Лабораторная работа 309 Определение аминокислот в их смеси
Работа добавлена на сайт samzan.net:
Лабораторная работа №309
Определение аминокислот в их смеси.
Литература:
ФХМА, М. 2001г, стр. 447-463
Краткое теоретическое введение:
Общая характеристика метода
Создание метода бумажной хроматографии (в 1944 г.) значительно расширило возможности разделения, идентификации и количественного определения ма лых количеств веществ в различных областях химии и биохимии. В зависимости от того, какого типа применяют бумагу или чем ее пропитывают, механизм разделения может быть различным: распределительным, адсорбционным, ионообменным, осадочным или смешанным. Однако в большинстве случаев на практике исполь зуют метод, в котором реализуется распределительный механизм, когда разделение достигается за счет различного распределения вещества между двумя жидкими фазами — вариант жидкость-жидкостной хроматографии. Поэтому ниже бумажная хромато графия будет рассмотрена в идеальном варианте распределитель ного механизма, когда неподвижная фаза, как правило, вода, удерживается твердым носителем — хроматографической бума гой, а подвижная фаза представляет собой органический раство ритель (или смесь растворителей) с добавлением кислот и воды.
Анализ смеси веществ этим методом проводится по следую щей схеме: на полоску бумаги различной формы на небольшом расстоянии от одного из ее концов наносят на линию старта в ви де капли (или полоски) смеси разделяемых веществ. После высы хания капли край бумаги ниже линии старта погружают в подвиж ную фазу, налитую на дно хроматографической камеры, затем подвешивают вертикально полоску бумаги, плотно закрывают ка меру и оставляют на некоторое время (восходящий вариант). Подвижная фаза под действием капиллярных сил поднимается по бумаге, вместе с ней перемещаются с различной скоростью анализируемые вещества. Когда фронт подвижной фазы прибли зится к противоположному концу бумаги или пройдет заданное расстояние, лист вынимают и сушат.
Зоны разделяемых веществ в виде пятен, которые могут быть как видимыми, так и невидимыми, обнаруживают, отмечают по ложение и проводят определение (качественное и количествен ное) разделенных компонентов.
Хроматографическая бумага. Подвижная фаза.
Хроматографическую бумагу изготавливают из высококачественного хлопка, т. е. из практически чистой α-целлюлозы (до 98%). Древесину в качестве исходного сырья не применяют, так как при длительной переработке ее и очистке получаются короткие и хаотично распо ложенные волокна бумаги. Хроматографическая же бумага должна представлять собой длинные, ориентированные в определенном направлении волокна. В этом случае нанесенная на бумагу жид кость перемещается по капиллярам, образуемым волокнами хро матографической бумаги. Наиболее четкое и воспроизводимое разделение достигается в том случае, когда направление движе ния подвижной фазы совпадает с направлением волокон бумаги.
α-Целлюлоза даже после сушки содержит в порах значительное количество связанной воды (гигроскопическая влага, до 25%), ко торая и служит неподвижной фазой. Физическая структура свя занной воды в целлюлозе сильно отличается от структуры "сво бодной воды", которая иногда применяется в качестве подвиж ной фазы или входит в ее состав.
Хроматографическая бумага должна отвечать следующим тре бованиям:
1) быть химически чистой, для чего ее предварительно обраба тывают растворами минеральных кислот, щелочей или ацетоном и спиртами, которые вымывают различные органические и неор ганические примеси;
2) быть химически и адсорбционно инертной по отношению к разделяемым веществам и подвижной фазе;
3) быть однородной по плотности и толщине; чем плотнее бу мага, тем медленнее скорость движения зон по ней, но тем боль шее количество вещества можно разделить (сорбционная емкость бумаги выше);
4) иметь длинные и определенным образом ориентированные волокна.
Хроматографические параметры.
Скорость перемещения по бумаге разделяемых веществ определяется соответствующими ко эффициентами распределения КД . Чем меньше величина КД тем быстрее вещество передвигается по бумаге. Оп ределить КД непосредственно из хроматографического экспери мента, т.е. найти концентрацию в подвижной и неподвижной фазах, довольно сложно. Поэтому в качестве основной характе ристики удерживания вещества, показывающей положение его зоны на полоске хроматографической бумаги, используется фак тор Rf, определяемый как отношение скорости (или расстоя ния) движения фронтов зоны и подвижной фазы:
Rf = l/L
где / — расстояние от линии старта до середины зоны хроматографируемого соединения, см; L — расстояние, пройденное под вижной фазой от стартовой линии до линии фронта.
Таким образом, величина Rf указывает на местоположение зо ны вещества на хроматограмме. Если Rf = 0,5, значит зона распо ложена на середине пути подвижной фазы. Фактор Rf меняется от 0 (зона на старте) до значения, близкого к 1 (зона движется с фронтом подвижной фазы). Величина Rf не зависит от концен трации определяемого вещества (если не превышена емкость бу маги) и от присутствия других веществ, но зависит от ряда других факторов: от природы вещества (возможны пространственные за труднения, возникающие при взаимодействии с растворителем функциональной группы определяемого вещества); от природы подвижной и неподвижной фаз; от сорта бумаги и от температуры.
Значения Rf для многочисленных веществ при определенных условиях приведены в справочной литературе.
Разделение двух веществ возможно, если Rf1 ≠ Rf2 и ∆Rf ≥ 0,1. Критерий разделения R рассчитывается по формуле:
Коэффициент распределения связан с Rf соотношением:
где VП / VH — отношение объемов подвижной и водной фаз в по лоске бумаги, которое находится экспериментально взвешивани ем хроматографической полосы до и после эксперимента.
Для более строгого вычисления КД требуется измерить отно шение площадей поперечного сечения подвижной АП и непод вижной АН фаз:
Типы хроматограмм.
В зависимости от направления движения подвижной фазы различают несколько способов получения хро матограмм: восходящий и нисходящий, линейные способы, круговой, электрофоретический, двумерный и др.
Оборудование. Методика эксперимента.
Применяемая в бу мажной хроматографии аппаратура отличается своей простотой и доступностью, что выгодно отличает этот метод от колоночной хроматографии.
Хроматографирование проводят в хроматографической каме ре, в качестве которой можно применить любой сосуд с гермети ческой крышкой, чтобы не происходило испарения растворите ля, которое может привести к нежелательному изменению состава одной или обеих фаз. Таким сосудом может быть цилиндр, высокий стакан, эксикатор, чашка Петри (для круговой хроматогра фии). Внутрь камеры вставляют держатель или подставку-стойку для полоски хроматографической бумаги и небольшую емкость для подвижной фазы.
Анализируемый раствор наносят на стартовую линию в объеме не более 5—10 мкл с помощью микропипетки, калиброванного капилляра или микрошприца. Чем меньше площадь стартового пятна, тем менее размытой будет зона вещества после хроматографирования. Поэтому пробу смеси веществ объемом более 1 мы наносят в одну и ту же точку повторно в несколько приемов, ка ждый раз подсушивая пятно. Подсушивать пятно над нагрева тельными приборами надо осторожно, чтобы не удалить из пор хроматографической бумаги неподвижную фазу.
Во время хроматографирования ни в коем случае нельзя откры вать крышку сосуда, чтобы не сместить равновесие между фазами.
После развития хроматограмм их сушат под тягой в специаль ном шкафу в токе теплого воздуха или под инфракрасной лам пой. После высушивания приступают к обнаружению и иденти фикации пятен.
Качественный анализ.
Если хроматографируемые вещества окрашены, то зоны их наблюдаются визуально. Если зоны бесцветны, то их обнаруживают на полоске бумаги следующими приемами.
Проявляют хроматограмму раствором-проявителем, который дает с определяемым веществом окрашенный продукт реакции. Проявитель наносят путем распыления с помощью пульверизато ра. Очень часто хроматограмму помещают в пары иода (в закры тый сосуд), который вступает в реакцию с различными органиче скими веществами, окрашивая их в желтый, коричневый или чернильно-синий цвет. Используют также специфическую реак цию на алифатические амины и аминокислоты с нингидрином: после опрыскивания реагента и последующего нагревания бумаги на ней появляются окрашенные в малиново-красный цвет пятна. Для проявления неорганических ионов, например Fe3+ и Со2+, на хроматограмму распыляют 10%-ный раствор роданида аммония в ацетоне, при этом зона железа окрашивается в красно- коричне вый цвет, кобальта — в синий вследствие образования комплекс ных роданидных ионов этих элементов. Иногда реактив наносят на хроматограмму кисточкой, если требуется проявление на огра ниченном участке бумаги.
Бесцветные вещества можно обнаружить при воздействии ультрафиолетовых лучей по возникновению их собственной флуоресценции или путем обработки их каким-либо реагентом, дающим специфическую флуоресцентную реакцию (флуоресци руют продукты реакции). Чтобы получить флуоресценцию, по лоску бумаги помещают в ультрафиолетовый свет ртутной лампы с определенными фильтрами и тут же обводят карандашом поя вившиеся пятна.
После обнаружения на бумажной хроматограмме зон разделяе мых веществ обычно приступают к их идентификации. Как пра вило, исследователь знает примерно состав анализируемой смеси. В этом случае идентифицировать зоны, т.е. определить принадлежность их к определенным веществам, можно несколькими способами.
1. Зная проявляющий реагент и окраску продукта реакции, по характерному цвету пятна соотносят зону тому или другому опре деляемому веществу. Аналогично можно провести идентифика цию по окраске флуоресцирующих пятен.
2. Сравнивают измеренные величины Rf с известными.
3. Проводят хроматографирование со "свидетелем". Для этого рядом с каплей определяемого вещества на линию старта наносят столько капель растворов индивидуальных веществ, сколько их содержится в анализируемой смеси. После хроматографирования и проявления сопоставляют положения пятен исследуемой смеси и "свидетелей" и делают вывод о присутствии или отсутствии их в анализируемом растворе.
Количественный анализ.
В бумажной хроматографии сущест вует две группы способов количественного анализа: непосредст венно на хроматограмме или после извлечения (элюирования) зо ны с хроматограммы. Количественное определение вещества на хроматограмме проводят следующими методами.
Исходят из пропорциональности между количеством вещества и площадью пятна. В интервале микрограммовых количеств хро-матографируемых веществ между площадью пятна и содержани ем вещества в нем наблюдается линейная зависимость
или
где S — площадь пятна, мм; g — содержание вещества в пятне.
В этом случае на полоску бумаги наносят несколько капель, содержащих разные, но определенные концентрации вещества (метод градуировочного графика). После хроматографирования измеряют площадь пятен. Затем строят градуировочный график или методом наименьших квадратов получают числовое значение коэффициентов а и b. Измерив площадь пятна определяемого ве щества, его содержание в пятне находят по графику или рассчи тывают по уравнению.
Используют и такой метод: вырезают и взвешивают пятно на бумаге и аналогичный по площади чистый кусочек той же бума ги, по разности находят массу вещества.
Если зоны (пятна) на хроматограмме окрашены, содержание вещества определяют по интенсивности окраски. В этом случае сравнивают интенсивность окраски с полученной на бумаге шка лой пятен различной интенсивности (и, следовательно, различ ного содержания данного вещества). Сюда же можно отнести определение содержания вещества по степени почернения фото пленки или фотобумаги в методе авторадиографии. Можно также измерить интенсивность окраски пятна на бумаге фотометриче ски на денситометре в отраженном или проходящем свете. Ден ситометр записывает пики, которые сравнивают с пиками стан дартных проб.
Количественный анализ можно провести путем извлечения (элюирования) вещества с хроматограммы водой или другим рас творителем с последующим измерением концентрации вещества в экстракте различными химическими, физико-химическими или физическими методами (титрование, фотометрия, потенциометрия, полярография и т. д.).
Практическая часть:
В работе анализируют смесь аминокислот — β-фениланилина (1), α-аланина (2), аспарагиновой кислоты (3), аргинина гидро хлорида (4):
Разделение смеси основано на различии коэффициентов рас пределения аминокислот между подвижной и неподвижной фа зами. Для проявления хроматограммы используют специфичный реактив на аминокислоты — нингидрин. По проявленной хрома-тографической зоне устанавливают качественный состав смеси (измеряют величины Rf) и количественное содержание одной из кислот по линейной зависимости площади пятна аминокислоты от ее содержания в пятне (метод градуировочного графика).
Приборы и реактивы
Хроматографическая бумага марки "С", круг диаметром 12 см.
Фильтровальная бумага, 8 х 8 см.
Эксикатор.
Пульверизатор.
Микрошприц вместимостью 10 мкл.
Пинцет.
Транспортир.
Канцелярская булавка.
Шаблон.
Растворы -"свидетели" аминокислот (β-фенилаланин, α-аланин, аспарагиновая кислота, гидрохлорид аргинина), содержа щие по 0,8—1 мг/мл аминокислот; соотношение изопропилового спирта и воды 1:9.
Подвижная фаза: смесь воды, изопропилового спирта и уксус ной кислоты (5:4:1); компоненты встряхивают в делительной во ронке и после расслоения используют в качестве подвижной фа зы верхний слой смеси.
Проявитель: 0,25%-ный раствор нингидрина в водно-насы щенном «-бутиловом спирте.
Выполнение работы
Все манипуляции с хроматографической бумагой проделыва ют с помощью пинцета. Бумагу следует брать руками только за внешний край круга.
На круг хроматографической бумаги накладывают шаблон с пятью секторами и простым карандашом очерчивают линию фронта (на рис. 5.32). В четыре сектора с помощью микрошприца в 2—3 приема в одну и ту же точку на стартовой линии (на ри сунке обозначено звездочками) наносят по 4 мкл растворов-"свидетелей" четырех аминокислот. После каждого нанесения пробы пятну дают подсохнуть. Диаметр пятна не должен превы шать 3 мм и ни в коем случае пятно не должно касаться границ секторов. Последовательность нанесения растворов-"свидетелей" аминокислот записывают в тетрадь. На стартовую линию пятого сектора микрошприцем наносят раствор, содержащий смесь аминокислот неизвестного состава (объем пробы указывает пре подаватель).
Из квадрата обычной фильтровальной бумаги сворачивают ко нус и с помощью канцелярской булавки скрепляют его. Вершину конуса вставляют в отверстие круга и круг с конусом помещают в эксикатор строго горизонтально таким образом, чтобы край круга лежал на внутреннем выступе эксикатора, а основание конуса было погружено в подвижный растворитель, находящийся в чаш ке на дне эксикатора (рис. 5.33). Движение растворителя и зон компонентов происходит от центра к периферии.
Развитие хроматограммы останавливают примерно че рез 30—40 мин, когда фронт растворителя достигнет очер ченной линии финиша. Хроматограмму извлекают из эксикатора пинцетом и помеша ют для высушивания в бокс под тягу. Сухую хроматограмму опрыскивают из пульверизато ра проявителем и снова подсу шивают. Опрыскивать следует так, чтобы хроматограмма ста новилась лишь влажной Не допустимо, чтобы раствор проявителя стекал с хроматограммы струйками. Затем хроматограмму осторожно нагревают над закрытой электроплиткой до появ ления окрашенных пятен в виде части колец.
Измеряют величины Rf индивидуальных аминокислот и уста навливают качественный состав смеси.
Для проведения количественного анализа рассчитывают пло щадь части кольца — проявленная хроматографическая зона — с центральным углом φ:
Угол φ (в градусах) находят с помощью транспортира.
По установленной линейной зависимости (гра фик прилагается) находят содержание одной из аминокислот. Хроматограмму помещают в лабораторный журнал.
6
2. Реферат- Регулирование деятельности иностранного банковского капитала за рубежом
3. Тема- АИ Куприн
4. Hrt~s Quiz 1 Вводная часть
5. наукового інституту права психології та економіки Львівського державного університету внутрішніх справ
6. Мобильный маркетинг займет ли мобильная рекламная технология свое место под солнце
7. .Узбекские рабочие временно работающие в России и получающие здесь заработную плату увеличивают
8. Мы рассказываем тебе самый прекрасный рассказ Йусуф 3
9. Зиммель Мост и дверь Тот образ вещей внешнего мира которым мы обладаем двойственен- в природе все может
10. НА ТЕМУ- ПРОЕКТИРОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ЗДАНИЙ ТЕКСТИЛЬНОЙ И ЛЕГКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
11. На тему Зимний дворец
12. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА по курсу
13. Курсовая работа- Бюджетное законодательство РФ
14. ~f~sd t~r~d~c~k v~ ~ox dikb~l~q yxud z~lm ed~c~ksinizrdquo; ~ dey~ bildirdik
15. Лекция БЕЗОПАСНОСТЬ ЖИЗНЕДЕЯТ
16. Дипломная работа- Бюджетирование деятельности организации
17. Сущность бухгалтерской профессии
18. тема 12в тетрадки дата 07
19. Бизнес план промышленного предприятия.1
20. Китай країна з найбільшою чисельністю населення