Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
34
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
ВІЩУР ОЛЕГ ІВАНОВИЧ
УДК 577.27:619:612.176:616-084:636.4
БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ФОРМУВАННЯ ТА РЕГУЛЯЦІЇ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ У ТЕЛЯТ І ПОРОСЯТ У РАННЬОМУ ВІЦІ
03.00.04 –біохімія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора ветеринарних наук
Львів –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.
Науковий консультант –доктор ветеринарних наук, професор,
академік УААН Влізло Василь Васильович
Інститут біології тварин УААН, директор.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Янович Вадим Георгійович,
Інститут біології тварин УААН,
головний науковий співробітник лабораторії живлення великої рогатої худоби;
доктор ветеринарних наук, професор
Гуфрій Дмитро Федорович,
Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького МАП України, завідувач кафедри фармакології та токсикології;
доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник
Чумаченко Володимир Володимирович,
Державний науково-контрольний інститут біотех-нології і штамів мікроорганізмів МАП України, завідувач відділу державного контролю та нагляду за якістю ветеринарних імунобіологічних препаратів
Захист дисертації відбудеться “14” травня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.
Автореферат розісланий “11” квітня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Федорович Є.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Збереження здоров’я молодняку сільськогосподарських тварин у ранньому віці є однією з найактуальніших проблем тваринництва України. Економічні втрати від захворювань та загибелі продуктивного поголів’я, особливо молодняку в Україні є значними. У господарствах України в перші 8 тижнів життя гине до 25 % отриманого приплоду поросят та біля 15 % телят. Серед незаразної патології 80 % припадає на шлунково-кишкові та респіраторні захворювання тварин. Це зумовлено низьким рівнем їх резистентності внаслідок недостатньої та неповноцінної годівлі, незадовільних умов утримання корів і свиноматок у період вагітності (Карпуть И.М., 1995; Левченко В.І. зі співавт., 2001; Мельничук Д.О. зі співавт., 2001; Butler J.E., 1999; Ramsey P., 2001), що призводить до порушення ембріонального розвитку, зниження вмісту імуноглобулінів, імунокомпетентних клітин, вітамінів, макро- і мікроелементів у молозиві та молоці (Чумаченко В.Ю., 1997; Маслянко Р.П., 2003, Влізло В.В. зі співавт., 2006).
У зв’язку з поліетіологічною природою шлунково-кишкових і респіраторних захворювань новонароджених тварин актуальним є розробка ефективних комплексних препаратів, які володіють імуномодулюючими, антибактеріальними, антитоксичними та протизапальними властивостями (Федоров Ю.Н., 1998).
Застосування імуномодуляторів при вакцинації тварин підвищує напруженість специфічного імунітету до збудників інфекційних захворювань. Проте в Україні спостерігається незадовільний стан з використанням ад’ювантів, оскільки в умовах імунодефіциту тварин, особливо у молодняку з синдромом імунологічної супресії, вони є недостатньо ефективними. Тому застосування телятам і поросятам у ранньому віці імуномодуляторів, що забезпечують прискорене формування повноцінної імунної відповіді, є важливим заходом підвищення резистентності (Головко А.М. зі співавт., 2004; Чумаченко В.В., 2006).
За неповноцінної годівлі та дії різних стрес-факторів на організм тварин, особливо в ранньому віці, разом зі зниженням функції імунної системи, посилюються вільнорадикальні процеси, що сприяє виникненню імунодефіцитів. У зв’язку з цим вивчення біохімічних особливостей формування та регуляції імунної відповіді у телят і поросят раннього віку та розробка ефективних комплексних препаратів для підвищення життєздатності молодняку сільськогосподарських тварин шляхом стимуляції активності імунної та антиоксидантної систем надалі залишається актуальною проблемою.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота входила у науково-технічну програму УААН “Біологічні основи високої продуктивності тварин”, що виконувалася у відповідності з планом науково-дослідних робіт лабораторії імунології Інституту біології тварин УААН на 1997– роки згідно завдання 07.10 “Вивчити вплив імуномодуляторів на формування імунобіологічної реактивності у поросят і телят та розробити тест-систему для оцінки імунного статусу”, державний реєстраційний номер 0198U009010 та завдання 02.01 “Вивчити механізм дії імунотропних засобів на імуногенез у тварин та розробити способи підвищення імунної функції організму” на 2000– роки (№ ДР 0101U003438), згідно яких автор досліджував вплив імунотропних препаратів на формування імунобіологічної реактивності та окремі біохімічні показники у поросят і телят.
Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було з’ясувати біохімічні механізми формування та регуляції клітинних і гуморальних факторів імунітету та системи антиоксидантного захисту (АОЗ) у телят і поросят раннього віку, вплив вакцинації та відлучення поросят від свиноматок на вказані функції, розробити на основі одержаних даних нові комплексні імуномодулюючі та антиоксидантні препарати для підвищення збереження молодняку сільськогоспо-дарських тварин.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:
–вивчити вікові особливості формування імунної та антиоксидантної систем у телят і поросят, вплив вакцинації та відлучення поросят від свиноматок на показники цих систем;
–визначити функціональну активність клітин Т-системи імунітету в телят і поросят у рецепторну та проліферативну фази імунної відповіді у ранньому віці, вакцинації та відлученні поросят від свиноматок;
–дослідити активність факторів неспецифічної резистентності та вміст окремих класів імуноглобулінів у крові телят і поросят при застосуванні імунотропних засобів;
–з’ясувати біохімічні механізми активації системи фагоцитуючих мононуклеарів у поросят при відлученні від свиноматок та при застосуванні розроблених препаратів “Антоксан” і “Ліпоген”;
–дослідити вікову динаміку показників пероксидного окиснення ліпідів та активність глутатіонової ланки антиоксидантної системи в організмі телят і поросят і вплив на них вакцинації та відлучення поросят від свиноматок;
–розробити нові комплексні імуномодулюючі препарати для підвищення функції імунної і антиоксидантної систем у телят і поросят;
–вивчити ефективність застосування розроблених імунотропних засобів для стимуляції імунної та антиоксидантної систем у поросят і телят раннього віку;
–вивчити вплив тимогену, левамізолу та антоксану на напруженість поствакцинального імунітету у телят і поросят та дослідити їх ад’ювантні властивості.
Об’єктом досліджень було формування імунної та антиоксидантної систем у телят і поросят у ранньому віці, вплив на активність цих систем вакцинації та відлучення поросят від свиноматок.
Предметом досліджень були показники імунної (клітинні й гуморальні) та антиоксидантної (ферментної та неферментної ланок) систем, білкового і ліпідного обмінів у телят і поросят при застосуванні імунотропних засобів (“Тимоген”, “Левамізол”, “Антоксан”, “Ліпоген”, “Імукор”).
Методи дослідження: клінічні, біохімічні (спектрофотометричні, хроматогра-фічні), фізіологічні (дослідження росту та розвитку телят і поросят), імунологічні (радіальна імунодифузія, визначення клітинних і гуморальних показників імунітету), гематологічні, цитоморфометричні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексне дослідження біохімічних та імунологічних показників, що характеризують функціональний стан клітинних і гуморальних факторів імунітету, активність ферментної та неферментної ланок антиоксидантної системи, метаболізм білків та ліпідів в організмі телят і поросят у ранньому віці, при вакцинації, відлученні поросят від свиноматок та вплив імунотропних засобів (“Тимоген”, “Левамізол”, “Антоксан”, “Ліпоген”, “Імукор”) на вказані показники. З’ясовано вплив тимогену і левамізолу на формування імунобіологічної реактивності та активність системи АОЗ у телят і поросят при вакцинації. Обґрунтовано склад і технологію одержання імунопротекторного та імуномодулюючого препарату з антиоксидантною дією –“Антоксан”, встановлено його корегувальну дію при посиленні вільнорадикального окиснення та при формуванні повноцінної імунної відповіді.
Встановлено взаємозв’язок між інтенсивністю пероксидного окиснення ліпідів в організмі телят і поросят та активністю антиоксидантного захисту й імунним потенціалом тварин, визначеним за показниками трансформаційної та функціональної активності гематогенних попередників макрофагів. Вперше доведено стимулювальний вплив препарату “Антоксан” на функціональну активність Т- і В-систем імунітету, бактерицидну і лізоцимну активності сироватки крові та фагоцитарну активність нейтрофілів крові. Доведено нормалізуючий вплив антоксану на показники антиоксидантного та імунного захисту й еритроцитопоез у поросят при імунодефіциті.
Показано імуносупресивний вплив вакцинації та відлучення поросят від свиноматок на гуморальну ланку імунітету та стимулювальний –на процеси вільнорадикального окиснення в організмі телят і поросят. Вперше доведено підвищення напруженості поствакцинального імунітету при введенні разом з вакциною антоксану, тимогену й левамізолу.
Розроблено препарат “Імукор”, що містить гамма-глобуліни сироватки крові та селен, встановлено його стимулювальний вплив на показники імунної системи та інгібуючу дію на пероксидне окиснення ліпідів в організмі телят. Встановлено корегувальний вплив розробленого комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген” на вказані функції у телят і поросят.
Практичне значення одержаних результатів. На основі теоретичних узагальнень та проведених досліджень розроблено та запатентовано ряд нових ефективних комплексних препаратів: “Імукор”, “Ліпоген”, “Антоксан” для підвищення імунобіологічної реактивності та антиоксидантного захисту у поросят і телят раннього віку, при вакцинації й відлученні поросят від свиноматок. Розроблено Технічні умови України та настанови із застосування препаратів “Ліпоген” і “Антоксан”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України (2003 р.). Розроблені препарати застосовуються у ветеринарній практиці для профілактики імунодефіцитного стану в окремі періоди постнатального розвитку тварин. У 2006 році препарат “Ліпоген” визнаний кращим винаходом року у Львівській області.
Розроблено та затверджено СОУ 1.42-37-668:2007 “Велика рогата худоба. Метод визначення Т-клітинного імунітету” і СОУ 1.42-37-668:2007 “Ветеринарна медицина. Біологічні рідини. Нефелометричний метод визначення вмісту імуноглобулінів”.
Запатентовано метод визначення концентрації окремих класів імуноглобулінів у біологічних рідинах та метод визначення імунного потенціалу тварин за показниками макрофагальної трансформації мононуклеарів, які включено у довідник “Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині” (2004 р.).
Отримані результати мають важливе теоретичне значення для з’ясування біохімічних механізмів формування і регуляції імунітету у тварин в період постнатальної адаптації. Їх можна рекомендувати для введення у навчальні програми ряду дисциплін на ветеринарних та біологічних факультетах вищих навчальних закладів третього і четвертого рівнів акредитації.
Особистий внесок здобувача. Автором було обгрунтовано концепцію дисертаційної роботи та розроблено стратегію і методологію досліджень. Усі результати отримані автором особисто або за безпосередньої участі, самостійно зроблено пошук та аналіз літературних даних, аналіз та оформлення результатів експериментів, підготовлено до друку наукові публікації, оформлена нормативна документація на препарати “Антоксан”, “Ліпоген” та “Імукор”. Основні положення і висновки дисертаційної роботи обговорювали із науковим консультантом, д.вет.н., професором, академіком УААН В.В.Влізлом. Окремі результати експериментів були отримані за участю співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем, участь яких задекларована у списку літератури.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися та обговорювалися, отримали загальне схвалення на Міжнародних науково-практичних конференціях: до 100-річчя від дня народження академіка С.З. Гжицького (Львів, ЛДАВМ ім. С.З. Гжицького, 2000); “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2000); “Animal Sciences in the XX1 century” (Краків, 2001); “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин” (Львів, ІБТ, 2002); “Молекулярні механізми клітинної активації” (Вроцлав, 2002); “Біотехнологія у ветеринарній медицині” (Київ, 2002); пам’яті професора І.В. Шостаковської (Львів, 2002); 4-й Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (Вроцлав, 2002); “Актуальні проблеми розвитку тваринництва” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2003); “Стан та розвиток агропромислового виробництва в межах Єврорегіону Верхній Прут” (Чернівці, 2003); “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2004); “Актуальні проблеми та інновації в тваринництві, ветеринарній медицині і харчових технологіях” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2004); “Біологічні основи підвищення продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, ІБТ УААН, 2005); “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, ДНДКІ ветпрепаратів і кормових добавок, 2005); “Інноваційний розвиток сучасного аграрного виробництва” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2005); “Сучасні проблеми ветеринарної медицини в свинарстві” (Київ, ІВМ УААН, 2006); “Сучасність і майбутнє аграрної науки та виробництва” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2006); “Пріоритетні напрями та наукові основи розвитку галузей землеробства, рослинництва і тваринництва” (с. Холоднянське, Черкаська область, ЧІАПВ УААН, 2006); IV Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (Київ, НАУ, 2006); “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, ДНДКІ ветпрепаратів і кормових добавок, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукових праці, у тому числі 13 одноосібних, із яких 33 статті, один посібник, методичні рекомендації, два ТУ України, 6 патентів, два СОУ, 7 тез.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методики досліджень, результатів власних досліджень, їх обговорення, висновків, пропозицій виробництву, додатків та списку використаної літератури, який включає 1157 джерел, з них українською і російською мовами –, іншими мовами –80. Дисертація викладена на 403 сторінках комп’ютерного тексту, містить 83 таблиці, які становлять 42 сторінки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна методика та методи досліджень. Експериментальна частина роботи виконана в лабораторії імунології Інституту біології тварин УААН (1997– рр.). Наукові досліди проводили у дослідному господарстві “Оброшино”, а також у господарствах Львівської області. Дослідження проведені на клінічно здорових телятах чорно-рябої молочної породи та поросятах великої білої породи. Апробацію і впровадження отриманих результатів досліджень проведено в Інституті епізоотології УААН, у господарствах Львівської, Волинської, Хмельницької, Черкаської, Рівненської, Донецької, Запорізької та Київської областей.
У процесі виконання дисертаційної роботи проведено дев’ять дослідів. Досліди проведено на поросятах-сисунах, а також до та після відлучення і телятах з 3- до 60-денного віку. У кожній серії дослідів за принципом аналогів (вік, маса тіла, стать, фізіологічний стан) формувалися дослідні групи поросят: поросята-сисуни 3–-денного віку, поросята перед відлученням, яке проводили у 45-денному віці, через 3, 5 і 14 днів після відлучення, які знаходилися в однакових умовах годівлі та утримання. Зразки крові для досліджень брали від поросят в один і той же час зранку шляхом пункції краніальної порожнистої вени. Групи піддослідних телят формували за принципом аналогів. Усі втручання та забій тварин проводили з дотриманням вимог “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей” (Страсбург, 1985) та ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001). Комісією з біоетики Інституту біології тварин УААН (протокол № 4 від 14 листопада 2007 р.) не виявлено порушень морально-етичних норм при виконанні науково-дослідної роботи.
З метою вивчення вказаних питань проведено дві серії досліджень. У першій серії проведено п’ять науково-виробничих дослідів на телятах.
У першому досліді з’ясовано вікові особливості становлення імунобіологічної реактивності та вплив розробленого нами комплексного препарату “Імукор”, який містить гамма-глобуліни сироватки крові та селен, на формування імунітету і показники обміну речовин у крові телят та їх ріст у ранньому віці. Дослід проведено у приватній агрофірмі “Опілля” Сокальського району Львівської області на двох групах телят 3-денного віку, по 5 тварин у кожній. Тваринам першої (контрольної) групи у вказаний період внутрішньом’язово вводили 5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, телятам другої групи (дослідної) –препарат “Імукор” у дозі 10 мл на тварину. Для імунологічних та біохімічних досліджень у телят брали кров з яремної вени: перед введенням препарату в 3-денному віці, а також у 10-, 20- і 30-денному віці.
Метою другого досліду було дослідити вплив розробленого нами комплексного імуномодулюючого препарату “Антоксан”, що містить селен, β-каротин та інтерферон, на формування імунної відповіді та окремі біохімічні показники в крові телят раннього віку. В дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області було підібрано десять телят 3-денного віку, розділених за принципом аналогів на дві групи, по 5 тварин у кожній. Тваринам дослідної групи у 3-, 10- і 20-денному віці внутрішньомязово вводили імуномодулятор з антиоксидантною дією –антоксан у дозі 1 мл/10 кг маси тіла, а тваринам контрольної групи –ізотонічний розчин натрію хлориду. Для досліджень від телят одержували кров з яремної вени перед введенням антоксану на 3-й день та у 10-, 20- і 30-денному віці.
У третьому досліді вивчали імунну відповідь та окремі показники обміну речовин у крові телят та їх ріст у ранньому віці під впливом розробленого нами комплексного препарату в формі ліпосомальної емульсії “Ліпоген”, що містить гентаміцин і вітаміни А, D3, Е. Дослід проведено у приватній агрофірмі “Опілля” Сокальського району Львівської області, на двох групах телят 3-денного віку, по 5 тварин у кожній. Тваринам першої групи (контрольної) у вказаний період одноразово внутрішньом’язово вводили ізотонічний розчин натрію хлориду, тваринам другої групи (дослідної) –препарат “Ліпоген” у дозі 0,2 мл/кг маси тіла. Для біохімічних та імунологічних досліджень від телят обох груп одержували кров з яремної вени: у 3-денному віці перед уведенням препарату та у 10-, 20- і 30-денному віці.
У четвертому досліді вивчали вплив імуномодуляторів тимогену і левамізолу на показники імунобіологічної реактивності у телят після вакцинації. Дослід проведено у господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області. За принципом аналогів було сформовано три групи телят тритижневого віку, по 4–тварин у кожній. Перша група телят –контрольна, друга і третя групи –дослідні. Телятам другої групи у 3-тижневому віці внутрішньом’язово вводили тимоген у дозі 100 мг на тварину, телятам третьої групи внутрішньом’язово –левамізол у дозі 3 мкг/кг маси тіла. Телятам контрольної групи при цьому вводили стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду. У 30-денному віці телят усіх груп вакцинували полівалентною гідроокис алюмінієвою формол-тіомерсаловою вакциною проти колібактеріозу, згідно настанови з її застосування. Через чотирнадцять днів після вакцинації проводили другу імунізацію телят цією ж вакциною. Разом з вакциною телятам другої та третьої груп вводили вказані імуномодулятори у тих же дозах.
Для досліджень від телят одержували кров з яремної вени перед застосуванням імуномодуляторів у 3-тижневому віці (1 період), після їх введення (2 період), після першої вакцинації на 14-й день (3 період) і на 7-й день після другої імунізації (4 період).
У п’ятому досліді вивчали вплив препарату “Антоксан” на формування імунобіологічної реактивності телят при вакцинації. Дослід проведено на трьох групах телят 30-денного віку, аналогів за віком, масою тіла та фізіологічним станом, у дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області. У 30-денному віці телятам контрольної групи внутрішньо-м’язово вводили вакцину проти колібактеріозу, згідно настанови з її застосування. Телятам 1- і 2-ї (дослідних) груп при цьому разом з вакциною вводили імуномодулятор антоксан у дозі 1 мл/10 кг маси тіла. Через 14 днів проводили другу імунізацію тварин контрольної та 1-ї дослідної груп. При цьому телятам 1-ї дослідної групи разом з вакциною вводили антоксан у вказаній дозі, а телятам 2-ї дослідної групи –тільки антоксан. Для досліджень від телят одержували кров з яремної вени перед вакцинацією у 20-денному віці, після вакцинації –у 30-денному віці та після другої імунізації –у 50-денному віці.
У другій серії досліджень, проведено чотири досліди на поросятах.
Метою першого досліду було з’ясувати вплив розробленого нами препарату “Антоксан” на формування імунної відповіді та обмін речовин в організмі поросят у ранньому віці. Дослід проведено у дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області на двох групах поросят 3-денного віку (контрольна і дослідна), які утримувались зі свиноматками, по 5-6 тварин у кожній. Поросятам дослідної групи в 3-, 10- і 20-денному віці внутрішньом’язово вводили препарат “Антоксан” у дозі 0,1 мл/кг маси тіла, поросятам контрольної групи – ізотонічний розчин натрію хлориду. Для досліджень від поросят одержували кров з краніальної порожнистої вени у 3- і 10-денному віці перед уведенням препаратів. У 30-денному віці по 3 поросят з кожної групи піддавали евтаназії з дотриманням правил біоетики. Одержані від них зразки тканин і кров використовували для проведення імунологічних, біохімічних та гістоморфометричних досліджень. Гістоморфометричними методами досліджували мікроскопічну структуру шийних лімфатичних вузлів у поросят у 30-денному віці.
У другому досліді з’ясовано вплив препаратів “Тимоген” і “Левамізол” на процеси імуногенезу у поросят після вакцинації. Дослідження проводили у дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області. Було відібрано три групи поросят-аналогів 10-денного віку: контрольна і дві дослідні групи, по 4 тварини у кожній. У 14-денному віці тваринам дослідних груп внутрішньом’язово вводили імуномодулятори: поросятам другої групи –тимоген у дозі 100 мг на тварину, поросятам третьої групи –левамізол у дозі 3 мкг/кг маси тіла. Тваринам контрольної групи вводили ізотонічний розчин натрію хлориду. У 20-денному віці поросят контрольної та дослідних груп внутрішньом’язово вводили вакцину проти колібактеріозу, згідно настанови з її застосування. Поросятам дослідних груп разом з вакциною вводили відповідно тимоген і левамізол. Через чотирнадцять днів після вакцинації проводили другу імунізацію тварин цією ж вакциною. Для досліджень використовували кров, яку одержували з краніальної порожнистої вени поросят: перед введенням імуномодуляторів (1 період), після їх введення –перед вакцинацією (2 період), на 15- (3 період) і 22-й дні після імунізації (4 період).
У третьому досліді вивчено дію розробленого нами препарату “Антоксан” на імунний потенціал та біохімічний профіль крові поросят після відлучення від свиноматок. Дослід проведено у господарстві “Західний Буг” Буського району Львівської області на поросятах 45-денного віку, розділених на дві групи (контрольну і дослідну), по 5 тварин у кожній. Поросятам дослідної групи за день до відлучення внутрішньом’язово вводили препарат “Антоксан” з розрахунку 0,1 мл/кг маси тіла, а контрольної –аналогічно ізотонічний розчин натрію хлориду. Для імунологічних і біохімічних досліджень від поросят одержували кров з краніальної порожнистої вени за день до відлучення та на 5-, 10- і 14-й дні після відлучення.
У четвертому досліді досліджено вплив розробленого нами препарату “Ліпоген” на імунний статус і біохімічний профіль крові поросят після відлучення від свиноматок. Дослід проведено у господарстві “Імпекс” Буського району Львівської області на двох групах відлучених поросят 30-денного віку (контрольна і дослідна), по 5–тварин у кожній. Поросятам дослідної групи в день відлучення внутрішньом’язово одноразово вводили препарат “Ліпоген” з розрахунку 0,2 мл/кг маси тіла, а контрольної –ізотонічний розчин натрію хлориду. Кров досліджували у день відлучення, а також на 3-, 5- і 14-й дні після відлучення.
У крові (плазмі та в гемолізатах еритроцитів) визначали: активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9; Моин В.М., 1986), активність каталази (КФ 1.11.1.6; Королюк М.А. зі співавт., 1988), вміст відновленого глутатіону (Баталер Э., Дюбон О., Келли Б., 1963), гідроперекисів ліпідів (ГПЛ; Мирончик А.К., 1982), малонового діальдегіду (МДА; Коробейникова Е.Н., 1989), неетерифікованих жирних кислот (НЕЖК; Прохоров М.И. с соавт., 1977), вільних амінокислот у плазмі крові –на амінокислотному аналізаторі ААА-339М фірми “Мікротехна” (Чехія).
У стабілізованій крові підраховували кількість лейкоцитів і еритроцитів, визначали вміст гемоглобіну, середній вміст гемоглобіну в одному еритроциті, гематокрит, співвідношення окремих видів лейкоцитів (лейкограма крові) –за загальноприйнятими методами (Кондрахин И.П., с соавт., 1985); загальну кількість Т-лімфоцитів (Е-РУЛ) –визначали в реакції спонтанного розеткоутворення з еритроцитами вівці та кози (Jondal M. et al., 1972), їх субпопуляції – Т-хелпери (ТФР Т-лімфоцити; Суровас В.М. с соавт., 1980); кількість “активних” РУЛ (Wansbrough-Jones М. et al., 1979); кількість Т-клітин з переважно супресорною активністю (ТФЧ Т-лімфоцити) –шляхом віднімання числа теофілінрезистентних Т-клітин (ТФР) від загальної кількості Т-лімфоцитів, імунорегуляторний індекс (ІРІ) розраховували за співвідношенням ТФР/ТФЧ Т-лімфоцитів, В-лімфоцити (ЕАС-РУЛ) –в реакції комплементарного розеткоутворення з еритроцитами вівці (Чернушенко Е.Ф. с соавт., 1979). При підрахунку кількості Т- і В-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій на фіксованих і фарбованих мазках крові визначали лімфоцити із низькою, середньою і високою щільністю рецепторів, функціональну активність Т-лімфоцитів –за реакцією бластної трансформації з фітогемаглютиніном (ФГА; Болотников И.А. с соавт., 1987), фагоцитарну активність та інтенсивність полінуклеарних клітин до добової культури Staphilоcoccus aureus (штам 209-Р; Гостєв В.С., 1950); бактерицидну активність нейтрофілів, використовуючи 0,1 % розчин нітросинього тетразолію (НСТ-тест; Маянський А.Н., 1989); макрофагальну трансформацію мононуклеарів (Собко А.И., Квачов В.Г., 1987) у нашій модифікації (Віщур О.І. зі співавт., 2006); лімфокінсинтезуючу активність лейкоцитів крові у реакції гальмування міграції лейкоцитів (Передерий В.Г. с соавт., 1995).
У сироватці крові визначали бактерицидну активність (БАСК) до мікробної культури Esherichia coli (штам ВКМ-125; Марков Ю.М., 1968); лізоцимну активність (ЛАСК) до добової культури Micrococcus lysodeikticus (штам ВКМ-109) –фотонефелометричним методом (Дорофейчук В.Г., 1968), вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) середньої молекулярної маси (Чернушенко Е.Ф., Когосовой П.С., 1981), кількість імуноглобулінів G і М класів методом радіальної імунодифузії (Mancini G. et al., 1965), а також запатентованим нами методом (Кичун І.В., Віщур О.І., 2003), концентрацію загального білка біуретовою реакцією, вміст молекул середньої маси (Николайчик В.В. с соавт., 1989), титри специфічних антитіл –в реакції аглютинації та пасивної гемаглютинації з використанням відповідних діагностикумів, концентрацію глюкози, сечовини, активність ферментів АсАТ (КФ 2.6.1.1), АлАТ (КФ 2.6.1.2), вміст HS- і SS-груп, вітамін С за допомогою стандартних наборів фірм “LACHEMA” (Чехія) та НВП “Біос” (Україна).
Жирнокислотний склад загальних ліпідів плазми крові та досліджуваних органів і тканин визначали методом газорідинної хроматографії (Немировський В.І. зі співавт., 1984). Ліпіди з тканин екстрагували сумішшю хлороформ-метанол у відношенні 2:1 за методом Фолча (Folch J., 1957), метилові ефіри жирних кислот одержували шляхом прямої переетерифікації та визначали відносну їх кількість на газорідинному хроматографі “Chrom –” (Чехія).
Гістоморфометричні дослідження структури шийних лімфатичних вузлів проводили шляхом мікроскопії після фарбування їх гематоксиліном за допомогою мікроскопу “Біолам” та окуляр-мікрометра АМ 9-2.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп’ютері за ліцензованою програмою MS Excel 97. Оцінку вірогідності здійснювали за критерієм Стьюдента (t). Вірогідною вважали різницю при р<0,05–,001 у порівнянні з контрольною групою тварин, а в окремих дослідах з вихідними даними.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Особливості формування клітинних та гуморальних факторів імунітету телят раннього віку. Проведені дослідження показали, що у телят до 20-денного віку є низькою функціональна активність імунокомпетентних клітин, про що свідчить менша, ніж у тварин 30–-денного віку, кількість Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій і В-лімфоцитів (рис. 1, 2). Встановлено велику кількість (60 %) у крові недиференційованих (нульових) Т-лімфоцитів (рис. 2), а також зниження показників бластної трансформації Т-клітин під впливом ФГА. В-клітини в крові телят, за даними R.A. Miller (1995), у перші 20 днів постнатального періоду не відповідають на специфічні антигени проліферацією та збільшенням синтезу антитіл.
Аналіз клітинних та гуморальних факторів імунітету у телят свідчить, що з віком їх функціональна активність підвищується. Стан рецепторного апарату плазматичної мембрани Т-лімфоцитів вказує на зростання їх функціональної активності, особливо у 20-денному віці, що зумовлено збільшенням на 7–% кількості низькоавідних та середньоавідних форм клітин. Аналогічних змін зазнають і В-лімфоцити. З віком у периферичній крові телят кількість 0 (нульових) малодиференційованих клітин зменшується в 1,8 раза (p<0,05), що зумовлено переходом клітин у зріліші, функціонально повноцінні лімфоцити (Т- або В-клітини).
Стан показників антигеннеспецифічного імунітету (комплемент) та бактерицидна і лізоцимна активність сироватки крові телят свідчать про їх зростання впродовж росту тварин. Водночас цей період характеризується розвитком поширених метаболічних порушень в організмі телят, серед яких важливе місце займає дисбаланс окиснювально-антиоксидантних процесів.
Отже, в цей період виникає необхідність введення телятам комплексних препаратів, які будуть володіти імуномодулюючими і антиоксидантними властивостями.
Імунна відповідь та метаболічний профіль крові телят раннього віку за дії препарату “Імукор”. Встановлено, що після введення імукору вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у плазмі крові телят спочатку збільшується, а пізніше знижується до рівня тварин контрольної групи. Така динаміка ЦІК у крові телят свідчить про стимуляцію імунобіологічної реактивності у тварин дослідної групи та про наступну елімінацію ЦІК. Зростання вмісту ЦІК у плазмі крові телят дослідної групи у 10- і 20-денному віці (p<0,05; p<0,01) можна пояснити впливом фрагментів молекул імуноглобулінів, що утворюються в організмі за умов часткового їх протеолізу після парентерального введення. При цьому, вміст молекул середньої маси у плазмі крові телят дослідної та контрольної груп на всіх стадіях досліду суттєво не відрізнявся між собою, що свідчить про відсутність негативного впливу досліджуваного препарату на деструктивні процеси в їхньому організмі.
Парентеральне введення телятам дослідної групи гамма-глобулінів та селену у складі препарату “Імукор” призводить до збільшення в їх крові у 10-денному віці кількості лейкоцитів на 15,5 % (p<0,01), зокрема відносного вмісту Т-лімфоцитів (загальних, активних і теофілін-резистентних СD4+ Т-лімфоцитів-хелперів) та В-лімфоцитів (p<0,05–,01). Ці зміни, в основному, відбувались за рахунок збільшення кількості Т- і В-лімфоцитів з низькою та середньою щільністю рецепторів (p<0,05–,01). Одержані дані свідчать про стимулювальний вплив препарату “Імукор” на функціональну активність імунокомпетентних клітин крові телят внаслідок збільшення кількості рецепторів на плазматичній мембрані Т-лімфоцитів, тобто розширення “рецепторного поля” клітин. Оскільки В-лімфоцити є попередниками клітин, що продукують антитіла, то збільшення їх кількості в крові телят у період становлення імунної системи є ознакою підвищеної здатності їх організму до активного синтезу захисних антитіл. У цьому плані заслуговує на увагу виявлений нами більший вміст IgG і IgМ у сироватці крові телят (рис. 3, 4) в усі періоди дослідження після введення імуномодулятора (p<0,05–,01).
Введення телятам препарату “Імукор” стимулює ранній та інтенсивний синтез імуноглобулінів в організмі телят, про що свідчить збільшення кількості В-лімфоцитів у крові (p<0,05). Ці дані можна пояснити стимулювальним впливом фрагментів молекул імуноглобулінів, які проявляють регуляторний вплив на імунну систему в організмі тварин. Зокрема, Fc-фрагменти імуноглобулінів здатні викликати поліклональну активацію В-лімфоцитів, посилювати антигеннезалежну продукцію антитіл (Bass R.T., 2001). Ці дані заслуговують на увагу в зв’язку з тим, що IgG1 відіграють ключову роль в імунному захисті новонароджених телят, а IgM –першими утворюються у відповідь на антигенну стимуляцію.
З інших результатів, одержаних у цьому досліді, слід відзначити встановлене нами підвищення бактерицидної та лізоцимної активності сироватки крові, а також фагоцитарної активності нейтрофілів крові у телят після введення препарату “Імукор” (р<0,05–0,01). Зростання всіх показників фагоцитозу –фагоцитарної активності, числа та індексу (ФА, ФЧ, ФІ) можна пояснити впливом імуноглобулінів, які є сильними опсонінами.
Показано, що після введення телятам препарату “Імукор” (рис. 5, 6) концентрація гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду в плазмі крові зменшується (p<0,05–0,01), а вміст відновленого глутатіону й активність глутатіонпероксидази –підвищується (р<0,05) у порівнянні з цими показниками у тварин контрольної групи. Ці дані свідчать про стимулювальний вплив селену, що входить до складу препарату “Імукор” на синтез глутатіонпероксидази, ключового ферменту системи антиоксидантного захисту.
d0. 5.
Введення телятам імукору спричиняє збільшення концентрації вітаміну С і HS-груп у плазмі крові, що вказує на позитивний вплив на синтез білків, які містять HS-групи і вітаміну С в організмі телят. При цьому, середньодобові прирости маси тіла телят дослідної групи були на 11,4 % більші, ніж контрольної.
Отже, розроблений нами препарат “Імукор” сприяє підвищенню імунного та антиоксидантного захисту, життєздатності телят раннього віку і є ефективним при профілактиці імунодефіциту.
Показники клітинного і гуморального імунітету та метаболічний профіль крові телят раннього віку за дії препарату “Антоксан”. Наші дослідження показали, що введення телятам у 3-денному віці імуномодулюючого препарату “Антоксан” підвищує киснево-транспортну функцію крові, про що свідчить збільшення в їх крові у 30-денному віці кількості еритроцитів (р<0,05) та вмісту гемоглобіну (р<0,05). Ці дані можна пояснити дією селену, що входить до складу антоксану. За даними Г.Л. Антоняк (2002), введення селеніту натрію поросятам підвищує інтенсивність перетворення вуглеводів гліколітичним шляхом. Однією з ланок механізму регуляції йонами селену метаболізму в еритроцитах, ймовірно, є утворення дифосфогліцерофосфату (2,3-DPG) і, відповідно, вплив на киснево-транспортну функцію гемоглобіну.
Введення телятам антоксану спричиняє збільшення кількості лейкоцитів (p<0,05–,01) і моноцитів (р<0,05) крові, підвищує функціональну активність Т-клітинної ланки імунітету, а також активує експресію рецепторів на поверхні лімфоцитів, про що свідчить зростання кількості загальних і високоавідних Т-активних лімфоцитів (p<0,05). Водночас у крові телят збільшується на 10–% індукція Т-клітин до бластної трансформації з ФГА (p<0,05–,01), зростає кількість В-лімфоцитів з високою і середньою щільністю рецепторів (р<0,05). Ці дані свідчать про те, що антоксан проявляє стимулювальний вплив на функціональну активність Т- і В-лімфоцитів крові телят.
У крові телят, яким вводили антоксан, встановлено вищу бактерицидну і лізоцимну активність сироватки крові, фагоцитарну активність нейтрофілів та НСТ-тест (p<0,05–,01). Отже, введення телятам у ранньому віці антоксану спричиняє підвищення неспецифічних факторів захисту організму, що можна пояснити стимулювальною дією β-каротину, селену та інтерферону, які входять до складу препарату, і проявляють версифікований механізм впливу на імунну систему.
Показано також, що під впливом антоксану в сироватці крові телят у 30-денному віці на 5 % підвищується вміст загального білка (p<0,05), а в 20- і 30-денному –вміст IgG на 39 (p<0,01) і 32 % (p<0,05) більший, ніж у тварин контрольної групи, що свідчить про зростання функціональної активності В-системи імунітету.
У забезпеченні імунітету тварин важливу роль відіграють холінергічні процеси. Встановлено, що активність холінестерази в крові телят, яким вводили антоксан, у 10- і 30-денному віці була на 15 (p<0,05) і 24 % (p<0,05) більша, ніж у телят контрольної групи.
Парентеральне введення телятам антоксану впливає на вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів у плазмі крові. Зокрема, концентрація гідроперекисів ліпідів, які є вторинними продуктами пероксидного окиснення ліпідів, у плазмі крові телят дослідної групи після введення антоксану була на 20–% менша в усі періоди дослідження (p<0,05). При цьому в крові телят, яким вводили антоксан, порівняно до тварин контрольної групи, зростає вміст загальних ліпідів на 35,7 % (p<0,05), відновленого глутатіону на 15 % (p<0,05) та підвищується активність глутатіонпероксидази на 24,1 % (p<0,05). Ці дані свідчать про зниження інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів в організмі телят, яким вводили антоксан. Підвищення каталітичної активності глутатіонпероксидази в еритроцитах крові телят дослідної групи можна пояснити зростанням інтенсивності синтезу ферменту внаслідок наявності селену в антоксані.
Середньодобові прирости маси тіла телят, яким вводили імуномодулюючий препарат “Антоксан”, були на 16,7 % більші, ніж у контрольній групі.
Імунний і антиоксидантний статус телят за дії комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген”. Показано, що введення телятам у ранньому віці ліпогену призводить до збільшення кількості лейкоцитів крові в 10- та 20-денному віці (р<0,05), відносної кількості Т-активних лімфоцитів (р<0,05) за рахунок збільшення малорецепторної субпопуляції (р<0,05) та зменшення неактивних їх форм (р<0,05). Зростання кількості В-лімфоцитів у крові телят після введення ліпогену відбувалось за рахунок збільшення частки субпопуляції з середнім і високим ступенем авідності (р<0,05–,01) та зменшення кількості низькоавідних лімфоцитів (р<0,05). Збільшення кількості Т-активних лімфоцитів у крові телят вказує на зростання функціональних можливостей імунокомпетентних клітин. Т-хелпери задіяні у розпізнаванні чужорідної генетичної інформації, стимулюють диференціацію та проліферацію В-лімфоцитів. Збільшення функціональної активності імунокомпетентних клітин крові телят можна пояснити комплексною дією ліпогену на експресію рецепторів Т- і В-лімфоцитів на плазматичній мембрані, зокрема, антиоксидантним та імуномодулюючим впливом вітамінів А і Е у складі препарату.
Введення телятам ліпогену призводить до підвищення лізоцимної і бактерицидної активності сироватки крові та фагоцитарної активності нейтрофілів крові на всіх стадіях дослідження (р<0,05–,01), а також до збільшення у плазмі крові вмісту HS-груп і вітаміну С (р<0,05), що можна пояснити комплексним стимулювальним впливом складників препарату на синтез антитіл. При застосуванні антибіотиків, зокрема тетрациклінового ряду, збільшується кількість мікро- і особливо макрофагів, насичених вітаміном С, та полісахаридів, що веде до утворення великої кількості плазматичних клітин, які синтезують антитіла (Карпуть И.М., 1981). При цьому в сироватці крові телят, яким вводили ліпоген, у 10- і 20-денному віці відзначено збільшення вмісту загального білка і циркулюючих імунних комплексів середньої молекулярної маси (р<0,05–,01), що, на нашу думку, зумовлено антигенним впливом наявного в ліпогені гентаміцину на синтез антитіл. Підвищення рівня ЦІК у сироватці крові телят дослідної групи у 10- і 20-денному віці та їх наступна елімінація до 30-денного віку свідчить про відсутність імуносупресивного впливу гентаміцину, на що також вказує відсутність збільшення кількості Т-супресорів.
Проведені дослідження показали, що введення телятам дослідної групи препарату “Ліпоген” призводить до зменшення концентрації ГПЛ і МДА у плазмі крові на всіх стадіях дослідження (р<0,05–,01) внаслідок антиоксидантної дії вітамінів А і Е, що входять до складу препарату.
Імунобіологічна реактивність телят при застосуванні тимогену і левамізолу. У результаті проведених досліджень встановлено, що вакцинація телят проти колібактеріозу проявляє інгібуючий вплив на гуморальну ланку імунітету, про що свідчить зменшення на 17 % абсолютної кількості В-лімфоцитів у крові, зростання на 16 % рівня ЦІК та зниження на 15,3 % лізоцимної активності сироватки крові. Разом з тим у крові телят після вакцинації зростає вміст продуктів ПОЛ.
Введення телятам тимогену і левамізолу спричиняє збільшення відносної та абсолютної кількості Т-лімфоцитів у крові як після введення імуномодуляторів, так і після вакцинації (р<0,05). Водночас у крові телят підвищується на 8–% функціональна активність Т-клітин до бластної трансформації під впливом фітогемаглютиніну в усі періоди дослідження після введення імуномодуляторів (р<0,05). Отримані результати досліджень свідчать, що введення телятам тимогену і левамізолу як окремо, так і в комплексі з вакциною активує Т-клітинну ланку імунітету та підвищує функціональну активність імунокомпетентних клітин, особливо Т-лімфоцитів. Тимоген і левамізол діють, в основному, на Т-клітинну ланку імунної системи, корегують порушену взаємодію між окремими субпопуляціями клітин і контролюють імунорегуляторну активність Т-системи в рецепторну і проліферативну фази імунного процесу.
Проведені дослідження показали, що введення телятам тимогену і левамізолу призводить до підвищення на 8–% бактерицидної (р<0,05–,01) та лізоцимної (р<0,05) активності сироватки крові, рівня ЦІК (р<0,05) та фагоцитарного індексу (р<0,05). При цьому встановлено, що тимоген проявляв імунорегуляторний вплив на БАСК телят раніше, ніж левамізол. Зростання рівня ЦІК у сироватці крові телят, яким вводили тимоген після вакцинації, і швидка їх елімінація з організму після вакцинації свідчить про зменшення імуносупресивного ефекту вакцини і про високий рівень набутого після вакцинації специфічного імунітету.
При оцінці імунобіологічної реактивності тварин важливим питанням є потенційна здатність їх організму в ранньому віці синтезувати специфічні та неспецифічні антитіла у відповідь на антигенну стимуляцію. Встановлено, що до початку імунізації у сироватці крові 30-денних телят виявлено низький титр специфічних антитіл проти колібактеріозу, а IgM та IgG містяться в різній концентрації. Введення телятам тимогену і левамізолу разом з вакциною проявляє стимулювальний вплив на В-систему імунітету, зокрема на продукцію імуноглобулінів G1, G2 і М. Рівень IgM (білки, що першими утворюються на антигенні подразнення) у крові телят дослідних груп був вищим (р<0,05), ніж у тварин контрольної групи. На 14-й день після вакцинації титр специфічних антитіл проти колібактеріозу у телят дослідних груп був на 21–% (р<0,05) більшим, ніж у телят контрольної групи. Ці дані свідчать, що телята, яким вводили імуномодулятори, мають підвищений гуморальний захист проти колібактеріозу.
Після введення телятам тимогену і левамізолу в усі періоди дослідження вміст ГПЛ і МДА у плазмі крові був менший, ніж у телят контрольної групи, проте вірогідну різницю спостерігали лише після введення тимогену (р<0,05). Ці дані вказують на інгібуючий вплив досліджуваних імуномодуляторів на проміжні та кінцеві стадії пероксидного окиснення ліпідів в організмі телят і про більший інгібуючий вплив тимогену, ніж левамізолу.
У цілому, отримані результати свідчать про коригувальний вплив тимогену і левамізолу на формування Т- і В-клітинної ланки імунітету, імунобіологічної реактивності та інгібуючу дію на процеси пероксидного окиснення ліпідів у телят, а одночасне введення їх з вакциною проти колібактеріозу посилює синтез специфічних антитіл.
Формування імунобіологічної реактивності та системи антиоксидантного захисту в організмі телят при вакцинації проти колібактеріозу та за дії препарату “Антоксан”. У результаті проведених досліджень встановлено стимулювальний вплив комплексного препарату “Антоксан” на формування клітинного компаркменту імунної системи у телят при вакцинації. Введення препарату телятам дослідних груп спричиняє зростання кількості малорецепторної популяції загальних Т-лімфоцитів (р<0,05), середньорецепторних Т-хелперів (р<0,05) та збільшення їх функціональної активності в РБТЛ з ФГА (р<0,05–,01). При введенні телятам вакцини разом з антоксаном у крові збільшується кількість В-лімфоцитів з середньою і високою щільністю рецепторів (р<0,05). Таким чином, під впливом антоксану в організмі телят прискорюється дозрівання, диференціація та спеціалізація Т- і В-лімфоцитів. Такий висновок узгоджується з результатами досліджень деяких авторів (Roy М. et al., 1994) про підвищення продукції Т- і В-лімфоцитів в організмі тварин при введенні їм селену, що зумовлено посиленим утворенням α- і β-субодиниць високоафінних рецепторів інтерлейкіну-2. При цьому особливе значення при формуванні поствакцинального імунітету має зростання функціональної активності В-лімфоцитів, як попередників плазматичних клітин, які продукують антитіла.
Парентеральне введення телятам препарату “Антоксан” при їх вакцинації проти колібактеріозу, сальмонельозу та ентеротоксемії спричиняє збільшення вмісту IgG2 (р<0,05–,025) і IgM (р<0,05) та підвищення активності глутатіонпероксидази (р<0,05–,01), а також зменшення вмісту малонового діальдегіду (р<0,05) в крові, що свідчить про стимулювальний вплив препарату на показники імунної та антиоксидантної систем організму. В сироватці крові телят обох дослідних груп зростає рівень циркулюючих імунних комплексів (р<0,05), підвищується бактерицидна і лізоцимна активність сироватки крові (р<0,05–,01) та титр специфічних антитіл (р<0,05). Зростання бактерицидної активності сироватки крові телят можна пояснити збільшенням кількості імуноглобулінів, які проявляють опсонізуючу дію на бактерії, зв’язують і активують комплемент (Передерий В.Г. с соавт., 1995), сприяють індукції інтерферону (Земсков А.М. с соавт., 1994) та синтезу лізоциму (Beel J.I., 1998). Отже, антоксан знижує реактогенність вакцини та стимулює природну резистентність організму телят.
Загалом, одержані результати свідчать, що телята, яким вводили антоксан разом з вакциною, мають підвищений потенціал специфічного захисту проти інфекційних захворювань. Введення телятам вакцини й антоксану призводить до посилення антитілоутворення та скорочення індуктивної фази антитілогенезу. Ці властивості можна пояснити здатністю селену, β-каротину та інтерферону, що входять до складу препарату “Антоксан”, стимулювати проліферативні процеси у лімфоїдній тканині.
Підсумовуючи одержані нами результати, можна зробити висновок, що препарат “Антоксан” володіє ад’ювантними та антиоксидантними властивостями, що має важливе значення при застосуванні імунобіологічних препаратів тваринам за умов імунодефіциту.
Імунний статус та метаболічні процеси в організмі поросят раннього віку за дії препарату “Антоксан”. У результаті проведених досліджень встановлено низький рівень імунітету у поросят раннього віку, подібно до того, як це має місце у телят, що зумовлено як недостатньою кількістю лімфоцитів та вмістом імуноглобулінів, так і низькою функціональною активністю імунокомпетентних клітин.
Введення поросятам у ранньому віці антоксану спричиняє збільшення кількості лейкоцитів (р<0,01), Т- і В-лімфоцитів (р<0,05) за рахунок зростання кількості середньо- і високоавідних клітин, тоді як кількість клітин з низькою щільністю рецепторів зменшувалась. Тобто, під впливом компонентів антоксану в імунокомпетентних клітинах, особливо Т-лімфоцитах крові поросят, проходить перебудова (реорганізація) плазматичних мембран у бік збільшення кількості рецепторів, що вказує на розширення “рецепторного поля клітини” і збільшення функціональних можливостей лімфоцитів. Встановлено стимулювальний вплив антоксану на лімфокінсинтезуючу активність Т-лімфоцитів поросят у реакції гальмування міграції лейкоцитів. Показано, що введення поросятам антоксану спричиняє підвищення лізоцимної та бактерицидної активності сироватки крові (р<0,01), а також зростання інтенсивності фагоцитозу в НСТ-тесті (р<0,05), що можна пояснити версифікованим впливом селену, β-каротину та інтерферону на функцію імунної системи.
Антоксан сприяв підвищенню активності ГП (р<0,01; р<0,001) і вмісту відновленого глутатіону в еритроцитах крові (р<0,01), що можна пояснити позитивною дією компонентів препарату на антиоксидантну систему захисту.
Подібні зміни було встановлено у деяких органах і тканинах поросят (рис. 7, 8).
Введення поросятам дослідної групи антоксану призводить до підвищення активності ГП у тканині селезінки і лімфатичних вузлів (р<0,05) і вмісту відновленого глутатіону в тканині селезінки і тимусу (р<0,05–0,01) та зниження вмісту ТБК-активних продуктів в органах поросят, особливо в кістковому мозку (р<0,01). Ці дані свідчать про інгібуючий вплив компонентів антоксану на ПОЛ в органах імунної системи та кровотворення у поросят.
Значне зацікавлення становлять відзначені нами різниці вмісту деяких жирних кислот у загальних ліпідах лімфатичних вузлів, печінки і легень поросят, яким вводили антоксан, порівняно до їх вмісту в загальних ліпідах органів поросят контрольної групи. Зокрема, жирнокислотний склад загальних ліпідів вказаних органів поросят дослідної групи характеризується значно більшим відносним вмістом поліненасичених жирних кислот. Це зумовлено значно більшим вмістом арахідонової кислоти (р<0,01) у загальних ліпідах легень, печінки і лімфовузлів поросят, яким вводили антоксан (рис. 9).
Ці дані заслуговують особливої уваги у зв’язку з тим, що арахідонова кислота є попередником простагландинів, які відіграють важливу роль у регуляції імунних реакцій в організмі тварин (Харази А.И., Пишель И.И., 1990).
У цілому, отримані в цьому досліді результати свідчать про обгрунтованість введення поросятам у ранньому віці препарату “Антоксан” з метою підвищення імунного та антиоксидантного захисту, які відіграють ключову роль у забезпеченні високої життєздатності організму.
Формування імунобіологічної реактивності та метаболічний профіль крові поросят при вакцинації проти колібактеріозу та за дії препаратів “Тимоген” і “Левамізол”. Введення поросятам разом з вакциною проти колібактеріозу як тимогену, так і левамізолу спричиняє збільшення в крові кількості лейкоцитів після другої імунізації (р<0,05). Водночас після вакцинації у крові поросят дослідних груп збільшується кількість загальних та теофілінрезистентних Т-лімфоцитів (р<0,05–,01), а також підвищується їх функціональна активність у реакції бластної трансформаціїї з фіто-гемаглютиніном (р<0,05), що свідчить про стимулювальний вплив тимогену і левамізолу на активацію Т-системи імунітету.
Встановлено інгібуючий вплив імунізації на гуморальну ланку імунітету в організмі поросят. При цьому в крові поросят обох груп зростає рівень ЦІК. Введення поросятам разом з вакциною тимогену і левамізолу істотно не впливає на вміст ЦІК, бактерицидну і лізоцимну активність сироватки крові. Водночас застосування поросятам тимогену активує процеси фагоцитозу нейтрофілів крові, про що свідчить збільшення у крові кількості диформазанчутливих фагоцитів у НСТ-тесті (р<0,05). Це пояснюється впливом імуномодулятора на Т-систему імунітету, зокрема збільшенням функціональної активності Т-лімфоцитів та індукцією в них синтезу цитокінів, які у свою чергу сприяють зростанню перетравної та бактерицидної функції як нейтрофілів, так і клітин моноцитарно-макрофагальної системи.
Тимоген і левамізол збільшує синтез імуноглобулінів G i M та специфічних антитіл (р<0,05), сприяє формуванню напруженішого поствакцинального імунітету, що зумовлено підвищенням функціональної активності імунокомпетентних клітин.
З інших результатів, одержаних у цьому досліді, слід відзначити також виявлене нами після першої вакцинації збільшення у плазмі крові поросят всіх досліджуваних груп концентрації продуктів пероксидного окиснення ліпідів. Введення поросятам разом з вакциною тимогену і левамізолу призводило до зменшення утворення продуктів ПОЛ. При цьому досліджувані імуномодулятори у більшій мірі інгібували пероксидне окиснення ліпідів в організмі поросят на стадії утворення гідроперекисів, ніж на стадії утворення ТБК-активних продуктів.
Отже, отримані результати свідчать про стимулювальний вплив тимогену і левамізолу на формування Т- і В-клітинної ланки імунітету, імунобіологічної реактивності поросят та інгібуючий вплив на процеси пероксидного окиснення ліпідів.
Імунний потенціал і антиоксидантний статус поросят після відлучення від свиноматок та за дії препаратів “Антоксан” і “Ліпоген”.
Показано, що відлучення поросят від свиноматок у ранньому віці призводить до посилення пероксидного окиснення ліпідів, зниження показників неспецифічної резистентності та функціональної активності лімфоцитів, збільшення вмісту ЦІК і зменшення перетравної здатності нейтрофілів, що позначається на зниженні інтенсивності росту, виникненні захворювань і загибелі поросят.
Введення поросятам перед відлученням антоксану проявляє стимулювальний вплив на проліферацію, диференціацію та дозрівання Т- і В-лімфоцитів, їх кількісний склад і функціональну активність, що характеризується зростанням кількості високоавідних та зменшенням малодиференційованих у функціональному відношенні лімфоцитів (р<0,05). Збільшення кількості Т-активних та теофілінрезистентних Т-лімфоцитів (р<0,05), В-лімфоцитів (р<0,05–,01) та величини імунорегуляторного індексу (ІРІ) в крові поросят, яким вводили антоксан, свідчить про мобілізацію гуморальних факторів імунітету в їхньому організмі. У поросят збільшується активність фагоцитозу нейтрофілів, його число та індекс, кілінг мікробів у НСТ-тесті, загальна кількість лейкоцитів та функціональна активність лімфоцитів у РБТЛ в усі періоди дослідження після відлучення (р<0,05–,01). Водночас у поросят підвищується лізоцимна та бактерицидна активність сироватки крові (р<0,05–,01) та знижується вміст циркулюючих імунних комплексів впродовж періоду дослідження після відлучення (р<0,05), що свідчить про підвищення активності гуморальної ланки імунітету та зниження антигенного навантаження на організм поросят.
Після введення поросятам препарату “Антоксан” у їх крові збільшується трансформаційна та функціональна активність гематогенних попередників макрофагів (р<0,05–,01), що вказує на підвищення імунного потенціалу тварин. Водночас у крові поросят дослідної групи знижується вміст малонового діальдегіду (р<0,01) та концентрація ГПЛ (р<0,05), підвищується активність глутатіонової системи антиоксидантного захисту (р<0,05–,01), що вказує на стимулювальний вплив складників препарату на синтез глутатіонпероксидази та відновленого глутатіону й інгібуючий вплив на утворення продуктів ПОЛ. Згідно сучасних уявлень (Сурай П.В. зі співавт., 1999) посилене пероксидне окиснення ліпідів з накопиченням в організмі пероксидів слід розглядати як універсальний пошкоджувальний чинник, що призводить до виникнення імунодефіциту.
Отже, проведені дослідження показали високу ефективність антоксану при застосуванні його з метою профілактики стресу в поросят після відлучення внаслідок підвищення у них антиоксидантного й імунного захисту.
Враховуючи те, що у поросят після відлучення виникають шлунково-кишкові та респіраторні захворювання з невизначеною етіологією, актуальною є проблема розробки ефективних комплексних препаратів, які б об’єднували антибактеріальні, протизапальні, антитоксичні та інші властивості (Чумаченко В.Ю., 1997).
У зв’язку з цим, нами було досліджено вплив препарату “Ліпоген” на імунний та антиоксидантний статус поросят після відлучення від свиноматок. Проведені дослідження показали, що введення поросятам при відлученні від свиноматок комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген” спричиняє підвищення активності системи антиоксидантного захисту організму. Внаслідок цього зменшується утворення продуктів пероксидного окиснення ліпідів, що позитивно впливає на імунний гомеостаз в організмі поросят за дії стрес-факторів, якими є відлучення від свиноматок, перегрупування і зміни годівлі. При цьому в крові поросят вірогідно підвищується загальна кількість Т-лімфоцитів і зростає їх авідність (р<0,05), а також збільшується кількість теофілін-резистентних Т-лімфоцитів із низькою щільністю рецепторів (р<0,05), В-лімфоцитів з низьким та високим ступенем авідності (р<0,05–,01). Водночас ліпоген проявляє стимулювальний вплив на функціональну активність Т-лімфоцитів, про що свідчить збільшення бластної трансформації лімфоцитів крові поросят (р<0,05–,01).
Нами встановлено також підвищення лізоцимної (р<0,05) та бактерицидної (р<0,05–,01) активності сироватки крові та зниження рівня циркулюючих імунних комплексів (р<0,05) у крові відлучених поросят, яким вводили ліпоген, що ймовірно зумовлено дією антибіотика гентаміцину, який володіє бактерицидними і бактеріостатичними властивостями, а також корегуючим впливом вітамінів А і Е на вільнорадикальні процеси в організмі поросят.
Введення поросятам перед відлученням від свиноматок ліпогену призводить до збільшення трансформаційної та функціональної активності гематогенних попередників макрофагів (р<0,05–,01), перетравної здатності фагоцитів та зростання оксидоредуктазного потенціалу фагоцитуючих клітин у НСТ-тесті (р<0,05), що можна пояснити антиоксидантною дією вітамінів А і Е.
У цілому проведені дослідження показали, що введення поросятам у день відлучення комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген” зумовлює корекцію прооксидантно-антиоксидантної рівноваги організму, сприяє підвищенню резистентності та енергії їх росту. З цих позицій метаболічна корекція вільнорадикальних процесів в організмі поросят розглядається як новий перспективний напрям підвищення імунного потенціалу тварин.
Результати виробничих апробацій досліджуваних імунотропних препаратів: зниження на 15–23 % захворюваності телят і поросят; зменшення терміну перебігу захворювання телят і поросят на гастроентерити на 10–12 %; зниження частоти респіраторних захворювань телят і поросят на 18–25 %; зменшення терміну перебігу респіраторних захворювань телят і поросят на 14–17 %; збільшення середньодобових приростів маси тіла телят та поросят на 10–%.
Вивчено біохімічні механізми формування імунної та антиоксидантної систем в організмі телят і поросят раннього віку, встановлено депресуючий вплив на їх активність вакцинації, а у поросят – відлучення від свиноматок, розроблено ефективні способи корекції порушень функціонування імунної та антиоксидантної систем шляхом використання розроблених комплексних препаратів.
11. Введення поросятам перед відлученням від свиноматок препарату “Ліпоген” призводить до вірогідного підвищення рецепторної здатності Т- і В-лімфоцитів (р<0,05–0,01), бактерицидної та лізоцимної активності сироватки крові (р<0,05–0,01), а також до зменшення концентрації гідроперекисів ліпідів (р<0,01), підвищення на 20 % середньодобових приростів маси їх тіла.
ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ
ДИСЕРТАЦІЇ
Віщур О.І. Біохімічні особливості формування та регуляції імунної відповіді у телят і поросят у ранньому віці. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.04 –біохімія. –Інститут біології тварин УААН. Львів, 2008.
У дисертації представлені результати комплексного дослідження біохімічних показників, які характеризують активність клітинних і гуморальних факторів імунітету, імунобіологічну реактивність, активність ферментної та неферментної ланок антиоксидантної системи, деякі сторони метаболізму білків та ліпідів в організмі телят і поросят на ранніх стадіях росту, при вакцинації та відлученні поросят від свиноматки, а також вплив імунотропних засобів (“Тимогену”, “Левамізолу”, “Антоксану”, “Імукору”, “Ліпогену”) на вказані показники.
Встановлено стимулювальний вплив імуномодулюючих препаратів “Тимоген” і “Левамізол” на формування імунобіологічної реактивності, активність неспецифічних факторів захисту та інтенсивність пероксидного окиснення ліпідів в організмі телят і поросят при вакцинації.
Розроблено склад і технологію одержання імуномодулюючого препарата з антиоксидантною дією “Антоксан”, встановлено його нормалізуючу дію при посиленні вільнорадикального окиснення та при формуванні повноцінної імунної відповіді у телят і поросят.
Встановлено стимулювальний вплив розробленого препарату “Імукор” на функцію імунної та антиоксидантної системи в організмі телят.
Доведено високу ефективність застосування комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген” з метою зменшення негативного впливу стресу у поросят при відлученні від свиноматок, а також з метою підвищення резистентності телят у ранньому віці.
Результати проведених досліджень розширюють і поглиблюють сучасні уявлення про біохімічні особливості становлення імунної системи та корекцію її порушень у телят і поросят раннього віку за умов імунодефіциту, вакцинації, а також відлучення поросят від свиноматок. Обґрунтовано, що метаболічна корекція вільнорадикальних процесів у організмі поросят і телят є новим перспективним напрямом підвищення імунного потенціалу молодняку.
Ключові слова: телята, поросята, імунітет, імунокомпетентні клітини, імуноглобуліни, селен, інтерферон, ліпосомальні препарати, вітаміни А і Е.
Вищур О.И. Биохимические особенности формирования и регуляции иммунного ответа у телят и поросят в раннем возрасте. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук по специальности 03.00.04 –биохимия. –Институт биологии животных УААН. Львов, 2008.
В диссертации представлены результаты комплексного исследования показателей клеточного и гуморального иммунитета, иммунологической реактивности, активности ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы, некоторые стороны метаболизма белков и липидов в организме телят и поросят в раннем возрасте, при вакцинации, отъеме поросят от свиноматок и влиянии иммунотропных препаратов “Тимоген”, “Левамизол”, “Антоксан”, “Имукор”, “Липоген” на указанные показатели. Полученные результаты свидетельствуют о зависимости исследованных показателей от возраста животных, а также от иммуномодулирующего действия исследуемых иммунотропных препаратов.
В процессе исследований было установлено стимулирующее влияние иммуномодулирующих препаратов “Тимоген” и “Левамизол” на формирование иммунобиологической реактивности, неспецифических защитных факторов, а также интенсивность пероксидного окисления липидов в организме телят и поросят при вакцинации. Установлено, что тимоген и левамизол действуют в основном на Т-клеточное звено иммунной системы, коррегируют нарушенную взаимосвязь между отдельными субпопуляциями лимфоцитов и контролируют иммунорегуляторную активность Т-системы иммунитета в рецепторной и пролиферативной фазах иммунного ответа. При этом тимоген проявляет иммуномодулирующие свойства быстрее, чем левамизол. При совместном использовании вакцины и иммуномодуляторов в организме поросят и телят стимулируется формирование поствакцинального иммунитета и ингибируется пероксидное окисление липидов.
Обоснован состав, разработана рецептура и технология изготовления иммуномодулирующего препарата с антиоксидантным действием “Антоксан”, установлено его коррегирующее действие при усилении свободнорадикальных процессов и при формировании полноценного иммунного ответа у телят и поросят. Показано нормализирующее влияние селена, β-каротина и интерферона, которые входят в состав антоксана, на систему антиоксидантной защиты, иммунную функцию и эритроцитопоэз у телят и поросят в раннем возрасте, у телят при вакцинации. Установлена взаимосвязь между интенсивностью пероксидного окисления липидов в организме поросят при отъеме от свиноматок, активностью антиоксидантной защиты и иммунным потенциалом животных, который определяли по показателям трансформационной и функциональной активности гематогенных предшественников макрофагов.
Установлено стимулирующее влияние разработанного препарата “Имукор”, который содержит гамма-глобулины сыворотки крови и селен, на функцию иммунной системы, неспецифическую резистентность и ингибирующее влияние на свободнорадикальные процессы в организме телят.
Показано высокую эффективность комплексного липосомального препарата “Липоген” при использовании его с целью уменьшения отрицательного влияния стресса у поросят при отъеме от свиноматок и у телят в раннем возрасте.
Результаты проведенных исследований расширяют и дополняют современные представления о биохимических особенностях формирования иммунной системы и ее коррекции с помощью новых комплексных иммуномодулирующих препаратов у телят и поросят в раннем возрасте, при иммунодефицитах, вакцинации и отъеме поросят от свиноматок. Обосновано, что метаболическая коррекция свободнорадикальных процессов рассматривается как новый перспективный путь повышения иммунного потенциала животных.
Ключевые слова: телята, поросята, иммунитет, иммунокомпетентные клетки, иммуноглобулины, селен, интерферон, липосомальные препараты, витамины А и Е.
Vishchur O.I. Biochemical features of forming and regulation of immune response in calves’and piglets’in early age. – Manuscript.
The dissertation for the scientific degree of veterinary sciences doctor by speciality 03.00.04 – biochemistry. – Institute of Animal Biology of Ukrainian Academy of Agrarian Sciences, Lviv, 2008.
The dissertation is devoted to the integrated studies of cellular and humoral immunity, immune reactivity, activity of enzymatic and nonenzymatic links of antioxidant defense system, some aspects of lipid and protein metabolism in the organism of calves and pigs in early age after vaccination, weaning of piglets from sows, and under the influence of immune tropic preparations (“Thymogen”, “Levamysol”, “Аntoxan”, “Іmmucor”, “Lipogen”) on the above-mentioned indices.
The stimulating influence of immune-response modulating preparations “Thymogen” and “Levamysol” on forming immune biological reactivity, activity of nonspecific defensive factors and peroxide lipid oxidation intensity in calves’and pigs’organism after vaccination was established.
The compound and production technology of immune-response modulating preparation with antioxidant effect – “Antoxan” was elaborated. Corrective effect during strengthening of peroxide processes and forming full-value immune response was determined.
The stimulating influence of elaborated preparation “Immucor”, on immune and antioxidant system functions, in the organism of calves was established.
High prophylactic efficiency of complex liposome preparation “Lipogen” for reducind stress of piglets at weaning and for calves’resistance increase in early age was proved.
The obtained results expand modern scientific conceptions concerning biochemical particular qualities of immune system (of calves and piglets in early age) forming and its correction with new complex immune modulating preparations at immune deficiency disorders, influence of vaccination, weaning of piglets from sows.
Key words: calves, piglets, immunity, immune globulins, selenium, interferon, liposome preparations, vitamins A and Е, immunocompetent cells.