Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
РЕФЕРАТ
Дипломная работа 43 страницы, 7 рисунков, 3 таблицы, 45 источников
Ключевые слова: водный экстракт куколок китайского дубового шелкопряда, митотическое деление, Allium-тест, патология митоза
Объект исследования: меристематические клетки корешков проростков Allium cepa L.
Предмет исследования: действие гидрофильных компонентов куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры тест-объекта Allium cepa L. в норме и при стрессе.
Цель работы: изучить влияние различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.
Результаты исследования: Установлено, что наиболее оптимальными концентрациями ВЭКШ, действующими на исследуемые цитогенетические параметры, являются 0,001 и особенно 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды. Минимальная исследуемая концентрация ВЭКШ была наиболее близка к физиологическим условиям по параметрам: длительность фаз митоза, патология митоза, спектр патологий митоза.
Также установлено, что тестируемое хроническое радиоактивное облучение луковиц способствует повышению показателя «патология митоза без учета профаз».
Использование ВЭКШ снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0 раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.
Содержание
|
Введение……………………………………………………………………….. |
4 |
|
1 Обзор литературы………………………………………………………...…. |
5 |
|
1.1 Использование антиоксидантов и их влияние на геном клеток……... |
5 |
|
1.2 Растительная тест-система Allium cepa………………………..……..... |
9 |
|
1.3 Митотическое деление клеток……………………..…….…………..… |
11 |
|
1.4 Патология митоза……………….………..…………………..…………. |
17 |
|
1.5 Нарушение митотической активности клеток ……..……………...….. |
20 |
|
1.6 Способы облучения растений………………………………………….. |
22 |
|
2 Объект, программа и методика исследований ……………….….............. |
24 |
|
2.1 Объект и программа исследований……………………….………..….. |
24 |
|
2.2 Методика исследований…………………..………………….....……… |
24 |
|
3 Результаты исследований и их обсуждение…………………………….. |
27 |
|
3.1 Цитогенетические и морфометрические параметры A.cepa L. в норме……………………………………………………………..……… |
27 |
|
3.1.1 Морфологические параметры Allium cepa L……………................. |
27 |
|
3.1.2 Продолжительность фаз митоза в корневой системе Allium cepa L.. |
28 |
|
3.1.3 Патология митоза…………………………………………..…….….... |
30 |
|
3.1.4 Уровень и спектр патологий митоза……………………….…..…… |
31 |
|
3.2 Цитогенетические и морфометрические параметры A.cepа L. после радиоактивного облучения……………..…...…...…………………….…. |
33 |
|
3.2.1 Морфологические параметры Allium cepa L…….………………..…. |
33 |
|
3.2.2 Митотический индекс………………………………………………….. |
34 |
|
3.2.3 Продолжительность фаз митоза в корневой системе Allium cepa L... |
36 |
|
3.2.4 Патология митоза…...………………………………………..………… |
37 |
|
Заключение.......................................................................................................... |
39 |
|
Список использованных источников………..….………………...…….…… |
40 |
Введение
Среди источников биологически активных веществ, используемых в растениеводстве, до настоящего времени не применяли препараты из гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда, хотя по химическому составу гемолимфа может быть использована для получения высокоэффективных стимуляторов роста. Ранее было обнаружено ингибирующее действие водного экстракта куколок шелкопряда (ВЭКШ) на образование in vivo активных форм кислорода и галогенов в нейтрофилах, что свидетельствует об его антиоксидантном действии [1]. Выявлен состав гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда, содержащий комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который оптимален для функционирования эукариотических клеток. Установлено общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок дубового шелкопряда, которое составляет 14-16 г/л; в том числе обнаружены следующие незаменимые аминокислоты (М±m, ммоль/л): треонин (10,28±0,272), гистидин (10,26±0,367), лизин (8,66±0,586), валин (8,16±0,193), лейцин (4,76±0,133), изолейцин (4,34±0,145), фенилаланин (1,04±0,070), метионин (0,67±0,083) [1].
Однако следует принять во внимание, что антиоксиданты, в зависимости от концентрации и других факторов, могут проявлять либо антиоксидантное действие, либо прооксидантное, либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления, и тем самым на общее состояние организма и его адаптивность.
Цель работы: изучить влияние различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.
Актуальность работы: всестороннее изучение влияния водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда имеет огромное значение при выявлении морфометрических и цитогенетических параметров различных растений, так как в составе гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда содержится комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который оптимален для функционирования эукариотических клеток, как в оптимальных условиях, так и при стрессе.
1 Обзор литературы
1.1 Использование антиоксидантов и их влияние на геном клеток растений
Выявлено, что значительное негативное влияние на биохимические процессы в организмах высших организмов оказывают особые химические частицы, называемые "свободными радикалами". Свободные радикалы представляют собой чрезвычайно активные образования (молекулы, а точнее частицы, имеющие неспаренные электроны), образующиеся в процессе жизнедеятельности организма, а также при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (радиация, загрязненная атмосфера, химические соединения и т.п.). Такие молекулы стремятся отнять электрон у других "полноценных" молекул, вследствие чего "пострадавшая" молекула сама становится свободным радикалом развивается разрушительная цепная реакция, губительно действующая на живую клетку. Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, в ослаблении иммунной системы и других защитных функций. Эти нарушения связаны, прежде всего, с повреждением клеточных мембран. Свободные радикалы могут также проявлять мутагенные свойства, связанные с нарушением структуры молекул ДНК и рибосомной РНК, вызывая изменения наследственной информации и ослабляя жизненные силы организма. В процессе эволюции клетки живых организмов выработали многочисленные свойства и функции, которые помогают им выживать в естественных условиях. И одним из таких широко распространенных природных соединения являются антиоксиданты, которые часто вырабатывают самими организмами. Спектр биологического действия антиоксидантов весьма разнообразен и обусловлен в основном их защитными функциями, выраженными в способности нейтрализовать негативное действие свободных радикалов. К числу наиболее известных антиоксидантов относятся токоферолы, каротиноиды, аскорбиновая кислота. Мощным антиоксидантным действием обладают также природные соединения растительного происхождения, объединенные под общим название – флавоноиды [2-7].
Однако огромный поток неблагоприятных внешних факторов различного происхождения приводит к ситуации, когда защитные механизмы самого организма на разных уровнях структуризации уже не в состоянии нейтрализовать образование агрессивных частиц, нарушающих скорость свободнорадикального окисления липидов мембран клеток, что в конечном итоге приводит к повреждению нуклеиновых кислот и/или хромосом. Поэтому важной и актуально задачей является активный поиск соединений, обладающих антиоксидантными, антимутагенными и иными полезными свойствами.
Новые антиоксиданты должны характеризоваться максимально широким действием на свободнорадикальное окисление, с возможно более специфичным действием на определенные звенья этого процесса (перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, повреждение нуклеиновых кислот и т.д.).
Поиск антиоксидантов может проводиться по двум основным направлениям. Первое – это синтез новых соединений с выраженной антиоксидантной активностью, низкой токсичностью и минимальным проявлением побочных явлений. Второе – это поиск антиоксидантов среди широко используемых в медицинской практике лекарственных средств различных фармакологических групп, либо выявление таких соединений в природе [1, 3].
Следует обратить внимание на то обстоятельство, что антиоксиданты в зависимости от концентрации и других факторов могут проявлять либо антиоксидантное (защитное) действие, либо прооксидантное (проявление высокой токсичности, нежелательных побочных явлений), либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления.
Китайский дубовый шелкопряд (Antheraea pernyi G.–M.) издавна культивируется для изготовления натуральных шелковых тканей. В последнее время куколка шелкопряда рассматривается как исходное сырье для получения различных лечебных, косметических средств, пищевых продуктов (масла, приправы) и применяться в качестве кормовых добавок для домашних животных, птицы, рыбы [1, 8].
Куколка шелкопряда – это природный объект, содержащий биологическую жидкость, между стадиями двух эукариотических организмов – гусеницы и бабочки. Очевидно, что в этой жидкости должен содержаться оптимальный для синтеза белков эукариотического организма спектр аминокислот. Кроме того в жидкости куколок шелкопряда должны присутствовать молекулы, предохраняющие гемолимфу от окислительного стресса и инфицирования.
Установлено, что при фракционировании содержимого куколок на сефадексе G-25 получают три пика веществ, поглощающих ультрафиолет при длинах волн 260 и 280 нм. При диск-электрофорезе содержимого куколок китайского дубового шелкопряда выделяется 8 фракций белков, четко делящихся на три группы по электрофоретической подвижности белков.
Разделение методом тонкослойной хроматографии на силикагеле выявило наличие нескольких флуоресцирующих компонентов гемолимфы. Количественная реакция указывает на наличие дигидроксихинонов. Концентрация свободных низкомолекулярных продуктов, содержащих сульфгидрильные группы оказалась низкой ~ 10-6 М. В гемолимфе куколок присутствуют водо- и жирорастворимые витамины (особенно большое количество аскорбиновой кислоты). Общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок китайского дубового шелкопряда составляет 14-16 г/л, в том числе обнаружены (М±m, ммоль/л) глутамин (19,07±1,886), аланин (18,33±2,601), глицин (17,15±0,907), серин (13,13±1,711), треонин (10,28±0,272), гистидин (10,26±0,367), лизин (8,659±0,586), валин (8,162±0,193), пролин (5,586±0,409), лейцин (4,763±0,133), аспарагиновая кислота (4,700±0,561), изолейцин (4,337±0,145), тирозин (2,530±0,230), цитрулин (2,152±0,141), фенилаланин (1,043±0,070), таурин (0,976±0,112), глутаминовая кислота (0,899±0,081), метионин (0,672±0,083), бета-аланин (0,511±0,029), этаноламин (0,227±0,016), орнитин (0,044±0,004). Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии не выявлены аминокислоты аспарагин, цистеин и триптофан. По сравнению со спектром свободных аминокислот растений в жидком содержимом куколок содержится больше глицина, лизина, гистидина, пролина и глутамина, а также снижено содержание глутаминовой кислоты и фенилаланина. Аминокислотный состав куколок близок к биологически полноценным белкам молока [9-13].
В 2007 году был описан антиоксидантный эффект гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда [1, 14].
Оказалось, что антиоксидантный эффект гемолимфы куколок шелкопряда существенно превышает антиоксидантную активность гемолимфы виноградных улиток (Helix pomatia L.). При вычислении ингибирования образования активных форм кислорода (АФК) установлено, что гемолимфа куколок китайского дубового шелкопряда эффективнее гемолимфы виноградных улиток в системе люминол + HCl в 200 раз, люминол + миелопероксидаза хрена + Н2О2 в 200 раз, генерации АФК нейтрофилами при адгезии в 700 раз, генерации АФК нейтрофилами при действии хемотаксического пептида f Met-Leu-Phe в 300 раз и генерации АФК нейтрофилами при действии латекса в 4000 раз. Следовательно, уникальное антиоксидантное действие гемолимфы шелкопряда наблюдается при степени ее разбавления на несколько порядков более высокой, чем у виноградных улиток.
В аминокислотный состав гемолимфы куколок дубового шелкопряда входят тирозин и таурин. Эти аминокислоты являются типичными физиологичными субстратами миелопероксидазы (МПО) и выявляются в фаголизосомах нейтрофилов, где осуществляется внутриклеточная деструкция патогенного материала при инфекционном заражении. Было показано, что богатые тирозином пептиды и белки могут связываться с активным центром МПО и ингибировать пероксидазную и галогенирующую активность фермента в отношении других субстратов. Вероятно, механизм антиоксидантного и антимикробного действия гемолимфы куколок также включает связывание компонентов гемолимфы с реакционным центром МПО, что приводит к ингибированию ее активности [15-22].
Помимо активных форм кислорода и хлора чрезвычайно высокой реакционной способностью и токсичным действием в отношении биосистем обладают активные формы азота, в первую очередь, пероксинитрит ONOO-, образование которого также имеет место при воспалении и при действии ксенобиотиков. Хемилюминесцентным методом удалось показать, что компоненты гемолимфы взаимодействуют с ONOO-. Cубстратом нитрования в гемолимфе куколок, по-видимому, является тирозин, продуктом реакции – нитротирозин.
В опытах in vitro показано, что уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах, подвергнутых действию окислителя (1 мМ tBOOH) в присутствие гемолимфы, был на 38 % выше, нежели в отсутствие протектора. Еще более выраженным антиоксидантным эффектом обладала гемолимфа шелкопряда, непосредственно извлеченная из куколки. Гемолимфа более чем на 65 % ингибировала процесс генерирования продуктов пероксидного окисления липидов в эритроцитах в присутствии 2 мМ tBOOH. Известно, что индуцируемое органическим пероксидом окислительное повреждение эритроцитов связано с генерацией алкоксильного и пероксильного радикалов в реакции окислителя с оксигемоглобином.
Можно предположить, что компоненты гемолимфы непосредственно взаимодействуют с образующимися радикалами либо ингибируют процессы их образования [23-26].
Установлено, что ни водный экстракт куколок тутового шелкопряда ни его фракции не оказали цитотоксического действия на культуру клеток нормальных фибробластов человека.
Таким образом, показано, что гидрофильные компоненты гемолимфы куколок дубового шелкопряда обладают антиоксидантным эффектом, взаимодействуют с системами антимикробной защиты, предохраняют мембраны клеток от пероксидного окисления липидов эукариотических клеток. Все вышеизложенное позволяет предложить использование водного экстракта куколок дубового шелкопряда или его фракций для оптимизации функционирования эукариотических клеток, в частности растительных клеток [1, 27-29].
Гомометаболические насекомые с полным превращением характеризуются тем, что у них между личиночной и взрослой стадиями происходит внезапная и резкая трансформация. Ювенильная личинка (гусеница) по мере роста претерпевает серию линек. Процесс линьки инициируется в мозге, нейросекреторные клетки которого в ответ на нервный, гормональный или средовый сигналы выделяют проторакотропный гормон (ПТТГ) – пептидный гормон с молекулярной массой 40 кДа, стимулирующий образование экдизона клетками проторакальной железы. С участием гидроксилазной системы периферических тканей экдизон превращается в активную форму – экдистерон. Развитие личинок до метаморфозной линьки контролирует ювенильный гормон, образуемый в прилежащих телах. В присутствии ювенильного гормона стимулирования экдизоном линька завершается переходом личинки в новый возраст. У личинок последнего возраста синтез ювенильного гормона постепенно прекращается и его содержание падает ниже порогового уровня. Это событие инициирует синтез экдизона и его превращение в экдистерон. Такой гормональный фон переводит клетки на путь, ведущий к окукливанию.
Личинка последнего возраста трансформируется в куколку. Куколка не питается, а живет за счет энергии пищи, потребляемой личинкой. В куколке происходят процессы гистолиза и гистогенеза. Гистолиз – разрушение подлежащих замене в ходе метаморфоза тканей и органов личинки, которое осуществляется при помощи автолиза, лиоцитоза и фагоцитоза. Содержимое куколки как бы возвращается к дифференцированному состоянию яйца. Гистолизу подвергаются все системы организма личинки, кроме нервной, половой, а также спинного сосуда. В дальнейшем гистолиз сменяется гистогенезом, конечной целью которого является построение из образовавшейся жидкой массы новых, имагинальных органов. Важную роль при гистогенезе также играют имагинальные зачатки – группы клеток, из которых возникают те или иные ткани и органы. Таким образом, в голометаболических личинках имеются две популяции клеток: личиночные клетки, функционирующие на ювенильных стадиях, и имагинальные клетки, собранные в кластеры, ждущие сигнала, чтобы приступить к дифференцировке [30]. Кроме того в гемолимфе обнаруживаются 5 типов циркулирующих гемоцитов: прогемациты (стволовые клетки), плазматоциты и три типа специализированных клеток [31, 32].
Ранее было показано, что реакции изолированных клеток на действие гидрофильных компонентов куколок дубового шелкопряда зависят от типа клеток и дозы экстракта: малые дозы стимулируют антиоксидантный эффект нейтрофилов, а относительно высокие дозы активируют фагоцитоз макрофагами и модулируют метаболизм и функции тканевых лимфоцитов [33].
1.2 Растительная тест – система Allium cepa
Allium-test – это растительная тест-система для оценки мутагенного, митозмодифицируещего и токсического эффектов факторов химической и физической природы на основе растения Allium cepa – лук репчатый (сорт «Штуттгартен»).
В Allium-test используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa, который впервые предложен Шведской Королевской Академией Наук как стандартный тест-объект.
Биотест разработан более 70 лет назад А. Леваном в 1938 и использовался для изучения эффекта влияния колхицина, получив много внимания в это время. В настоящее время термин Allium-test используется на ряду с постоянно увеличивающимся числом объектов и при этом продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов. После А. Левана разработкой биотестирования с помощью лука обыкновенного занимался шведский ученый Dr. Geirid Fiskesjo в 80-х годах [9].
В современных исследованиях Allium cepa L. считается эталонным растительным тест-объектом для анализа мутагенности, митотоксичности и токсичности различных факторов. Наряду с Allium-test используются и другие тест-объекты (среди растений наиболее часто горох Pisum sativum и бобы Vicia faba).
Данный метод является простым, экономичным, краткосрочным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор, «цитотоксичен» или «не цитотоксичен».
Allium-test рекомендован для исследования практически любых химических, физических и биологических факторов. По мере синтеза новых веществ, тест получает новые рекомендации, что делает его одним из наиболее популярных.
Allium-test рекомендован экспертами как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, так как результаты, полученные на данном тесте, показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях, насекомых, в том числе и млекопитающих и человеке.
Рекомендован в качестве альтернативы генотоксикологическим тестам на лабораторных животных (в том случае если для одних и тех же исследуемых веществ наблюдается одинаковый результат в данном тесте и тестах на животных, то есть если показана корреляция).
Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор.
Метод позволяет регистрировать хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, следствием которых является наличие мостов и фрагментов в ана- и телофазе. Метод позволяет выявить изменение поведения хромосом на веретене деления. Allium-test идеально подходит для проведения микроядерного теста.
Известный и распространённый тест Эймса по чувствительности и достоверности результатов значительно уступает Allium-test при оценке загрязнений. Кроме того Allium-test был рекомендован для тестирования образцов различных наноматериалов, тогда как тест Эймса оказался неприемлемы, в связи с ложноотрицательными результатами.
Исследование мутагенных свойств наночастиц диоксида титана на корневых меристемах Allium cepa и лимфоцитах человека показало, что оба теста проявляют сходную чувствительность к данному веществу.
Allium cepa L. в качестве тест объекта широко применяется для оценки генетического потенциала химических соединений, природных и сточных вод.
Лук имеет 16 хорошо прокрашиваемых хромосом (2n=16). Продолжительность клеточного цикла составляет примерно 17,8 часа. Митотический индекс может колебаться в разных корнях одного и того же растения, но усреднённые данные являются достаточно устойчивыми. Продолжительность митоза в разных тканях корня Allium cepa одинакова и не меняется по длине корня. Соотношение различных фаз митоза не зависит от времени фиксации.
Наиболее часто применяется анализ частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза (ана-телофазный тест). В этом тесте регистрируются хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, а также нарушения веретена деления по частоте отставания хромосом, многополюсных и асимметричных митозов. Ана-телофазный метод с использованием лука в качестве тест-объекта рекомендован в качестве тест-объекта природных сред. При сравнении мутагенной активности химических загрязнителей, определённых в других токсикогенетических тестах с ана-телофазным методом установлено, что чувствительность его высока и составляет 82 %.
Однако учёт только хромосомных аберраций может привести к занижению реального генотоксического эффекта, например, по следующим причинам. Во-первых, эти методы не позволяют регистрировать генные мутации, которые возникают значительно чаще хромосомных. Во вторых, хромосомные мутации выявляются, как правило на фоне высокой митотической активности меристематических клеток. Повышенная токсичность факторов среды может вызывать снижение количества делящихся клеток за счёт задержки клеточного цикла в точках контроля, либо гибели части клеток, следовательно при этом искусственно снизится и частота регистрируемых хромосомных повреждений.
В настоящее время термин Allium-test используется наряду с постоянно увеличивающимся числом объектов и при этом продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов.
Растительные тест-системы получают всё большее распространение при оценке мутагенного загрязнения окружающей среды. Это обусловлено целым рядом преимуществ растений как индикаторов генотоксичности различных факторов, так и сигнальных объектов при генетическом мониторинге за состоянием окружающей среды [1, 14].
1.3 Митотическое деление клеток
Митоз (от греч. Mitos – нить), называемый также кариокинезом, или непрямым делением клеток, является универсальным механизмом деления клеток. Митоз следует за G2-периодом и завершает клеточный цикл.
Он длится 1-3 часа и обеспечивает равномерное распределение генетического материала в дочерние клетки. Митоз включает 4 основные фазы: профазу, метафазу, анафазу и телофазу.
Митоз – это один из фундаментальных процессов онтогенеза. Митотическое деление обеспечивает рост многоклеточных эукариот за счёт увеличения популяций клеток тканей.
В результате митотического деления клеток меристем увеличивается количество клеток тканей растений. Дробление оплодотворённого яйца и рост большинства тканей у животных также происходит путём митотических делений.
На основании морфологических особенностей митоз условно подразделяется на стадии: профазу, прометафазу, метафазу, анафазу, телофазу. Первые описания фаз митоза и установление их последовательности были предприняты в 70-80-х годах XIX века. В конце 1870-х годов немецкий гистолог Вальтер Флемминг для обозначения процесса непрямого деления клетки ввёл термин «митоз».
Продолжительность митоза в среднем составляет 1-2 часа. Митоз клеток животных, как правило, длится 30-60 минут, а растений – 2-3 часа. За 70 лет в теле человека суммарно осуществляется порядка 1014 клеточных делений [34].
Первые неполные описания, касающиеся поведения и изменения ядер в делящихся клетках, встречаются в работах учёных начала 1870-х годов.
В работе русского ботаника Руссова, датируемой 1872 годом, отчётливо описаны и изображены метафазные и анафазные пластинки, состоящие из отдельных хромосом.
Годом позже немецкий зоолог Г.А. Шнейдер ещё более отчётливо и последовательно, но, конечно, не совсем полно описал митотическое деление на примере дробящихся яиц прямокишечной турбеллярии Mesostomum. В его работе, в сущности, описаны и проиллюстрированы в правильной последовательности основные фазы митоза: профаза, метафаза, анафаза (ранняя и поздняя). В 1874 году московский ботаник И.Д. Чистяков также наблюдал отдельные фазы клеточного деления в спорах плаунов и хвощей. Несмотря на первые успехи ни Руссову, ни Шнейдеру, ни Чистякову не удалось дать чёткое и последовательное описание митотического деления.
В 1875 году вышли работы, содержащие более детальные описания митозов. О. Бючли дал описание цитологических картин в дробящихся яйцах круглых червей и моллюсков и в сперматогенных клетках насекомых.
Э. Страсбургер исследовал митотическое деление в клетках зелёной водоросли спирогиры, в материнских клетках пыльцы лука и в материнских споровых клетках плауна. Ссылаясь на работу О. Бючли и основываясь на собственных исследованиях, Э. Страсбургер обратил внимание на единство процессов клеточного деления в растительных и животных клетках.
К концу 1878 – началу 1879 года появились подробные работы Шлейхера и В. Флемминга. В своей работе в 1879 году Шлейхер предложил термин «кариокинез» для обозначения сложных процессов клеточного деления, подразумевая перемещения составных частей ядра. Вальтер Флемминг впервые для обозначения непрямого деления клетки ввёл термин «митоз», который впоследствии стал общепринятым. Также Флеммингу принадлежит окончательная формулировка определения митоза как циклического процесса, завершающегося разделением хромосом между дочерними клетками [29].
В 1880 г. О.В. Баранецкий установил спиральное строение хромосом. В ходе дальнейших исследований были развиты представления о спирализации и деспирализации хромосом во время митотического цикла.
В начале 1900-х годов хромосомы были идентифицированы в качестве носителей наследственной информации, что в дальнейшем дало объяснение биологической роли митоза, заключающейся в образовании генетически идентичных дочерних клеток [13].
В 1970-х годах началась расшифровка и детальное изучение регуляторов митотического деления, благодаря серии экспериментов по слиянию клеток, находящихся на разных этапах клеточного цикла. В тех опытах, когда клетку в М-фазе объединяли с клеткой, находящейся в любой из стадий интерфазы (G1, S или G2), интерфазные клетки переходили в митотическое состояние (начиналась конденсация хромосом и распадалась ядерная оболочка).
В итоге был сделан вывод, что в цитоплазмемитотической клетки присутствует фактор (или факторы), стимулирующий митоз, или, иначе, М-стимулирующий фактор (МСФ, от англ. M-phase-promoting factor, MPF).
Впервые «фактор стимуляции митоза» был открыт в зрелых неоплодотворенных яйцах шпорцевой лягушки, находящихся в М-фазе клеточного цикла. Цитоплазма такого яйца, инъецированная в ооцит, приводила к преждевременному переходу в М-фазу и к началу созревания ооцита (первоначально сокращение MPF означало Maturation Promoting Factor, что переводится как «фактор, способствующий созреванию»). В ходе дальнейших экспериментов были установлены универсальное значение и вместе с тем высокая степень консервативности «фактора стимуляции митоза»: экстракты, приготовленные из митотических клеток весьма разнообразных организмов, при введении в ооциты шпорцевой лягушки переводили их в М-фазу.
В ходе последующих исследований выяснилось, что фактор, стимулирующий митоз, представляет собой гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина и зависимой от циклина протеинкиназы. Циклин является регуляторным белком и обнаруживается у всех эукариот. Его концентрация периодически возрастает в течение клеточного цикла, достигая максимума в метафазе митоза. С началом анафазы наблюдается резкое сокращение концентрации циклина, вследствие его расщепления с помощью сложных белковых протеолитических комплексов – протеосом. Зависимая от циклина протеинкиназа представляет собой фермент (фосфорилазу), модифицирующий белки за счёт переноса фосфатной группы от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Таким образом, с установления роли и структуры основного регулятора митотического деления начались исследования тонких регуляторных механизмов митоза, которые продолжаются до настоящего времени [35].
Выработка единой типологии и классификации митозов осложняется целым спектром признаков, которые в различных комбинациях создают разнообразие и неоднородность картин митотического деления. При этом отдельные варианты классификации, разработанные применительно к одним таксонам, являются неприемлемыми в отношении других, поскольку не учитывают специфики их митозов. Например, отдельные варианты классификации митозов, свойственных животным или растительным организмам, оказываются неприемлемыми для водорослей.
Одним из ключевых признаков, лежащих в основе различных типологий и классификаций митотического деления, является поведение ядерной оболочки. Если образование веретена и само митотическое деление протекает внутри ядра без разрушения ядерной оболочки, то такой тип митоза называют закрытым. Митоз с распадом ядерной оболочки, соответственно, называется открытым, а митоз с распадом оболочки только на полюсах веретена, с образованием «полярных окон» – полузакрытым.
Ещё одним характерным признаком является тип симметрии митотического веретена. При плевромитозе веретено деления билатерально симметрично либо асимметрично и состоит, как правило, из двух полуверетён, располагающихся в метафазе-анафазе под углом друг к другу. Для категории ортомитозов характерна биполярная симметрия веретена деления, а в метафазе зачастую наблюдается различимая экваториальная пластинка.
В рамках обозначенных признаков наиболее многочисленным является типичный открытый ортомитоз, на примере, которого ниже рассматриваются принципы и стадии митотического деления. Данный тип митоза характерен для животных, высших растений и некоторых простейших [35-37].
Профаза начинается с конденсации хромосом, которые становятся видимыми в световой микроскоп как нитевидные структуры. Каждая хромосома состоит из двух параллельно лежащих сестринских хроматид, связанных в области центромеры. Ядрышко и ядерная оболочка к концу фазы исчезают (последняя распадается на мембранные пузырьки, сходные с элементами ЭПС, а поровый комплекс и ламина диссоциируют на субъединицы). Кариоплазма смешивается с цитоплазмой.
Центриоли мигрируют к противоположным полюсам клетки и дают начало нитям митотического (ахроматинового) веретена. В области центромеры образуются особые белковые комплексы – кинетохоры, к которым прикрепляются некоторые микротрубочки веретена (кинетохорные микротрубочки); показано, что кинетохоры сами способны индуцировать сборку микротрубочек и поэтому могут служить центрами организации микротрубочек. Остальные микротрубочки веретена называются полюсными, так как они протягиваются от одного полюса клетки к другому; лежащие вне веретена микротрубочки, расходящиеся радиально от клеточных центров к плазмолемме, получили наименование астральных или микротрубочек (нитей) сияния.
Метафаза соответствует максимальному уровню конденсации хромосом, которые выстраиваются в области экватора митотического веретена, образуя картину экваториальной (метафазной) пластинки (вид сбоку) или материнской звезды (вид со стороны полюсов). Хромосомы перемещаются в экваториальную плоскость и удерживаются в ней благодаря сбалансированному натяжению кинетохорных микротрубочек. Сестринские хроматиды к концу этой фазы разделяются щелью, однако удерживаются в области центромеры.
Анафаза начинается с синхронного расщепления всех хромосом на сестринские хроматиды (в области центромеры) и движения дочерних хромосом к противоположным полюсам клетки, которое происходит вдоль микротрубочек веретена со скоростью 0,2-0,5 мкм/мин. Сигнал к началу анафазы включает резкое (на порядок) повышение концентрации катионов кальция в гиалоплазме, выделяемого мембранными пузырьками, образующими скопления у полюсов веретена. Механизм движения хромосом в анафазе окончательно не выяснен, однако установлено, что в области веретена помимо актина имеются такие белки как миозин и динеин, а также ряд регуляторных белков. По некоторым наблюдениям, оно обусловлено укорочением (разборкой) микротрубочек, прикрепленных к кинетохорам. Анафаза характеризуется удлинением митотического веретена за счет некоторого расхождения полюсов клетки. Она завершается скоплением на полюсах клетки двух идентичных наборов хромосом, которые образуют картины звезд (стадия дочерних звезд). В конце анафазы благодаря сокращению актиновых микрофиламентов, концентрирующихся по окружности клетки (сократимое кольцо), начинает образовываться клеточная перетяжка, которая углубляясь, в следующей фазе приведет к цитотомии.
Телофаза – это конечная стадия митоза, в течение которой реконструируются ядра дочерних клеток и завершается их разделение. Вокруг конденсированных хромосом дочерних клеток из мембранных пузырьков (по другим данным, из ЭПС) восстанавливается кариолемма, с которой связывается формирующаяся ламина, вновь появляются ядрышки, которые образуются из участков соответствующих хромосом. Ядра клеток постепенно увеличиваются, а хромосомы прогрессивно деспирализуются и исчезают, замещаясь картиной хроматина интерфазного ядpa. Одновременно происходит углубление клеточной перетяжки, и клетки в течение некоторого времени остаются связанными суживающимся цитоплазматическим мостиком, содержащим пучок микротрубочек (срединное тельце). Дальнейшая перешнуровка цитоплазмы завершается формированием двух дочерних клеток. В телофазе происходит распределение органелл между дочерними клетками; равномерности этого процесса способствует то, что одни органеллы достаточно многочисленны (например, митохондрии), другие (подобно ЭПС и комплексу Гольджи) во время митоза распадаются на мелкие фрагменты и пузырьки.
Атипические митозы возникают при повреждении митотического аппарата и характеризуются неравномерным распределением генетического материала между клетками – анэуплоидией (от греч. аn – не, eu – правильное, ploon – складываю); во многих случаях цитотомия отсутствует, в результате чего формируются гигантские клетки. Атипические митозы характерны для злокачественных опухолей и облученных тканей. Чем выше их частота и чем значительнее степень анэуплоидии, тем более злокачественной является опухоль. Нарушение нормального митотического деления клеток может обусловливаться аномалиями хромосом, которые называют хромосомными аберрациями (от лат. Aberratio – отклонение). Вариантами хромосомных аберраций служат слипание хромосом, их разрыв на фрагменты, выпадение участка, обмен фрагментами, удвоение отдельных участков хромосом и др. Хромосомные аберрации могут возникать спонтанно, но чаще развиваются вследствие действия на клетки мутагенов и ионизирующего облучения.
Кариотипирование – диагностическое исследование с целью оценки кариотипа (набора хромосом) производится путем изучения хромосом в метафазной пластинке. Для кариотипирования получают культуру клеток, в которую вводят колхицин – вещество, блокирующее формирование митотического веретена. Из таких клеток извлекают хромосомы, которые далее окрашивают и идентифицируют. Нормальный кариотип человека представлен 46 хромосомами – 22 парами аутосом и двумя половыми хромосомами (XY у мужчин и XX у женщин). Кариотипирование позволяет диагностировать ряд заболеваний, связанных с хромосомными аномалиями, в частности, синдромы Дауна (трисомия 21-й хромосомы), Эдвардса (трисомия 18-й хромосомы), Патау (трисомия 13-й хромосомы), а также ряд синдромов, связанных с аномалиями половых хромосом – синдром Кляйнфельтера (генотип – XXY), Турнера (генотип – ХО) и другие [35].
Предполагается, что сложный митотический процесс высших организмов развивался постепенно из механизмов деления прокариот. Это предположение подтверждается тем, что прокариоты появились около миллиарда лет раньше первых эукариот. Кроме того, в митозе эукариот и бинарном делении прокариот принимают участие схожие белки.
Возможные промежуточные стадии между бинарным делением и митозом можно проследить у одноклеточных эукариот, у которых в ходе деления не разрушается ядерная оболочка. У большинства же других эукариот, в том числе растений и животных, веретено деления формируется вне ядра, а ядерная оболочка разрушается в течение митоза. Хотя митоз у одноклеточных эукариот ещё недостаточно изучен, можно предположить, что он произошёл от бинарного деления и в конечном счёте достиг того уровня сложности, который имеется у многоклеточных организмов.
У многих простейших эукариот митоз также остался процессом, связанным с мембраной, однако теперь уже не плазматической, а ядерной.
Основными регуляторными механизмами митоза являются процессы фосфорилирования и протеолиза.
Обратимые реакции фосфорилирования и дефосфорилирования обеспечивают протекание обратимых событий митоза, таких как сборка/распад веретена деления или распад/восстановление ядерной оболочки. Протеолиз лежит в основе необратимых событий митоза, таких как разделение сестринских хроматид в анафазе или разрушение митотических циклинов на поздних стадиях митоза.
Деление всех эукариотических клеток сопряжено с формированием специального аппарата клеточного деления.
Активная роль в митотическом делении клеток зачастую отведена цитоскелетным структурам. Универсальным как для животных, так и для растительных клеток является двухполюсное митотическое веретено, состоящее из микротрубочек и связанных с ними белков. Веретено деления обеспечивает строго одинаковое распределение хромосом между полюсами деления, в области которых в телофазе образуются ядра дочерних клеток.
Процесс митоза обеспечивает строго равномерное распределение хромосом между двумя дочерними ядрами, так что в многоклеточном организме все клетки имеют совершенно одинаковые (по числу и по характеру) наборы хромосом.
Хромосомы содержат генетическую информацию, закодированную в ДНК, и поэтому регулярный, упорядоченный митотический процесс обеспечивает также полную передачу всей информации каждому из дочерних ядер; в результате каждая клетка обладает всей генетической информацией, необходимой для развития всех признаков организма. В связи с этим становится понятно, почему одна клетка, взятая из полностью дифференцированного взрослого растения, может при подходящих условиях развиться в целое растение. Мы описали митоз в диплоидной клетке, но этот процесс протекает сходным образом и в гаплоидных клетках, например в клетках гаметофитного поколения растений [37].
1.4 Патология митоза
Патология митоза развивается при нарушении нормального течения митотического деления и зачастую приводит к возникновению клеток с несбалансированными кариотипами, следовательно, ведёт к развитию мутаций и анеуплоидии. Также в результате развития отдельных форм патологии наблюдаются хромосомные аберрации. Незавершённые митозы, прекращающиеся по причине дезорганизации или разрушения митотического аппарата приводят к образованию полиплоидных клеток. Полиплоидия и формирование многоядерных клеток возникают в случае нарушений механизмов цитокинеза. При значительных последствиях патологии митоза возможна гибель клетки. В нормальных тканях патология встречается в незначительных количествах. Условно различают патологию митоза функционального и органического типа. К функциональным нарушениям относят, например, гипореактивность вступающих в митоз клеток – снижение реакции на физиологические регуляторы, определяющие интенсивность пролиферации нормальных клеток. Органические нарушения возникают при повреждении структур, участвующих в митотическом делении (хромосомы, митотический аппарат, клеточная поверхность), а также при нарушении процессов, связанных с данными структурами (репликация ДНК, образование веретена деления, движение хромосом, цитокинез) [35].
На основании морфологических признаков и цитохимических нарушений митотического процесса выделяют три основных группы патологии митоза: патология, связанная с повреждением хромосом; патология, связанная с повреждением митотического аппарата; нарушение цитокинеза.
I. Патология митоза, связанная с повреждением хромосом:
1) Задержка митоза наблюдается при нарушениях репликации ДНК;
2) Раннее (преждевременное) разделение хроматид в профазе (в норме разделение хроматид происходит на рубеже перехода метафазы в анафазу). Обозначенная патология наблюдается, к примеру, при изменении осмотического давления в фибробластах кролика в культуре ткани или же при воздействии канцерогенов (бензопирена, метилхолантрена) на мышиные фибробласты;
3) Фрагментация и пульверизация хромосом возникает в опухолевых клетках, при вирусной инфекции, в результате воздействия на нормальные клетки ионизирующего излучения или мутагенов. Фрагменты могут быть одиночными, парными и множественными. Те из них, которые лишены центромерного участка, не участвуют в метакинезе, и, соответственно, не расходятся к полюсам деления в анафазе. При массовой фрагментации хромосом (пульверизация) большинство фрагментов также беспорядочно рассеиваются в цитоплазме и не участвуют в метакинезе.
В итоге часть фрагментов хромосом может попасть в одно из дочерних ядер, либо резорбироваться, либо образовать обособленное микроядро. Также отдельные фрагменты обладают способностью воссоединяться своими концами, причём подобные воссоединения носят случайный характер и приводят к хромосомным аберрациям;
4) Хромосомные и хроматидные мосты являются следствием фрагментации хромосом. При воссоединении фрагментов содержащих центромер образуется дицентрическая хромосома, которая в ходе анафазы растягивается между противоположными полюсами деления, образуя мост. Хромосомный (обычно двойной) мост возникает в результате воссоединения фрагментов хромосом, каждый из которых образован двумя хроматидами с центромерой. Хроматидный (обычно одиночный) мост возникает в результате воссоединения двух фрагментов отдельных хроматид с центромерой.
К концу анафазы – в начале телофазы мосты обычно быстро рвутся в результате чрезмерного растягивания дицентрических фрагментов хромосом. Образование мостов приводит к генотипической разнородности дочерних клеток, а также нарушает течение завершающих стадий деления и задерживает цитокинез;
5) Отставание хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникает при повреждении хромосом в области кинетохора. Поврежденные хромосомы пассивно «дрейфуют» в цитоплазме и в итоге либо разрушаются и элиминируются из клетки, либо случайным образом попадают в одно из дочерних ядер, либо образуют отдельное микроядро. Отставание хромосом наблюдалось в культурах ткани опухолевых клеток, а также в экспериментах, в ходе которых кинетохоры хромосом облучались микропучком ультрафиолетовых лучей;
6) Образование микроядер происходит вследствие фрагментации или отставания отдельных хромосом, вокруг которых в телофазе формируется ядерная оболочка, параллельно образованию оболочки вокруг основных дочерних ядер. Новообразованные микроядра либо сохраняются в клетке в течение всего дальнейшего клеточного цикла вплоть до очередного деления, либо подвергаются пикнозу, разрушаются и выводятся из клетки;
7) При нерасхождении хромосом сестринские хроматиды не разъединяются с началом анафазы и вместе отходят к одному из полюсов, что приводит к анеуплоидии;
8) Набухание и слипание хромосом наблюдается в опухолевых клетках и при воздействии токсических доз различных митотических ядов. Вследствие набухания хромосомы теряют свои нормальные очертания и слипаются, превращаясь в комковатые массы. Расхождения хромосом не происходит и клетки в таком состоянии зачастую погибают.
II. Патология митоза, связанная с повреждением митотического аппарата:
1) Задержка митоза в метафазе характерна для всей группы патологий митоза, связанных с повреждением митотического аппарата;
2) Рассеивание хромосом в метафазе происходит в результате повреждения или полной дезорганизации митотического аппарата;
3) Многополюсный митоз связан с аномалией репродукции центриолей, что ведет к формированию дополнительных полюсов и веретен деления. В итоге хромосомы распределяются неравномерно между дочерними ядрами, что в свою очередь ведет к образованию анеуплоидных клеток с несбалансированным набором хромосом;
4) Моноцентрический анафазамитоз связан с нарушением разделения центриолей. При этом формируется лишь один полюс, от которого расходятся нити единственного полуверетена. В итоге моноцентрический митоз приводит к полиплоидизации;
5) Асимметричный митоз характеризуется непропорциональным развитием противоположных полюсов деления, что приводит к неравномерному распределению хромосом между дочерними ядрами, то есть к анеуплоидии. В результате асимметричный митоз приводит к образованию микроклеток и гигантских клеток с гипо- и гиперплоидными ядрами;
6) Трехгрупповая метафаза и метафаза с полярными хромосомами характеризуется наличием в метафазе помимо основной экваториальной пластинки ещё двух групп или отдельных («полярных») хромосом в области полюсов деления клетки. Хромосомы сохраняются вблизи полюсов веретена из-за отставания в процессе метакинеза, а не из-за преждевременного расхождения. Причинами отставания могут служить повреждения кинетохора или дезорганизация отдельных хромосомальных нитей, участвующих в движении отстающих хромосом;
7) Полая метафаза представляет собой кольцевое скопление хромосом в экваториальной пластинке вдоль периферии клетки.
III. Патология митоза, связанная с нарушением цитотомии
Различают две группы патологии митоза, связанные с нарушением цитотомии: раннюю цитотомию, берущую начало ещё в анафазе; либо наоборот, запаздывание или полное отсутствие цитотомии, в результате чего формируются двуядерные клетки, либо образуется одно полиплоидное ядро [36].
1.5 Нарушение митотической активности клеток при облучении
Нарушение митотической активности клеток зависит от вида излучения и его энергии. Радиобиологический эффект излучений разного вида и неодинаковой энергии, но в одной и той же поглощенной дозе может быть различным.
Биохимическая природа радиационного нарушения в митозе клеток пока неизвестна. Предполагается, что в результате нарушения обмена веществ в клетке накапливаются метаболиты, ингибирующие деление клетки [38]. Например, есть данные, что накопление АТФ тормозит митоз. Установлено, что при облучении нарушается обмен нуклеиновых кислот. По-видимому, эти нарушения также ответственны за торможение или блокаду митоза клеток. Однако убедительных доказательств о связи между радиационным нарушением синтеза ДНК и торможением митоза еще нет.
Установлено, что облучение клеток на стадии интерфазы митоза приводит к замедлению процесса и даже его полной остановке. Однако митотические последствия облучения имеют ритмический характер: после уменьшения числа митозов митотическая активность или восстанавливается или даже усиливается, затем наступает новый спад ее и новое возвращение к норме или стимуляция и т.д. Объяснение этого эффекта весьма дискуссионно. По крайней мере, с внешней стороны, в этом процессе наблюдаются признаки, столь характерные для физиологической реакции торможения и возбуждения биологической системы. Пострадиационное (после облучения) уменьшение митотической активности клеток имеет еще ряд закономерностей. Время наступления минимума митотической активности клеток, длительность и степень торможения митоза зависят от биологической специфики облучаемых клеток, от дозы излучения и в определенных пределах от мощности дозы излучения. Митотическая радиоустойчивость также значительно различается для разных клеток. У дрожжей митотическая активность нарушается при дозах около 1000 рад, а у растительных и животных организмов при дозе 50 рад. Падение митотической активности в эпидермисе мыши обнаруживается уже при облучении в дозе около 5 рад.
Вообще следует отметить, что пострадиационное нарушение митотической активности весьма чувствительный тест на биологическое действие радиации. Другим морфологическим эффектом, наблюдаемым в клетках после облучения, являются повреждения хромосом (слипание, образование комков, набухание). Такое действие излучения на хромосомы называют диффузным, так как оно не локализовано, а распространяется на всю хромосому. Предполагается, что диффузное действие излучения на хромосому объясняется какими-то нарушениями в белковой части нуклеопротеидов. Как правило, это действие обратимо: деление клеток продолжается, и образование комков хромосом при последующих делениях не возобновляется. Однако могут быть и необратимые диффузные нарушения хромосом, приводящие к смерти клетки. Наблюдаются и другие повреждения хромосом локальные, ограничивающиеся одним или несколькими участками хромосом. Такие морфологические изменения хромосом называются аберрациями. Можно указать два типа хромосомных аберраций: поломки или разрывы хромосом и соединение фрагментов разных хромосом. Если нарушенная хромосома восстанавливает свое первоначальное состояние, то такой процесс называется реституцией. Соединение фрагментов хромосом приводит к появлению структурно новой хромосомы. Имеющиеся данные показывают, что разрывы хромосом являются следствием не только прямого поражения хромосом ионизирующими частицами, но главным образом следствием косвенного действия через радиационнохимические эффекты.
О косвенном действии излучения на появление хромосомных аберраций свидетельствует кислородный эффект. Установлено, что с увеличением дозы облучения число хромосомных аберраций увеличивается. Наблюдается также зависимость числа хромосомных аберраций от мощности дозы излучения. Облучение в одной дозе, но при большей мощности дозы вызывает больше аберраций, чем при облучении меньшей мощности дозы.
Хромосомные аберрации могут приводить к разным последствиям: нарушению обмена веществ, задержанию митоза, появлению морфологически видоизмененных клеток и новых генотипов. Крайним случаем является гибель клетки.
Выше рассматривались основные эффекты действия излучений на клетку. Необходимо отметить, что физиологическое действие радиации на клеточном уровне изучено еще очень мало. Несомненно, что нарушения обмена веществ в клетках, мембранах и других структурных элементах клетки приводят к нарушению всего механизма регуляторных физиологических функций клетки, проявляющемуся в ее реакции на внешние условия, в прохождении фаз и стадий роста и развития клетки. Наиболее изученным радиобиологическим эффектом, как уже отмечалось, является нарушение физиологической функции митоза. Более изучено физиологическое действие излучений на уровне целого многоклеточного организма.
Прежде всего, отметим, что у растений нет каких либо органов, которые были бы избирательно чувствительны к радиации. Хотя и могут быть местные локальные радиационные нарушения тех или иных тканей или органов многоклеточного организма, однако организм реагирует на любое действие ионизирующих излучений как единое целое [34-38].
1.6 Способы облучения растений
Радиобиологические эффекты у растений, как, впрочем, и у всех живых существ, зависят не только от значения дозы, но и от способа, посредством которого эта доза сообщалась организму.
Различают следующие способы облучения:
– острое однократное облучение, когда организм получает дозу за сравнительно короткий промежуток времени. При определенной длительности облучения радиобиологический эффект не зависит от мощности дозы радиации. Такой интервал и называют «коротким», длительность его зависит от физиологического состояния организма;
– острое фракционированное облучение, при котором доза накапливается за счет нескольких, в простейшем случае двух, фракций доз. Если фракции доз равны между собой, то говорят об эквивалентном фракционировании, а в противном случае о неэквивалентном фракционировании дозы. Интервалы между последовательными фракциями доз могут быть равными между собой либо различаться. Использование разных типов фракционированного облучения оказывается очень эффективным приемом в изучении радиобиологических процессов в живом организме;
– пролонгированным облучением называют способ радиационного воздействия, при котором организм получает дозу облучения за период, существенно превышающий интервал, названный выше «коротким».
Пролонгированное облучение может быть фракционированным и нефракционированным. При фракционированном пролонгированном облучении можно варьировать значение фракции дозы, интервалов между фракциями дозы, продолжительность облучения для каждой фракции дозы.
Хроническим называют непрерывное облучение, когда мощность дозы сохраняется постоянной либо изменяется на протяжении всей жизни организмов. Такому облучению в малых дозах растения подвергаются в природной среде за счет естественных радиоактивных элементов и космического излучения.
Облучение от инкорпорированных радионуклидов обычно имеет характер пролонгированного накопления дозы.
Кроме приведенных выше характеристик условий облучения, связанных преимущественно со временем накопления дозы, различают равномерное и неравномерное, гетерогенное облучение организма.
В первом случае любая часть растения получает одинаковую дозу радиации, во втором – разные дозы. Иногда облучают только отдельные органы растения. При одной и той же дозе облучения радиобиологические эффекты могут оказаться различными, что зависит от способа облучения. В опытах с растениями не всегда достаточно полно учитывались условия облучения (это относится к опытам, главным образом, начального периода развития радиобиологии растений), поэтому результаты их подчас оказывались несопоставимыми.
Вместе с тем, прослеживая связь между способом облучения и характером радиобиологической реакции, можно получать ценную информацию о механизмах формирования радиационного синдрома у растений.
Гибель облученных растений может наступать в разное время после облучения. Поэтому выживаемость растений следует проводить в определенное время и указывать, на какой день после облучения оценивалась доля сохранившиеся растений. В случае хронического облучения эффект оценивают на определенный момент после начала облучения [35].
2 Объект, программа и методика исследований
2.1 Объект и программа исследований
Объектом исследований являются меристематические клетки корешков проростков Allium cepa L.
Программа исследований включала следующие этапы:
1. Проращивание луковиц в тестируемых растворах. Измерение длины корней, подсчет числа корней на луковице и определение морфологических изменений корней, фиксация материала для цитогенетического анализа.
2. Микроскопирование препаратов, статистическая обработка результатов, анализ влияния различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на изменение цитогенетических параметров у Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.
2.2 Методика исследований
Биотестирование различных концентраций ВЭКШ выполняли с помощью Allium-теста [34].
Были выполнены две серии экспериментов.
Первая серия – использовали луковицы лука, хранившиеся в нормальных условиях. Цель работы – выявление оптимальных концентраций ВЭКШ на позитивный рост и развитие луковиц.
Вторая серия – использовали луковицы, предварительно подвергшиеся хроническому облучению. В исследованиях использовали луковицы лука посевного (Allium cepa L., сорт «Штуттгартен», диаметром 2,0-2,5 см). Хроническое облучение луковиц проводили на установке УОГ-1 с источником излучения цезий-137 (мощность дозы 0,339 мк Гр/с). Луковицы облучали в течение 74 суток до суммарной дозы 5,71 Гр. Предполагается, что облучение в такой дозе может подавлять рост и развитие растений лука. Проращивание выполняли спустя 1-3 суток после облучения.
Перед началом эксперимента луковицы A. cepa выдерживали при 40 С для активизации и синхронизации процесса прорастания на протяжении двух недель [35]. В эксперименте на каждый вариант использовали в трех повторностях по 12 репчатых луковиц сорта «Штуттгартен», диаметром 2,0-2,5 см. Предварительно у луковиц удалили внешние чешуи и коричневую нижнюю пластинку, а затем поместили в 20-мл пробирки, наполненные дистиллированной водой. Проращивание луковиц проводили при комнатной температуре 20-250 С при естественном освещении. Через 48 часов отобрали на каждую повторность по 10 наиболее развитых луковицы, и поместили их на 24 часа в тестируемые растворы ВЭКШ (таблица 1).
Для приготовления маточного водного раствора экстракта и последующих разведений использовали дистиллированную воду. Маточный водный раствор экстракта куколок китайского дубового шелкопряда получали в соответствии с авторским свидетельством СССР № 1787439А1 (Трокоз В.А., Лотош Т.Д., Абрамова А.Б. и др.). Нормирование исходного ВЭКШ проводили по сумме свободных аминокислот путем разведения до концентрации 550 мг/л. Такой экстракт использовали для приготовления 6 вариантов разведений экстракта. В качестве основного контроля использовали дистиллированную воду (к1), и дополнительного контроля – водопроводную воду (к2). Выбор дистиллированной воды обоснован в работе [36].
Таблица 1 − Тестируемые концентрации водного экстракта
|
Концентрация экстракта на 100 мл воды, мл |
Номер варианта опыта |
|
10,0 |
о1 |
|
1,0 |
о2 |
|
0,1 |
о3 |
|
0,01 |
о4 |
|
0,001 |
о5 |
|
0,0001 |
о6 |
Воду и растворы для обеспечения аэрации меняли каждые 24 часа. Через 72 часа культивирования (от начала проращивания) выполняли фиксацию корешков в растворе Карнуа, в течение 24 часов, в холодильнике. Фиксацию корешков проводили с 8 до 9 часов [37]. Для фиксации отрезали от каждой из 10 луковиц кончики корешков длиной не более 1,0 см (игнорируя самые длинные и самые короткие корешки). Хранили материал в холодильнике до приготовления препаратов. Давленые препараты для цитогенетического анализа, окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [38].
Анализировали по 10-30 проростков в варианте. В каждом препарате учитывали все клетки на стадиях интерфазы, профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Для выявления стадии митоза, на которой происходит митотический блок, подсчитывали относительную продолжительность фаз митоза. Возможность ингибирующего либо стимулирующего эффектов ВЭКШ оценивали с использованием метафазного и ана-телофазного метода учета перестроек хромосом в клетках корневых меристем лука. Патологию митоза (ПМ) подсчитывали как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток [29] и классифицировали отдельно для каждого корешка по И.А. Алову с незначительной модификацией [39]. Наряду с аберрациями (мостами и фрагментами), учитывали прочие цитогенетические нарушения, не связанные с повреждениями хромосом: отставание хромосом в метафазе или при расхождении к полюсам делящихся клеток, их слипание, асимметричное расположение веретена деления. Для получения более точной оценки по критерию «патология митоза» вычисляли их частоту без учета профаз. Также подсчитывали число клеток с микроядрами, отмечая их количество в клетке и размеры. Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе Leica Gallen III при увеличении 600. По каждому варианту было просмотрено более 20 000 клеток.
После определения оптимальных концентраций ВЭКШ (таблица 2) в первой серии экспериментов, выполнили вторую серию экспериментов с использованием облученных луковиц. Этапы и содержание работы – аналогично вышеизложенному.
Таблица 2 – Схема второй серии экспериментов
|
Варианты опыта с облучением |
Н2О |
о1 (10 мл в 100 мл Н2О) |
о3 (0,1 мл в 100 мл Н2О) |
о6 (0,001 мл в 100 мл Н2О) |
|
луковицы |
к |
к-о1 |
к-о3 |
к-о6 |
|
луковицы облученные |
I-к |
I-о1 |
I-о3 |
I-о6 |
Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили на персональном компьютере с помощью программ Statistica 6.0 с расчетом выборочной средней и стандартной ошибки среднего.
Для сравнения выборок по митотической активности, доли клеток на стадиях митоза и по патологиям митоза использовали t-критерий Стьюдента.
3 Результаты исследований и их обсуждение
3.1 Цитогенетические и морфометрические параметры Allium cepa L. в норме
3.1.1 Морфометрические параметры Allium cepa L.
Корневые меристемные клетки содержат определенные энзимы, выполняющие роли оксидаз, которые способствуют превращению многих немутагенных веществ в мутагенные. Эта система активации позволяет обнаружить те химические вещества, которые усиливают свой негативный эффект в процессе метаболизма. Ростовые процессы луковиц Allium cepa включают в себя большое количество клеточных метаболизмов: это деление клеток, прежде всего корневой меристемы, а на следующей фазе роста – листовой меристемы, растяжение клеток, их дифференциация и т.д. Мы исследовали влияние различных концентраций экстракта на морфологические параметры растений лука.
Параметр «число корней на луковице» характеризуется довольно значительным уровнем изменчивости, от 20 до 32 %. Среднее число корней на луковице равнялось 18-23 (рисунок 1), независимо от состава водных растворов, на которых проводили проращивание.
Рисунок 1 – Зависимость длины корней Allium cepa L. от концентрации водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда
При оценке средней длины корней пучка не установлено существенных различий между большинством опытных и обоими контрольными вариантами. Большая часть корней развивалась с одинаковой интенсивностью и спустя 72 часа роста их длина составила 9,0-10,1 мм.
Достоверное превышение контрольного значения в к1 (при р<0,01) отмечали в варианте о4. Коэффициент вариации составил 25-38 % в вариантах: к1, к2, о1, о3. В остальных опытных вариантах отмечали изменчивость на уровне средней величины 16-19 %. Данные результаты свидетельствуют о снижении спектра изменчивости по параметру «длина корней пучка» при обработке луковиц низкими концентрациями экстракта.
Спустя 12 суток культивирования выполняли измерение длины всех корней на луковице. При анализе данного параметра дополнительно проводили ранжирование корней по длине, и в дальнейшем также работали с массивом, который включал результаты по 10 самым длинным корням. При вычислении корреляции между параметрами «длина всех корней на луковице» и «длина 10 самых длинных корней на луковице» было установлено, что коэффициент корреляции равен 0,99, что свидетельствует о сильной корреляционной зависимости.
В период окончательной оценки наблюдали значительный рост корней в контрольном варианте 2, где проращивание проводили на водопроводной воде. Можно предположить, что луковицы начинают испытывать недостаток в макро-и микросолях при культивировании свыше 3-4 суток. В остальных опытных вариантах с применением экстракта не наблюдали достоверных различий по сравнению с контролем. Следует подчеркнуть, что дальнейшее культивирование луковиц в течении еще дополнительных 8 суток не привело в опытных вариантах к увеличению параметра «средняя длина корней». Хотя, несомненно, рост корней в длину имел место. Однако, по-видимому, существенного прироста по длине корней не наблюдали по той причине, что в этот период происходило прорастание новых корней, и это нивелировало разницу по средней длине корней.
По морфологии все корни были определены как нормальные. Отмечали только незначительное изменение цвета корней в варианте о1. Они были более интенсивно окрашены в бежевый цвет, чем в других вариантах. Практически во всех вариантах наблюдали отдельные луковицы с корнями розоватого цвета. По-видимому, эта индивидуальная реакция конкретного генотипа.
Таким образом, при исследовании различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на развитие луковиц Allium cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые морфологические параметры.
3.1.2 Продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa L.
Изучение распределения клеток по стадиям митоза показало, что наибольшее их число, как в контрольных вариантах, так и в опытных, приходится на метафазу (27,2±2,9–51,0±6,8 %), доля клеток на стадиях ана- и телофазы суммарно составила 34,3±3,6–41,2±4,8 %, на стадии профазы – 11,1±2,1–35,4±4,0 % (рисунок 2).
Рисунок 2 – Относительная продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ
Расчет различных типов митотического индекса и определение долей делящихся клеток необходимы для регистрации времени прохождения клетками различных стадий митоза, в том числе выявления возможной задержки клеток на какой-либо стадии вследствие повреждения собственных структур под действием внешних или внутренних факторов любой природы.
Известно, что продолжительность разных стадий митоза в физиологических условиях неодинакова. Наиболее продолжительны стадии, связанные с процессами синтеза: профаза и телофаза. Стадии митоза, во время которых происходит движение хромосом, обычно осуществляются быстро. При сопоставлении прохождения фаз митоза в текущем эксперименте установлено, что наиболее близки к оптимальным условиям роста для меристематических клеток корней водные растворы, используемые в контроле 2 и вариантах опыта о5 и о6 (см. рисунок 2).Применение дистиллированной воды в контроле 1 изменяет темп прохождения клетками профазы в сторону ее сокращения, а метафазы – в сторону удлинения в сравнении с общепринятой нормой.
В зависимости от того, на какие синтетические процессы клеточного цикла влияют разные концентрации экстракта, происходит остановка клеточного деления на определенной стадии митоза (см. рисунок 2). Так, по сравнению с контролем 2 концентрации экстракта в вариантах опыта о1, о2, о3, о4 вызывали митотический блок на стадии метафазы, и концентрации экстракта в вариантах опыта о1, о2, о4, о5, о6 – на стадии телофазы.
3.1.3 Патология митоза
Поскольку многие соединения, индуцирующие или ингибирующие митотическую активность, часто способствуют возникновению мутаций в анализируемых тест-системах, мы исследовали способность ВЭКШ в различных концентрациях стимулировать или подавлять протекание патологических процессов в клетках корневой меристемы лука.
Установлено, что все тестируемые концентрации ВЭКШ не вызывают достоверное повышение показателя патологии митоза по сравнению с контролем 1. Причем, определение корреляционных отношений между ПМ с учетом профазы и ПМ без учета профазы выявило высокое положительное значение, равное 0,97. В сравнении с контролем 2 процент клеток с регистрируемой патологией митоза не изменяется в вариантах опыта о1, о2, о5, о6 и возрастает с 1,9±0,3 до 5,1±0,5-6,3±0,8 % в вариантах о3, о4, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования: 2-5 % [40-45].
Данные, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ. Низкое число патологий митоза в опытных вариантах позволяет предположить проявление высокой адаптивности у исследуемого объекта, возможно, в результате действия ВЭКШ.
Рисунок 3 – Патология митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ
3.1.4 Уровень и спектр патологий митоза
Спектр патологии митоза включал такие типы патологий как асимметричное расположение веретена деления, забегание и отставание хромосом в анафазе митоза, обособление единичных хромосом и группы хромосом в метафазе, мосты в анафазе и телофазе, то есть наиболее общие типы митотических нарушений. Выявлено, что в результате действия ВЭКШ при большинстве тестируемых концентраций сужается спектр различных патологий митоза по сравнению с контрольными вариантами в меристематических клетках корешков лука. Тот факт, что исходный опытный материал в контроле 1 и в контроле 2 характеризуется определенным спектром патологий митоза и показывает достаточно высокий уровень по каждому регистрируемому типу, свидетельствует об особенностях партии луковиц, которую использовали в опыте (таблица 3).
Таблица 3 − Уровень и спектр патологий митоза в корневой меристеме
Allium cepa под действием ВЭКШ
|
Вари- анты опыта |
Асимметричное расположение веретена деления |
Отставание и забегание хромосом в анафазе, обособление хромосом |
Мосты |
Фрагмен-тация хромосом |
Микроядра |
|
к1 |
39,3±4,0 |
52,0±5,1 |
5,9 ±0,4 |
2,8 ±0,7 |
0,02±0,008 |
|
к2 |
39,8±4,1 |
44,3±4,1* |
6,8 ±0,7 |
9,1± 0,8** |
0 |
|
о1 |
35,0±4,2 |
65,0±7,1* |
0 |
0 |
0 |
|
о2 |
37,8±4,0 |
62,2±5,6* |
0 |
0 |
0,03±0,009 |
|
о3 |
40,0±4,2 |
57,4±5,0 |
2,6 ±0,4* |
2,0± 0,40 |
0,01±0,001* |
|
о4 |
22,3±2,1** |
77,7±8,6** |
0 |
0 |
0,01±0,001* |
|
о5 |
25,0±2,0* |
68,8±5,9** |
2,1± 0,3* |
4,1± 0,4 |
0,03±0,009 |
|
о6 |
28,6±2,5* |
71,4±6,8** |
0 |
0 |
0 |
|
Примечание: *Р<0,05; **Р <0,01 |
В данном эксперименте довольно высокую долю среди патологий митоза составляет асимметричное расположение митотического веретена, как в контрольных, так и в опытных вариантах.
В контрольных вариантах и в вариантах опыта о1, о2, о3 значения данного признака колеблются от 35,0±4,2 до 40,0±4,2 %, в вариантах о4, о5, о6 отмечено достоверное снижение значений до 22,3±2,1−28,6±2,5 % (Р<0,05). Следует подчеркнуть, что деление клетки нуждается не только в событиях, которые происходят в точной временной последовательности, но и в точном их расположении в месте деления. Чтобы гарантировать, что дочерние клетки получат одинаковые наборы ДНК, место деления должно разделять пополам митотическое веретено с определенной ориентацией.
Выявлено, что меристематические клетки корешков лука в контрольных вариантах содержат мосты, которые составляют 5,9±0,4−6,8±0,7 от всех патологий митоза. Действие экстракта существенно снижает величину встречаемости мостов в клетках до 2,6±0,4 % либо 0. Хромосомные и хроматидные мосты являются обычно следствием фрагментации хромосом, что прослеживается по нашим данным (см. табл. 3). Образование мостов приводит к генотипической разнородности дочерних клеток, а также нарушает течение завершающих стадий деления и задерживает цитокинез. Тестируемые концентрации экстракта, по-видимому, нивелируют негативные процессы, имеющие место при клеточном делении.
Поступление в межклеточное пространство и меристематические клетки повышенного количества комплекса аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов в результате использования ВЭКШ, по-видимому, замедляет метаболические процессы в связи с перестройкой, что и индуцировало увеличение числа клеток (Р<0,05; Р<0,01) с повреждениями в области кинетохора, у которых регистрировалось отставание и забегание хромосом в анафазе, обособление хромосом.
Образование микроядер происходит вследствие фрагментации или отставания отдельных хромосом, вокруг которых в телофазе формируется ядерная оболочка, параллельно образованию оболочки вокруг основных дочерних ядер. Новообразованные микроядра либо сохраняются в клетке в течение всего дальнейшего клеточного цикла вплоть до очередного деления, либо подвергаются пикнозу, разрушаются и выводятся из клетки.
В эксперименте обнаружено незначительное число микроядер как в контроле 1, так и в ряде вариантов опыта (от 0,01±0,001 % до 0,03±0,009 %), что, однако является тревожным моментом, поскольку их присутствие служит индикатором начала патологических процессов и нестабильности генома [45].
На основании данных таблицы следует отметить, что наиболее грубые патологии митоза (мосты, фрагментация хромосом, микроядра) не были выявлены при использовании ВЭКШ в максимальной и минимальной концентрациях, соответственно, 10 мл и 0,0001 мл ВЭКШ на 100 мл воды.
3.2 Цитогенетические и морфометрические параметры Allium cepa L. после радиоактивного облучения
3.2.1 Морфометрические параметры Allium cepa L.
Ростовые процессы луковиц Allium cepa включают в себя большое количество клеточных метаболизмов: это деление клеток, прежде всего корневой меристемы, а на следующей фазе роста – листовой меристемы, растяжение клеток, их дифференциация и т.д.
В ходе работы исследовали влияние различных концентраций экстракта на морфологические параметры растений лука и влияние облучения на цитогенетические и морфометрические параметры лука. Доза облучения луковиц равнялась 5,71 Гр.
Параметр «число корней на луковице» характеризуется довольно значительным уровнем изменчивости, от 20 до 32 %. Среднее число корней на луковице равнялось 17-24, которое существенно зависит от состава водных растворов, на которых проводили проращивание (рисунок 4).
Рисунок 4 – Зависимость длины корней Allium cepa L. от концентрации водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда и влияния радиоактивного облучения
При оценке средней длины корней пучка наблюдаются некоторые различия между опытными и обоими контрольными вариантами. Корни развивались не совсем одинаково и спустя 72 часа роста их длина составила 9,0-14,0 мм.
Достоверное уменьшение контрольного значения к-к (при р<0,01) отмечали в варианте I-к. Также уменьшение показателей наблюдали в вариантах опыта I-о1, I-о3 и I-о6, по сравнению с вариантами к-о1, к-о3 и к-о6 соответственно.
Коэффициент вариации составил 32-51 % в вариантах к-к, к-о1, к-о3, I-о3, I-о6, в вариантах опыта I-к, к-о6, I-о1 коэффициент вариации увеличивается и составляет 62-67 %.
Спустя 12 суток культивирования выполняли измерение длины всех корней на луковице. При анализе данного параметра дополнительно проводили ранжирование корней по длине, и в дальнейшем также работали с массивом, который включал результаты по 10 самым длинным корням. При вычислении корреляции между параметрами «длина всех корней на луковице» и «длина 10 самых длинных корней на луковице» было установлено, что коэффициент корреляции равен 0,91, что свидетельствует о сильной корреляционной зависимости.
В период окончательной оценки наблюдали значительный рост корней в контрольном варианте к-к, где проращивание проводили на дистиллированной воде (см. рисунок 4).
Можно предположить, что луковицы начинают испытывать недостаток в макро- и микросолях при культивировании свыше 3-4 суток. Достоверное превышение контрольного значения I-к (при р<0,01) отмечали в варианте опыта I-о3. Дальнейшее культивирование луковиц в течение еще дополнительных 8 суток не привело в опытных вариантах к увеличению параметра «средняя длина корней».
В большинстве вариантов по морфологии были определены как нормальные, но в некоторых вариантах наблюдалось незначительное количество коротких, слаборазвитых корней (к-о3, I-о1, I-о6). Отмечали незначительное изменение цвета корней в варианте опыта I-к. Корни были окрашены в бежево-коричневый цвет, по сравнению с остальными корнями.
Таким образом, при исследовании различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на развитие луковиц Allium cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые морфологические параметры.
Луковицы, которые ранее были облучены, имеют более низкие показатели длины корней, что наблюдается во всех опытных вариантах, по сравнению с луковицами, находящимися в норме.
3.2.2 Митотический индекс
Анализ данных микроскопического исследования выявил, что при всех тестируемых концентрациях экстракта встречаются видимые изменения в размерах и морфологии меристематических клеток лука. При воздействии на корешки экстракта определяли единичные клетки большого размера и до 1 % интерфазных фрагментированных клеток. Последние были представлены в виде клеток, не содержащих генетический материал, т.е. это какая-то часть цитоплазмы в межклеточном пространстве, либо это отдельные компоненты цитоплазмы с обособленной частью материала ДНК. По-нашему мнению, химические соединения фрагментов клеток могут включаться в различные метаболические пути и тем самым выполнять позитивную роль, но фрагменты могут и чисто механически мешать дальнейшему делению близлежащих клеток.
Для многоклеточных организмов любое нарушение митотической активности клеток является потенциально опасным, поскольку может приводить к серьезным отклонениям от нормального роста и развития. Мы изучали способность экстракта влиять на пролиферирующую активность клеток корневой меристемы лука, используя показатели «митотический индекс» и «метафазно-профазный индекс». Результаты исследований суммированы на рисунке 5.
Рисунок 5 – Митотический индекс (МИ)
Из представленных данных видно, что средние значения МИ варьировали в опытных вариантах от 4,2±0,54 % до 7,7±0,82 % против 1,8±0,38 % в контроле I-к и 10±1,8 % в контроле к-к. Не установлено прямой зависимости между изменением величины МИ от уменьшения концентрации экстракта.
Во всех исследуемых опытных вариантах отмечали существенное снижение значения митотического индекса по сравнению с контролем к-к, когда использовали дистиллированную воду. С уменьшением концентрации экстракта у облученных луковиц митотический индекс уменьшается. На основе полученных данных также определяли изменчивость цитологических параметров (МИ, МПИ) для каждой исследуемой выборки.
Коэффициент корреляции между МИ с учетом профаз имеет значение равное 0,91. Существенно возрастает МПИ в варианте опыта к-о3, по сравнению с контролем к-к. В остальных вариантах МПИ практически не изменяется.
Таким образом, митотическая активность с учетом и без учета профаз в облученных луковицах, проращиваемых в растворах с экстрактом существенно возрастает в 3-4 раза по сравнению с контролем I-к.
3.2.3 Продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa L.
Изучение распределения клеток по стадиям митоза показало, что наибольшее их число, как в контрольных вариантах, так и в опытных, приходится на профазу (41,6±3,8–61,8±4,0 %), доля клеток на стадиях ана- и телофазы суммарно составила 9,4±3,5–16,4±4,5 %, на стадии метафазы – 14,2±2,4–30,3±3,7 % (рисунок 6).
Рисунок 6 – Относительная продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ и радиоактивного облучения
Расчет различных типов митотического индекса и определение долей делящихся клеток необходимы для регистрации времени прохождения клетками различных стадий митоза, в том числе выявления возможной задержки клеток на какой-либо стадии вследствие повреждения собственных структур под действием внешних или внутренних факторов любой природы.
Известно, что продолжительность разных стадий митоза в физиологических условиях неодинакова. Наиболее продолжительны стадии, связанные с процессами синтеза: профаза и телофаза. Стадии митоза, во время которых происходит движение хромосом, обычно осуществляются быстро.
При сопоставлении прохождения фаз митоза в текущем эксперименте установлено, что наиболее близки к оптимальным условиям роста для меристематических клеток корней водные растворы, используемые в варианте и вариантах опыта к-к, к-о1, к-о3 (см. рисунок 6).
В зависимости от того, на какие синтетические процессы клеточного цикла влияют разные концентрации экстракта, происходит остановка клеточного деления на определенной стадии митоза.
Наибольшее количество клеток на стадии метафазы наблюдается в вариантах опыта к-о6, I-о3, I-о6, на стадии телофазы в вариантах опыта к-о3, I-к, I-о3 и наибольшее количество клеток на стадии анафазы наблюдалось в вариантах к-о6, I-к, I-о1.
Контроль к-к имеет более высокие значения стадий митоза, чем контрольный вариант I-к, луковицы которого были подвержены облучению радиацией.
В вариантах опытов I-o1, I-o3, I-o6 число клеток в стадии профазы уменьшается, по сравнению с вариантами к-o1, к-o3, к-o6 соответственно.
Таким образом, наличие экстракта в растворах независимо от концентрации, при прорастании облученных луковиц, практически не влияет на относительную продолжительность фаз митоза.
В варианте I-к продолжительность профазы по сравнению с опытными вариантами длиннее, что свидетельствует об адаптивных процессах в популяциях клеток.
3.2.4 Патология митоза
В ходе работы исследовали способность ВЭКШ в различных концентрациях стимулировать или подавлять протекание патологических процессов в клетках корневой меристемы лука.
Установлено, что наибольшая патология митоза наблюдается в варианте опыта I-к, по сравнению с контролем к-к. Причем, определение корреляционных отношений между ПМ с учетом профазы и ПМ без учета профазы выявило высокое положительное значение, равное 0,95.
В сравнении с контролем к-к процент клеток с регистрируемой патологией митоза почти не изменяется в вариантах опыта к-о1, к-о6 и снижается в варианте к-о3, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования: 2-5 % [40-45]. По сравнению с вариантом I-к патология митоза значительно уменьшается в варианте I-о6.
Данные, представленные на рисунке 7, свидетельствуют о том, что ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ.
Низкое число патологий митоза в опытных вариантах позволяет предположить проявление высокой адаптивности у исследуемого объекта, возможно, в результате действия ВЭКШ.
Рисунок 7 – Патология митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ и радиоактивного облучения
Следует отметить, что мы не отслеживали патологии митоза на стадии профазы, поскольку при рутинной окраске их нельзя выявить. Поэтому для получения более точного анализа результатов эксперимента необходимо учитывать патологию митоза без учета профаз. Установлено позитивное влияние ВЭКШ, которое снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0 раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.
Заключение
При исследовании различных концентраций ВЭКШ на развитие луковиц A. cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые цитогенетические параметры (доля клеток на определенной стадии митоза, патология митоза, уровень и спектр патологий митоза, частота встречаемости клеток с микроядрами).
ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ, которое колеблется от 2,12 до 6,25 %, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования. Выявлено, что в результате действия ВЭКШ при большинстве тестируемых концентраций сужается спектр различных типов патологий митоза в меристематических клетках корешков лука в сравнении с контрольными вариантами.
Установлено, что наиболее оптимальными концентрациями ВЭКШ, действующими на исследуемые цитогенетические параметры, являются 0,001 и особенно 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды. Минимальная исследуемая концентрация ВЭКШ была наиболее близка к физиологическим условиям по параметрам: длительность фаз митоза, патология митоза, спектр патологий митоза.
Также установлено, что тестируемое хроническое радиоактивное облучение луковиц способствует повышению показателя «патология митоза без учета профаз». Использование ВЭКШ снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0 раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.
Список использованных источников
1 Антиоксидантная активность куколок китайского дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Ученые записки УО «ВГУ им. П.М. Машерова»: сборник научных статей. – Витебск: «Изд-во УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2007. − С. 248 – 265.
2 Симонян, А.В. Антиоксиданты в современном здравоохранении / А.В. Симонян // Медицинский вестник. – 2008. – № 16 (443). – С. 14 – 15.
3 Трокоз, В.А. Биологически активные продукты из дубового шелкопряда: аспекты использования с лечебно-профилактической целью / В.А. Трокоз, Т.Б. Аретинская, Н.В. Трокоз // Сборник тезисов 2 Всероссийской конференции по вопросам онкологии и анестезиологии мелких домашних животных. – Витебск: «Изд-во УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2006. – С. 21 – 28.
4 Бенсон, Дж. Хроматографический анализ аминокислот и пептидов на сферических смолах и его применение в биологии и медицине / Дж. Бенсон, Дж. Патерсон // Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. – Мн., 1974. – С. 9 – 84.
5 Антиоксидантная активность куколок китайского дубового шелкопряда (Antheraea pernyi G.-M.) / А.А. Чиркин [и др.] // Ученые записки УО «ВГУ им. П.М.Машерова». – Витебск: Изд-во УО «ВГУ им. П.М. Машерова», 2007. – Том 6. – С. 248 – 265.
6 Химическая характеристика гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда, акклиматизированного в Витебской области / А.А. Чиркин [и др.] // Биологическое разнообразие Белорусского поозерья: современное состояние, проблемы использования и охраны / Матер, II междунар. конференции. – Витебск: ВГУ, 2008. – С. 19 – 21.
7 Использование куколок китайского дубового шелкопряда для эукологического мониторинга и метаболической терапии / А.А. Чиркин [и др.] // Экологическая антропология. – Минск: ИООО «Право и экономика», 2008. – С. 191 – 195.
8 Оценка цитотоксичности водного экстракта куколок дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Молекулярная и биохимическая фармакология / Матер. междунар. научн. конф., посвященной 80-летию НАНБ. – Гродно: ГрГУ, 2008. – С. 83 – 84.
9 Fiskesjö, G. The Allium test. Methods in molecular biology. In vitro toxicity testing protocols / G. Fiskesjö. – New York: Nova Science Publishers, Inc. – 1995. – Vol. 43. – P. 119 – 127.
10 Fiskesjö, G. The Allium test for screening chemicals; evalution of cytological parameters. Plants for environmental studies / G. Fiskesjö. – New York: CRC Press LLC. – 1997. – P. 308 – 333.
11 Sabti, K. Allium test for air and water borne pollution control / K. Sabti. – Cytobios. – 1989. – Vol. 58. – P. 71 – 78.
12 Оценка фито- и цитотоксической активности соединений тяжелых металлов и алюминия с помощью корневой апикальной меристемы лука / А.И. Довгалюк [и др.] // Цитология и генетика. – 2001. – Т. 1. – № 1. – С. 3 – 9.
13 Mustafa, Y. Genotoxicity testing of quizalofop-P-ethyl herbicide using the Allium cepa anaphase-telophase chromosome aberration assay / Y. Mustafa // Caryologia. – 2008. – Vol. 61. – P. 45 – 52.
14 Rathore, H.S. A study on the cytological effects of myrobalan (fruit of Terminalia chebula) in Allium tests / H.S. Rathore // Ethnobotanical Leaflets. – 2006. – Vol. 10. – P. 92 – 97.
15 Rank, J. Genotoxicity testing of the herbicide Roundup and its active ingredient glyphosate is opropylamine using the mouse bone marrow micronucleus test, Salmonella mutagenicity test, and Allium anaphase-telophase test / J. Rank // Mutat. Res. – 1993. – № 300. – P. 29 – 36.
16 Phil, P.M. Antigenotoxic Potential of Terminalia chebula fruit (myrobalan) against cadmium in Allium test / P.M. Phil, H.S. Rathore // The Internet Journal of Toxicology. – 2007. – V. 4 (1). – P. 1 – 9.
17 Asita, O. Genotoxicity of Chlorpyrifos, Alpha-thrin, Efekto virikop and Springbok to onion root tip cells / O. Asita, R. Makhalemele // African Journal of Biotechnology. − 2008. − Vol. 7 (23). − P. 4244 − 4250.
18 Zakia, A. Cytological Effects of Certain Active Constituents of Peganum Harmala L. Effect of Harmol and Harmine Alkaloids on Mitosis of Allium cepa / A. Zakia // J. King Saud Univ. − Vol. 4. − Science (1). − 1992. − P. 37 − 45.
19 Fiskesjo, G. The Allium test as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. – 1985. – V. 102. – P. 99 – 102.
20 Rathore, H.S. Prevention of Acetaminophen-Induced Mitodepression with Myrobalan (Fruit of Terminalia chebula) in Allium cepa Model / H.S. Rathore, P. Choubey // Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics. – 2005. – Vol. 4. – N 2. – P. 100 – 104.
21 Knoll, M.F. Effects of Pterocaulon polystachyum DG (Asteraceae) on onion (Allium cepa) root-tip cells / M.F. Knoll // Genetics and Molecular Biology. − 2006. − Vol. 29. − P. 539 − 542.
22 Akinboro, A. Cytotoxic and genotoxic effects of aqueous extracts of five medicinal plants on Allium cepa Linn. / A. Akinboro, A.A. Bakare // J. Ethnopharmacol. − 2007. − Vol. 112. – N 3. − P. 470.
23 Solanke, P. An Evalution of the Genotoxic effects of seed decoction of Cassia tora L. (Leguminosae) in Allium cepa Model / P. Solanke // Ethnobotanical Leaflets. − 2007. − Vol. 11. − P. 217 − 223.
24 Kumar, L.P. G2 studies of antimutagenic potential of chemopreventive agent curcumin in Allium cepa root meristem cells / L.P. Kumar, N. Paneerselvam // Facta Universitatis. – Series Medicine and Biology. − 2008. − Vol. 15. − N 1. – P. 20 − 23.
25 Artyukhov, V.G. Cytogenetic indices of English oak (Quercus robur L.) seminal progeny subject to radioactive radiation in the Chernobyl nuclear disaster and growing on territories with different levels of anthropogenic contamination / V.G. Artyukhov, V.N. Kalaev // 20 Years after Chernobyl Accident: past, present and future: Editors E.B. Burlakova, V.I. Naidich. – New York: Nova Science Publishers, Inc. – 2006. – P. 247 – 264.
26 Булдаков, Л.А. Радиоактивное излучение и здоровье / Л.А. Булдаков. – М.: Информ-Атом, 2003. – 165 с.
27 Райков, И.Б. Ядро простейших. Морфология и эволюция / И.Б. Райков. – Л.: Наука, 1978. – 328 с
28 Окада, Ш.А. Радиоционная биохимия клетки / Ш.А. Окада. – М.: Мир, 1974. – 407 с.
29 Алов, И.А. Цитофизиология и патология митоза / И.А. Алов. – М.: Медицина, 1972. − 264 с.
30 Словарь-справочник энтомолога / С.П. Белошапкин [и др.]. – М.: Нива России, 1992. – 334 с.
31 Гилберт, С. Биология развития: в 3 т. / С. Гилберт, пер. с англ. – М.: Мир, 1995. – Т.3. – 352 с.
32 Радкевич, В.А. Экология листогрызущих насекомых / В.А. Радкевич. – Минск: Наука и техника, 1980. – 240 с.
33 Реакции изолированных клеток на действие гидрофильных компонентов куколок дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Ученые записки УО «ВГУ им. П.М. Машерова». – 2009. – Т. 8. – С. 278 – 298.
34 Fiskesjo, G. The Allium test as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. – 1985. – V. 102. – P. 99 – 102.
35 Гудков, И.Н. Роль асинхронности клеточных делений и гетерогенности меристемы в радиоустойчивости растений / И.Н. Гудков, Д.М. Гродзинский // Механизмы радиоустойчивости растений. – Киев: Наукова думка, 1976. – С. 110 – 137.
36 Evseeva, T.I. Genotoxicity and cytotoxicity assay of water sampled from the underground nuclear explosion site in the north of the Perm region (Russia) / T.I. Evseeva // J. Environ. Radioactivity. – 2005. – Vol. 80. – P. 59 – 74.
37 Токсические и цитогенетические эффекты, индуцируемые у Allium cepa L. низкими концентрациями Cd и 232Th / Т.И. Евсеева [и др.] // Цитология и генетика. – 2005. − № 5. − С. 73 − 80.
38 Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р.П. Барыкина [и др.]. – М.: Изд-зо МГУ, 2004. – 312 с.
39 Калаев, В.Н. Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма / В.Н. Калаев, С.С. Карпова. – Воронеж: ВГУ, 2004. – 80 с.
40 Захаров, В.М. Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов / В.М.Захаров, Д.М. Кларк. − М.: Моск. отд-ние Междунар. фонда "Биотест", 1995. − 68 с.
41 Толкачева, Т.А. Действие гидрофильных компонентов куколок шелкопряда на тест-объект Allium cepa L. / Т.А. Толкачева // Наука – образованию, производству, экономике: материалы XV (62) Рег. науч. – практ. конф. преподавателей, научных сотрудников и аспирантов, посвящ. 100-летию со дня основания УО «ВГУ имени П.М. Машерова», Витебск, 3-5 марта 2010 г. / Вит.гос. ун-т; редкол.: А.П. Солодков [и др.]. – Витебск, 2010. – С. 122 – 123.
42 Чиркин, А.А. Биологическая активность продуктов гистолиза / А.А. Чиркин. – Germany: Lambert Akademic Publishing, 2012. – 156 с .
43 Жизнеспособность клеток куколок дубового шелкопряда / А.А. Чиркин [и др.] // Вестн. Витебск.госуд.ун-та. – 2011. – № 1 (61). – С. 30 – 36.
44 Белковый и аминокислотный состав куколок китайского дубового шелкопряда / С.И. Денисова [и др.] // Вестн. Витебск. госуд. ун-та. – 2007. – № 1 (43). – С. 143 – 149.
45 Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. – М.: Агропромиздат, 1988. – 272 с.
PAGE \* MERGEFORMAT2