Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Актуальность проблемы. Термические поражения, огнестрельные ранения, обширные механические повреждения, гнойно-некротические заболевания представляют серьезную медицинскую и социально - экономическую проблему (Брюсов П.Г., Хрупкин В.И., 1997).
В настоящее время широкое развитие механизации и автоматизации, рост тяжелой индустрии и химической промышленности, а также широкое использование электрической и атомной энергии в науке и промышленности способствуют значительному увеличению ожогов (Дмитриенко О. Д., 1991), механо - термических поражений (Микаелян А. А. и др., 1990; Шаховец В. В. и др., 1991; Джитова И.Г. и др., 1998), гнойно-некротических осложнений и заболеваний (Кузин М.И. и др., 1987; Любарский М.С., 1989; Ефименко Н.А., Нуждин О.И., 1998).
Нет сомнения, что в ответ на массивную травму в организме развивается множество патологических процессов, которые захватывают практически все органы и системы, приводят к выраженному нарушению гомеостаза, срыву адаптационных механизмов (Ерюхин И.А., 1997). Что способствует развитию глубокой депрессии как клеточного, так и гуморального иммунитета (Назаров И.П. и др., 1994), а это приводит к нарушению местных репаративных процессов и развитию инфекционных осложнений (Шкроб Л.О. и др., 1990; Шляпников С.А. и др., 1997).
Проблема регуляции воспалительных и репаративных процессов весьма актуальны в современной хирургии (Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У, 1996; Лавров В.А. и др., 1998).
Нарушение процессов тканевой репарации, особенно у лиц пожилого возраста, ослабленных, имеющих иммунные нарушения, часто замедляет заживление ран (Bideau J.C., Echinard C., Damour O., 1992). Даже небольшие по глубине и площади раны из-за выраженных нарушений трофики могут с трудом поддаваться лечению, формируя контингент больных с длительно незаживающими ранами после ожогов, огнестрельных ранений и вскрытия флегмон (Ханин А.Г., Суховеров А.С., 1997; Нузов Б.Г. и др., 1998). Несмотря на то, что для их лечения предложен широкий выбор способов лечения, проблема остается актуальной (Басов В.З., 1997; Поято Т.В. и др., 1998).
Большое значение имеет поиск новых методов лечения ран любого генеза во время катастроф и стихийных бедствий, где данная патология занимают одно из ведущих мест (Дмитриева Т.Б., Гончаров С.Ф., 1998).
Лечение обширных ожогов - одна из наиболее трудноразрешимых проблем комбустиологии. Существующие биологические и синтетические материалы могут быть использованы лишь в качестве временного закрытия ожоговых ран (Purdue G. F. et al., 1997). Известные способы аутодермопластики не всегда приемлемы, поскольку существует дефицит донорской кожи, особенно, у детей, у септических больных (Hanshmungh J.F. et al., 1997). Кроме того, аутодермопластика может расцениваться как операция риска и являться дополнительной травмой (Соколов В.А., Бурмистров В.М., 1995; Caruso D.M. et al, 1996).
В связи с этим исследования, направленные на поиск новых способов восстановления кожного покрова имеют большое практическое и научное значение.
Наиболее перспективным представляется метод выращивания клеток кожи больного и самой кожи в лабораторных условиях с последующей трансплантацией их на рану (Каншин Н.Н., Воленко А.В., Магомедов М.К. и др. 1989; Островский А.А., Меламед В.Д., Смотрин С.М., 1990; Туманов В.П., и др., 1990; Малахов С.Ф. и др., 1992; Алейник Д.Я., 1994, Колокольцова Т.Д. и др. 1997; Rennekampff Y.O et al., 1996; Lin R.Y., Adzick N.S., 1996).
Однако широкому клиническому использованию трансплантатов клеточных структур препятствуют трудности, связанные с длительными сроками выращивания и большими затратами на их получение (Алексеев А.А. и др., 1998, Юрченко Н.Д. и др., 1998).
Решить данную проблему можно, используя в лечении ожоговых ран культивированные ауто- и аллоклетки (Eming S.A. et al., 1996).
Одним из наиболее перспективных направлений является, применение в ожоговой терапии фетальных тканей человека (Гребенникова Н.В. и др., 1995; Сергеев В.Г., 1996). Перспективность данного направления исследований обусловлена высоким потенциалом жизнеспособности фетальных клеток (Куликов В.И., Сухих Г.Т., Молнар Е.М., 1996; Lin R.Y., Adzick N.S., 1997). В последние годы много публикаций появилось по использованию эмбриональной ткани и клеток в онкологии, травматологии (Кулаков В.И. и др., 1996; Родионов С.Ю. и др., 1996) , нейрохирургии (Брюховецкий А.С., Ушаков С.О., 1996; Ярыгин В.Н. и др., 1997), эндокринологии (Скалецкий Н.Н., Шумаков В.И., 1996). Изучение возможности использования эмбриональных клеток кожи открывает новое перспективное направление. Разработка технологии применения эпидермальных клеток фетуса человека, заранее аттестованных и заложенных на хранение в ампулах в достаточном количестве, позволит обеспечить стандартным клеточным материалом тяжелообожженных при чрезвычайных ситуациях (Алейник Д.Я., 1994; Васильев А.В., Логинов Л.П. и др. 1994; Блинова М.И., Парамонов Б.А., 1996).
Целью исследования являлась разработка технологии культивирования и применения клеток кожи в лечении длительно незаживающих ран и изучение особенности течения репаративных процессов при их применении.
Задачи исследования:
1. Изучить возможности культивирования клеток ауто - и аллокожи в лабораторных условиях для эффективного лечения дефектов кожи.
2. Оценить состояние клеточного звена иммунной системы у больных с длительно незаживающими ранами и его влияние на репаративные процессы в ране.
3. Исследовать репаративные процессы в ране при трансплантации на нее культивированных клеток кожи.
4. Изучить эффективность воздействия на репаративные процессы в ране при использовании клеток кожи эмбриона.
5. Изучить особенности репаративного процесса в длительно незаживающих ранах при аппликационном применении цитокинов.
6. Провести сравнительную оценку клинической эффективности новых технологий в лечении длительно незаживающих ран в сравнении с контрольной группой.
Научная новизна исследования Разработаны способы выращивания культуры клеток на целлофановой подложке и в геле.
Впервые применена методика транспортировки культуры клеток в геле, что позволяет перевозить материал на большие расстояния и сохранять жизнеспособный материал в течение недели.
Выявлено, что у больных с длительно незаживающими ранами имеется снижение функциональной активности нейтрофилов в ране.
Изучено влияние культивированных фибробластов на репаративные процессы в длительно незаживающей ране и доказано, что они активизируют регенерацию и увеличивают скорость эпителизации.
Доказанно, что культивированные клетки обладают бактерицидностью. Особенно большим санирующим потенциалом обладают культивированные фибробласты эмбриональной ткани.
Изучены особенности течения III фазы воспаления при трансплантации клеток кожи эмбриона и доказана их эффективная функция в ангиогенезе и быстром восстановлении раны грануляционной тканью и эпителием.
Изучены репаративные процессы в длительно незаживающей ране при аппликации цитокинов и доказано их эффективное влияние на эпителизацию раны, что позволяет принципиально изменить течение воспалительного процесса и регенерации при многих заболеваниях.
Результаты, полученные по применению эмбриональных клеток человека, открывают новые возможности лечения путем использования штаммов диплоидных клеток кожи человека, аттестованных и заложенных на хранение.
Разработаны подходы к созданию и применению банка клеток кожи человека, потенциально пригодных для терапии ожогов в клинике и при чрезвычайных ситуациях.
Практическая значимость исследования
1. Разработан способ забора, транспортировки, хранения, получения и культивирования клеток кожи.
2. Получено три формы фасовки культивированных фибробластов: на микроносителях, целлофановой подложке и в геле, что позволяет применять их в разных условиях с учетом дальности и длительности доставки до больного.
3. Разработано три новых способа местного лечения длительно незаживающих ран.
4. Применение культивированных фибробластов позволяет сократить потребности аутокожи при обширных ожогах, за счет использования кожных лоскутов с большим коэффициентом перфорации.
5. Предложенные способы лечения позволяют закрыть дефект кожи до 200 см2 без оперативного вмешательства, за счет усиления краевой эпителизации.
6. При применение новых способов лечения, длительность стационарного лечения больных сокращается в 2- 3 раза.
Положения выносимые на защиту:
1. В лабораторных условиях возможно культивирование большого количества ауто- и аллофибробластов для эффективного использования в лечении обширных ран.
2. Наибольшим пролиферативным потенциалом обладают фибробласты эмбриона, что позволяет хранить их в банке клеток кожи в режиме “до востребования”.
3. Разработаны способы культивирования, транспортировки клеток кожи на микроносителях, на целлофановой подложке и в геле.
4. В длительно незаживающей ране у 24% пациентов выявлена сниженная функциональная активность нейтрофилов, в результате чего бактериальная инфекция может вызывать увеличение глубины ожога и препятствовать процессу заживления ран.
5. Главным фактором в патогенезе хронического воспаления является несостоятельность (первичная или вторичная) фагоцитарной системы, что требует искусственной активации мононуклеарных клеток для разрыва цепи хронического воспаления.
6. Трансплантация культивированных клеток кожи позволяет разорвать патогенез хронического воспаления за счет активации фагоцитарной активности мононуклеарных клеток, увеличения продукции факторов роста и макромолекул внеклеточного матрикса.
7. Применение культивированных фибробластов, эмбриональных клеток и цитокинов позволяет активизировать процесс репаративной регенерации и ускорить в 2 – 3 раза заживление раны по сравнению с возможностями традиционных методов.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Проблема лечения гнойных ран различного генеза является одной из актуальных проблем хирургии (Ефименко Н.А., Нуждин О.И., 1998). Несмотря на достигнутые успехи (применение современных ферментов, сорбентов, мазей на водорастворимой основе) в настоящее время, лечение больных с данной патологией представляет трудную задачу (Кузин М.И. и др., 1987; Исаев И.М., Гасанов Р.П., 1988; Юхтин В.И., Чадаев А.П., Хуторянский И.Н., 1997).
Тенденции к снижению нагноительных заболеваний и инфекционных осложнений в последнее время не наблюдается (Брюсов П.Г., Ефименко Н.А.,1997; Ханин А.Г., Суховеров А.С.; 1997, Ерохов А.Н., 1997). Так по данным М.С. Любарского (1989) нагноительные заболевания у хирургических больных составляют 10 –15%, а инфекционные осложнения со стороны операционной раны у 38% пациентов. По данным П.Г. Брюсова (1997) нагноительные заболевания у военнослужащих состовляют 30% и занимают второе место по заболеваемости, послеоперационные осложнения гнойно-инфекционного характера составляют 50%. Основной причиной данных заболеваний и осложнений многие авторы считают резистентность возбудителей ко многим антибиотикам и вторичный иммунодефицит (Саркисов Д.С., 1993; Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е., 1997; Нузов Б.Г., Смолягин А.И., Чайникова И.Н. и др., 1997).
Большую проблему в лечении ран представляют пострадавшие с ожогами и больные с трофическими язвами (Басов В.З., 1997; Джитова И.Г., Буеверова Э.И., Багрина Е.В. и др., 1998; Haith L.R. et al., 1992). Использование современных методов лечения позволяет лишь в 35 – 84,6% заживить рану, а в 15, 3% - случаев у таких больных вообще не отмечено эффекта от проведенной терапии (Любарский М.С., 1989; Бабаджанов Б.Р., Султанов И.А., 1998). Термические поражения представляют серьезную медицинскую и социально - экономическую проблему (Дмитриенко О.Д., 1991; Кузнецов Н.М. и др., 1998). Почти ежеминутно где-нибудь в мире человек становится жертвой ожогов со всеми вытекающими медицинскими и социальными последствиями. В течение столетий усилия врачей направлялись на улучшение результатов лечения ожогов и на снижение летальности в случае обширных поражений (Назаров И.П. и др., 1994).
Лечение тяжелых ожогов является сложным, дорогостоящим и требует усилий врачей различных специальностей. Нередко требуются многие месяцы лечения в стационаре, чтобы предотвратить непосредственную угрозу жизни пациента. Хирургическое и терапевтическое лечение, трудовая и социальная реабилитация нередко продолжаются в течение ряда лет, прежде чем пациент сможет возвратиться к активной жизни.
Интерес врачей многих специальностей к проблеме ожогов позволил за последние 10 лет значительно улучшить лечение обожженных пациентов. Улучшились хирургические методы лечения ожогов. Но исследования по изучению бактериологии и инфекции ожоговых ран до сих пор остаются актуальными. Именно при ожоговой болезни с наибольшей четкостью выявляется фактор повреждения, который вначале вызван термическим воздействием, а затем, после присоединения инфекции, прогрессивно развивается вследствие воспалительной альтерации (Колкер И.И. и др., 1985, Жуковский Ю.М. и др., 1987).
Участие микроорганизмов придает воспалению характер инфекционного процесса (Колкер И.И., Гришина И.А., Акатова Н.С. и др., 1977; Вуль С.М., Колкер И.И., Панова Ю.М. и др., 1979; Орлов А.Н., 1979; Ерюхин И.А. и др., 1989). Для того чтобы понять масштабы повреждающего действия токсинов при ожоговой патологии, целесообразно рассмотреть повреждающее действие токсина золотистого стафилококка или палочки сине-зеленого гноя. Исследования последних лет показали, что в развитии гнойно-воспалительных процессов у ожоговых больных, стафилококк выделен у 34,5% - 41,2% больных, палочка сине-зеленого гноя у 35% - 70% пациентов (Федоровская Е.Д., Назарчук Л.В., Литовченко П.П. и др., 1984; Колкер И.И. и др.,1984; Федоровская Е.А., Назарчук Л.В., 1989; ЛЕ НАМ, 1990; Сологуб и др., 1990; Бабаджанов Б.Р., Султанов И.А., 1998; Шевченко Ю.Л., Гришанин В.А., Матвеев С.А. и др., 1996).
М.И. Кузин (1990) приводит токсические свойства золотистого стафилококка:
Гемолизин - обладает гемолитическим, некротическим, летальным и тромбоцитозным действием;
Гемагглютинин способен склеивать эритроциты;
Лейкоцидин (1,2,3) способен повреждать и разрушать лейкоциты;
Летальный яд - при внутривенном введении вызывает мгновенную смерть животных;
Дермонекротоксин вызывает некроз мягких тканей;
Эритрогенный токсин вызывает скарлатинозный синдром;
Энтеротоксины вызывают повреждение желудочно-кишечного тракта и развитие острейшего гастроэнтерита;
Энтеротоксин Е обуславливает экзотоксический шок;
Прокоагулаза - при активации факторами крови вызывают свертывание плазмы;
Стафилококкиназа- активирует фибринолиз, изменяет свертываемость крови, растворяет сгустки;
Антикоагулаза -препятствует свертыванию крови;
Гиалуронидаза -расщепляет гиалуроновую кислоту межклеточного вещества, увеличивает проницаемость тканей;
Лецитиназа - разрушает лецитин тканей, приводит к его увеличению в крови;
Липаза - разрушает липоиды и липопротеиды тканей;
Антифагины подавляют фагоцитоз лейкоцитов;
Уреаза - расщепляет углеродноазотистые связи в молекуле мочевины, образует аммиак;
Протеиназа - разлагает желатин;
Рибонуклеаза - разрушает РНК клеток;
Тиаминаза II - расщепляет тиамин;
Дезоксирибонуклеаза - вызывает распад ДНК, обладает способностью растворять лейкоциты (по данным М.И. Кузина, 1990).
Токсин синегнойной палочки имеет следующие фракции (Бочиришвили В.Г., 1988, Кузин М.И. и др., 1990):
По данным С. Глянцева (1997) ученые из Майнцского университета (Германия) в 1996 году опубликовали результаты исследования, не обнаружив зависимости темпа заживления трофических язв ни от уровня их обсемененности, ни от вида микрофлоры. По данным Д.Н. Маянского (1983, 1991) при длительных, затяжных воспалительных реакциях большую роль играют полиморфноядерные лейкоциты их врожденная или приобретенная неполноценность. Р.М. Хаитов (1995) так же придерживается взгляда основной роли в хронизации воспаления – дефект фагоцитарного процесса.
В механизме развития общих патофизиологических реакций у больных с ожоговой травмой основная роль принадлежит эндогенной интоксикации. Синдром эндогенной интоксикации - понятие сложное и многокомпонентное. Анализируя течение воспалительного процесса при ожоговой болезни осложненной септическим состоянием В.К. Гостищев и соавт. (1992) выделили три отдельных компонента эндогенной интоксикации: микробиологический, биохимический и иммунологический, при этом в каждом из компонентов имелись сочетания факторов.
Дезинтеграция компенсаторных механизмов, ослабление иммунологической реактивности или нарушение систем регуляции иммунного ответа являются основными причинами генерализации инфекции и причиной смерти при ожоговой болезни (Колкер И.И.. 1986; Пекарский Д.Е., Захарченко О.М., 1987; Нузов Б.Г., Смолягин А.И., Чайникова И.Н. и др., 1997; Бабаджанов Б.Р., Султанов И.А., 1998; Kawakami M., et al., 1991).
Одной из основных причин развития генерализованного воспалительного процесса является, нарушение механизмов регуляции, приводящих к неконтролируемой гиперпродукции различных медиаторов воспаления (Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У., 1996; Лавров В.А. и др., 1998, Chao C.C., Hu S., 1994).
При сохраненных компенсаторных возможностях организма массивный выброс медиаторов воспаления и цитокинов из участка воспаления в кровь приводит, как правило, к развитию острофазового ответа (ОФО), он длится около 24 - 48 часов и при рациональном лечении общее состояние больного нормализуется в течение нескольких дней (Фрейдлин И.С., 1995).
Однако, помимо физиологического, нормального пути развития ОФО существуют две возможности его трансформации в патофизиологические состояния. Во - первых, неуправляемый ОФО в условиях гиперпродукции провоспалительных цитокинов и превышения пределов защитных механизмов может привести к развитию бактериально - токсического шока (Ерюхин И.А., 1997). Во-вторых, на фоне персистенции инфекции и нарушения контрольных механизмов регуляции острый воспалительный процесс может перейти в хроническое воспаление (Маянский Д.Н., 1991).
Нарушение процессов тканевой репарации, особенно у лиц пожилого возраста, ослабленных, имеющих иммунные нарушения, часто замедляют заживление ран. Даже небольшие по глубине и площади раны из-за выраженных нарушений трофики могут с трудом поддаваться лечению, формируя контингент больных с длительно незаживающими ранами после ожогов, огнестрельных ранений, вскрытия флегмон. Несмотря на то, что для их лечения предложен широкий выбор способов лечения, проблема остается актуальной (Козлов В.А., 1991; Николас А. Майер, Майкл Дж. Моллер, Дэвид Н. Херндон, 1996; Поято Т.В. и др., 1998).
Большое значение имеет поиск новых методов лечения ран любого генеза во время катастроф и стихийных бедствий, где раны занимают одно из ведущих мест (Дмитриева Т.Б., Гончаров С.Ф., 1998). Неудовлетворительные результаты лечения больных с ожоговой травмой в значительной мере определяются выраженными нарушениями гомеостаза, связанными с развитием эндогенной интоксикации и вторичным иммунодефицитом. Развивающаяся вторичная (приобретенная) иммунная недостаточность вызывает подавление клеточных механизмов защиты (Маянский А.М., Маянский Д.Н.,1983; Маянский Д.Н., 1991; Kiess W., Gallaher B., 1998). Главным образом это касается клеток фагоцитарной системы, таких как полиморфноядерные нейтрофилы и макрофаги, нарушение функциональной активности которых выявляется уже в ранние сроки после травмы (Д.С. Саркисов, 1993; Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 1995; Ганова Л.А. и др., 1996; Koller M.et al., 1991; Cetinkale O. Et al., 1993).
Наступает угнетение всех систем и органов. Возникает вторичный иммунодефицит, нарушаются репаративные процессы в ране. Лечение затягивается, заживление ран не происходит, наступает лизис пересаженных кожных лоскутов, присоединяется одно за другим осложнения, ожоговые раны длительное время не эпителизируются ( Bucky L.P. et al., 1994).
Прежде, чем переходить к рассмотрению лечения ран хотелось бы остановиться кратко на некоторых моментах воспаления и регенерации.
1.2. Некоторые аспекты хронического воспаления
Воспаление – ответная реакция организма на повреждение. И.И. Мечнков (1892) сформулировал фагоцитарную теорию воспаления. Согласно ей основным и центральным звеном воспалительного процесса является поглощение фагоцитами инородных частиц и бактерий (Саркисов Д. С., 1996).
Современный этап о воспалении характеризуется все большим его сближением с учением об иммунитете, иммунных и иммунологических реакциях организма (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995; Petinaki E., Nikolopoulos S., Castanas E., 1998).
J. Alexander, в 1966 изучая снижение фагоцитарной активности полиморфноядерных лейкоцитов у больных с ожогами, заметил, что развитие инфекционных осложнений и воспалительных процессов связано с повреждением лейкоцитов и утратой ими способности бороться с микробами. Д.Н. Маянский (1991) рассматривает воспаление как реакцию на несостоятельность фагоцитарной системы. По данным Саркисова Д.С. (1993) могут быть случаи: когда патологический процесс обуславливается первичной, генетически обусловленной несостоятельностью системы полиморфноядерных лейкоцитов (дефект хемотаксиса, дефицит актинсвязывающего протеина, отсутствие лизоцима и т. д.); аналогичная ситуация возникает, когда организм не в состоянии эффективно нейтрализовать микрофлору, вследствие приобретенного повреждения полиморфноядерных лейкоцитов (агранулоцитоз, снижение реактивности организма в результате тяжелого заболевания); возможен третий вариант, когда функционально полноценные лейкоциты взаимодействуют с бактериальным патогеном высокой вирулентности (Саркисов Д.С., 1993).
Течение воспаления определяется в первую очередь состоянием реактивности организма, а также силой и длительностью действия воспалительного агента (Маянский Д.Н., 1991). Острое воспаление характеризуется сравнительно небольшой продолжительностью и достаточно выраженной интенсивностью. По характеру сосудисто-тканевой реакции обычно является экссудативно-инфильтративным. Роль основных эффекторов в его патогенезе играют полиморфноядерные лейкоциты. По данным С. Глянцева (1997) при остром воспалении в ране присутствует правильный набор и высокая концентрация основных факторов воспаления, при хронической ране наблюдается высокая концентрация факторов роста, но их набор оказывается неполным (Cowin A.J. et al., 1998).
Хроническое воспаление характеризуется большой длительностью и слабой выраженностью. По тканевой реакции чаще всего яляется пролиферативным. Ведущая роль в его патогенезе принадлежит макрофагам и лимфоцитам (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983). При хроническом воспалении в воспалительных инфильтратах с самого начала скапливаются не полиморфноядерные лейкоциты, и так называемые мононуклеарные клетки — моноциты, макрофаги, лимфоциты. Скопление мононуклеарных клеток, является предпосылкой к долгому течению воспаления (Шахтер А.Б., Берченко Г.Н., Николаев А.В., 1984; Маянский Д.Н., 1991; Cowin A.J. et al, 1998).
В отличие от острого воспаления хроническое воспаление начинается не с нарушений микроциркуляции в сосудистом русле, а со скопления раздраженных (активированных) макрофагов в одном месте. Стойкое раздражение макрофагов вызывается разыми способами. Во-первых, ряд микробов поглощается макрофагами, но, оказавшись в их фагосомах, не погибает и получает возможность безнаказанно долго жить и размножаться внутри клетки. Макрофаги, содержащие микробы, переходят в активное состояние и начинают секретировать медиаторы воспаления. Тот же результат получается, если макрофаги поглощают не микробы, а неинфекционные частицы, которые клетка не может расщепить или выбросить наружу. Через 2—3 суток вокруг таких макрофагов, как вокруг эпицентров, начинают скапливаться пришедшие с кровью моноциты и формируется то, что принято называть мононуклеарным инфильтратом (Маянский Д.Н., 1991). Привлечение новых моноцитов-макрофагов в зону локализации активированных макрофагов связано с веществами, вызывающими хемотаксис, которые образуются при их самом деятельном участии. Активированные макрофаги секретируют биоокислители, которые запускают перекисное окисление липидов в мембранах других клеток. Лизосомальные ферменты, секретируемые макрофагами такие, как коллагеназа, расщепляют коллаген. Продукты же частичной деградации коллагена обладают мощной способностью притягивать свежие моноциты в очаг воспаления. В результате сложной реакции в очаге воспаления открывается простор для выхода лейкоцитов из крови и их передвижения в сторону высокой концентрации веществ, вызывающих хемотаксис, где они присоединяются к другим клеткам инфильтрата (Маянский Д.Н., 1991). Моноциты, придя в инфильтрат, выделяют фибронектин. Благодаря этому они прочно связываются с матриксом соединительной ткани, прежде всего с коллагеновыми волокнами (Хаитов Р.М. и др., 1995).
Таким образом, активные макрофаги в состоянии не только запускать, но и детерминировать весь процесс хронического воспаления. Наряду с этим макрофаги связаны с лимфоцитами не только через антигены, но и через свои секреты. Макрофаги выделяют вещества, усиливающие рост лимфоцитов и повышающие их активность (интерлейкин - 1). В то же время активно пролиферирующие лимфоциты выделяют лимфокины, которые активируют макрофаги и резко усиливают их эффекторные функции в очаге хронического воспаления (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995).
Острое воспаление заканчивается быстро, в считанные дни, если не возникнет осложнений в виде гнойной полости (абсцесса). Хроническое воспаление не может закончиться быстро по следующим причинам. Во-первых, макрофаги в очаге воспаления имеют длительный жизненный цикл, который исчисляется неделями, месяцами и даже годами (Маргулис Ф.Б., Польский В.П., Шахтахтинский Т.А., 1986). Во-вторых, хроническое воспаление — это не застывшее образование. К нему постоянно следуют потоком все новые и новые моноциты с кровью из костного мозга. Если в тканях раны много активированных макрофагов, то приток будет превышать отток клеток из гранулемы. Поэтому пока раздраженные макрофаги "работают", баланс будет смещен в сторону притока клеток в инфильтрат и его рассасывание невозможно.
Хроническое воспаление может продолжаться в течение всей жизни. Периодически оно обостряется, когда в очаг приходят нейтрофилы и свежие макрофаги с высокой провоспалительной активностью. В очаге мононуклеарной инфильтрации идет деструкция соединительной ткани. В ответ на это происходит разрастание волокнистых структур. В конечном счете дело может завершаться склерозом (Саркисов Д.С., 1993). Воспалительный процесс является результатом реакции организма на местное повреждение, вызванное флокогеном. Реакция организма зависит прежде всего от его реактивности, которая в первую очередь определяется функциональным состоянием его высших регуляторных систем — нервной, эндокринной и иммунной (Абрамов В.В., Абрамова Т.Я.,1996). Анатомический или химический перерыв афферентной части рефлекторной дуги в ходе воспалительного процесса ослабляет его дальнейшее развитие. В патогенезе воспаления играют роль и высшие отделы центральной нервной системы (Абрамов В.В., Абрамова Т.Я., 1996). Заметная задержка развития и ослабление воспалительной реакции наблюдаются при воспроизведении ее на фоне наркоза или в период зимней спячки. Значительное влияние на развитие воспаления оказывает эндокринная система. По отношению к воспалению гормоны можно разделить на про- и противовоспалительные. К первым относятся соматотропин, минерало-кортикоиды, тиреоидные гормоны, инсулин, ко вторым — кортикотропин, глюкокортикоиды, половые гормоны. Гормоны модулируют различные воспалительные явления: нарушения микроциркуляции и сосудистой проницаемости, эмиграцию, фагоцитоз, пролиферацию (Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У., 1996).
Исход воспаления зависит от характера процесса, его локализации и распространенности. При незначительном повреждении тканей за счет регенерации специфических элементов наступает практически полное восстановление их структуры и функции (возврат к нормальному состоянию). При значительном дефекте ткани на месте очага воспаления образуется рубец (возврат к нормальному состоянию с неполным восстановлением), который может не сказаться на функциях или привести к деформации органа или ткани. Возможен переход острого воспаления в хроническую форму с вытекающими отсюда последствиями.
1.3. Особенности регенерации при хроническом воспалении
Регенерацией (возрождением) называется процесс восстановления разрушенных или утраченных тканей, органов и отдельных частей живых существ (Саркисов Д.И., 1993). Различают физиологическую и патологическую регенерации. Д.И. Саркисов (1993) выделяет три периода исследования процессов регенерации – первый макроскопический, когда элементарными структурными единицами организма считали крупные части тела – естественно представление о регенерации ассоциировалось с этими органами. Второй период микроскопический, единицей измерения регенерации стала клетка.
И третий период изучения регенерации – внутриклеточный. На этом этапе изучения регенерации были выделены 3 различные формы внутриклеточной регенерации: молекулярная, внутриорганоидная и органоидная. В настоящее время особое внимание уделяется выяснению закономерностей репарации ДНК. Оказалось, что после патогенного воздействия и повреждения ДНК происходит ее "залечивание", осуществляемое последовательной работой репаративных ферментов.
Патологическая регенерация - процесс возрождения органов и тканей после их повреждения. Эпителиальные ткани (многослойный плоский эпителий кожи, роговая оболочка глаза) характеризуются весьма выраженной регенераторной способностью. Регенерация эпидермиса имеет очень большое значение в процессах заживления ран. Многослойный эпителий кожи возрождается из глубокого зародышевого слоя (Воронцова М.А., Лиознер А.Д., 1953). Установлено, что уже через 2 часа после повреждения в гистиоцитах рыхлой соединительной ткани, а затем в лейкоцитах и фибробластах возникает активирование окислительно-восстановительных ферментов (сукцинатдегидрогеназа, глютатион), а также гидролаз (фосфатаза, пептидаза, липаза и др.). В дальнейшем отмечается активация 5-нуклеотидазы, аденозинтрифосфатазы и других ферментов. Активация этих ферментов вызывает увеличение процесса расщепления белка, освобождает жиролипоидные вещества (лецитин, жирные кислоты), которые понижают поверхностное натяжение в регенерирующих клетках (Шахтер А.Б., Берченко Г.Н., Николаев А.В., 1984; Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995).
Регенерирующая ткань характеризуется активацией анаэробного гликолиза. Активация гликолиза в растущей ткани является важной особенностью обмена веществ при регенерации. Распад лейкоцитов и освобождение из них стимулирующих рост продуктов распада тканей (нуклеопротеиды, другие вещества) вызывают усиленное митотическое деление регенерирующих клеток. Усиление размножения клеток приводит к увеличению митогенетического излучения. Активация протеолитических ферментов приводит также к освобождению из поврежденных регенерирующих клеток гистамина. Гистамин вызывает расширение сосудов, окружающих регенерирующую ткань или врастающих в нее. Расширение сосудов улучшает поступление нового количества лейкоцитов, доставляющих новые порции стимуляторов роста в регенерирующую ткань. В клетках этой ткани увеличиваются осмотическое давление и гидратация; в дальнейшем процесс заменяется дегидратацией (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У., 1996). Регенерировать могут как взрослые дифференцированные клетки, так и менее дифференцированные (камбиальные) клетки различных тканей (например, герминативный слой эпителиальных клеток кожи, гистиоциты рыхлой соединительной ткани), возможны превращения клеток в менее дифференцированные формы (Саркисов Д.С., 1993).
Процесс регенерации обусловливается рядом факторов.
4. С увеличением возраста регенерирующая способность всех тканей понижается (Coleman C. et al, 1998). При этом особое значение имеет состояние реактивности целого организма (Воронцова М.А., Лиознер Л.Д., 1953; Калантаевская К.А., 1983);
5. Большое значение в регуляции регенерации имеют железы внутренней секреции. Так, тиреоидэктомия снижает регенерирующую способность тканей, а введение гормонов щитовидной железы стимулирует заживление ран. Удаление поджелудочной железы приводит к замедлению заживления ран, а кастрация затрудняет заживление переломов. Минералокортикоиды (альдостерон) стимулируют, а глюкокортикоиды (кортизол) угнетают регенерацию (Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У., 1996);.
6. В качестве стимулятора регенерации выступает нервная система (Абрамов В.В., Абрамова Т.Я., 1996). Экспериментальная перерезка или травма смешанных периферических нервов вызывают резкие нервно-дистрофические явления. Одним из ярких выражений этого влияния является образование незаживающих трофических язв. Они образуются часто на месте случайной царапины, а иногда и без видимого повреждения. Нарушение обмена веществ в тканях, в частности в коже, приводит к ослаблению процессов регенерации эпидермиса. На поверхности кожи образуется дефект - язва, она обычно окружена вялыми грануляциями, заживает очень долго, иногда несколько лет. После временного заживления она легко возобновляется. Замедление процессов регенерации в данном случае вызывается нарушением трофического влияния нервной системы и сосудо-двигательными расстройствами в денервированной ткани.
1.4. Особенности заживления раны при хроническом воспалении
Заживление ран является типичным примером патологической регенерации тканей, наступающей после их повреждения. Заживление кожи осуществляется за счет соединительной ткани и сопровождается регенерацией эпителия. Легкие повреждения эпидермиса кожи восстанавливаются полностью за счет регенерации эпидермиса (Ефимов Е.А., 1995).
Сущность начала заживления как первичным, так и вторичным натяжением заключается в том, что под краями раны скапливаются лейкоциты, которые выделяют вещества, стимулирующие размножение, прежде всего соединительно-тканных клеток — гистиоцитов. Последние превращаются в фибробласты, которые образуют коллагеновые и эластические волокна. Постепенно дефект в ткани заполняется этими клетками. Одновременно на пленку фибрина начинают двигаться размножающиеся клетки эпидермиса. Стимулом для размножения этих клеток является факт соприкосновения их с выпавшим в рану фибрином. Размножаясь, клетки эпителия заполняют и затягивают дефект, вызванный ранением. Возникает полное заживление (Николас А. Майер и др., 1996).
Заживление вторичным натяжением происходит обычно при инфицировании раны (нагноении) или при ее относительно больших размерах, когда рана не может первично быть слепленной выпавшим фибрином. В этих случаях кроме процессов, характерных для первичного натяжения, рана постепенно заполняется новой, молодой соединительной тканью, очень богатой кровеносными сосудами. Она приобретает ярко-красный цвет и имеет вид зернышек, связанных друг с другом. Грануляционная ткань образуется за счет размножения гистиоцитов и фибробластов, со стороны здоровой ткани в нее врастают кровеносные сосуды (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983). Грануляционная ткань весьма богата водой, ее коллоиды находятся в состоянии гидратации. После заполнения грануляционной тканью, в ране начинают происходить изменения: кровеносные сосуды ее затягиваются, клетки постепенно разрушаются и рассасываются. Остаются только волокна субстанции соединительной ткани, образующие рубец. Возможна эпителизация раны и после заживления вторичным натяжением если рана небольших размеров (Николас А. Майер и др., 1996), при размерах раны свыше 5 см в диаметре, в центре раны образуется соединительно-тканный рубец.
1.5. Раневой процесс и заживление раны
Предложено несколько периодизаций регенерационного процесса. По С.С. Гирголаву следует различать 3 фазы регенерации - подготовительная, предварительной регенерации, окончательной регенерации. Третья фаза раневого процесса (фаза регенерации) начинается после окончания биологического очищения раны. Рана заполняется грануляционной тканью, после чего происходит эпителизация раны идущая от краев раны. Эпителий нарастает на поверхность грануляций в виде белой каймы. В инфицированной ране влияние микрофлоры значительно отягощает течение раневого процесса. Микробы распространяются в глубину жизнеспособных тканей, размножаются проникают в кровеносные и лимфатические пути. Продукты их жизнедеятельности губительно действуют на живые клетки, вызывая бурный, прогрессирующий характер вторичного некроза тканей. Все это ведет в лучшем случае к резкому замедлению заживления раны, в худшем - к гибели больного (Шапошников Ю.Г. и др., 1991; Козинец Г.П. и др., 1995).
Особенности развития, течения и исхода репаративной регенерации определяются размерами гибели ткани и характером патологических воздействий. В отличие от физиологической регенерации, репаративная охватывает круг процессов, ведущих к возмещению дефекта, вызванного утратой ткани вследствие ее повреждения (Шахтер А. Б. И др., 1984; Ефимов Е.А., 1995).
Степень полноты регенерации определяется двумя факторами: 1) регенерационной потенцией данной ткани; 2) объемом дефекта погибших тканей (Воронцова М.А., Лиознер Л.Д., 1953). Первый фактор нередко связывают со степенью дифференцировки данной ткани. Наряду с тканями, обладающими высокой регенерационной способностью (печень, органы кроветворения), существуют органы с ничтожной потенцией к регенерации (миокард). Чрезвычайно высокой регенеративной способностью обладают соединительная ткань, периферические нервы, ретикулярная ткань. Объем погибшей ткани имеет существенное значение для полноты регенерации (Ефимов Е.А., 1995).
Общим законом регенерации является закон развития, согласно которому в процессе новообразования возникают юные недифференцированые клеточные производные, в дальнейшем проходящие этапы морфологической и функциональной дифференцировки вплоть до формирования зрелой ткани (Мертвецов Н.П., Стефанович Л.Е., 1997).
В зависимости от различных причин (ухудшение питания, авитоминоз, местные нарушения инервации и васкуляризации, инфицирование раны) репаративные процессы могут быть извращены (Николас А. Майер и др., 1996). В одних случаях грануляции развиваются медленно и вяло, в других, напротив, происходит избыточное образование пышных, сочных, богатых клетками и сосудами грануляций (Саркисов Д.С., 1993).
1.6. Иммунитет и репаративные процессы в ране
Заживление раны – сложнейший биологический процесс, в котором участвуют не только клеточные элементы соединительной ткани, но и многочисленные факторы иммунной системы (Ковальчук Л.В., Ганковская П.В., 1995; Gallivan K. et al., 1998). За выведение из организма чужеродного генетического материала отвечает специализированная система органов и клеток иммунная система. Ведь именно она через иммунитет распознает "свое" и " чужое", даже если этот носитель " чужого" отличается всего лишь одним геном. К этому сводится концепция иммунологического надзора, выдвинутая известным австралийским ученым Ф. Бернетом (Бернет Ф.,1971). Основная задача иммунной системы - контроль за генетическим постоянством внутренней среды организма. В случае ослабления или повреждения иммунной системы различными экзогенными и эндогенными факторами появляются инфекционные заболевания, аутоиммунные и аллергические расстройства (Пекарский Д.Е., Захарченко О.М., 1987).
1.6.1. Клеточные элементы, органы и ткани иммунной системы
Распознавание и удаление (элиминация) из организма генетически чужеродного материала представляет собой сложный многоэтапный процесс, обозначаемый как иммунная реакция (Петров Р.В., 1987; Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В., 1989). Она осуществляется специализированными клетками: лимфоцитами, многочисленными добавочными клетками и гуморальными факторами иммунитета. Элементы иммунной системы достаточно широко распространены в организме (Лозовой В.П.,. Шергин С.М, 1981; Батчер Э.С., Вайссман И.Л., 1987). Они преимущественно локализуются в крови, в лимфе и лимфоидных органах, включая костный мозг, вилочковую железу, лимфатические узлы, селезенку, пейеровы бляшки в стенке тонкого кишечника. В значительном количестве клеточные элементы, ответственные за реагирование на "чужое", представлены в толще слизистых оболочек кишечника, легких а также в коже. Несмотря на анатомическую разобщенность, отдельные компоненты иммунной системы связаны в единую систему посредством крово- и лимфотока. Организм реагирует на чужеродные субстанции двумя основными иммунологическими способами (Кульберг А.Я., 1985). Первый из них - гуморальный иммунитет. Это синтез и секреция В-лимфоцитами и их потомками — плазматическими клетками, специфических гликопротеидов (антител), которые циркулируют по кровеносному руслу и специфически действуют против чужеродных субстанций и молекул (антигенов). Такого типа иммунная реакция развивается, главным образом, на бактерии и другие микроорганизмы, на некоторые чужеродные клетки, на белки и подобные им молекулы.
Второй способ - клеточный иммунитет, который осуществляется путем прямого контакта Т-лимфоцитов с чужеродными антигенами. Противоопухолевая, противовирусная защита, реакция отторжения чужеродного трансплантата и ряд других защитных механизмов реализуются непосредственно лимфоцитами, которые в данном случае называются цитотоксическими, то есть способными разрушать клетки (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995).
В настоящее время на основании экспериментальных исследований и изучения различных заболеваний, связанных с нарушением иммунных реакций, выявлены 2 типа лимфоцитов: Т- и В- лимфоциты (Кантор Х., 1987; Купер М.Д. и др., 1987). Развитие и функционирование первой Т популяции лимфоцитов контролируется тимусом, а второй (В)- сумкой Фабрициуса у птиц или такими ее аналогами у млекопитающихся в том числе и человека, как костный мозг, пейеровы бляшки кишечника, а во внутриутробном периоде развития-печенью.
B-лимфоциты и их потомки - плазматические клетки вырабатывают антитела, которые служат эффекторами гуморального иммунитета. T лимфоциты распознают и уничтожают чужеродные клетки с участием рецепторов, находящихся на их поверхности. В связи с этим, их обозначают как клетки киллеры (убийцы). Помимо них, существуют другие подклассы (субпопуляции) T- клеток. Одна из этих субпопуляций оказывает помощь B клеткам в продукции антител и поэтому получила название как T лимфоциты помощники или хелперы (от англ. to help - помогать). Лимфоциты другой субпопуляции обозначены как T-супрессоры (от англ. to suppress - подавлять). Свойством этой субпопуляции T-лимфоцитов является способность подавлять функцию уже работающих (вырабатывающих антитела) B-клеток по механизму обратной связи (Земсков В.М., Земсков А.М., 1996).
Помимо лимфоцитов, важнейшую роль в реализации иммунных процессов играют клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Макрофаги захватывают поступивший в организм антиген, перерабатывают его и затем представляют T- и B-лимфоцитами (Фрейдлин И.С.,1984; Кульберг А.Я., 1985; Шеван И.,1987; Потапнев М.И., 1995; Gohda E. et al., 1998). Кроме того, моноциты и макрофаги вместе с полиморфноядерными лейкоцитами (нейтрофилами) обладают уникальной способностью поглощать (фагоцитировать) другие клетки (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Бережная Н.М.,1988).
Кроме реакций клеточного и гуморального иммунного ответа, в организме участвует целый спектр так называемых неспецифических защитных реакций, которые реализуются через эффекторные факторы (Кульберг А.Я., 1985; Ломакин М.С., 1990). Растворимые эффекторные факторы, находящиеся в основном в сыворотке или плазме крови, представлены компонентами комплимента, белками острой фазы (пропердин, C-реактивный белок и другие), лизоцимом и некоторыми другими ферментами. Действие их проявляется непосредственно на мишени (клетки, микроорганизмы, растворимые продукты, типа иммунных комплексов и другие) без развития типичной иммунной реакции. Поэтому их и обозначают как эффекторные факторы.
1.6.2. Лимфоциты
Лимфоцит - ключевая клетка иммунной системы, обеспечивающая основные реакции иммунитета. Общая масса лимфоцитов взрослого человека составляет около 1,5 кг. Лимфоциты циркулируют в крови и лимфе, скапливаются в различных лимфоидных органах, в межтканевых пространствах, обладают уникальной способностью проникать через стенку сосуда через специализированные клеточные элементы (высокий эндотелий венул), не нарушая их целостности. Считается, что в крови находится около 0,2-0,3% лимфоцитов от общего числа, а основная масса распределена в тканях и лимфе. Если в 1 мкл периферической крови взрослого человека содержится от 4,5 до 9,5 тысяч лимфоцитов, то в 1 мкл лимфы их находится до 20 тысяч (Брискин Б., Савченко З., 1995). Известны 3 популяции лимфоцитов: B-лимфоциты превращаются в антителообразующие клетки, которые вырабатывают антитела; T лимфоциты обладают более разнообразными функциями: распознавание чужеродного антигенного материала, оказывают помощь B-клеткам в антителообразовании, распознавание и непосредственном разрушение (килеры) клеток мишеней, активиция макрофагов и других клеток вырабатываемыми растворимыми продуктами (лимфокинами), контроль силы и продолжительности иммунной реакции (Петров Р.В. и др., 1997). Натуральные или естественные клетки (лимфоциты) убийцы распознают и убивают некоторые опухолевые клетки, клетки инфицированные вирусом, без развития типичной иммунной реакции. Это клетки первой линии противоопухолевой и противовирусной защиты и их распознающие структуры (рецепторы) иные, чем у T- и B лимфоцитов.
1.6.3. Популяции и субпопуляции лимфоцитов и их роль в регуляции воспаления
B-лимфоциты относятся к наиболее важным клеточным элементам иммунной системы, предназначенным для реализации гуморального иммунитета посредством специфических антител. Зрелые B-клетки, морфологически подобны лимфоцитам, поступают в кровоток из костного мозга, пейеровых бляшек и из других органов. Затем они заселяют периферические лимфоидные органы, где под влиянием факторов роста и созревания и специфического антигена в специальных зонах (вторичные фолликулы лимфоидной паренхимы в лимфатических узлах, белая пульпа селезенки, миндалины и другие) дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие и продуцирующие антитела. Формирующийся B-клеточный клон обеспечивает выработку антител одной специфичности. Отличительная особенность созревающих и зрелых B-лимфоцитов заключается в наличии поверхностных иммуноглобулиновых молекул. Они являются рецепторами для антигена. Кроме иммуноглобулиновых рецепторов, на B-клетках экспрессируется ряд других поверхностных маркеров.
T-лимфоциты.
Среди клеточных элементов иммунной системы несомненное лидерство как по количественным, так и функциональным параметрам принадлежит T-лимфоцитам. Это клетки происходят из полипотентной стволовой клетки и через ряд стадий дифференцировки в костном мозге (лимфоидная стволовая клетка, общая для B- и T-клеток) приобретают способность к миграции в тимус, где окончательно созревают в функционально полноценную иммунокомпетентную клетку. Внутритимический этап развития T-лимфоцитов определяет формирование высоко специализированных клеток. Среди T-клеток выделяют T-хелперы, T-индукторы, T-супрессоры, T-цитоксические клетки, T эффекторы гиперчувствительности замедленного типа. Именно эти клетки определяют практически полной спектр клеточных реакций иммунитета, включая реакции гиперчувствительности замедленного типа, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета и многие другие.
Помимо эффектной функции, у лимфоцитов высоко развита иммунорегуляторная активность. Известно, что на тимусзависимые антигены B-лимфоциты не могут развивать адекватный иммунный ответ без помощи субпопуляции T-лимфоцитов, являющихся T-хелперами, в то время как другая субпопуляция T-лимфоцитов (T-супрессоры) обладает негативным действием на развитие и реализацию иммунных процессов. Разнообразны регуляторные влияния T-лимфоцитов на клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Распознавание антигенного материала путем восприятия его поверхности антиген-представляющих моноцитарно-макрофагальных клеток с последующим запуском активационных процессов, отражает уникальную способность T-клеток инициировать иммунную реакцию.
T-лимфоциты хелперы/индукторы.
Они являются наиболее важными клеточными элементами иммунной системы. Именно T-хелперы (помощники) включают B-лимфоциты в развитие, обеспечивающее накопление соответствующего клона зрелых антителопродуцентов, интенсивно синтезирующих антитела против иммунизирующего антигена. Первый этап этого процесса начинается с распознавания Т – хелперами антигенных молекул, которые были предварительно переработаны антигенпредставляющими клетками моноцитарно-макрофагального ряда. В последующем T-хелперы синтезируют растворимые факторы (интерлейкин - 2 и другие), помогающие B-лимфоцитам превращаться в антителопродуцирующие клетки, а также регулировать другие иммунные реакции.
T-лимфоциты супрессоры.
T-супрессоры выполняют одну из основных рягуляторных ролей в иммунных реакциях воздействуя на T- и B-клетки. Основное их предназначение - негативная регуляция иммунного ответа. Под влиянием этих клеток тормозятся выработка антител, цитоксические и другие реакции. Данная субпопуляция T-лимфоцитов угнетает иммунную реакцию специфически, то есть в отношении того антигена, который ее не индуцирует, и неспецифически в отношении многих других антигенов. Следует отметить, что окончательное созревание функционально активных T-супрессоров зависит от T-хелперов.
T-цитотоксические клетки.
T-цитотоксические клетки выполняют эффекторную (киллерную) функцию и поэтому их называют T-киллеры. Эти лимфоциты способны специфически разрушать (лизировать) чужеродные опухолевые клетки, клетки мишени, пораженные вирусом (например, клетки печени, инфицированные вирусом гепатита B). Особенностью их действия, отличающегося от естественных клеток киллеров (NK), является необходимость предварительного контакта с антигеном и последующего развития в так называемые сенсибилизированные T лимфоциты. последние будут разрушать клетки, на которых присутствует антиген, вызывающий их специализацию. При взаимодействии с клеткой мишенью T-киллеры выделяют цитотоксические факторы (лимфотоксин, перфорин и др.), под влиянием которых нарушается целостность клеточной мембраны чужеродной клетки и она лизируется.
Цитотоксические T-клетки в основном находятся в периферических органах и тканях иммунной системы (лимфатические узлы, селезенка, лимфоидные скопления в слизистых и т.д.), а также в различных участках организма, где непосредственно развивается реакция клеточного иммунного ответа. В небольшом количестве цитотоксические T-лимфоциты присутствуют в периферической крови, но подсчитать их отдельно доступными методами не удается, так как они имеют сходные с T-супрессорами поверхностные маркеры (CD2,CD3,CD8 и др.).
В литературе имеется значительное число сообщений по отдельным аспектам иммунитета и неспецифической иммунологической резистентности при хирургических заболеваниях с гнойно-воспалительными осложнениями местного и системного характера (Колкер И.И., Вишневская С.М., Панова Ю.М., 1985; Шкроб Л.О. , Лукоянова Т. Н., Вишневская С.М. и др., 1990; Назарова И. П., Попов А.А., Мальцева М. А. и др., 1994).
Проблема лечения неспецифической инфекции и ее гнойно- септических осложнений за последние годы приобрела особую остроту практически во всех сферах клинической практики. Использование современных антибиотиков, способствующих селекции высокорезестентных штаммов, внедрение методов иммунодепрессивной терапии, экологические факторы, все это способствует росту осложненных форм хирургической инфекции (Черных Е.Р., 1997).
Одной из ведущих причин возникновения осложненного течения бактериальной инфекции являются нарушения в иммунной системе. Поэтому перспективы лечения данного контингента больных связывают с внедрением методов иммунокоррекции и в частности, с использованием цитокинов (Ерюхин И.А.,1997; Ковальчук Л.В. и др., 1997).
1.7. Цитокины и их роль в воспалительных реакциях
Цитокины представляют обширную группу растворимых молекул, которые продуцируются гемопоэтическими клетками, включая клетки иммунной системы, а также эндотелиальными и стромальными клетками. Цитокины опосредуют противоинфекционный процесс, формируют воспалительные реакции, контролируют регенераторные процессы (Фрейдин И.С, 1995). На сегодня известно более 60 цитокинов (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 1995). Особая роль в патогенезе инфекционно - воспалительного процесса отводится двум группам цитокинов, обладающих провоспалительной и противовоспалительной активностями. Группу провоспалительных цитокинов формируют цитокины Т-хелперов 1 типа - интерлейкин 2, интерферон - гамма, фактор некроза опухоли -a, -b, ряд цитокинов моноцитарно-макрофагальной природы - интерлейкины -1, -6, -8, -12. К группе противовоспалительных цитокинов относятся продуцируемые Т-хелперами 2 типа и макрофагами: интерлейкин - 4, - 10, - 13. Провоспалительные цитокины модулируют запуск и развитие воспалительной реакции, стимулируют репаративные процессы (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995). Противовоспалительные цитокины осуществляют негативный контроль иммунного ответа и воспалительной реакции. Таким образом, баланс про- и противовоспалительных цитокинов во многом определяет характер ответа организма на бактериальную агрессию (Фрейдлин И.С. 1995, Потапнев М.П., 1995).
Гиперпродукция провоспалительных цитокинов может приводить к развитию инфекционо-токсического шока, ДВС - синдрома и дестресс синдрома обусловливающих раннюю летальность при сепсисе. В свою очередь продолжительная инактивация клеток моноцитарно-макрофагального ряда, основанная на включении продукции противовоспальтельных цитокинов, приводит к глубокой иммунодепрессии и летальности на поздних этапах септического процесса (Фредлин И.С., 1995; Черных Е.Р., 1996).
На основе результатов исследования иммуногенеза бактериальной инфекции и анализа иммуномодулирующей активности цитокинов, сотрудниками лаборатории клеточной иммунологии Института Иммунологии СО АМН (Черных Е.Р., Останин А.А., 1994) разработаны и апробированы методы применения противовоспалительных цитокинов в лечении бактериальной инфекции. Создана программа цитокинотерапии в трех вариантах. Первый вариант использования цитокинов в виде аппликаций, ингаляций, непрямой лимфотропной терапии. Источником цитокинов служили кондиционные Среды мононуклеарных клеток, стимулированных рекомбинантным интерлейкином - 2 или ИЛ -1, ФНО - .
Показанием к региональной цитокинотерапии являются ограниченные гнойно -воспалительные процессы мягких тканей, опорно-двигательного аппарата, ожоговые раны. Применение цитокинов в таком режиме характеризуется быстрой элиминацией патогенной флоры, противовоспалительным эффектом, ускорением репаративных процессов.
Второй вариант представляет инфузионное использование смеси нативных цитокинов в виде перфузатов ксеноселезенки.
Третий способ представляет использование цитокинов для экстракорпоральной обработки иммунокомпетентных клеток. Активация мононуклеарных клеток вне организма позволяет избежать токсического иммунодепрессивного действия эндогенных метаболитов. В культуре in vitro удается достичь гораздо более выраженных сдвигов активности иммунокомпетентных клеток. Показанием к проведению третьего варианта цитокинотерапии являются наличие синдрома эндогенной интоксикации или развитие состояния иммунопарилича при сепсисе, разлитом гнойном перитоните.
Таким образом проблема регуляциии репаративных и воспалительных процессов весьма актуальны в современной хирургии. Большие перспективы открывает локальное применение новой группы препаратов на основе естественных клеточных регуляторов – цитокинов. Цитокины выступают в качестве модуляторов воспалительного процесса в организме и регуляторов функции основных клеток – эффекторов воспаления – нейтрофилов. Воспалительные реакции регулируются цитокинами, продуцируемыми в основном макрофагами. Цитокины формируют способность, интенсивность и направленность ответа нейтрофилов на патоген. Есть сообщения, что цитокины не действуют на нормально протекающие репаративные процессы.
1.8. Кожа как иммунный орган
Кожа – самый большой и сложный орган состоящий из эпидермиса, дермы и подкожной клетчатки. Кроме защиты организма от внешних вредностей кожа выполняет функции осязания, обмена веществ и терморегуляции (Морозов Б.Н. , Могирева И.А. , Максимова Н.А. и др. , 1997).
Эпидермис - наружный слой кожи толщиной от 0,07 до 1,5 мм происходит из эктодермального листка и представляет собой многослойный плоский эпителий, ороговевающий на поверхности. Эпидермис отделен от дермы базальной мембраной. Базальный слой, самый нижний, состоит из одного слоя призматических клеток, расположенных палисадообразно и прилежащих непосредственно к базальной мембране. Здесь происходит деление клеток, почему базальный слой называют также зародышевым слоем. Новообразованные эпителиальные клетки отделяются от оставшихся клеток базального слоя и продвигаются вверх, подвергаясь ряду изменений. В результате, в эпидермисе образуется несколько слоев: шиповатый, зернистый, стекловидный, роговой.
Дерма (или собственно кожа) состоит главным образом из плотных сплетений соединительно-тканных волокон, образующих каркас, в котором расположены клетки, эпителиальные образования (волосы, сальные и потовые железы), сосуды, нервы. Толщина дермы колеблется от 0,5 до 4 мм. Поверхность кожи взрослого человека составляет 1,5-2 м2 колеблясь в зависимости от роста пола и возраста.
Дерма состоит из богатой волокнами (коллагеновые, эластичные, ретикулярные) и бедной клетками ткани. Клетки соединительной ткани немногочисленны, но разнообразны (фибробласты, фиброциты, гистиоциты, меланофаги, тучные, плазматические, эндотелиальные, лимфоциты, лейкоциты).
Фибробласты оказывают непосредственное влияние на заживление ран. Известно, что фибробласты могут продуцировать коллагены I и III типов, ламинин, нидоген, тенасцин, хондроитин-4-сульфат протеогликан, фибронектин, интерлейкин-8 и вызывать миграцию кератиноцитов. Имеется и прямое подтверждение положительного действия выращенных в культуре фибробластов на заживление ран (Саркисов Д.С. и др.,1994: Rennekampff H.O.et al., 1996).
К моменту рождения анатомически и функционально кожа недоразвита. Сосочковый слой, сальные и потовые железы, гиподерма достигают нормального развития лишь через 2-3 месяца от рождения. Далее наступает относительная стабилизация кожи до возраста 14-16 лет. Эти процессы заканчиваются примерно к 25 годам. Начиная, с 25-30 лет в коже открытых участков тела происходит медленная гиперплазия эластичных волокон и эластоидное превращение коллагена. В пожилом возрасте эти процессы происходят во всей коже, обнаруживается системность. В старости прибавляются явления подлинной атрофии кожи, особенно эпидермиса (Воронцова М.А., Лиознер Л.Д., 1953).
Кожа имеет высокоэффективный арсенал клеточных элементов и их продуктов, с помощью которых она функционирует как иммунный орган. Кожа является первичной мишенью во время различных иммунных реакций, особенно это касается эпидермального слоя. Кожа - уникальный иммунный орган, заселенный клетками, способными инициировать системный ответ на антигены, поступившие через нее (Зимина И.В. и др., 1994). Как иммунный орган кожа способна к изоляции, прессингу и презентации антигенов и развитию иммунного ответа. В коже содержится иммунокомпетентные клетки костномозгового происхождения – гистиоциты, тучные клетки, клетки Лангерганса, лимфоциты и гранулоциты. Выяснено, что кератиноциты, состовляющие основную часть эпидермальных клеток, способны синтезировать и секретировать различные вещества, участвующие в реализации иммунного ответа. Они продуцируют цитокины, эпидермально-клеточный фактор, простогландины и др. Цитокины продуцируются также структурными клетками кожи – фибробластами, эндотелиальными клетками. Цитокины связывают кератиноциты с лимфоцитами, фагоцитами и гранулоцитами и являются критическими элементами в ответ кожи на воспаление. Среди цитокинов имеются как иммуностимулируюшие, так и иммуносупрессорные факторы. По данным И.В. Зимина (1994) в коже синтезируются цитокины: интерликины (от ИЛ –1 до ИЛ –11), гемопоэтические факторы роста, интерфероны, фактор некроза опухоли, фактор роста фибробластов.
Кожа наибольший орган человека отвечающий за защиту организма от внешнего воздействия. Содержит большой набор иммунокомпетентных клеток и часто является первичной мишенью во время различных иммунных реакций. Многие хронические заболевания кожи связаны с локальным нарушением иммунитета, гиперпродукцией цитокинов провоспалительного характера или наоборот гпопродукцией противовоспалительного назначения.
1.9. Краткие сведения о лечении ран
Известно, что заживление ран является сложным морфологическим, патофизиологическим и биохимическим процессом, на течение и исход которого существенное влияние оказывают факторы: обусловленные непосредственно повреждением ткани; присоединившаяся первичная или вторичная раневая инфекция; наличие воспаления, часто с нагноением, препятствующего естественной регенерации; уровень защитных иммунобиологических сил организма; реактивность и исходное состояние больного.
По мнению С.Д. Саркисова (1993) в общей динамике раневого процесса четко прослеживаются три периода: 1) расплавление некротических масс и очищение от них раневого дефекта через воспаление; 2) пролиферация соединительно-тканных элементов с формированием грануляционной ткани восполняющей рану; 3) фиброзирование грануляционной ткани с образованием рубца и эпителизацией его.
Общеизвестно, что практически все ранения мирного и военного времени первично или вторично инфицированы различной микрофлорой, в которой наиболее постоянными являются стафилококки, стрептококки, пневмококки, протей, кишечная и синегнойная палочки, анаэробная микрофлора, условно-патогенная микрофлора и сапрофиты.
Поэтому ведутся постоянные поиски и разработка лечебных препаратов и средств, обладающих, прежде всего бактерицидным и бактериостатическими свойствами предупредить, ограничить и ликвидировать раневую инфекцию, а также средств, стимулирующих заживление ран (Carson H., 1994).
По мнению большинства клиницистов, общее и местное лечение ран следует проводить с учетом общего состояния организма, оценки защитных сил, стадии клинического течения, раневого процесса и наличия микробной флоры.
Известно, что общие принципы местного лечения раневого процесса сводятся к ограничению воспалительных явлений, предупреждению инфекционных осложнений и улучшению условий для регенерации в очаге поражения. Поэтому лечебные средства и препараты, используемые для местного лечения ран, прежде всего, должны обладать антисептическими свойствами, стимулировать развитие грануляционной ткани и эпителизацию раны, повышать местные и общие защитные свойства тканей. Однако весьма справедливо мнение М.И. Кузина и др. (1990) о том, что сегодня не существует средств или методов, пригодных для лечения ран вообще, во все фазы. Поэтому принципиальные требования к местному медикаментозному лечению ран сводятся к следующим моментам.
Во-первых, лечение ран должно строиться строго в соответствии с теми процессами, которые происходят в различные фазы раневого процесса, способствуя регенерации; во-вторых, в большинстве случаев только медикаментозное лечение не может полностью обеспечить достаточно эффективного воздействия на раневой процесс; в-третьих, в настоящее время нет лекарственных препаратов, могущих вызвать быстрое и полное отторжение некроза и надежное подавление инфекции в первой фазе и эффективно стимулировать регенерацию.
В настоящее время при местном лечении ран мягких тканей применяются всевозможные химические и биологические средства (Chang C.J., Yang J.Y., 1994).
Для местного лечения раневого процесса было предложено и использовалось более 100 антисептических средств и препаратов, различающихся по своей природе и механизму действия: 5-10%-я настойка йода, 1-2%-й раствор хлорамина, водные растворы риванола, фурацилина, перекись водорода, марганцовокислый калий, азотнокислое серебро, водные и спиртовые растворы метилвиолета и бриллиантовой зелени, борная кислота и многие другие.
Биологические методы лечения инфицированных ран находили широкое применение. Ряд хирургов для повышения защитных сил организма и неспецифической сопротивляемости организма использовали препараты, приготовленные из различных микроорганизмов, бактериофагов или продуктов их жизнедеятельности, а также органов и тканей (Boyce – S.T. et al., 1997).
С целью повышения специфической реактивности организма, в частности при преобладании стафилококковой инфекции в ране, многими исследователями были предложены и применялись антистафилококковый анатоксин, антистафилококковая плазма и -глобулин, бактериофаги (Федоровская Е.А., Назарчук Л.В., 1989). В последние десятилетия в клинической практике для лечения гнойно-воспалительных заболеваний и ожоговых ран широко применяются биологически активные вещества - протеолитические ферменты, такие как трипсин, химотрипсин, папаин, плазмин, стрептокиназа и другие ферменты - ДНКаза, РНКаза, гиалуронидаза, лидаза, ронидаза, профезим, иммозимаза и др. (Любарский М.С., 1989, Павлов В.В., 1996). Большинство применяемых ферментов по своей природе являются продуктами животного происхождения, получаемыми из поджелудочной железы животых: трипсин, химотрипсин, панкреатическая рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза; из плодов и листьев растения корики папуа - бромеаним, папаин; из бактериальных культур - стрептокиназа, стрепдорназа, коллагеназа, альфа-амилаза.
В качестве биологически активных веществ, стимуляторов репаративного процесса, широкое применение находят различные фармакологические средства. А также гормональные препараты: экстракт щитовидной железы - тиреоидин, гормоны поджелудочной железы - инсулин, надпочечника - адреналин, глюкокортикостероиды, синтетические анаболические гормоны (Сологуб В.К. и др., 1986; Сандомирский, Б.П. и др., 1984; Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У., 1996; Demleng R.H., 1995; Hansbrough J.F., 1995).
Широкое применение в качестве биологических стимуляторов раневого процесса получили тканевые и белковые препараты, из которых в результате ферментативного расщепления в ране образуются биологически активные вещества. С этой целью использовались экстракты из различных органов, тканей, пленки из консервированной кожи и другие белковые препараты (Джитова И.Г. и др., 1998; Chang C.J., Yang J.Y., 1994).
В клинической практике успешно применяли компоненты крови в виде бактериостатической кровяной повязки или гемопасты, так называемый гемосинтолизин - препарат приготовленный из гемолизированной крови в комбинации с синтомицином, который использовался в виде повязки на свежие раны (Ханин А.Г., Суховеров А.С., 1997).
В последнее десятилетие появилось принципиально новые подходы к лечению ран, которые сводятся к проведению лазерной (гелий-неоновой, углекислый, ультрафиолетовый), ультразвуковой и гидровакуумной обработки ран. Используются такие методы как, фракционный промывной дренаж, лечение ран в управляемой абактериальной среде. Применяются методы криовоздействия и гиперборической оксигенации ран. Применение современных антибиотиков с широким спектром действия, протеолитических ферментов, антикоагулянтов, фибринолитических препаратов, а также средств, стимулирующих регенераторные и иммунобиологические процессы (Гончар А.М. и др., 1986; Юхтин В.И. и др., 1997; Жиляев Е.Г. и др., 1998; Бабаджанов Б.Р., Султанов И.А.,1998).
Поэтому совершенно справедливо мнение Б.М. Костюченок (1990) о том, что "трудно представить другой раздел медицины, где бы применяли столько различных веществ, как при лечении ран, их арсенал поистине безграничен".
Лечение больных с термическими поражениями представляют собой сложную и трудную проблему (Кузин М.И. и др., 1988; Leitch J.O., 1995). Современные методы лечения подразделяются на общие и местные. Общие мероприятия при ожоговой болезни проводятся в зависимости от стадии и степени ожога. Местные методы лечения ожогов подразделяются на закрытые, полуоткрытые, открытые и смешанные. В обзорах посвященных местному лечению ожогов, чаще всего описывается опыт применения антисептических средств - повязки с различными дубящими, коагулирующими и адсорбирующими веществами.
При закрытом способе лечения лекарственные вещества применяются, как правило, после первичной обработки ожоговой поверхности, наиболее распространенным методом местного лечения ожогов является применение мазевых повязок с различными лекарственными веществами. Они обладают рядом преимуществ: уменьшают болевые ощущения в ране, не раздражают ткани, способствуют лучшему заживлению и эпителизации раневой поверхности, хотя и не лишены некоторых недостатков (Кузин М.И. и др., 1987).
Антибиотикотерапия не решила основной проблемы – надежной профилактики инфекционных осложнений при ожоговой болезни. Более того, под влиянием широкого применения их, по мнению многих авторов, изменился характер раневой микрофлоры, антибиотики способствовали появлению резистентных и антибиотико-независимых форм микроорганизмов, дисбактериозов, суперинфекции, снижению иммунологических защитных сил организма, участились случаи аллергических осложнений и других побочных явлений (Павлов В.В., 1996).
При применении гормонов, более благоприятно протекают репаративные процессы, идет формирование грануляционной ткани, эпителизация раневой поверхности. Повышается вероятность приживления аутотрансплантатов.
Анализ методов консервативного лечения ран позволяет судить о значительном арсенале лекарственных средств, оказывающих ранозаживляющее влияние. Однако и до настоящего времени представляются актуальными поиски новых препаратов, обладающих более эффективным ранозаживляющим действием, чем существующие вещества. На современном уровне развития хирургии очевидно, что консервативные методы лечения ран и ожоговой болезни должны применяться с учетом характера и тяжести повреждения, клинического течения и осложнений, а также необходимости и целесообразности хирургических методов лечения.
1.9.2. Современный подход к местному лечению ожогов.
Разумным обоснованием для использования того или иного препарата местного действия служит характер патологического повреждения, вызванного термической травмой. Основной целью лечения глубоких ожогов является ускорение отторжения струпа, предупреждение развития или подавление патогенной микрофлоры в ожоговой ране, профилактика генерализации инфекции, закрытие или эпителизация ожоговой раны (Рудовский В. и др., 1980; Лагвилава М.Г., 1991).
Спонтанное отторжение некротических тканей происходит под влиянием протеолитических ферментов, которые вырабатываются самим организмом и микробной флорой, персистирующей в ране. Но самостоятельное отторжение - довольно длительный процесс, в ходе которого появляются аутоантитела к обожженной коже и к тканям внутренних органов, что является причиной иммунных нарушений и приводит в 20-49% наблюдений к неудовлетворительным результатам аутодермопластики (Дубяга А.Н. и др., 1988). Кроме того, такое длительное существование некроза в ране является почвой для продолжительной интоксикации организма, создает благоприятные условия для развития патогенной микрофлоры и генерализации инфекции, что особенно выражено при наличии влажного струпа.
На современном этапе развития комбустиологии выработаны основные принципы местного лечения глубоких термических поражений (Вихриев Б.С. и др., 1986; Пахомов С.П., 1987). Основным методом лечения остается аутодермопластика, которая может быть произведена только после очищения раны от некротического струпа и образования грануляций, способных воспринять трансплантант (Эскина Л.Ю и др., 1988).
В последнее время активно разрабатываются методики трансплантации клеток кожи (кератиноцитов и фибробластов) применяемые при недостатке ресурсов собственной кожи (Матчил Е.Н. и др., 1998; Jurgens C. et al., 1995; Williamson J.S. et al., 1995). Ранее считалось, что с момента отторжения некроза до созревания грануляций в среднем проходит одна неделя. Максимальные сроки формирования грануляций - три недели. Таким образом, лишь конец третьей - начало четвертой недели считались наиболее реальными и оптимальными сроками для пластического закрытия ожоговой раны при традиционной консервативной терапии (Яругский Е.Е., 1987). Такая тактика была общепринятой до 80-х годов, поскольку считалось, что микрофлора ожоговых ран является препятствием для проведения аутодермопластики (Арьев Т.Я., 1966). В связи с этим практиковалась выжидательная тактика в лечении глубоких ожогов, рассчитанная на самопроизвольное отторжение струпа, с поэтапной некрэктомией и аутодермопластикой (Лагвилава М.Г., 1991). Но многочисленные микробиологические исследования доказали, что ведущая роль в высокой летальности больных с обширными глубокими ожогами принадлежит редким или госпитальным штаммам патогеной микрофлоры (Колкер И.И. и др.1984).
Раннее удаление ожогового струпа привлекает возможностью добиться излечения больного в более ранние сроки, избежать осложнений ожоговой болезни, возникающих в процессе лечения традиционными методами (Юденич В.В. и др., 1979; Мадыненов О.М., 1981; Фисталь Э.Я.,. Самойленко Г.Е, 1992). Но от момента травмы до созревания грануляций, пригодных к аутодермопластике, проходит довольно значительный срок. Поэтому особого внимания заслуживают методы, позволяющие сократить сроки излечения пострадавших с глубокими ожогами. Одним из них является раннее иссечение струпа с одновременной аутодермопластикой образовавшейся раны (Скобелкин О.С. и др., 1981; Фисталь Э.Я., Самойленко Г.Е., 1992; Будкевич Л.И. и др., 1998). Раннее оперативное лечение глубоких ожогов требует выполение ряда условий: ранней диагностики некроза на 1-5 сутки; наличия сухого некроза в ожоговой ране, при котором количество микрофлоры и ее патогенность минимальны; адекватной компенсации гомеостаза; атравматического удаления некротических тканей (Повстяной Н.Е. и др., 1982). Теоретически ранняя некрэктомия позволила бы сократить сроки лечения до 2-х недель, что не сопровождается достоверным снижением летальности. При данном методе трудно определить границу некроза, для чего предложены различные методы диагностики глубины ожога (Цветаев Е.В. и др., 1990). Наиболее благоприятны результаты некрэктомий, проводимых в первые трое суток, а также в 3-7 сутки. В более поздние сроки их целесообразность сомнительна, так как к этому времени начинается гнойное расплавление струпа, развивается отек тканей, что снижает вероятность приживления трансплантатов. Сдерживающими сторонами указанного метода является его травматичность и возникающая при этом высокая кровопотеря, что делает его применимым лишь при ограниченных повреждениях. Показано, что тотальная некрэктомия сопровождается кровопотерей, равной 1-1,5 мл на 1 кв. см иссекаемой площади, и достигает 2-4 литров на площади до 15-20% общей поверхности тела (Повстяной Н.Е. и др., 1982).
Альтернативным методом является более раннее удаление ожогового струпа и снижение бактериальной обсемененности раны с помощью местного применения антибактериальных препаратов для ускорения подготовки больных к аутодермопластике (Коган Л.Е., 1989, Полищук С.А. и др., 1990). С этой целью предложены, химическая или ферментативная некрэктомия в сочетании с местным применением средств, значительно снижающих степень бактериальной обсемененности ожоговых ран (Рудовский В. и др., 1980, Гоголев Л.С. и др., 1986).
Для отторжения девитализированных тканей в хирургической практике нашли применение различные ферментные препараты: животного (трипсин, химотрипсин, панкреатическая рибонуклеаза), бактериального (стрептокиназа, террилитин, протелитин, гигролитин) и растительного происхождения (Толстых П.И. и др., 1977; Стручков В.И. и др., 1984; Гончар А.М. и др., 1990). Все эти препараты имеют много общего в механизме своего действия. Воздействие их осуществляется за счет расщепления и разложения денатурированного белка, расплавления струпа, рассасывания гнойно-фибринозных налетов. Они способствуют большему выходу нейтрофилов и мононуклеаров из кровеносного русла в окружающие ткани, более интенсивному фагоцитозу бактерий и продуктов распада тканей, в чем проявляется их опосредованное антибактериальное действие. Благодаря этим свойствам протеолитические ферменты получили широкое применение также при лечении гнойно-некротических процессов мягких тканей (Гостищев В.К. и др., 1969, Стручков В.И. и др., 1984, Гончар А.М. и др., 1986, Толстых П.И. и др., 1990). Ряд протеолитических ферментов, в том числе иммобилизованных на различных носителях, были предложены для лечения глубоких ожогов. Встречается мнение, что местное применение протеолитических ферментов не оказывает существенного влияния на сухой струп, поэтому считается целесообразным их применение для расплавления гнойно-фибринозного налета и ликвидации остаточного некроза. С другой стороны, показано выраженное некролитическое действие иммобилизованных протеолитических ферментов при термических ожогах (Любарский М.С., 1989).
Положительные свойства ферментных препаратов неоспоримы, широкое применение их пока не вошло во врачебную практику. Этому препятствуют дефицитность и дороговизна препаратов, возможность их давать аллергические реакции, кратковременность воздействия, разрушающее действие на грануляционную ткань, возможность усиления общей интоксикации при активных процессах некролиза (Кузин М.И. и др., 1990).
1.9.2. Особенности закрытия ожоговой раны
Все средства и методы, направленные на лечение обожженного, преследуют в конечном счете одну цель - превратить открытую, инфицированную ожоговую рану в чистую и закрытую, что достигается аутодермопластикой.
Чистая рана, освобожденная от некротической ткани и имеющая достаточную сосудистую сеть для питания наложенного трансплантата - основное условие для успешной операции.
Существует много способов свободной аутодермопластики, некоторые из них имеют лишь исторический интерес, как, например, пересадка небольших островков кожи по Янович-Чайнскому - Дейвису. Для окончательного закрытия раны берут аутодермотрансплантаты либо в виде цельного лоскута, либо, если площадь донорских участков ограничена, используют полоски кожи, марки, сетчатый трансплантат.
При ожогах, занимающих до 25% поверхности тела, применимы аутогенные кожные покрытия с обычной техникой трансплантации. Чаще для этой цели используют цельные расщепленные кожные трансплантаты, легче приживающие, а донорские места после снятия тонких лоскутов быстро эпителизируются.
При обширных ожогах существует несоответствие между площадью поражения и площадью здоровой кожи, годной для пересадки. За последние годы описаны многие способы оптимальной утилизации аутогенной кожи (использование расщепленных по толщине трансплантатов в виде полосок, марок, микромарочных трансплантатов и др.). Наиболее широкое распространение получила трансплантация расщепленным перфорированным сетчатым лоскутом после того, как были изготовлены специальные аппараты для нанесения разрезов на лоскуте. Перфорация позволяет растягивать лоскут и превращать в сетку с просветами различной величины. При этом площадь сетчатого трансплантата может увеличиваться от полуторного до восьми и даже двенадцатикратного размера. С помощью сетчатых трансплантатов можно значительно сократить площадь донорских зон и оптимально использовать ресурсы непораженной кожи для целей аутодермопластики. Сетчатые лоскуты приживают лучше, чем сплошные. Это объясняется наличием на них отверстий, создающих надежную дренажную систему, благодаря которой под пересаженным лоскутом почти не образуется гематом и не скапливается раневое отделяемое (Юдневич В.В. и др., 1979).
При отсутствии достаточного количества аутокожи ожоговые раны могут быть закрыты временными биологическими покрытиями. Термин "биологическое покрытие" или "биологическая повязка" применяют для обозначения ткани, полученной от живого или недавно умершего человека (гомо-, или аллотрансплантат) или животного (гетеро- или ксенотрансплантат), к ним относятся также оболочки эмбриона, губки, пленки из специально обработанного коллагена или фибрина.
Биологические повязки применяют для временного закрытия как свежих (тотчас после проведения нерэктомии), так и гранулирующих ожоговых ран. Используемые после обширных иссечений некротического струпа биологические покрытия, кроме механической защиты раны, снижают потери жидкости, белков и электролитов, а также тепла и энергии. Потеря жидкости при испарении сопровождается одновременно и потерей тепла. Эти потери составляют 251, 208 Дж на каждый литр испаряющейся воды. При наложении гомотрансплантата испарение воды уменьшается на 85%, соответственно снижается и потеря тепла, метаболизм из катаболической фазы переходит в анаболическую. Наконец, биологические покрытия дают возможность сохранить собственную кожу больного, поскольку ее пересаживают на хорошо подготовленную раневую поверхность, что гарантирует успешное приживление. Плотное "схватывание" биологического покрытия с ожоговой поверхностью может служить своеобразным тестом подготовленности раны к аутодермопластике.
Материалом для биологических покрытий обычно является кожа, имеющая коллагеновую дермальную поверхность и ороговевший водонепроницаемый слой эпидермиса. Независимо от того, в какой срок и каким методом был удален ожоговый струп, биологическую повязку начинают применять после того, как обнажаться лежащие под струпом ткани.
Несмотря на тканевую несовместимость, при закрытии раны гомотрансплантатом, уже через 5-7 дней в нем начинается васкуляризация, чего никогда не наблюдается в гетеротрансплантате даже после полного "схватывания" его с раневой поверхностью. Гомотрансплантаты, находящиеся на ране более 5 дней, плотно прилипают к ее дну и снятие их вызывает кровотечение, которое может стать помехой для аутодермопластики. Кроме того, через 6 дней под гомотрансплантатом можно обнаружить инфильтрат, свидетельствующий о начавшемся процессе отторжения. Процесс отторжения - нежелательное явление для тяжелообожженных, поскольку он сопровождается повышением температуры и интоксикацией. Время наступления реакции отторжения в значительной степени зависит от иммунологического статуса больного и подвержено значительным индивидуальным колебаниям (Caruso D.M. et al., 1996). В среднем отторжние гомотрансплантата можно наблюдать через 8-11 дней, однако имеются случаи, когда аллотрансплантат кожи, взятый не от родственника, переживал 82 дня.
Методика заготовления и хранения гомокожи довольно проста. Кожу можно брать у трупов в течение первых 6 часов после смерти с соблюдением правил асептики (Purdue G.F. et al.,1997, Hanshmugh J.F. et al., 1997). Взятую кожу помещают в флаконы с изотоническим раствором хлорида натрия, добавляют антибиотики и хранят в холодильнике при температуре +2 +4°С. Замороженная при температуре минус 196°С кожа может храниться много месяцев. Одновременно с забором кожи из вены берут кровь для проведения соответствующих анализов, которые должны подтвердить отсутствие противопоказаний к использованию заготовленного материала.
Возрастающие потребности в заменителях кожи, широкое распространение за последнее время получило применение расщепленных кожных ксенотрансплантатов. Ксенотрансплантат способен плотно прилегать к поверхности раны, однако в отличие от аллотрансплантатов не воспринимается тканями человека и не васкуляризуется. При наложении ксенотрансплантатов возникает характерная немедленная интенсивная иммунологическая реакция отторжения (Соколов В.А., Бурмистров В.М., 1995).
Трудность приобретения кожных алло- или ксенотрансплантатов, их короткая жизнеспособность, присущая им антигенность ограничивают возможность широкого использования этих биологических препаратов и побуждают к поиску новых покрытий, сходных с человеческой кожей, но лишенных указанных недостатков.
Используется в качестве биологических покрытий ожоговых ран, а также донорских участков оболочки эмбриона - амнион и хорион (Гаврилюк Б.Г. и др., 1995). Наложение оболочек эмбриона на рану сразу же снимает боли, стимулирует рост грануляций, способствует очищению раны и предупреждает риск развития раневой инфекции. Амнион как производное электродермы может служить заменителем кожи. Реакция отторжения к нему выражена минимально даже после повторных аппликаций. Считается, что амниотические оболочки по своей эффективности не уступают ауто- и аллотрансплантатам, а по способности контролировать рост бактерий имеют преимущество перед ксенотрансплантатами. Ценным свойством амниотических оболочек, является возможность их длительного использования, до момента повторного взятия кожи с реэпителизированных донорских участков. Амнион же воспринимается тканью на месте покрытия. Когда же ожоговую рану закрывают хорионом, имеет место васкуляризация с воспалительной реакцией. При поражении всей толщи кожи после некрэктомии лучше накладывать хорион, который обладает, способностью снижать уровень бактерий в ране. Учитывая, что на гранулирующей ране амнион временно васкуляризируется, его начальный захват может служить ценным прогностическим признаком успешности дальнейшей аутодермопластики. Амниотическая оболочка обеспечивает хорошее прилегание к ране сохраняет свою жизнеспособность в течение 1-2 недели.
Ряд авторов использует в качестве временных биологических покрытий коллагеновую губку. Приготовленные из коллагена пластины размером 8x10 см, толщиной 4-6 мм стерилизуют гамма-облучением и сохраняют при комнатной температуре. Ее накладывают на рану в сухом виде или после предварительного смачивания в изотоническом растворе хлорида натрия. Губка также может служить носителем необходимых медикоментов, в том числе антибиотиков, выбранных согласно чувствительности к ним микробов. Антигенными свойствами коллагеновая губка при местном наложении на рану не обладает и иммунологические реакции по этой причине не развиваются. Скорость растворения коллагеновой губки зависит от степени ее плотности: мягкая губка растворяется в течение 2 дней, плотная от 5 до 8 дней. Предполагается, что коллаген действует как стимулятор фибриногенеза. Способность связывать раневой секрет – ценное свойство этой губки. После растворения губки на раневой поверхности формируется желатиноподобная пленка, препятствующая дальнейшей раневой секреции. После высыхания пленки или губки под ней остается нежный струп, не нарушающий заживления раны. Особенно показано наложение ее на донорские раны, где она оказывает гемостатический эффект и способствует быстрому заживлению.
Нет сомнения, что восстановление кожного покрова при травмах, ранениях и заболеваниях остается одной из актуальных проблем медицины. Аутодермопластика часто может расцениваться как операция риска и дополнительная травма. Кроме этого существует проблема донорской кожи у обожженных с большой площадью поражения (Саркисов Д.С. и др., 1991; Малахов С.Ф. и др.. 1994). Поэтому исследования, направленные на разработку новых, менее травматических методов восстановления утраченного кожного покрова, актуальны и перспективны (Кузин М.И. и др., 1985; Туманов В.П. и др., 1990; Островский А.А. и др., 1990; Глущенко Е.В. и др., 1993; Малахов С.Ф. и др., 1997; Юрченко Н.Д. и др., 1997; Лавров В.А. и др., 1998).
Наиболее перспективным представляется метод выращивания клеток кожи больного (фибробластов, кератиноцитов) и самой кожи в лабораторных условиях с последующей трансплантацией их на рану (Саркисов Д.С. и др., 1991; Васильев А.В. и др., 1994; Малахов С.Ф. и др., 1995; Константинова Н.В. и др., 1996; Длинова М.И. и др., 1996; Хрупкин В.И. и др., 1998; Смирнов С.В. и др., 1998). В основе данного метода лежит стимулирующее влияние фибробластов на процессы адгезии и пролиферацию эпидермоцитов (Глущенко Е.В. и др., 1996; Серов Г.Г., 1998). Известно, что фибробласты могут продуцировать коллагены I и III типов и компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тенасцин, некоторые факторы роста, факторы, стимулирующие адгезию к коллагену и миграцию кератиноцитов (Блинова М.И. и др., 1997; Алейник Д.Я. и др., 1998).
В последнее время многие ученые и клиницисты остановились только на культивировании фибробластов. Применение трансплантантов из культивированных кератиноцитов, определяется рядом недостатков, препятствующих их широкому клиническому использованию: сроки изготовления достаточного по площади трансплантанта велики и составляют 3-4 недели, высока стоимость питательных сред для культивирования кератиноцитов, кератиноциты практически не приживаются при трансплантации на гранулирующие ожоговые раны, использование аутокератиноцитов не позволяет создать банк клеток (Соркисов Д.С. и др., 1998).
А.А. Алексеев (1998) применил метод комбинированной аутодермопластики при глубоких ожогаж с трансплантацией культивированных аллофибробластов и использованием сетчатых кожных лоскутов, перфорированных в соотношении 1:6 и 1:8. Патогенетическая суть методики в данном случае заключается в том, что аллофибробласты стимулируют пролиферацию эпидермоцитов сетчатых кожных лоскутов, ячейки которых значительно быстрее, чем при традиционном методе, эпителизируются.
В настоящее время выявлено, что для восстановления кожного покрова можно использовать не только ауто- , но и аллогенные фибробласты. Фибробласты эмбрионов, обладающие лучшими ростовыми свойствами и сохранением высокие культуральные свойства до 45 – 50 пассажей (Колокольцова Т.Д. и др., 1998).
В последние годы много публикаций появилось по использованию эмбриональной ткани и клеток эмбриона в онкологии, нейрохирургии, гинекологии, эндокринологии. Изучение возможности использования эмбриональных клеток кожи открывает новое перспективное направление в лечении и ран (Гребенникова Н.В. и др., 1995; Сергеев В.Г., 1996; Ярыгин В.Н. и др., 1996). Эмбриональные ткани обладают рядом незаменимых в лечении ран свойств. Наиболее важным из них являются повышенный пролиферативный потенциал, сниженные антигенные свойства, содержание ряда ростовых, антибактериологических и анальгезирующих факторов (Смирнов С.В. и др., 1995; Колокольцова Т.Д. и др., 1998). Большие перспективы в регуляциии репаративных и воспалительных процессов открывает локальное применение новой группы препаратов на основе естественных клеточных регуляторов – цитокинов. Имеется опыт применения рекомбинантных цитокинов: интерлейкина - 1, интерферонов, фактора роста фибробластов в лечении экспериментальных ран (Зимина И.В. и др., 1994).
Л.В. Ковальчук (1997) проведя исследования в эксперименте, доказала, что естественный комплекс цитокинов регулирует течение раневого процесса на всех его стадиях. В раннем периоде (первые 7 суток) наблюдается активация миграции нейтрофилов, которая сопровождается усилением их функциональной активности. В эти сроки автор отмечает полное очищение ран от бактериальной обсемененности. В более позднем периоде (10 –19 сутки) под влиянием естественного комплекса цитокинов усиливаются перестроечные процессы: появление большого количества фибробластов, образование коллагеновых волокон, нарастания эпителия с краев раны. Наряду с фибробластическими процессами включаются и механизмы подавления избыточного разрастания соединительной ткани. С.А. Шляпников (1997) применил рекомбинантный дрожжевой интерлейкин –2 «ронколейкин» при лечении сепсиса и получил обнадеживающие результаты, наблюдал снижение тяжести состояние больного, грануляции становились розовыми, сочными, активно кровоточили. Отмечено возрастание числа Т – лимфоцитов, нормализация показателя Т – хелперов, нормализовалось соотношение хелперов и супрессоров.
Л.А. Ганова (1996) в эксперименте доказала, что Pseudomonas aeruginosa вызывает нарушение функциональной активности лимфоцитов, вызывает резкое возрастание продукции интерлейкина –1 и фоктора некроза опухоли, что препятствует развитию клеточных реакций иммунитета и приводит к угнетению эффекторных функций макрофагов и киллеров. Однократное введение а –интерферона быстро восстанавливает функциональное созревание лимфоцитов и продукцию указанных регуляторных медиаторов, что позволяет скоррегировать дефицит эффекторных клеток. Цитокины выступают в качестве модуляторов воспалительного процесса и регенерации в организме человека и регуляторов функции основных клеток – эффекторов воспаления – нейтрофилов (Потапнев М.П., 1995; Фрейдлин И.С., 1995; Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995).
Л.В. Ковальчук (1995) применила в эксперименте гетерологичные (свиные) цитокины в лечении ран на кроликах и получала хороший результат. Эффект проявился в снятии воспалительных явлений, ускорении эпителизации и анальгезируюшем действии.
Резюме
За последнее десятилетие частота и тяжесть гнойной хирургической инфекции неуклонно возрастают, и в наши дни различные ее виды регистрируются почти у одной трети больных хирургического профиля. У 30% больных данной категории отмечен иммунодефицит.
Главными моментами в лечении гнойной хирургической инфекции являются клинический подход к конкретному больному, обязательный учет индивидуальной особенностей организма и постоянный динамический контроль за иммунной системой. В связи с этим закономерен поиск новых способов и средств иммунокоррекции, воздействующих, прежде всего на инициальную стадию иммунного ответа при хирургической инфекции. Восстановление кожного покрова в ранах любого генеза путем трансплантации выращенных клеток кожи относится к перспективным биомедицинским методам лечения.
Таблица 2.1
|
Нозологическая форма |
Всего |
Муж |
Жен |
Возраст |
|
|
до 50 лет |
Старше 50 лет |
||||
|
Раны после ожогов |
41 |
36 |
5 |
40 |
1 |
|
Раны после вскрытия флегмон |
58 |
55 |
3 |
55 |
3 |
|
Трофические язвы |
27 |
22 |
5 |
25 |
2 |
|
Всего |
126 |
113 |
13 |
120 |
6 |
Методы лечения |
Больные с ранами |
||||||
После ожогов |
После вскрытия флегмон |
Трофически-ми язвами |
Всего |
||||
ж |
м |
ж |
м |
ж |
м |
||
Традиционный метод |
1 |
23 |
- |
35 |
3 |
12 |
74 |
Фибробласты |
4 |
10 |
- |
6 |
- |
2 |
22 |
Эмбрионы клетки |
- |
2 |
1 |
9 |
1 |
4 |
17 |
Цитокины |
- |
1 |
1 |
5 |
2 |
4 |
13 |
Всего: |
41 |
57 |
28 |
126 |
Нозологи ческиеформы |
Размеры ран |
|||||
до 10 см² |
до 20 см² |
до 50 см² |
до 100 см² |
Свыше 100 см² |
Всего |
|
Раны после ожогов |
- |
3 |
5 |
3 |
6 |
17 |
Раны после вскрытия флегмон |
4 |
7 |
8 |
3 |
- |
22 |
Трофическая язва |
1 |
6 |
4 |
2 |
- |
13 |
Всего: |
5 |
16 |
17 |
8 |
6 |
52 |
НозологическиеФормы |
Длительность лечения |
||||||||
до 3-х недель |
До 1 месяца |
До2-х мес. |
до 3-х месяцев |
до 6-ти месяцев |
До1 года |
До2-х лет |
Свыше2-х лет |
Всего |
|
Раны после ожогов |
2 |
7 |
2 |
4 |
2 |
- |
- |
- |
17 |
Раны после вскрытия флегмон |
4 |
9 |
5 |
3 |
1 |
- |
- |
- |
22 |
Трофические язвы |
- |
- |
6 |
2 |
- |
1 |
1 |
3 |
13 |
Всего: |
6(11,2%) |
16(30,8%) |
13(25%) |
9(17,4%) |
3(5,8%) |
1(24) |
1(24%) |
3(5,8%) |
52(100%) |
Нозологическая форма |
Однократно |
Двукратно |
Всего |
Раны после ожогов |
5 |
- |
5 |
Раны после вскрытия флегмон |
7 |
2 |
9 |
Трофические язвы |
3 |
3 |
6 |
Всего: |
15 (28,8%) |
5 (9,6%) |
20(39,2%) |
Предлагаемый способ лечения длительно незаживающих ран основан на применении региональной трансплантации культивированных клеток кожи и местном воздействии на репаративные процессы в ране за счет активации макрофагальных и лимфоидных клеток.
В связи с тем, что при гнойно-воспалительных процессах в первую очередь вовлекаются регионарные фагоцитарные клетки их приобретенная или врожденная недостаточность и будет формировать характер воспаления и репаративную регенерацию. Своевременная коррекция, как на общем уровне, так и локальном, позволит снизить характер воспалительной реакции и течение репаративных процессов. Применение клеточных культур позволит регулировать репаративные процессы в ране. Их применение разорвет порочный круг хронического воспаления.
Большую проблему составляют пострадавшие с обширными ожогами, когда тяжесть состояния пациента не позволяет использовать активную хирургическую тактику или имеется дефицит ресурсов кожи, для закрытия ожоговой раны. В таких случаях приходиться искать иные способы восстановления кожного покрова (алло- , ксено-, трупная кожа, биологические заменители кожи). Несмотря на достаточно широкий арсенал лекарственных средств, перевязочных материалов и способов лечения обширных ран в настоящее время в клинической практике нет альтернативного искусственного покрытия, которое по своим физиологическим свойствам соответствовало бы коже человека, поэтому живые кожные и эпидермальноклеточные трансплантаты являются наиболее эффективным материалом, служащим этим целям (Смирнов С.В., 1998).
Культура фибробластов, пересаженная на раневую поверхность продуцирует - экстрацеллюлярный матрикс богатый фибронектином и коллагеном, которые влияет на пролиферацию и адгезию кератиноцитов, а пересадка перфорированного сетчатого трансплантата с коэффициэнтом перфорации 1:8 позволяет добиться быстрой эпителизации в ячейках пересаженного кожного лоскута. Доказано, что без трансплантации фибробластов пересадка такого лоскута у тяжело больного обречена на лизис (Будкевич Л.И. и др., 1998).
Эмбриональная ткань человека обладает рядом уникальных и незаменимых в лечении ран свойств. К ним относится: повышенный пролиферативный потенциал, сниженная антигенная активность, содержание ряда ростовых, антибактериальных и анальгезирующих факторов. Эмбриональные клетки продуцируют ряд цитокинов регулирующих репаративные процессы: эпидермальный фактор роста, фактор роста кератиноцитов, фактор роста фиброблатов, интерлейкины 1, 3, 4, 6, 10, интерферон –гамма (Смирнов С.В. и др., 1996, Koph M. Et al., 1994). Сущность предложенного метода заключается в том, что стимуляция репаративных процессов в ране повышается при местном применении клеточных культур (Колокольцова Т.Д. и др., 1998).
В качестве трансплантационного материала нами в клинической практике использовались ауто- и аллокератиноциты, ауто- и аллофибробласты, фибробласты эмбриональной кожи и легкого.
Культивирование ауто- и аллокератиноцитов оказалось дорогим процессом, а эффективность их при трансплантации незначительной. Поэтому мы применяли их только на первых этапах работы. Культивированные ауто- и аллофибробласты (рис. 1) получали из лаборатории в чашках Петри (диаметром 5-10 см.) на целлофановых мембранах (рис. 2), в 20 мл. флаконах на коллагеновых носителях, а так же в геле.
Рис. 1 Культивированные фибробласты (описание в тексте). Окраска гематоксилин - эозином. Увеличение х80.
Рис. 2 Доставка культивированных фибробластов проводится в чашках Петри диаметром 10 или 5 см. (описание в тексте).
Рис. 3 Доставка фибробластов в геле (описание в тексте).
2.3. Характеристика культивированных клеток кожи
В Институте Клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» выполняются исследования по культивированию клеточных культур в том числе кератиноцитов и фибробластов (Колокольцова Т.Д., 1998).
Появление в последние годы большого числа научных работ в области культивирования клеток кожи человека и успешные попытки использования этих клеток в медицинской практике показывают высокую перспективу их применения в терапии ожоговых и других ран. Р. В. Меdewаг (1941) впервые доказал возможность поддержания in vitro жизнеспособных кератиноцитов, а позднее Н. Gгееn (1979) подобрал условия выращивания эпидермальных клеток кожи человека in vitro с использованием облученных мышиных фибробластов в качестве фидерного слоя. Дальнейшее совершенствование метода было направлено на подбор адекватной питательной среды и сознание клеточно-дермального эквивалента (Harriger M.D., 1995). Для этой цели использовали различные субстраты, пригодные как для роста клеток, так и для их трансплантации на рану. В настоящее время выявлено, что для восстановления кожного покрова ожоговой раны можно использовать не только ауто-, но и аллогенные кератиноциты (Boice S.T., 1995). В то же время российскими исследователями Д. С. Саркисовым и соавт. (1994) разработан новый метод лечения ожогов, путем трансплантации на раневую поверхность культивированных аллофибробластов. Несмотря на высокую эффективность метода, лечения глубоких ожогов с помощью фибробластов, ограничено. Во-первых, уникальностью первичного материала и, во-вторых, сложностью его переработки (Смирнов и др., 1994). Поскольку фибробласты отличаются от кератиноцитов более высокой пролиферативной активностью, простотой состава питательных сред, необходимых для их роста и поддержания in vitro, то целесообразным, на наш взгляд, представляется создание банка аттестованных культур клеток фибробластов человека, пригодных для широкого применения в медицине. Создание банка культур клеток позволит обеспечивать медицинские исследования стандартным по биологическим и генетическим свойствам клеточным материалом. Кроме того, поскольку опыт работы крупнейших коллекций мира показывает высокую вероятность контаминации культур клеток, то необходимость аттестации клеток, используемых в медицинской практике, на наличие посторонней микрофлоры подчеркивает актуальность проблемы.
Целью настоящей лабораторной работы являлось получение и аттестация новых и имеюшихся в коллекции штаммов диплоидных фибробластов человека и изучение возможности использования их в качестве аллотрансплантатов при лечении ран различной этиологии.
Материалом для исследования служили кусочки кожи, полученные от ожоговых больных, от больных при ампутации конечностей, кожа крайней плоти детей взятая во время операции, эмбриональный материал 6 - 12 недельного плода, полученный при медицинских абортах.
Считается, что наиболее полноценным раствором для временного хранения и передачи донорского материала в лабораторию является богатая питательная среда с добавлением сыворотки. Однако широкое применение данного способа ограничено высокой стоимостью обогащенной питательной среды. С целью подбора более дешевых и доступных в любом медицинском учреждении растворов для хранения донорской кожи, нами была предпринята попытка оценить возможности использования физиологического раствора или раствора 5% гидролизата лактальбумина (ГЛА).
У пострадавшего или донора кусочек кожи 2х2 см толщиной 0,5 –1мм с соблюдением правил асептики забирали лезвием бритвы или электродерматомом чаще всего с передней поверхности средней трети бедра. Кожу помещали в стерильный флакон с физиологическим раствором или с 0,5%-ным раствором (ГЛА) с добавлением канамицина в концентрации до 500 мкг/мл и передавали в лабораторию. Для отработки условий хранения кожного биоптата материал разрезали на небольшие кусочки размером 1—2 см, помещали в физиологический раствор либо в 0,5%-ный раствор ГЛА и хранили при температуре +4° или +20°±2° в течение 1 - 5 суток.
Результаты изучения влияния различных условий хранения на жизнеспособность клеток показали, что наиболее близким к оптимальному, является хранение кожных лоскутов в физиологическом растворе при температуре +4°, при этом даже после 5-и суток хранения оставались жизнеспособными 58,8% эпидермальных клеток, в то же время при комнатной температуре большая часть клеток погибала. Достаточно высоким оставался показатель жизнеспособности клеток на 1-е и 2-е сутки после хранения кожных лоскутов в растворе ГЛА при температуре +20°±2°. Однако последующее расслоение кусочков кожи, предварительно хранившихся в физиологическом растворе, было более полным, в то время как расслоение кожи, хранившейся в растворе ГЛА, было недостаточным и ухудшалось пропорционально увеличению времени хранения.
Таким образом, данные проведенного эксперимента показали, что для хранения и доставки донорской кожи возможно использование физиологического раствора при пониженной температуре как наиболее дешевого, доступного и позволяющего длительно сохранять жизнеспособность клеток.
Эксперименты по получению и доставке донорской кожи показали, что существует высокая вероятность контаминации ткани микроорганизмами. В литературе предлагаются различные прописи растворов антибиотиков, используемых при транспортировке. Анализ собственных данных по использованию антибиотиков показал, что для временного хранения достаточно использовать канамицин в дозе от 200 до 500 мкг/мл.
Диссоциацию тканей проводили с помощью ферментов: трипсина (производства ГНЦ ВБ "Вектор") разной концентрации (0,25%, 0,125; 0,05; 0,025; 0,0125%), коллазы (0,15—0,2%, производства ГНЦ ВБ "Вектор") и протеаз (Вгаtislаva, Чехоcловакия). Кусочки кожи отмывали от антибиотиков, помещали в растворы ферментов на 18— 24 ч при температуре +4°С. Эксперименты по получению эпидермоцитов были проведены путем дезагрегации кожных лоскутов под действием различных протеолитических ферментов: трипсина, коллазы и протеазы. При холодовом способе получения эпидермоцитов более высокие показатели жизнеспособности клеточной суспензии были получены в результате обработки кусочков кожи 0,05—0,125%-ным раствором трипсина или 0,2%-ным раствором коллазы и протеазы в течение 18—24 ч при температуре +4°С с последующим разделением слоев кожи и выделением эпителиальных клеток в свежих порциях раствора фермента. При этом выход живых клеток превышал выход последних, полученных при использовании 0,0125—0,025%-ного раствора трипсина. Необходимо отметить, что клетки, полученные при обработке коллазой, были морфологически однородны. Суспензия практически не содержала детрита, что, вероятно, объясняется более мягким воздействием коллазы на оболочки клеток. Использование более низких концентраций растворов трипсина (0,025 и 0,0125%) не давало полного расслоения кожи и вследствие этого значительно снижало выход клеток при стандартном временном диапазоне (18—24 ч). Увеличение экспозиции до 72 ч улучшало диссоциацию, при этом сохранялось достаточное количество жизнеспособных клеток.
Таким образом, снижая концентрацию трипсина, можно увеличивать продолжительность диссоциации в случае крайней необходимости. Показано, что одним из источников аллоэпидермоцитов может быть кожа крайней плоти ребенка. Жизнеспособность выделенных клеток при дробной и холодовой трипсинизации кожи крайней плоти оказалась аналогичной таковой при холодовой трипсинизации кожи взрослого человека, а при использовании 0,05—0,125%-ного раствора трипсина достигала значений 80—90%, при этом из 1 см2 кожи получали 2—3 млн. клеток. Обработка традиционным способом - путем дробной трипсинизации ткани приводило в обоих случаях к потере клеток и несмотря на их высокую жизнеспособность получали не более 1,5 млн. клеток из 1 см2 кожи.
В настоящее время в практике лечения ожогов используются фибробласты человека. Поскольку фибробласты продуцируют факторы роста, молекулы внеклеточного матрикса и таким образом стимулируют пролиферацию эпидермоцитов. Их применение оправдано в случаях реконструкции кожного покрова при сохранившихся очагах эпителиальных клеток. В настоящее время существует несколько методик получения первичной суспензии фибробластов из кожи взрослых доноров или из абортивного материала. Сравнение разных методов показало, что для выделения фибробластов кожи взрослого человека наилучшим является метод кожных эксплантов, поскольку позволяет получить монослой клеток даже при очень ограниченном количестве донорского материала. Методы дробной и холодовой ферментации дермы оказались более трудоемкими и малоэффективными. Поэтому для выделения аутофибробластов из кожи взрослого человека предпочтительнее использовать метод тканевых эксплантов.
Результаты экспериментов по выбору метода получения эмбриональных аллофибробластов показали, что наибольшее число жизнеспособных клеток выделяется путем обработки кожно-мышечных фрагментов 0,0125—0,05%-ным раствором трипсина при температуре +4°С в течение 18—24 ч. Доля жизнеспособных клеток при этом составляла 80—92%. Использование эмбриональных клеток давало возможность через 3—4 сут получить клеточный монослой.
В то же время фибробласты кожи взрослого донора начинали формировать монослой лишь на 7-е—10-е сутки и только при использовании качественных питательных сред. Высокая пролиферативная активность и более высокий жизненный потенциал эмбриональных фибробластов позволяют считать их вполне перспективными для аллотрансплантации. Кроме того, эмбриональные фибробласты способствуют безрубцовому заживлению ран (Sullivan K.M., 1995) и значительно снижают собственную иммуногенность при пассировании in vitro (Саркисов Д.С. и др., 1995).
За время работы было получено около 60 штаммов диплоидных фибробластов. Из них 5 штаммов — из лоскутов кожи взрослого человека и 25 штаммов эмбриональных фибробластов — из кожно-мышечной ткани или тканей легкого эмбрионов.
Поскольку фибробласты, полученные из дермы взрослого человека, во всех случаях не отличались высокой пролиферативной активностью и требовали обогащения питательной среды, а кроме того, имели достаточно ограниченный срок жизни (до 20—25 пассажей in vitro), то они использовались нами только для аутотрансплантации и в дальнейшей перспективе не рассматривались. Фибробласты эмбрионов в отличие от фибробластов дермы взрослого человека обладали лучшими ростовыми свойствами, индекс пролиферации составлял от 2,0 до 3,0 клеток. В наших опытах диплоидные клетки сохраняли высокие культуральные свойства до 45—50 пассажей in vitro (время наблюдений). При сравнении свойств фибробластов, полученных из кожно-мышечной ткани или ткани легкого, последние отличались высокой жизнеспособностью, стабильностью и культуральными свойствами (индекс пролифера ции достигал 3,0—4,0).
Все штаммы клеток были представлены типичными фибробластоподобными клетками вытянутой формы с отростками на полюсах. Существенных различий в ультраструктуре фетальных клеток разных штаммов или клеток на 5—40 пассажах не обнаружено. Культуры клеток эмбриональных фибробластов, прошедшие предварительный контроль на наличие контаминантов и имеющие хо рошие культуральные характеристики, были заложены на хранение на 3—12 пассажах в количестве не менее 10 ампул в качестве посевных или исход ных банков культур клеток. Фибробласты легкого эмбриона человека, фетальные кожно-мышечные фибробласты, отличавшиеся стабильностью свойств, были заложены дополнительно по 30—300 ампул в качестве рабочих банков, полученных из аттестованных посевных банков.
Согласно данным литературы, использование для восстановления кожного покрова альтернативного источника трансплантируемых клеток — фибробластов — дает ряд преимуществ. Установлено, что фибробласты посредством синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса стимулируют как адгезию кератиноцитов, так и пролиферацию их с последующей дифференцировкой. Преимущество использования фетальных аллофибробластов обусловлено, кроме того, рядом других причин. Прежде всего известно, что фетальные фибробласты при субкультивировании in vitro утрачивают поверхностные антигены гистосовместимости, что снижает вероятность отторжения трансплантата. Кроме того, рядом авторов выявлено, что фетальные фибробласты способствуют заживлению ран без образования рубцов, что обусловлено их секрецией и метаболизмом. В настоящее время установлено, что эмбриональные фибробласты не просто более эффективны в отношении стимуляции эпидермоцитов, но и в отличие от аналогичных клеток взрослого человека активно мигрируют в зоны механического повреждения клеточного слоя. В связи с вышеизложенным, представляло интерес изучение возможности использования аттестованных фибробластов на примере клеток легкого эмбриона человека при лечении ран различной этиологии.
Использование клеток из аттестованных банков культур клеток позволит не только иметь однородный по биологическим и генетическим свойствам материал, но и стандартизировать метод лечения, обеспечивая стандартными линиями клеток медицинские учреждения, не имеющие опыта работы с культурами клеток. Соз дание банков культур клеток в большом количестве ампул и хранение их неограниченно долго при температуре жидкого азота дает возможность быстро и в достаточном количестве обеспечивать медицинские исследования культивируемыми фибробластами не только в повседневной практике, но и при чрезвычайных ситуациях.
Перед трансплантацией культивированных клеток, клеток эмбриона или аппликацией цитокинов рана тщательно промывалась раствором антисептика (1% раствор борной кислоты, 1:5000 раствор фурацилина), высушивалась тампоном. Культивированные фибробласты наносили на раневую поверхность вместе с целлофановой подложкой площадью от 5см2 до 100см2, рану закрывали асептической повязкой. Первую перевязку проводили на 3 сутки после трансплантации культуры фибробластов, рану вновь закрывали культурой фибробластов или выполняли аутодермопластику перфорированным кожным лоскутом или закрывали асептической повязкой с антисептиком или индеферентной мазью.
В среднем проводили 1 - 2 трансплантации фибробластов в течение 3-5и суток, в последующие дни перевязки проводили с антисептиком или индеферентной мазью. На перевязках обращалось внимание на состояние раневого отделяемого, грануляций, краевой и островковой эпителизации, на наличие отека, инфильтрации, Ph раны, температуры поверхности раны и на скорость эпителизации.
Из лаборатории института Иммунологии СО РАМН, от обследованного 12 -18 недельного эмбриона получали культуральный материал в специальном полужидком изоосмотическом геле. Доказано, что в эмбриональной ткани содержатся: эпидермальный фактор роста; фактор роста кератиноцитов, фактор роста фибробластов, интерлейкины (ИЛ – 1, 3, 4, 6, 10), интерферон гамма.
Клеточный материал в стерильных стеклянных флаконах (емкостью 20мл) из нейтрального стекла, закрытый стерильными резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками хранится при температуре +4С. Клетки остаются живыми в запаянных флаконах в течение недели. При вскрытии флакона за этот период времени, требуется только соблюдения асептики. Клетки в гелеобразном состоянии наносили на раны, закрывали асептической повязкой. Первую перевязку проводили на следующий день. При отсутствии гнойного отделяемого, вновь проводили трансплантацию клеток кожи. Последующие перевязки осуществляли через день. В зависимости от эффекта лечения проводили от 5 до 10 трансплантаций клеток кожи эмбриона.
В стерильный флакон вводили 7,5 тыс. ЕД гепарина, забирали 300 мл. венозной крови больного, доставляли в течение часа в лабораторию. Инкубировали 45 минут при температуре 37С. После чего лейковзвесь собирали в отдельный флакон, цинтрифугировали при 1000 об/мин 20 минут и удаляли надосадок. Клетки лейковзвеси (лимфоциты, моноциты) помещали в культуральную среду, добавляли интерлейкин –2, и культивировали при температуре 37С в СО2 инкубаторе. После окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием, а собранный надосадок подвергали стерелизуюшей фильтрации. Полуавтоматом фильтрат разливали по 5 мл в стеклянные флаконы (емкостью 20мл) из нейтрального стекла, закрывали стерильной резиновой крышкой, алюминиевым колпачком и хранили до использования при температуре –18С. Для получения кондиционных сред использовали либо аутологичные мононуклеарные клетки пациентов, либо мононуклеарные клетки здоровых доноров. Полученные кондиционные среды содержат интерлейкин –2, (ИЛ –2), интерлейкин –1 (ИЛ –1), фактор некроза опухоли (ФНО-а), интерферон –гамма, (ИФ-v), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ). Концетрация ИЛ- 2 в кондиционной среде составляет – 123 10 Ед/мл., ФНО-a – 1280 300 рg/мл., ИЛ – 1 – 450 80 pg/мл. Срок хранения кондиционной среды при –18С. – 6 месяцев, но даже однократное размораживание снижает активность среды на 10 –15%.
Цитокины наносили на стерильную марлевую салфетку и закрывали рану. Первую перевязку проводили на следующий день. При отсутствии гнойного отделяемого, рану вновь закрывали повязкой с кондиционной средой. Последующие перевязки осуществляли через день. В зависимости от эффекта лечения проводили от 5 до 10 перевязок с цитокинами.
Основным критерием оценки течения раневого процесса является его клиническая характеристика. В процессе лечения гнойных ран клинически оценивались:
1. Сроки исчезновения отека и перифокальной инфильтрации мягких тканей (в сутках).
2. Сроки появления грануляционной ткани в ране (в сутках).
3. Сроки появления краевой эпителизации (в сутках).
4. Сроки появления островковой эпителизации.
5. Сроки полной эпитализации раны (в сутках).
7. Сроки нормализации температуры тела (в сутках).
1. Сроки нормализации количества лейкоцитов в периферической крови, лимфоцитов и моноцитов.
Исследование уровня общего белка крови проводилось рефрактометрическим методом. Исследования выполнялись на 1, 5, 10 сутки наблюдения.
Бактериологические исследования проводились в баклаборатории 333 ОВКГ Сиб.ВО. Материал из раны брался стерильным тампоном и в стерильной пробирке доставлялся в лабораторию, где пересевался на питательные среды.
Затем материал помещают в термостат (температура 37С). Через сутки подсчитывают число колоний по всей чашке:
а) до 10 колоний - 1 степень обсемененности.
б) от 10 до 25 колоний - 2 степень обсемененности.
в) от 25 до 50 колоний - 3 степень обсемененности.
г) от 50 колоний и больше - 4 степень обсемененности.
Исследования на раневую микрофлору проводилось согласно приказу Минздрава N 535 от 22 апреля 1985 г. " Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".
Цитологическая диагностика важна на любом этапе заживления раны. Она позволяет судить о характере морфологических изменений, состоянии неспецифических факторов защиты, четко определять фазы течения раневого процесса. Мы получали цитологические отпечатки с раневой поверхности по методу М. П. Покровской и М. С. Макарова (1942). Цитологию эксудата изучали с помощью мазков - отпечатков. Препараты окрашивали по Романовскому. При исследовании каждого отпечатка подсчитывали не менее 200 клеток. Подсчитывали количество - фибробластов, лимфоцитов, макрофагов, эпителиальных клеток, моноцитов, эозинофилов, нейтрофилов, дегенерирующих клеток, наличие микрофлоры.
Гистологическое исследование грануляционной ткани проводилось в патологоанатомической лаборатории Сибирского Военного округа. Материал забирали до начала лечения предложенными методами, в первые сутки лечения 3, 5, 7, 10. Препараты окрашивали гематоксилин – эозином и по Ван Гизону. В грануляционной ткани исследовали наличие капилляров, сосудистых петель, наличие фибробластов и эпителиальных клеток, лейкоцитов, эозинофилов и макрофагов. Определяли тип воспалительной регенерации.
Развитие иммуносупрессии — закономерная реакция иммунной системы на заболевание или тяжелую травму. В первые же минуты после такого воздействия возникают первичные изменения факторов неспецифической резистентности, выражающиеся в усилении секреции лизосомальных катионных белков, вследствие чего уменьшается число нейтрофилов, содержащих эти белки. Функциональная активность фагоцитов падает. Одновременно увеличивается лизосомальная активность сыворотки крови за счет поврежденных фагоцитов.
Оценка иммунологической реактивности включала в себя количественную характеристику Т-клеточного звена иммунитета в системе фагоцитирующих клеток. Определяли общее количество активных Т-лимфоцитов, баланс иммунорегуляторных клеток (индукторно-хелперной и эффекторно-супрессорной субпопуляций Т-лимфоцитов, а также их соотношение).
Роль фагоцитов в патогенезе воспаления далеко не исчерпывается их способностью очищать очаг от инфекции и других нарушителей гомеостаза. Течение воспаления в значительной мере зависит от способности фагоцитов вырабатывать эффекторные молекулы с флокогенными свойствами.
Поэтому изучение свойств фагоцитов в клинике не должно ограничиваться оценкой их поглотительной и микробицидной активностью, но важно знать их функциональные резервы.
Исследования второй половины XX века выявили в лейкоцитах ряд факторов неспецифической резистентности организма. Среди них лизоцим, лактоферрин, миелопероксидаза, неферментные катионные белки. Доказана ан тибактериальная функция указанных веществ. Наименее ис следованы неферментные катионные белки, открытые в 60-х годах нашего века во время поисков антибактериальных струк тур в лейкоцитах. Неферментные катионные белки содержатся во вторичных, специфических гранулах полиморфноядерных лейкоцитов. По своей природе катионные белки являются продуктами частичного протеолиза ядерных гистонов, богатых цистеином и лизином. Им присущ широкий спектр биологических эффектов. Так, в малых концентрациях они активируют обменные процессы в клетке, в больших — угнетают их. Они способны повреждать клеточные и сосудистые мембраны. Последнее дало повод отнести их к "медиаторам воспаления" Неферментные катионные белки в лейкоцитах исследуют цитохимическим методом с применением красителей — прочного зеленого либо бромфенолового синего. Неферментные катионные белки определяли по следующей методике. Делали мазки отпечатки с раны, фиксировали спиртом. В лаборатории иммунологии 333 Окружного Военного клинического госпиталя окрашивали их бромфеноловым синим. На свежие мазки крови наносили 5 –6 капель сульфосалициловой кислоты и фиксировали в течение 1,5 минуты, затем тщательно промывали препарат дистиллированной водой и высушивали, Окрашивали 0,1% раствором бромфенолового синего в течение 1-2 минут, нанося на мазки по 5 –6 капель красителя. Краситель смывали несколькими каплями баратного буфера. После тщательного отмывания дистиллированной водой, мазки высушивали и докрашивали раствором основного фуксина в течение 1– 2 секунд. Остатки красителя отмывали проточной водой и после высыхания микроскопировали с увеличением х90 с масляной иммерсией. Катионный белок выявляется в цитоплазме нейтрофилов в виде синих гранул. При оценке активности внутриклеточного фермента чаще пользовались полуколичественным анализом результатов, используя принцип Астальды, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делятся на 4 группы:
Подсчитывали 100 клеток, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножали на соответствующие данной группе количество плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Удобнее использовать средний цитохимический коэффициент (СЦК). С этой целью количество полученных единиц активности делят на 100 клеток. Нормальные величины ЛКТ у здоровых людей в нейтрофилах обнаружено 120 – 170 ед или СЦК 1,2 1,7, при этом не отмечено различий у здоровых лиц обоего пола. Необходимые реактивы:
Для анализа заживления раны мы за основу взяли формулу Л.П. Поповой исследуя динамическое измерение площади раневой поверхности... По Л.П. Поповой (1942) на рану накладывают стерильную пластинку целлофана и на нее наносят контуры раны, подсчитывают площадь раны. Измерения повторяют через 6-10 дней и вычисляют процент уменьшения площади раневой поверхности за сутки по формуле.
(So - Sn)*100
Sc = -------------------
Sо * t
Sc - суточное уменьшение площади раны; So - исходная площадь раны ; Sn - площадь раны в настоящий момент; t - число дней между первым и поледующим измерением. При нормальном течении заживления суточное уменьшение площади раны составляет 4%.
Стандартная обработка вариационных рядов включала подсчет значений арифметических величин (М) и ошибок средних (m). Таблицы и рисунки содержат информацию в виде значений М+m. Статистическая обработка полученных результатов выполнялась на персональной ЭВМ по программе «Статистика 5.0» и определением достоверности различий по t – критерию Стьюдента.
Таким образом, круг примененных методов исследований, включающих клинические, иммунологические и морфологические методы оценки особенностей течения раневого процесса, клинические и биохимические методы оценки проявления общей интоксикации, бактериологические методы контроля за раневой микрофлорой, являются адекватным при изучении характера патологических изменений в гнойной ране и направленности реакции макроорганизма в ответ на воспаление. Эти методы позволяют с разных сторон оценить эффективность предлагаемых новых технологий в лечение ран, что подтверждает системность подхода к изучаемой проблеме.
Для лечения ран мы использовали культивированные ауто- и аллофибробласты, клетки кожи эмбриона, кондиционные среды (цитокины). Приготовление культивированных фибробластов, эмбриональных клеток кожи и цитокинов подробно описаны во второй главе.
Методика трансплантации культивированных фибробластов следующая. Каждая перевязка начиналась обработкой раневой поверхности раствором антисептика, например, раствором гипохлорита натрия, раствором фурацилина, механического удаления с поверхности раны отделяемого, наложений фибрина. Раневая поверхность тщательно осушивалась. На раневую поверхность наносили целлофановый диск с фиксированными на нем фибробластами или гель с фибробластами и закрывали рану асептической повязкой. Первую перевязку проводили на третьи сутки. При необходимости повторно проводили трансплантацию фибробластов. При выраженной краевой эпителизации и чистых грануляциях, ограничивались одной трансплантацией, максимум двумя. Небольшие раны до 50см2, закрывали асептической повязкой с раствором фурацилина или 1% раствором борной кислоты. При обширных ожоговых ранах (10-15% поверхности тела) на третьи сутки после трансплантации фибробластов выполняли аутодермопластику расщепленным, перфорированным (1 : 4) кожным лоскутом. Последующие перевязки проводили через день.
Методика трансплантации клеток кожи эмбрионов осуществлялась следующим образом. Рану обрабатывали раствором антисептика, механически удаляли гной, детрит. При трансплантации клеток кожи эмбриона не дожидались полного очищения раны от гнойно-некротического детрита. Рану закрывали гелем с клетками кожи. Поверх геля накладывали перфорированный целлофан для уменьшения пропитывания повязки гелем. Первую перевязку проводили на следующий день и вновь наносили клетки кожи эмбриона. В зависимости от скорости эпителизации раны перевязки проводили ежедневно или через день. Всего проводилось у одного больного от 5 до 10 трансплантаций клеток кожи эмбриона. Лечение проводили ограниченных ран до 10 – 50 см2 или множественных ран общей площадью до 1 - 2% поверхности тела.
Методика лечения ран цитокинами значительно не отличалась от предыдущих и заключалась в следующем. Рану обрабатывали раствором антисептика и закрывали марлевой салфеткой или шариками, пропитанными кондиционной средой. При необходимости перевязки проводили один – два раза в день, ежедневно. Общее количество аппликаций на одного больного приходилось от 5 до 10. Все манипуляции выполнялись в условиях перевязочной с соблюдением асептики.
Под нашим наблюдением находилось 126 больных с различными ранами после ожогов, вскрытия флегмон, с трофическими язвами (табл. № 2.1). Из них на лечении находилось женщин 13 человек, мужчин 113. В возрасте до 50 лет - 120 пациентов, после 50 лет 6 больных. В опытной группе было пролечено предложенными методами 52 человека, в контрольной 74 пациента (табл. № 2.2). Больных с ранами после ожогов всего пролечено 41 пациент, из них предложенными методами 17 больных, пациентов с ранами после вскрытия флегмон 57, предложенными методами 22 человека. С трофическими язвами лечилось всего 28 больных, предложенными методами 13 человек. Лечение ран фибробластами проведено у 22 больных, эмбриональными клетками у 17 пациентов и цитокинами у 13 человек.
Всех больных брали на лечение предложенными методами исключительно тогда, когда были использованы традиционные методы, а эффекта от их лечения не получено. Длительность лечения до предложенных технологий культивированными клетками или цитокинами осуществлялась до 3-х недель у 11,2% больных, до месяца у 30,8%, до 2-х месяцев у 25%, до 3 месяцев у 17,4% (табл. № 2.3). Основная группа больных лечилась от 1 месяца до 3-х месяцев и составила 73,2% больных. Больным местно применялись ферменты, сорбенты, мази на водорастворимой основе. Проводилось общее лечение: инфузионная терапия по показаниям, физиолечение, ГБО. Несмотря на проводимое лечение эпителизации раны не наступало.
Площадь ран у больных в опытной группе представлена в таблице №2.4. У основной группы больных площадь раны была от 20 до 50 см2. На первых этапах работы лечение ран проводили на небольших по площади ранах, для детального изучения репаративных процессов. При получении эффекта от применения культивированных фибробластов, последние стали применять на обширные ожоговые раны площадью до 10-15%. На такую площадь требовалось от 10 до 12 чашек Петри с фибробластами. Лечение фибробластами проводили и на ранах до 50 – 100 см2. Лечение эмбриональными клетками кожи проводили на ограниченных ранах от 20 до 100см2 и трофических язвах. Получив хороший эффект от применения эмбриональных фибробластов и клеток кожи эмбриона, стало ясно, что наступает активация макрофагальных клеток в самой ране. Было принято решение провести исследования - влияния цитокинов на активацию репаративных процессов в ране. Цитокины применяли чаще всего при трофических язвах и ограниченных ранах.
В опытной группе до предложенных новых методов, кроме консервативного лечения применялись и оперативные методы лечения – аутодермопластика. В таблице № 2.5. представлено количество и процент оперированных больных 20 (39,2%) до предложенных методов лечения, причем 9,6% из них оперировалось дважды, но пересаженные лоскуты на ранах лизировались.
Всем больным в процессе лечения проводились клинические и биохимические анализы крови, измерялась температура тела, температура раневой поверхности. Проводились иммунологические, бактериологические, гистологические, цитологические исследования.
Бактериологическое исследование включало в себя качественное и количественное изучение раневой микрофлоры в динамике. Исследования проводились на 1,3,5,7 сутки после трансплантации культивированных клеток или аппликации цитокинов. При исследовании исходного бактериологического материала выявили, что у больных перед началом лечения фибробластами чаще выделяли стафилококк в 36,8% случаев. У больных леченных эмбриональными клетками стафилококк выделен у 38,6% пациентов, у больных леченных цитокинами стафилококк выделен у 35,4%. Соответственно палочка сине-зеленого гноя у данных категорий больных была выделена у 13,4%, у 14,6% и у 16,4% случаев. Остальные микроорганизмы были выделены реже, поэтому в таблицу не включены. Роста микробов в ранах не выявлено во второй группе – в 32,5% случаях, в третьей у 26,8% пациентов и в четвертой у 23,1% больных. Степень обсемененности микроорганизмами в начале лечения не превышала 104.
В опытных группах на 3 сутки после трансплантации культивированных клеток микробный пейзаж раны представлен следующим: при лечении фибробластами посевы оказались стерильными – роста микробов не получено, при лечении эмбриональными клетками золотистый стафилококк выделен у 11,8% больных, при лечении цитокинами 7,6%. Рs. аeruginosae при лечении эмбриональными клетками выделена у 5,9%, при лечении цитокинами у 15,3%. Роста микробов не выявлено во второй группе 100%, в третьей 82,3%, в четвертой 77,1%. Степень обсемененности микроорганизмами 102.
В опытных группах на пятые сутки микрофлора в процессе лечения высевается редко и встречалась в единичных случаях (Рs. аеruginosае и Staph. аuгеus). Интересно то, что с третьих суток после трансплантации фибробластов посевы становятся стерильными, при трансплантации эмбриональных клеток подобная картина наступает на 7 сутки, при аппликации цитокинов на 5 сутки. Эффективность противовоспалительного предложенного способа лечения трофических язв и длительно незаживающих ран оценивалась по бактериологическим анализам и приведена в таблице № 3.1.
|
Методы лечения |
Микробы |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
|
(Б) фибробласты |
St. aureus Ps. aerugin. Роста нет |
36,8% 13,4% 32,5% |
- - - |
- - - |
- - - |
|
(В) Эмбриональные клетки |
St. aureus Ps. aerugin. Роста нет |
36,8% 14,5% 26,8% |
11,8% 5,9% 82,3% |
- 5,9% 94,1% |
- - - |
|
(Г) Цитокины |
St. aureus Ps. aerugin. Роста нет |
35,4% 16,4% 23,1% |
7,6% 15,3% 77,1% |
- - - |
- - - |
В контрольной группе в первые сутки исследования выделили Staph. aurеus 32 больных (43,7%), Strep. spp у 3 (4,3%) пациентов, Рs. aeruginоsае у 7 (9,3%), E. Coli 4 (5,7%), Enterobacter 3 (4,1%), Citrobacter 2 (2,3%), ассоциация микробов отмечена у 4 пациентов (5,4%). В 19 (25,6%) случаях посевы были отрицательными - роста микробов не обнаружено.
На 3-и сутки отмечается увеличение удельного веса грамм-отрицательной флоры Рs. aeruginоsае (11,2%). Citrobacter (5,1%), E.coli (6,2%), у 7(9,4%) пациентов отмечена ассоциации микробов. Ведущее место занял Stаph. аurеus (52,3%). Роста микробов в ране не выявлено у 15,8% пациентов.
На 7 сутки в контрольной группе из всего микробного пейзажа раны выделяется по-прежнему Staph. аurеus (48,9%), а из грамм (-) Рs. aeruginosae (12,7%), E. coli 5,8%, Enterobacter (3,4%). Число микробных ассоциаций осталось прежним (9,6%). Роста микробов не выявлено у 19,6% больных. Степень обсемененности ран в каждом случае, начиная с 1 суток, оставалась 103, 104 (табл. № 3.2).
Микробы |
1 сутки |
3 сутки |
7 сутки |
10сутки |
Всего |
St. aurеus |
32(43,7%) |
38 (52,3%) |
36 (48,9%) |
34(44,6%) |
35(47,4%) |
Рs. aerugin |
8 (9,3%) |
8 (11,2%) |
9 (12,7%) |
10(13,8%) |
9(11,7%) |
E. coli |
4 (5,7%) |
5 (6,2) |
5 (6,2%) |
4(5,9%) |
4(6,0%) |
Enterobacte |
3 (4,1%) |
- |
3 (3,4%) |
3(4,3%) |
3(3,9%) |
Citrobacter |
2 (2,3%) |
4 (5,1%) |
- |
2(3,1%) |
2(3,5%) |
Ассоциация |
4 (5,4%) |
7 (9,4%) |
7 (9,6%) |
5(7,0%) |
6(7,8%) |
|
Роста нет |
21(25,6%) |
12(15,8%) |
15(19,6%) |
16(21,3%) |
15(20,6%) |
Итого: |
74(100) |
74(100) |
74(100) |
74(100) |
74(100) |
Таким образом, сравнение обнаружило в опытной группе снижение частоты и степени вторичного инфицирования ран, раннее подавление микрофлоры особенно при трансплантации фибробластов. Отсутствие высокой степени обсемененности в опытной группе на 3 - 5 сутки создает возможность для закрытия ран кожным лоскутом.
Наличие гнойно-некротического процесса в мягких тканях проявлялось совокупностью общих и местных признаков воспаления. Общая реакция организма была выражена пропорционально масштабам и характеру нагноительного процесса. Длительно незаживающие раны, образовавшиеся после оперативных вмешательств по поводу абсцессов и флегмон, представляли собой этап развившегося воспалительного процесса с присущими ему характерными признаками: отечностью и инфильтрацией краев раны, гнойным отделяемым, наличием некротических масс и наложением фибрина, гиперемией и мацерацией кожи. Трофические язвы чаще всего были представлены как кратеробразные раны, без грануляций, с омозолелыми краями.
После предпринятого лечения предложенными технологиями боли исчезали: при лечении эмбриональными клетками в первые сутки, на третьи сутки при лечении фибробластами и цитокинами (табл. 3.3.).
Отек и инфильтрация тканей исчезали на 3 сутки после начала лечения клетками кожи эмбриона, на пятые сутки после начала лечения фибробластами и цитокинами. При лечении традиционными методами отек исчезал на 17 сутки.
Грануляционная ткань в ране появилась на 2 сутки при лечении эмбриональными клетками кожи и аппликации цитокинов.На третьи сутки при трансплантации цитокинов. У больных контрольной группы грануляционная ткань появилась на 14 сутки.
Появление краевой эпителизации в ране происходило на 2 сутки при трансплантации клеток кожи эмбриона и аппликации цитокинов. После трансплантации фибробластов краевая эпителизация появляется на третьи сутки и на 13 сутки в ранах контрольной группы больных.
Островки эпителия появлялись на пятые сутки после трансплантации фибробластов, на седьмые после пересадки клеток кожи эмбриона, единичные случаи наблюдали на ограниченных ранах при применении цитокинов. Следует заметить, что появившиеся островки эпителия так же внезапно могли исчезнуть.
Полной эпителизации длительно не заживающих ран без применения оперативных методов лечения удалось достичь: при применении эмбриональных клеток и цитокинов на 12 сутки, при применении фибробластов на 15 сутки. При лечении ран традиционными методами заживление ран происходило на 32 сутки. При лечении трофических язв в опытных группах данный показатель равен 20 – 25 суткам, в контрольной он равнялся 39 суткам.
|
Методы лечения |
Исчезновение боли |
Купирование отека |
Появление грануляций |
Появление краевой эпителизации |
Появление островковой эпителизации |
Заживление |
|
(А) традиционный |
18,0±1,6 сутки |
17,2±1,4 сутки |
14,1±1,3 сутки |
13,2±1,1 сутки |
Нет |
32,3±2,6 сутки- |
|
(Б) фибробласты |
3,1±0,23 сутки * |
5,2±0,24 сутки * |
3,1±0,22 сутки * |
3,2±0,2 сутки * |
7,1±0,6 сутки |
12,2±1,1 сутки * |
|
(В) эмбриональные клетки |
1,2±0,09 сутки * |
3,2±0,12 сутки * |
2,1±0,1 сутки * |
2,1±0,1 сутки * |
5,1±0,3 сутки |
12,2±1,3 сутки * |
|
(Г) цитокины |
3,0±0,23 сутки * |
5,1±0,34 сутки * |
3,1±0,24 сутки * |
2,1±0,16 сутки * |
Редко |
12,1±1,1 сутки * |
Примечание: * - звездочкой обозначены величины, достоверно отличающиеся от величин контрольной группы.
При исследовании температуры тела и температуры поверхности раны, ожидали осложнений связанных с применением культуры фибробластов, эмбриональных клеток кожи или цитокинов. В контрольной и опытной группах больных, показатель температуры тела достоверно не отличался и в процессе лечения был все время нормальными, как до применения предложенных методов так и после трансплантации культивированных фибробластов, эмбриональных клеток кожи и цитокинов (табл. 3.4, 3.5.).
|
Методы лечения |
Исходн. |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
А (74) |
36,4±0,26 |
36,5±0,29 |
36,1±0,32 |
36,1±0,29 |
36,4±0,29 |
36,5±0,28 |
|
Б (22) |
36,7±0,28 |
З6,6±0,31 |
36,7±0,31 |
36,7±0,23 |
36,4±0,32 |
З6,5±0,27 |
|
В(17) |
36,5±0,27 |
36,4±0,28 |
36,8±0,34 |
36,8±0,25 |
36,7±0,29 |
36,5±0,31 |
|
Г(13) |
36,6±0,31 |
36,7±0,32 |
36,6±0,33 |
36,7±0,34 |
36,6±0,32 |
36,6±0,34 |
Примечание: (А) традиционный способ, (Б) местное лечение культурой фибробластов, (В) местное лечение эмбриональными клетками, (Г) лечение цитокинами.
|
Метод лечения |
Исходные |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
А (74) |
35,6±0,3 |
35,5±0,31 |
35,3±0,31 |
36,1±0,29 |
35,4±0,29 |
З5,4±0,31 |
|
Б (22) |
35,3±0,3 |
З5,3±О,29 |
35,2± 0,3 |
35,1±0,31 |
35,1±0,28 |
З5,1±0,29 |
|
В(17) |
35,3±0,2 |
35,3±0,3 |
35,2±0,3 |
35,2±0,28 |
35,1±0,31 |
35,1±0,32 |
|
Г(13) |
35,4±0,3 |
35,4±0,32 |
35,4±0,29 |
35,2±0,3 |
35,2±0,34 |
35,1±0,33 |
Примечание: А – группа больных у которых лечение проводилось традиционным способом; Б – группа больных, лечение которым проводилось культивированными фибробластами; В – группа больных, лечение которым проводилось эмбриональными клетками; Г – больные, лечение которым проводилось цитокинами.
При исследовании показателей лейкоцитов в периферической крови отмечено повышенное содержание их в начале лечения во всех группах. В процессе лечения содержание их достоверно начало снижаться в опытных группах. Особенно при применении цитокинов уже на первые сутки и на третьи сутки при лечении фибробластами и эмбриональными клетками кожи. У больных леченных традиционными методами данный показатель приходил к норме на 14 сутки. Показатель постепенного снижения лейкоцитов периферической крови показывает отсутствия осложнений при применении предложенных технологий (табл. 3.6).
|
Метод лечения |
Исходн. |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
А (74) |
11,4±0,10 |
11,6±0,1 |
12,4±0,2 |
11,1±0,11 |
12,2±О,12 |
11,5±0,2 |
Б (22) |
11,5±0,11 |
10,8±0,1 |
9,7±0,13* |
8,7±0,11* |
8,4±0,12* |
8,5±0,13* |
В (17) |
10,6±0,3 |
10,5±0,2* |
8,9±0,2* |
8,8±0,13* |
8,6±0,13* |
7,5±0,2* |
Г(13) |
10,7±0,2 |
9,5±0,11* |
7,7±0,14* |
7,7±0,13* |
7,6±0,11* |
6,5±0,1* |
Примечание: лейкоциты периферической крови (х109/л). А – группа больных, у которых лечение проводилось традиционным способом; Б – больные лечение которым проводилось культивированными фибробластами; В – больные, лечение которым проводилось эмбриональными клетками; Г – больные, лечение которым проводилось цитокинами. * - звездочкой обозначены величины, достоверно отличающиеся от величин контрольной группы.
С целью выявления предложенных новых технологий на репаративные процессы в ране и в целом организме исследовали клеточный иммунитет. На первом этапе, исследовали процентное содержание лимфоцитов периферической крови, где выявили снижение их в группах на 42-62% до начала лечения. При лечении предложенными методами к 10 суткам показатель лимфоцитов постепенно приходил к норме. В контрольной группе он оставался пониженным до 13 суток (табл. 3.7.).
Показатели лимфоцитов в периферической крови у больных в процессе лечения длительно незаживающих ран в % .
|
Методы лечения |
Сутки лечения |
|||||
|
Исходн. |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
|
А (74) |
19,11,2 |
19,21,3 |
19,11,1 |
20,31,2 |
19,31,2 |
20,11,6 |
|
Б (22) |
17,21,1 |
17,41,2 |
18,21,2 |
23,21,6* |
26,41,7* |
27,31,4* |
|
В(17) |
18,11,2 |
20,11,3 |
23,21,3* |
24,11,5* |
25,11,3* |
25,41,5* |
|
Г(13) |
19,31,2 |
20,21,5 |
21,11,2 |
25,11,3* |
26,21,7* |
26,11,3* |
Примечание: А – группа больных у которых лечение проводилось традиционным способом, Б – больные лечение которым проводилось культивированными фибробластами, В – больные лечение которым проводилось эмбриональными клетками, Г – больные лечение которым проводилось цитокинами. * - звездочкой обозначены величины, достоверно отличающиеся от величин контрольной группы.
|
Методы лечения |
Сутки лечения |
|||||
|
Исходн. |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
|
А (74) |
9,1±0,1 |
9,2±0,3 |
9,1±0,1 |
10,2±0,3 |
9±0,3 |
8±0,16 |
|
Б (22) |
10,2±0,3 |
10,1±0,2 |
9,2±0,2 |
8,3±0,2* |
5,1±0,3* |
4,1±0,1* |
|
В(17) |
8,2±0,2 |
8,1±0,3 |
7,1±0,1* |
7,3±0,1* |
5,3±0,2* |
4,2±0,3* |
|
Г(13) |
8,1±0,2 |
8,2±0,2 |
7,2±0,2* |
5,3±0,3* |
5,2±0,3* |
3,2±0,1* |
Примечание: А – группа больных, у которых лечение проводилось традиционным способом; Б – больные лечение которым проводилось культивированными фибробластами; В – больные лечение которым проводилось эмбриональными клетками; Г – больные лечение которым проводилось цитокинами. * - звездочкой обозначены величины, достоверно отличающиеся от величин контрольной группы.
При исследовании моноцитов в периферической крови отмечено повышенное содержание их в начале лечения. В процессе лечения в опытных группах наступает их нормализация к пятым суткам, а при течении традиционными методами они приходили к норме на 16 сутки.
Большое значение в течение репаративных процессов в ране играет содержание белка в сыворотке крови. При исследовании данного показателя мы не заметили существенной разницы его по группам и в процессе лечения (табл. 3.9).
Показатели содержания белка в сыворотке крови у больных
в процессе лечения (г/л)
|
Методы лечения |
Сутки лечения |
|||||
|
Исходн. |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
|
А (74) |
61,4±2,2 |
62,1±2,3 |
62,2±2,6 |
62,5±2,6 |
62,3±2,7 |
62,1±2,5 |
|
Б (22) |
62,3±2,3 |
64,3±2,4 |
66,1±1,5 |
68,2±2,1 |
72,2±1,7 |
69,2±2,4 |
|
В(17) |
68,2±2,4 |
68,3±2,7 |
69,3±2,3 |
68,3±1,5 |
67,0±2,3 |
68,2±1,9 |
|
Г(13) |
69,4±2,2 |
69,2±2,7 |
69,2±2,5 |
69,3±2,3 |
68,1±2,7 |
69,0±2,3 |
Примечание: А – группа больных, у которых лечение проводилось традиционным способом; Б – больные лечение которым проводилось культивированными фибробластами; В – больные лечение которым проводилось эмбриональными клетками; Г – больные лечение которым проводилось цитокинами.
После выявления снижения процентного содержания лимфоцитов периферической крови у больных всех групп. Вторым этапом исследовали абсолютное количество лимфоцитов периферической крови и выявили их снижение от 6% до 12%. Третьим этапом выявления нарушения клеточного иммунитета исследовали Т клеточные популяции и выявили их нарушение у 24% больных. Общее количество Т- популяций во всех группах до начала лечения было нормальным или незначительно сниженным (1 группа). Т- лимфациты хелперно /индукторного типа во всех группах были снижены от 14 до 40% от нормы и пришли к норме в опытных группах: на 5 сутки при лечении цитокинами, на 7 сутки при лечении фибробластами и на 10 сутки при лечении эмбриональными клетками кожи. В контрольной группе они оставались незначительно пониженными до 15 суток от начала лечения. При исследовании эффекторно/супрессорной популяции Т – лимфацитов, имеется повышение их от 4% до 44% до начала лечения. В процессе лечения Т - лимфоциты эффекторно/супрессорной популяции постепенно к 10 суткам приходили к норме в опытных группах. В контрольной группе показатель данной популяции оставася незначительно повышенным до 14 дня лечения. Во всех группах соотношение Т-лимфоцитов хелперно/индукторного типа к Т-лимфацитам эффекторно/супрессорной популяции оставалось низким и приходило к норме в разных группах только к 10 – 15 суткам после начала лечения. По нашим данным иммунный статус у больных с длительно незаживаюшими ранами характеризуется дисбалансом иммунорегуляторных клеток с пареобладанием супрессии почти при нормальном содержании Т-хелперов. Такой тип иммунограмм характерен для локальных гнойных ран. Во второй и четвертой группах наиболее преобладает супрессорный тип иммунограммы, где на фоне снижения Т-хелперов, в два раза повышены Т- супрессеры. В данном случае иммунограммы характерны как для распространенного, так и локального воспалительного процесса (табл. 3.10).
|
Методы лечения |
Контроль |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
(А) абс. Кол-во лимфоцитов Р-РОК Т-РОК В-РОК Р-РОК/В-РОК |
1,6±0,1 27,1±1,3 52,2±2,03 28,0±1,2 0,9±0,1 |
1,6±0,11 29,2±1,6 57,0±2,03 28,1±1,2 1,1±0,2 |
1,6±0,11 29,2±1,7 57,3±2,03 29,2±1,2 1,0±0,2 |
1,5±0,12 31,0±1,7 60,1±2,01 28,3±1,3 1,1±0,3 |
1,6±0,1 29,4±1,2 55,3±2,1 28,0±1,4 1,1±0,4 |
1,6±0,11 28,1±1,3 58,2±2,01 28,3±1,2 1,1±0,2 |
|
(Б) абс. Кол-во лимфоцитов Р-РОК Т-РОК В-РОК Р-РОК/В-РОК |
1,6±0,12 35,4±1,5 55,3±2,3 34,0±1,7 1,0±0,11 |
1,7±0,12 36,3±1,7 55,4±2,2 32,3±1,8 1,1±0,09 |
1,7±0,12 37,2±1,9 58,0±2,6 30,3±2,1 1,2±0,11 |
1,8±0,13 40,2±2,5 60,3±2,7 28,1±1,7 1,4±0,12 |
1,8±0,14 47,2±2,3 66,1±2,4 20,3±1,5 2,3±0,13 |
1,8±0,12 50,1±3,4 68,3±2,6 20,1±1,4 2,5±0,15 |
|
(В) абс. Кол-во лимфоцитов Р-РОК Т-РОК В-РОК Р-РОК/В-РОК |
1,6±0,14 36,4±1,6 65,3±3,9 28,2±1,3 1,2±0,1 |
1,6±0,12 36,2±1,7 68,1±3,9 26,3±2,1 1,3±0,12 |
1,6±0,13 37,2±2,7 68,3±2,9 27,3±1,7 1,4±0,11 |
1,7±0,13 38,2±2,6 66,1±2,8 28,1±2,3 1,4±0,11 |
1,8±0,14 40,2±2,7 67,3±2,9 26,2±1,4 1,5±0,12 |
1,9±0,12 45,3±2,1 68,1±2,8 24,3±1,3 1,8±0,2 |
|
(Г) абс. Кол-во лимфоцитов Р-РОК Т-РОК В-РОК Р-РОК/В-РОК |
1,6±0,1 39,2±2,2 66,3±3,8 38»±2,6 1,0±0,07 |
1,8±0,12 41,1±3,2 68,0±3,8 34,1±2,6 1,2±0,09 |
1,8±0,13 44,4±2,2 64,0±3,3 34,2±2,6 1,2±0,08 |
1,9±0,12 53,0±3,3 65,3±2,9 32,1±3,7 1,6±0,11 |
1,9±0,15 50,3±2,3 66,1±3,5 28,0±2,7 1,7±0,1 |
1,9±0,11 48,2±2,2 70,1±3,8 22,3±1,6 2,1±0,12 |
При исследовании функциональной активности нейтрофилов, определяли лактат катионные белки (ЛКТ). Выявили, что исходные показатели ЛКТ при длительно незаживающих ранах низкое. При лечении традиционными методами данный показатель приходил к норме на 12 сутки, тогда, как при лечении фибробластами на 5 сутки, при применении эмбриональными клетками кожи и цитокинов на 3 сутки. Достоверного повышения лактат катионного белка у больных в опытных группах по отношению к контрольной не наблюдали (табл. 3.11).
|
Методы лечения |
Сутки лечения |
|||||
|
Исходн. |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
|
А (74) |
1,08±0,1 |
1,11±0,1 |
1,1±0,11 |
1,1±0,1 |
1,1±0,09 |
1,12±0,1 |
|
Б (22) |
1,09±0,1 |
1,08±0,1 |
1,12±0,1 |
1,24±0,12 |
1,27±0,1 |
1,4±0,12 |
|
В(17) |
1,08±0,1 |
1,09±0,1 |
1,26±0,12 |
1,36±0,12 |
1,38±0,13 |
1,42±0,1 |
|
Г(13) |
1,09±0,1 |
1,11±0,1 |
1,2±0,11 |
1,25±0,11 |
1,26±0,12 |
1,31±0,1 |
В мазках-отпечатках, взятых до лечения, преобладает детрит, большое количество до 50 –70% разрушенных нейтрофилов (рисунок 4) и обильная микрофлора, преимущественно внеклеточно. Содержание клеток крови составляло: полинуклеарных лейкоцитов – 79–95%, лимфоцитов – до 2%, макрофагов 1%. Такой характер цитограммы характерезуется по Кузину (1990) как дегенеративно - воспалительный.
На третьи сутки после трансплантации фибробластов в мазке отпечатке отмечалось снижение содержания нейтрофильных лейкоцитов до 56-75% (рисунок 5), лизис нейтрофилов значительно уменьшился и составлял 28–30%, появились полибласты до 3-7%, фибробласты и макрофаги 8-9%.
На 5 сутки в мазках отпечатках уменьшилось количество нейтрофилов, процент разрушенных уменьшился до 17 –21%, увеличилось количество фибробластов и эпителиальных клеток Клеточный состав мазков отпечатков характеризовался как воспалительно - регенеративного типа. (рисунок 6).
К 10 – 12 дню после трансплантации клеточных культур почти полностью исчезали нейтрофильные лейкоциты, увеличивалось количество эпителиальных клеток и лимфоцитов. Цитограмма принимала регенераторный тип воспаления. В контрольной группе больных цитограммы в процессе лечения до 18 суток оставались дегенеративно-воспалительными (табл. 3.12.).
|
Метод лечения |
Клетки крови и ткани |
1 сутки |
3 сутки |
5 сутки |
7 сутки |
10 сутки |
|
(А) |
Нейтрофилы Лимфоциты Макрофаги Фибробласты Эпителиальные клетки |
79% 2% 0,5% - - |
80% 1% 1% - |
78% 3% 1% - - |
89% 2% - - - |
87% 2% 1% - - |
|
(Б) |
Нейтрофилы Лимфоциты Макрофаги Фибробласты Эпителиальные клетки |
78% 2% - - - |
72% 4% 2% 2% 1% |
54% 7% 3% 3% 4% |
52% 6% 4% 5% 3% |
46% 6% 4% 4% 3% |
|
(В) |
Нейтрофилы Лимфоциты Макрофаги Фибробласты Эпителиальные клетки |
79% 2% 1% - - |
73% 4% 2% 1% 1% |
58% 6% 3% 2% 3% |
49% 6% 4% 2% 2% |
45% 6% 8% 6% группы |
|
(Г) |
Нейтрофилы Лимфоциты Макрофаги Фибробласты Эпителиальные клетки |
78% 1% 0,5% - - |
76% 4% 1% 2% - |
60% 10% 2% 2% 3% |
54% 11% 3% 5% 10% |
48% 10% 6% 6% группы |
Рис. 4 Цитограмма мазка отпечатка с раны в первые сутки лечения (описание в тексте). Окраска гематоксилин –эозином. Увеличение х 80.
Рис.5 Цитограмма мазка отпечатка с раны третьи сутки лечения (описание в тексте). Окраска гематоксилин –эозином. Увеличение х 80.
Рис. 6 Цитограмма мазка отпечатка с раны на пятые сутки лечения культивированными клетками кожи (описание в тексте). Окраска гематоксилин –эозином. Увеличение х 80.
При гистологическом исследовании грануляционной ткани взятой в разные сроки лечения выявлено: в начале процесса лечения у всех групп больных в ране определяется некротический детрит, фиброзная ткань с обильной нейтрофильной инфильтрацией (рисунок 7).
На третьи сутки после применения фибробластов и эмбриональных клеток увеличивается количество молодых сосудов (рисунок 8), некробиотические процессы уменьшались, на 10-12 сутки нейтрофильная инфильтрация исчезает, микрофлора не определяется, сосудистая сеть запустевает, и появляются пласты эпителия (рисунок 9).
Рис. 7 Гистология грануляционной ткани 1 сутки начала лечения предложенными методами (описание в тексте). Окраска гематоксилин –эозином. Увеличение х 80.
Рис. 8. Гистология грануляционной ткани с раны на третьи сутки после начала лечения фибробластами (описание в тексте). Окраска гематоксилин –эозином. Увеличение х 80.
Рис. 9 Гистология грануляционной ткани с раны на 10 сутки после на начала лечения эмбриональными клетками (описание в тексте). Окраска гематоксилин –эозином. Увеличение х 80.
Объективным критерием заживления раны является суточное сокращение площади раны. Измерения площади раны проводили через 5 -10 дней и вычисляли процент уменьшения площади раневой поверхности за сутки по формуле. При нормальном течении заживления суточное уменьшение площади раны составляет 4%.
При применении фибробластов в лечении длительно незаживающих ран после вскрытия флегмон без применения аутодермопластики суточная эпителизация составила 3%. Лечение эмбриональными клетками ран после вскрытия флегмон позволило эпителизировать рану в сутки до 2%, трофическую язву до 1,5% в сутки. При лечении цитокинами суточная эпителизация длительно незаживающих ран составила в среднем 1%. При лечении ран традиционными методами суточная эпителизация раны составила 0,4%.
Лечение ран культивированными фибробластами провели у 22 больных. Из них у 8 пострадавших после ожогов и 19 человек после вскрытия флегмон. Перед пересадкой фибробластов рана или ожоговая поверхность не имела выраженного гнойного отделяемого, сухого или влажного струпа, имела мелкие грануляции покрытые фибрином. Площадь ран при трансплантации составляла от 50 см2 до 200см2. Давность лечения раны составляла от 2 недель до 2-х месяцев. Фибробласты на микроносителях, на подложке или в геле наносили на подготовленную раневую поверхность. Рану закрывали асептической повязкой с антисептиком или нейтральной мазью. Первую перевязку делали на второй день, рану обрабатывали антисептиком, при необходимости вновь наносили культуру фибробластов и рану закрывали асептической повязкой. Последующие перевязки проводили через день, рану закрывали с антисептиком или с нейтральной мазью.
При наблюдении за больным, отмечено: улучшение аппетита, нормализация сна и температуры тела, исчезали боли в ране, уменьшался отек окружающих тканей. При визуальном контроле раны, на третьи сутки на поверхности раны появлялась «нитеобразная» пленка, усиливалась краевая эпителизация в виде белой каймы, на 7 –10 сутки в отдалении от края раны появлялись отдельные островки эпителизации. При необходимости у 6-и пострадавших после ожогов проводилась аутодермопластика расщепленным кожным лоскутом. Приживление кожного лоскута 85 - 90%. На 5 сутки активная эпителизация в ячейках перфорированного лоскута. При проведении лабораторных исследований выявлено: количество лейкоцитов в периферической крови с 11,5 х 109/л., к 5 суткам лечения приходило к норме, лимфоциты и моноциты так же к 5 суткам нормализовались. Значительного колебания содержания белка в сыворотке крови не наблюдали, местное лечение не влияло на данный показатель. Показатели клеточного иммунитета при лечении фибробластами к седьмым суткам нормализовались. Скорость эпителизации раны в сутки составила 3%.
В качестве примера можно привести результат лечения обширной раны после вскрытия флегмоны у больного С., история болезни № 9091 Окружной военный клинический госпиталь. Больной поступил в стационар с флегмоной средней и нижней трети правой голени, 19.11.1996 года больному выполнена операция – вскрытие и дренирование флегмоны. После операции произошел некроз краев раны и образовался дефект кожи 18 х 6,0 см. В течение двух месяцев больной лечился консервативными и оперативными методами (аутодермопластика расщепленным лоскутом), эффекта от лечения не наступило. Пересаженный кожный лоскут лизировался.
Бактериологическое обследование 22.11.96г. золотистый стафилококк чувствительный к антибиотикам. Бактериологическое обследование 27.11.96г. золотистый стафилококк чувствительные к антибиотикам. Бактериологическое обследование 30.11.96г. энтеробактер чувствительный к канамицину, гентамицину. Бактериологическое обследование 4.12.96г. энтерококк фекальный чувствительный к ампициллину, карбенициллину. Бактериологическое обследование 12.12.96г. стафилококк чувствительный к антибиотикам. Бактериологическое обследование 25.12.96г. Эпидермальный стафилококк чувствительный к антибиотикам. Бактериологическое обследование 19.01.97г. золотистый стафилококк не чувствительный к антибиотикам.
Анализы крови на момент начала лечения фибробластами: гем. - 131 г/л, эрит. - 4,2*10.12/л, СОЭ - 19 мм/час., лейк. - 10,7 * 109/л, э -1%, лим.- 18%. м- 9%, п-8%, с-48%. Иммунограмма 28.01.1997г. Абсолютное количество лимфоцитов –1,6 (норма –1,8 и более). Ранние РОК –36%, тотальные РОК – 63%, восстановленные РОК – 29%, Тр/Тв – 1,2. Иммунограмма супрессорного типа с понижением хелперов. После начатого лечения культивированными фибробластами количество хелперов повысилось до нормальных цифр, а супрессоры снизились до нормы. Динамика изменений лейкоцитов периферической крови, СОЭ и Т- клеточного иммунитета показана на рисунках (рисунок 10,11,12).
28.1. 1997 года проведена трансплантация фибробластов легочной ткани эмбриона (10 дисков по 5см. в диаметре). Рана закрыта повязкой с 1% раствором борной кислоты к ране подведен хлорвиниловый дренаж для постоянного орошения области раны 1% раствором борной кислоты. На вторые сутки исчез отек мягких тканей правой голени, под дисками с фибробластами белая «паутина». Диски удалены на 3 сутки. На 6 сутки активная краевая эпителизация, Ph раны – 7, появились островки эпителизации. На 10 сутки рана активно покрывается белой пленкой как с краев так и от островков (рис. 13). На 14 сутки рана закрылась плотной эпителиальной тканью (рис. 14). Восстановленный кожный покров взят на гистологию. При гистологическом исследовании – выявлен пласт многослойного плоского эпителия, фибробласты не выявлены. Гистология № 602 от 17.2.1997г.
В результате проведенного лечения, рана за 14 суток эпителизировалась. Больной осмотрен через год, в области раны восстановленный кожный покров, плотный, беловатый, волосяной покров отсутствует (рис. 15). При гистологическом исследовании за № 4565 от 18.11. 97г. - пласт многослойного плоского эпителия.
Рис. 13. Вид раны больного. С на 10 сутки после пересадки культивированных фибробластов эмбриона.
Рис. 14. Вид раны больного. С на 14 сутки после пересадки культивированных фибробластов эмбриона.
Рис. 15. Вид восстановленного кожного покрова у больного. С через год (описание в тексте).
Пример 2. Больной Ш. История болезни № 3349 – 1997г. (333 Окружной военный клинический госпиталь) 1920 года рождения (врач - терапевт), поступил в отделение 25.3. 1997г. с рожей стопы и нижней трети голени, некротическая форма, прегангрена левой стопы. Сахарный диабет II тип. Общее состояние расценено как тяжелое. Анализ крови 25.3.97г. гемоглобин – 93 г/л, эритроциты 3,1 х 1012/л., лейкоциты 5,6 х 109/л., эозинофилы –4%, лимфоциты 17%, моноциты – 5%, палочкоядерные – 10%, сегментоядерные –64%, СОЭ –40 мм/час. Общий белок –56 г/л, альбумин – 19 г/л, АЛТ 2,28 ммоль/л, сахар крови 15,8 ммоль/л. Иммунограмма 27.3.97г. Абсолютное количество лимфоцитов 0,9 х 109/л, ранние 43%, тотальные –72%, восстановленные –34%, Тр/Тв = 1,3. Заключение – выраженная абсолютная лимфопения. Супрессорный тип. В анализах крови анемия, гипопротеинэмия, абсолютная лимфопения. Был собран консилиум и больному предложена ампутация нижней конечности с уровня верхней трети левой голени, от которой больной категорически отказался. В течение недели сахар крови удалось скоррегировать. В течение месяца проводилось комбинированное патогенетическое, интенсивное лечение основного заболевания. Несмотря на проводимое лечение, оставалась анемия, гипопротеинемия, абсолютная лимфопения. Анализ крови 22.4.97г. гемоглобин – 101 г/л, эритроциты 3,3 х 1012/л., лейкоциты 10,2 х 109/л., эозинофилы –1%, лимфоциты 19%, моноциты – 7%, палочкоядерные – 1%, сегментоядерные –50%, плазматические клетки 2%, СОЭ –50 мм/час. Общий белок –60 г/л, альбумин – 24 г/л. Сахар крови 6,5 миллимоль/л. Иммунограмма 8.5.97г. Абсолютное количество лимфоцитов 1,2 х 109/л, ранние 56%, тотальные –77%, восстановленные –41%, Тр/Тв = 1,4. Заключение – выраженная абсолютная лимфопения. Супресорный тип иммунограммы. Больному была проведена химическая и ферментативная некрэктомия сухого и влажного некроза на ранах стопы и голени (рисунок 19). 19.5.1997 года на раны голени были трансплантированы культивированные фибробласты 4 диска по 3 см в диаметре, на вторые сутки в ранах появились грануляции. 22.5.1997 года на участки гранулирующих ран были года пересажены марки аутокожи забранной с передней поверхности средней трети правого бедра (рисунок 20). Пересаженные кожные лоскуты прижились, 30.5.1997 года повторно выполнена операция аутодермопластика кожным лоскутом 60см2. Пересаженные кожные лоскуты прижились раны левой стопы и голени 12.6.97г. эпителизировались. Больной выписан домой в удовлетворительном состоянии. Анализ крови 2.6. 97г. гемоглобин – 110 г/л, эритроциты 3,5 х 1012/л., лейкоциты 9,8 х 109/л., эозинофилы –2%, лимфоциты 34%, моноциты – 3%, палочкоядерные – 2%, сегментоядерные –39%, СОЭ –27 мм/час. Общий белок –66 г/л, альбумин – 29 г/л. Сахар крови 4,2 миллимоль/л. Иммунограмма 30.5.97г. Абсолютное количество лимфоцитов 1,8 х 109/л, ранние 58%, тотальные –76%, восстановленные –36%, Тр/Тв = 1,6. Анализ крови 12.6.97г. гемоглобин – 110 г/л, эритроциты 3,5 х 1012/л., лейкоциты 8,2 х 109/л., эозинофилы –1%, лимфоциты 42%, моноциты – 2%, палочкоядерные – 2%, сегментоядерные –46%. СОЭ –20 мм/час. Общий белок –64 г/л, альбумин – 42 г/л. Сахар крови 5,6 миллимоль/л.
Бак. анализ 26.3.97г. выделен из раны сапрофитный стафилококк не чувствительный к антибиотикам. Бак. анализ 14.4.97г. выделен из раны золотистый стафилококк не чувствительный к антибиотикам. Бак. анализ 21.4.97г. выделен из раны сапрофитный стафилококк чувствительный только к оксациллину и гентамицину. Бак. анализ 5.5.97г. выделен из раны золотистый стафилококк чувствительный к антибиотикам. Бак. анализ 12.5.97г. выделена из раны грамотрицательная бактерия - Serratia не чувствительная к антибиотикам. Бак. анализ 2.6.97г. роста микробов нет.
Рис. 19. Вид раны больного после химической и ферментативной некрэктомии (описание в тексте).
Рис. 20. Пересаженные кожные лоскуты на раны стопы и голени у больного Ш (описание в тексте).
Тестированные клетки кожи 12-18 недельного эмбриона получали из лаборатории в виде геля, в запаянных стерильных флаконах.
Клетки кожи эмбриона трансплантировали на раны: после ожогов, вскрытия флегмон, трофические язвы. Всего пролечено 17 пациентов в возрасте от 18 до 50 лет. Два, пострадавших после ожога Шб ст., у которых раны не заживали в течение 3 месяцев лечения, несмотря на интенсивную терапию и аутодермопластику. У 10-и пациентов трансплантацию проводили на длительно незаживающие раны различной площади после вскрытия флегмон. У 5 больных трансплантацию проводили на трофические язвы голеней, длительность которых превышала 3 года.
Клетки в гелеобразном состоянии наносили на раны, рану закрывали перфорированным целлофаном и асептической повязкой. Первую перевязку проводили на следующий день. При отсутствии гнойного отделяемого вновь проводили трансплантацию клеток кожи. Последующие перевязки осуществляли через день. Во время перевязки на рану наносили клетки кожи эмбриона.
В первые сутки больные отмечали исчезновение болей в ране, улучшение сна, особенно, у больных с трофическими язвами. На вторые сутки видна краевая эпителизация в виде белой полоски шириной от 2 до 4 мм. На 5-7 сутки появляется рост островков эпителия. Но следует заметить, что они также быстро могут исчезнуть - лизироваться. На 10 сутки наблюдали явную эпителизацию от островков, которая в дальнейшем разрасталась, восстанавливая кожный покров. В сутки раневая поверхность эпителизировалась на 1-2 см2., что составляло 1-2% к площади раны. Отмечали так же выраженную пролиферацию грануляционной ткани, рана за 3 суток превращалась из кратерообразной в плоскую. У двух пациентов после трехкратной трансплантации клеток кожи эмбриона, выполнили аутодермопластику расщепленным кожным лоскутом, приживление полное. Длительно незаживающие раны площадью 25-100см2 эпителизировались за 12 дней. Трофические язвы двухлетней давности за 21 день, язва 3 летней давности за 45 суток.
Пример. Больной Л. 1978 года рождения, история болезни № 5217 (Окружной военный клинический госпиталь) находился на лечении с 31.5.97 г. по поводу ожога пламенем туловища, конечностей общей площадью 30%, глубокого 12%, I – IIIб степени, ожоговой болезни (рисунок 24). Больному проводилось патогенетическое лечение ожоговой болезни (переливание кровезаменителей, препаратов крови, детоксикационная терапия, физиолечение, ГБО и местное лечение ожоговых ран). После химической, хирургической и ферментативной некрэктомии были выполнены (27.6.97г. и 2.7.97г.) две операции - аутодермопластики свободными расщепленными кожными лоскутами общей площадь 800 и 600 см2. Приживление кожных трансплантатов до 80%, между пересаженными кожными лоскутами остались гранулирующие раны общей площадью до 1,5 % поверхности тела больного. Проводилось консервативное лечение оставшихся ран, эффекта не получено. Через три месяца после последней операции (8.10.1997г.) на раневые поверхности левой нижней конечности нанесены эмбриональные клетки кожи и закрыты асептическими повязками. Последующие трансплантации проводили ежедневно в течение 8 дней. После первой трансплантации эмбриональных клеток больной отметил улучшение сна, аппетита, исчезла боль в области ран, грануляции очистились от некротических тканей, стали сочными, розовыми. На третий день появилась краевая эпителизация в виде белой каймы до 2-х – 4-х мм (рисунок 25). В течение 13 суток раны левой нижней конечности эпителизировались.
Анализ крови 23.6.97г. гемоглобин – 112 г/л, эритроциты 4,0 х 1012/л., лейкоциты 18,5 х 109/л., эозинофилы –2%, базофилы –1% лимфоциты 8%, моноциты – 12%, палочкоядерные – 21%, сегментоядерные –53%, плазматические клетки 1%, СОЭ –53 мм/час. Общий белок –59 г/л, альбумин – 24 г/л. Сахар крови 11,8 миллимоль/л. Иммунограмма 23.6.97г. в норме. Анализ крови 4.7.97г. гемоглобин – 120 г/л, эритроциты 4,3 х 1012/л., лейкоциты 11,8 х 109/л., эозинофилы –0%, лимфоциты 10%, моноциты – 13%, палочкоядерные – 7%, сегментоядерные –70%, плазматические клетки 0%, СОЭ –35 мм/час. Общий белок –69 г/л, альбумин – 43,8 г/л. Сахар крови 5,5 миллимоль/л. Иммунограмма 4.7.97г. Абсолютное количество лимфоцитов 1,2 х 109/л, ранние 56%, тотальные –77%, восстановленные –60%, Тр/Тв = 0,9. Заключение – выраженная абсолютная лимфопения, супрессорный тип. Анализ крови 24.9.97г. гемоглобин – 118 г/л, эритроциты 3,9 х 1012/л., лейкоциты 10,1 х 109/л., эозинофилы –8%, лимфоциты 15%, моноциты – 10%, палочкоядерные – 2%, сегментоядерные –30%, плазматические клетки 0%, СОЭ –29 мм/час. Общий белок –73 г/л, альбумин – 39 г/л. Сахар крови 4,5 миллимоль/л. Иммунограмма 23.9.97г. Абсолютное количество лимфоцитов 0,9 х 109/л, ранние 44%, тотальные –62%, восстановленные –26%, Тр/Тв = 1,6. Незначительно выраженная супрессия.
Анализ крови 13.10.97г. гемоглобин – 116 г/л, эритроциты 3,7 х 1012/л., лейкоциты 12,1 х 109/л., эозинофилы –5%, лимфоциты 23%, моноциты – 7%, палочкоядерные – 4%, сегментоядерные –49%, плазматические клетки 0%, СОЭ –10 мм/час. Иммунограмма 13.10.97г. Абсолютное количество лимфоцитов 2,5 х 109/л, ранние 42%, тотальные –70%, восстановленные –30%, Тр/Тв = 1,4. Незначительно выраженная супрессия.
Рис. 24. Ожог пламенем нижних конечностей IIIб ст. у больного Л (описание в тексте).
Рис. 25. Третьи сутки после трансплантации клеток кожи эмбриона на гранулирующие раны после ожога пострадавшего Л (описание в тексте).
Пример. Больной Г. история болезни № 5811 (Окружной военный клинический госпиталь), 49 лет находился на лечении с 24.6.1997г. по поводу облитерирующего атеросклероза сосудов нижних конечностей, множественных трофических язв голеней. Болен 4 года, неоднократно лечился амбулаторно и стационарно, значительного эффекта от лечения не получено. При поступлении в стационар, на голенях 18 трофических язв различной величены и давности. В течение 4 месяцев проводилось лечение всеми возможными методами, в том числе и оперативными. 17.9.97г. выполнена операция - аутодермопластика расщепленным кожным лоскутом площадью 60см2 гранулирующих ран голени. Пересаженные кожные лоскуты в послеоперационном периоде лизировались. 23.10.1997 года на левой голени пять язв 5 х 3; 3 х 2,5; 2,5 х 1,5 и 1 х 1 (2) см. с подрытыми краями покрытые фибрином, грануляций нет, вокруг ран умеренная инфильтрация и отек мягких тканей (рисунок 29). На правой нижней конечности две трофических язвы 2х3 см. с подрытыми краями, покрытые фибрином, грануляций нет. На трофические язвы левой голени нанесены клетки кожи эмбриона, раны закрыты перфорированным целлофаном и асептической повязкой. В первые сутки больной отметил значительное облегчение, исчезла боль в области язв, улучшился сон, аппетит. На третьи сутки раны-язвы очистились от фибрина, появились грануляции, краевая эпителизация в виде белой каймы до 0,3 мм (рисунок 30). На а 5-7 сутки выраженный рост грануляций. На 10-12 сутки язвы из кратерообразных превратились в плоские и шла активная краевая эпителизация. В сутки раневая поверхность эпителизировалась до 1% к площади раны. Замечено, что язвы с длительным сроком сосуществования эпителизируются медленнее, язвы более «молодые» эпителизируюся быстрее. У пациента Г. трофические язвы двухлетней давности эпителизировались за 21 день (рисунок 31), язва 3 летней давности за 45 суток (рисунок 32). Следует заметить, что после трансплантации эмбриональных клеток на гипертрофические рубцы находящиеся рядом с язвой, последние исчезают и кожный покров становится ровным, чистым и нежным. Трофическая язва на правой голени леченная традиционными способами – ферментами, мазями, антисептиками за период наблюдения осталась прежних размеров.
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ.
Длительно незаживающие раны и трофические язвы являются распространенным заболеванием. Отмечается увеличение числа больных с данной патологией. Большинство из них неоднократно лечилось в условиях стационара и в амбулаторном режиме. Значительное число способов лечения длительно незаживающих ран и трофических язв нижних конечностей свидетельствуют о том, что в настоящее время не существует эффективного способа лечения, позволяющего получить стойкий положительный результат. Причиной стойкого хронического воспаления в длительно незаживающей ране является первичная или вторичная иммунодепрессия. Функциональная неполноценность макрофагальных клеток не может ликвидировать патоген, а медиаторы воспаления распадающихся клеток продолжают поддерживать хроническое воспаление длительное время. Применяемые способы лечения не позволяют разорвать круг хронического воспаления. Все это обуславливает актуальность поиска новых методов лечения больных с данной патологией.
Целью работы явилось изучение новых технологий: трансплантации культур клеток кожи и цитокинов в лечении больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами.
Для достижения цели настоящего исследования были созданы методы лечения больных с длительно незаживающими ранами: лечение культивированными фибробластами, лечение эмбриональными клетками кожи и местным аппликационным применением цитокинов.
Основным патогенетическим механизмом воздействия предложенных способов лечения является активация макрофагальных клеток в области раны.
Основными классическими симптомами заболевания являлись наличие у больных раневых поверхностей, часто с гнойным отделяемым, не склонных к заживлению, боли в области раны, мацерация кожи вокруг язвы, отек конечности или наоборот наличие фибрина в ране, омозолелость краев раны и отсутствие грануляционной ткани.
У половины больных длительность существования язв составляла от 1 месяца до 3 месяцев. У 10,6% больных длительность болезни была более 1 года.
По данным бактериологических исследований раневого отделяемого чаще всего из ран высеивались Staph. аureus и Ps. aeruginosa.
При проведении исследования общего иммунного статуса были выявлены характерные изменения клеточного иммунитета 24 % больных, с нарушением соотношения иммунорегуляторных клеток. Выявлено процентное содержание лимфоцитов периферической крови во всех группа на 42-62%. При лечении предложенными методами данный показатель приходил к норме на 10 сутки после лечения, в контрольной группе он оставался до 13 суток. При исследовании абсолютного количества лимфоцитов периферической крови выявили снижение лимфоцитов у больных по группам от 6% до 35%. При исследовании Т клеточных популяций выявлено повышенное содержание Т-лимфоцитов эффекторно/супрессорной популяции при нормальных показателях общего количества Т-лимфоцитов и Т- лимфоцитов хелперно/индукторного типа. У обследованных больных преобладали иммунограммы с супрессивным типом, что характерно для локальных гнойных ран. При лечении предложенными новыми технологиями данные показатели приходили к норме в течение 10 суток с начала лечения. В контрольной группе больных показатели клеточного иммунитета приходили к норме на 15 сутки лечения.
Для лечения больных с ранами разного генеза нами предложены разные методы лечения с целью оценить их эффективность. Так, у больных с трофическими язвами нами использовались все три предложенные способа лечения. Для лечения больных с обширными ожогами только культивированные фибробласты на целлофановой подложке, так как этот материал можно получить за короткий период времени (три дня) и в большом количестве. Фибробласты в геле применяли на ограниченных ранах как после ожогов, вскрытия флегмон, так и на трофические язвы. Эмбриональные клетки кожи в виду исключительности материала применяли только на ранах до 100см2. Аутологичные и донорские кондиционные среды применяли также на ограниченные по размерам раны в виде аппликаций.
При трансплантации культивированных фибробластов, клеток кожи эмбриона и аппликации цитокинов происходит активация иммунокомпетентных клеток в ране и выработка биологически активных веществ – медиаторов воспаления и цитокинов которые, и стимулируют ангиогенез, миграцию эпителиоцитов от края раны. При местном применение культивированных фибробластов, клеток кожи эмбриона и цитокинов, в результате контактного воздействия с аутолимфоцитами и макрофагами проиcходит экспрессия новых рецепторов на мембранах данных клеток, что имеет значение для их активации.
В результате проведенного лечения в разных группах были обнаружены характерные различия: исчезновение перифокального отека, боли, появление грануляций, краевой и островковой эпителизации, полной эпителизации раны, нормализации количества лейкоцитов в периферической крови и т. д.
Показатели температуры у обследуемых больных, как по группам, так и в процессе лечения предложенными способами лечения значительно не изменялись. Это связано с тем, что больные предложенными методами начинали лечиться на 30,60, 90 сутки после нахождения в стационаре и имели негенерализованнные воспалительные явления. Отсутствие повышения температуры в процессе лечения доказывает отсутствие осложнений при применении предложенных способов лечения. При исследовании температуры раневой поверхности, мы не наблюдали значительных колебаний ее в процессе лечения предложенными технологиями.
Суммируя выше сказанное можно сделать вывод, что длительно незаживающая рана - хронический процесс с местной воспалительной реакцией, а местная трансплантация культивированных клеток кожи и аппликация цитокинов не вызывают осложнений со стороны организма.
При анализе динамики показателей лейкоцитов периферической крови у больных в процессе лечения, отмечено незначительное повышение данного показателя в начале предложенных способов лечения и быстрое снижение его в опытных группах. В контрольной группе данный показатель нормализовался в 2,9 раза позже. Наиболее быстрое снижение данного показателя произошло в группе, где лечение проводили цитокинами. Он нормализовался в 4 раза быстрее по сравнению с опытными группами. Это можно объяснить не только эффективностью, но и меньшей обширностью ран леченных данным способом.
При исследовании динамики изменения моноцитов периферической крови в процессе лечения, которые отражают характер воспалительной реакции, отмечено значительное повышение их у больных во второй группе, где преобладали более тяжелые больные после ожогов и обширных ран после вскрытия флегмон. В процессе лечения предложенными новыми способами данный показатель приходил к норме на 5 сутки лечения. Повышенное содержание моноцитов оставалось в контрольной группе в процессе нашего наблюдения. Не нашли мы и коррелирующего колебания моноцитов в мазках отпечатках с раневой поверхности и моноцитами периферической крови.
При исследовании белка крови, который значительно влияет на репаративные процессы в ране у наших больных, мы не выявили значительных изменений в процессе лечения данного показателя. Обосновано тем, что до нашего лечения у некоторых больных уже была проведена коррекция белка, а наше лечения не повлияло на данный показатель.
При исследования функциональной активности нейтрофилов (определение лактат катионных белков) выявлено, что у 24% больных имеется снижение функциональной активности нейтрофилов на 10%. При применении предложенных новых технологий в лечении длительно незаживающих ран данный показатель приходит к норме в третьей, четвертой группах на третьи сутки во второй на 5 сутки, в контрольной он остается сниженным в процессе всего наблюдения. Следует сделать вывод, что данный показатель является хорошим критерием определения течения раневого процесса и зная функциональную активность нейтрофилов можно корригировать дальнейшее течение воспалительного процесса применением предложенных способов лечения.
При оценке общего иммунного статуса в динамике до и после лечения, различия были выявлены лишь у больных опытных групп. Причем, положительные изменения касались только клеточного звена иммунитета и были более выражены в группе с применением культивированных фибробластов. В контрольной группе с применением традиционного метода лечения изменений иммунологических показателей отмечено не было. Следовательно, культивированные фибробласты, эмбриональные клетки кожи при местном применении, за счет продукции цитокинов вызывают иммуностимулирующее действие, направленное на клеточное звено. Местное применение цитокинов также сопровождается изменениями в общем иммунном статусе. Последние, всасываясь с раневой поверхности, обладают непосредственным иммуностимулирующим воздействием на иммунокомпетентные клетки. Закономерно не обнаруживается изменений в общем иммунном статусе и при использовании традиционного метода лечения больных с трофическими язвами.
При исследовании возбудителя в ране выявили, что наибольшей местной бактерицидной активностью обладали фибробласты, с третьих суток применения последних посевы с раны становятся стерильными. В группе с применением кондиционных сред возбудитель не определяется с пятых суток, а при применении эмбриональных клеток кожи только на седьмые сутки. В группе с применением традиционного способа лечения возбудители продолжали выделять в процессе всего наблюдения. Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о том, что наибольшей бактерицидностью обладают фибробласты. В 1,6 раза быстрее, посевы с ран становятся стерильными по сравнению с лечением цитокинами и в 2,5 раза быстрее по сравнению с лечением эмбриональными клетками. Следует заметить, что в двух случаях у больных при применении цитокинов было отмечено обильное гнойное отделяемое, которое связываем с выраженным бактерицидным действием и стимуляцией макрофагальных клеток. На третьи сутки гнойного отделяемого не стало и появилась выраженная краевая эпителизация.
Оценивая цитологическую характеристику сравниваемых групп, можно предположить, что исходное состояние пациентов было в группах одинаковое, преобладал воспалительно – дегенеративный тип воспаления. Наилучшие результаты получены при использовании кондиционных сред и эмбриональных клеток кожи. Уже в первые сутки после лечения в грануляционной ткани появляются лимфоциты и макрофаги, с третьих суток в этих группах появляются фибробласты и эпителиальные клетки. При лечении культивированными фибробластами процесс миграции эпителиальных клеток начинается на пятые сутки. На седьмые, десятые сутки лечения во всех опытных группах начинается активная миграция эпителиальных клеток в центр раны и они определяются уже группами. Оценивая цитологические показатели мазков-отпечатков у больных опытных и контрольной групп, отмечается снижение дегенеративных форм в опытных группах в процессе лечения и они оставались на прежнем уровне в контрольной группе. В начале лечения количество нейтрофилов составляло до 95% из них дегенеративных форм в мазках отпечатках всех групп составляло до 70%. На третьи сутки после начала предложенными методами нейтрофилы составляли 75%, дегенеративные формы до 30%. На пятые сутки лечения процент дегенеративных форм сократился до 21%. В контрольной группе цитограммы оставались с дегенеративно – воспалительным типом.
При изучении гистологических срезов грануляционной ткани выявлено, что до лечения предложенными способами лечения грануляционная ткань представлена с некротическим детритом, с крупными очагами склероза, единичными очагами молодой грануляционной ткани, выраженным отеком стромы, лимфостазом и выраженной нейтрофильной инфильтрацией. В мазках определяется микрофлора как внутриклеточно, так и внеклеточно. На третьи сутки после начала лечения предложенными новыми способами нейтрофильная инфильтрация уменьшилась, появились мелкие капилляры, небольшое количество фибробластов. Микрофлора определяется единично внеклеточно.
На 10 - 12 сутки нейтрофильная инфильтрация значительно уменьшилась, микрофлора не определяется, появляются пласты эпителия. Приведенные гистологические данные полностью коррелируют с цитологическими и клиническими показателями активизации репаративной регенерации при лечении предложенными новыми способами лечения длительно незаживающих ран.
При исследовании репаративных процессов в ране изучали динамику исчезновения боли в ране и выявили, что при применении эмбриональных клеток кожи боль в ране исчезает в первые сутки и у больного улучшается сон и аппетит. При лечении больных культивированными фибробластами и цитокинами исчезновение боли наступает на третьи сутки. Исчезновение боли в ране можно связать лишь с уменьшением отека и инфильтрации мягких тканей вокруг раны, а также и непосредственного анальгезирующего действия эмбриональных клеток и самих цитокинов.
Купирование отека мягких тканей при лечении предложенными методами произошло на третьи сутки при использовании эмбриональных клеток кожи и на пятые сутки при использовании фибробластов и цитокинов. Особенно, больные отмечают положительный эффект в исчезновении боли и отека мягких тканей при применении эмбриональных клеток кожи. Видимо эмбриональные клетки кожи обладают более выраженным лимфостимулирующим действием, чем и достигается быстрое уменьшение отека мягких тканей и боли.
Время появления грануляций в опытных группах произошло при трансплантации эмбриональных клеток в первые сутки. Следует заметить, что они наиболее сильно влияют на ангиогенез, выражено стимулируя разрастание грануляционной ткани. При лечении трофических язв с применением эмбриональных клеток кожи за пять суток язва из кратерообразной превращалась в плоскую, за счет быстрого разрастания грануляционной ткани. Замечено, что при множественных трофических язвах, аппликация клеток кожи эмбриона на одну из них стимулирует репаративные процессы на соседних. Исчезает гнойное отделяемое, появляются молодые мелкие грануляции, начинается краевая эпителизация. После эпителизации раны с применением эмбриональных клеток, образуется нежный, розовый, гладкий восстановленный кожный покров. В участках, где имелись грубые гипертрофические рубцы, после применения эмбриональных клеток они исчезают, кожный покров выравнивается.
При трансплантации культивированных фибробластов и аппликации цитокинов грануляционная ткань в ране у наших больных появлялась на третьи сутки и не была такой выраженной как при трансплантации эмбриональных клеток кожи.
При исследовании появления краевой эпителизации выявлено появление ее после первых суток в виде белой полоски по краю раны при трансплантации эмбриональных клеток кожи и появление после третьих суток при применении цитокинов и фибробластов. Экспериментальные исследования гистологов доказывают, что цитокины, фибробласты и эмбриональные клетки уменьшают поверхностное клеточное натяжение в ране и усиливают миграцию краевого эпителия к центру раны. По заключению комбустиологов и нашему личному опыту рана самостоятельно может эпителизироваться только до 5 см в диаметре, свыше же 5 см в диаметре, в центре раны будет соединительнотканный рубец без эпителия. Подобную картину можно наблюдать и при небольших по размеру ранах у больных с тяжелым эндотоксикозом, когда небольшая рана закрывается соединительной тканью, но не эпителием. Применение культивированных клеток кожи и аппликации цитокинов нам позволили эпителизировать раны 10 х 10 и даже 12 х 20 см без аутодермопластики.
Интересные результаты получены при исследовании появления островковой эпителизации. Следует сразу оговориться, что все больные лечились с полным поражением кожного покрова. И никаких придатков кожи в данной ране не оставалось, потому рассчитывать на появление островковой эпителизации мы не могли. Но при применении эмбриональных клеток кожи она появилась на пятые сутки после аппликации в виде отдельных островков эпителия, до 3 – 5 мм в диаметре, при применении культивированных фибробластов островковая эпителизация появлялась на седьмые сутки после трансплантации. Островки эпителизации могли находиться как в одном сантиметре от края раны, так и в трех сантиметрах от края раны. Следует отметить, что некоторые из них в последующем могли лизироваться. Что позволяет заключить, что островковая эпителизация могла появиться как за счет клеток краевого эпителия, так и живой эпителиальной клетки эмбриона. Есть экспериментальные доказательства, что, если трансплантировать фибробласты дермы, то они могут давать полноценную репаративную регенерацию кожи, вплоть до восстановления волос. При аппликационном лечении ран цитокинами островковой эпителизации не наблюдали. В контрольной группе вышеописанных изменений в ране в процессе лечения не наблюдали. Сравнивать время появления краевой, островковой эпителизации трудно, ее не было месяцами, годами и вдруг рана эпителизируеся за 12 – 25 суток.
Время полной эпителизации ран при применении культивированных фибробластов наступило в среднем на 15 сутки после начала лечения. При применении клеток кожи эмбриона и аппликациионого применения цитокинов в среднем на 12 сутки после начала лечения. При трофических язвах средние сроки эпителизации одно и двух годичных язв произошло на 21 – 25 сутки. Самое скромное сравнение методов лечения всех четырех групп, позволяет заключить, что репаративные процессы в кожной ране при применении предложенных новых технологий происходят в 2 – 3 раз быстрее.
Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о том, что местное применение культивированных фибробластов, клеток кожи эмбрионов и цитокинов является патогенетически обоснованным и эффективным методом лечения длительно незаживающих ран и трофических язв нижних конечностей. Обладая иммуномодулирующей активностью культивированные клетки, клетки кожи эмбриона и цитокины снижают активность воспаления в ране и окружающих тканях, что сопровождается уменьшением отека и инфильтрации ткани, повышением миграции краевого эпителия к центру раны. Внедрение предложенных способов лечения этой сложной патологии в клиническую практику позволит оптимизировать результаты лечения больных. Дальнейшее изучение методов культивирования клеток кожи и их применения в медицине позволят наладить производство ауто- и алло кожи в лабораторных условиях пригодной для закрытия обширных раневых поверхностей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Среди хирургической патологии раны и гнойные осложнения их занимают третье место среди всех хирургических больных. При эндотоксикозе происходит угнетение как клеточного, так и гуморального иммунитета. А это приводит к нарушению местных репаративных процессов. Нарушение процессов тканевой репарации, особенно у лиц пожилого возраста, ослабленных, имеющих иммунные нарушения, часто замедляет заживление ран.
В Ы В О Д Ы
1. При заборе и транспортировке донорской кожи существует высокая вероятность контаминации ткани микроорганизмами. Транспортировку и временное хранение донорской кожи целесообразно проводить в физиологическом растворе с добавлением антибиотика в дозе 200 –500 мкг/мл.
2. Фибробласты взрослого человека обладают недостаточной пролиферативной активностью и малым сроком жизни (до 20 – 25 пассажей in vitro), поэтому, их следует использовать только для аутотрансплантации. Фибробласты эмбриона обладают высокой жизнеспособностью и высокой пролиферативной активностью (до 45 – 50 пассажей), что позволяет хранить их в банке клеток кожи в режиме “до востребования”.
3. Разработан метод получения и культивирования клеток кожи (кератиноцитов, фибробластов) в лабораторных условиях на микроносителях, на целлофановой подложке и в геле, что позволяет их использовать в условиях длительной транспортировки и поздних сроков трансплантации.
4. При исследовании длительно незаживающих ран у 24 % больных наблюдается снижение функциональной активности нейтрофилов в зоне воспаления, что способствует хронизации раневого процесса.
5. Культивированные фибробласты кожи человека обладают выраженной бактерицидностью, активируют ангиогенез, стимулируют миграцию краевых эпителиоцитов к центру раны, тем самым усиливают репаративную регенерацию кожной раны в 2 раза по сравнению с лечением традиционными методами.
6. Применение клеток кожи эмбриона в лечении длительно незаживающих ран, вызывает выраженную стимуляцию процессов ангиогенеза, появлений краевой и островковой эпителизации в 2,6 раза по сравнению с контрольной группой.
7. Использование цитокинов при лечении больных с длительно незаживающими ранами позволяет усилить явление краевой эпителизации и заживление раны в 2,6 раза быстрее чем в контрольной группе.
8. Применение новых технологий в лечении ран позволяет в 2,4 раза быстрее корригировать нарушения общего иммунного статуса и восстановление функциональной активности нейтрофилов в незаживающей ране, чем при лечении традиционными методами.
9. Использование разработанного способа местного лечения ран с применением культивированных ауто - и аллофибробластов, клеток кожи эмбриона и цитокинов позволяет более эффективно стимулировать репаративные процессы в ране, ускорить (в 2 - 3 раз) процессы регенерации и на 50 % увеличить эффективность лечения больных с длительно незаживающими ранами.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1) Все больные с длительно не заживающими ранами и трофическими язвами нуждаются в исследовании клеточного иммунитета и функциональной активности нейтрофилов.
2. У больных с длительно не заживающими ранами и трофическими язвами, сформировавшимися на фоне длительного безуспешного лечения, в программу лечения целесообразно включать при ограниченных ранах - аппликационную цитокинотерапию (одна две аппликации кондиционными аутологичными или донорскими средами в течение 5 – 10 суток), трансплантацию эмбриональных клеток кожи (один раз в сутки в течение 5 – 7 суток) и культивированные фибробласты на любой основе (на микроносителях, на целлофановой подложке или в геле, один раз в три дня, не более двух трансплантаций).
4.При обширных ранах любого генеза у истощенных и септических больных целесообразно использовать культивированные фибробласты эмбриона с последующей аутодермопластикой перфорированным кожным лоскутом с коэффициентом перфорации 1 4, 1 6.