Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
ДНІПРОДЗЕРЖИНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ
До виконання лабораторних робіт з дисципліни
„Загальна мікробіологія та вірусологія”
для студентів напряму
6.051401 „Біотехнологія”
всіх форм навчання
Затверджено редакційно-видавничою
секцією науково-методичної ради ДДТУ
21.05.20092009 р. протокол №7
Дніпродзержинськ
2009
Розповсюдження і тиражування без офіційного дозволу Дніпродзержинського державного технічного університету заборонено
Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з дисципліни „Загальна мікробіологія та вірусологія” для студентів всіх форм навчання напряму 6.051401 „Промислова біотехнологія”/ Укл.: асист. Філімоненко О.Ю., ст. викладач Філімоненко Д.В. – Дніпродзержинськ: ДДТУ, 2009.– 56 с.
Укладачі: асист. Філімоненко О.Ю.
ст. викладач Філімоненко Д.В.
Відповідальний за випуск: к.т.н., доцент Гуляєв В.М.
Рецензент: к.т.н., доцент кафедри БТЕ Авраменко С.Х.
Затверджено на засіданні кафедри
біотехнології та екології,
протокол № 11 від 02.03.2009 р.
Коротка анотація видання. Методичні вказівки містять 12 лабораторних робіт, що розраховані на 4-годинні заняття, метою яких є навчити студентів сучасним методам дослідження в мікробіології, виробити навички самостійної роботи, навчити вмінню протоколювати хід роботи та узагальнювати її результати.
Зміст
|
1. Загальні положення …………………………………………………… |
4 |
|
2. Основні вимоги з техніки безпеки……………………………….. |
5 |
|
3. Лабораторна робота №1 Мікроскоп та методи мікроскопіювання………………………………. |
8 |
|
4. Лабораторна робота №2 Приготування препаратів живих клітин………………………………… |
15 |
|
5. Лабораторна робота № 3 Приготування препаратів фіксованих клітин. Прості методи забарвлення………………………………………………………………. |
17 |
|
6. Лабораторна робота №4 Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму……….. |
20 |
|
7. Лабораторна робота №5 Методи стерилізації……………………………………………………. |
22 |
|
8. Лабораторна робота № 6 Приготування поживних середовищ…………………………………. |
28 |
|
9. Лабораторна робота № 7 Морфологія цвільових грибів та дріжджів…………………………….. |
33 |
|
10. Лабораторна робота № 8 Морфологія бактерій та актиноміцетів…………………………………. |
38 |
|
11. Лабораторна робота № 9 Будова бактеріальної клітини…………………………………………. |
41 |
|
12. Лабораторна робота № 10 Культивування мікроорганізмів………………………………………… |
44 |
|
13. Лабораторна робота № 11 Підрахунок клітин мікроорганізмів під мікроскопом………………… |
49 |
|
14. Лабораторна робота №12 Вимірювання розмірів клітин…………………………………………… |
51 |
|
15. Перелік посилань……………………………………………………. |
55 |
Лабораторні роботи є важливим етапом навчального процесу, що дозволяє вдосконалювати теоретичну й практичну підготовку студентів. Практикум проводиться паралельно з теоретичним курсом, що дає можливість глибше й повніше засвоїти матеріал.
Лабораторні заняття з курсу "Загальна мікробіологія та вірусологія" виконуються відповідно до навчального плану підготовки бакалаврів денної та заочної форми навчання за напрямом 6.051401 «Біотехнологія»
Мета курсу "Загальна мікробіологія та вірусологія" - вивчення сучасного стану мікробіологічної науки, отримання практичних навиків вивчення мікроорганізмів у об'ємі, необхідному для розуміння протікання основних процесів, зв'язку мікробіології з суміжними науками, сільським господарством, медициною та біотехнологією, що повинно створити студентам базу для викладання чи (та) проведення біохімічних досліджень в науково-дослідних чи виробничих установах.
У результаті вивчення дисципліни студенти повинні:
- знати: основні завдання та значення курсу, систематику мікроорганізмів, основні метаболічні процеси у мікроорганізмів, системи енергозабезпечення мікроорганізмів, конструктивний метаболізм у мікроорганізмів, елементи інтеграції метаболічних шляхів, техніку безпеки при роботі з мікроорганізмами, вплив чинників зовнішнього середовища на мікроорганізми та їх екологію, використання мікроорганізмів у народному господарстві та медицині;
- вміти: користуватись приладами та обладнанням мікробіологічної лабораторії, вирощувати та досліджувати певні види мікроорганізмів, виконувати аналізи складу мікроорганізмів та активності деяких ферментів, оформляти результати лабораторних робіт, проводити математичну і статистичну обробку експериментальних даних, користуватись довідниками та каталогами, підбирати та використовувати наукову та методичну літературу, застосовувати теоретичні знання на практиці.
Підготовка до лабораторного заняття передбачає теоретичне опрацювання матеріалу даної теми і знайомство з методикою виконання роботи. До початку заняття в робочому зошиті повинні бути описані принцип методу та хід роботи. По закінченні практичної частини студенти захищають роботу у викладача.
Практикум складений у повній відповідності із робочою програмою курсу «Загальна мікробіологія та вірусологія». В методичних вказівках викладені правила техніки безпеки при роботі в мікробіологічній лабораторії, відомості про посуд, устаткування й прилади, які використовуються при проведенні лабораторних робіт.
Методичні вказівки являють собою частину учбово-методичного комплексу з дисципліни «Загальна мікробіологія та вірусологія» і є керівництвом до проведення лабораторних занять для студентів.
Основна мета практикуму — закріплення теоретичних знань шляхом формування практичних навичок в мікробіології. У процесі виконання робіт студенти опановують сучасні методи експериментальних досліджень та уміння аналізувати отримані результати.
У практикум увійшли найбільш типові лабораторні роботи, що представляють основні розділи загальної мікробіології та вірусології: мікроскоп та методи мікроскопіювання; культивування, зберігання та виготовлення препаратів мікроорганізмів; методи стерилізації; приготування поживних середовищ, морфологія бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів, вірусів. У кожному розділі роботи наведені контрольні запитання для перевірки знань студентів.
Лабораторні роботи містять виклад принципу методу, перелік основних матеріалів, реактивів й устаткування, докладний опис ходу роботи й очікуваних результатів. Побудова робіт дозволяє проводити їх без додаткових вказівок, що особливо актуально в цей час у зв'язку з необхідністю підготовки студентів до самостійного рішення наукових проблем.
2. Основні вимоги з техніки безпеки
Особливістю мікробіолочіних робіт є постійний контакт працівників лабораторії з біологічно-небезпечним матеріалом: культурами патогенних мікроорганізмів, тканинами, кров'ю і виділеннями живих організмів тощо. Тому всі працівники мікробіологічної лабораторії зобов'язані дотримуватись наступних правил роботи, які забезпечують стерильність в роботі і попереджують можливість зараження:
Забороняється заносити до лабораторії сторонні речі.
Не дозволяється виходити за межі лабораторії в халатах або одягати верхній одяг на халат.
Двері мікробіологічної лабораторії повинні бути постійно зачиненими.
В приміщенні мікробіологічної лабораторії категорично заборонено палити, вживати їжу, зберігати продукти харчування.
Весь матеріал, який потрапляє до мікробіологічної лабораторії для аналізу повинен трактуватися як інфікований.
При використанні біологічного матеріалу не дозволяється ставити посуд, який містить матеріал для дослідження, безпосередньо на стіл. Для цього використовуються підноси або кювети, посуд попередньо протирають ззовні дезінфікуючим розчином.
Переливання рідин, які містять патогенні мікроорганізми, здійснюють над посудиною з дезінфікуючим розчином.
У випадках пошкодження посуду з мікробіологічним матеріалом або його витіком слід негайно повідомити відповідальній особі і провести заходи для обеззараження забрудненого одягу, частин тіла, предметів робочого місця.
10.При роботі з мікробіологічним матеріалом необхідно використовувати загальноприйняті технічні прийоми, які виключають можливість контакту рук з мікробіологічним матеріалом.
13.Мікробіологічний матеріал та культури мікроорганізмів, які потрібні для подальшої роботи, здаються відповідальній особі.
Специфіка мікробіологічних робіт вимагає, щоб приміщення лабораторії було ізольованим від інших кімнат. До мікробіологічної лабораторії належать: приміщення для бактеріологічних досліджень; стерильний бокс для виконання робіт в стерильних умовах; передбоксник, де знаходиться стерильний матеріал; автоклавна для стерилізації посуду, поживних середовищ та знешкодження відпрацьованого матеріалу; приміщення для миття посуду та приготування середовищ. Бокс повинен бути обладнаним бактерицидною лампою, стіни і підлога вистелені плиткою або лінолеумом, що забезпечує можливість використання дезінфікуючих розчинів при прибиранні кімнати. До необхідних інструментів та обладнання мікробіологічної лабораторії відносять: термостати, центрифуги, мікроскопи з освітлювачами, шафи сушильні, спиртівки або газові пальники, піпетки пастерівські, шпателі скляні та металеві, пінцети, ножиці, предметні та покривні скельця, петлі бактеріологічні тощо.
Причини пожеж у мікробіологічній лабораторії
та засоби їх гасіння
Можливість виникнення пожежі у мікробіологічній лабораторії особливо велика, бо постійно доводиться працювати з газовими або спиртовими пальниками, електронагрівальними приладами, легкозаймистими фарбами, фіксаторами, розчинниками, виготовленими на спирті, фенолі, ацетоні і т. ін. При роботі з газовим пальником можли вий "проскок" полум'я, що може привести до загорання гумової трубки або предметів та речовин, які знаходяться поруч. Займання може трапитися під час стерилізації сухим жаром посуду, загорнуто го у папір, при неправильному режимі роботи сушильної шафи. При чиною пожеж може стати несправність електричних приладів.
У випадку виникнення пожежі необхідно пам'ятати, що засіб його гасіння залежить від причини, яка викликала загорання і від ха рактеру об'єкта, який горить. Якщо горять дерев'яні предмети, то їх можна гасити водою, піском та за допомогою вогнегасника. Нерозчинні у воді органічні речовини (бензин) не можна гасити водою, бо при цьому пожежа може навіть посилитися. Ці речовини слід гасити піском або ж швидко накрити азбестом. Розчинні у воді органічні речовини (спирт, ацетон) можна гасити водою. Для гасіння усіх вище названих речовин годиться чотирьоххлористий вуглець. При зіткненні з вогнем він утворює важкі випари, які витісняють вогонь, внаслідок чого горіння припиняється. Найбільш ефективним проти пожежним засобом у лабораторії є вогнегасники. На кожному з них є інструкція, з якою повинен бути ознайомлений кожен, хто працює в лабораторії. Таким чином, на випадок пожежі в лабораторії у визна чених місцях завжди повинні бути: пожежний рукав, відро або ящик з піском, войлок або шерстяна ковдра, вогнегасник, чотирьоххлористий вуглець.
При виникненні пожежі всі засоби гасіння, які є під рукою, не обхідно негайно використовувати і одночасно викликати пожежну команду. Телефон пожежної служби «01» зі стаціонарного телефону і «101» - з мобільного.
Невідкладна медична допомога в лабораторії
У лабораторії трапляються випадки, які потребують невідкладної медичної допомоги - порізи рук, опіки гарячими пред метами або кислотами та лугами. При пораненнях склом необхідно перш за все видалити його з рани, обробити її йодом та пе рев'язати уражене місце.
При термічних опіках першого та другого ступеня обпечене місце необхідно помістити під струмінь холодної води, а після цього присипати двовуґлецевим натрієм або обробити примочками із свіжоприготовлених розчинів питної соди (2%) або марганцевокислого калію (5%). Найкращим розчином для примочок є абсолютний або 96% спирт. Він одночасно знезаражує та знеболює. При опіках кислотами та лугами уражену ділянку слід швидко промити великою кількістю води. Після цього на обпечене місце слід накласти примочку: при опіках кислотою - з 2%-го розчину соди, при опіках лугом - із слабкого розчину оцтової кислоти. При отруєнні газом потерпілого необхідно винести на свіже повітря і негайно викликати лікаря або доставити його в медпункт.
Дезінфекція
В мікробіологічних лабораторіях дезінфекційні заходи використовуються дуже широко. Закінчуючи роботу з зараженим матеріалом, проводять профілактичну дезінфекцію рук та робочого місця.
Забруднені патогенним матеріалом або культурою мікробів градуйовані та пастерівські піпетки, скляні шпателі та металеві інструменти відразу після їх використання опускають у скляні банки з дезінфікуючим розчином, які знаходяться на столі біля кожного робочого місця. Обов'язковій дезінфекції підлягають також використані робочі предметні та покривні скельця, бо навіть у фіксованому та забарвленому мазку іноді зберігаються життєздатні мікроорганізми, які мо жуть стати джерелом внутрішньолабораторного зараження. Не об робляється дезінфікуючими засобами тільки той посуд, у якому вирощувалися мікроорганізми. Його складають у металеві бачки або бікси, пломбують та здають у стерилізацію.
Мікроскоп та методи мікроскопіювання
Мета роботи: Вивчення видів мікроскопії, методів мікроскопіювання, класифікації мікроскопіювальної техніки та будови світлового мікроскопа.
Теоретичні основи: Вивчення морфології та будови клітин мікроорганізмів, розміри яких вимірюються у більшості випадків мікрометрами (1 мкм = 10-3 мм), можливе тільки за допомогою мікроскопів, які за безпечують збільшення об'єктів у тисячі (світлові мікроскопи) та де сятки і сотні тисяч разів (електронні мікроскопи).
За допомогою мікроскопа вивчається морфологія та будова клітин мікроорганізмів, їх ріст, розвиток, первинна ідентифікація тощо.
Мікроскопія в темному полі
В основі методу лежить явище Тиндаля - освітлення об'єкта косими променями світла. Ці промені, не потрапляючи в об'єктив, залишаються невидимими для ока, тому поле зору виглядає темним. В той же час оптично неоднорідні клітини, що знаходяться в полі зору і потрапляють в зону проходження променів, відхиляють їх так, що промені попадають в об'єктив. Оскільки промені світла ідуть саме від об'єктів, спостерігач бачить їх в темному світлі у вигляді променів, що інтенсивно світяться. Метод використовується при дослідженні живих клітин мікроорганізмів. Особливо він корисний для функціонально-морфологічного вивчення великих об'єктів, таких як дріжджі.
Фазово-контрастна мікроскопія
Людське око розрізняє тільки довжину (колір) і амплітуду (інтенсивність, контрастність) світлової хвилі, але не вловлює фазових відмінностей.
Майже всі живі клітини прозорі, так як світлові промені, проходячи через них, не змінюють своєї амплітуди, хоча і змінюються за фазою. Метод фазово-контрастної мікроскопії розроблено для спостереження за прозорими об'єктами. Він ґрунтується на перетворенні невидимих для людського ока фазових змін світлової хвилі, які відбуваються при її проходженні через об'єкт, у видимі амплітудні з допомогою спеціального оптичного пристрою.
Метод застосовують для дослідження живих клітин мікроорганізмів, контрастність яких досягається оптичним шляхом без втручання в фізіологічні процеси об'єктів, що вивчаються.
Люмінісцентна або флуоресцентна мікроскопія
Деякі біологічні об'єкти здатні поглинати світло і потім випромінювати промені з більшою довжиною хвилі. При цьому клітини немов би світяться жовто-зеленим або помаранчевим світлом. Це так звана власна, або первинна, люмінесценція.
Нелюмінесцентні об'єкти можна обробити спеціальними флуорохромами (акридином жовтим, акридином помаранчевим, аураміном, примуліном, тіофлавіном, конго червоним, тетрацикліном) і також спостерігати люмінесценцію. Це, так звана, наведена або вторинна люмінесценція.
Люмінесцентна мікроскопія у порівнянні зі звичайною дозволяє: поєднувати кольорове зображення і контрастність об'єктів; вивчати морфологію живих і мертвих клітин мікроорганізмів у поживних середовищах і тканинах тварин та рослин; досліджувати клітинні мікроструктури, які вибірково поглинають різні флуорохроми; визначати функціонально-морфологічні зміни клітин; використовувати флуорохроми при імунологічних реакціях і підрахунку бактерій в зразках з невисоким їх вмістом.
Електронна мікроскопія
За схемою будови електронний мікроскоп аналогічний світловому, але на досліджуваний об'єкт подається не світло, а потік електронів від вольфрамової нитки, що нагрівається електричним струмом.
Роздільна здатність сучасних електронних мікроскопів - 0,2-0,4 нм, робоче збільшення в середньому - 100 000 разів.
Трансмісійний електронний мікроскоп широко застосовується в біологічних дослідженнях. Кожен електронний мікроскоп складається з джерела електронів; електромагнітних котушок, які виконують роль конденсаторної, об'єктивної і проекційної лінз; предметного столика; екрана для зображення і окуляра. Для роботи мікроскопа необхідна вакуумна помпа, оскільки рух електронів можливий тільки у вакуумі. Електрони у трансмісійному мікроскопі рухаються таким же шляхом, як і промені світла у світловому мікроскопі.
Зображення об'єкта можна сфотографувати, якщо замінити екран (металеву пластинку, покриту тонким шаром сульфіду цинку чи сульфіду цинку з селенідом кадмію) фотопластинкою.
Препарати для електронно-мікроскопічних досліджень поміщають на спеціальні сітки, на які нанесена тонесенька плівка (підкладка). Загальна товщина препарату не повинна перевищувати 0,25 мкм.
При дослідженні морфологічних особливостей клітин мікроорганізмів під електронним мікроскопом вивчають цілі клітини і їх зрізи, товщина яких не повинна перевищувати 0,8-0,9 мкм.
Контрастність забезпечується напиленням об'єкта важкими металами (хромом, золотом, паладієм) чи обробкою контрастуючими речовинами типу фосфорно-вольфрамової кислоти і уранілацетату.
Скануючий, або растровий, електронний мікроскоп дає об'ємне зображення досліджуваного об'єкта. В скануючих мікроскопах рухомий тонкий електронний промінь дуже швидко і послідовно оббігає поверхню досліджуваного зразка по квадратному растру і передає отриману інформацію на електронно-променеву трубку, покриту люмінофором, який світиться під дією електронів
Препарати для скануючого мікроскопа піддають спеціальній обробці, основна мета якої - обезводнення об'єкта. Потім препарат покривають тонким шаром сплаву золота чи платини, що робить поверхню зразка електропровідною і дозволяє уникати накопичення електричного заряду, який може знизити розрізнюючу здатність мікроскопа.
При роботі з електронним мікроскопом слід особливо дотримуватись правил техніки безпеки.
Світлова мікроскопія.
Найбільш зручними мікроскопами, призначеними для мікробіологічних досліджень, є мікроскопи типу МБД-1, МБР-1 та МБР-1А (рисунок 1.1). Вони складаються з механічної та оптичної частин. Механічна частина мікроскопа МБР-1 включає штатив з предметним столиком і тубус.
Предметний столик може переміщуватися у горизонтальній площині
1 - окуляр; 2 - нахилений тубус; 3 - гвинт для кріплення тубуса; 4 – револьвер; 5 – об’єктиви; 6- предметний столик; 7- гвинт для закріплення конденсора у гільзі; 8 - конденсор; 9 - гвинти для переміщення предметного столика, 10 — дзеркало; 11- підковоподібна основа мікроскопа; 12 - рукоятка ipисової діафрагми конденсора; 1З —рукоятки переміщення конденсорів; 14 - кронштейн конденсора, 15 - рукоятка мікрометричного гвинта; 16 - рукоятка мікрометричного гвинта; 17 – тубусотримач; 18 - клеми для притис кання препарату.
Рисунок 1.1 - Мікроскоп МБР-1
на 8 мм за допомогою двох гвинтів, які знаходяться справа та зліва, а також обертатися навколо своєї осі. Це дає можливість провести будь-яку точку препарату у центр поля зору. На поверхні столика є дві клеми, які затискують препарат Під предметним столи ком закріплено кронштейн конденсора, який може переміщуватися у межах 20 мм спеціальним гвинтом, розміщеним справа.
Верхня частина штатива - тубусотримач (11) — має форму дуги та може переміщуватися на 50 мм обертанням макрометричного (12) та мікрометричного (13) гвинтів, які призначені для грубого та точ ного фокусування препарату.
У верхній частині тубусотримача знаходиться револьвер (14), який обертається навколо своєї осі. У отвори револьвера вгвинчу ються об'єктиви (15) та гніздо для кріплення прямого або похилого тубуса (16). У верхній кінець тубуса вставлений окуляр (18).
Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарата, об'єктива (15) та окуляра (18). Освітлювальний апарат скла дається із дзеркала (10) та конденсора (5). Дзеркало регулюється, во но закріплене в основі штатива і має дві сторони: увігнуту та плоску. Увігнуте дзеркало збирає та концентрує у площині препарату пучок паралельних променів, які йдуть від джерела світла, тому ним кори стуються тільки тоді, коли працюють без конденсора, тобто з малими збільшеннями. При роботі з конденсором слід користуватися тільки плоскою стороною дзеркала. Конденсор складається з двох лінз, за допомогою яких промені, що йдуть від дзеркала, конденсуються та направляються на площину препарату. При мікроскопіюванні з ден ним світлом конденсор повинен бути піднятий до рівня предметною столика; при штучному освітленні конденсор опускають до тих пір, доки при малому збільшенні зображення джерела світла не з'явиться в площині препарату. Під конденсором знаходиться ірисова діафрагма, яка служить для затримання зайвих променів світла та дозволяє зменшувати апepтypу конденсора (охоплення лінзи).
Об'єктиви - найбільш важлива та цінна частина мікроскопа, яка визначає його оптичну потужність. Вони складаються з системи лінз, які вставлені в металічну оправу.
Біологічні мікроскопи звичайно оснащені трьома змішаними об'єктивами зі збільшенням 8х, 20х, 40х та 90х. Перші три нази ваються сухими, бо при їх використанні між об'єктом та об'єктивом знаходиться шар повітря (рисунок 1.2. а) При цьому, приймаючи до уваги різницю між показниками приломлення скла препарату (n=1,53) та повітря (n=1,0), частина світлових променів відхиляється і не потрапляє в око спостерігача. Звичайно сухі об'єктиви використовуються при не великих (400 600 разів) збільшеннях.
Об'єктиви зі збільшенням 90х називаються імерсійними (лат. “immеrsio” - занурюю), бо під час роботи вони обов'язково зану рюються у імерсійну рідину, яка знаходиться між об'єктивом та об'єктом. Звичайно використовують кедрову олію (n = 1,52), гліцерин (n = 1,4), воду (n = 1,3) та інші речовини, показники залом лення яких близькі до показника приломлення скла. Завдяки цьому, усі промені, не заломлюючись та не змінюючи свого напрямку, потрапляють в об'єктив та забезпечують можливість розглядати найдрібніші об'єкти. Імерсійні об'єктиви дають збільшення до 9001350 разів.
Окуляри мікроскопа служать для того, щоб роздивлятися зображення об'єкта, збільшеного за допомогою об’єктива. Окуляри збільшують зображення у 5, 7, 10, 15, 20 разів, що показує цифра, яка вигравірувана на оправі окуляра. Збільшення, яке дає мікроскоп, визначається множенням збільшення об'єктива на збільшення окуляра Так, наприклад, використовуючи окуляр 20х та об'єктив 90х , можна отримати збільшення зображення у 1800 разів.
Збільшення зображення є не єдиною характеристикою мікроскопа. Збільшене зображення може бути як чітким, так і не чітким. Важливим показником мікроскопа є його роздільна здатність, під якою розуміють мінімальну відстань між двома точками, коли вони ще не зливаються в одну. Чим більша роздільна здатність мікроскопа, тим меншої величини об'єкт можна побачити. Роздільна здатність неозброєного ока 200 мкм (0,2 мм).
В J
a).
б).
а) Схема ходу променів в сухій та імерсійній системі.
А, В, С, D, J - промені світла;
б) Схема ходу променів при різному значенні кута u .
Α - об'єкт; О – οб’єктив; α - отворовий кут; u - половина отворового ку та.
Рисунок 1.2 - Схема ходу променів при мікроскопіюванні
Величина роздільної здатності мікроскопа залежить від довжини хвилі світла, яке використовується, та суми числових апертур об'єктива та конденсора
(1.1)
де:
d - мінімальна відстань між двома точками;
A1 - числова апертура об'єктива;
A2 - числова апертура конденсора;
Числова апертура (А) - це "охоплення" лінзи, вона характери зується кількістю променів, які потрапляють у лінзу. Вона визна чається множенням синуса половини (u) отворового кута () на показ ник заломлення (n) середовища, що межує з лінзою (рисунок 1.2. б).
А= sin u n
Числова апертура будь-якої лінзи, що межує з повітрям, не може бути більше ніж 1, тому що показник заломлення повітря дорівнює 1, а кут u не може бути більше ніж 90о (sin u 1).
Величина числової апертури кожного об'єктива показується на його оправі. Сухі системи МБР-1 - 8х та 40х - мають апертуру 0,20 та 0,65 відповідно. Апертура імерсійного об'єктива 90х = 1,25.
Апертура імергованого конденсора мікроскопа МБР-1 = 1,20. Цього значення можна досягти тільки в тому випадку, якщо вмістити імерсійну олію між верхньою лінзою конденсора та нижньою поверхнею предметного скла. Неімергований конденсор має апертуру близько 1.
Простий розрахунок показує, що при освітленні об’єкта світлом з довжиною хвилі 550 нм (0,55 мкм), до якого найбільш чутливе око, роздільна здатність мікроскопа для сухої системи (об'єктив 40х) дорівнює:
0,33 мкм.
Збільшити роздільну здатність мікроскопа можна двома шля хами: або освітлюючи об'єкт світлом ще коротшої довжини хвилі, наприклад ультрафіолетовим, або збільшуючи показник заломлення середовища, яке межує з лінзою, чого можна досягти, використовую чи імерсійну олію. Тим самим числова апертура об'єктива збільшується до 1,2 (імерсійний об'єктив), а розділення дося гає 0,25 мкм.
При роботі з мікроскопом важливе значення має правильне ви користання конденсора. Неправильне користування ірисовою діафрагмою, необгрунтоване підняття та опускання конденсора при водить до різкого погіршення якості та спотворення мікроскопічної картини.
Оптимально числова апертура конденсора повинна бути такою ж як у об'єктива. У випадку, коли апертура конденсора менша за апертуру об'єктива, остання буде використана не повністю, і роздільна здатність зменшиться. Якщо апертура конденсора більша за апертуру об'єктива, то необхідно дещо прикрити ірисову діафрагму конденсора. Це призведе до усунення розсіяного світла та дасть необхідну контрастність зображення.
Освітлювач - невід'ємна частина мікроскопа. У багатьох су часних мікроскопах освітлювальний апарат разом із джерелом світла вмонтований у основу мікроскопа. Для мікроскопів, які не оснащені таким пристроєм, використовують спеціальні освітлювачі. Освітлювач ОД-19, який використовується найбільш часто, має низьковольтну лампу (8 вольт, 20 Вт) з короткою товстою ниткою.
Лампу включають у мережу через знижуючий трансформатор, у корпусі якого є реостат, що регулює розжарення лампи. Освітлювач встановлюється перед мікроскопом на з'єднувальній планці.
Матеріали, реактиви й устаткування: Світловий мікроскоп, готові препарати мікроорганізмів, імерсійна олія.
Хід роботи:
Розглянути та замалювати препарати мікроорганізмів за допомогою світлового мікроскопа та використовуючи імерсійну олію.
1. Підготувати мікроскоп до роботи. Протерти лінзи окуляра і об'єктива м'якою серветкою, розмістити лампу та мікроскоп так, щоб було зручно для роботи.
Контрольні питання:
1. В чому полягає суть фазово-контрасної, люмінесцентної та мікроскопії в темному полі?
2. Чим відрізняється електронний мікроскоп від світлового?
3. Дайте визначення наступним термінам: роздільна здатність, числова апертура.
4. Що таке імерсійний об’єктив?
5. Будова світлового мікроскопа.
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №1.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №1 |
|||
|
Мікроскоп та методи мікроскопіювання |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Рисунок культури мікроорганізмів …………………………………… при збільшенні (назва препарату мікроорганізмів латинською) а) 8х, б) 40х, в) 90х. 2) Відповідь на контрольні питання. 3) Висновки по лабораторній роботі №1 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Приготування препаратів живих клітин
Мета роботи: Навчити студентів техніці приготування препаратів живих клітин для вивчення їх морфології, метаболізму та життєздатності.
Теоретичні основи: Мікроскопічне дослідження мікроорганізмів проводять у живо му або фіксованому стані. Мікроскопія мікробних клітин у живому стані проводиться, головним чином, для вивчення їх розмірів, форми рухомості, характеру розмноження та відношення клітин до різних хімічних подразників.
Для спостереження мікроорганізмів під мікроскопом необхідно відповідним чином приготувати препарат. Препарати готують на предметних скельцях, товщина яких не повинна перевищувати 1,21,4 мм. Застосування більш товстих скелець приводить до різкого зниження чіткості зображення. Поверхня скельця повинна бути ретельно очищена та знежирена, щоб крапля рідини рівномірно розпливалася по скельцю. Існує декілька способів знежирення ске лець, найбільш надійний спосіб - обробка скелець хромовою сумішшю протягом двох годин разом з наступним обполіскуванням їх водою та спиртом. До знежирення скелець приводить також обпалювання їх поверхні у полум'ї пальника або обробка скелець ефіром.
Мікроорганізми в живому стані можна вивчати за допомогою препаратів «роздавлена крапля», «висяча крапля» та «відбиток».
В препараті «роздавлена крапля» в світлому та темному полі можна встановити форму та розміри клітин, їх фізіологічний стан, характер розмноження, розташування спор та наявність запасних поживних речовин в клітині.
Препарат «висяча крапля» дозволяє вивчати клітини на протязі декількох днів, спостерігаючі за ростом та розмноженням мікроорганізмів, утворенням та проростанням спор, рухом клітин.
Препарат відбиток готують для вивчення природного розташування в колонії клітин актиноміцетів та міцеліальних грибів.
Матеріали, реактиви й устаткування: Мікроскопи, покривні та предметні скельця, предметні скельця з лункою, вазелін, фільтрувальний папір, бактеріологічні петлі, спиртові пальники, сірники, дезінфікуючий розчин, вата, ефір, стерильна вода, фізіологічний розчин, культури бактерій, дріжджів та міцеліальних грибів.
Хід роботи:
1. Приготувати препарат «роздавлена крапля»:
На чисте та знежирене предметне скло наносять краплю стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину та вносять у неї бактеріологічною петлею невелику кількість культури мікроорганізмів. Після перемішування культури на край краплі став лять покривне скельце під кутом 45° та, обережно нахиляючи, кла дуть його на краплю. У даному препараті не можна допускати, щоб вода вис тупала за край покривного скельця та містила пухирці повітря. Якщо рідина нанесена у надлишку, її видаляють за допомогою фільтрувального паперу.
2. Приготувати препарат «висяча крапля»:
Для приготування препарату невелику краплю суспензії мікроорганізмів наносять на покривне скельце та накладають на ньо го спеціальне предметне скло з заглибленням (лункою) у центрі. Краї покривного скельця та лунки попередньо змазують вазеліном. Предметне скельце легко притискують до покривного та обережно повертають.
3. Приготувати препарат «відбиток»:
Із щільного середовища, на якому мікроорганізми ростуть густим газоном у вигляді колоній, вирізають скальпелем невеликий кубик або окрему колонію та переносять на предметне скло. Поверхня з мікроорганізмами повинна бути направлена на верх. Потім прикладають чисте покривне скельце, злегка натискуючи на нього петлею і відразу знімають, намагаючись не здвинути в бік. Препарат розташовують відбитком у низ в краплю води на предметному склі та мікроскопіюють.
Препарати живих клітин розглядають у мікроскопі, використо вуючи суху систему.
4. Замалювати культури мікроорганізмів при збільшенні 40х.
Контрольні питання:
1. Для чого проводять мікроскопію мікроорганізмів в живому стані?
2. Техніка приготування препаратів «роздавлена крапля», «висяча крапля», «відбиток»?
3. Назвіть переваги препарату «висяча крапля» над препаратом «роздавлена крапля»
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №2.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №2 |
|||
|
Приготування препаратів живих клітин |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Рисунок культури мікроорганізмів …………………………………… (назва препарату мікроорганізмів латинською) А) бактерії, Б) дріжджі, В) міцеліальні гриби. 2) Відповідь на контрольні питання. 3) Висновки по лабораторній роботі №2 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
5. Лабораторна робота № 3
Приготування препаратів фіксованих клітин. Прості методи забарвлення.
Мета роботи: Ознайомлення з методикою приготування препаратів фіксованих клітин та простими методами забарвлення.
Теоретичні основи: Для виявлення деяких морфологічних особливостей та кількісного обліку мікроорганізмів, перевірки чистоти культури та інших цілей готують фіксовані забарвлені препарати.
Фіксація препаратів має мету:
- вбити мікроорганізми та зробити безпечною подальшу роботу з ними;
- забезпечити краще прили пання клітин до скла;
- зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення.
Забарвлення препаратів виконується аніліновими барвниками. За хімічною класифікацією вони поділяються на три групи: кислі, ос новні та нейтральні.
Кислі барвники містять у своїх молекулах групи –SO3H, COOH та мають властивості кислот. Основні барвники ма ють у своєму складі аміногрупи, котрі надають їм властивості основ. Нейтральні барвники не містять у складі кислотних груп та аміногруп і не мають спільних властивостей з кислотами та лугами.
Основні барвники, у яких забарвлююча частина молекули заряджена позитивно, виявляють найбільшу здатність вступати у спо лучення з бактеріальною клітиною, яка несе на поверхні негативний електричний заряд та має у складі цитоплазми, у переважній кількості, кислі компоненти.
Найбільш широко використовуються такі барвники: червоні (фуксин основний, фуксин кислий), сині (метиленовий та то луїдиновий сині), фіолетові (генциан віолет, метиловий фіолетовий, кристалічний фіолетовий), жовто-коричневі (везувін, хризоїдин), зелені (діамантовий зелений, малахітовий зелений).
Виділяють прості та диференційні методи забарвлення.
При простому забарвленні використовується один вид барвника, який дає змогу рівномірно забарвити всю клітину, так що добре видна її фор ма та розмір.
Диференційні методи забарвлення передбачають вико ристання кількох барвників та переслідують ціль виявлення окремих структур та компонентів клітин.
Приготування фіксованих забарвлених препаратів включає на ступні етани:
Матеріали, реактиви й устаткування:
Мікроскопи, культура мікроорганізмів, предметні та покривні скельця, стерильна вода у пробірках, газові пальники, бактеріологічні петлі, барвники: 0,01% розчин метиленового синього, водний розчин фуксину основного, кристалізатор з підставкою для предметних скелець, фільтрувальний папір, імерсійна олія, дезінфікуючий розчин, марлеві серветки.
Хід роботи:
Приготувати та провести простий метод забарвлення культури мікроорганізмів по наступній схемі:
На знежирене предметне скельце наносять краплю стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину та вносять в неї петлею невелику кількість матеріалу, який досліджується. Отриману суспензію розмазують петлею тонким шаром по поверхні предметного скельця на площі 1 - 2 см2.
Препарат сушать при кімнатній температурі. Для скорочення часу висихання препарату, допускається легке нагрівання його над полум'ям пальника у струмені теплого повітря. Скельце необхідно тримати мазком доверху. Не можна допускати перегрівання мазка, бо можлива деформація мікроорганізмів.
Найбільш простим способом фіксації є термічна обробка. Для цього препарат 3-5 разів швидко проводять через найбільш гарячу частину полум'я пальника, тримаючи скельце мазком доверху. Цю операцію слід проводити вкрай обережно, не перегріваючи мазка і не допускаючи зміни клітинних структур та зовнішнього виду клітин.
Для дослідження внутрішньої будови клітини вдаються до фіксації різними хімічними речовинами. У цьому випадку фіксуючу рідину наливають на мазок або занурюють препарат у склянку з фіксатором. Для фіксації використовують етиловий спирт (час фіксації І5 – 20 сек.), метиловий спирт (3 - 5 хв.). Існує цілий ряд інших фіксаторів. Після закінчення фіксації препарат відмивають від фіксатора у тонкому струмені водопровідної води та забарвлюють.
Для простого забарвлення клітин мікроорганізмів найчастіше використовують фуксин або метиленовий синій. Фіксований препа рат кладуть мазком доверху на місток з двох паралельних скляних паличок, які з'єднані гумовими трубочками та покладені на стінки кювети або кристалізатора. Піпеткою наносять на мазок 2-3 крап лини водного розчину фуксину, щоб він покрив увесь мазок. Забарвлення проводять протягом 2-3 хвилин. Після закінчення забарвлен ня струменем води змивають з препарату барвник. Препарат вису шують на повітрі або легко промокають фільтрувальним папером. Препарат мікроскопіюють з об'єктивом 40х та 90х.
У правильно забарвленому та добре промитому препараті поле зору залишається світлим та чистим, а забарвленими виявляються клітини мікроорганізмів.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №3.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №3 |
|||
|
Приготування препаратів фіксованих клітин. Прості методи забарвлення. |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Рисунок культури мікроорганізмів …………………………………… при збільшенні (назва препарату мікроорганізмів латинською) а) 40х б) 90х 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №3 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
6. Лабораторна робота №4
Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму
Мета роботи: Ознайомлення з методикою забарвлення бактерій по Граму.
Теоретичні основи: Складні або диференційовані способи забарвлення бактерій за сновані на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини. Ці способи забарвлення використовуються для вивчення клітинних структур, а також для характеристики та ідентифікації мікроорганізмів.
На відміну від простих методів забарвлення при користуванні складними методами використовуються декілька барвників. До складних методів забарвлення відносять забарвлення по Граму, Цилю-Нільсену, Нейссеру, Романовському-Гімзе.
Найбільш універсальним з усіх складних методів забарвлення є метод забарв лення по Граму. Він має важливе діагностичне значення при визначенні видів бактерій. Усі бактерії за цим методом поділяються на дві групи: грам позитивні (Г+) та грамнегативні (Г-). Складність методу полягає в тому, що одні клітини утворюють міцний, не розчинний у спирті, комплекс барвника генцианвіолета з йодом або іншого барвника трифенілметанового ряду (кристалічний фіолетовий, метиленовий фіолетовий). Ці мікроорганізми забарвлюються барвником у фіолетовий колір та належать до грампозитивних організмів. Клітини інших мікроорганізмів після обробки генцианвіолетом та йодом знебарвлюються спиртом та забарвлюються у рожевий колір при додатковому забарвленні фуксином. Такі мікроорганізми складають групу грамнегативннх бактерій.
Основну роль у забарвленні грає клітинна стінка, будова якої у Г+ та Г- мікроорганізмів має принципові відмінності. У Г+ бактерій муреїновий каркас багатошаровий та складає до 90% усієї маси стінки. При обробці клітин спиртом відбувається розбухання пептидоглікану та зменшення діаметра пор клітинної стінки, що приводить до зни ження її проникної здатності, у тому числі і для барвника.
У Г- бактерій пептидоглікан одношаровий, рідше двошаровий. Зовнішня мембрана клітинної стінки Г- мікроорганізмів також не є значним бар'єром на шляху проходження барвника, бо при обробці спиртом відбувається розчинення та вимивання ліпідів, що значним чином збільшує проникність клітинної стінки.
Здатність клітин забарвлюватися по Граму залежить від ряду причин та, насамперед, залежить від віку культури. Для забарвлення по Граму доцільно брати молоді, 8 - 24 годинні, клітини, бо при старінні культури у популяції збільшується кількість мертвих клітин, які завжди забарвлюються грамнегативно.
Матеріали, реактиви й устаткування:
Предметні скельця, бактеріологічні петлі, пробірки зі стериль ною водопровідною водою, сірники, сухе пальне, фільтрувальний папір, імерсійна олія, мікроскопи, розчин кислого фуксину, генциан-віолет, метиленовий синій, 96% етиловий спирт, розчин люголю, добові культури мікроорганізмів.
Хід роботи:
Забарвити по Граму суміш клітин Г+ та Г- мікроорганізмів.
Забарвлення по Граму проводится таким чином:
1. Па фіксований мазок наносять краплю генциан-віолету або метиленового синього. Забарвлення проводиться протягом 1 - 2 хвилин.
2. Зливаємо барвник та, не промиваючи мазок водою, наносимо розчин люголя на одну хвилину (до почорніння препарату).
3. Зливають розчин люголя та промивають мазок спиртом на протязі 30-50 секунд, постійно похитуючи предметне скельце.
4. Препарат промивають водою.
5. Далі на мазок наносять фуксин та забарвлення проводять на протязі 1-2 хвилин.
6. Зливши розчин фуксину, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером та мікроскопують. При правильному за барвленні грампозитивні бактерії забарвлюються генцианвіолетом в синьо-фіолетовий колір, грамнегативні - в додатковий червоний колір фуксином.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №4.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №4 |
|||
|
Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Рисунок суміші мікроорганізмів …………………………………… (назва препарату мікроорганізмів латинською) 2) Заповніть таблицю Забарвлення клітин при внесенні барвників та реактивів Внесений барвник, реактив Колір клітин Г+ Г- Генциан-віолет (метиленовий синій) Розчин люголю Спирт 96% Фуксин 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №4 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
7. Лабораторна робота №5
Методи стерилізації
Мета роботи: Ознайомлення з методами стерилізації поживних середовищ, посуду, одягу.
Теоретичні основи: Стерилізація - один з найважливіших прийомів у мікробіологічній практиці. В практичній роботі стерилізацію трактують, як методи які застосовують для знищення всіх форм життя як на поверхні, так і всередині об' єктів стерилізації. Стерилізують поживні середовища, посуд,
інструменти з метою не допустити розвитку сторонніх мікроорганізмів у досліджуваних культурах. Розрізняють стерилізацію: термічну, хімічну,
фільтруванням та опроміненням.
Прожарювання вогнем (фламбування) застосовують безпосередньо
перед використанням для стерилізації петель, голок, пінцетів, ножиць,
шпателів, скляних паличок, предметних та покривних скелець та іншого
дрібного інструменту.
Кип'ятіння у воді використовують для стерилізації шприців, голок,
пінцетів, скальпелів, дрібного скляного посуду, фільтрів у стерилізаторах.
При цьому гинуть, в основному, вегетативні клітини, спори бактерій
зберігають життєздатність.
Пастеризація - одноразовий короткочасний прогрів матеріалу при
температурах, нижчих 100°С для знищення вегетативних форм
мікроорганізмів. Цей прийом запропонував Луї Пастер. Пастеризацію
часто застосовують у харчовій промисловості, для обробки продуктів, які
втрачають смакові і поживні якості при кип'ятінні: молока, овочевих і
фруктових соків, вин, пива та ін. Пастеризацію зазвичай проводять при
60°С-75°С протягом 15-30 хв чи при 80°С 15 хв. Інколи нагрівають
матеріал до 90°С і одразу ж охолоджують.
Дробна стерилізація використовується для стерилізації середо вищ, які псуються під дією температур вище 100°С. Цей метод був запропонований англійським вченим Тиндалем. Принцип тиндалізації заснований на використанні багаторазового прогріву сере довищ текучою парою (у парі киплячої води при температурі 100 оС протягом 30 - 40 хвилин). Обробку текучою парою проводять 3 рази у автоклаві з незагвинченою кришкою. Час прогріву відмічається з моменту енергійного виділення пари. У проміжках між прогріваннями, середовища вміщують у термостат (температура 28 - 30 оС) для пророщування спор. Середовища, які не витримують нагрівання при 100°С, прогрівають більш обережно при 60 – 80 оС 4 - 5 хвилин.
Стерилізацію сухим жаром при температурі 170°С, 160°С або
140°С здійснюють у сушильних шафах відповідно протягом 1 год, 2 год та
3 год. Нагрівання за допомогою сухого жару справляє значно слабший
вплив на мікроорганізми, ніж волога пара. В той же час можуть серйозно
пошкоджувати такі матеріали, як гума, папір, вата, тканина. Тому цей
прийом переважно використовують для стерилізації предметів, які є
непроникними для пари, зокрема посуду (чашок Петрі, колб, пробірок,
піпеток тощо). Температура в сушильній шафі не повинна перевищувати 170°С,
оскільки у протилежному випадку з вати та деяких сортів паперу можуть
виділятися смолисті речовини, жирні кислоти, які мають здатність
пригнічувати ріст мікроорганізмів. Ці речовини у невеликих кількостях
також можуть виділятися й при значно нижчих температурах, а при
охолодженні шафи осаджуватись на її стінках. Тому час від часу слід
очищувати стінки печі. Для попередження інтенсивного змішування холодного забрудненого повітря зі стерильним вмістом шафи, її небажано
відкривати до охолодження.
Стерилізація насиченою парою під тиском (автоклавування) -
найбільш надійний і широко застосовуваний спосіб стерилізації поживних
середовищ і посуду. Цей метод ґрунтується на нагріванні матеріалу
насиченою водяною парою під тиском, вищому від атмосферного. Відомо,
що температура пари зростає при підвищенні її тиску. Наприклад, при
тиску 1,5 атм. температура пари становить 127°С, 2 атм. - 135°С.
Автоклавування забезпечує високу ефективність стерилізації: гинуть
вегетативні клітини, і найстійкіші спори. Стерилізацію парою під тиском
здійснюють у спеціальних герметичних товстостінних апаратах -
автоклавах (рисунок 5.1).
1 – стерилізаційна камера; 2 – кран для виходу повітря; 3 – манометр; 4 – запобігаючий клапан; 5 – водо парова камера; 6 – лійка для заповнення автоклаву водою; 7 – водомірна трубка; 8 – отвір для проходження пари в стерилізаційну камеру; 9 – захисний кожух; 10 – кришка автоклаву; 11 – підставка для розміщення стерилізуємих предметів.
Рисунок 5.1 – Схема автоклаву
Для правильного автоклавування необхідно повністю витіснити
повітря з робочої камери, оскільки повітря затримується між предметами,
які автоклавуються, внаслідок чого вони можуть не нагріватися до заданої
температури. Крім того, заповнювати автоклав слід таким чином, щоб не
перешкоджати вільному рухові повітря.
Перед стерилізацією поживні середовища і посуд слід ізолювати від
зовнішнього середовища. Для цього колби і пробірки закривають ватними
пробками: чашки Петрі, піпетки, шпателі загортають у папір чи кладуть у
паперові пакети. Посуд, зазвичай, стерилізують при 1 атм. 20-30 хв.
Температура і тривалість автоклавування поживних середовищ
визначається, перш за все, їх складом. Термолабільні субстрати (молоко,
желатинові середовища, середовища з цукрами, вітаміни тощо) зазвичай
стерилізують при 0,5 атм., протягом 15-30 хв, пивне сусло та сусло-агар-
при 0,7 атм 20 хв, м'ясо-пептонні середовища при 1 атм. 20 хв.
Працювати з автоклавом слід обережно, дотримуючись інструкцій.
Оскільки автоклав - апарат, який працює при високому тиску і високій
температурі, неправильна експлуатація його може бути причиною нещасних
випадків. Для роботи з автоклавом допускаються тільки особи, які мають
спеціальну підготовку і дозвіл відповідної інстанції.
Для контролю правильного режиму стерилізації використовують
кілька методів: за допомогою прямого вимірювання температури,
максимальних термометрів або хімічних індикаторів. Перший спосіб
здійснюють за допомогою термопар, розташованих в різних частинах
камери. Зручнішим є використання максимальних термометрів та
патентованих хімічних індикаторів. Останні змінюють своє забарвлення
внаслідок прогрівання протягом певного часу при заданій температурі.
Хімічну стерилізацію використовують для дезінфекції приміщення,
столів, знищення патогенних культур мікроорганізмів тощо.
Для стерилізації цим методом застосовують солі важких металів
(найчастіше ртуті, міді, цинку), 50-60%-ний розчин етилового спирту, -
оксихіноліну, лізол, формалін (41%-ний розчин формальдегіду), хлорне
вапно, хлорамін, пероксид водню, перманганат калію, -пропіолактон, йод,
йодоформ, детергенти та інші хімічні сполуки.
Обладнання, яке має дзеркальні, оптичні поверхні, радіодеталі, а
також вироби з термолабільних пластмас (чашки Петрі, центрифужні
пробірки тощо) стерилізують, застосовуючи газовий метод. Найчастіше
використовують оксид етилену, метилбромід, формальдегід,
- пропіолактон, озон тощо. Газову стерилізацію здійснюють у спеціальних
герметичних апаратах. При стерилізації строго контролюють концентрацію
газу, тиск, вологість, температуру і тривалість обробки, у більшості
випадків процес відбувається при температурі 45°С-70°С. Режим
стерилізації різними газами неоднаковий. Предметами, простерилізованими
газами, можна користуватися лише через 24 години (після десорбції газів).
Приміщення (стерильні бокси, операційні, реанімаційні), інколи
вироби з термолабільних пластмас стерилізують за допомогою
ультрафіолетових променів у діапазоні 260-280 нм. Час опромінення, який
встановлюють експериментально, залежить від потужності бактерицидної
лампи, від величини об'єкту стерилізації. При обробці УФ-променями
дрібних предметів їх одразу після стерилізації кладуть у стерильний
обгортковий матеріал або стерильний посуд, де і зберігають до
використання.
Метод часто застосовують для стерилізації субстратів, які не
витримують нагрівання, зокрема, сироваток, рідких середовищ і розчинів,
до яких входять термолабільні білки, вітаміни, вуглеводи, деякі
антибіотики. Спосіб полягає в пропусканні рідин через спеціальні
дрібнопористі фільтри, діаметр пор яких менший за розміри бактерій.
У лабораторіях як бактеріальні фільтри використовують:
а) мембранні (колоїдні) фільтри, виготовлені на основі ефірів
целюлози. Це диски різного діаметру товщиною 0,1-0,5 мм. Розміри пор
вітчизняних мембранних фільтрів коливаються в межах від 0,35 до 3,5 мкм.
Фірма "Міліпор" (Франція, США) продукує фільтри з розміром пор від
0,01 до 14 мкм, фірма "Синпор"(Чехія) - від 0,12 до 4 мкм.
На практиці придатність фільтрів для стерилізації встановлюють
шляхом пробного фільтрування через них суспензії дрібних
мікроорганізмів. Для перевірки на стерильність фільтрат у великих кількостях висівають на поживні середовища. Якщо пртягом 5-ти діб тест-мікроорґанізм не проросте, фільтри можуть бути використані для стерилізації.
б) азбестові фільтри Зейца виготовляють з суміші азбесту і целюлози.
Їх недоліком є те, що азбест адсоробує речовини рідини, а фільтрат
забруднюється волокнами.
в) пористі скляні фільтри виготовляють з фраґментів скла "пірекс",
сплавляючи їх диски фільтрів впаяні в скляні лійки - держаки різної
форми. Скляні фільтри нестандартні, тому перед використанням їх
обов'язково перевіряють, як і мембранні фільтри.
Для прискорення фільтрації на фільтрі, зазвичай, створюють перепад
тисків, якого найчастіше досягають відкачуванням повітря з допомогою
вакуумного насоса чи компресора.
Серйозним недоліком цього способу стерилізації є те, що фільтрування
через будь-який фільтр, окрім видалення з розчину суспендованих у ньому
частинок, може також призвести до різкої зміни властивостей фільтрату.
Так, при фільтруванні може змінюватись рН розчину, у
фільтрат можуть потрапляти різного роду іони, гліцерин тощо.
Матеріали, реактиви й устаткування: автоклав, сухо-жаровий стерилізатор, стерилізатор водний, чашки Петрі, колби, піпетки, шпателі, бум ага для загортання посуду, вата, марля, нитки.
Хід роботи:
В ході роботи необхідно ознайомитися з будовою автоклава та сухо-жарового стерилізатора, приготувати ватно-марлеві пробки, підготовити та простерилізувати посуд.
Для приготування пробки плоский шматок вати, узятий уздовж
волокна, скачують валиком. Щоб додати пробці міцність,
неї прокочують між долонею й чистим склом, що лежить на
столі. Довжина пробки для звичайної пробірки приблизно 4 см. Пробка повинна входити в пробірку на 1,5—2,0 см (рисунок 5.2). Для зберігання форми пробку виймають із пробірки, злегка обертаючи.
Зручно обернути пробку чистою марлевою серветкою.
А – правильно приготовлена пробка;
Б, В – Неправильно приготовлені пробки
Рисунок 5.2 – Ватні пробки
Перед стерилізацією пробки можна прикрити паперовими
ковпачками. Не можна обертати пробки посуду, який буде
стерилізуватися в автоклаві, целофаном, фольгою або іншими
матеріалами, що не пропускають пару, тому що пара повинна обов’язково проникати через пробку в посуд, інакше середовища не нагріються до потрібної температури й не простерилізуються. При використанні скляних, гумових, коркових й інших пробок їх огортають у подвійний шар обгорткового паперу й стерилізують при в'язаними до склянки, закритою ватяною пробкою. Пробки в посуді міняють стерильно в полум'ї пальника.
а) пробірки закривають ватно-марлевими пробками та об’єднавши по три штуки огортають папером та перев’язують нитками;
б) колби закривають ватно-марлевими пробками, на які зверху надівають паперові ковпачки;
в) шпателі кладуть у паперові конверти;
г) піпетки загортають в полосу паперу шириною 4-5 см, попередньо в піпетку зверху поміщають шматок вати;
д) чашки Петрі загортають в папір по 3 штуки.
Весь посуд та інструменти перед підготовкою та стерилізацією повинні бути вимиті та просушені.
Весь посуд та інструменти кладемо в сухо-жаровий стерилізатор на 2 год при температурі 160°С
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №5.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №5 |
|||
|
Методи стерилізації |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Принцип роботи автоклава 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 5 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Приготування поживних середовищ
Мета роботи: Ознайомлення з методикою приготування поживних середовищ для мікроорганізмів та видами поживних середовищ.
Теоретичні основи: Харчування є важливою функцією мікроорганізмів. Воно не обхідне для їх росту і розмноження. У лабораторних умовах мікроорганізми культивують на поживних
середовищах, які повинні мати всі речовини, необхідні для їх росту.
Конструктивні і енергетичні процеси у мікроорганізмів дуже відрізняються.
Тому так само відрізняються їх потреби у поживних речовинах.
Універсальних середовищ, однаково придатних для росту всіх без винятку
мікроорганізмів, не існує. Відомо дуже багато поживних середовищ (ще в
1930 р. було класифіковано більше 2000 середовищ). В той же час число
інгредієнтів, які становлять основу поживних середовищ, невелике.
Основними компонентами будь-якого поживного середовища для
культивування мікроорганізмів є сполуки вуглецю і азоту. Вони і
визначають специфічність більшості поживних середовищ.
Автотрофні мікроорганізми можуть використовувати
вуглекислоту як єдине джерело вуглецю, тому в середовище вносять
гідрокарбонат натрію або продувають повітря, збагачене вуглекислим
газом.
Гетеротрофні мікроорганізми здатні використовувати різні
вуглецевмісні органічні сполуки - кислоти, спирти, вуглеводи, ароматичні
сполуки тощо.
Потреби мікроорганізмів в азоті задовольняються за рахунок
азотовмісних сполук, в яких азот має різний ступінь окислення (амонійні
солі, нітрати, амінокислоти і молекулярний азот, а інколи білки та
пептони).
Багато мікроорганізмів потребує наявності в середовищі так
званих факторів росту (вітамінів, пуринів, піримідинів, амінокислот), які
додають до середовища у вигляді чистих сполук чи у складі дріжджового
або кукурудзяного екстрактів.
Крім джерел вуглецю та азоту і факторів росту для побудови
речовин клітині необхідні сірка, фосфор та інші елементи, а також
мікроелементи. Всі вони повинні входити до складу поживного середовища
у доступній для мікроорганізмів формі. Останнім етапом у приготуванні
поживного середовища є доведення рН розчину до необхідного.
Натуральні середовища складаються з продуктів рослинного та тваринного походження. Це овочеві або фруктові соки, молоко, кар топля або відвари та екстракти, отримані з природних субстратів. Прикладом натуральних середовищ є м'ясо-пептонний бульйон (МПБ) та м'ясо-пептонний агар (ΜΠА), неохмелене пивне сусло, дріжджове середовище, ґрунтова витяжка та інші.
Синтетичні середовища готують з певних хімічно чистих спо лук у точно вказаних концентраціях. Переваги синтетичних середо вищ полягають у тому, то їх можна точно повторити. Прикладом синтетичних середовищ є середовище Чапека для цвільових грибів та актиноміцетів, середовище Ешбі для азотофіксуючих мікроорганізмів та інші.
Напівсинтетичні середовища поряд зі сполуками відомого складу (вуглеводи, фосфати, нітрати) вміщують у себе речовини невизначеного складу - м'ясний відвар, дріжджовий екстракт.
Універсальні або загальновживані середовища призначені для вирощуваня широкого кола мікроорганізмів. Це МІІА, МПБ.
Спеціальні середовища призначені для виявлення тих чи інших біохімічних особливостей мікроорганізмів або для отримання культур мікроорганізмів, які мають особливі властивості. Серед спеціальних середовищ розрізняють елективні (вибіркові) та диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища:
Рідкі середовища використовують для вивчення продуктів обміну мікроорганізмів, для виявлення їх фізіолого-біохімічних особливостей, накопичення біомаси.
Щільні середовища використовують для отримання чистої культури мікроорганізмів, для зберігання культур, для визначення ряду властивостей мікроорганізмів.
Щільні поживні середовища готують з рідких шляхом додавання до них агар-агару, желатину, гелю кремнекислого або поліакриламідного гелю.
Сипучі середовища іноді використовують у промисловій мікробіології. До таких середовищ відносять розварене пшоно, висівки, просичені поживним розчином
Готують поживні середовища наступним чином:
Пивне сусло готують на пивоварних заводах з ячмінного солоду.
До нього входять вуглеводи (мальтоза, декстрини), азотовмісні сполуки, а
також вітаміни групи В, органічні кислоти і мінеральні солі.
Для усунення білків сусло фільтрують, за допомогою сахариметра
визначають у ньому концентрацію вуглеводів у градусах Балінга (°Б), які
приблизно відповідають відсотковому вмісту цих речовин. Для
культивування дріжджів і грибів використовують сусло з концентрацією 6-
8°Б, для молочнокислих бактерій - 8-12°Б.
Для приготування сусло-агару до сусла додають 1,5-2,0% агару.
Гарячий сусло-агар розливають у колби або пробірки і стерилізують при
0,5 атм. протягом 20-30 хв.
Автоліз в присутності хлориду натрію. Сушені дріжджі (клітинна
оболонка сушених дріжджів більш проникна, що полегшує автоліз)
розмочують у воді у співвідношенні 1:4 і рівномірно перемішують до
однорідної маси, після чого додають НС1 (2,5% відносно до маси сухих
дріжджів) і витримують у термостаті при температурі 48-52°С протягом
12-18 год. По закінченні автолізу рідину кип' ятять протягом 1 год.
Автоліз у присутності суперфосфату. Дріжджі розмішують у
витяжці суперфосфату (1:1) і поміщають у термостат на 48 год при
температурі 45°С. По закінченні автолізу середовище кип'ятять. Витяжку
суперфосфату готують при розведенні однієї частини суперфосфату у двох
частинах води.
Термін зберігання дріжджового препарату у вигляді пасти до 20
діб при температурі 2-4°С. Комплексний дріжджовий ферментний
препарат слугує біологічним каталізатором біохімічних реакцій і
біостимулятором мікроорганізмів.
Приготування антибіотика: 50 мг новобіоцину розчиняють у 10,6 мл етилового спирту (отримується концентрація антибіотика 4 тис. од. / мл), потім до 3 мл цього розчину приливають 9 мл фізіологічного розчину (отримується концентрація 1000 од. / мл). Цю кількість антибіотика (12 мл) вносять у стерильну пляшечку з 200 мл розтопленого та охолодженого до 45 - 50 оС стерильного м'ясо-пептонного агару. Середовище розливають стерильно у чашки Петрі по 20 мл.
7. Диференціально-діагностичне середовище Ендо.
У наш час диференціально-діагностичні середовища випуска ються у вигляді сухих порошків. Для приготування цих середовищ 5г порошку всипають у 100 мл холодної дистильованої води, нагрівають при ретельному перемішуванні до повного розчинення агару та кип'ятять 5 хвилин. Гаряче середовище слід фільтрувати че рез вату та знову довести до кипіння. Середовище охолоджують до 50 оС та розливають у стерильні чашки Петрі. Застигле середовище підсушують у термостаті. У склад сухого середовища Ендо входять: сухий агар, лактоза, фуксин, фосфорнокислий натрій та сульфат натрію.
8. Середовище Гісса.
При вивченні біохімічних властивостей мікробів можна використовувати напіврідкий строкатий ряд, який являє собою набір пοживних середовищ з вуглеводами. Індикатором у таких середовищах служить суміш водного блакитного (барвник) з розоловою кислотою (індикатор ВР).
Середовища готують наступним чином: 2 граму по рошку всипають у 100 мл холодної дистильованої води, нагрівають при помішуванні до повного розплавлення агару. Приготовану суміш розливають у пробірки по 5 мл і стерилізують при 0,8 атм. протягом 20 хвилин. Рожево-сірий колір середовища при кислотоутворенні змінюється на синій.
Твердість поживним середовищам надають желатин та агар-агар
Агар - складний полісахарид, якій отримують з морських
водоростей. Він здатний утворювати гелі, які плавляться при температурі приблизно 100°С і стають твердими при 45°С. Агар не розщеплюється під
дією більшості мікроорганізмів. За необхідності його можна
використовувати кілька разів після кількакратного промивання
дистильованою водою і наступного фільтрування.
Желатин - білок, який отримують виварюванням кісток, хрящів,
сухожиль, луски. Желатин плавиться при температурі 25°С, яка нижча за
звичайну температуру інкубації багатьох мікроорганізмів (30-37°С). Ця
властивість желатину обмежує його застосування для ущільнення
середовища. Желатин використовують, головним чином, для виявлення
протеолітичної активності мікроорганізмів. Його додають до рідких
середовищ у кількості 15-20%. Желатинові середовища стерилізують при
0,5 атм 15 хв.
Матеріали, реактиви й устаткування: Стерильні колби з пробками, середовища МПА, ГРМ-1, Ендо, Чапека, Блаурокка.
Хід роботи:
Приготувати та простерилізувати наступні поживні середовища:
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №6.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота № 6 |
|||
|
Приготування поживних середовищ |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
Приготовлені поживні середовища Колір Запах Консистенція Які мікроорганізми можуть рости на цьому середовищі Середовище Ендо Середовище ГРМ-1 Середовище Чапека Середовище МПА Середовище Блаурокка 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №6 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Морфологія цвільових грибів та дріжджів
Мета роботи: Вивчення морфології цільових грибів та дріжджів за допомогою мікроскопа.
Теоретичні основи: Гриби, поряд з тваринами та рослинами, утворюють са мостійне царство живого світу - Fungi. Сред грибів зустрічаються як багатоклітинні, так і одноклітинні та ценоцитні організми. Тіло більшості грибів складається з довгих розгалужених ниток - гіфів. Розмноження клітин здійснюється вегетативним, безстатевим та статевим шляхом. У основу систематики грибів покладений тип будови міцелію, спор та способів розмноження.
У групу нижчих грибів (Phicomycetes) включені класи: хітридіоміцетів, ооміцетів, зігоміцетів. Фікоміцети утворюють неклітинний (ценоцитний) добре розвинутий міцелій. Безстатеве розмноження здійснюється спорангіоспорами, які розвиваються сидогенно всередені спорангію, рідше конідіями.
Спори у хітридіоміцетів та ооміцетів рухомі та мають один чи два джгутики. Статевий процес - оогамія та зігогамія, котрі завершуються утворенням спор, що знаходяться у стані спокою - ооспор або зігоспор.
Групу вищих грибів (Eumycetes) складають Ascomycetes, Basidiomycetes та Fungi Imperfecti. Вищі гриби мають септований, розгалужений міцелій або представлені одноклітинними формами дріжджових грибів, які втратили здатність до утворення міцелію. Статевий процес у аскоміцетів – аскогамія, базидіоміцетів - базидіогамія. У недосконалих грибів статевий процес не виявлений.
Особливу групу грибів складають дріжджі та цвільові гриби.
Цвільові гриби утворюють характерний пухнастий наліт (цвіль) різного забарвлення на продуктах харчування, плодах, рос линних залишках та інших предметах при відповідних умовах: тем пературі та вологості. У систематичному відношенні цвільові гриби не однорідні і належать до різних класів грибів: зігоміцетів, ас коміцетів та недосконалих грибів.
У основу систематики цвільовнх грибів покладена будова міцелію та органів розмноження (спор). Цвільові гриби з класу зігоміцетів представлені родами Mucor та Rhizopus.
Мукорові гриби на щільних поживних середовищах утворюють войлочний наліт. Вегетативне тіло - розгалужений багатоядерний міцелій, який не має перегородок. Від міцелію відходять потужні плодоносні гіфи - спорангієносці з шароподібними спорангіями, у яких утворюються численні ендоспори (рисунок 7.1).
Види мукора широко розповсюджені у природі, особливо у ґрунті. Серед них є представники, які викликають псування продуктів, а також хвороби різних сільськогосподарських культур. Багато мукорових грибів використовуються у промисловості для вироб ництва органічних кислот та спирту.
А - Rhizopus; В - Mucor
Рисунок 7.1 - Різоїди та спорангієносці зі спорангіями
Різопус - відрізняється від мукора спорангієносцями, котрі розміщуються на міцелії пучками. Різопус розповсюджений на різноманітних органічних субстратах. Деякі види (Rhixopus betavora) викликають цвіль та псування насіння, цукрового буряка та інших рослин.
До класу сумчатих грибів (Ascomycеtes) належать цвільові гриби - пеніцил (Pеnicillium) або кістьовик та аспергілл (Aspеrgillus) або лійковий гриб. Ці гриби мають добре розвинутий багатоклітинний розгалужений міцелій. Розмножуються вони звичайно безстатевими конідіальними спорами та іноді утворюють сумчаті плодові тіла, всередині яких розвиваються сумки зі спорами (рисунок 7.2). Розрізнюються ці гриби за будовою органів безстатевого розмножен ня — конідієносців.
Гриби роду Penicillium мають розгалужені багатоклітинні конідієносці, які розвиваються з клітин міцелію. На кінці конідієносця утворюються короткі клітини-стеригми, від яких відшнуровуються ланцюжки конідій. Конідієносці, які таким чином утворюються, нагадують китички.
До роду пеніциліум відноситься також половина усіх цвільових грибів. Вони широко розповсюджені у грунті, кормах, сирих приміщеннях, викликають псування продуктів та матеріалів. Бага то пеніцилів використовуються у промисловості для отримання ліпідів та ферментів. Pen. camabеrti бере участі, у визріванні деяких сортів сиру. Серед грибів роду пеніціліум 25% мають антибіотичну активність. Pen. notatum та Pen. crysoginum використовуються як продуценти пеніциліну.
В
А- Aspcrgillus; В - Репісіllіum
1 - конідії; 2 – стеригми; 3 - конідіофор; 4 – вегетативні гіфи.
Рисунок 7.2 - Конідії та спори у цвільових грибів
Гриби роду Aspеrgillus мають септований міцелій з вертикаль но розташованими конідієносцями, на верхньому кінці яких утворю ються розширення у вигляді булави. На поверхні нього розширення розташовані короткі стеригми, від яких відшнуровуються ланцюжки пігментованих конідій. Конідії розташовані на радіусах сфери та на гадують струмені води, які виливаються з лійки, звідки походить друга назва гриба - лійкова цвіль.
Багато представників роду Aspergillus мають важливе практич не значення. Asp. niger застосовують для отримання лимонної кисло ти, Asp. flavus використовується для виділення комплексу проте олітичних ферментів.
Недосконалі гриби (Fungi imperfecti) мають багатоклітинний міцелій, але не мають статевого процесу та досконалого спороношення.
Систематика недосконалих грибів заснована на будові конідієносців та конідій. Найбільш розповсюдженими у природі цвільовими грибами цього класу є гриби роду Alternaria (рисунок 7.3) тa Тrіchoderma.
Рисунок 7.3 - Конідії гриба Alternaria fenius
Рід Altеrnaria має темнозабарвлений міцелій, темно-димчастого або оливково-чорного кольору. Конідієносці - розгалу джені або прості. Багатоклітинні конідії з поперечними та по вздовжніми перегородками у ланцюжки по 10 та більше конідій. Найбільш розповсюджений у природі вид мешкає на різних рослинних субстратах, а також викликає захворювання сходів моло дих рослин та насіння.
Рід Trichodеrma широко розповсюджений на рослинних за лишках та в грунті. Tr. lignorum та Tr. koningi є руйнівниками клітковини у ґрунті та продуцентами антибіотика - триходерміну, який застосовується у боротьбі з хворобами рослин. Tr. lignorum має безбарвний міцелій, на якому розвиваються трійчасторозгалуджені конідієносці темно-зеленого кольору. Округлі конідії зібрані в голов ки та розвиваються на стеригмах пляшкоподібної форми.
Дріжджі - одноклітинні гриби, які втратили міцеліальний ха рактер росту. Вони зустрічаються серед усіх класів вищих грибів - аскоміцетів, базидіоміцетів та недосконалих грибів. Більш ніж 50% дріжджів належать до класу аскоміцетів.
Морфологічно дріжджові клітини дуже різноманітні. Серед них зустрічаються округлі, яйцевидні, овальні, стріловидні, серпо видні форми.
Розміри одиночних дріжджових клітин лежать у межах 1 - 10 мкм, частіше 3 - 7 мкм. Розмножуються дріжджі вегетативним, безстатевим та статевим шляхом. Найбільш характерним видом веге тативного розмноження є брунькування. При брунькуванні на по верхні клітини утворюється один чи кілька горбків - бруньок, які рос туть. У бруньку з материнської клітини переходить частина прото плазми та елементів ядра, після чого брунька відшнуровується. У деяких видах дріжджів бруньки зберігають зв'язок з клітиною, утво рюючи скупчення дріжджових клітин.
Деякі види дріжджів розмно жуються бінарним поділом шляхом утворення однієї чи декількох поперечних перегородок. Такий спосіб розмноження спостерігається у представників роду Shizosaccharomyces.
Безстатеве розмноження дріжджів здійснюється за допомогою спеціалізованих клітин - спор. Процес спороутворення звичайно починається за несприятливих умов. Спори у кількості від 2 до 18 утворюються або всередині клітини (ендоспори), або на клітинному вирості - стеригмі ( баллістоспори ). При визріванні баллістоспори з силою відстрілюються від материнської клітини. Утворення спор - це одно часно і процес розмноження, і формування стійких форм.
У багатьох дріжджів, які діляться та брунькуються, спо стерігається статевий процес, яких здійснюється за типом копуляції.
Серед дріжджоподібних організмів є несправжні дріжджі, які не здатні до статевого процесу та спороутворення. Вони належать до класу недосконалих грибів.
Дріжджі широко розповсюджені у природі. Вони зустрічаються у ґрунті, у воді, на ягодах та фруктах, шкірі людини. Багато дріжджів мають велике практичне значення та використовуються у виробництві хліба, отриманні білково-вітамінних концентратів, вітаміну D2, ліпідів, нуклеїнових кислот. Серед дріжджів є патогенні для людини та тварин види.
Матеріали, реактиви й устаткування:
Добові культури дріжджів Candida tropicales, 5 – 7 -добові куль тури цвільових грибів Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillium cyclopium, предметні та покривні скельця, суміш вода + оцтова ки слота (1:1) з додаванням метиленового синього, водний фуксин, мікроскопи, імерсійна олія, препарувальні голки, марлеві серветки, метиленовий синій в розведенні (1 : 40).
Хід роботи:
1. Розглянути колонії грибів родів Mucor, Aspergillus, Pеnicillium, які виросли на сусло-агарі в чашках Петрі під мікроскопом з об'єктивами 8х та 40х.
Приготувати з них препарати "роздавлена крапля". Препарат готують в суміші вода + оцтовa кислота (1 : 1) або спирт + гліцерін (1 : 1), бо міцелій грибів погано змочується водою. Препарувальною голкою шматочок міцелію обережно переносять па предметне скель це та розтягують його двома препарувальними голками. Препарат накривають покривним скельцем та роздивляються з об'єктивами 8х та 40х.
При мікроскопіюванні колонії та препаратів звернути увагу на розділеність міцелію, будову спороносців та конідієносців, форму спор, забарвлення вегетативного та спороносного міцелію, дифузію пігменту в середовище. Результати спостережень оформити у вигляді таблиці.
2. Приготувати фіксовані препарати дріжджів Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicales.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №7.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота № 7 |
|||
|
Морфологія цвільових грибів та дріжджів |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Рисунок культури мікроорганізмів …………………………………… та опис форми клітин, міцелію, форми конідієносців та ін. 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №7 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Морфологія бактерій та актиноміцетів
Мета роботи: Вивчити морфологію бактерій та актиноміцетів за допомогою мікроскопа
Теоретичні основи: Бактерії належать до надцарства прокаріотів. Більшість бак терій - одноклітинні організми, рідше зустрічаються багатоклітинні форми з низьким рівнем диференціації клітин.
За способом живлення бактерій поділяють на авто- та гетеротрофи, за способом отримання енергії на фото- та хемотрофи. За відношенням до кисню - на аероби та анаероби.
Розмножуються бактерії неперервним поділом клітини. Як правило, поділ відбувається в результаті кострикції або шляхом утворення перегородки. У багатьох бактерій клітини після поділу розходяться, у деяких представників залишаються разом, утворюючи різні сполучення.
Ряд форм мають складні цикли розвитку.
Серед бактерій є рухливі організми. Рух більшості бактерій здійснюється за допомогою джгутиків. Рідше зустрічаються форми, які володіють повзаючим рухом зв'язаним з нерівномірним виділенням слизу усією поверхнею тіла (міксобактерії) або такі, що мають поступово-обертальний рух, який забезпечується скороченням фібріл (спірохети).
При несприятливих умовах деяким бактеріям властиве утворення ендоспор. Спори бак терій не зв'язані з розмноженням, а призначені для збереження виду в умовах, несприятливих для розвитку вегетативних клітин.
Порівняно з морфологічною різноманітністю багатоклітинних організмів бактерії морфологічно мало диференційовані. Звичайно розрізнюють три основні форми бактерій:
Сферичні бактерії - коки (від грецького - зерно). Діаметр кокових форм коливається від 1,0 до 2,5 мкм. Переважна більшість ко кових клітин не утворюють спор та є нерухомими. Морфологічно розрізнюють коки правильної сферичної форми, овальні, конічні та еліпсовидні утворення. У залежності від способів ділення коки поділяються на декілька груп:
Паличковидні бактерії — це найбільш численна група про каріотів. Довжина паличковидних бактерій у середньому складає 2 - 5, іноді 10 - 12 мкм. Довжина клітин одного виду залежить рід ряду факторів та визначається віком культури і умовами вирощування. Більш стійкою ознакою є ширина клітин, яка коливається у межах від 0,5 до 1 мкм. Більшість паличковидних бактерій не утворюють ендоспор, але є і спороутворюючі форми. У класификації спороутворюючі палички називаються бацилами (від латинського bacillum - паличка), неспороутворюючі палички отримали назву бактерії (від грецького bacteria).
Як і сферичні клітини, палички можуть бути з'єднані попарно або в ланцюжки (диплобацили і дипдобактерії, стрептобацили і стрептобактерії). При визначенні систематичного положення паличковидних бактерій важливою ознакою є форма кінців клітини (округлі, загострені, тупі).
Звиті бактерії мають спіралевидну форму та розрізнюються за довжиною, товщиною нитки та за кількістю та характером звитків. Серед звитих бактерій відомі негнучкі та звивисті форми. До негнуч ких бактерій відносять вібріони, які мають форму коми, та спірилли. Спірилли мають великі та рідкі завитки, кількість яких не більше шести. Звивисті форми мають велику кількість дрібних завитків, які мають діагностичне значення. Звивисті форми представлені спірохетами.
Актиноміцети - це особлива група Г+ мікроорганізмів, яку слід розглядати як перехідну форму між бактеріями та грибами. Клітини актиноміцетів дуже розгалуджені та нагадують міцелій цвільових грибів. Проте міцелій актиноміцетів тонший та в діаметрі не більший 1,2 мкм. У переважній більшості випадків міцелій актиноміцетів не має перегородок, виняток складають деякі види вищих актиноміцетів.
На щільному поживному середовищі інші актиноміцети утво рюють щільні корковидні або бархатисті колонії різного розміру та забарвлення. Частина колонії занурюється у субстрат та щільно з ним зростається, з другої частини формується повітряний міцелій, на кінцях якого утворюються спороносні гілки або спороносці. Форма спороносців та спор (рисунок 8.1) постійна для кожного виду та використовується для діагностики актиноміцетів.
Спороносці актиноміцетів
а)—прямі; б) — звивисті; г) — пучкоподібні; г)— первинні спіралі;
д) - відкриті спіралі; е)- закриті спіралі; ж)- міцелій актиноміцету.
Рисунок 8.1 - Спороносці актиноміцетів
У менш організованих представників актиноміцетів міцелій відносно швидко розпадається на окремі фрагменти, даючи дуже різнорідну мікроскопічну картину. На поверхні щільних середовищ вони утворюють щільні колонії, які майже не зрощуються з субстра том. Повітряний міцелій утворюється рідко. Розмноження здійснюється фрагментами міцелію. Спори не утворюються. Оскільки діаметр міцелію дуже малий, то звичайно для вивчення цих організмів готують препарати-відбитки. Для цього предметне скельце кладуть на поверхню міцелію та злегка притискують для отримання чіткого відбитку. Препарат фіксують жаром, забарвлюють та мікроскопують, використовуючи об'єктив 90х.
Матеріали, реактиви й устаткування:
Предметні скельця, водний розчин фуксину, імерсійна олія, стерильна водопровідна вода, бактеріологічні петлі, мікроскопи, дезінфікуючий розчин, марлеві тампони, готові препарати культур Spirochaeta dentium, Vibrio El-tor добові культури мікроорганізмів Sarcina flava, Staphilococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus lactis.
Хід роботи:
1. Приготувати фіксовані препарати культур Sarcina flava, Staphilococcus аureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcus lactis.
2. Приготувати препарат-відбиток з культури актиноміцетів. Розглянути будову міцелію та спороносців зі спорами.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи № 8.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №8 |
|||
|
Морфологія бактерій та актиноміцетів |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Рисунок культури мікроорганізмів …………………………………… при збільшенні (назва препарату мікроорганізмів латинською) а) 40х б) 90х 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 8 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Будова бактеріальної клітини
Мета роботи: Вивчення будови бактеріальної клітини
Теоретичні основи: Не дивлячись на зовнішню простоту організації, будова бак теріальної клітини досить складна. Цитоплазма бактеріальних клітин оточена трьома оболонками - цитоплазматичною мембраною, клітинною стінкою та капсулою, які виконують життєво важливі функції.
У цитоплазматичному матриксі розташовані нуклеоїд, рибосо ми, внутрішньоцитоплазматичні мембранні утворення, а також ряд інших внутрішньоклітинних утворень, таких як газові вакуолі, карбоксісоми, магнітосоми, які зустрічаються у окремих представників прокаріотів.
У цитоплазмі бактерій виявляються різні включення, які є продуктами клітинного метаболізму і запасними поживними речо винами. У клітинах це безазотисті органічні речовини — глікоген, крохмаль, гранулеза; жироподібні речовини - полі-b-оксимасляна кислота та азотовміщуючі запасні речовини - цианофіцинові грану ли, а також гранули волютину, включення сірки та карбонату кальцію. Багато з цих структур добре видно у світловий мікроскоп при відповідних методах забарвлення.
А) Виявлення капсул
При звичайних методах забарвлення капсули залишаються без барвними. Для виявлення капсул застосовують спеціальні методи за барвлення. Метод Буррі-Гінса складається з декількох етапів.
1. Краплю досліджуваної культури Bac. anthracoides вміщують на край скельця та ретельно змішують з краплиною туші.
2. До краплини досліджуваної рідини під кутом 45° підводять край шліфованого скельця, крапля при цьому розтікається по його краю. Швидким рухом шліфовального скельця готують препарат по типу мазка крові.
3. Препарат висушують, фіксують у полум'ї пальника та забарвлюють протягом 2 - 3 хвилин фуксином Циля.
4. Забарвлений мазок промивають водою, підсушують та мікроскопують за допомогою імерсійного об'єктива.
Туш утворює темний фон препарату, на якому добре видно безбарвні капсули, які оточують забарвлені фуксином бактеріальні клітини.
Б) Виявлення спор у бактерій
Виявлення здатності культури до спороутворення краще проводити у старих культурах. Спори у бактерій можна виявити при мікроскопіюванні препарату "роздавлена крапля" у світловому полі. Спори заломлюють світло сильніше, ніж інша частина клітини, і їх видно у клітині як більш темні включення округлої чи овальної фор ми.
Проте для виявлення спор краще використовувати складні ме тоди забарвлення клітин. Оболонка спор важко проникна для барвника. Тому всі наявні способи забарвлення спор засновані на тому, що попередньо сильним барвником з прогріванням забарвлюють од ночасно клітину і спору. Потім протоплазму клітини знебарвлюють, залишаючи спору забарвленою. Додаткове забарвлення цитоплазми найчастіше виконують контрастним до кольору спори барвником. Найбільш розповсюдженим є спосіб Ожешки.
Спосіб Ожешки
1. На знежиреному предметному скельці готують тонкий мазок бак терій Вас. subtilis, висушують його на повітрі та, не фіксуючи, за ливають 0,5 % розчином НСl.
2. Мазок підігрівають протягом 2 хвилин у струмені теплого повітря пальника до появи парів.
3. Кислоту зливають, препарат промивають водою, мазок закрива ють фільтрувальним папером та заливають карболовим фуксином Циля.
4. Препарат забарвлюють протягом 5 хвилин при нагріванні над по лум'ям пальника до появи парів. По мірі випаровування барвника його періодично додають, не даючи препарату підсохнути.
5. Препарат промивають водою та обробляють протягом 2 хвилин 1 % розчином сірчаної кислоти для знебарвлення.
6. Препарат знову промивають водою та забарвлюють розчином метиленового синього 1 : 40 протягом 10 – 15 хвилин.
7. Барвник зливають та мікроскопіюють з імерсійною системою. При правильному забарвленні клітини повинні бути синіми, а спори червоними.
В)Виявлення деяких включень у клітинах мікроорганізмів
Виявлення жиру та гранул полі-b-оксибутирату
1. На предметне скельце наносять краплину мікробної суспензії Saccharomyces cerevisiae з краплиною розчину судана III та накри вають покривним скельцем.
2. Мікроскопують з об'єктивом 40х та 90х. У полі зору мікроскопа видно рожево-червоні краплини ліпідів у безбарвній цитоплазмі.
Виявлення гранул волютинy методом Омелянського
Сутність забарвлення заснована на поганій розчинності мета-хроматичних гранул у розчинах кислот.
1. Готують фіксований препарат Saccharomycеs cerevisiae.
2. На мазок наносять фуксин Циля та забарвлюють клітини протягом 30 - 60 секунд.
3. Промивають препарат водою та наносять на мазок 1 % розчин сірчаної кислоти на 20 - 30 секунд. Клітини знебарвлюються, а стійкий до дії кислот волютин зберігає забарвлення.
4. Препарат промивають водою та додатково контрастно забарв люють метиленовим синім у розведенні 1 : 40 протягом 15 - 30 се кунд.
5. Барвник змивають водою, препарат просушують фільтрувальним папером та мікроскопують з об'єктивом 90х.
У полі зору мікроскопа гранули волютину забарвлюються в червоний колір, цитоплазма клітини - в синій.
Матеріали, реактиви й устаткування: Предметні та покривні скельця, бактеріологічні петлі, пробірки з стерильною водопровідною водою, сірники, сухе пальне, фільтрувальний папір, кедрова олія, фуксин Циля, розчин судана III, розчин метиленового синього 1:40, розчин туші, 0,5 % розчин НС1, 0,5% розчин нейтрального червоного, 1% розчин H2S04, культури Вас. anthracoidеs. Вас. sublilis, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicales.
Хід роботи:
1. Приготувати препарат з культури Вас. anthracoides для виявлення капсул.
2. Забарвити ендоспори культури Вас. subtilis.
3. Виявити включения жиру в клітинах Sаcchаromyces cerevisiae та гранул полі-b-оксимасляної кислоти у цієї культури.
4. Виявити включения волютину в культурі Sасchаromyces cеrevisiaе.
5. Промікроскопіювати та.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи № 9.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота № 9 |
|||
|
Будова бактеріальної клітини |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Замалювати готові препарати забарвлених по методу Романовського-Гімза ядер Candida tropicales, нуклеоїдів у клітинах Вас. anthracoidеs, джгутиків у культурі Proteus vulgaris 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 9 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Культивування мікроорганізмів
Мета роботи: Ознайомитися з методом культивування мікроорганізмів в лабораторних умовах
Теоретичні основи:
Культивування мікроорганізмів на поживних середовищах здійснюють різними методами. Вибір методу вирощування мікроорганізмів багато в чому залежить від типу їх харчування та дихання.
Мікроби одного виду, отримані на поживних середовищах, називають чистими культурами, а сукупність, клітин, що походять з однієї клітини, отримала назву клона.
Зберігання чистоти культур, які вивчаються, є важливою вимогою. Тому поживні середовища, які використовуються для пересіву культур, повинні бути стерильними, а розлив середовищ та посів культур повинні проводитися в асептичних умовах.
Методи розливу поживних середовищ
Мікроорганізми культивують у пробірках, колбах, чашках Петрі, матрацах та іншому посуді. Поживні середовища розливають безпосередньо з колб та пляшок або за допомогою піпеток. Для забезпечення стерильності розлив середовищ проводять біля полум’я пальника в радіусі не більше 10 – 15 см від його центру. Щільні по живні середовища перед розливом розплавлюють на водяній бані та охолоджують до температури 50 - 60 °С.
При розливі середовища у чашки Петрі посудину з середовищем беруть у праву руку та, три маючи її біля вогню, лівою рукою виймають пробку (затиснувши її мізинцем). Обпалюють горлечко посудини та, злегка відкривши лівою рукою кришку чашки, вводять під неї горлечко, не доторкаю чись до краю чашки. У кожну чашку наливають 15 - 20 мл середови ща (шаром 2 - 3 мм), розподіляючи середовище рівномірно по дну чашки. Якщо при цьому на поверхні середовища утворюються пу хирці повітря, до них підносять полум'я горілки або сірника ще до того, як середовище застигає - пухирці щезнуть. Потім кришку за кривають та дають середовищу застигнути. Якщо посів виконують у день розлива, середовище необхідно підсушити. Для цього чашки в термостаті обережно відкривають та встановлюють кришки та чашки дном доверху. Чашки витримують у термостаті 20 – 30 хвилин.
У пробірки розливають середовища по 3 - 5 мл або по 10 мл. Для приготування скошеного агару пробірки зі стерильним розплав леним агаровим середовищем укладають у нахиленому положенні (приблизно під кутом 20°), щоб середовище не заходило за 2/3 висоти пробірки, інакше воно може змочити пробку. Після того, як середо вище застигне, пробірки ставлять вертикально та дають стекти воді (конденсату). У колби, матраци та пляшки розливають середовища на 2/3 їх ємності.
Методи посіву мікроорганізмів
У залежності від характеру посівного матеріалу та середовищ існують різні методи посіву. Усі вони переслідують одну ціль: посіяти матеріал таким чином, щоб з оточуючого середовища у нього не попали сторонні мікроорганізми. Тому під час посіву не можна робити різких pyxiв та розмовляти. Найкраще проводити посіви у спеціальних приміщеннях - боксах.
Пробірки з посівним матеріалом та пробірку з середовищем тримають трохи нахилено у лівій руці між великим та вказівним пальцями так, щоб краї пробірок були на одному рівні, а їх основи знаходились поверх кисті. Петлю вертикально прожарюють, тримаючи правою рукою у полум’ї пальника. Пробки з пробірок вийма ють правою рукою, затискаючи їх між мізинцем та долонею.
Вийнявши пробки, обпалюють краї пробірок у полум’ї пальника. Прожарену петлю вводять через полум'я пальника у пробірку з посівним матеріалом, охолоджують та, набравши невелику кількість посівного матеріалу, обережно переносять його у пробірку з середо вищем.
При посіві на рідке середовище петлю злегка занурюють у рідину та розтирають посівний матеріал по стінці пробірки, після чо го змивають його середовищем. При посіві на скошений агар ма теріал розтирають на поверхні середовища зигзагоподібними рухами знизу вверх, починаючи від межі конденсаційної води.
Якщо посів проводиться на агарові або желатинові середовища, розлиті у пробірки стовпчиком, то петлею з посівним матеріалом проколюють стовпчик до дна, проводять так званий посів уколом. Після посіву петлю виймають з пробірки, краї пробірок обпалюють та, провівши пробки через полум'я горілки, пробірки закривають, а петлю прожарюють.
Посів рідкого матеріалу можна проводити стерильними пастеровськими або градуйованими піпетками. Крім того, для посіву мож на використовувати тампон з досліджуваним матеріалом. При посіві на рідкі середовища тампон занурюють у середовище та декілька се кунд ополіскують у ньому. При посіві на щільні поживні середовища матеріал з тампона ретельно втирають у поверхню середовища, обер таючи тампон.
Великим та вказівним пальцями лівої руки злегка відкривають кришку та вводять під неї обпалену петлю. Набравши посівний ма теріал, петлю виймають з чашки та закривають її. У ліву руку беруть пробірку з середовищем. Посів проводять так само, як з пробірки в пробірку. Після посіву чашку перевертають дном доверху.
Піпеткою, петлею або скляною паличкою наносять па поверхню середовища посівний матеріал та ретельно втирають його круго вими рухами шпателя доти, доки шпатель не перестане вільно ковзатись по поверхні агара. Лівою рукою при цьому притримують криш ку та одночасно обертають чашку. Після закінчення посіву скляний шпатель опускають у дезінфікуючий розчин, а металевий - прожа рюють у полум'ї пальника, засіяну чашку перевертають дном доверху.
Невелику кількість посівного матеріалу зигзагоподібними ру хами розподіляють по всій поверхні чашки, після закінчення посіву закривають чашку та пропалюють петлю.
Чашку зі сторони дна розкреслюють на сектори. Посів прово дять зигзагоподібними рухами від краю чашки до центру. При ньому необхідно слідкувати, щоб штрихи не заходили на сусідній сектор. Чашку закривають та перевертають дном доверху.
Злегка відкривши кришку, вносять у чашку тампон та рухами по колу втирають його вміст у поверхню середовища, обертаючи при цьому тампон і чашку. Чашку закривають та перевертають дном до верху.
Приблизно 1 мл рідкої культури (якщо культура вирощена на щільному середовищі, її емульгують у фізіологічному розчині або бульйоні) наносять піпеткою на поверхню агару та ретельно роз поділяють рідину по поверхні середовища. Чашку злегка нахиляють та піпеткою відсмоктують надлишок культури, виливаючи його у дезінфікуючий розчин. Туди ж вміщують піпетку.
Культуру, вирощену в рідкому середовищі, або суспензію мікробів вносять піпеткою в склянку з розтопленим та охолодженим до 45 оС агаровим середовищем, переміщують та виливають у стерильну чашку Петрі. Після застигання агару чашки перевертають дном доверху. Для посіву й товщу агару можна також внести посівний матеріал у порожню стерильну Чашку Петрі та залити 15 – 20 мл охолодженого до 45 оС агару. Для переміщування вмісту чашки її злегка похитують або обертають. Після застигання середовища чашку повертають дном доверху.
Посів у флакони, колби, матраци та пляшки проводять приблизно так само, як в пробірки, тільки спочатку набирають посівний матеріал, а потім відкривають пробірку в посудині з середовищем. Після посіву чашки, флакони надписують: пробірки - у верхній частині, чашки - зі сторони дна.
Засіяні середовища розміщують в умови, які забезпечують життєдіяльність мікроорганізмів. До таких умов відносяться темпе ратурний режим, вологість, аерація, світло та інші фактори.
Вирощування мікроорганізмів проводять в спеціальних шафах - термостатах або термостатованих кімнатах, у яких підтримується відповідна температура. Більшість мікроорганізмів розвивається при оптимальній температурі 25 - 37 °С. Вони належать до мезофілів. Верхня межа для них складає приблизно 38 - 45 °С.
Існує група мікроорганізмів - психрофілів, які розвиваються у межах від -20 до +20 °С.
Теплолюбні організми - термофіли - витримують нагрівання до 70 оС. Однак оптимальною температурою для їх росту є температура 45 – 65 оС.
Для розвитку мікроорганізмів необхідно підтримання певної вологості середовища. Мінімальний вміст вільної води, при якому ще можливий розвиток більшості бактерій, дорівнює 20%. Тому тривале зберігання культур на щільних середовищах як при кімнатній темпе ратурі, так і в холодильнику небажано, бо це приводить до підсихання середовища та загибелі мікроорганізмів.
Більшість мікроорганізмів не потребує освітлення при культивуванні. Світло необхідно при вирощуванні фототрофних мікроорганізмів, які використовують енергію світла в процесах обміну речовин. З цією метою звичайно використовують лампи роз жарювання потужністю 75 – 100 Вт.
Важливе значення при вирощуванні мікроорганізмів має три валість культивування. Більшість бактерій культивується протягом 18 - 24 годин при температурі 37 оС. Гриби вирощують при температурі 28 - 30 °С протягом двох діб. Актиноміцети при такій самій температурі ростуть 3 - 5 діб.
Матеріали, реактиви й устаткування:
ΜΠА в колбах, МПБ в колбах, середовище Чапека, стерильні чашки Петрі, пробірки, піпетки, бактеріологічні петлі, культури мікроорганізмів Вас.subtiiis, E. coli, Sarcina flava, Staph. aureus, сірники, сухе пальне, пальники, спирт, шпателі, тампони.
Хід роботи:
1. Опанувати техніку розливу поживних середовищ у колби, чашки Петрі, пробірки.
2. Опанувати основні методи посіву мікроорганізмів:
- у чашки Петрі бактеріологічною петлею;
- шпателем на чашки Петрі;
- на сектори;
- тампоном;
- у посуд зі щільним поживним середовищем;
- піпеткою в рідке поживне середовище.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи № 10.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота № 10 |
|||
|
Культивування мікроорганізмів |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Відповідь на контрольні питання 2) Висновки по лабораторній роботі №10 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Підрахунок клітин мікроорганізмів під мікроскопом
Мета роботи: Ознайомитися з методикою підрахунку клітин мікроорганізмів під мікроскопом за допомогою камери Горяєва-Тома
Теоретичні основи:
Підрахувати клітини мікроорганізмів під мікроскопом можна, використовуючи рахункові камери, капіляри Перфильева, препарати фіксованих і пофарбованих клітин, приготовлені на предметних стеклах або мембранних фільтрах. Перераховані методи дозволяють визначити загальна кількість клітин в одиниці об'єму. Варто пам'ятати, що підраховуються всі клітки, як живі, так і мертві. Основне обмеження більшості зазначених методів - необхідність досить високих концентрацій клітин в одиниці досліджуваного субстрату.
Підрахунок клітин у рахункових камерах.
Цей метод рекомендується використовувати для підрахунку великих об'єктів - дріжджів, одноклітинних водоростей, конідій грибів і деяких великих бактерій. Зазвичай використають камеру Горяева -Тома (рисунок 11.1), хоча можна застосовувати й інші рахункові камери.
А – вид з верху; Б – вид з боку
В – при малому збільшені мікроскопу.
Рисунок 11.1 – Підрахункова камера Горєва – Тома
Камера Горєва являє собою товсте предметне скельце розділене бороздками. На центральну частину скельця нанесена сітка. Площа квадрату сітки вказана на одній із сторін предметного скельця і складає 1/25 мм2 (великий квадрат) або 1/400 мм2 малий квадрат. Частина предметного скельця на якій розташована сітка на 0,1 мм нижче двох інших сторін. Це глибина камери.
При роботі з камерою необхідно підтримувати визначений порядок її заповнення. По-перше, заглиблення сіткою покривають спеціальним шліфованим покривним скельцем до появлення кілець Ньютона (ретельно притирають покривне скельце до сторін камери. Далі камеру заповнюють суспензією мікроорганізмів яку вносять крізь бороздку камеру капіляром або піпеткою. Підрахунок клітин починають через 3-5 хвилин після заповнення камери. Цей час необхідне для того, щоб клітини осіли і при підрахунку були видимі в одній площині. Кількість клітин підраховують з об’єктивом 8× та 40×. Підраховують клітини в 10 великих або 20 маленьких квадратах сітки, переміщаючи останні по діагоналі. Підраховують всі клітини, що лежать в квадраті сітки, а також клітини, що пересікають верхню і праву сторону квадрату. Кількість клітин в великому квадраті не повинна перевищувати 20, а в малому 10. В протилежному випадку суспензію розводять водопровідною водою. Для отримання достовірного результату, загальна кількість підрахованих клітин повинна бути не менше 600. Підрахунок клітин повторюють 3-4 рази при цьому кожний раз камеру монтують заново і заповнюють дріжджовою суспензією.
Кількість клітин в 1 мл суспензії розраховують по формулі
, (11.1)
де М – кількість клітин в 1 мл суспензії;
а – середня кількість клітин в квадраті сітки;
h – глибина камери в мм;
S – площа квадрату сітки в мм2;
103 – коефіцієнт переводу см3 в мм3;
n – розведення суспензії мікроорганізмів.
Матеріали, реактиви й устаткування:
Дріжджі хлібопекарські Saccharomyces cerevisiaе, камера Горяєва – Тома, мікроскоп, капіляри або піпетки.
Хід роботи:
Провести підрахунок кількості дріжджових клітин в 1 мл суспензії.
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи №11.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота №11 |
|||
|
Підрахунок клітин мікроорганізмів під мікроскопом |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
|
1) Розрахувати кількість клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiaе в 1 мл суспензії за формулою 13.1 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 11 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
Вимірювання розмірів клітин
Мета роботи: Ознайомитись з методикою вимирювання розмірів мікроорганізмів
Теоретичні основи: Дріжджові клітини вимірювали під мікроскопом за допомогою гвинтового окулярного мікрометру (рисунок 12.1) .
1 – корпус; 2 – відрахунковий барабан; 3 – окуляр з діоприйною наводкою; 4 – вінт для кріплення на тубусі мікроскопу;
5 – вид під мікроскопром.
Рисунок 12.1 - Окулярний мікрометр
Окулярний мікрометр являє собою круглу скляну пластинку, в центрі якої знаходиться лінійка довжиною 5 мм. Лінійка розділена на 50 частин. Окулярний мікрометр вставляють в окуляр. Для цього викручують окулярну лінзу окуляра поміщають на його діафрагму окулярний мікрометр намітками вниз та закручують лінзу. Однак, діленнями окулярмікрометру не можна виміряти величину клітини, тому що останні продивляються через об’єктив та окуляр, а поділи лінійки – тільки через верхню лінзу окуляру. Тому, перед тим, як почати вимірювання величини клітин, необхідно визначити ціну ділення окулярного мікрометру для даного збільшення мікроскопу, що роблять за допомогою об’єктивного мікрометру (рисунок 12.2).
а – загальний вид; б – вид під мікроскопом.
Рисунок 12.2 – Об’єктивний мікрометр
Об’єктивний мікрометр – це металічна пластина з вирізом в центрі. В виріз вставлено скло, на якому нанесено лінійку довжиною 1 мм. Вона розділена на 100 частин, тобто ділення об’єктивного мікрометру складає 0,01 мм, або 10 мкм. Для визначення ціни ділення окулярного мікрометру об’єктивний мікрометр поміщають на столик мікроскопу й фокусують при малому збільшені. Зображення лінійки переміщають в центр поля зору і тільки після цього змінюють об’єктив на той, при якому будуть визначатися розміри клітин. Переміщаючи столик мікроскопу і повертаючи окуляр, встановлюють мікрометри так, щоб їх шкали були паралельні і одна перекривала другу. Ціну ділення окулярного мікрометру визначають за принципом ноніуса, тобто суміщають одне ділення шкали окулярного і об’єктивного мікрометрів і находять слідуючи їх ділянки сумісництва (рисунок 12.3).
1 – об’єктивний мікрометр; 2 – окуляр мікрометр
Рисунок 12.3 - Визначення ціни ділення окулярного мікрометру:
Встановлюють, скільком діленням об’єктивного мікрометру мікрометру відповідає одне ділення окулярного мікрометру. Наприклад, два ділення об’єкт – мікрометру (20 мкм) відповідають п’яти діленням окуляр – мікрометру, тобто, одне тобто одне ділення окуляр – мікрометра дорівнює 4 мкм (20:5). Якщо тепер на столик мікроскопу положити препарат з клітинами мікроорганізму і роздивляти його при тому ж збільшенню, то можна визначити величину клітини. Для цього визначають, якому числу ділень окулярної лінійки відповідає величина виміряємого об’єкта, і помножують це число на ціну ділення окулярного мікрометра.
Оскільки для вимірювання краще використовувати живі, а не фіксовані клітини (фіксація і фарбування приводять до змінення розмірів клітин) проводили вимірювання дріжджових клітин також за допомогою фазово-контрасного пристрою (рисунок 12.4).
Рисунок 12.4 – Фазово – контрастний пристрій
Визначення розмірів клітин фазово-контрасною мікроскопією Препарати живих кліток мікроорганізмів по фарбуванню і прозорості мало відрізняються від навколишнього середовища, тому що світлові промені, проходячи через живу клітку, не змінюють своєї амплітуди, хоча і змінюються по фазі. Метод фазово-контрастної мікроскопії дозволяє перетворити невидимі фазові зміни, що перетерплюються світловою хвилею при проходженні через мікробну клітину, у видимі амплітудні і тим самим підвищити контрастність зображення. Оптична система, яка використовується для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластинки і кільцевої діафрагми.
Фазова пластина - це коло напилювання із солей рідких металів на одну з лінз об'єктива, вона забезпечує зміну фази минаючої хвилі на 1/4, що приводить до перетворення фазових розходжень в амплітудні. Кільцева діафрагма - це непрониклива для світла пластина, що має прозору щілину у виді кільця, через яку надходить світло в конденсор. Фазовий ефект виходить лише при точному сполученні фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми.
Фазово-контрастний пристрій складається з набору фазових об'єктивів, що мають на металевій оправі крім указівки збільшення ще і позначку "Ф", револьверного конденсора з набором кільцевих діафрагм, кожна з який відповідає фазовій пластинці визначеного об'єктива, і допоміжного мікроскопа, призначення якого - центрування кільцевої діафрагми стосовно фазової пластинки об'єктива.
Застосування фазово-контрасного пристрою не збільшує дозволяючи здатність мікроскопу але дає можливість побачити прозорі об’єкти більш чітко і навіть виявити деякі структури в клітинах дріжджів. При роботі з фазово-контрасним прстоєм для вимірювання дріжджових клітин застосовується також гвинтовий окулярний мікрометр МОВ-1-15.
Матеріали, реактиви й устаткування: мікроскоп, об’єктивний мікрометр, окулярний мікрометр, культура дріжджів.
Хід роботи:
Контрольні питання:
Форма звітного бланка до лабораторної роботи № 12.
|
Група |
Курс |
Лабораторна робота № 12 |
|||
|
Вимірювання розмірів клітин |
|||||
|
Прізвище студента |
|||||
2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі № 12 |
|||||
|
Роботу прийняв |
Дата |
Підпис |
1. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум no микробиологии пищевых продуктов. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984.-186 с
2. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. -М.: Медицина, 1978.-205
3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие/ Под ред. Н.С. Егорова, - М., изд-во МГУ, 1983.-215с.
4. Черемисинов Н.А., Баева Л.И., Амухатова Ο.Α. Практикум по микро биологии. -М.: Высшая школа, 1967.- 169 с.
5. Теппер Е.З, Шильникова В.К., Переверзева Г.Т. Практикум по
микробиологии .- М.:Колос, 1993.-175 с.
6. Костенко Т.С. Скоршевская Е.И., Гительсон С.С Практикум
по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.:
Агропромиздат, 1989.- 105 с
7. Методичні вказівки до лабораторних робіт з дисципліни «Біохімія і мікробіологія біологічних агентів», частина 2 “Мікробіологія - для студентів спеціальності 7.091607 – “Біотехнологія” Укладач Т.К.Винокурова; Дніпродзержинськ, ДДТУ, 2001, 52 стор.
Навчальне видання
Методичні вказівки до лабораторних робіт з дисципліни „Загальна мікробіологія та вірусологія” для студентів напряму 6.051401 „Промислова біотехнологія” всіх форм навчання
Укладачі: Філімоненко Ольга Юріївна
Філімоненко Дмитро Володимирович
Підписано до друку______________2009 р.
Формат________________ Обсяг_________________
Тираж______________ екз. Заказ_________________
51918, м. Дніпродзержинськ, вул. Дніпробудівська,2