Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
|
НЕОБЫЧАЙНАЯ ИСТОРИЯ О ТОМ, КАК РОДИЛАСЬ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ |
||
|
В мире науки (Scientific American) Июнь N 6 1990 г. |
||
|
Кэри Б. Мюллис лауреат Нобелевской премии в области химии |
||
|
Этот удивительно простой метод получения фрагментов ДНК в неограниченном количестве копий был придуман при необычных обстоятельствах - ночью, во время автомобильной поездки в горах Калифорнии. |
||
|
Иногда удачная идея приходит в голову совершенно неожиданно. Со мной, например, это случилось в одну из апрельских ночей в 1983 г., когда я, сидя за рулем автомобиля, пробирался по освещенной луной горной дороге в секвойные леса Северной Калифорнии. Мысль моя случайно натолкнулась на процесс, благодаря которому можно получать копии генов в неограниченных количествах. Теперь его называют полимеразной цепной реакцией (ПЦР). ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получать 100 млрд. сходных по структуре молекул. Эта реакция очень проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За семь лет, прошедших с той апрельской ночи, ПЦР нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже 15 лет все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны. Полимеразная цепная реакция значительно облегчила работу молекулярных биологов - с ее помощью они могут получать сколь угодно большие количества специфической ДНК. На первый взгляд может показаться, что ДНК получить очень просто. В действительности выделить специфический тип молекул нативной ДНК из любого организма, за исключением чрезвычайно простых вирусов, - задача не из легких.. |
||
|
смотри рисунок N1 |
Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов: дезокиаденилатов (А), дезоксигуанилатов (G), дезокситимидилатов (Т) и дезоксицитидилатов (С). Последовательность нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности другой: а располагаются всегда против T, а G против С. Благодаря комплементарности цепи удерживаются вместе. У каждой цепи есть 3` конец и 5` конец. Поскольку ориентации двух цепей противоположны, говорят, что оно антипараллельны. |
|
|
Трудности обусловлены самой природой молекул ДНК. Они представляют собой хрупкие цепи, построенные из четырех типов дезоксирибонуклеотидов: дезоксиаденилата (А), дезокситимидилата (Т), дезоксигуанилата (G) и дезоксицитидилата (С); в последовательности этих оснований закодирована генетическая информация. Одиночные цепи ДНК встречаются редко, обычно пары цепей с комплементарными последовательностями образуют двойные спирали, в которых остатки А в одной цепи связываются с остатками Т в другой, а остатки G связываются с остатками С (см. рисунок нас. 27). В клетках молекулы ДНК окружены белками, которые обеспечивают ее более плотное свертывание. Как правило, не удается выделить ДНК из клеток неповрежденной - нить оказывается разорванной в случайно расположенных точках. Поэтому, если ДНК выделяется из 1000 идентичных клеток, препарат будет содержать 1000 копий каждого гена, однако все эти копии окажутся во фрагментах разной длины. В течение длительного времени эта проблема затрудняла изучение генов. Наконец, в 70-х годах были открыты ферменты - рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), которые расщепляют ДНК в специфических точках. Исследователи получили возможность "разрезать" ДНК на более короткие и более стабильные фрагменты, которые просто идентифицировать. При этом легче выделять и изучать фрагменты ДНК с находящимися в них генами. К концу 70-х годов молекулярные биологи энергично взялись за изучение ДНК с помощью эндонуклеаз и других молекул, называемых олигонуклеотидными пробами (зондами). Олигонуклеотид представляет собой короткую цепь нуклеотидов, расположенных в специфической последовательности. В определенных условиях олигонуклеотид специфически связывается с комплементарной последовательностью нуклеотидов в одноцепочечной ДНК. Поэтому искусственно синтезированные радиоактивные олигонуклеотиды могут служить "пробами", когда необходимо определить, содержит ли препарат ДНК специфическую последовательность нуклеотидов или ген. В 1979 г. я поступил на работу в фирму Cetus в Эмервилле (шт. Калифорния), в мои обязанности входил синтез олигону-клеотидных проб. К 1983 г. синтез олигонуклеотидов стал утрачивать свою привлекательность для химиков. Этот трудоемкий процесс - своего рода искусство - стала вытеснять более надежная технология с применением автоматических устройств. Это было огромным достижением. В результате этой минипромышленной революции у химиков, синтезирующих олигонуклеотиды, работы стало гораздо меньше. Автоматические синтезаторы, которые мы стали использовать, позволяли получать даже больше олигонуклеотидов, чем помещалось в холодильниках, и заведомо больше, чем могли использовать в своих опытах молекулярные биологи, которые, как оказалось, работали еще нерасторопнее, чем мы предполагали. У меня оказалось вполне достаточно свободного времени на размышления и я почти невольно стал придумывать различные комбинации с олигонуклеотидами. Я понимал, как важно разработать простой метод идентификации нуклеотида в заданном положении в молекуле ДНК, особенно для ДНК высокой сложности (например, ДНК человека), а также для малых количеств ДНК. Я не видел принципиальных препятствий, чтобы для этого использовать фермент ДНК-полимеразу и один из вариантов метода, который называют секвенированием с использованием дидезоксинуклеотидов. Для проверки этого предположения я задумал несложный эксперимент. Чтобы понять ход моих мыслей, стоит напомнить некоторые данные о ДНК. Концы цепи ДНК химически различны, один обозначается как 5', другой - как 3 '. В двойной спирали ДНК комплементарные цепи антипараллельны, следовательно, 3'-конец одной цепи связан с 5 '-концом другой, и наоборот. В 1955 г. А. Корнберг и его коллеги из Станфордского университета открыли в клетках фермент, который назвали ДНК-полимеразой. ДНК-полимеразы выполняют ряд функций, в том числе обеспечивают репарацию и репликацию ДНК. Эти ферменты способны удлинять короткие олигонуклеотидные затравки (праймеры), присоединяя к 3'-концу дополнительный нуклеотид, но для этого необходимо, чтобы праймер был гибридизован, т. е. связан с комплементарной цепью ДНК, которая называется матрицей. Раствор, в котором происходит эта реакция, должен содержать нуклеозидтрифосфаты (они используются в качестве строительных блоков). Нуклеотид, который присоединяет ДНК-полимераза, комплементарен основанию в соответствующем положении матричной цепи. Например, если это А, полимераза присоединяет Т, если матричный нуклеотид - G, то фермент присоединяет С. Многократно повторяя эту реакцию, полимераза способна удлинять 3'-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5 ' -конца матрицы (см. рисунок на с. 29). В ходе репарации и репликации двойной спирали ДНК каждая цепь служит матрицей для синтеза другой цепи. Остановимся теперь на методе секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов, который обычно называют методом Сэнгера, по имени одного из его создателей - Ф. Сэнгера из Лаборатории молекулярной биологии Британского совета медицинских исследований. Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК он использовал ДНК-полимеразу, матричную ДНК, нуклеозидтифосфаты, а также специальные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTP). Подобно обычным нуклеотидам, ddNTP могут быть присоединены к концу растущей цепи с помощью ДНК-полимеразы, однако ddNTP при этом блокирует 3 ' -конец, полностью предотвращая дальнейшее наращивание цепи. В реакции Сэнгера можно получить праймеры, удлиненные в разной степени, а затем блокированные ddNTP, Зная, какой из ddNTP был присоединен, и определив длину синтезированных фрагментов ДНК, можно установить последовательность нуклеотидов в матричной цепи. Например, если в данном положении был присоединен дидезоксиаденозин (ddA), соответствующим комплементарным основанием в матрице должен быть Т, а присоединение дидезоксигуанозина (dclG) означает присутствие в матрице С. Я намеревался модифицировать этот метод и использовать только полимеразу, матрицу, ddNTP и праймер, т. е. исключить из смеси обычный нуклеозидтрифосфаты. Поэтому наращивание праймеров должно было завершиться сразу после включения первого же ddNTP в цепь. Если бы я знал, какой ddNTP присоединился к праймеру, можно было установить соответствующее основание в матричной цепи. Таким способом я смог бы идентифицировать основание в матричной цепи, располагающееся рядом с участком связывания праймера. |
||
|
смотри рисунок 2 |
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - это простой лабораторный метод копирования фрагмента ДНК с использованием легко доступных реактивов. Поскольку число копий возрастает экспоненциально, всего за несколько часов можно получить более 100 млрд. копий. |
|
|
Тогда я не осознавал, что существуют довольно веские причины, по которым подобный метод определения последовательности нуклеотидов непригоден. Трудность заключалась в том, что иногда олигонуклеотиды гибридизуются не с теми последовательностями ДНК, для выявления которых они синтезированы; подобное неспецифическое связывание неизбежно привело бы к неоднозначности результатов. Даже наиболее искусным экспериментаторам не удавалось достичь связывания олигонуклеотидов с суммарной ДНК человека со специфичностью, которая позволяла бы получать осмысленные результаты. Именно из-за этих ограничений исследователи были вынуждены применять для изучения ДНК человека более сложные методы. Например, для разрезания ДНК могут быть использованы ферменты рестрикции, затем полученные фрагменты (рестрикты) можно разделить с помощью электрофореза. Таким способом добиваются некоторой "очистки" искомой последовательности ДНК от общей ДНК перед гибридизацией с олигонуклеотидными пробами. Благодаря этой процедуре уменьшается вероятность случайной гибридизации и соответственно увеличивается вероятность получения значимых результатов. Однако удается она далеко не всегда и, кроме того, занимает много времени и не позволяет работать с де-градированной или денатурированной ДНК. Другой подход, значительно более трудоемкий для рутинного анализа, основан на клонировании. Изучаемую последовательность нуклеотидов ДНК человека можно клонировать, или копировать, встроив ее в небольшую кольцевую ДНК, которая называется плазмидой. Затем, размножая бактериальные клетки, несущие эту плазмиду, можно получить большое количество исследуемой ДНК. Чтобы определить ее последовательность, проводят гибридизацию с олигонуклеотидом и секвенирование с использованием дидезоксинуклеотидов. С помощью такого подхода в начале 80-х годов была получена большая часть данных о последовательностях ДНК человека. Планируя свой довольно простой эксперимент, я не допускал и мысли о том, что для обнаружения специфической последовательности в ДНК человека с помощью гибридизации с олигонуклеотидом понадобится клонирование или какой-то другой этап. Чтобы оправдать свою наивность, замечу, что группа под руководством Г. Эрлиха, одного из ведущих специалистов фирмы Cetus, пыталась осуществить другой подход, также основанный на гибридизации одного олигонуклеотида со специфической последовательностью ДНК человека. Никто над нами не смеялся, более того, всем нам регулярно платили жалованье, и мы чувствовали себя на переднем крае генной инженерии. |
||
|
смотри рисунок N3 |
ДНК-ПОЛИМЕРАЗА - это фермент, способный наращивать короткие цепочки ДНК, так называемые олигонуклеотидные праймеры, если эти короткие цепочки связаны с более длинной "матричной" цепью ДНК. При этом полимераза присоединяет к 3'-концу связанного праймера соответствующий комплементарный нуклеотид. Однако если добавить дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP), например дидезоксиаденозин (ddA), дальнейший рост цепи будет невозможен, поскольку к 3'-концу ddA нуклеотиды присоединяться уже не могут. |
|
|
Однажды поздним вечером в пятницу вместе с подругой, также химиком из компании Cetus, я ехал в автомобиле в округ Мендоцино. Она спала. Шоссе 101 было пустынным. Я любил ночную езду и регулярно по выходным три часа проводил за рулем, чтобы попасть в свой загородный дом на севере Калифорнии. Руки при этом заняты, а голова свободна. Той ночью я думал о предстоящем эксперименте по секвенированию ДНК. У меня был прямой план. Прежде всего разделю цепи ДНК нагреванием, затем проведу гибридизацию олигонуклеотида с комплементарной последовательностью в одной из этих цепей. Эту смесь ДНК разделю на четыре пробирки. В каждой пробирке будут присутствовать все четыре типа ddNTP, но только один из них будет помечен радиоактивным изотопом. Затем добавлю ДНК-полимеразу, которая удлинит связанный с ДНК олигонуклеотид в каждой пробирке на один ddNTP. С помощью электрофореза можно отделить удлиненные олигонуклеотиды от оставшихся ddNTP. Определив, какой из радиоактивных ddNTP присоединился к олигонуклеотиду, можно будет установить, какой нуклеотид располагается в соответствующем положении в цепи ДНК. Очень просто. Вблизи Кловердейла, где шоссе Калифорния 128 уходит на север от шоссе 101 и начинается серпантин вверх по побережью, мне пришла мысль, что если вместо одного олигонуклеотида использовать два, такое определение будет гораздо точнее. Два праймера будут расположены с обеих сторон от пары нуклеотидов, которую я хотел идентифицировать. Если синтезировать олигонуклеотиды разного размера, их можно будет отличить друг от друга. Если олигонуклеотиды будут комплементарны разным цепям ДНК, можно будет определить соответствующие последовательности в обеих цепях молекулы. Это позволит без дополнительных сложностей осуществлять внутренний контроль. |
||
|
смотри рисунок N4 |
ЧТОБЫ ИДЕНТИФИЦИРОВАТЬ пару оснований в определенном положении фрагмента ДНК, автор статьи надеялся использовать вариацию метода секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов. Сначала два праймера должны были связаться с противоположными цепя праймеру мог присоединиться всего один нуклеотид. Идентифицировав присоединившиеся ddNTP, можно установить, какая пара нуклеотидов расположена между праймерами. Метод можно использовать с одним праймером, но применение двух праймеров обеспечивает контроль для подтверждения результатов. Планируя этот эксперимент, автор пришел к идее полимеразной цепной реакции. |
|
|
Хотя тогда я не отдавал себе в этом отчета, но задумав использовать два олигонуклеотида, расположенных по обе стороны от исследуемого гена, с 3'-концами, направленными друг к другу, я был очень близок к открытию ПЦР. В тот момент, однако, я был и на грани падения с горной дороги и остро ощущал это. Влажный ночной воздух был наполнен ароматом цветущих каштанов. Их белые "свечи" как бы выскакивали на меня в свете фар. Я думал о новых прудах, которые делал у себя на участке, а также о возможных осложнениях в планируемом опыте по секвенированию. Еще с тех пор, когда я стажировался в лаборатории В. Сэди в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, где Дж. Мейбаум разрабатывал для клиники метод определения нуклеотидов, я помнил, что препараты ДНК могут содержать следовые примеси нуклеозидтрифосфатов. Если эти случайные нуклеотиды будут присоединяться к 3'-концам праймеров до того, как произойдет присоединение меченых ddNTP, интерпретировать результаты электрофореза окажется непросто. Сначала я считал, что свободные нуклеозидтрифосфаты в пробе можно разрушить с помощью щелочной фосфатазы - бактериального фермента. Этот фермент отщепит от нуклеозидтрифосфатов необходимые для реакции остатки фосфата, предотвратив их участие в реакции полимеризации. Однако после этого придется каким то способом удалить фосфатазу из реакционной смеси, иначе она разрушит ddNTP, которые я добавлю. Обычно ферменты, активность которых нежелательна, можно инактивировать нагреванием пробы; при этом нарушается форма молекул фермента, важная для его функционирования действия. Однако я был уверен, что молекулы бактериальной щелочной фосфатазы после нагревания способны восстанавливать исходную форму и поэтому решил ее не использовать. Однако я ошибался. Значительно позже я узнал, что щелочную фосфатазу можно необратимо денатурировать, если полностью удалить из раствора ионы цинка и прогреть пробу. Как выяснилось, моя ошибка оказалась на редкость удачной: если бы я был лучше осведомлен, я перестал бы искать новые варианты эксперимента. Примерно каждую милю у меня рождалось новое решение, которое я тут же отбрасывал. Потом, когда начался спуск в долину Андерсона, пришла мысль применить один и тот же фермент - ДНК-полимеразу - дважды, сначала для того, чтобы удалить из пробы находящиеся в ней нуклеозидтрифосфаты, а затем, чтобы присоединить к праймеру меченые ddNTP. Я рассуждал так. Если в пробе присутствует достаточно нуклеотидов, чтобы исказить мой эксперимент, их должно быть также достаточно для функционирования ДНК-полимеразы. Если сначала провести своего рода имитацию реакции в присутствии олигонуклеотидных праймеров и ДНК-полимеразы, но без ddNTP, то можно без труда удалить свободные нуклеозидтрифосфаты, которые присоединятся к удлиняющимся олигонуклеотидам. Затем, повысив температуру реакционной смеси, я смогу отделить удлиненные олигонуклеотиды от матрицы ДНК. Однако при этом олигонуклеотиды с наращенными концами останутся в пробе, но таких праймеров будет намного меньше, чем исходных неудлиненных, поэтому, когда температура смеси снизится, с ДНК, вероятно, будут связываться преимущественно неудлиненные праймеры. Затем можно добавить ddNTP и новую порцию ДНК-полимеразы уже для проведения самого эксперимента по секвенированию. И все-таки некоторые вопросы продолжали беспокоить меня. Будут ли мешать реакции олигонуклеотиды, синтезированные в имитационной реакции? Что если они удлинятся не на один-два, а на большее число нуклеотидов и перекроют участок связывания второго праймера? Конечно, это приведет к осложнениям... Нет, отнюдь! Я вздрогнул от неожиданного прозрения: цепи ДНК в исходной матрице и в удлиненном олигонуклеотиде по последовательности нуклеотидов будут идентичны. В итоге в реакции имитации число ДНК-матриц для секвенирования удвоится! Неожиданно для меня аромат цветущих каштанов стал резко ослабевать. ЕСЛИ бы это было при обычных обстоятельствах, я бы не понял значения удвоения так быстро. Действительно, идея о многократном повторении одной и той же процедуры может показаться совсем скучной, однако я тратил массу времени на составление компьютерных программ и познакомился при этом с циклически повторяющимися "петлями" - процедурами, при которых одна и та же математическая операция многократно используется для преобразования результатов предыдущих циклов. Мой опыт подсказывал мне, что процессы экспоненциального роста в циклически повторяющихся операциях могут быть очень значительными. А вариант репликации ДНК, о котором я размышлял, представлял собой как раз такой процесс. Взволнованный, я стал перебирать в памяти степени числа 2: 2, 4, 8, 16, 32... Я помнил, что 2 в десятой степени составляет приблизительно 1000, а 2 в двадцатой степени - миллион. На выезде из долины Андерсона я остановил машину, достал бумагу и карандаш, чтобы проверить свои расчеты. Дженнифер, моя спящая пассажирка, слабо протестовала против задержки и против света в кабине, но я воскликнул, что открыл нечто фантастическое. В замешательстве она заснула снова. Я убедился в том, что 2 в двадцатой степени составляет несколько больше миллиона, и поехал дальше. Приблизительно через милю пути я понял еще кое-что о продуктах реакции. После нескольких циклов, состоящих из наращивания праймеров, отделения продуктов полимеризации, связывания новых праймеров и их наращивания, длина экспоненциально накапливающихся цепей ДНК окажется фиксированной, поскольку их концы будут точно определяться 5'-концами олигонуклеотидных праймеров. Если синтезировать праймеры, связывающиеся с более удаленными друг от друга участками ДНК, можно реплицировать в исходном препарате фрагменты ДНК большей длины. Продуктами реакции всегда будут фрагменты ДНК строго определенной длины. Я вновь остановил машину и принялся рисовать, как молекулы ДНК связываются друг с другом и удлиняются и как продукты одного цикла становятся матрицами для последующих циклов в цепной реакции... Дженнифер снова запротестовала сквозь сон. "Ты ни за что не поверишь, - крикнул я, - это невероятно!" Она не проснулась. Я поехал дальше, не останавливаясь до самого дома. В конце долины Андерсона начинаются секвойные леса. Существует давнее поверье, что в этих местах живут раззявы-неумехи. Я почувствовал, что своим открытием почти нарушил это представление. В ту ночь мне не спалось - в мозгу непрерывно взрывались дезоксирибонуклеиновые бомбы. Утром я был слишком изнурен и не мог поверить, что эту идею еще никто не реализовал. Тысячи ученых с разными целями производили наращивание олигонуклеотидов с использованием полимераз, и, конечно, кто-нибудь из них должен был заметить возможность полимеразной цепной реакции. Но если бы она кому-то удалась, я знал бы об этом: исследователи должны были бы использовать ее постоянно для амплификации, или размножения фрагментов ДНК. Вернувшись в понедельник в свою фирму, я обратился к Дж. Макгрегору, одному из библиотекарей, с просьбой провести компьютерный анализ литературы по ДНК-полимеразе. Он не обнаружил ничего, имеющего отношения к амплификации. На протяжении следующих нескольких недель я излагал свою идею любому желающему выслушать меня. Никто не слышал, что это когда-либо пробовали осуществить; никто не мог также привести разумных доводов, позволяющих понять, почему это невыполнимо. Тем не менее идея ни у кого не вызывала особого энтузиазма. До этого случая мои коллеги скептически относились к моим идеям, касающимся ДНК, и часто, поразмыслив несколько дней, я соглашался с ними. Однако на этот раз я понимал, что приблизился к чему-то значительному. Прошли месяцы, прежде чем я подготовился к своему первому эксперименту по проверке принципа ПЦР. Мне пришлось основательно поработать с литературой, чтобы правильно использовать буферные растворы, подобрать концентрации реагентов, решить, как долго следует нагревать и охлаждать реакционные смеси и т. д. Полезными оказались некоторые ранние работы Корнберга, посвященные ДНК-полимеразе. Для проведения опыта в качестве ДНК-матрицы я выбрал участок плазмидной ДНК длиной 25 нуклеотидных пар и два олигонуклеотида длиной соответственно 11 и 13 нуклеотидов. |
||
|
смотри рисунок N5 |
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - это циклический процесс; в каждом цикле число молекул ДНК мишени разделяются при нагревании, потом при охлаждении с ними связываются праймеры. Затем ДНК-полимераза наращивает праймеры, присоединяя к ним нуклеотиды. В результате образуются копии цепей исходной ДНК мишени. |
|
|
Когда все было готово, я провел эксперимент из тех, что нравятся мне больше всего, - эксперимент, который ставится в одной пробирке и позволяет получить простой ответ: да или нет. Будет ли ПЦР амплифициро-вать выбранный мною участок ДНК? И ответ был получен: да, будет. Поздно вечером, выходя из лаборатории, я заметил, что Эл Халлуин, патентовед фирмы Cetus, все еще сидит в своем офисе. Я сказал ему, что придумал кое-что, и рассказал о ПЦР. Приблизительно из сотни людей, которым я объяснил свою идею, он был первым, кто согласился с тем, что я придумал что-то важное. Он даже захотел тут же посмотреть радиоавтограф, на котором был виден результат опыта, причем пленка была еще мокрой. Опыты, проводимые в одной пробирке, на многих людей не производят впечатления, однако Эл явно не был настроен скептически. В конце концов, интерес патентоведов к изобретениям вполне оправдан. Он выслушал мои разъяснения по поводу реакции и согласился, что они логичны. Он сам заинтересовался всем этим, предложил мне продолжить эксперименты и написать патент. Уходя, он поздравил меня. На протяжении следующих нескольких месяцев я продолжал изучать и оптимизировать ПЦР вместе в Фредом Фалуном, молодым, талантливым математиком, с которым меня познакомила моя дочь. Фред помогал мне и в первом опыте по ПЦР, обеспечивая циклические изменения температуры реакционной смеси. Для него это был, конечно, первый биохимический эксперимент и ночью после его успешного завершения мы отпраздновали это событие несколькими порциями пива. В течение следующих месяцев мы подтвердили эффективность ПЦР для плазмидной ДНК все большей длины. Наконец, мы получили из лаборатории Г. Эрлиха немного ДНК человека и провели амплификацию фрагмента, содержащего ген, присутствующий в геноме человека в количестве одной копии. В настоящее время многие из первоначальных сбоев и ошибок при постановке ПЦР преодолены. Теперь используется несколько слегка различающихся вариантов методики проведения этой реакции. Обычно я рекомендую изменять температуру реакционной смеси примерно от 98¦С, т. е. почти от точки кипения, приблизительно до 60¦С. Такие циклы могут занимать всего одну-две минуты; в ходе каждого цикла количество ДНК, с которой связываются праймеры, удваивается. Праймеры обычно имеют длину 20-30 нуклеотидов. Одно из наиболее значительных усовершенствований процесса заключается в использовании особой ДНК-полимеразы, которая первоначально была выделена из бактерии Thermus aquaticus, живущей в горячих источниках. Полимераза, которую мы использовали в первых экспериментах, легко инактивировалась при нагревании, поэтому в каждом цикле реакции приходилось добавлять новую порцию фермента. Однако ДНК-полимераза Т. aquaticus стабильна и активна при высоких температурах, поэтому ее можно добавлять только один раз в начале реакции. В настоящее время эту термостабильную ДНК-полимеразу выделяют из штамма бактерий, специально сконструированного методами генной инженерии. Практически неограниченная амплификация ДНК с помощью ПЦР была настолько беспрецедентной, что не могла быть воспринята немедленно. Исследователи были не подготовлены к тому, что существует процесс, с помощью которого можно получать любую ДНК. Реакция казалась очень простой мне и Фреду, потому что была нашим детищем. Для других потребовалось время, чтобы свыкнуться с ней. Весной 1984 г., работая над патентом, я выставил стенд, посвященный ПЦР, на ежегодной научной конференции в фирме Cetus. Эти конференции всегда были очень интересными, поскольку научными консультантами в фирме работали крупнейшие ученые. Я предвкушал разговор с ними о моем открытии. Однако, казалось, мой стенд никого не заинтересовал, и я стал нервничать все больше. Люди бросали на него беглый взгляд и проходили дальше. Наконец, я заметил поблизости Джошуа Ледерберга, президента Рокфеллеровского университета, и попросил его посмотреть результаты моих опытов. Джошуа внимательно просмотрел их, а затем, повернув ко мне свою крупную голову, голову лауреата Нобелевской премии, в которой в 1946 г. родилась идея о том, что у бактерий возможен половой процесс, спросил: "И что, получается?" Казалось, он даже развеселился. Польщенный, я ответил, что да, получается. После этого мы еще долго беседовали. Он упомянул, что примерно 20 лет назад, когда Корнберг открыл ДНК-полимеразу, они обсуждали идею о том, что этот фермент можно каким-то образом использовать для синтеза больших количеств ДНК. Однако им не удалось точно представить, как именно этого можно достичь. Я напомнил ему, что в то время исследователи не могли получать нуклеотиды и, кроме того, отсутствовала какая-либо информация о последовательностях нуклеотидов в ДНК. Он вновь посмотрел на мой стенд с таким выражением, которое я почти ожидал увидеть. Я думаю, что Джошуа, поняв необыкновенную простоту полимеразной цепной реакции, оказался, вероятно, первым, у кого возникло ощущение, которое теперь возникает почти у всех молекулярных биологов и других исследователей, работающих с ДНК: "Почему я не подумал об этом?" И никто не может ответить на этот вопрос. Не могу ответить, конечно, и я. Просто однажды ночью я наткнулся на решение. |
||