Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лекция №13. Основные генетические механизмы
Параграф 1. НК в живой клетке
Пункт 1. История открытия
ДНК была открыта Иоганном Фридрихом Мишером (1844 — 1895), в 1868 году. Из остатков клеток, содержащихся в гное, он выделил вещество, в состав которого входят азот и фосфор. Вначале новое вещество получило название нуклеин, а позже, когда Мишер определил, что это вещество обладает кислотными свойствами, оно стало называться нуклеиновая кислота.
Термин «хромосома» был предложен немецким гистологом Генрихом Вальдейером (1836 – 1921) в 1888 году, «хромосома» в буквальном переводе означает «окрашенное тело», поскольку основные красители хорошо связываются хромосомами. Однако до Вальдейера эти тела в ядре делящейся клетки видели очень многие учёные, настолько многие, что не представляется возможным узнать, кто увидел их первым.
После подтверждения в 1900 году законов наследственности Грегора Иогана Менделя (1822 – 1884) Гуго де Фризом (1848—1935) начались поиски того самого элемента наследственности, который предопределял признаки потомства. В 1902-1903 годах Теодор Бовери (1862—1915) и Уолтер Сеттон (1877-1916) независимо друг от друга выдвинули гипотезу о генетической роли хромосом, наблюдая за их поведением. Теодор Бовери поставил эксперимент с личинками морского ежа, доказавший, что единицы наследственности лежат именно в ядре (самостоятельно). Они же позднее сформулировали хромосомную теорию наследственности, которую расширили и доработали Томас Морган и его сотрудники (1910-1915).
Т. Морган и его коллеги ошибочно считали, что ген является единицей мутации, рекомбинации и функции, т.е. гены мутируют и рекомбинируют как единое целое.
В 20-30-х гг. XX века А.С. Серебровским и Н.П. Дубининым на примере генов дрозофилы было показано, что гены имеют сложную природу. Это открытие подтвердилось последующими работами зарубежных учёных.
Одно из первых решающих доказательств того, что ДНК действительно несёт гентическую информацию принесли эксперименты по трансформации бактерий (о трансформации поговорим далее) в 1944 году (прошу обратить внимание на то, как поздно это случилось). Но мы не будем разбирать эти и другие великолепные открытия. Для этого есть курс генетики.
Пункт 2. Структура ДНК
Мы непосредственно обратимся к тому, что важно для наших рассуждений – к собственно структуре ДНК. Её впервые чётко охарактеризовали двое английских учёных, но перед этим была небольшая череда предпосылок.
Таким образом, когда Джеймс Уотсон (1928 год, 85 лет старичку) и Френсис Крик (1916 - 2004) делали свою работу, они основывались на уже имевшихся данных. Их модель экспериментально подтвердилась, и им вместе с М. Уилкинсом дали Нобелевку. Только после установления строения ДНК стала возможна её расшифровка. Расшифровка структуры ДНК помогла объяснить и принцип её репликации (полуконсервативный).
Позднее оказалось, что двойная спираль, предложенная Уотсоном-Криком, оказалась универсальной только в одном – это действительно правильная двойная спираль с антипараллельной ориентацией нитей и там действительно действует правило комплементарности Чаргаффа. В остальном это была лишь самая распространённая из форм ДНК – правозакрученная, с параллельным водородными связями, так называемая B-форма (расстояние между соседними нуклеотидами в ряду – 0,36 нм). Существует множество различных так или иначе отличающихся форм, в том числе спирали без различий в большом и малом желобке, левозакрученные спирали, спирали с косым расположением связей и др. Существует множество форм.
С расшифровкой генетического кода и с историей создания механизмов этой расшифровки мы познакомимся на следующей лекции. Пока что запишем свойства генетического кода:
Бывают терминирующие триплеты (стоп-кодоны). Обычно их три – УАА, УАГ и УГА. Информация генетического кода переписывается с ориентацией 3’-5’ на РНК. Значения тех или иных последовательностей могут меняться от организма к организму, но общее сходство впечатляет. Есть подтверждённая теория о том, что существующий генетический код – это одна из самых эффективных форм организации генома, какие только могли быть, и его вырожденность играет в этом не последнюю роль (подумайте почему).
Параграф 2. Аспекты организации и функционирования генома эукариот
Для эукариот типичным является прерывистый характер структурно-функциональной организации генов. Информация такого гена существует не в виде непрерывной цепочки нуклеотидов, а в форме кодирующих фрагментов (экзонов), которые прерываются инертными интронами, не принимающими прямого участия в кодировании того или иного продукта.
Как происходит регуляция нашего тяжелого гена? Каким образом в РНК не попадают некодирующие интроны? Возникшую в начале гетерогенную ядерную РНК необходимо подвергнуть созреванию.
Процессинг состоит в ферментативном разрезании первичного транскрипта с последующим удалением его интронных участков и воссоединением (сплайсингом) его экзонных фрагментов, формирующих непрерывную структуру матричной, или информационной РНК.
Наиболее известен процессинг иРНК, с которых осуществляется синтез собственно белков. Выделяют следующие модификации: кэпирование, сплайсинг и полиаденилирование. В этом процессинге большую роль играют т.н. мяРНК, которые связываются с интронными участками и обеспечивают их вырезание.
Кэпирование и полиаденилирование происходят в самом начале процессинга. Кэпирование – это присоединение к 5’ концу через несвойственную для НК связь метилгуанозина. Эта структура называется “cap” – англ. кепка, шапка; выполняет множество функций, о которых советую почитать дополнительно, в их числе – предохранение РНК от преждевременного ферментативного разрушения, инициация транскрипции, помощь в выходе из клеточного ядра.
Полиаденилирование – модификация 3’ конца. Образование длинного полиаденилинового хвоста (100-200 последовательно соединённых аденилинов). Этот хвост обеспечивает транспорт молекулы к рибосоме, защищая её от ферментативного разрушения, но сам постепенно разрушается, чем и определяет срок жизни нашей мРНК.
Процессинг у других типов РНК протекает своеобразно. В транспортной РНК складывается присущая ей клеверная структура, модифицируются основания, встраивается тимин (это единственная РНК, имеющая в своём составе тимин).
Большинство генов прокариот, кодирующих белки, не имеют интронов, поэтому у них сплайсинг пре-мРНК встречается редко. У представителей эукариот, бактерий и архей встречается также сплайсинг транспортных РНК (тРНК) и других некодирующих РНК.
Параграф 3. Аспекты организации и функционирования генома прокариот.
Ещё в моргановские времена было введено понятие цистрона – участка ДНК, кодирующего одну белковую молекулу. В настоящий момент это название устарело, но…эта формулировка пришлась как раз кстати, когда начали изучать структурные особенности геномов прокариот. Оказалось, что их «гены» имеют полицистронное строение – то есть одна функциональная единица кодировала множество белков.
В 1961 г. Ф. Жакоб и Д. Моно установили общий принцип работы оперона – группы генов, определяющих синтез функционально связанных ферментов. Эта модель явилась мощным стимулом в разработке практического использования знаний о нуклеиновых кислотах, включая и развитие генной инженерии.
Другое определение: оперон (транскриптон) – это участок, транскрипция к-рого осуществляется на одну молекулу информационной РНК (иРНК) под контролем белка-репрессора.
А - активатор, часть промотора, к которому присоединяется белок-активатор (САР - белок или catabolite activator protein), что активирует присоединение РНК- полимеразы к промотору; это "положительно" контролирующий элемент, который есть не в каждом опероне.
П - ген-промотор - это участок ДНК, который распознается ферментом РНК - полимеразой и указывает место, где должна начинаться транскрипция.
О - ген-оператор, управляющей работой структурных генов; "негативно" контролирующий элемент - присутствие на нем белка-репрессора прекращает транскрипцию.
Т - ген-терминатор - это участок, после которого прекращается транскрипция и перед которым прекращается трансляция. В состав этого участка входит один из трех кодонов терминаторов (стоп-кодонов). В некоторых оперонах между оператором и структурными генами расположен участок(16 пар оснований), частью которого является аттенуатор, служащий барьером для транскрипции.
Итак, методы регуляции синтеза ферментов:
Индукция и репрессия. Синтез продуктов осуществляется только в присутствии индуктора, это позитивный контроль активности (пример – регуляция lac-оперона у E.coli). Иначе осуществляется отрицательный контроль – синтез продуктов прекращается в присутствии молекулы – корепрессора, которая изменяет конфигурацию ранее неактивного белка-репрессора.
Синтез сигма-фактора. Серия сигма-факторов может регулировать сложных процесс. Каждый из них даёт возможность полимеразе узнавать определённую последовательность перед генами и транскрибировать именно их. Фаги используют эти факторы для контроля синтеза РНК в своём жизненном цикле. Способ распространён среди прокариот.
Параграф 4. Наследственность у прокариот
У прокариотических организмов изменчивость вызывают (если не считать мутации) три механизма: конъюгация, трансформация и трансдукция.
Конъюгация предполагает непосредственный контакт клетки-хозяина и клетки-реципиента. Клетка-донор должна обладать так называемой половой плазмидой ( F-фактором), который может быть или автономен, или интегрирован в хромосому. Он обуславливает способность клетки формировать половые пили и вступать в контакт с клетками - реципиентами. Штаммы, содержащие F-фактор в хромосоме носят название HFr.
Плазмиды – кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые могут существовать и реплицироваться как независимо от бактериальной хромосомы, так и быть интегрированными в неё. Плазмиды не являются обязательным для клеток элементом, хотя могут давать определённые преимущества. Известно, что они могут нести гены устойчивости к антибиотикам, гены факторов патогенности, гены, определяющие дополнительную метаболическую активность.
Скорость переноса в определённых условиях для одного штамма постоянна. Обычно всей хромосоме не получается перейти в ходе конъюгации, так как контакт клеток очень нестабилен и часто прерывается. Поскольку первым реципиенту всегда удаётся передать участок гена, расположенный ближе всего к половому фактору, можно составить генетическую карту, оценивая лишь частоту передачи того или иного гена конъюгацией в пределах одного штамма.
Трансформацией называется процесс изменения свойств одних бактерий под влиянием экзогенной ДНК, выделенной из других бактерий. Для трансформации не нужна клетка-донор, проникновение фрагментов ДНК зависит от физиологического состояния клетки-реципиента (компетентности). Только двухцепочечные фрагменты ДНК значительной молекулярной массы могут быть трансформирующими агентами. Также, эта ДНК должна обладать определённой степенью гомологии с ДНК реципиента.
В процессе трансдукции функцию переноса генов выполняют фаги, случайно захватывающие фрагменты хромосомы в процессе формирования зрелых фаговых частиц. При заражении клетки-реципиента таким фагом в неё может включаться фрагмент ДНК другой клетки путём обмена по гомологичным участкам. Фаги в данном случае играют роль векторов. Вектор – молекулярная структура, способная к захвату и переносу фрагментов ДНК от одного организма к другому.
В настоящее время векторные системы хорошо разработаны для Escherichia coli. Освоение систем хозяин-вектор для промышленных микроорганизмов (бациллы, актиномицеты, псевдомонады, дрожжи) – задача промышленной микробиологии.
Все эти три процесса имеют сущность рекомбинации, благодаря этому не происходит перегружения клетки генетической информацией.