Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе.
Работа добавлена на сайт samzan.net:
Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
То же самое что и 18 билет!!! Одно и тоже кроме 3 вопроса
Вопрос №3
Проточная цитометрия — метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.
Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.
[править]Образцы
- кровь
- костный мозг
- ликвор
- суставная жидкость
- плевральная жидкость
- асцитическая жидкость
- суспензированные клетки тканей (например, опухолей)
[править]Принцип
Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:
- рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
- рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
- интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.
[править]Флуорохромы
- Флуоресцеина изотиоцианат (FITC)
- Фикоэритрин (PE, RD1)
- Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)
- Алофикоцианин (APC)
Тандемные красители:
- Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
- Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
- Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
- Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)
«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.
[править]Преимущества
- короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости
- анализ большого количества клеток (до 108 клеток)
- логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
- измерение параметров редко встречающихся клеток
- объективное измерение интенсивности флуоресценции
[править]Применение
[править]Иммунология
- иммунофенотипирование клеток периферической крови
- определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
- определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
- определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
- определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
- исследование клеточного цикла
- оценка клеточной цитотоксичности
[править]Онкология
- количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
- анализ стадий клеточного цикла
- выявление анеуплоидного клона
- определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
- определение специфических маркеров
- позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
- оценка состояния иммунной системы:
- оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
- оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)
[править]Цитология
- определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
- оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
- определение экспрессии поверхностных антигенов
- анализ стадий клеточного цикла
- измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)
[править]Гематология
- анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
- подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
- дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
- диагностика лимфопролиферативных заболеваний
- диагностика острых лейкозов
- оценка минимальной резидуальной болезни
[править]Фармакология
- измерение экспрессии маркеров
- измерение активности внутриклеточных ферментов
- определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне
В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.
Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.
Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии