Будь умным!


У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

ФУНКЦІОНАЛЬНА АКТИВНІСТЬ СИСТЕМИ РЕЦЕПТОРНИХ ТИРОЗИНОВИХ ПРОТЕЇНКІНАЗ У ЛІМФОЦИТАХ СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ РАДІАЦІЙНОГО ВПЛИВУ

Работа добавлена на сайт samzan.net: 2016-03-13

Поможем написать учебную работу

Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Предоплата всего

от 25%

Подписываем

договор

Выберите тип работы:

Скидка 25% при заказе до 16.5.2024

                                                                                           

К И Ї В С Ь К И Й  Н А Ц І О Н А Л Ь Н И Й  У Н І В Е Р С И Т Е Т імені  Т А Р А С А  Ш Е В Ч Е Н К А

КІРПЕНКО ТЕТЯНА  ОЛЕГІВНА

УДК 599:539.1.047+577.122.5

                                                                   

ФУНКЦІОНАЛЬНА АКТИВНІСТЬ СИСТЕМИ РЕЦЕПТОРНИХ ТИРОЗИНОВИХ ПРОТЕЇНКІНАЗ У ЛІМФОЦИТАХ СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ РАДІАЦІЙНОГО ВПЛИВУ

03. 00. 04 –біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

 Науковий керівник:       

доктор біологічних наук

Остапченко Людмила Іванівна,

професор кафедри біохімії Київського  

національного університету              

імені Тараса Шевченка

 

Офіційні опоненти:

 

доктор біологічних наук

Тугай Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник      

Інституту біохімії         

імені О. В. Палладіна НАН України

                                    

доктор біологічних наук, професор

Мирошніченко Микола Степанович,

завідувач кафедри біофізики       

Київського національного  

університету імені Тараса Шевченка

 

Провідна установа:

 Інститут

експериментальної патології, онкології          і радіобіології імені Р.Є. Кавецького    НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “червня 2000 р. о  год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12 (біофак), ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ, вул.Володимирська, 64, спецрада                 Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету: 01033, Київ, вул.Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “травня 2000 р.

Вчений секретар

         спеціалізованої вченої ради

О. В.  БРАЙОН


Актуальність проблеми. До імунологічних наслідків, які розвиваються як пізні прояви радіаційних ефектів, належать мієлоїдні та лімфоїдні новоутворення, комплексні імунні захворювання, аутоагресивні імунні реакції та інші дегенеративні захворювання імунологічної природи (Takashi, 1990). З особливою ретельністю вивчається розвиток мієлоїдних та лімфоїдних неоплазм у відповідь на дію випромінювання (Little, 2000). Під час неопластичної трансформації клітин спостерігається накопичення великої кількості онкогенних продуктів, які є нормальними або спотвореними елементами сигнальних систем ростових факторів (Boutin, 1996). Різноманітні ростові фактори, в свою чергу, виконують функцію регуляції росту, диференціювання й імунної відповіді лімфоїдних клітин. Вони беруть участь в активації В- і Т-лімфоцитів шляхом зв’язування з поверхневими мембранними рецепторами цих клітин, після чого індукуються процеси сигнальної трансдукції (Ullrich, 1990). Необхідно відзначити, що в складний і багатоступеневий процес неопластичної трансформації залучено численні механізми, що включають порушення експресії певних генів, аномальну продукцію цитокінів, гіперекспресію їх рецепторів, спотворення передачі регуляторних сигналів від специфічних рецепторів плазматичної мембрани до ядра клітини і ряд інших (Liebow, 1992).

Одна із ланок сигнальної трансдукції ростових факторів включає активацію  тирозинових  протеїнкіназ  (АТФ: протеїнфосфотрансферази;     КФ 2.7.1.37), яка часто збільшується під впливом онкогенних продуктів (Liebow, 1992). Питання функціонування рецепторних тирозинових протеїнкіназ за умов розвитку патологічного процесу є найбільш хвилюючим на протязі останніх років наукового розвитку. Показано, що рецепторні тирозинові протеїнкінази виконують  функцію ключової ланки сигнальної трансдукції епідермального ростового фактора (ЕРФ) –одного з найбільш відомих  цитокінів  з  широко  показаними онкогенними властивостями (Burke, 1997).

Згідно сучасних радіобіологічних поглядів клітини лімфоїдних органів розглядаються як гранично радіочутлива модель для досліджень впливу іонізуючого випромінювання на тваринний організм. Незважаючи на те, що в клітинах гематопоетичного ряду було виявлено експресію цитокінів родини ЕРФ та їх рецепторів (Walz, 1995), роль ЕРФ у цих клітинах за умов розвитку різних патологічних процесів ще не є досконально вивченою.

Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідити особливості функціонування системи тирозинових протеїнкіназ рецептора ЕРФ в лімфоїдних клітинах селезінки щурів в контрольних умовах та після дії іонізуючої радіації в дозах 0,5 та 1 Гр. Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

  1.  Оцінити рівні активності тирозинових протеїнкіназ у мембранах та цитозолі лімфоцитів селезінки опромінених тварин.
  2.  Виділити ЕРФ-рецепторну тирозинову протеїнкіназу із спленоцитів контрольних та опромінених тварин, вивчити її основні каталітичні властивості.
  3.  Проаналізувати чутливість рецептора ЕРФ у лімфоїдних клітинах селезінки до дії променевого фактору.
  4.  Дослідити участь рецепторних протеїнфосфатаз в регуляції ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ в контрольних умовах та після дії радіації.
  5.  Провести аналіз внутрішньоклітинних ефекторних ланок сигнальної системи ЕРФ та його рецепторів у лімфоїдних клітинах селезінки контрольних та опромінених тварин.  

Наукова новизна роботи. Встановлено пострадіаційні порушення функціональної активності тирозинових протеїнкіназ рецептора ЕРФ у лімфоїдних клітинах селезінки щурів під впливом рентгенівського опромінення. Вперше проведено комплексне дослідження впливу радіації на каталітичні властивості та регуляцію активності ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ, які було отримано з лімфоцитів селезінки через 12 годин після опромінення тварин у дозах 0,5 та 1 Гр. Показано, що порушення регуляції ферменту в післяпроменевий період зумовлено частковою радіаційною інактивацією системи рецепторних фосфатаз і проявляється у вигляді розладів взаємодії ферменту з субстратами фосфотрансферазної реакції. Виявлено участь внутрішньоклітинних сАМР-залежних протеїнкіназ у радіоіндукованому шляху передачі сигналу від ЕРФ та його рецептора.   

 

Практична значимість роботи. Результати, які було отримано під час дослідження функціонування системи тирозинових протеїнкіназ рецептора ЕРФ в умовах дії променевого фактору, сприяють більш комплексному розумінню біохімічних механізмів радіоіндукованої сигнальної трансдукції лімфоїдних клітин селезінки. Оскільки процес розвитку неопластичних трансформацій супроводжується подібними порушеннями функціонування даних ферментів, необхідним виявляється застосування засобів спрямованої корекції радіоіндукованих змін їх активності. Результати досліджень можуть бути корисними при розробці  науково-обгрунтованих шляхів створення ефективних сполук, що здатні модифікувати дію іонізуючої радіації.

Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та оцінка літературних даних, проведення експерименту, аналіз та теоретичне обгрунтування результатів дослідження виконані дисертантом особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу лабораторних досліджень проведені з науковим керівником.

 

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана згідно з тематичним планом №97083 “Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації ” в рамках комплексної наукової програми “Здоров’я людини”.  

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені на VІІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), ІІІ з’їзді по радіаційним дослідженням (Москва, 1997), ІІ з’їзді українського біофізичного товариства (Харків, 1998), ISREC Conference “Cancer and the cell cycle” (Switzerland, 1999), ICRR Satellite Meeting “Biological Effects of Low Dose Radiation” (Ireland, 1999), UICC Advanced Course on Cell Signaling and Cancer (Sweden, 1999), Gordon Research Conference (Singapore, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті в наукових журналах та 6 тез у матеріалах конгресів, конференцій, з’їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що включає 254 роботи. Дисертація викладена на 159 стор., має в своєму складі  15 рисунків, 2 таблиці.

 

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

 

В дослідженнях використовували білих щурів лінії Вістар обох статей масою 130-150 г. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 в дозах 0,5 і 1 Гр за умов: потужність дози в повітрі 24,5 сГр/хв, фільтри 1 мм Сu + 0,5 мм Аl, напруга 200 кВ, сила струму 5 мА, відстань до поверхні шкіри тварин 50 см.

Дослідження проводили через 12 годин після опромінення тварин, що є терміном найбільш виражених порушень основних ланок метаболізму лімфоїдних клітин після опромінення в дозах 0,5 та 1 Гр (Кучеренко, 1996; Остапченко, 1998).

Лімфоцити селезінки отримували центрифугуванням клітинної суспензії на градієнті Ficoll-Paque (густина 1,077) за методом (Boyum, 1968).

Вміст циклічного аденозинмонофосфату в лімфоїдних клітинах визначали за методом (Steiner, 1972).

Препарат ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ отримували за рекомендаціями (Boutin, 1996) з використанням лінійного градієнта концентрації NaCl при елюції ферменту з BrCN-активованої сефарози “Sigma”, яку було попередньо зв’язано з моноклональними антифосфотирозиновими антитілами 4G10 “INSERM”.

Інгібіторний аналіз отриманого препарату ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ проводили за рекомендаціями (Boutin, 1996) з використанням тирфостина та геністеїна “Sigma”.

Визначення активності ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ та вивчення їх автофосфорилювання проводили за методом (Glyn, 1992).

Визначення активності сАМР та сGMP-залежних протеїнкіназ проводили за методом (Gill, Walton, 1979); активності Са+, фосфоліпідзалежних протеїнкіназ –за методом (Mire, 1985); активність Са+, кальмодулінзалежних протеїнкіназ –як рекомендовано в роботі (Sato, 1990).

Активність усіх досліджуваних протеїнкіназ визначали за включенням Р з -Р/-АТP до білкових субстратів фосфотрансферазної реакції. Радіоактивність вимірювали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107, на рідинно- сцинтиляційному лічильнику Delta (USA). Питому активність ферментів виражали в пмоль Рн за 1 хвилину на 1 мг білка.

Активність ЕРФ-рецепторних протеїнфосфатаз визначали за модифікованим методом (Hardrer, 1994) по кількості неорганічного фосфату, відщепленого від білкового субстрату. Питому активність протеїнфосфатаз  виражали пмоль Рн за 1 хвилину на 1 мг білка.

Автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ визначали методом гель-електрофорезу з подальшою авторадіографією (Laemmli, 1970).

Концентрацію білка визначали за методом (Lowry, 1951) та (Bradford, 1976).

Кінетичний аналіз отриманих результатів виконували за допомогою модифікованої програми “ENSFITTER”. Статистичну обробку результатів та побудову графіків проводили на IBM PC ET з використанням стандартних пакетів прикладних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Велика кількість онкогенних продуктів, накопичення яких спостерігається під час неопластичної трансформації клітин, являють собою нормальні або спотворені елементи сигнальних систем ростових факторів. Різноманітні ростові фактори, в свою чергу, виконують функцію регуляції росту, диференціювання й імунної відповіді лімфоїдних клітин. Вони беруть участь в активації В- і Т-лімфоцитів шляхом зв’язування з поверхневими мембранними рецепторами цих клітин. Завдяки відкриттю взаємозв’язку  між ростовими факторами й онкогенами було виявлено, що онкогенна понадстимуляція сигнальної трансдукції реалізується через нормальну ростову відповідь.  Одна  із  ланок  цієї  сигнальної   послідовності  включає  активацію

тирозинових протеїнкіназ, яка часто інтенсифікується під впливом онкогенних продуктів (Liebow, 1992). Надмірна чи невідповідна продукція гормонів, лігандів (ростових факторів), рецепторів, тирозинових протеїнкіназ або їх субстратів може призводити до надлишкового росту клітини. Будь-яке помилкове збільшення активності тирозинових протеїнкіназ у рамках сигнальної трансдукції викликає дисбаланс системи контролю росту нормальних клітин, що спричиняє клітинну трансформацію.

Нами вивчалася активність тирозинових протеїнкіназ у різних фракціях лімфоїдних клітин селезінки щурів. У ході дослідження було виявлено, що активність тирозинових протеїнкіназ у цитозолі лімфоцитів селезінки щурів у 2 рази перевищувала активність даного ферменту в мембранах.

У результаті дослідження впливу рентгенівського випромінювання у дозі 0,5 Гр не було виявлено перерозподілу активності тирозинових протеїнкіназ у лімфоїдних клітинах селезінки. В той же час підвищення дози випромінювання до 1 Гр призводило до істотного збільшення тирозинпротеїнкіназної активності в плазматичних мембранах досліджуваних клітин. Спостережене підвищення тирозинпротеїнкіназної активності в мембранах лімфоцитів селезінки щурів через 12 годин після дії тотального рентгенівського опромінення в дозі 1 Гр можна розглядати як критичну стадію радіоіндукованої сигнальної трансдукції в лімфоїдних клітинах селезінки.

Відомо, що активація ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ відбувається за міжмолекулярним механізмом шляхом взаємодії з цитокінами родини ЕРФ. Оскільки ліганд-рецепторна асоціація є головною та першорядною умовою активації тирозинових протеїнкіназ, великий інтерес викликало дослідження ЕРФ-індукованої активності тирозинових протеїнкіназ в умовах дії рентгенівського випромінювання в досліджуваних дозах. Показано, що за умов преінкубації лімфоцитів селезінки з ЕРФ активність тирозинових протеїнкіназ зростала в 4 рази в плазматичних мембранах досліджуваних клітин (рис. 1).

Вивчення дії випромінювання на цей процес показало, що при цьому спостерігається статистично значуще зниження стимулюючої дії ЕРФ на активність  рецепторних форм тирозинових протеїнкіназ (рис. 1). Цікавим виявляється те, що після дії рентгенівського випромінювання на тваринний організм не спостерігається зниження активності даного ферменту в клітинах, які не було преінкубовано з ЕРФ. Радіоіндуковане зниження активуючої дії ЕРФ поряд із підвищенням активності ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ під впливом випромінювання в дозі 1 Гр може свідчити про виникнення порушень у взаємодії ЕРФ з його мембранними рецепторами. Крім того, виявлений ефект може бути пов’язаним із залученням інших механізмів, які викликають гіперактивацію ЕРФ-рецепторних тирозинових кіназ у післяпроменевий період.

Рис. 1. Вплив ЕРФ на активність [(А), пмоль(хв х мг)-1] ЕРФ - рецепторних тирозинових протеїнкіназ у плазматичних мембранах лімфоцитів селезінки щурів у контролі (І) та після випромінювання в дозах 0,5 (ІІ) і 1 Гр (ІІІ).

Рис. 2. Профіль елюції ЕРФ-рецепторної тирозинової протеїнкінази з лімфоцитів селезінки щурів при хроматографії на BrCN-активованій сефарозі з антифосфотирозиновими антитілами. 1 –активність ферменту в присутності тирфостина; 2 –без тирфостина.  

Серед таких механізмів, перш за все, можуть бути радіоіндуковані конформаційні перебудови структури ферменту, які можуть привести до порушення його взаємодії з субстратами фосфотрансферазної реакції та з регуляторами його активності.

Для з’ясування можливих механізмів змін активності тирозинових кіназ у рамках досліджуваної моделі використовували ферментативний препарат ЕРФ- рецепторних тирозинових протеїнкіназ, який було отримано на колонці з        BrСN-активованою сефарозою, попередньо зв’язаною з моноклональними антифосфотирозиновими антитілами. ЕРФ-рецепторні тирозинові протеїнкінази елюювалися з колонки у вигляді одного виразного піка в інтервалі іонної сили 0,3-0,4 М градієнта NaCl  (рис. 2). Причому, умови елюції ферменту не змінювалися після опромінення тварин у дозах 0,5 і 1 Гр. Останнє може свідчити про відсутність будь-яких конформаційних змін ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ під впливом рентгенівського випромінювання в досліджуваних дозах. Отриманий ферментативний препарат було протестовано на тирозинпротеїнкіназну активність у присутності інгібіторів тирозинового фосфорилювання тирфостина та геністеїна. В ході інгібіторного аналізу виявилося, що тирфостин, який є високо селективним інгібітором ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ, володів виразним інгібіторним ефектом на досліджувану ферментативну активність. Геністеїн, який є тирозинпротеїнкіназним інгібітором загального типу, взагалі не виявив гальмуючої дії. Цей факт дозволяє вважати, що досліджуваний  ферментативний препарат є саме ЕРФ-рецепторною тирозиновою протеїнкіназою.

Тирозинові протеїнкінази –це бісубстратні ферменти, які каталізують переніс фосфатних груп від АТP на Tyr залишки білкових субстратів. Тому в  подальшому було досліджено взаємодію ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ із білковими субстратами та АТР.

В результаті вивчення субстратної специфічності ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки щурів по відношенню до різних екзогенних субстратів (пептид А: ARG- ARG-LEU-ILE-GLU-ASP-ASN-GLU-TYR-THR-ALA-ARG-GLY; пептид В: ARG- ARG-LEU-ILE-GLU-ASP-ALA-GLU-TYR-ALA-ALA-ARG-GLY та ангіотензин ІІ) виявилося, що найкращим субстратом за нормальних умов протікання фосфотрансферазної реакції є ангіотензин ІІ (рис. 3). Гірше всього відбувалося включення фосфату

до пептиду А. Опромінення тварин у досліджуваних дозах призводило до суттєвих змін субстратної специфічності ферменту. Так, після опромінення в дозі 0,5 Гр найбільш активно фосфорилювався пептид В, що може вказувати на неоднотиповий прояв дії радіації на взаємодію ферменту з субстратами даної фосфотрансферазної реакції. Кінетичний аналіз не виявив суттєвих змін спорідненості ферменту до білкового субстрату (ангіотензина ІІ) в післяпроменевий період. Пострадіаційне порушення було встановлено при дослідженні взаємодії даного ферменту з іншим субстратом фосфотрансферазної реакції –АТР, про це свідчить зменшення в 2,2 рази його спорідненості до АТР при опроміненні тварин у дозі 1 Гр ( рис. 4).

Рис. 7. Вплив рентгенівського випромінювання на ступень фосфорилювання різних екзогенних субстратів ЕРФ-рецепторними тирозиновими протеїнкіназами з лімфоцитів селезінки щурів.

  1.  контроль; B- випромінювання 0,5 Гр; C- випромінювання 1 Гр.
  2.  Пептид А; 2- Пептид В; 3- aнгіотензин II.  

, /( )

      Рис. 8. Залежність активності (А) ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки контрольних () та опромінених у  дозах  0,5  ()    і 1 (----) Гр тварин від концентрації АТP й ангіотензина ІІ.

Описаний характер радіаційного впливу на взаємодію ферменту з АТP цілком корелює з рівнем його активності через 12 годин після дії досліджуваних доз рентгенівського випромінювання (табл.). Це надає підстави зробити припущення про причетність порушень у взаємодії АТР з даним ферментом до його гіперактивації під впливом рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр.                                                                                                                         

                                                                                                               Таблиця.

Активність ферментативного препарату ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки контрольних та опромінених тварин

m; n=3-5).

р0,05 порівняно з контролем

Взаємодія ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ з АТР взагалі набуває функціональної значущості для цих ферментів. Фосфорильовані внаслідок цього тирозинові залишки виконують функцію адапторних модулів зв’язування ферменту з тригерними сигнальними молекулами. З іншого боку, фізіологічна активність рецепторних тирозинових протеїнкіназ  забезпечується компенсаторною дією системи рецепторних тирозинових фосфатаз, яка спрямована на автофосфорильовані тирозинові залишки, що входять до структури каталітичних доменів рецепторів ЕРФ.  Таким чином, зв’язування рецепторних тирозинових протеїнкіназ із тригерними молекулами цілком залежить від ступеня їх автофосфорилювання.

Встановлено, що рентгенівське опромінення тварин у дозі 1 Гр викликає значне    збільшення    ступеня    автофосфорилювання      ЕРФ - рецепторних

 

тирозинових протеїнкіназ, що супроводжується порушенням кінетичних констант (Км і Vmax) (рис. 3). Результати, які було отримано при дослідженні рівня мембранозв’язаної фосфатазної активності в умовах дії радіації, дозволяють припустити залучення системи рецепторних тирозинових фосфатаз до радіоіндукованої зміни ступеня автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ (рис.4).

Таким чином, визначене нами гіперфосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових кіназ з лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, може розглядатися як наслідок часткової радіоіндукованої інактивації фосфатаз, що в свою чергу призводить до збільшення кількості фосфотирозинових залишків у складі ЕРФ-рецепторних тирозинових кіназ. Останнє потенціює зв’язування цих ферментів з їх субстратними мішенями, оскільки фосфотирозинові залишки у складі досліджуваних кіназ виконують функцію модулів зв’язування сигнальних молекул.

Рис. 3. Залежність автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки контрольних () та опромінених у дозах 0,5 () та 1 (----) Гр тварин від концентрації АТР.

         Рис. 4.  Активність (А) тирозинових протеїнфосфатаз мембран лімфоцитів селезінки щурів в умовах променевого впливу.

1-контроль; 2- рентгенівське випромінювання в дозі 0,5 Гр;

  1.  рентгенівське випромінювання в дозі 1 Гр.

Порушення функціональної активності ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ, які виникають внаслідок дії випромінювання, надають підставу очікувати дисбаланс тригерних внутрішньоклітинних сигнальних послідовностей, які мають місце при трансдукції сигналу від ЕРФ та його рецепторів.

Нами було досліджено внутрішньоклітинну активність циклонуклеотид-, кальцій-залежних і тирозинових протеїнкіназ у відповідь на ЕРФ стимуляцію лімфоїдних клітин селезінки контрольних та опромінених у досліджуваних дозах тварин (рис. 5). Як за контрольних умов, так і після опромінення не було виявлено статистично значимих коливань рівнів активності cGMP-, Са2+/фосфоліпід-, кальмодулінзалежних та тирозинових протеїнкіназ у цитозолі спленоцитів щурів, які було попередньо преінкубовано з ЕРФ. Однак, при цьому спостерігалося дворазове ЕРФ-індуковане підвищення активності  сАМР-залежної протеїнкінази лімфоцитів селезінки контрольних тварин. Опромінення тварин у дозі 0,5 Гр не призводило до статистично значимих змін ЕРФ-індукованої внутрішньоклітинної А-кіназної активності. Однак, під впливом іонізуючого випромінювання в дозі 1 Гр спостерігалося зниження активності ферменту в 1,3 рази.

Післяпроменева зміна сАМР-залежної протеїнкіназної активності в цитозолі преінкубованих з ЕРФ лімфоцитів селезінки цілком узгоджується з рівнем мембранної тирозинкіназної активності рецептора ЕРФ у цих клітинах за умов дії радіації.

Таким чином, отримані результати дають можливість очікувати, що в лімфоїдних клітинах селезінки щурів в процес передачі сигналу від ЕРФ та його рецептора може залучатися аденілатциклазна система.

Для з’ясування механізмів такої участі було визначено вміст циклічного аденозинмонофосфату в цитозолі лімфоцитів селезінки щурів, які було попередньо преінкубовано з ЕРФ. Результати проведеного дослідження не виявили статистично значимих змін вмісту циклічного аденозинмонофосфату під впливом стимуляції клітин ЕРФ як за контрольних умов, так і за умов рентгенівського випромінювання у досліджуваних дозах. Тому, вірогідно, встановлений ефект пригнічення ЕРФ-індукованої А-кіназної активності в пострадіаційний період можна пояснити зниженням спорідненості цього ферменту до сАМР, що було раніше встановлено дослідниками нашої лабораторії при вивченні особливостей зв’язування цього циклічного нуклеотиду з сАМР-залежними протеїнкіназами лімфоцитів щурів в умовах впливу радіації (Остапченко, 1997). В свою чергу, зниження спорідненості А-кіназ під впливом випромінювання опосередковується радіоіндукованою гіперактивацією ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ у лімфоїдних клітинах селезінки.

Рис. 5. Активність [пмоль/(хв х мг)] різних протеїнкіназ у цитозолі лімфоцитів селезінки контрольних (І) та опромінених у дозах 0,5 (ІІ) і

1 Гр (ІІІ) тварин.

Результати представленої роботи свідчать, що ЕРФ-рецепторні тирозинові протеїнкінази  залучені до механізмів радіаційноіндукованої відповіді імунокомпетентних клітин селезінки щурів та опосередкують ефекти сигнальної трансдукції епідермального ростового фактора в цих клітинах за умов дії випромінювання в дозі 1 Гр, що може бути графічно відображено наступним чином:

Схема сигнальної трансдукції Епідермального Ростового Фактору (ЕРФ) в лімфоцитах селезінки щурів.

RX - вплив рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр.

АЦ-аденілатциклаза; РТФ-рецепторна тирозинова фосфатаза; РТП-рецепторна тирозинова протеїнкіназа; ПКА-протеїнкіназа А; ПКС-протеїнкіназа С; Grb2-адапторний білок; ФІ-3К-фосфоінозитид-3-кіназа; ФЛС-фосфоліапза С;

МАРК-мітоген активована протенкіназа; c-fos, c-jun, SRF-фактори транскрипції;

у формі куль зображено фосфотирозинові залишки, тінню відмічено радіоіндуковані механізми сигнальної трансдукції.

В И С Н О В К И

  1.  Встановлено, що рецепторні тирозинові протеїнкінази виконують функцію молекулярного механізму, який опосередкує ефекти сигнальної трансдукції епідермального ростового фактора (ЕРФ) в лімфоцитах селезінки щурів і бере безпосередню участь у формуванні радіоіндукованої відповіді імунокомпетентних клітин на дію рентгенівського випромінювання в дозі  1 Гр.
  2.  Вивчено вплив ЕРФ на активність мембранозв’заних тирозинових протеїнкіназ у лімфоїдних клітинах селезінки та виявлено пригнічення його активуючої дії після радіаційного впливу в дозі 1 Гр.
  3.  З мембран лімфоцитів селезінки в контролі та через 12 годин після опромінення методом імуноафінної хроматографії було виділено ЕРФ-рецепторну тирозинову протеїнкіназу, активність якої зберігалася незмінюваною під впливом випромінювання в дозі 0,5 Гр та  зростала       на  58 % при опроміненні в дозі 1 Гр.
  4.  Вивчено взаємодію ферменту з субстратами фосфотрансферазної реакції: ангіотензином ІІ та АТР. При опроміненні тварин у дозі 1 Гр встановлено порушення спорідненості ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ  до АТР (збільшення в 2 рази).
  5.  Методом авторадіографії проаналізовано ступінь автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ. Встановлено, що за умов дії випромінювання в дозі 1 Гр процес автофосфорилювання інтенсифікується, що супроводжується збільшенням Vmax у 2 рази.
  6.  Досліджено активність ЕРФ-рецепторних протеїнфосфатаз як регуляторної ланки функціонування рецептора ЕРФ у лімфоцитах селезінки; встановлено двократне пригнічення їх активності після впливу радіації.
  7.  Встановлено залучення сАМР-залежних протеїнкіназ до реалізації ефектів радіоіндукованої активації ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Томачинська Л. І., Долішняк О. І., Кірпенко Т. О. Са2+, кальмодулінзалежні протеїнкінази лімфоцитів селезінки щурів: особливості виділення та властивості // Вісник КУ. – 1998, № 27. – С.18-20.
  2.  Остапченко Л. І., Нальовіна О. Є., Кірпенко Т. О. Автофосфорилювання сGMP-залежних протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки щурів // Вісник КУ. – 1998, №27. – С. 23-25.
  3.  Кірпенко Т. О., Остапченко Л. І., Кучеренко М. Є. Вплив випромінювання на активність тирозинових протеїнкіназ в лімфоїдних клітинах селезінки та тимусу щурів  // Доповіді НАН України. – 1999, № 6. – С. 173-176
  4.  Кірпенко Т. О., Остапченко Л. І., Шаповал І.М. Вивчення фосфорилювання білкових субстратів тирозиновими протеїнкіназами лімфоцитів селезінки щурів під впливом променевого й онкологічного факторів // Вісник КУ. – 1999, №29. – С.32-34.
  5.  Остапченко Л. І., Нальовіна О. Є., Долішняк О. І., Кірпенко Т. О. Дослідження властивостей Са2+, кальмодулінзалежної протеїнкінази лімфоцитів селезінки щурів // VІІ Український біохімічний з’їзд. - Київ. -  1997. – С. 183.
  6.  Остапченко Л. И., Нальовина О. Е., Кирпенко Т. О. Влияние рентгеновского облучения в дозах 0,5 и 1 Гр на регуляцию активности циклонуклеотид- и кальцийзависимых протеинкиназ из лимфоцитов селезёнки крыс // ІІІ съезд  по радиационным исследованиям. Москва. -  1997. – С.124-125.
  7.  Кірпенко Т. О., Остапченко Л. І., Остапченко С. Г., Нальовіна О. Є. Вивчення впливу випромінювання на конформаційний стан систем фосфорилювання лімфоцитів селезінки // ІІ з’їзд українського біофізичного товариства. Харків. -  1998. – С. 3с.
  8.  Kirpenko T. O., Nalovina O. E., Ostapchenko L. I. Tyrosine Protein Kinase activity in lymphoid cells of spleen and thymus under the influence of X-ray irradiation // ISREC Conference “Cancer and the cell cycle”. Switzerland. – 1999. – P.46.
  9.  Kirpenko T. O., Nalovina O. E., Ostapchenko L. I. Possible causes of tyrosine protein kinase activity disruption in lymphoid cells of thymus under the influence of X- ray irradiation in low doses // UICC Advanced Course on Cell Signaling and Cancer. Sweden. – 1999. – P.119.
  10.  Kirpenko T. O., Nalovina O. E., Ostapchenko L. I. The changes in autophosphorylation degree of EGF receptor Tyrosine Protein kinase from spleen lymphocytes under the influence of X-ray irradiation and downstream signaling events // Gordon Research Conference. Singapore. -  1999. – Р.24.

А Н О Т А Ц І Я

Кірпенко Т. О. Функціональна активність системи рецепторних тирозинових протеїнкіназ у лімфоцитах селезінки щурів за умов радіаційного              впливу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2000.

 Узагальнено результати вивчення функціонування ЕРФ - рецепторних тирозинових протеїнкіназ у лімфоцитах селезінки щурів за умов радіаційного              впливу. Встановлено порушення активуючого ефекту епідермального ростового фактора на активність рецепторних тирозинових протеїнкіназ після дії рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр, яке супроводжується зміною взаємодії ферменту з субстратом фосфотрансферазної реакції – АТР. При цьому спостерігається інтенсифікація процесу автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ, що обумовлено виникненням дисбалансу  в функціонуванні системи рецепторних тирозинових фосфатаз. сАМР-залежне фосфорилювання є залученим до реалізації внутрішньоклітинних ефектів радіоіндукованої активації ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ в лімфоцитах селезінки.

Ключові слова: цитокіни, рецепторні тирозинові протеїнкінази, протеїнфосфатази, рентгенівське випромінювання, лімфоцити селезінки.

А Н Н О Т А Ц И Я

Кирпенко Т. О. Функциональная активность системы рецепторных тирозиновых протеинкиназ в лимфоцитах селезёнки крыс в условиях радиационного воздействия. – Рукопись.

Дисcертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000.

 Обобщены результаты изучения функционирования ЕРФ - рецепторных тирозиновых протеинкиназ в лимфоцитах селезёнки крыс в условиях радиационного воздействия. Выявлено  нарушение  активирующего эффекта ЕРФ на активность рецепторных тирозиновых протеинкиназ после действия рентгеновского излучения в дозе 1 Гр, которое сопровождается  изменением взаимодействия фермента с субстратом фосфотрансферазной реакции – АТР. При этом наблюдается интенсификация процеса автофосфорилирования ЕРФ-рецепторных тирозиновых протеинкиназ, что обусловлено  возникновением  дисбаланса в функционировании системы рецепторных тирозиновых фосфатаз. В реализации внутриклеточных эффектов радиоиндуцированной активации ЕРФ-рецепторных тирозиновых протеинкиназ в лимфоцитах селезёнки принимает участие сАМР-зависимое фосфорилирование.

Ключевые слова: цитокины, рецепторные тирозиновые протеинкиназы, протеинфосфатазы, рентгеновское излучение, лимфоциты селезёнки.

A N N O T A T I O N

Kirpenko T. O. The functioning of receptor tyrosine protein kinase’s system in rat spleen lymphocytes under the influence of X-ray radiation.

Dissertation for the obtaining of the scientific degree of the specialized in 00.03.04 – Biochemistry, Taras Shevchenko Kyiv national university. Kyiv, 2000

 The Epidermal Growth Factor Receptor (EGF-R) has been shown to play a crucial role in radio-induced signaling response in rat spleen lymphocytes. The results of study of EGF receptor tyrosine protein kinase’s functioning in rat spleen lymphocytes under the influence of    X-ray radiation have been summarized. The 2-fold increase of its Tyrosine Protein kinase domain activity under the influence of X-ray irradiation in dose of 1 Gy has been established. At the same time there is no statistically significant alteration in the level of enzyme activity after irradiation of rats in dose of 0.5 Gy. However, we have also determined a partial reduction of EGF stimulating action on its receptor Tyrosine kinase activity in conditions of irradiation. To clarify a reason of hyper-activation of ЕGF-R Tyrosine kinase we have carried out partial purification procedures with using the antiphosphotyrosine antibodies and then valued the autophosphorylation rate of this enzyme by autoradiography and kinetic analysis. These data reveal the significant intensification of EGF-R tyrosine kinase autophosphorylation in combining with a decreased binding constant of autophosphorylated enzyme to ATP under the influence of X-ray irradiation in dose of 1 Gy. Although, kinetic analysis of enzyme interaction with a various exogenous substrates performed by us earlier has not shown a disruption on the level of enzyme-substrate association under the influence of X-ray irradiation.

The post-radiation intensification of EGF-R tyrosine kinase autophosphorylation in combining with a decreased binding constant of autophosphorylated enzyme to ATP could suggest a protein phosphotase system involvement in radiation-induced signaling of EGF and its receptor. As a result of performed research we established a decrease of EGF-R phosphatases activity in conditions of radiation. For instance, the irradiation in dose of 1 Gy leads up to 2-fold inactivation of EGF-R phosphatases. The influence of X-ray irradiation in dose of 0.5 Gy is characterized by the same type effect.

Consequently, the above mentioned hyperphosphorylation of EGF-R tyrosine protein kinase in spleen lymphocytes of rats irradiated in dose of 1 Gy could be considered like a result of partial phosphatase inactivation. Apparently, this event in turn provokes the increased number of phosphorylated residues within EGF-R, which have been shown to play a role of adapter sites in interaction with downstream signaling molecules. In this way it is appeared the probability of potentiation of EGF-R tyrosine kinase trigger molecules.      

Obviously, the above mentioned disruptions might result in alteration of downstream signaling pathways, which include activation of distinct Protein kinases. As a result of examination of intracellular Protein kinases activities  (cAMP-, cGMP-, Ca2+/phoshpolipid- and Calmodulin-dependent Protein kinases) after spleenocytes stimulation by EGF we have observed a significant increase of cAMP-dependent Protein kinase activity in control rats, while it has been reduced under the influence of X-ray irradiation in dose of 1 Gy.

After performed researches we suggest that cytosolic cAMP-dependent Protein kinase participates in radio-induced signal transduction pathways through EGF and its receptor in rat spleen lymphocytes and it is accompanied by EGF-R Tyrosine kinase domain hyperautophosphorylation.

Thus, EGF-R tyrosine protein kinases are involved in radiation-induced response of immune competent spleen cells and mediate the effects of EGF signal transduction in these cells in 12 hours after rat’s irradiation in dose of 1 Gy.

Key words: cytokines, receptor tyrosine protein kinases, protein phosphatases,       X-ray radiation, spleen lymphocytes.




1. Реферат на тему- Водні ресурси України проблеми їх раціонального використання
2. а Str~enverkehr der дорожное движение Wiese die n луг поляна.html
3. Море в поэтической картине мира Бродского
4. Внешнеполитические полномочия парламентов (зарубежных стран)
5. Как называется совокупность взглядов и убеждений которые определяют отношения человека к миру и регулиру
6. ~ 4222102 зчн плн Орган
7. Тема 6 ФЕДЕРАЛЬНЫЕ ОРГАНЫ ИСПОЛНИТЕЛЬНОЙ ВЛАСТИ- ОРГАНИЗАЦИОННОПРАВОВЫЕ ФОРМЫ СТРУКТУРА ПОЛНОМОЧИЯ 6
8. Оптические телескопы 21 века
9. Работа деталей трактора
10. Феодализм, феодальная раздробленность Руси
11.  Определяем требуемый расход воды на тушение пожара
12. Ценности как философская категория
13. 1 Учебный год 1
14. Реферат- Остров Ольхон.html
15. На тему- Создание и анализ базы данных рекламного агентства
16. Про громадянство та ін
17. Реферат- Мышление и условия формирования личности
18. Теоретические основы товароведения для специальности 080401 Товароведение и экспертиза товаров
19. а амбен памба в ампулах по 5 мл 1 раствора Дицинон этамзилат в ампулах по 2 мл 12
20. Лицензирование страховой деятельности.html