном семян, обозначается М1, второе поколение — М2 и т. д.
Работать следует очень осторожно в вытяжном шкафу, так как. мутагены представляют собой сильные яды. Обрабатываемых семян в каждом варианте должно быть столько, чтобы в поле выжило около 1000 растений.
Растения (М1), выращенные из обработанных мутагеном семян, часто угнетены, частично или полностью стерильны, но среди них встречаются и внешне вполне нормальные. Для растений М1 следует создавать наиболее благоприятные условия. Отбирают ценные мутанты во втором поколении (М2), так как большинство мутаций, будучи рецессивными, выявляются лишь в М2.
У пшеницы, ячменя и других злаков в М2 колосья могут быть генетически различны, и потому для получения семей М2 семена каждого колоса М1 высевают отдельно. Семена выявленных в М2 мутантных растений высевают отдельно для проверки наследования измененных признаков в М3. Для обнаружения так называемых малых мутаций, т. е. мутаций, фенотипически неотличимых, семена от отдельных растений М2 высевают для получения М3, а затем растения М3 подвергают биометрической обработке по тем или другим показателям. Только в результате такой обработки удается выделить малые мутации, которые имеют большую ценность, так как они касаются таких количественных признаков, как урожайность, белковость, масличность и др. Отбирают лучшие по малым мутациям семьи, начиная с М4. Желательно в М2 иметь 400—500 семей. Семян, подвергаемых воздействию мутагена, должно быть в 2—3 раза больше, чем семей в М2, которые желательно получить, поскольку растения в М1 частично гибнут.
Мутабильность сортов различна и зависит от их наследственных особенностей. Обычно в качестве исходного материала для получения мутаций рекомендуется использовать районированные сорта.
Выполнение задания.
№10-практическая работа. Мутации. Критерии множественного аллелизма.
Задание. 1. Ознакомиться с типами структурных изменений хромосом и методами их изучения. 2. Определить митотическую активность в меристеме корешков лука-батуна после обработки мутагеном и сравнить с контролем. 3. Установить наличие и процент аберраций хромосом у мутантов. 4. Определить типы аберраций.
Материал и оборудование. 1. Препараты срезов корешков лука-батуна (контрольных и после обработки мутагенами проросших семян). 2. Микроскоп с рисовальным аппаратом.
Пояснения к заданию. Любым структурным изменениям хромосомы предшествует ее разрыв, при котором получаются два новых «клейких» конца. Такие «клейкие» концы способны соединиться с любым другим (но только «клейким») концом. Если соединяются концы, возникшие при одном разрыве, восстанавливается целость хромосомы — структурных изменений не происходит. В случае же соединения концов, возникших при разных разрывах, получается новое расположение генов в хромосоме, т. е. появляются структурные изменения хромосом.
Характер хромосомных аберраций зависит от состояния, хромосомы в момент воздействия мутагенного фактора. Если хромосома находится в состоянии одиночной нити, то в период S интерфазы она удваивается и аберрация сохраняется в обеих хроматидах, т. е. возникают хромосомные аберрации (рис.7). Если мутаген действует на хромосому, находящуюся в состоянии двойной нити (периоды S и G2 интерфазы, профаза и метафаза митоза), аберрация может образоваться в каждой нити отдельно. В этом случае возникают так называемые хроматидные аберрации.
Рис. 7. Характер перестроек хромосом в митотическом цикле клетки.
Различают внутри и межхромосомные аберрации. К внутрихромосомным относятся делеции, инверсии и дупликации.
Делеция (нехватка)—выпадение участка хромосомы, содержащего один или несколько генов. В случае утери хромосомой концевого участка возникает концевая делеция, при утере внутреннего участка — интерстициальная делеция.
Инверсия — разрыв хромосомы в двух местах одновременно с сохранением внутреннего участка, который поворачивается на 180°. Инверсия может быть парацентрической, если оба разрыва происходят в одном плече хромосомы, или перицентрической, если разрывы происходят по обе стороны от центромеры (в обоих плечах одновременно).
Дупликация — удвоение одного и того же участка хромосомы, содержащего одни и те же гены.
Межхромосомными аберрациями называют структурные изменения, затрагивающие одновременно две или более негомологичные хромосомы. К таким структурным изменениям хромосом относятся транслокации.
Транслокация — обмен участками между негомологичными хромосомами.
Организмы, в клетках которых имеются хромосомные аберрации, чаще всего бывают маложизнеспособны или нежизнеспособны.
Изучение хромосомных аберраций можно проводить двумя методами — метафазным и анафазным. Метафазныи метод заключается в анализе аберраций в метафазе митоза. Он довольно точен, но в связи с тем, что у многих растений хромосомы распознавать в метафазе трудно, его используют лишь для объектов, имеющих четко различимые хромосомы, например скерды. Анафазный метод предусматривает анализ хромосомных аберраций в анафазе митоза. Чаще всего они представляют собой мосты (рис. 8.) и фрагменты. Их образование можно, например, представить так, что при разрыве обеих хроматид в результате репликации образуются две сестринские хромосомы с разрывом в одном и том же месте. В дальнейшем при соединении концов сестринских хромосом, как правило, получаются две новые хромосомы: одна без центромеры (ацентрическая), другая с двумя центромерами (дицентрическая). В анафазе митоза дицентрическая хромосома одновременно тянется к обоим полюсам, образуя мост. Ацентрическая хромосома (фрагмент) располагается случайно и в дальнейшем элиминируется. В описанном случае происходит дупликация и делеция одновременно. Если в анафазе образуются не мосты, а лишь беецентромерные фрагменты,— значит, налицо структурные изменения типа делеций. Удобный объект для изучения хромосомных аберраций — проросшие семена лука-батуна, ячменя и других растений, предварительно обработанные химическими мутагенами или облученные гамма-лучами в соответствующей дозе.
Изучение хромосомных аберраций следует проводить в самом начале прорастания корешков, на первых митотических делениях клеток меристемы.
Выполнение задания. 1. Семена лука-батуна замачивают на 50 ч при температуре 24 °С. К этому времени корешки обычно достигают длины 5 мм.
Рис.8. Анафаза митоза в меристематической клетке зародышевого кроешка ячмена после воздействия мутагена.
№11-практическая работа. Геномные мутации. Микроскопический анализ препаратов хромосом с целью изучения различных форм гетероплоидии.
Задание. 1. Ознакомиться с наиболее широко применяемыми методами получения полиплоидов. 2. Провести колхицинирование проростков ржи. 3. Высадить полученные проростки в ящики. 4. Подсчитать число хромосом на временных или постоянных препаратах, приготовленных из точек роста проростков.
Материал и оборудование. 1. Семена ржи. 2. Чашка Петри диаметром 8—10 см. 3. Раствор колхицина (концентрация 0,25%). 4. Ящик с почвой. 5. Микроскоп. 6. Препарат (постоянный или временный), приготовленный из точки роста проростка, выросшего из колхицинированного семени.
Пояснения к заданию. Методов получения полиплоидных растений довольно много. Большая часть этих методов основана на колхицинировании. Колхицин — желтовато-белый или белый порошок; он относится к группе алкалоидов; добывают его из растения — безвременника осеннего. Слабые растворы этого вещества парализуют процесс образования тянущих нитей веретена. Поэтому в митозе хромосомы не расходятся к полюсам, клетка не делится, и образуется ядро с тетра-плоидным (2пХ2) набором хромосом. Если на образовавшиеся тетраплоидные клетки продолжать воздействие колхицином, то могут возникнуть окто-плоидные клетки, а если действовать колхицином на последующие деления, то число хромосом в клетках может увеличиться в 4, 8, 16 и более раз. Но обычно такое увеличение числа хромосом снижает жизнеспособность клеток и даже обусловливает их гибель.
Для получения полиплоидов чаще всего используют 0,1—0,25%-ный водный раствор колхицина, которым обрабатывают прорастающие семена или верхушки Молодых побегов, находящиеся в состоянии интенсивного деления клеток. Следует избегать попадания раствора колхицина на корни, так как это ослабляет тетраплоидные растения.
При обработке растений с длинным подсемядольным коленом (например, проростки гречихи) используют следующий метод. В чашке Петри на фильтровальной бумаге проращивают семена, разложив их по периметру чашки. Когда проростки достигнут длины 4—6 см, чашку с проростками вставляют в другую, большего диаметра, в которую наливают 0,05%-ный раствор колхицина. Проростки пригибают таким образом, чтобы семядоли и конус нарастания находились в растворе колхицина, налитого в чашку большего диаметра. Через 12—24 ч их вынимают, прополаскивают в воде и сажают в почву.
Полиплоидные растения можно получать и другим методом. На молодые проростки, почки, побеги накладывают ватный тампон, смоченный колхицином. Для этого пинцетом осторожно отодвигают в стороны молодые листочки и между ними вкладывают как можно глубже ватный тампон, чтобы он находился в непосредственной близости от точки роста. Лучше всего тампон вкладывать вечером и следить, чтобы он все время находился во влажном состоянии. Ежедневно тампон смачивают раствором колхицина. Через 2—5 дней вату снимают, и верхушки побегов промывают водой. Рост обработанных побегов приостанавливается, они сильно утолщаются, появляются толстые мясистые листья. Через 2—4 недели рост побега возобновляется.
При колхицинировании значительная часть растений погибает; это нужно учитывать и брать для опыта семена в достаточном количестве.
Полиплоиды можно получать также с помощью аценафтена. Он действует слабее, но не вызывает у обработанных побегов такой сильной депрессии в росте, как колхицин. Аценафтен слабо растворим в воде, поэтому растения обрабатывают им преимущественно следующими способами.
1. Семена покрывают влажной фильтровальной бумагой, на которую сверху насыпают порошок аценафтена. Семена выдерживают таким образом 2— 4 дня, а затем высаживают в поле.
2. Молодые сеянцы, выращенные в горшках в теплице, прикрывают химическим стаканом, смазанным внутри ланолином, на который насыпано 2—4 г аценафтена. Через день стакан снимают.
Выполнение задания. 1. В чашке Петри на фильтровальной бумаге прорастить в течение 2—3 дней семена ржи районированного сорта.
2. Когда колеоптиле достигнет 2—4 мм длины, поместить проростки в 0,25%-ный водный раствор колхицина. Для этой цели в чистую чашку Петри, имеющую диаметр на 1—2 см меньше, чем фильтровальная бумага, на которой проращиваются семена, наливают раствор колхицина.
Бумагу с проростками вынимают из чашки Петри и перевертывают таким образом, чтобы верхушки проростков оказались в растворе колхицина, а корни прикрыть сверху бумагой, чтобы они не высыхали.
3. Через 30 мин проростки вынуть из раствора колхицина, промыть дистиллированной водой, высадить в ящик и поставить в теплицу.
4. Через 30 дней отобрать тетраплоидные растения. Они отличаются толстыми мясистыми листьями, неправильными искривленными побегами.
5. Подсчитать число хромосом и проверить плоидность отобранных растений на временных или постоянных препаратах, приготовленных по обычной цитологической методике.
Определение числа хромосом в клетках диплоидного и тетраплоидного растений может быть темой самостоятельного занятия.
№12-практическая работа. Определение генетического сходства и степени гомозиготности популяции.
Задание. 1. Познакомиться с законом Харди — Вейнберга. 2. Вычислить частоты генотипов в популяции озимой ржи сорта Вятка, растения которой различаются по антоциановой окраске всходов.
Задание характеризует частоты фенотипов, различающихся по окраске всходов в популяции озимой ржи сорта Вятка 2.
Пояснения к заданию. Английский математик Г. Харди и немецкий врач В. Вейнберг в 1908 г. независимо друг от друга установили закон, которому подчиняется частота распределения гомозигот и гетерозигот в свободно скрещивающейся популяции, и выразили его в виде алгебраической формулы. Согласно этой формуле частота членов пары аллельных генов в популяции распределяется в соответствии с формулой бинома Ньютона (р + q)2=1 или р2 + 2pq+q2 =1
Закон Харди—Вейнберга гласит: в неограниченно большой популяции при отсутствии факторов, изменяющих концентрацию генов, при свободном скрещивании особей, отсутствии отбора и мутирования данных генов и отсутствии миграции численные соотношения аллелей АА, аа и Аа остаются из поколения в поколение постоянными.
Этот закон дает возможность определить вероятность содержания генотипов АА, Аа и аа в свободно скрещивающейся популяции.
Условия, при соблюдении которых действует этот закон, практически невозможны ни в одной реально существующей популяции, поэтому закон Харди — Вейнберга следует рассматривать как закон, применимый для идеальной (модельной) популяции, хотя он и лежит в основе динамики всех типов популяций.
Пример. У озимой ржи антоциановая (фиолетовая) окраска всходов — доминантный (А) признак по отношению к зеленой (а) окраске, N — число особей в популяции, D — число гомозиготных особей с генотипом АА, R — число гомозиготных особей с генотипом аа, Н — число гетерозиготных особей с генотипом Аа.
Выполнение задания. 1. Определить состав популяции. Он будет представлен следующей формулой: N=D+R+H
2. Вычислить число генов А и число генов а в данной популяции сорта Вятка 2 по формуле A (число генов) =2D + Н, так как каждое растение D имеет два гена A, а каждое растение Н — один ген A.
Число генов а — 2R + Н, так как каждое растение R имеет два гена а, а каждое растение Н — один ген.
3. Вычислить частоту (долю) генов A в популяции. Она обозначается буквой р и вычисляется по формуле:
p=2D+H / 2N=D+ 1/2H / N.
4. Вычислить частоту генов а в популяции (q) по формуле:
p=2R+H / 2N=R+ 1/2H / N.
5. Пользуясь формулой Харди — Вейнберга, вычислить состояние равновесия в популяции при p= 0,6 и q= 0,4 и частоте генотипов AA=0,10, Aа = 0,20 и аа = 0,70.
Следует обратить внимание, что популяция при таком соотношении генотипов неустойчива, и уже в следующем поколении в ней устанавливается равновесие, которое сохраняется и в дальнейших поколениях.
Таким образом, в рассматриваемом примере в популяции ржи сорта Вятка 2 во всех поколениях сохраняется соотношение генотипов с антоциановой окраской всходов (гомозигот) AA=0,36, гетерозигот Aа = 0,48 и с зеленой окраской всходов аа = 0,16. При этом сохраняется частота гена А — р = 0,6 и частота гена а — q = 0,4.
№13-практическая работа. Знакомства с динамикой генеотипов в чистых линиях и популяциях.
Задание. Вычислить процент гетерозиготных особей в 10-м поколении гибридной популяции яровой пшеницы, полученной от скрещивания сортов Фильгия и Саратовская 29.
Пояснения к заданию. В природе даже у самых строгих облигатных самоопылителей, как например пшеница, ячмень, овес и др., бывают случаи перекрестного опыления. Однако эти случаи довольно редки и немногочисленны, поэтому сорта-самоопылители обычно продолжительное время сохраняют свою генетическую однородность.
У пшеницы красная окраска колоса (А) по отношению к белой окраске (а)—доминантный признак. Сорт Фильгия, имеющий красную окраску колоса, скрещивают с белоколосым сортом Саратовская 29, а затем проводят самоопыление полученной гетерозиготной популяции F1 в последующих поколениях.
Выполнение задания. 1. Составить схему образования гетерозигот и гомозигот в 3 поколениях гибридной популяции
PP♀AA X ♂ аа
F1 Aa
F2 AA+2Aa+aa
F3 4AA+2AA+4Aa+2aa+4aa,
или 6AA+4Aa+6aa, или 3AA+2Aa+3aa
Fn (2n-1-1)AA+2Aa+(2n-1 –1)aa
2. В соответствии с полученной формулой определить частоту гетерозиготных растений в популяции в 10-м поколении:
F10 (29— 1) АА+2Аа + (29— 1)аа = 511 АА + 2Аа + 511аа
3. Определить процент гетерозиготных особей в гибридной популяции ФильгияXСаратовская 29 к 10-му поколению. Расчет удобно выполнять в форме таблицы.
Таким образом, в 10-м поколении у самоопыляющихся растений число гетерозигот составит около 0,1%. Доминантных гомозигот будет около 49,45% и рецессивных гомозигот — около 49,45%.
№14-практическая работа. Оценка влияния элементарных факторов эволюции на структуру популяции.
Задание. 1. Ознакомиться с причинами, нарушающими равновесие в популяции. 2. Определить изменение соотношения процента особей с различными генотипами в поколениях при полной элиминации рецессивных гомозигот.
Пояснения к заданию. Равновесие в популяции может нарушаться под влиянием таких факторов, как мутационная изменчивость, увеличение или уменьшение численности популяции, избирательность оплодотворения, отбор и др. Причем наибольшее значение имеет направление отбора.
Динамика генетической структуры популяции выражается в изменении соотношения разных генотипов в поколениях. Генофонд популяции может пополняться большим или меньшим числом мутаций. Этот процесс накопления мутаций называется мутационным давлением. Например, мутирование аллеля А в аллель а или обратно может нарушить равновесие в популяции, т. е. изменить соотношение генотипов АА, Аа и аа. Каждая вновь возникшая мутация подвергается действию отбора, т. е. все особи, у которых возникает мутация, снижающая жизнеспособность или плодовитость, полностью или частично элиминируются. Если возникшая мутация доминантна, то все обладающие ею особи подвергаются действию отбора в первом поколении. Если же мутация рецессивна, то она подвергается действию отбора только в гомозиготном состоянии. В этом случае мутантные рецессивные гены могут накапливаться в популяции в гетерозиготном состоянии. Поэтому элиминация рецессивных генов в популяции мало эффективна: в каждом последующем поколении рецессивные гомозиготы будут появляться вновь из гетерозигот Аа в результате их расщепления.
При выполнении данного задания в качестве примера может быть рассмотрена популяция озимой ржи, у которой частота доминантных генов р = 0,5, частота рецессивных генов q — 0,5, а гомозиготное состояние рецессивного гена обусловливает полную стерильность цветков.
Доминантный ген F как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии обусловливает нормальное развитие фертильных цветков. В этом случае коэффициент отбора (коэффициент элиминации), обозначаемый буквой S, для рецессивных гомозигот ff равняется 1, то есть эти гомозиготы в каждом поколении бесплодны, не завязывают семян.
Согласно заданию в исходной популяции частоты доминантного и рецессивного генов равны и составляют р = 0,5 и q = 0,5.
При S = 1 частота генов в популяции вычисляется
по формуле: qn=q/1+nq,
где п — число поколений, для которых ведется расчет.
Для удобства расчетов следует вычислять не частоты генотипов, а процент особей с соответствующим генотипом.
Выполнение задания. 1. Вычислить процент особей с генотипами FF, Ff, ff в исходной популяции при S = 1 и q = 0,5. Данные занести в таблицу, умножив предварительно на 100, чтобы перевести их в проценты. Расчет ведется по формуле:
P2 +2hq+q2=1
(0,5)2+ (2 X 0,5 X 0,5)+ (0,5)2 = 1.
Следовательно, в исходной популяции будет следующее соотношение генотипов: 25% FF; 50% Ff и 25% ff.
Динамика изменения соотношения генотипов в популяции при полной элиминации рецессивных гомозигот (S = 1)
|
Поколение |
Частота доминантного гена p |
Частота рецессивного гена q |
Процент особей с генотипом |
||
|
ff (q2) |
Ff (2pq) |
FF (p2) |
|||
|
Исходное 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 n |
0,500 0,667 0,750 0,800 0,833 0,857 0,875 0,889 0,900 0,909 0,917 0,955 Pn=1-qn |
0,500 0,333 0,250 0,200 0,167 0,143 0,125 0,111 0,100 0,091 0,083 0,045 qn=q/1+nq |
25,00 11,12 6,25 4,00 2,78 2,04 1,56 1,23 1,00 0,83 0,69 0,20 q2n |
50,00 44,44 37,50 32,00 27,78 24,51 21,88 19,74 18,00 16,54 15,22 8,60 2pnqn |
25,00 44,44 56,25 64,00 69,44 73,44 76,56 79,03 81,00 82,63 84,09 91,20 p2n |
q1=0,5/1+(1X0,5)=0,5/1,5=0,333
p1=1-q1=1-0,333=0,6677
4. Таким же образом вычислить частоты доминантного и рецессивного генов и определить процент особей с генотипами FF-44,4%, Ff и ff во втором, третьем и последующих поколениях. Как видно из таблицы, при полной элиминации рецессивных гомозигот с генотипом ff в каждом поколении соотношение генотипов в популяции изменяется: к 20-му поколению численность доминантных гомозигот FF возрастает с 25 до 91,2%, численность рецессивных гомозигот ff уменьшается с 25 до 0,2%. Численность гетерозигот Ff тоже уменьшается в поколениях с 50 до 8,6 %, но уменьшение их идет медленнее, чем рецессивных гомозигот.