Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лекция 5, 6. Биофизика транспортных процессов
Перейдем теперь к рассмотрению некоторых направлений клеточной биофизики и начнем с биофизики транспортных процессов.
Прежде всего, определим некоторые понятия – под транспортом на клеточном ровне понимаются прежде процессы переноса нейтральных веществ и ионов через биологические мембраны, и именно эти процессы изучаются в первую очередь в биофизике транспортных процессов. Надо отметить, что транспорт на клеточном уровне этими процессами не исчерпывается. Так существует латеральный транспорт – т.е. транспорт веществ ВДОЛЬ мембраны. Можно говорить также о транспорте веществ внутри клетки, который не связан с мембранными структурами, а осуществляется, например, за счет взаимодействия транспортируемых молекул с белками цитоскелета или водных потоков внутри клетки.
Однако именно трансмембранный транспорт, т.е. транспорт ЧЕРЕЗ биологические мембраны играет одну из ключевых ролей. Поему так? Чтобы понять это, необходимо вспомнить роль биологических мембран в существовании живых систем.
Как вы, наверно, знаете мембраны представляют собой клеточные структуры состоящие из бислоя (если нужно – напомнить структуру бислоя, РИС) и взаимодействующих с ним белков. У прокариот основной мембранной структурой является клеточная мембрана, выполняющая широкий спектр функций. У эукариот имеется широкий спектр мембранных структур – плазматическая мембрана, ядерная мембрана, сопрягающие мембраны – у митохондриальная и тилакоидная, и другие. Наиболее общей функцией биомембран является барьерная – т.к. за счет центрального гидрофобного участка в бислое, они обладают очень низкой проницаемостью для полярных, водорастворимых соединений. Именно благодаря этой функции мембраны и стали играть столь значительную роль в функционировании живых систем – без них само существование живых систем как отдельных объектов стало бы невозможным.
Однако, как мы уже говорили, живые системы – это открытые системы, т.е. системы, которые не могут существовать без обмена с внешней средой веществом и энергией. Отсюда существование биомембран, являющееся само по себе необходимым условиям для существования живых организмов в том виде в каком они есть, с необходимостью требует существования транспортных процессов через эти мембраны и обуславливает большую биологическую значимость этих процессов.
Рассмотрим процессы транспорта через биомембраны подробнее.
Простая диффузия
Простая диффузия представляет собой движение молекул незаряженного вещества по градиенту концентрации, т.е. от участков с более высоким содержанием данного вещества к участкам с более низким содержанием его. Такой процесс является пассивным, т.е. его непосредственное протекание не требует затрат энергии. Его существование было изначально показано эмпирически, однако этот закон может быть выведен, например, из более общего второго принципа термодинамики (равновесие – как отсутствие градиентов, если нужно объяснить). Впрочем, к явлению диффузии легко прийти и на основе молекулярной картины строения вещества и броуновского движения, которое, в общем-то, тоже вытекает из этой картины. Так, если у нас имеется два отсека, заполненных, например, разной концентрацией газа, то если мы откроем перегородку между этими отсеками, то получим, что количество молекул, движущихся из 1 в 2, будет пропорционально концентрации газа в 1, а из 2 в 1 – концентрации газа в 2 (РИС). Т.е. можно записать, что , а , следовательно – общая скорость транспорта молекул будет: . Учтем, что k зависит от расстояния между участками 1 и 2 и запишем, что k = k0*1/∆x, где ∆x – расстояние между участками С1 и С2. Учтем также, что, чтобы перейти к потоку мы должны домножить выражение на V/S, т.е. перейти к другой размерности (если нужно – пояснить). Отсюда получим:
или - уравнение Фика.
Отметим, что D – коэффициент диффузии, размерность которого обычно см2*с-1, j – поток вещества, с размерностью М*см-2*с-1. D – можно найти, учитывая, что , где R и T – универсальная газовая постоянная и абсолютная температура, а u - подвижность вещества в рассматриваемой среде.
В том случае, когда речь идет о перемещении вещества через тонкий барьер, например, через биомембрану, толщиной h, можно принять внутри этого барьера связь между С и х имеет линейный характер, т.е. dC/dx = const. Справедливость этого легко доказать, проанализировав зависимость ΔС от x, на участке от 0 до h:
, если х – мало (или если x<h, а h – мало).
Отсюда для данного случая можно записать: , здесь γ – коэффициент пропорциональности между концентрацией диффундирующего вещества в растворе и внутри барьера (мембраны), т.е. C1m=γC1 и C2m=γC2, Р – проницаемость мембраны для данного вещества (см*с-1).
В общем случае, концентрации в уравнении Фика также не являются стационарными величинами. Если рассмотреть некий малый объем (РИС), то изменение концентрации диффундирующего вещества в нем будет прямо пропорционально разности потоков вещества, входящего в этот объем, и выходящего из него. И обратно пропорционально длине этого объема (Δх), т.к. чтобы перейти от потоков к концентрации, нам нужно домножить выражение на S/V=S/(S* Δх)=1/Δх. Отсюда, перейдя к бесконечно малым изменениям, мы можем получить общее уравнение для одномерной диффузии:
Для трехмерной диффузии, это выражение будет выглядеть:
Решение общего уравнения для одномерной диффузии, в случае локального введения диффундирующего вещества в систему, в которой оно отсутствовало, будет выглядеть как:
, где с0 – количество введенного в систему вещества, x=0 – точка введения этого вещества, t=0 – момент введения его.
Динамику изменения концентрации диффундирующего вещества в этом случае, можно привести на РИС. Как можно видеть из РИС с течением времени концентрация вещества в точке введения снижается, и оно все больше распространяется вдоль координаты х.
Опираясь на приведенную формулу, можно найти связь между хе – расстоянием, на котором концентрация вещества снижается в е раз, и временем диффузии: (если нужно пояснить, как выводится)
Из приведенной формулы вытекает в частности следующее важное свойство диффузии – время необходимое для диффузии на определенное расстояние, пропорционально квадрату этого расстояния.
Коэффициент диффузии во многом зависит от размеров и форы молекул. Для сферических частиц используют уравнение Стокса-Эйнштейна:
, где r – радиус частицы, η – вязкость среды. Если принять, что молекулярная масса частицы (М) пропорциональна объему (), то при постоянной температуре и вязкости, D~M-1/3. Т.е. или . Последняя формула может быть использована для анализа зависимости lgD от lgM.
Для достаточно крупных молекул (небольшие белковые молекулы и т.п.) показано, что тангенс угла наклона зависимости lgD от lgM составляет около -1/3, что соответствует const=1 и подтверждает полученную закономерность. Для малых молекул – от водорода до трисахаридов, полученная картина больше соответствует варианту , это связано с тем, что для малых молекул говорить о сферической форме не вполне корректно.
Следует отметить, что роль простой диффузии в транспорте вещества через биологические мембраны достаточно ограниченна. Так она может играть существенную роль для транспорта через мембрану ряда неполярных соединений, которые хорошо растворяются в гидрофобной фазе бислоя. Так, например, именно с простой диффузией связан, по-видимому, транспорт кислорода через биомембраны.
Определенную роль простая диффузия может играть и для транспорта малых полярных соединений, но здесь надо сделать некоторые важные оговорки. Так простая диффузия малых полярных молекул через биомембраны связана не столько с диффузией молекул через гидрофобный слой, сколько с их транспортом через так называемые кинки, которые возникают при наличии в мембране липидных молекул с транс-конформацией углеводородных хвостов (пояснить, РИС). Т.е. в данном случае речь идет уже не о диффузии через липидную, а о диффузии через водную фазу.
Облегченная диффузия
Пассивный транспорт веществ при участии переносчиков характеризуется некоторыми чертами, отличающими его от простой диффузии.
1. Высокая специфичность, которая связана со способностью переносчиков различать близкие по структуре соединения (например, L- и D-изомеры сахаров и аминокислот).
2. С ростом концентрации субстраста скорость транспорта увеличивается только до некоторой предельной величины (насыщение).
3. Наблюдается чувствительность к низким концентрациям ингибиторов, взаимодействующих с переносчиками.
Механизм транспорта с участием переносчика можно представить в виде следующей кинетической схемы (РИС).
В этой схеме со и сi – переносчики в свободном состоянии на наружной и внутренней сторонах мембраны, a csо и csi – переносчики, связанные с субстратом; So и Si — концентрации субстрата в наружном и внутреннем растворах соответственно, a k1 – k8 –константы скоростей отдельных стадий. Выражение для скорости потока субстрата можно получить, решая систему уравнений, описывающих стационарное состояние, когда концентрации всех промежуточных состояний постоянны и – как следствие – все потоки равны между собой:
Зная, что суммарная концентрация переносчика сS (cS=co+[cso]+[csi]+ci) не меняется, мы можем найти систему алгебраических уравнений, описывающих стационарные концентрации переносчика (если нужно – записать и описать решение через определители системы).
Скорость переноса вещества такой системой зависит от значений k, от общей концентрации переносчика и от концентрации субстрата. Можно отметить, что начальная скорость переноса вещества таким переносчиком (когда si=0) определяется уравнением близким к уравнению Михаэлиса:
, где Jmax – максимальная скорость переноса. Как можно видеть из приведенного уравнения, зависимость скорости потока от концентрации субстрата будет иметь иной характер, чем для простой диффузии. Так, из уравнения Фика видно, что скорость диффузии будет линейно возрастать по мере роста концентрации диффундирующего вещества, однако для облегченной диффузии такое будет наблюдаться лишь при очень низких концентрациях субстрата (so) (РИС). При росте концентрации субстрата на кривой зависимости появляется насыщение, что связано с вовлечением в облегченную диффузию большой доли переносчика. Такая зависимость – с насыщением – является характерной для ферментов, и может быть рассмотрено в качестве характерного признака, отличающего облегченную диффузию от обычной.
Следует отметить, что облегченная диффузия может быть связана не только с химическими, но и с электрохимическими градиентами. В этом случае влияние оказывает не только химический, но и электрический градиент на мембране. Однако при этом транспортироваться должны уже ионы.
С помощью облегченной диффузии, например, в клетки животных транспортируется ряд сахаров, аминокислот, пуринов и глицерин.
Пассивный транспорт ионов
Существует несколько возможных механизмов прохождения ионов через мембрану: 1) растворение иона в липидной фазе мембраны, диффузия и последующий переход из мембраны в раствор; 2) движение по ионным каналам, являющимся структурными компонентами мембран; 3) транспорт с участием переносчиков. Эти механизмы переноса установлены как для биологических мембран, так и для бислойных липидных мембран. Отдельную категорию составляет транспорт через мембранные барьеры клетки по механизму пиноцитоза.
Факторы, влияющие на транспорт электролитов
Начнем с того, что рассмотрим некоторые факторы, связанные с транспортом ионов или являющиеся его движущей силой.
Следует отметить, что движущей силой ионного транспорта является электрохимический потенциал для некоторого иона.
, где μ – химический потенциал, μ0 – стандартный химический потенциал, С – концентрация иона, z – заряд иона, F – постоянная Фарадея, φ – электрический потенциал.
Электрохимический потенциал – мера работы, необходимой для переноса 1 моля (1 грамм-эквивалент) ионов из раствора с данной концентрацией и данным электрическим потенциалом в бесконечно удаленную точку в вакууме. Эта работа складывается из затрат на преодоление сил химического взаимодействия () и работы по переносу зарядов в электрическом поле (). Иногда работу по переносу ионов относят не к молю, а к одному иону
Важным фактором, способным модулировать транспорт заряженных частиц, является их гидратация, т.е. формирование вокруг иона оболочки из полярных молекул воды (РИС). Этот фактор является весьма важны потому, что, как мы уже отметили для диффузии неэлектролитов, скорость диффузии зависит от радиуса диффундирующей молекулы, а гидратация может существенно менять такой радиус. Эмпирически эффективный радиус гидратированного иона зачастую рассчитывают на основе величины коэффициента диффузии данного иона в растворе, с использованием уже приведенной ранее форулы Стокса-Эйнштейна: Так, например, рассчитано, что для ионов натрия такой радиус составляет 0.184 нм. Следует отметить, что энергия гидратации обычно весьма высока - -280 - -400 ккал/моль, что делает гидратную оболочку иона достаточно устойчивой.
Следующим фактором, который может оказывать значительное влияние как на пассивный, так и на активный транспорт электролитов, являются потенциалы, возникающие на границе раздела фаз.
Рассмотрим случай, когда у нас имеется две водные фазы, разделенные мембраной.
В первом варианте примем, что мембрана является полупроницаемой, т.е. способна пропускать только один тип ионов, например катионы калия, не несет на себе фиксированных зарядов и концентрации данного типа ионов, по разные стороны мембраны различны (РИС). Как поведет себя такая система?
Очевидно, что сразу после добавления ионов, в силу простой диффузии начнется транспорт через мембрану, который будет продолжаться до момента выравнивания электрохимических градиентов. Последнее вытекает, например, из второго закона термодинамики и того факта, что именно электрохимический градиент (разность электрохимических потенциалов) является движущей силой транспорта ионов. Т.е. мы будем иметь ситуацию когда или , такая разность потенциалов называется равновесным потенциалом или потенциалом Нернста, и С1 и С2 здесь – концентрации ионов с каждой из сторон мембраны в равновесии.
Попробуем оценить – насколько концентрации ионов в равновесии отличаются от исходных? Если не приводить детальный анализ (а можно и привести…), то можно отметить, что потенциал (φ) меняется пропорционально перенесенному через мембрану заряду, отнесенному к площади мембраны, а перенесенный заряд и изменение концентрации – пропорциональны. Однако если изменение электрического потенциала пропорционально непосредственно изменению концентрации (заряда), то изменение химического потенциала – пропорционально логарифму изменения концентрации. Очевидно, что изменение логарифма величины при ее изменении, меньше чем изменение самой величины. Отсюда можно сделать вывод, что электрический потенциал будет в обычных условиях меняться много быстрее, чем химический. Как следствие – система будет достигать равновесия по электрическому потенциалу, при малых изменениях химического. Т.е. в уравнении Нернста С1 и С2 – приблизительно будут совпадать с начальными концентрациями.
Рассмотрим теперь ситуацию, когда на мембране будут располагаться некоторые фиксированные заряды. Примем, что мембрана непроницаема.
Наличие фиксированных поверхностных зарядов клеточных мембран приводит к образованию около мембраны двойного электрического слоя, который является важным фактором в протекании многих биоэлектрохимических процессов.
Согласно представлениям, развитым в работах Г. Гуи и Д. Л. Чэпмена (1910), распределение ионов в области заряженной поверхности определяется двумя факторами: электростатическим притяжением, удерживающим противоионы у поверхности, и тепловым движением этих ионов, стремящихся, наоборот, к выравниванию их концентраций в поверхностном слое и объеме. В устанавливающемся равновесии плотность распределения ионов около заряженной поверхности убывает с увеличением расстояния от поверхности. Равновесные концентрации катионов (с + ) и анионов (с_) в поверхностном слое и в объеме раствора представлены схематически на РИС. Слой раствора с измененными концентрациями вблизи поверхности называется диффузным. В зависимости от условий его толщина изменяется на несколько порядков – от десятых нанометра до микрометров.
Концентрацию ионов вблизи такого слоя фиксированных зарядом, для положительных ионов можно рассчитать на основе уравнения Больцмана , где С∞ - это концентрация иона на бесконечном удалении от мембраны (концентрация в объеме).
Профиль потенциала в зависимости от концентрации описывается в общем случае уравнением Пуассона-Больцманна:
Для случая бинарного симметричного электролита (приняв С=С0) потенциал может быть описан:
Опустив ряд преобразований и введя величину σ – плотность заряда на мембране, можно получить уравнение Гуи-Чэпмена:
Это уравнение позволяет связать поверхностный заряд мембраны с потенциалом на ней:
Таким образом, учитывая потенциал Нернста, с одной стороны, и профиль потенциала, связанный с двойным электрическим слоем, с другой – можно получить общий профиль потенциала на биомембране (РИС).
Следует рассмотреть еще один фактор, влияющий на транспорт ионов – это так называемый Доннановский потенциал. Он возникает в тех случаях, когда имеется фиксированный заряд, однако расположенный не на мембране, а в некотором объеме. В этом случае заряженные ионы будут поступать в фазу с фиксированными зарядами или уходить из нее, пока не потенциал, связанный с наличием фиксированных зарядов не будет уравновешен электрохимическим градиентом, связанным с транспортом ионов (Доннановское равновесие).
При этом если плотность фиксированных зарядов в заряженной фазе мала (Q (заряд) << с (концентрации ионов) ), то Доннановский потенциал можно найти по формуле:
А если, наоборот – велика:
Электродиффузия
Основное отличие электродиффузии от обычной диффузии – это учет влияния электрического потенциала на диффузионный процесс. Электродиффузия может быть описана уравнением Нернста-Планка:
где u – подвижность иона и т.д. Для концентрации, его можно переписать как:
Однако, в общем случае, при решении уравнения Нернста-Планка необходимо учитывать тот факт, что изменения концентрации сопровождаются изменением профиля потенциала в системе. Т.е. одновременно с решением уравнения Нернста-Планка в системе необходимо решить равнение Пуассона
Решение такой системы достаточно сложная задача, поэтому в ряде случаев возможны упрощения, связанные либо с допущением о постоянстве распределения концентрации dc/dx=const, либо с допущением о постоянстве электрического поля – dφ/dx=const.
Именно второе используется в подходе Гольдмана, развитым Ходжкиным и Катцем. Приняв это допущение, мы получаем для потока:
, где h=Δx – например, толщина мембраны. Если принять, что J=const, т.е. что достигнуто стационарное распределение ионов в мембране, то можно получить:
Решая поучившееся уравнение, можно найти:
где c’ и c’’ – концентрации ионов в мембране с внешней и внутренней сторон. Удобно перейти от концентраций ионов в мембране, к их концентрациям в водной фазе, учитывая, что c’’=γcin, c’=γcout.
В этом случае мы можем перейти к уравнению Гольдмана-Хаджкина-Катца:
в котором P=uTγ/h – проницаемость мембраны для данного иона.
Уравнение (XIX.2.4), выведенное Д. Е. Гольдманом (1943) и дополненное А. Ходжкиным и Б. Катцем (1949), позволяет рассчитать пассивный поток иона, если известны его концентрация в растворах по обе стороны мембраны, разность потенциалов на мембране и проницаемость мембраны для данного иона. Для оценки коэффициента проницаемости мембраны необходимо с помощью радиоактивной метки определить односторонние потоки и суммарный поток иона, и также убедиться в том, что в транспорте иона не принимают участия системы активного транспорта. На мембранах растительных клеток значения коэффициентов проницаемости для К+ варьируют в пределах от 10-8 до 10-6 см/с; значения РNa обычно на порядок ниже значений Рк, а значения PCl не превышают 10-8 см/с.
Понятие ионной проницаемости следует отличать от ионной проводимости. Эти два свойства тесно связаны между собой, и фактически изменения проницаемости всегда сопровождаются изменениями проводимости. Проницаемость (Р) является свойством мембраны и в первом приближении не зависит от содержания ионов в окружающих растворах. Проводимость мембраны (g) характеризует изменение потока ионов j при небольших сдвигах мембранного потенциала:
Если концентрации ионов по обе стороны мембраны одинаковы, то проводимость мембраны по одновалентному иону / определяется простым уравнением
Суммарная проводимость мембраны (величина, обратная электрическому сопротивлению мембраны) равна сумме проводимостей мембраны для отдельных ионов и определяется как изменение суммарного электрического тока (/) через мембрану в ответ на небольшое смещение мембранного потенциала:
Уравнение Гольдмана предсказывает нелинейную зависимость трансмембранного потока ионов от разности потенциалов на мембране. При больших положительных и больших отрицательных потенциалах поток линейно зависит от разности потенциалов, однако коэффициенты пропорциональности различны. При φ→-∞ и φ→+∞ зависимости ионного тока от потенциала аппроксимируются. Асимптотами J = PcozFφ/(RT) и J = PcizFφ/(RT) соответственно (РИС). Нелинейность характеристики тем больше, чем больше перепад концентраций в растворах справа и слева от мембраны; зависимость линейна, если концентрации иона в обоих растворах одинаковы. В равновесии, когда ионный ток равен нулю, из уравнения (XIX.2.4) следует, что со–сi*exp[zFφ/(RT)] = 0 и соответственно равновесное значение φ=[RT/(zF)]ln(co/ci) находится как точка пересечения кривых с осью потенциала. Суммарная вольт-амперная характеристика мембраны совпадает по форме с характеристикой ток – напряжение для того вида иона, который вносит основной вклад в проводимость мембраны.
Причины нелинейности вольт-амперной характеристики при резком отличии ионных концентраций по обе стороны мембраны вызваны влиянием электрического поля на профиль концентрации ионов в мембране (РИС). При наложении электрического поля различной ориентации концентрация токопереносящих ионов в мембране либо повышается, либо уменьшается, что приводит соответственно к повышению или снижению электропроводности мембраны – эффект выпрямления.
Опираясь на полученное выражение, можно, в частности, найти значение, которое принимает мембранный потенциал. Если принять, что вклад в мембранный потенциал вносят лишь ионы натрия, калия и хлора, то условия возникновения стационарного значения мембранного потенциала на мембране – JK+JNa+JCl=0, опираясь на это условие, можно найти:
Из полученного выражения, в частности, следует, что наибольшее влияние на мембранный потенциал оказывает тот ион, который обладает самым высоким коэффициентом проницаемости, что и наблюдается в экспериментах. Отметим, что полученное выражение удовлетворительно описывает экспериментальные зависимости потенциала от ионного состава среды при условии, что интервал концентраций не слишком широк. Это указывает на серьезные ограничения электродиффузионной теории для описания электрических характеристик живой клетки.
Коснемся еще одного вопроса, связанного с критериями пассивного транспорта для ионов – а именно, с соотношениями Усилка-Теорелла. Так если в уравнении Гольдмана-Ходжкина-Катца выделить два потока – наружу (jо) и внутрь (ji), то можно записать:
Как видно из приведенных уравнений, входящий поток линейно зависит от концентраций иона в наружном растворе и не зависит от концентрации во внутренней среде. В свою очередь, выходящий поток зависит только от концентрации во внутреннем растворе. Это и означает, что входящий и выходящий потоки в приближении постоянного поля являются независимыми.
Отношение таких потоков будет:
Выполнение уравнения Уссинга — Теорелла является критерием пассивного транспорта, при котором поток иона обусловлен только градиентом концентраций и действием электрического поля. Отклонение от такого равенства может указывать на участие системы активного транспорта в переносе ионов через мембрану или быть следствием нарушения независимости ионных потоков, например при диффузии через узкие каналы в мембране. В этом случае обычное электродиффузионное описание; основанное на представлении о диффузии точечных невзаимодействующих частиц, теряет силу.
Транспорт ионов через каналы
Полученное на основе анализа процессов электродиффузии уравнение Гольдмана-Ходжкна-Катца для потока широко используют не только для описания пассивных потоков ионов через бислой, но и для описания транспорта ионов через каналы. Однако, строго говоря, это не вполне корректно, так как канальный транспорт имеет ряд особенностей, специфичных по отношению к электродиффузии. Так для канального транспорта характерна высокая специфичность, регулируемость, возникновение эффектов насыщения при высоких концентрациях ионов. Кроме того, скорость транспорта ионов через канал значительно выше, нежели транспорт ионов за сет диффузии в водной среде. Указанные особенности сближают канальный транспорт, с ферментативными процессами, хотя есть и отличия – например, меньшая температурная чувствительность. Таким образом, вопрос о канальном транспорте заслуживает отдельного рассмотрения.
Ионные каналы представляют собой интегральные белки, функция которых - обеспечение ускорения и регуляции транспорта ионов через мембрану. В общем случае, ионный канал включает в себя следующие структуры (РИС): ионную пору, селективный фильтр, воротный механизм, сенсор.
Ионная пора образуется на основе интегральных белков, которые несут на себе как гидрофильные, так и гидрофобные группы, при этом гидрофобные группы образуют внешнюю поверхность поры, т.е. поверхность, взаимодействующую с неполярным компонентом бислоя, а гидрофильные – внутреннюю поверхность, с которой происходит взаимодействие транспортирующегося иона. Именно ионная пора обеспечивает транспорт ионов через канал. Следует отметить, что транспорт иона через пору не является простой диффузией, значительно превосходя ее по скорости.
Селективный фильтр – это структура, обеспечивающая специфичность транспорта ионов каналом. При этом селективные свойства канала могут реализовываться разными путями. Например, существуют каналы слабо специфичные к типу иона, но обладающие высокой специфичностью к его заряду. Это, например, максикатионные каналы. В этом случае, «работа» селективного фильтра связана с наличием на нем заряженных группировок. Для более «тонкой» дифференциации ионов может быть использован, например, критерий размера – в этом случае селективность определяется размерами отверстия в селективном фильтре.
Воротный механизм – это структура, позволяющая каналу находиться в двух состояниях: открытом и закрытом. Функционирование воротного механизма связано, по-видимому, с изменениями конформации ионного канала и – возможно – с физическим закрытием ионной поры.
Сенсор – это структура, регулирующая работу воротного механизма, т.е. обеспечивающая чувствительность ионного канала к действию тех или иных регулирующих факторов, например, градиенту электрического поля для потенциал-зависимых ионных каналов, связыванию с определенным химическим агентом – для лиганд-зависимых или изменению механического напряжения мембраны – для механочувствительных.
Следует отметить, что конкретный тип ионных каналов может не иметь всех описанных структур. Так, например, простейшую структуру канального типа представляют собой неспецифичные ионные поры, которые лишены селективного фильтра, воротного механизма и сенсора, т.е. – по сути – представляют собой просто «отверстие» в мембране. Однако, свойства таких пор отличаются от свойств каналов и движение ионов через такие структуры может быть описано также, как простая электродиффузия.
Рассмотрим некоторые общие принципы, которые применяются в настоящее время при описании канального транспорта:
1. Считается, что при поступлении в канал ионы, происходит замещение водородных связей с молекулами воды в гидратной оболочке на связи с полярными группами аминокислот на внутренней поверхности ионной поры. Благодаря этому переход иона в канал, становится возможным с энергетической точки зрения.
2. Считается, что взаимодействие между ионами и молекулярными группами внутри ионной поры может быть адекватно описано как определенный профиль максимумов и минимумов потенциальной энергии при движении иона вдоль канала
3. Время пребывания иона в потенциальной яме много больше времени перехода его через барьер, т.е. переход между потенциальными ямами можно рассматривать как «мгновенный». Также полагается, что в одной потенциальной яме у одного канала всегда находится только один ион, так как попаданию туда второго иона будут мешать электростатические взаимодействия.
4. Перескоки между состояниями канала определяются тепловыми флуктуациями, а вероятность такого перехода зависит от электрического потенциала на мембране.
Наиболее распространенным энергетическим профилем для ионных каналов является, по-видимому, профиль с тремя барьерами и двумя минимумами потенциальной энергии (РИС). В этом случае канал имеет два центра связывания ионов, расположенные на разных сторонах мембраны. Боковые потенциальные барьеры связаны, по-видимому, с затратами энергии на дегидратацию иона, с последующей компенсацией ее за счет связывания с гидрофильными структурами внутри ионной поры. Центральный барьер связан с собственно переносом иона через канал, в частности – он может зависеть от ширины канала (например, в зоне селективного фильтра) и от других характеристик канала. Наложение на мембрану потенциала – модулирует профиль потенциала. Итоговую картину можно найти на основе простой суперпозиции. Так, если принять что изменение потенциала внутри мембраны имеет линейный характер (РИС), а обычно так и считается, то общий профиль потенциала можно найти просто как сумму собственного профиля канала и профиля внешнего потенциала (РИС).
Соотношение величин барьеров может различаться (РИС). Так если величина боковых потенциальных барьеров мала по сравнению с величиной центрального, то такой канал будет более чувствительным к изменениям градиента электрического потенциала на мембране, так как именно на центральный участок приходится наибольшая доля электрического потенциала. С другой стороны – в обратной ситуации, зависимость от потенциала будет менее выражена, т.к. в этом случае «узким местом» будет не транспорт иона через мембрану, а его связывание с внутренней или внешней ее стороны.
Коснемся теперь вопроса – как описать ионный транспорт через канал? Сделаем это на примере канала с тремя барьерами.
Прежде все определим – сколько состояний может иметь такой канал. Исходя из уже приведенного допущения, что в одной потенциальной яме не может быть больше одного иона, получим, что таки состояний должно быть не более четырех (00, 10, 01, 11). Если нарисовать такие состояния и переходы между ними в виде схемы (РИС), то можно видеть, что в системе будет 3 пары (прямой и обратный) переходов, которые соответствуют переходам в прямом и обратном направлении через каждый из трех барьеров.
В общем случае, такие константы скорости можно для некоторого (симметричного) барьера описать как:
где k0 – константа скорости транспорта ионов через этот барьер, EB – величина барьера, а – доля мембранного потенциала, приходящаяся на этот барьер.
Применив полученные уравнения для каждого из барьеров канала, можно записать следующую систему уравнений:
Здесь 1, 2, 3 – соответствуют левому, центральному и правому барьерам на энергетическом профиле канала, константы описываются приведенными выше уравнениями.
Найдя стационарное решение данной системы уравнений и рассчитав на основе полученных значений концентраций стационарный поток ионов, можно получить общее уравнение потока ионов через канал с тремя энергетическими барьерами. В том случае, когда центральный барьер существенно выше боковых или наоборот – описание ионного канала можно существенно упростить.
Так в первом, наиболее интересном для нас случае, поток через него может быть задан формулой:
где I – концентрация ионов, а и - потенциал-зависиые константы.
Интересно отметить, что если разделить суммарный поток J на прямой и обратный (J+ и J-), то их отношение также будет подчинятся соотношениям Усилка-Теоррелла. Этот эффект является следствием универсальности данных соотношений, того, что они опираются не на конкретную форму транспортного процесса, а на закон сохранения энергии. Таким образом, полученный нами вывод подтверждает применимость критерия Усилка-Теорелла и для канального транспорта.
Следующее важное свойство, вытекающее из полученного описания – это способность каналов к насыщению и даже ингибированию активности при высоких концентрациях субстрата. Действительно, из полученной формулы можно видеть, что при возрастании концентрации субстрата с одной стороны мембраны к бесконечности скорость переноса не будет возрастать в бесконечность, как это следовало бы, например, из уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца, но достигнет некоторого стационарного уровня.
С другой стороны, если мы будем пропорционально повышать концентрации ионов с обеих сторон мембраны, то зависимость для потока будет еще более сложной (РИС). На начальном этапе будет наблюдаться возрастание потока, что обусловлено увеличением абсолютной величины разности концентраций между внутренней и внешней сторонами мембраны. Однако при дальнейшем повышении зависимость примет противоположенный характер – поток ионов будет снижаться при росте их концентрации. Последний эффект связан с тем, что при высокой концентрации ионов по обе стороны мембраны повышается вероятность перехода канала в состояние [1,1], которое исходя из описанных выше свойств канального транспорта будет неспособно к переносу ионов.
Таким образом, приведенное теоретическое описание воспроизводит важные эффекты, наблюдающиеся на реальных каналах – насыщение, блокировка субстратом, соблюдение соотношений Усилка-Теорелла – подтверждает верность принятых в основе такого теоретического описания допущений.
Однако следует отметить, что реальная картина, вероятно, более сложна, нежели описанная. Так, в частности, представляется весьма перспективным подход, в рамках которого ионный канал описывается как фермент, причем изменения положения иона в трансмембранном направлении понимаются как конформационные переходы в таком ферменте.
Рассмотрим подробнее некоторые примеры ионных каналов нервных клеток.
Na-каналы
Натриевые каналы – являются одним из важнейших типов ионных каналов плазматической мембраны нервных клеток. Они обладают высокой селективностью для ионов натрия и являются потенциал-зависимыми. Основная роль их, по-видимому, заключается в участии в генерации ПД.
Согласно данным Б. Хилле, через натриевые каналы могут проходить различные органические катионы, размеры которых не превышают 0.3-0.5 нм, что соответствует минимальному сечению поры. Размеры многих из проникающих ионов такие же, как у частично гидратированного иона Na. Очевидно, ион Na может проходить через селективный фильтр, сохраняя в гидратной оболочке 1—3 молекулы воды. На основании этого, было предположено, что селективные свойства натриевого канала связаны с определенными размерами ионной поры. При этом, размер поры обеспечивает геометрическое соответствие между размерами поры, с одной стороны, и размерами комплекса – ион натрия + молекула воды, с другой (РИС).
Энергетический профиль натриевого канала достаточно сложен и в зависимости от рН может иметь как 3, так и 4 максимума. Последний случай, в котором центральная часть канала соответствует потенциальной яме, может способствовать транспорту ионов за счет их накопления в центральной части, однако одновременно такой профиль затрудняет выход ионов из канала. В целом, приведенные профили соответствуют ситуации, когда потенциал оказывает значительное влияние на транспорт ионов через мембрану.
К-каналы
Калиевые каналы также являются потенциал-зависимыми и участвую в генерации ПД.
Одним из характерных свойств калиевых каналов является наличие широкого устья с цитоплазматической стороны и узкого участка в центре, играющего роль селективного фильтра (РИС).
В отличие от натриевых каналов, для калиевых движение иона через селективный фильтр происходит, по-видимому, в полностью гидратированном виде. При этом диаметр селективного участка в поре составляет около 0.26-0.30 нм, что максимально близко к размерам ионов калия. При этом большие по размерам ионы не проходят за счет стерического фактора, а меньшие по размерам – за счет слабого взаимодействия с порой
Предполагаемый энергетический профиль калиевого канала отличается от натриевого, так как у калиевого канала основными являются барьеры с боковых сторон мембраны, в то время как центральный барьер – менее выражен. В результате для калиевых каналов лимитирующим скорость транспорта звеном является не перенос иона через мембрану, а его связывание с сайтами с внешней и внутренней сторон мембраны.
Проводимость калиевого канала нервного волокна составляет 10 пСм / канал. Существует и более высокопроводящие калиевые каналы. Например, калиевые каналы СПР (РИС), проводимость которых достигает 130 пСм. Возможно, это связано с более широки, нежели у обычных калиевых каналов устьем.
Транспорт ионов через неканальные системы пассивного транспорта
Отметим, что пассивный перенос ионов за счет подвижных переносчиков представлен в естественных условиях довольно ограниченно, однако известно достаточно много искусственных переносчиков, обеспечивающих такой транспорт.
Общий принцип работы таких систем связан во многих случаях с увеличением радиуса образующегося комплекса, по отношению к радиусу исходного иона (даже в гидратированном состоянии). Так возрастание энергии при встраивании в мембрану комплекса с переносчиком радиусом b и ионом радиуса r будет в соответствие с формулой Борна:
Видно, что по мере возрастания b увеличение свободной энергии будет уменьшаться, тем самым облегчая встраивание комплекса в мембрану и процесс переноса иона. Другой путь – это экранирование заряда иона.
Рассмотрим в качестве примеров два переносчика, играющих важную роль в исследованиях транспортна ионов через мембрану – валиномицин и нигерицин. Первый из них осуществляет транспорт калия, второй – обмен калия и протонов. Общий вид каталитического цикла представлен на РИС
Молекула валиномицина имеет полость, (РИС), которая по своей геометрии максимально соответствует размерам иона калия, что и обеспечивает высокую степень специфичности данного переносчика. После связывания, благодаря меньше энергии встраивания в мембрану переносчик может встраиваться в мембрану и диффундировать к другой ее стороне.
У нигерицина – в составе молекулы имеются СООН группы. В условиях с высоким содержанием протонов, такие комплексы недиссоциированы и не могут связывать ионы калия. Оказавшись на сторона с высоким рН – происходит диссоциация СООН групп и освобождение протонов, образовавшиеся СОО- взаимодействуют с ионами калия, в результате чего молекула нигерицина как бы сворачивается вокруг иона калия, и образовавшийся комплекс уже может диффундировать к другой стороне мембраны, перенося К.
В целом, следует отметить, что эффективность переносчиков данного типа уступает эффективности каналов и, возможно, именно поэтому данный тип транспорта является более ограниченно распространенным.
Активный транспорт
Активный транспорт – это транспорт, реализация которого осуществляется с непосредственной затратой энергии АТФ (первичный активный транспорт) или энергии уже сформированных градиентов других веществ или ионов (вторичный активный транспорт)
Первичный активный транспорт
К системам первичного активного транспорта относятся различные транспортные АТФазы. Это, например, Na-К-АТФаза плазматической мембраны нервных клеток, Са-АТФазы, Н-АТФаза плазматической мембраны у растений и т.д.
Транспортные АТФазы являются векторными ферментами, т.е. ферментами, сопрягающими ненаправленный процесс гидролиза АТФ и направленный процесс переноса ионов. Они могут быть электрогенными – т.е. перенос зарядов может быть некомпенсированным, как, например, для Na-К-АТФазы и Н-АТФазы, и – неэлектрогенными, когда такой перенос скомпенсирован, что характерно, например, для некоторых типов Са-АТФаз (2Н+/Са2+).
Существуют различные типы транспортных АТФаз. Рассмотрим некоторые из них.
Е1Е2 – АТФазы. Это АТФазы характерные для многих про- и эукариотических организмов. При работе таких ферментов, они совершают переходы между двумя конформационными состояниями Е1 и Е2. Е1Е2-АТФазы имеют трансмембранные домены и – в большинстве случаев – представлены одной полипептидной цепью. Исключением является Na-К-АТФаза – для функционирования которой необходима β-субъединица, играющая, по-видимому, регуляторную роль.
Примерами Е1Е2 АТФаз является – Na-K-АТФаза клеток животных, Са-АТФаза и др.
Наиболее хорошо изученной при этом является Na-K-АТФаза, которая катализирует перенос 3 Na из клетки во внешний раствор, а 2 K из внешней среды в клетку. При этом расходуется энергия одной молекулы АТФ.
На РИС приведен каталитический цикл Na-K-АТФазы. В соответствии с ним фермент в состоянии Е1 связывается с 3 Na и 1 АТФ, после чего происходит гидролиз АТФ до АДФ и фосфата, причем последний – связан с Е1. На следующей стадии происходит переход Е1 в Е2, с одновременной потерей энергии связи Е-Р, а затем – освобождение 3 Na во внешнюю среду. В дальнейшем – происходит связывание 2 К и освобождение фосфата. После этого Е2 с 2 связанными К переходит в Е1, и происходит освобождение 2 К в цитоплазму. При этом конформационное состояние Е1 соответствует связыванию фермента на внутренней стороне мембраны, а Е2 – на наружной.
С небольшими модификациями, такой цикл считается достаточно универсальным для Е1Е2 АТФаз.
Другим типом транспортных АТФаз являются так называемые F0F1-АТФазы. Их особенностью является более сложная организация фермента, который состоит из двух субъединиц – канальной (F0) и каталитической (F1). При этом первая участвует в транспорте ионов (обычно – Н), а вторая в гидролизе АТФ. В качестве примера такого фермента можно назвать Н-АТФсинтазу тилакоидов, когда она работает не как система синтеза АТФ, а как система переноса Н. Такая ситуация, по-видимому, складывается в первые секунды освещения листа после его темновой адаптации.
В отличие от Е1Е2-АТФаз принципы функционирования F0F1-АТФаз изучены хуже и более-менее общепринятое представление о них отсутствует. Существуют лишь отдельные гипотезы.
Например, известно, что при работе Н-АТФаз как в транспортном, так и в синтазном режиме, происходит вращение части каталитической субъединицы (F1), причем этот процесс тесно связан с переносом протонов. Так, даже показано, что перенос протона происходит при повороте части F0 на 120 градусов, причем каждый такой поворот в свою очередь разбивается на два участка – 90 и 30 градусов. На основе таких фактов, некоторые авторы выдвигают гипотезу о том, что транспорт Н (при АТФазной активности) и синтез АТФ (при синтазной) связан с процессами индукции. В соответствии с этими представлениями движение Н через канал, может за счет явления индукции вызывает вращение F1, энергия чего затем используется для синтеза АТФ. И обратно – вращение F1 за счет гидролиза АТФ может индуцировать ток Н через протонный канал – F0.
Отметим, что существуют и другие типы транспортных АТФаз. Кроме того, следует отметить, что существуют и системы первичного активного транспорта, не являющиеся АТФазами. Например, активно дискутируется вопрос о возможности функционирования в плазматической мембране растений элементов электронно-транспортной цепи, осуществляющей транспорт протонов за счет энергии макроэргических соединений. Наконец, следует отметить, что несмотря на то, что большинство систем первичного активного транспорта связано с транспортом ионов, существуют и транспортные системы первичного активного транспорта переносящие нейтральный вещества. Например это бактериальные фосфотрансферазы – который переносят сахара (например – глюкозу) и используют энергию фосфоенолпирувата
При математическом описании транспортных АТФаз использует те же общие подходы, как и для описания ионных каналов. В наиболее общем случае – составляется полная система дифференциальных уравнений, описывающая каталитический цикл фермента (особенно удобно это сделать в отношении Е1Е2 АТФаз, с достаточно хорошо изучены циклом), которая затем решается (обычно для стационарных условий). В том случае, когда каталитический цикл недостаточно известен или высокая степень детализации описания АТФазы не требуется, используют модели, опирающиеся на различные формы упрощенного описания каталитического цикла.
При этом достаточно успешно применяются модели, учитывающие два состояния АТФазы – свободное и связанное с ионом. “Two-state” модели (РИС). При относительной простоте, такие модели достаточно хорошо описывают такие важные свойства транспортных АТФаз как зависимость от потенциала и концентрации субстрата, явление насыщения и т.д.
Поток через такую систему может быть задан как
где k определяют тип АТФазы.
Для Н-АТФазы плазматической мембраны растений будут следующими:
; ;
;
При этом, если построить зависимость активности Н-АТФазы от концентрации субстрата (РИС), от величины потенциала (РИС) и т.д., мы получим достаточно «хорошее» описание помпы.
Однако, существуют и качественно другие подходы к вопросу описания систем первичного активного транспорта, например, описание электрогенных АТФаз как электрических элементов (ЭДС).
Вторичный активный транспорт
К системам вторичного активного транспорта относятся системы, переносящие нейтральные молекулы или ионы против химического или электрохимического градиентов, однако осуществляющие это не за счет прямого использования энергии АТФ, а за счет использования химических и электрохимических градиентов других ионов, которые были предварительно созданы теми же транспортными АТФазами.
В качестве примеров подобных систем можно отметить протон-калиевый обменник пламатической мембраны растений, который поддерживает баланс протонов и калия; протон-хлорный симпортер расположенный там же, который обеспечивает высокую концентрацию хлора внутри клетки, различные Са-Н обменники, поддерживающие низкие концентрации Са в цитоплазме и т.д. В качестве примера системы вторичного транспорта, переносящего нейтральные вещества можно привести систему транспорта сахарозы внутрь ситовидных трубок, которая работает за счет энергии электрохимического градиента протонов.