Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
СОСТОЯНИЕ АКТИВНОСТИ ЯДРЫШКОВЫХ ОРГАНИЗАТОРОВ В ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС ПОСЛЕ ИНДУКЦИИ ЧЕТЫРЕХХЛОРИСТЫМ УГЛЕРОДОМ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ И ЛЕЧЕНИЯ
Рябинин В.Е. 1, Полевщикова Е.Е. 1, Пушкарев С.А. 1, Попков П.Н. 1, Стасюк А.А. 1, Дубасов А.Ю. 1, Мухаметжанова Р.И. 1
1. ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ», Челябинск
Резюме | Комментарии ( 0) | PDF (283 K) | стр. 1055-1058
Хронические гепатиты и циррозы печени занимают ведущее место в структуре патологии печени [4]. В последние годы в гепатологии достигнуты большие успехи как в отношении методов лабораторной и инструментальной диагностики циррозов, так и в направлении лечебных мероприятий. Однако сложность строения печени и многообразие её функций обуславливают необходимость применения разнообразных диагностических приёмов и методологических подходов к оценке её деятельности в норме, при патологии и лечении. Высокой информативностью при изучении этих явлений обладает метод определения активности ядрышковых организаторов путем окрашивания тканей 50 % коллоидным раствором нитрата серебра [1]. В окрашенных препаратах визуализируются ядрышки и интрануклеарные аргентаффинные белковые гранулы, ассоциированные с зонами нуклеолярной транскрипции. Этот метод может объективно отражать степень напряженности рибосомального синтеза и пролиферативной активности различных клеток [1, 2].
Целью данного исследования явилось изучение показателей активности ядрышковых организаторов в гепатоцитах крыс при токсическом циррозе печени и после лечения препаратами фетальной печени, хорионическим гонадотропином и гепатозащитным препаратом «Максар».
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на половозрелых крысах-самцах массой от 180 до 220 г в количестве 71 особь. Животные были разделены на 6 групп. I–V опытные группы составили животные, которым подкожно вводили 50 % масляный раствор CCl4 в дозе 0,1 мл 3 раза в неделю в течение 2-х месяцев. Животные VI группы – интактные. Через 2 месяца I-й опытной группе после возникновения у них цирроза печени вводили экстракт фетальной печени человека; II опытной группе – клеточную суспензию фетальной печени человека; III опытной группе – хорионический гонадотропин человека; IV опытной группе – растительный препарат «Максар» (экстракт Маакии амурской), который был любезно предоставлен ведущим научным сотрудником С.А. Федореевым (Тихоокеанский ин-т биоорган. химии ДВО РАН).
Источником фетальной печени человека служили остатки абортного материала, полученные в результате самопроизвольных выкидышей, а также при вызывании преждевременных родов по социальным показаниям (20–22 недельного срока внутриутробного развития плода). Время, проходившее от момента взятия фетальной печени до эксплантации в организм животных, не превышало 4-х часов. В стерильных условиях извлекали печень, в небольшом объеме раствора Рингера рассекали на фрагменты. Затем готовили 10 % гомогенат путем центрифугирования фрагментов печени в растворе Рингера при 5000 об/мин в течение 10 минут. Полученный экстракт фетальной печени человека сразу же вводили крысам, подвергшимся интоксикации, по 1,5 мл каждой 1 раз в неделю в течение 2 недель. Клеточную суспензию фетальной печени готовили следующим способом: извлечённую печень в небольшом объеме раствора Рингера рассекали на фрагменты, разводили раствором Рингера до 10 % по массе взятой навески печени, затем добавляли коллагеназу и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее пипетировали иглами уменьшающегося диаметра, добавляли раствор Рингера, вновь пипетировали. После центрифугирования супернатант сливали, к осадку добавляли раствор Рингера, снова пипетировали и центрифугировали при тех же условиях. Таким путем отмывали раствор от коллагеназы еще несколько раз. После последнего центрифугирования супернатант сливали, к осадку добавляли первоначальный объем раствора Рингера, пипетировали и вводили по 1,5 мл полученной клеточной суспензии внутрибрюшинно каждой крысе, подвергшейся интоксикации, 1 раз в неделю в течение 2 недель. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) при лечении вводили внутрибрюшинно 3 дня подряд по 1,5 мл раствора, полученного при разведении ампул по 500 ЕД физраствором из расчета 170 ЕД на животное. Раствор «Максара» готовили следующим образом: к 1 г сухого препарата добавляли 5 мл 96 % этилового спирта и 45 мл дистиллированной воды, перемешивали, полученную взвесь вводили животным перорально под лёгким эфирным наркозом из расчёта 1 мл на 100 г веса 1 раз в неделю в течение 2 недель. Материал печени нелеченных и интактных животных забирали на забое через 4 недели после прекращения введения CCl4, а леченных – через 2 недели после окончания лечения. Забой животных проводили под эфирным наркозом.
Ядрышковые организаторы в гепатоцитах выявляли в парафиновых срезах печени крыс [3]. Оценку активности ядрышковых организаторов проводили при увеличении ?1000 с масляной иммерсией и зеленым светофильтром, используя микроскоп «JЕNAMED-2» [8]. Для анализа было взято 20 клеток для каждого животного. В гепатоцитах подсчитывали число ядрышек, интрануклеолярных и экстрануклеолярных включений, а также сумму аргентаффинных гранул и нуклеолярные индексы, вычисляемые как отношение числа ядрышек к числу интрануклеолярных аргентафинных включений. С целью оценки процессов пролиферации производили подсчет числа гепатоцитов 1-го и 2-го типа. В гепатоцитах 1-го типа выявляли аргентаффинные внутриядрышковые включения или диффузно окрашенные ядрышки. Такое распределение включений наблюдается в непролиферирующих клетках [1]. В гепатоцитах 2-го типа визуализировались не только целиком прокрашенные ядрышки и депозиты внутри них, но и диспергированные в кариоплазме аргентаффинные белковые гранулы, т.е. экстрануклеолярные включения. Такой тип распределения аргентаффинных гранул характерен для пролиферирующих клеток. Полученные данные в абсолютных значениях подвергали обработке приемами вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по критерию t Стьюдента и χ2.
Результаты исследования и их обсуждение
Через 2 месяца после введения CCl4 у крыс развился цирроз печени, который морфологически проявлялся отсутствием типичных печеночных долек и диффузным разрастанием соединительной ткани. Паренхима печени состояла из ложных печеночных долек, регистрировалась диффузная и зональная жировая дистрофия гепатоцитов. В портальных трактах наблюдалось разрастание фиброзной ткани, диффузная лимфоцитарная и гистиоцитарная инфильтрация. Лечение сопровождалось появлением типичных печеночных долек, представленных несколько увеличенными в размерах гепатоцитами с гиперхромными ядрами, пронизанными соединительно-тканными прослойками. В печеночных дольках после лечения была отмечена обычная радиарная ориентация печеночных балок. Результаты определения активности ядрышковых организаторов в эксперименте представлены в табл. 1, 2.
Рассматривая данные по активности ядрышковых организаторов в экспериментах с интоксикацией CCl4, вызывающей цирротические изменения в печени, и последующим лечением (табл. 1), можно выделить ряд закономерностей. Не вызывает сомнения факт, что активность ядрышковых организаторов в гепатоцитах крыс с циррозом печени нарастает в результате действия гепатотоксичного яда CCl4. Такое явление даже на фоне достаточно выраженной жировой, вакуольной и других видов дистрофии свидетельствует об известной способности гепатоцитов резко интенсифицировать гиперпластические процессы в их ультраструктурах в ответ на повреждающее воздействие [6]. Это говорит о том, что организму в высшей степени свойственна способность к экономии материальных ресурсов и к максимальной концентрации их на главном участке развёртывания приспособительной реакции [6]. Количество ядрышек при хронической интоксикации CCl4 возрастает более чем в 2 раза по сравнению с контролем. Возможно, что увеличение их числа при циррозе печени происходит за счёт активации ЯОР, которые ранее были неактивными и не выявлялись методом серебрения [7]. Абсолютное число интрануклеолярных включений также возрастает, однако нуклеолярный индекс остаётся практически неизменным, что говорит об одинаковом количестве интрануклеолярных включений, приходящемся на отдельное ядрышко как в норме, так и при циррозе. Это согласуется с представлениями о том, что репаративная регенерация печени протекает в равной степени в двух формах – клеточной и внутриклеточной [6].
Таблица 1
Число ядрышек, интрануклеолярных и экстрануклеолярных аргентафинных гранул и отношение числа ядрышек к числу интрануклеолярных аргентафинных гранул в гепатоцитах у крыс
Экспериментальные группы
Абсолютное число ядрышек на гепатоцит
Абсолютное число интрануклеолярных включений на гепатоцит
Абсолютное число экстрануклеолярных включений
на гепатоцит
Суммарное число включений на гепатоцит
Отношение числа ядрышек к числу интрануклеолярных включений
I (n = 260)
5,13 ± 0,09***
26,34 ± 0,53***
1,13 ± 0,11***
27,45 ± 0,52***
0,20 ± 0,006***
II (n = 260)
4,70 ± 0,09***
22,91 ± 0,49***
0,92 ± 0,11***
23,81 ± 0,47**
0,21 ± 0,007***
III(n = 280)
2,95 ± 0,07*
15,98 ± 0,54***
0,49 ± 0,06***
16,46 ± 0,51***
0,19 ± 0,008***
IV(n = 240)
2,96 ± 0,07*
15,63 ± 0,37***
0,61 ± 0,06***
16,25 ± 0,35***
0,19 ± 0,003***
V (n = 200)
6,92 ± 0,34**
18,29 ± 0,99**
3,74 ± 0,21**
22,03 ± 1,17**
0,38 ± 0,016
VI (n = 180)
3,07 ± 0,12
7,98 ± 0,25
0,28 ± 0,03
8,27 ± 0,26
0,39 ± 0,004
Примечание: группа I – лечение экстрактом фетальной печении (20–22 нед. гестации); группа II – лечение клеточной суспензией фетальной печени (20–22 нед. гестации); группа III – лечение хорионическим гонадотропином человека; группа IV – лечение препаратом «Максар»; группа V – интоксикация CCl4 без лечения; группа VI – интактные животные; n – общее количество исследованных гепатоцитов в группе; * – достоверные различия обнаружены в группах I–IV по отношению к V группе (p < 0,05); ** – достоверные различия обнаружены в группах I–V по отношению к VI группе (p < 0,05).
Таблица 2
Число гепатоцитов 1-го и 2-го типов у крыс
Группа крыс
Число гепатоцитов 1-го типа
Число гепатоцитов 2-го типа
Всего
I
168 (64,6 %)
92 (35,4 %)
260 (100,0 %)
II
193 (74,2 %)
67 (25,8 %)
260 (100,0 %)
III
216 (77,1 %)
64 (22,9 %)
280 (100,0 %)
IV
171 (71,3 %)
69 (28,7 %)
240 (100,0 %)
V
8 (4,0 %)
192 (96,0 %)
200 (100,0 %)
VI
144 (80,0 %)
36 (20,0 %)
180 (100,0 %)
Примечание: нумерация экспериментальных групп такая же, как и в табл. 1; выявлены достоверные отличия между I, II, III, IV, VI группами по отношению к V группе (?2 (p < 0,0001)).
При лечении во всех группах отмечалось резкое снижение числа ядрышек, в случаях лечения ХГЧ и «Максаром» с достижением контрольных отметок, что коррелирует со снижением пролиферативной активности клеток [1, 7]. В то же время уменьшение числа интрануклеолярных включений было не так значительно, а в случаях лечения экстрактом и клеточной суспензией фетальной печени количество интрануклеолярных включений даже несколько возросло по сравнению с интоксикацией. Тем не менее, расчёт нуклеолярных индексов показал близость их значений для всех групп лечения, что свидетельствует о едином росте числа интрануклеолярных включений, приходящегося на отдельное ядрышко. Данные изменения происходят, по всей видимости, за счёт рекомбинационных преобразований аргентаффинного вещества ядрышек. Увеличение зоны фибриллярных центров приводит к интенсификации рибосомального синтеза в зонах нуклеолярной транскрипции гепатоцитов. Таким образом, при лечении происходит интенсификация процессов внутриклеточной регенерации, в то время как пролиферативная активность снижается. С этими данными согласуется изменение распределения гепатоцитов по типам (табл. 2). При лечении количество экстрануклеолярных включений и клеток 2-го типа снижается по сравнению с интоксикацией и стремится к контрольным значениям.
Мы считаем, что такой положительный терапевтический эффект, вероятно, обусловлен появлением в гепатоцитах белков, блокирующих их пролиферативный потенциал, в то время как биосинтетические процессы остаются на высоком уровне, а в случае лечения препаратами фетальной печении даже интенсифицируются. Таким образом, по данным показателям можно говорить о наличии положительного терапевтического эффекта при лечении всеми способами, однако в сравнительном аспекте можно отметить более сильное модулирующее действие препаратов фетальной печени, проявляющееся в сохранении и увеличении количества белков-регуляторов, ассоциированных с зонами нуклеолярной транскрипции.
Вывод
Таким образом, исследования показали, что печень интактных и леченных крыс состоит главным образом из гепатоцитов I типа (с низкой пролиферативной активностью), в то время как у нелеченных крыс – из гепатоцитов II типа (с высокой пролиферативной активностью). Модулирующее действие лекарственных препаратов позволяет снизить опасность образования неконтролируемого пула пролиферирующих клеток и способствует направлению репаративных процессов в сторону внутриклеточной регенерации гепатоцитов.
Работа выполнена при финансовой поддержке по гранту ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 8275).
Пристатейные списки литературы
1. Крокер Д. Молекулярная диагностика. Методы: пер. с англ.; под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – М., 1999.
2. Куренков Е.Л. Морфологическая характеристика полиповидных образований желудка и фонового хронического гастрита // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. – 2000. – Т.10, № 2. – С. 18–25.
3. Куренков Е.Л., Кузнецов М.Е., Шевяков С.А., Рассохин А.Г. Активность ядрышковых организаторов в клетках эритробластических островков костного мозга при различных функциональных состояниях эритропоэза // Вестн. РАМН. – 2002. – № 3. – С. 13–16.
4. Львов Д.К. Вирусный гепатит С — «ласковый убийца» // Рос. журн. гастроэнтерол. и гепатол. – 1995. – Т.5, № 1. – С. 4–6.
5. Состояние активности ядрышковых организаторов в гепатоцитах крыс после индукции четыреххлористым углеродом цирроза печени и лечения биологически активными препаратами печени и селезенки / А.М. Ма-
лышева, П.Н. Попков, Е.Л. Куренков, В.Е. Рябинин, С.И. Гробовой // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2006. – Т. 142, № 7. – С. 114–117.
6. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии. – М., 1993. – 336 с.
7. Штейн Г.И., Кудрявцева М.В., Кудрявцев Б.Н. Изменение морфометрических параметров окрашенных серебром ядрышек гепатоцитов крыс при циррозе печени и в процессе ее реабилитации // Цитология. – 1999. – Т. 41, № 7. – С. 574–580.
8. Crocker J., Egan M.J. Correlation between NOR sizes and numbers in non-Hodgkin’s lymphomas // J. Pathol. – 1998. – Vol. 3. – P. 233–239.
На правах рукописи
ШИЛОВ АНДРЕЙ МИХАЙЛОВИЧ
ВЛИЯНИЕ НЕОНАТОПЛАСТИКИ НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ У КРЫС
16.00.02 - патология, онкология и морфология животных;
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук
МОСКВА 2005
Работа выполнена на кафедре патологической анатомии и физиологии ФГОУ ВПО " Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина"
Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,
доктор ветеринарных наук, профессор Жаров Александр Васильевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,
доцент В. П. Сапрыкин
кандидат ветеринарных наук, В. Э. Пруссак-Глотов
Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.
Защита состоится " Л " ' . 2005 года в I Т часов на заседании диссертационного совета Д220.042.02 в ФГОУ ВПО " Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина" по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23, ФГОУ ВПО МГАВМ и Б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина".
Автореферат разослан - 2005 года.
Учёный секретарь диссертационного совета, доцент
А.И. Торба.
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы: Несмотря на значительное внимание, уделяемое патологии печени в гуманной и в ветеринарной медицине в последние десятилетия, поиск новых методов стимуляции репаративных процессов в печени при различной патологии по-прежнему актуален. И если оперативному стимулированию репарации в гуманной медицине уделяется большое внимание, то в ветеринарной медицине как в отечественных, так и в зарубежных публикациях подобные методы мало описываются. Поэтому восполнить указанный пробел представляется крайне необходимым.
Для лечения различных видов патологии некоторые авторы используют трансплантацию нативных тканей плодов. Данная методика известна под названием - брефопластики (от греч. brephos - плод, plastic - формирую) (Беляев B.C., 1985). Применяется она и при лечении патологии печени, в частности при циррозе печени (Батанов А.Н. и др., 2000), но использование плодных тканей приводит к необходимости воздействия (как минимум терапевтического) на организм матери. Вместе с тем, анализ литературы (Скалецкий Н.Н.,1999) показывает, что разница между печенью плодов в завершающий период беременности и печенью новорожденных животных незначительна. Поэтому изучение влияния печени новорожденных на патологически измененную печень будет весьма перспективно, так как при положительном эффекте ткани новорожденных животных можно будет получать в достаточно большом количестве без ущерба для здоровья матери, особенно если учесть, что подавляющая часть животных многоплодна. Это приобретает важное значение при внедрении методики в клиническую практику. По нашему мнению, вполне уместно будет называть данную методику неонатопластика (от лат. neonatus - новорожденный и греч. plastic -формирую). Следует отметить отсутствие описания подобных исследований в доступной литературе.
Цель работы: Изучить влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени у крыс.
Задачи исследования:
1. Разработать и апробировать в эксперименте методику визуальной малоинвазивной оценки состояния печени крыс в норме и при патологии.
2. Разработать и апробировать в эксперименте методику трансплантации печени новорожденных животных - неонатопластику.
3. Исследовать клинические, гематологические и биохимические показатели крови крыс в норме и при экспериментальной патологии печени под влиянием неонатопластики.
4. Исследовать патоморфологические изменения в печени крыс под влиянием неонатопластики.
Положения выносимые на защиту.
1. Методика визуальной малоинвазивной оценки состояния печени крыс в норме и при экспериментальной патологии печени.
2. Гематологические и биохимические показатели крови крыс в норме, при экспериментальной патологии печени и под влиянием неонатопластики.
3. Методика трансплантации печени новорожденных животных -неонатопластика.
Научная новизна. Впервые получены показатели биохимического, гематологического состава крови, патоморфологических изменений печени у здоровых крыс, при экспериментальной патологии и под влиянием неонатопластики, свидетельствующие о положительном влиянии трансплантации тканей новорожденных на течение экспериментального цирроза печени у крыс. После доработки неонатопластику можно внедрить в клиническую практику, для лечения животных с патологией печени.
Впервые проведена визуальная малоинвазивная оценка состояния печени при моделировании патологии посредством отоскопа фирмы Welch Allyin (США), модели № 20000 у крыс, а также получены факты, позволяющие использовать данную методику как в клинической практике, так и в научных исследованиях.
Научно - практическое значение полученных результатов. Научно-практическая ценность диссертации состоит в том, что полученные данные
расширяют и дополняют имеющиеся сведения о закономерностях изменений биохимического, гематологического состава крови и морфологии печени крыс при экспериментальной патологии и под влиянием неонатопластики.
Материалы, полученные в ходе проведения научных исследований используются при проведении учебных занятий по теме «регенерация». Апробация работы:
Метод визуальной малоинвазивной оценки состояния печени и других органов брюшной полости у мелких животных массой до 1 кг применяется в лечебной деятельности ветеринарной клиники ООО «Лада-С» г. Люберцы Московской области.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 2 работы в научных трудах МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Список литературы включает 204 источника, в том числе 52 иностранных источника. Работа иллюстрирована 26 таблицами, 17 графиками, 33 рисунками.
2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментальную работу проводили на базе вивария лабораторных животных ФГОУ ВПО "МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина". Гематологические и биохимические исследования крови проводили в Диагностическом центре № 3 г. Москвы. Патоморфологические исследования проводили на кафедре патологической анатомии и физиологии ФГОУ ВПО "МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина".
Опыт проводили на 25 самцах беспородных белых крыс с начальной живой массой 190 - 210 г. Все животные находились в одинаковых условиях содержания и в течение всего эксперимента получали только специализированный полнорационный комбикорм для мышей и крыс. На 3-х
животных отрабатывали методику лапароскопической диагностики. Остальные животные были поделены на 4 группы: 1-ая контрольная - интактные животные (5 крыс), 2-ая опытная (5 крыс) и две опытных (12 крыс). Животным опытных групп моделировали экспериментальный цирроз. В область холки 2 раза в неделю инъецировали 50 % - ный тетрахлорметан на вазелиновом масле из расчета 0,5 мл на 1 кг массы в течение 8 - 8,5 месяцев. Контрольным интактным животным вводили 0,85%-ный раствор натрия хлорида по аналогичной схеме. Проводили клиническое обследование, гематологические и биохимические исследования крови, лапароскопическую диагностику и гистологические исследования.
После лапароскопического подтверждения цирроза и лабораторных исследований крови животных проводили:
в 1-ой интактной контрольной группе - частичную резекцию печени; во 2-ой опытной группе - прекращали затравку и проводили лапаротомию без воздействия на печень;
в 3-ей опытной группе - прекращали затравку и проводили частичную резекцию печени;
в 4-ой опытной группе - прекращали затравку, проводили частичную резекцию печени и неонатопластику.
Техника операции:
Животное наркотизировали эфиром и фиксировали в спинном положении. После обработки операционного поля производили оперативный доступ по белой линии живота. Извлекали каудальную долю печени, из нее иссекали клиновидный краевой участок массой 0,5 - 1,0 г (что составляет примерно 3-5% от массы органа). У контрольной и 3-ей опытной группы -дефект ушивали кетгутом, стягивая между собой края раны. Крысам 4-ой опытной группы в образовавшийся дефект трансплантировали асептически полученную нативную печень однодневных крысят, которую фиксировали сведением краев раны при ушивании кетгутом. В брюшную полость иньецировали 1-2 мл 1%-го р-ра диоксидина. Брюшину ушивали кетгутом, а кожу черным шелком, накладывая П - образный шов. Полученный в результате
операции участок печени подвергали гистологическому исследованию с постановкой окончательного диагноза.
Через 30 дней после оперативного вмешательства проводили забор крови для лабораторных исследований, животных подвергали эутаназии в парах эфира и вскрывали. Далее суммировали полученные данные и подвергали их статистической обработке.
В ходе моделирования экспериментального цирроза проводили выборочные исследования крови. После гибели отдельных животных проводили патологоанатомическое вскрытие и патогистологические исследования. Основным критерием нормы считали показатель по контрольной группе животных на момент оперативного вмешательства. В связи с отсутствием подробных данных по изменению картины крови при экспериментальном циррозе печени, мы провели расширенное исследование гематологических параметров в средней и завершающей фазах эксперимента. Клинические методы обследования.
В ходе клинического исследования изучали общее состояние животных, упитанность, состояние кожи и шерстного покрова, состояние стула. Поскольку масса тела животных является одним из самых объективных показателей общего состояния организма, то в ходе эксперимента животных подвергали регулярному взвешиванию на электронных весах фирмы «Monmert» с точностью до грамма. Гематологические методы исследования.
Из биологических жидкостей материалом для исследования служила цельная кровь и сыворотка крови.
Для морфологического и биохимического анализа кровь брали в утренние часы натощак из сердца после наркотизации парами эфира. Для цельной крови в качестве стабилизатора использовали КЗ ЕДТА. Сыворотку получали центрифугированием предварительно отстоянной крови.
Подсчет форменных элементов и их качественных характеристик проводили на гематологическом анализаторе «Sysmex К 1000». В ходе работы определяли число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ширину
распределения эритроцитов и тромбоцитов, средний объем тромбоцита и эритроцита, уровень гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в одном эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в одном эритроците, процентное и количественное содержание лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов. По мазку крови на предметном стекле изучали морфологическое состояние эритроцитов. Выведение лейкограммы.
Выведение лейкограммы проводили по методу Романовского-Гимзы. При записывании результатов лейкограммы отдельные виды лейкоцитов располагали в такой последовательности: базофилы (Б), эозинофилы (Э), нейтрофилы - миелоциты (М), юные (Ю), палочкоядерные (П), сегментоядерные (С), лимфоциты (Л), моноциты (М). Биохимические методы исследования.
Сыворотку крови исследовали при помощи биохимического анализатора «Hitachi 917». определяли активность АлАТ, АсАТ, у-ГТ, ЩФ', уровень билирубина, количество общего белка и альбуминов. Белковые фракции, общий белок, альбумины, исследовали на
пластинах в полиакриламидном геле анализатором белковых фракций «Согтеу». Изучали абсолютное и относительное (за 100 % принимали количество общего белка) количество выше перечисленных белковых фракций. Эндоскопические методы исследования.
Лапароскопичекую диагностику выполняли при помощи отоскопа фирмы Welch Allyn (США), модели № 20000, начиная со 2-го месяца затравки. Лапароскопическую оценку осуществляли сначала 1 раз в месяц, при остановке и колебании прироста живой массы, через 2 недели после ее снижения - выборочно, а через 1-1,5 месяца при появлении первых признаков кахексии - у всех животных.
Техника исполнения. Животных наркотизировали эфиром и фиксировали в спинном положении. Проводили подготовку операционного поля (выбривание шерсти и обработку йодно-спиртовым р-ром.). Отступя 1 - 1,5 см от мечевидного хряща, с помощью зажима Аллиса - Томса, осуществляли
одномоментную фиксацию кожи и мышц брюшной стенки. После этого делали прокол брюшной стенки троакаром «под зажим». При необходимости диаметр образовавшегося отверстия увеличивали с помощью ножниц - тупым способом. В отверстие вводили канюлю отоскопа (предварительно продезинфицированную 70%-ным спиртовым р-ром) и осматривали печень. В связи с тем что желтая галогеновая лампа отоскопа искажала реальный цвет печени, в первую очередь обращали внимание на строение печени: состояние краев печеночных долей и поверхности. Морфологические исследования.
Макрокартину оценивали у павших и убитых животных (вскрывали по общепринятой методике, обращали преимущественное внимание на состояние печени), а также во время оперативного вмешательства.
Подготовку патологического материала для гистологического анализа осуществляли по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1961). Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Срезы выполняли на замораживающем гелевом столике. Препараты окрашивали гематоксилин -эозинном, а также Суданом - III на жир, с последующим заключением их в канадский бальзам.
У животных 1-ой, 3-ей и 4-ой групп первоначально исследовали резецированный участок печеночной ткани. После эутаназии исследовали участок оперативного вмешательства и участок из другой доли, не подвергавшийся каким-либо воздействиям. У животных 2-ой группы производили исследование одного участка каудальной доли полученного после эутаназии.
На микропрепаратах изучали общую картину, описывали изменения со стороны паренхиматозных и стромальных элементов. На препаратах, окрашенных Суданом - III на жир, описывали наличие жировых отложений, их форму и преимущественную локализацию.
Результаты исследований обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Поиск путей эффективного лечения острой и особенно хронической патологии печени продолжает сохранять свою актуальность. Несмотря на внедрение в клиническую практику новых способов диагностики и лечения, цирроз печени по-прежнему относится к значимым и наиболее сложным проблемам ветеринарной медицины (Жаров А.В., 2001; Лебедева И.О., 2002; Шиляева Т.И., 2003; Уша Б.В., 1979).
Анализ литературы показывает, что в ветеринарной медицине практически не используются методы оперативного стимулирования и трансплантационных методик при лечении цирроза печени у животных, в то время как в гуманной медицине они используются достаточно широко (Копатикова И. И,. 1999; Смирнова Е. М., 2001).
В подавляющем большинстве работ (Саркисов Д. С, Рубецкой Л. С, 1965; Попова И. В., 1974, 1975; Рывняк В. В., 1986, 1996; Дунаев П. В. и др., 1998; Муслимов С. А., 2000) глубоко изучаются морфологические изменения непосредственно в печени. В несколько меньшем количестве работ (Сидорова В. Ф. И др., 1966; Жаров А В. и др., 1986; Рорр Y.- Р., 1993; Батанов А Н. и др., 2000) проведено изучение изменений биохимического состава крови. И только отдельные авторы (Гусейнова Л.А., 1981; Филипова Т. А., 1981; Wilijams S. E. et al., 1989) описывают изменения периферической крови при некоторых хронических заболеваниях печени. В клинической практике ветеринарные специалисты для оценки состояния животных гораздо чаще используют данные биохимических и гематологических исследований по сравнению с морфологическими исследованиями. Поэтому именно результаты общеклинических и биохимических исследований крови представляют наибольшую ценность для практикующих специалистов.
Современная наука достаточно продвинулась в вопросах изучения факторов стимуляции репаративных процессов в печени (Подымова С.Д., 1998; Копатикова И. И., 1999; Смирнова Е. М., 2001). Известно, что в регенерации печени принимает участие комплекс гепатоцитстимулирующих веществ, среди которых выделены гепатоцит-стимулирующая субстанция и гепатопоэтин-А и
В (Арцимович Н.Г., 1991; Olsen P.S. et al., 1998) и целый ряд других митогенных факторов, таких как ТРФ-а, ГСРФ-1 (Mead J.E., Fausto N., 1989). Известны и другие вещества, которые регулируют гепатоцитарную активность, но не проявляют собственного митогенного действия (Караполян СР., Сванадзе Н.Л., 1985; Солопаев Б.П., 1990; Абакумова О.Ю. и др., 1996). Такими свойствами обладают: норадреналин, вазопрессин, ангиотензины, эстрогены, инсулин, глюкагон. Факторы пролиферации гепатоцитов, а также другие регуляторы роста гепатоцитов выделяются клетками печени после частичной гепатоэктомии (Солопаев Б.П. и др., 1981), клетками печени растущих животных (Мусселиус С.Г., 1993; Онищенко Н.А. и др., 1995), особенно неонатальной печени (Дугладзе Д.И., 1984; Сухих Г.Т., 1998; Репина B.C., 1998; Копатикова И.И., 1999).
Таким образом, приступая к настоящему исследованию, мы опирались на имеющиеся в литературе данные о том, что печень молодых животных на всех этапах филогенетического развития продуцирует факторы, которые могут оказывать стимулирующий эффект на цирротически измененную печень и на организм больного животного в целом (Лепехова СА. и др. 1998; Хлыстова З.С.и др., 1998).
Планируя проведение клинических обследований животных, морфологических исследований печени, гематологических и биохимических исследований состава крови при экспериментальном циррозе печени у крыс, мы исходили из понимания системности заболевания, т.е. взаимосвязи различных систем и органов животных с патологией печени (Саркисов Д.С., 1977,1993; Сетков Н.А. и др., 1991; Жаров А.В., 2001).
Все полученные данные мы разделили на системные группы:
- результаты клинических исследований;
- результаты гематологических исследований;
- результаты биохимических исследований;
- результаты лапароскопических исследований;
- результаты патоморфологических исследований.
Клиническая выраженность патологии печени у крыс развивалась постепенно, практически не проявляя себя в течение первых трех - четырех месяцев опыта, затем отмечается снижение прироста живой массы в фазу развития цирроза. После проведения лечебных манипуляций наиболее выраженное улучшение состояния отмечено у крыс в 4-ой группе, подвергнутых частичной гепатэктомии и неонатопластике. Прирост живой массы составил 7,3 %.
Таблица 1 Динамика массы тела крыс, г.
Группа Начальная масса На момент опер, вмешат. Через 30 дн. п/е опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 196,0 ±3,2 524,8 ±27,4* 496,8 ±16,0
2-я. контр, затр. 199,2 ±3,6 459,6 ±7,4 451,0 ±14,8
3-я. опытная 201,4 ±1,6 461,6 ±11,0 463,2 ±14,2
4-я. опытная 195,8 ±2,5 444,0 ±11,8 476,5 ±6,8
* - данные статистически недостоверны (Р > 0,05)
В ходе моделирования экспериментального цирроза печени у крыс мы отмечали снижение большинства из 13 исследуемых показателей крови, что позволяет сделать нам вывод о развитии общей анемии, но регистрировали увеличение числа тромбоцитов. Также мы отмечали увеличение числа лейкоцитов, что является показателем прогрессирующего воспаления (Лифшиц В.М., Сидельникова В.И., 2000).
Наиболее достоверные данные положительного воздействия частичной гепатэктомии и частичной гепатэктомии в сочетании с неонатопластикой получены нами при изучении следующих показателей:
а) средний объем эритроцита - в 4-ой группе было отмечено достоверное повышение на 7,8 % и достижение уровня 1-ой (контрольной) группы;
б) среднее содержание гемоглобина в одном эритроците - в 3-ей и 4-ой группах отмечали достоверное повышение на 5,8 % и 6,4 % соответственно и достижение уровня 1-ой (контрольной) группы;
в) средняя концентрация гемоглобина - в 3-ей и 4-ой группах отмечали достоверное повышение на 2,2 % и 1,4 % соответственно;
г) число лейкоцитов - в 3-ей и 4-ой группах отмечали достоверное понижение на 60,3 % и 50,7 % соответственно.
Таблица 2
Динамика среднего объема эритроцита, мкм3.
Группа На момент опер, вмешат. Через 30 дн. после опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 50,6 ±0,8 50,5 ±0,6
2-я. контр, затр. 47,8 ±2,6* 49,5 ±2,0*
3-я. опытная 48,1 ± 1,3 51,0 ±2,0*
4-я. опытная 47,2 ±1,4 50,9 ±1,6
*- данные статистически недостоверны (Р > 0,05)
Таблица 3
Динамика среднего содержания гемоглобина в одном
эритроците, пкг.
Группа На момент опер, вмешат. Через 30 дн. после опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 18,0 ±0,4 18,3 ±0,3
2-я. контр, затр. 17,4 ±0,6 17,7 ±0,6
3-я. опытная 17,3 ±0,4 18,3 ±0,6
4-я. опытная 17,1 ±0,2 18,2 ±0,7
Данные статистически достоверны (Р < 0,05)
Таблица 4
Динамика средней концентрации гемоглобина, г/дл.
Группа На момент опер, вмешат. Через 30 дн. после опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 36,5 ±0,6 36,2 ±0,3
2-я. контр, затр. 36,5 ±0,4 35,7 ±0,5
3-я. опытная 36,1 ± 1,0 35,9 ±0,9
4-я. опытная 36,2 ±1,0 35,7 ±0,7
Данные статистически достоверны (Р < 0,05).
Таблица 5
Динамика числа лейкоцитов, тыс/мм3.
Группа До начала На момент опер. Через 30 дн. после
эксперимента вмешат. опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 10,4 + 1,1 10,1 ±0,9 9,0 ±1,0
2-я. контр, затр. 9,2 ±0,4* 20,8 ±2,6 19,3 ±2,1
3-я. опытная 9,8 ±1,5 20,2 ±1,7 12,6 ±4,5
4-я. опытная 9,9 ±1,2 20,5 ±1,6 13,6 ±2,2
* - данные статистически достоверны (Р < 0,05)
Положительные тенденции нами выявлены при изучении гематокрита в 4-ой группе, числа эритроцитов (увеличение) в 4-ой группе, средний объем эритроцита (увеличение) в 3-ей группе, ширина распределения эритроцитов (понижение) в 3-ей и 4-ой группах, морфологические изменения эритроцитов (снижение) в 3-ей и 4-ой группах, количество гемоглобина (увеличение) в 4-ой группе, число тромбоцитов (увеличение) в 3-ей и 4-ой группах, ширина распределения тромбоцитов (увеличение) в 3-ей и 4-ой группах, в 4-ой группе более выражено, средний объем тромбоцита (увеличение) в 3-ей и 4-ой группах, лейкограмма (нормализация) в 3-ей и 4-ой группах.
В ходе эксперимента, мы проводили биохимическое исследование сыворотки крови. Исследовали изменения аланин- и аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, у- глутаминтранспептидазы, общего билирубина, общего белка, альбуминов, глобулинов
(всего 11 показателей).
В ходе моделирования экспериментального цирроза печени у крыс мы отмечали изменения основных показателей сыворотки крови, характерные для цирроза печени и сопоставимые с данными литературы (Подымова С.Д., 1998), а именно увеличение активности аланин- и аспартатаминотрансфераз и щелочной фосфатазы, увеличение уровня общего билирубина, снижение абсолютного и относительного количества альбуминов и й[ - глобулинов, увеличение абсолютного и относительного количества глобулинов
(Лифшиц В.М., Сидельникова В.И., 2000).
Наиболее достоверные данные положительного воздействия лечебных манипуляций получены нами при изучении следующих показателей:
а) динамики активности аланинаминотрансферазы - в 3-ей и 4-ой группах отмечали достоверное понижение на 72,8 % и 78,1 % соответственно;
б) динамики активности аспартатаминотрансферазы - в 3-ей и 4-ой группах отмечали достоверное понижение на 112,2 % и 194,0 % соответственно;
в) динамики активности щелочной фосфатазы - в 3-ей и 4-ой группах отмечали достоверное понижение в 4 раза и в 2,9 раза соответственно;
г) динамики абсолютного и относительного количества альбуминов -в 3-ей группе отмечали достоверное повышение 21,4 % и 22,5 %, в 4-ой группе на 26,8 % и 31,9 % соответственно;
д) динамики абсолютного и относительного количества у-глобулинов - в 3-ей группе отмечали достоверное понижение 23,3 % и 25,1 % , в 4-ой группе на 37,4 % и 26,9% соответственно;
Таблица 6
Динамика активности аланинаминотрансферазы сыворотки крови крыс, Ед/л.
Группа До начала эксперимента На момент опер, вмешат. Через 30 дн. после опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 55,7 ±6,5 65,0 ±12,0 99,4 ±6,7
2-я. контр, затр. 56,0 ±4,4 408,2 ±38,0 402,2 ±38,4
3-я. опытная 54,0 ±2,8 394,2 ±34,3 109,5 ±17,0
4-я. опытная 54,5 ±2,9 368,9 ±40,4 80,5 ±9,1
Данные статистически недостоверны (Р > 0,05).
Таблица 7
Динамика активности аспартатаминотрансферазы сыворотки крови крыс, Ед/л.
Данные статистически недостоверны (Р > 0,05).
Табллица 8
Динамика активности щелочной фосфатазы сыворотки крови крыс, Ед/л.
Группа До начала эксперимента На момент опер, вмешат. Через 30 дн. после опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 141,9 ±10,0 88,3 ±17,2 116,3 ±26,6
2-я. контр, затр. 154,9 ±26,4 236,0 ±69,2 287,8 ±125,2
3-я. опытная 145,0 ±10,2 240,7 ±66,8 60,7 ± 33,5
4-я. опытная 140,4 ±11,0 315,9 ±95,8 110,5 ±22,3
Данные статистически недостоверны (Р > 0,05).
Таблица 9
Динамика количества альбуминов, г/л.
Группа До начала эксперимента На момент опер, вмешат. Через 30 дн. после опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 32,19 ±3,76 26,70 ±1,01* 23,27 ±1,00
2-я. контр, затр. 30,91 ± 1,58 24,21 ±3,81 19,58 ±3,46
3-я. опытная 31,88 ±2,28 20,23 ±2,28 24,95 ±1,86
4-я. опытная 32,83 ±2,20 18,35 ±2,13 25,21 ±2,05
* - данные статистически достоверны (Р < 0,05).
Таблица 10
Динамика количества у-глобулинов, г/л.
Группа До начала эксперимента На момент опер, вмешат. Через 30 дн. После опер, вмешат.
1-я. контр, интакт. 8,15 ±1,36 12,20 ±2,12 14,61 ± 1,05
2-я. контр, затр. 8,24 ±1,16 15,18 ±2,49 16,73 ±1,84
3-я. опытная 9,59 ±1,27 15,00 ±4,20 11,79 ±4,16
4-я. опытная 7,77 ±0,65 14,21 ±2,30 10,40 ±2,88
Данные статистически недостоверны (Р > 0,05).
Положительные тенденции нами выявлены при изучении уровня общего билирубина (снижение) во всех группах, количества общего белка (повышение) в 4-ой группе, абсолютного и относительного количества ОС] -глобулинов (повышение) в 3-ей и 4-ой группах, абсолютного и относительного количества глобулинов (повышение) в 4-ой группе.
При изучении развития цирроза печени у крыс с помощью лапароскопической диагностики было выяснено, что заболевание развивается
стадийно. Однако жесткие границы перехода одной стадии в другую отсутствуют. Всего нами было выделено 5 стадий:
1) здоровая печень, до 2,5 - 3 месяца затравки;
2) жировой гепатоз печени, с 3-го по 5-ый месяц затравки;
3) токсическая жировая дистрофия печени, с 4,5 по 6,5 месяц затравки;
4) токсическая жировая дистрофия, переходящая в цирроз 1 стадии, с 6-го по 7,5 месяц затравки;
5) микронодулярный цирроз 1- 2 стадии, с 7-го по 8-ой месяц затравки.
Кроме того, установлено, что визуальные изменения печени,
установленные с помощью отоскопа, возникают раньше (примерно на 0,5 - 1 мес), чем выраженное изменение показателей крови и общего состояния животных. Лапароскопическая диагностика с помощью отоскопа является и весьма безопасным методом. За время наших исследований не было выявлено каких - либо осложнений.
Полученные нами результаты морфологических исследований подтверждают стадийность развития цирроза, выявленную при лапароскопических исследованиях.
Наиболее существенным изменением микрокартины печени у животных контрольной группы явилось развитие жировой дистрофии гепатоцитов по периферии печеночных долек через 30 дней после частичной гепатэктомии. Этот факт согласуется с данными других авторов (Сидорова В. Ф. и др., 1966; Лиознер Л.Д., 1975; Лиознер Л.Д., Бабас А.Г. и др., 1990), рассматривающих накопление жира по периферии долек как проявление перилобулярной жировой инфильтрации с последующим использованием жира в качестве энергетического материала для регенераторных процессов.
Разница между животными, не подвергнутыми лечебным воздействиям, (2-ая группа) и животными, подвергнутыми частичной гепатэктомии (3-ая группа) и неонатопластике (4-ая группа), очевидна и сомнению не подлежит. Через 30 дней после прекращения затравки отмечали лишь незначительные изменения. Выражавшиеся в некотором восстановлении (сглаживании) поверхности печени; цирротические узелки в ней были менее выражены, но тем
не менее имели место. Печень имела коричневый цвет со слегка вишневым оттенком. Плотность печени понижалась. Микроскопически отмечали атрофический цирроз с разростом соединительной ткани по периферии долек. У отдельных животных отмечали кровоизлияния в соединительную ткань. Гепатоциты в состоянии жировой и белковой дистрофии. Многие клетки некротизированы и содержат белково-жировой детрит. Жировую дистрофию гепатоцитов отмечали преимущественно по периферии печеночных долек. В глубине долек паренхиматозная ткань сохранялась лучше.
Разница между животными после частичной гепатэктомии (3-ая группа) и после частичной гепатэктомии в сочетании с неонатопластикой (4-ая группа) выражена в меньшей степени. В 3-ей группе восстановительные процессы вокруг рубца проявлялись слабее с преобладанием размножения малодифференцированных клеток паренхимы и соединительнотканных элементов. Образование мелких сосудов капиллярного типа наблюдается по периферии очага. Отмечали единичные липидные капли по периферии печеночных долек. У животных 4-ой группы в участке трансплантации трансплантат был заключен в соединительнотканную капсулу. Вокруг трансплантата отмечали репаративную регенерацию паренхимы печени. Возникший дефект восполнялся посредством пролиферации и
дифференцировки паренхиматозных и соединительнотканных элементов (ретикулярных и адвентициальных клеток, эндотелия капилляров) и регенераторного почкования сосудов микроциркуляторного русла с образованием грануляционной ткани. В грануляционной ткани отмечали островки гепатоцитов, включавшие от 2 - 4 гепатоцитов до групп, формирующих печеночные балки и дольки.
Данные, полученные в ходе наших исследований, показывают положительное влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени у крыс. Вместе с тем мы хотим отметить, что положительный эффект не является значительным. Естественно в этом случае встает вопрос о целесообразности применения неонатопластики. При оценке влияния неонатопластики следует помнить, что практически все трансплантационные
методики сочетаются с фармакологической защитой трансплантата (Шумаков В. И. и др., 1986). Несмотря на низкую антигенную активность тканей новорожденных животных, в организме взрослого реципиента иммунные процессы на неонатотрансплантат все - таки протекают. В пользу этого говорит частичная резорбция трансплантата. Исходя из этого, можно предположить что сочетание трансплантации с фармакологической защитой трансплантата приведет к повышению лечебного эффекта. Кроме того, степень лечебного воздействия может зависеть от места трансплантации тканей. Подсадку тканей можно проводить во внепеченочное пространство, например в сальник, по аналогии с методикой трансплантации культур клеток поджелудочной железы (Скалецкий Н.Н., 1999). Важное значение имеют и способы получения, время и условия хранения тканей новорожденных. Только после решения всех этих вопросов неонатопластику можно будет рекомендовать для клинической практики.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Настоящее исследование было проведено с целью изучения влияния трансплантации тканей печени новорожденных животных - неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени у крыс. Для этого нами был смоделирован микронодулярный (атрофический) цирроз печени посредством подкожного введения 50 % -ного четыреххлористого углерода.
Через 7 дней после подтверждения цирроза животных 3-ей и 4-ой групп подвергали оперативному вмешательству по следующей методике. Животное наркотизировали эфиром и фиксировали в спинном положении. После обработки операционного поля производили оперативный доступ по белой линии живота. Извлекали каудальную долю печени, из нее иссекали клиновидный краевой участок массой 0,5 - 1,0 г (что составляет примерно 3 - 5 % от массы органа). У животных 3-ей опытной группы - дефект ушивали кетгутом, стягивая между собой края раны. Крысам 4-ой опытной группы в образовавшийся дефект трансплантировали асептически полученную нативную печень однодневных крысят, которую фиксировали сведением краев
раны при ушивании кетгутом. В брюшную полость инъецировали 1-2 мл 1%-го р-ра диоксидина. Брюшину ушивали кетгутом, а кожу черным шелком, накладывая П - образный шов.
Развитие процесса и влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза оценивали по клиническому обследованию животных, гематологическим и биохимическим показателям крови и морфологическим изменениям в печени (всего 27 показателей). Также нами была разработана и апробирована методика визуальной лапароскопической диагностики с помощью отоскопа.
Сопоставляя между собой группы подопытных животных, мы установили, что у животных, повергнутых неонатопластике в сочетании с частичной гепатоэктомией, процессы восстановления основных клинических, гематологических, биохимических и морфологических показателей протекали в более выраженной форме. Положительное влияние неонатопластики объясняется, вероятно, поступлением большого количества факторов, содержащихся в неонатальной печени, оказывающих стимулирующее воздействие на репаративные процессы.
Результаты проведенных нами экспериментов позволяют заключить, что ткани неонатальной печени могут служить стимулятором восстановительных процессов при циррозе печени у взрослых животных. Можно предположить, что при дальнейшем изучении способов получения, времени и условий хранения, техники трансплантации неонатальных тканей в сочетании с фармакологической защитой трансплантата неонатопластику можно будет рекомендовать для клинической практики.
4. ВЫВОДЫ.
1. Экспериментальный цирроз печени у крыс, вызванный курсовым введением четыреххлористого углерода, развивается последовательно через ряд стадий: первая - стадия жирового гепатоза с 3-го по 5-ый месяц затравки; вторая - стадия токсической жировой дистрофии -печени с 4,5 по 6,5 месяц
затравки; третья - стадия токсической жировой дистрофии, переходящей в цирроз 1 стадии; четвертая - стадия токсической жировой дистрофии, переходящей в цирроз 1 стадии с 6-го по 7,5 месяц затравки; пятая - стадия микронодулярного цирроза 1-2 стадии с 7-го по 8-ой месяц затравки.
2. Развитие микронодулярного (атрофического) цирроза печени, вызванного курсовым введением четыреххлористого углерода, характеризуется белковой дистрофией и жировой инфильтрацией паренхимы печени, диссименированным некрозом гепатоцитов с разростом соединительной ткани по периферии долек с постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипортальной зоны к центру.
3. Трансплантация печени новорожденных животных неонатопластика, проведенная с применением неонатотрансплантата в качестве стимулирующего средства, оказывает более выраженный эффект по сравнению с частичной гепатэктомией на репаративные процессы в печени крыс при экспериментальном циррозе.
4. Клинический статус животных с применением неонатопластики характеризовался улучшением общего состояния и приростом живой массы с 444,0 ± 11,8 до 476,5 ± 6,8 граммов, т. е. на 7,3 %, в аналогичной группе, без неонатопластики прирост живой массы составил лишь 0,4 %.
5. Гематологические и биохимические показатели крови крыс при экспериментальной патологии печени под влиянием неонатопластики характеризовались:
а) повышением среднего объема эритроцита на 7,8 %, среднего содержания гемоглобина в одном эритроците на 6,4 %, средней концентрации гемоглобина на 1,4 %, понижением числа лейкоцитов на 50,7 %, тенденцией к нормализации гематокрита, среднего объема, ширины распределения и числа эритроцитов, количества гемоглобина, среднего объема и ширины распределения тромбоцитов;
б) понижением активности аланинаминотрансферазы на 78,1 % и аспартатаминотрансферазы на 194,0 %, активности щелочной фосфатазы в 2,9 раза, абсолютного и относительного количества у - глобулинов на 37,4 % и
26,9 %, повышением абсолютного и относительного количества альбуминов на 26,8 % и 31,9 % соответственно, тенденциями к нормализации уровня общего билирубина, абсолютного и относительного количества ар и а2 -глобулинов.
6. Патоморфологические изменения в печени крыс под влиянием неонатопластики характеризовались частичным восстановлением структуры долек и паренхиматозных клеток печени, при этом трансплантат в течение 30 дней сохранял жизнеспособность в печени реципиента.
7. Визуальная малоинвазивная оценка состояния печени крыс в норме и при экспериментальном циррозе является эффективным, объективным и безопасным методом диагностики и может быть использована в составе комплексного обследования животного в научных исследованиях и в клинической практике.
5 . ПРЕДЛОЖЕНИЯИРЕКОМЕНДАЦИИ.
1. Для клинической практики:
а) метод визуальной малоинвазивной оценки состояния печени и других органов брюшной полости у мелких животных массой до 1 кг применяется в лечебной деятельности ветеринарной клиники ООО «Лада-С» г. Люберцы Московской области;
б) данные по биохимическим, гематологическим, лапароскопическим и морфологическим показателям могут быть использованы как критерии норм в клинической биохимии, гематологии, морфологии при изучении патологии печени животных.
2. Для научных целей. Продолжить более глубокое изучение взаимоотношений трансплантата и органа в зависимости от методики получения, условий хранения, техники трансплантации и дополнительной фармакологической защиты трансплантата.
3. Для учебных целей. Результаты исследований используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических
занятий на кафедре патологической анатомии и физиологии МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина при подготовке специалистов ветеринарного профиля.
Список опубликованных работ:
1. Шилов А.М. Лапароскопическая оценка состояния печени крыс при экспериментальном циррозе. / Материалы международной учебно-методической и научно-практической конференции посвященной 85 - летию академии.// Сб. научн. тр. МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. М.: 2005, - Ч. 2. - С 186-189.
2. Шилов A.M. Влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени крыс. / Материалы международной учебно-методической и научно-практической конференции посвященной 85 -летию академии.// Сб. научн. тр. МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. М.: 2005, -4.2.-С 279-281.
Подп. в печ. 07.02.2005. Формат 60x90/16. Объем 1,5 печ.л. Бумага офисная. Печать цифровая.
Тираж 70 экз. Заказ № 85
ГОУВПО Государственный университет управления Издательский центр ГОУВПО ГУУ
109542, Москва, Рязанский проспект, 99, Учебный корпус, ауд. 106
Тел./факс: (095) 371-95-10, e-mail: ic@guu ru
www.guu.ru
/ ' ч 7 \
и г, h ,
22AnP 2005=.V 1361
Оглавление диссертации
Шилов, Андрей Михайлович :: 2005 :: Москва
1.ВВЕДЕНИЕ
2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Ррранение патологии печени у животных
2.2. Этиология
2.3. Клификация
2.4. Эериментальное моделирование и патогенез
2.5. Диагника
2.5.1. Клиничое оедование животных
2.5.2. Гематологичекое ледование крови
2.5.3. Биохимичие ледованияворотки крови
2.5.4. Ультразвуковая диагника
2.5.5. Лапаропичая (эндопичая) диагника
2.5.6. Пункционная биоя и морфологичое ледование биойного материала
2.6. Регенерация печени и ееимуляция
2.6.1. Современные преавления о регуляции втановительного ра поврежденной паренхимы печени
2.6.2. Некоторые факторы, учвующие в регенерации печени
2.6.3. Методы втановления биорегуляции иимуляции репаративных процов в паренхиме печени при лечении печеночной недаточни
2.6.4. Другие виды применения плодных и неонатальных тканей
Введение диссертации
по теме "Патология, онкология и морфология животных", Шилов, Андрей Михайлович, автореферат
• Актуальность работы. Несмотря на значительное внимание, уделяемое патологии печени в гуманной и в ветеринарной медицине в последние десятилетия, поиск новых методов стимуляции репаративных процессов в печени при различной патологии по-прежнему актуален. И если оперативному стимулированию репарации в гуманной медицине уделяется большое внимание, то в ветеринарной медицине как в отечественных, так и в зарубежных публикациях подобные методы мало описываются. Поэтому восполнить указанный пробел представляется крайне необходимым.
Для лечения различных видов патологии некоторые авторы используют нативные ткани плодов. Данная методика получила название брефопластика (brephos - плод, plastic - формирую) (Беляев B.C., 1988). Так были получены данные о положительном влиянии плодных тканей при циррозе печени, но использование плодных тканей приводит к необходимости воздействия (как минимум терапевтического) на организм матери. Вместе с тем анализ литературы (Скалецкий Н.Н.,1999) показывает, что разница между печенью плодов в завершающий период беременности и печенью новорожденных
• животных незначительна. Поэтому изучение влияния печени новорожденных на патологически измененную печень будет весьма перспективно, так как при положительном эффекте ткани новорожденных животных можно будет получать в достаточно большом количестве без ущерба для здоровья матери, особенно если учесть, что подавляющая часть животных многоплодна. Это приобретает важное значение при внедрении методики в клиническую практику. Применение трансплантации тканей новорожденных животных по нашему мнению будет уместно называть -неонатопластикой (neonatus - новорожденный, plastic - формирую). Следует отметить отсутствие описания подобных исследований в доступной литературе.
Цель работы: Изучить влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени у крыс. Задачи исследования:
1. Разработать и апробировать в эксперименте методику визуальной малоинвазивной оценки состояния печени крыс в норме и при патологии.
2. Разработать и апробировать в эксперименте методику трансплантации печени новорожденных животных — неонатопластику.
3. Исследовать клинические, гематологические и биохимические показатели крови крыс в норме и при экспериментальной патологии печени под влиянием неонатопластики.
4. Исследовать патоморфологические изменения в печени крыс под влиянием неонатопластики.
Положения выносимые на защиту.
1. Методика визуальной малоинвазивной оценки состояния печени крыс в норме и при экспериментальной патологии печени.
2. Гематологические и биохимические показатели крови крыс в норме, при экспериментальной патологии печени и под влиянием неонатопластики.
3. Методика трансплантации печени новорожденных животных -неонатопластика.
Научная новизна. Впервые получены показатели биохимического, гематологического состава крови, пато^рфологических изменений печени у здоровых крыс, при экспериментальной патологии и под влиянием неонатопластики, свидетельствующие о положительном влиянии трансплантации тканей новорожденных на течение экспериментального цирроза печени у крыс. После доработки неонатопластику можно внедрить в клиническую практику, для лечения животных с патологией печени.
Впервые проведена визуальная малоинвазивная оценка состояния печени при моделировании патологии посредством отоскопа фирмы Welch Allyin (США), модели № 20000 у крыс, а также получены факты, позволяющие использовать данную методику как в клинической практике, так и в научных исследованиях.
Научно - практическое значение полученных результатов. Научно-практическая ценность диссертации состоит в том, что полученные данные расширяют и дополняют имеющиеся сведения о закономерностях изменений биохимического, гематологического состава крови и морфологии печени крыс при экспериментальной патологии и под влиянием неонатопластики.
Материалы, полученные в ходе проведения научных исследований используются при проведении учебных занятий по теме «регенерация». Апробация работы:
Метод визуальной малоинвазивной оценки состояния печени и других органов брюшной полости у мелких животных массой до 1 кг применяется в лечебной деятельности ветеринарной клиники ООО «Лада-С» г. Люберцы Московской области.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 2 работы в научных трудах МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Список литературы включает 204 источников, в том числе 52 иностранных источника. Работа иллюстрирована 26 таблицами, 17 графиками, 33 рисунками.
Заключение диссертационного исследования
на тему "Влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени у крыс"
Можно предположить, что при дальнейшем изучении способов получения, времени и условий хранения, техники трансплантации неонатальных тканей в сочетании с фармакологической защитой трансплантата неонатопластику можно будет рекомендовать для клинической практики. 5. ВЫВОДЫ.
1. Экспериментальный цирроз печени развивается у крыс, вызванный курсовым введением четыреххлористого углерода, развивается последовательно через ряд стадий: первая - стадия жирового гепатоза с 3-го по 5-ый месяц затравки; вторая - стадия токсической жировой дистрофии печени с 4,5 по 6,5 месяц затравки; третья - стадия токсической жировой дистрофии, переходящей в цирроз 1 стадии; четвертая - 1-ая стадия цирроза с 6-го по 7,5 месяц затравки; пятая - стадия микронодулярного цирроза 1-2 стадии с 7-го по 8-ой месяц затравки.
2. Развитие микронодулярного (атрофического) цирроза печени, вызванного курсовым введением четыреххлористого углерода, характеризуется белковой дистрофией и жировой инфильтрацией паренхимы печени диссименированным некрозом гепатоцитов с разростом соединительной ткани по периферии долек с постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипортальной зоны к центру.
3. Трансплантация печени новорожденных животных неонатопластика, проведенная с применением неонатотрансплантата в качестве стимулирующего средства оказывает более выраженный эффект по сравнению с частичной гепатэктомией на репаративные процессы в печени крыс при экспериментальном циррозе.
4. Клинический статус животных с применением неонатотрансплантата характеризовалось улучшением состояния и приростом живой массы с 444,0 ± 11,8 до 476,5 ± 6,8 граммов, т. е. на 7,3 %; в аналогичной группе без неонатопластики прирост живой массы составил лишь 0,4 %.
5. Гематологические и биохимические показатели крови крыс в норме и при экспериментальной патологии печени под влиянием неонатопластики характеризовались: а) повышением среднего объема эритроцита на 7,8 %, среднего содержания гемоглобина в одном эритроците на 6,4 %, средней концентрации гемоглобина на 1,4 %, понижением числа лейкоцитов на 50,7 %, тенденцией к нормализации гематокрита, среднего объема, ширины распределения и числа эритроцитов, количества гемоглобина, среднего объема и ширины распределения тромбоцитов; б) понижением активности аланинаминотрансферазы на 78,1 % и аспартатаминотрансферазы на 194,0 %, активности щелочной фосфатазы в 2,9 раза, абсолютного и относительного количества у - глобулинов на 37,4 % и 26,9 %, повышением абсолютного и относительного количества альбуминов на 26,8 % и 31,9 % соответственно, тенденциями к нормализации уровня общего билирубина, абсолютного и относительного количества аг иаг - глобулинов.
6. Патоморфологические изменения в печени крыс под влиянием неонатопластики характеризовались частичным восстановлением структуры долек и паренхиматозных клеток печени, при этом трансплантат в течение 30 дней сохранял жизнеспособность в печени реципиента.
7. Визуальная малоинвазивная оценка состояния печени крыс в норме и при экспериментальном циррозе является эффективным, объективным и безопасным методом диагностики и может быть использована в составе комплексного обследования животного в научных исследованиях и в клинической практике.
6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ.
1. Для клинической практики: а) метод визуальной малоинвазивной оценки состояния печени и других органов брюшной полости у мелких животных массой до 1 кг применяется в лечебной деятельности ветеринарной клиники ООО «Лада-С» г. Люберцы Московской области; б) данные по биохимическим, гематологическим, лапароскопическим и морфологическим показателям могут быть использованы как критерии норм в клинической биохимии, гематологии, морфологии при изучении патологии печени животных.
2. Для научных целей. Продолжить более глубокое изучение взаимоотношений трансплантата и органа в зависимости от методики получения, условий хранения, техники трансплантации и дополнительной фармакологической защиты трансплантата.
3. Для учебных целей. Результаты исследований используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на кафедре патологической анатомии и физиологии МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина при подготовке специалистов ветеринарного профиля.
пользу этого говорит частичная резорбция трансплантата. Исходя из этого, можно предположить что сочетание трансплантации с фармакологической защитой трансплантата приведет к повышению лечебного эффекта. Кроме того, степень лечебного воздействия может зависеть от места трансплантации тканей. Подсадку тканей можно проводить во внепеченочное пространство, например в сальник, по аналогии с методикой трансплантации культур р - клеток поджелудочной железы (Скалецкий Н.Н., 1999). Важное значение имеют и способы получения, время и условия хранения тканей новорожденных. Только после решения всех этих вопросов неонатопластику можно будет рекомендовать для клинической практики. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Настоящее исследование было проведено с целью изучения влияния трансплантации тканей печени новорожденных животных - неонатопластики на течение экспериментального цирроза печени у крыс. Для этого нами был смоделирован микронодулярный (атрофический) цирроз печени посредством о подкожного введения 50 % -ного четыреххлористого углерода. о*—1 г ^
Через 7 дней после подтверждения цирроза животных 3-ей и 4-ой групп подвергали оперативному вмешательству по следующей методике.
Животное наркотизировали эфиром и фиксировали в спинном положении.
После обработки операционного поля производили оперативный доступ по белой линии живота. Извлекали каудальную долю печени, из нее иссекали клиновидный краевой участок массой 0,5 - 1,0 г (что составляет примерно 3
5 % от массы органа). У животных 3-ей опытной группы - дефект ушивали
128 кетгутом, стягивая между собой края раны. Крысам 4-ой опытной группы в образовавшийся дефект трансплантировали ассептически полученную нативную печень однодневных крысят, которую фиксировали сведением краев раны при ушивании кетгутом. В брюшную полость иньецировали 1-2 мл 1%-го р-ра диоксидина. Брюшину ушивали кетгутом, а кожу черным шелком, накладывая П - образный шов.
Развитие процесса и влияние неонатопластики на течение экспериментального цирроза оценивали по клиническому обследованию животных, гематологическим и биохимическим показателям крови и морфологическим изменениям в печени (всего 27 показателей). Также нами была разработана и апробирована методика визуальной лапароскопической диагностики с помощью отоскопа.
Сопоставляя между собой группы подопытных животных, мы установили, что у животных, повергнутых неонатопластике в сочетании с частичной гепатоэктомией, процессы восстановления основных клинических, гематологических, биохимических и морфологических показателей протекали в более выраженной форме. Положительное влияние неонатопластики объясняется, вероятно, поступлением большого количества факторов, содержащихся в неонатальной печени, оказывающих стимулирующее воздействие на репаративные процессы.
Результаты проведенных нами экспериментов позволяют заключить, что ткани неонатальной печени могут служить стимулятором восстановительных процессов при циррозе печени у взрослых животных.
Медицинские Диссертации http://medical-diss.com/veterinariya/vliyanie-neonatoplastiki-na-techenie-eksperimentalnogo-tsirroza-pecheni-u-krys#ixzz2nC7mqdRY
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
Изобретение относится к медицине, в частности к методам моделирования заболеваний печени, и может найти широкое применение при моделировании цирроза печени.
Моделирование заболеваний печени - достаточно сложная задача, во-первых, из-за многообразия ее функций, имеющих жизненно важное значение для организма, во-вторых, из-за особенностей ее васкуляризации, представленной двумя самостоятельными системами - воротной вены и печеночной артерии.
Известен способ моделирования цирроза печени длительным введением малых доз гепатотропных ядов, например ССl4.
При введении биологическим объектам два раза в неделю по 3-5 мл раствора ССl4 цирроз развивается через шесть месяцев.
Для ускорения получения модели цирроза введение гепатотропных ядов сочетают с дополнительной инъекцией бактерий или перевязкой или сужением общего желчного протока.
Процесс формирования цирроза печени начинается через 1,5-2 месяца от начала эксперимента, а спустя 3-4 месяца патологический процесс выражен достаточно отчетливо (см. кн. С.А. Шалимова и др. "Руководство по экспериментальной хирургии", М.: Медицина, 1989г., стр. 186-187).
Однако данные способы имеют существенные недостатки - трудность при моделировании цирроза печени и длительность эксперимента.
Учитывая данные недостатки на практике чаще воспроизводят один из ведущих синдромов цирроза печени - портальную гипертензию, что требует меньше времени и усилий.
Различают портальную гипертензию, возникающую при внепеченочном блоке воротной вены, внутрипеченочном блоке и затруднении оттока по печеночным венам (см. там же стр. 187-188).
Внепеченочный блок, развивающийся при нарушении проходимости основного ствола воротной вены, моделируют, сужая его лигатурой, накладываемой непосредственно у ворот печени, сочетая наложение лигатуры с введением в окружающую клетчатку веществ, вызывающих воспаление, накладывая различные спирали, манжеты и т.д.
Дистрофические повреждения печеночных клеток отмечаются через 3-4 недели. Но при сужении просвета воротной вены более чем на 40-50% возникает прогрессирующая печеночная недостаточность, и животные гибнут спустя 1-2 месяца.
Портальную гипертензию, вызванную внутрипеченочным блоком, воспроизвести труднее всего. Наиболее реальный путь - селективная катетеризация внутрипеченочных разветвлений воротной вены и их эмболизация микросферами.
Однако воспроизводимость патологического процесса в данном случае тоже невелика и составляет 50-55%.
Портальную гипертензию, возникающую из-за нарушения оттока по печеночным венам, моделируют тремя способами:
1) сужением полой вены проксимальнее спадения печеночных вен под диафрагмой или сразу же над ней лигатурой и т.п.; 2) обтурацией устьев печеночных вен полой трубкой, препятствующей оттоку крови от печени или надувного баллончика; полной или частичной окклюзией печеночных вен спиралями типа Тиантурко.
Однако все перечисленные способы трудоемки, длительны и к тому же созданные модели не отвечают полностью реальным условиям клиники.
Известен способ хирургического моделирования цирроза печени, выбранный в качестве ближайшего аналога, предусматривающий частичную резекцию хвостовой, правой латеральной, квадратной долей и сосковидного (папиллярного) отростка, осуществляемую с предварительным наложением лигатур (швов с помощью шелковой нити) на соответствующие сосудистые ножки, позволяющие полностью перекрыть питание этих долей, и затем наложение (временное) сосудистых зажимов на ножки левой и правой медиальной и левой латериальной долей печени на уровне ее ворот в течение не более 60 мин (см. Transplantation, 1998 г. 65, 1433-1436 "A new end simpl technigue...") Yadar SS. Gao W).
Для предотвращения закупоривания брыжейки известный способ предусматривает ее шунтирование.
Продолжительность пережатия сосудистых ножек нерезецированных долей печени, превышающая 60 мин, заканчивалась в большинстве случаев гибелью объекта.
Как видно данный способ хирургического моделирования ишемии печени с последующим возникновением в печени циррозоподобных изменений хирургически сложен, достаточно длителен и также не отвечает полностью реальным условиям клиники, т.е. недостаточно эффективен.
Таким образом, техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является упрощение способа моделирования цирроза печени, обеспечение его большей доступности и повышение его эффективности.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе хирургического моделирования цирроза печени, предусматривающем одновременное пережатие сосудистых ножек долей печени, согласно изобретению количество одновременно переживаемых сосудистых ножек долей печени составляет по меньшей мере четыре.
При этом время, в течение которого осуществляют пережатие сосудистых ножек долей печени, составляет не более 40 мин.
Заявителем экспериментально установлено, что именно одновременное пережатие по меньшей мере четырех сосудистых ножек долей печени способствует достижению поставленных перед изобретением технических задач.
Именно пережатие одновременно по меньшей мере четырех сосудистых ножек и именно в течение не более чем 40 мин обеспечивает формирование примерно через 1,5 месяца циррозоподобных изменений в печени, причем полностью удовлетворяющим требованиям эксперимента, исключает гибель экспериментальных животных.
Данный способ значительно проще, чем все известные ранее хирургические способы моделирования цирроза печени, поскольку исключает дополнительные хирургические манипуляции, которые не только более сложны, но и иногда более губительны для животного.
Способ дает стабильные результаты при всех заявляемых количествах пережимаемых ножек, что немаловажно в экспериментальной хирургии.
При этом легко моделируется именно цирроз тех долей печени, сосудистые ножки которых пережимаются.
Таким образом, заявляемый способ достаточно прост и более эффективен в отличие от всех известных способов.
Совокупность существенных признаков заявляемого объекта "способ" имеет отличия от ближайшего аналога и не следует явным образом из изученного уровня техники, что свидетельствует о его соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".
Заявляемый способ может найти широкое применение в экспериментальной хирургии, что свидетельствует о его соответствии критерию "промышленная применимость".
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве биологических объектов использовались крысы весом 100-300 г. Наркоз осуществлялся интраперитонеальным введением 1 мл 0,25%-ного калипсола на 100 г веса животного.
Биологический объект (крыса) укладывался на операционный стол в положении на спине, передние и задние конечности фиксировались растяжками к специальным державкам. Операционное поле обрабатывалось 70%-ным спиртом.
По белой линии живота проводилось послойное рассечение ножницами кожи и мышц, длина разреза 2,5-3 см.
На марлевую салфетку, смоченную 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осторожно извлекались по очереди доли печени, при этом визуализировались их сосудистые ножки (пучки), которые пережимались сосудистыми зажимами в течение не более 40 мин. О нарушении нормального кровотока свидетельствовало резкое побледнение поверхностей долей в первые минуты, а затем их багрово-синюшный цвет.
По истечении указанного времени зажимы снимали, доли печени осторожно укладывали в брюшную полость, рану послойно ушивали.
Животные после операции содержались в виварии в течение 45 дней, после чего некоторых животных забивали. Вскрытие показало, что в прооперированных долях всех вскрытых животных сформировались циррозоподобные изменения.
Пример 1. Биологический объект весом 200 г. Наркоз - 0,25% калипсол. Объект фиксируется на операционном столе. Операционное поле обрабатывается 70%-ным раствором спирта.
Делают послойный разрез 3 см по белой линии живота. Извлекают сначала левую латеральную долю. Визуализированную сосудистую ножку (пучок) левой латеральной доли пережимают сосудистым зажимом. Затем извлекают левую медиальную долю и пережимают сосудистым зажимом ее сосудистую ножку. Затем извлекают правую медиальную долю и, наконец, правую латеральную доли и также пережимают их сосудистые ножки (пучки) сосудистыми зажимами.
О нарушении портального кровотока свидетельствует резкое побледнение поверхностей долей в первые минуты после пережатия, а затем их багрово-синюшный цвет.
Время пережатия сосудистых ножек (пучков) 40 мин. По истечении указанного времени зажимы снимают, доли печени осторожно укладывают в брюшную полость, рану послойно ушивают.
Животное выведенно из эксперимента на 14-е сутки.
Ткань печени фиксируется 10%-ным нейтральным формалином, после стандартной гистологической проводки из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы, которые окрашивают гематоксилином-эозином. Микроскопия осуществлялась с применением увеличения 400х.
На фиг. 1 четкость балочного строения ткани печени нарушена за счет набухания цитоплазмы гепатоцитов. Отмечается выраженная дистрофия гепатоцитов, пролиферация фибробластов.
На фиг. 2 по ходу портальных трактов определяется очаговая инфильтрация макрофагами, лимфоцитами и нейтрофильными лейкоцитами с тенденцией к распространению инфильтратов в периферические отделы долек.
Пример 2. Биологический объект весом 190 г. В отличие от примера 1 в данном примере пережимали сосудистые ножки (пучки) левой латеральной доли, левой медиальной доли, правой латеральной доли, хвостатой доли, правой латеральной доли. Время удержания сосудистых зажимов на сосудистых ножках (пучках) 39 мин. Животное выведено из эксперимента на 45 сутки после проведения операции.
Ткань печени фиксирована 10%-ным нейтральным формалином, после стандартной гистологической проводки из парафиновых блоков изготавливают гистологические срезы, которые окрашивают гематоксилином-эозином, микроскопия осуществлялась с применением увеличения 200х.
Фиг. 3. От портальных трактов в паренхиму печеночной ткани отходят соединительно-тканные прослойки различной толщины и формы вплоть до кольцевидной. Эти прослойки соединяют между собой по два-три портальных тракта или портальные тракты с центральными венами. Гепатоциты имеют различную форму, встречаются двуядерные клетки, выражен полиморфизм ядер: от мелких гиперхромных до крупных просветленных. Диффузная тяжелая гидропическая дистрофия и мелкие рассеянные очаги некробиозов гепатоцитов.
Пример 3. Биологический объект весом 240 г.
Операция осуществлена полностью, как описано в примере 1.
Животное выведено из эксперимента на 45 сутки после проведения операции. Ткань печени фиксирована 10%-ным нейтральным формалином, после стандартной гистологической проводки из парафиновых блоков изготовлены гистологические срезы, которые окрашены гематоксилином-эозином, микроскопия осуществлялась с применением увеличения 400х.
Прослойки соединительной ткани отграничивают в ткани печени ложные дольки. Ложные дольки построены из фрагментов одной дольки и лишены портальных трактов и центральных вен. Признаки диффузной тяжелой гидропической дистрофии и мелкие рассеяные очаги некробиозов гепатоцитов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ хирургического моделирования цирроза печени, предусматривающий одновременное пережатие сосудистых ножек долей печени, отличающийся тем, что количество одновременно пережимаемых сосудистых ножек долей печени составляет по меньшей мере четыре, а время, в течение которого осуществляют пережатие, составляет не более 40 мин.
(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА У КРЫС
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной гепатологии, и может быть использовано для моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс. Для этого в течение 6 месяцев ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели. Предложенная модель проста в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода у экспериментальных животных и комплексностью формирования дисметаболических нарушений в печени и организме в целом, характерных для данного заболевания. 3 н.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной гепатологии, и может быть использовано для изучения механизмов формирования, прогрессирования и терапии заболеваний печени неинфекционного генеза.
Экспериментальные модели жировой болезни печени широко используются для изучения механизмов формирования, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в становлении патологических процессов, дают возможность подробно изучить патогенез и изыскать средства для рационального терапевтического вмешательства и профилактики.
Изучение патогенетических и саногенетических аспектов заболеваний печени обычно проводится с использованием экспериментальных моделей, сопровождающихся глубокими структурными изменениями ткани органа, сходными с таковыми нарушениями у человека, но формирующимися за более короткий период времени. Однако в каждой из известных моделей гепатита, цирроза печени, жирового гепатоза и др. заболеваний печени за основу берется токсический фактор инициации повреждения печени [5-7].
Известен способ создания модели гепатита и цирроза печени у млекопитающих, включающий помещение животного в клетку с открытым резервуаром, наполненным 70%-ным раствором формалина. В этих условиях лабораторных животных содержат в течение 5-7 месяцев [5]. К недостаткам данного способа можно отнести длительный период моделирования и побочные эффекты токсических доз формалина на дыхательную и сердечно-сосудистую системы, способствующие летальному исходу экспериментальных животных.
Известен способ моделирования токсической гепатопатии путем введения химических веществ лабораторному животному, согласно которому однократно в желудок вводят 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 150 мг на 100 г массы тела [6].
Известен способ моделирования цирроза печени путем введения химических веществ лабораторному животному, согласно которому в желудок вводят два раза в неделю в течение месяца 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ный раствор этанола вместо воды для питья [7].
Перечисленные выше способы моделирования токсической гепатопатии, жировой дистрофии и цирроза печени способствуют быстрому органическому поражению печени.
Однако недостатком этих способов является то, что способы имеют сугубо специфические триггерные механизмы развития заболеваний печени, которые отличаются от реальных причин, способствующих патогенезу печени у людей.
У людей же основными инициаторами неинфекционных заболеваний печени являются неправильное питание и злоупотребление алкоголем. Следовательно, существуют трудности в экстрополяции экспериментальных данных по изучению механизмов развития патологии печени на человека. В связи с этим для изучения механизмов формирования заболеваний печени, разработки новых подходов в профилактики и лечения с применением современных достижений науки и техники исследователям требуются экспериментальные модели, наиболее приближенные к реальным клиническим условиям.
Проведенные патентные исследования и анализ научной медицинской литературы показал, что конкретных рекомендаций по моделированию неалкогольного стеатогепатита (НАСТ) и цирроза печени, характерных для реальных условий развития данных заболеваний у людей, не существует.
Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ формирования алиментарной гиперлипидемии гиперхолестериновым рационом по J. Fan. Согласно этому способу экспериментальных крыс содержат в течение 12 недель на гиперхолестериновом рационе. В результате у крыс происходит отложение избытка жира в печени и формируется стеатоз [11]. К недостаткам данного способа можно отнести низкую вероятность развития глубоких структурных повреждений печени, способствующих формированию стеатогепатита и фиброза.
Учитывая возможность развития жировой болезни печени при несбалансированном гиперкалорийном питании, представляет интерес разработка способа моделирования неалкогольного стетогепатита путем воздействия на экспериментальных животных гиперкалорийным гепатогенным рационом.
Задача изобретения состоит в том, чтобы создать более простой способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс с повышенной воспроизводимостью и высоким приближением к клиническому течению заболевания печени, воздействуя на животных алиментарными патогенетическими факторами, способствующими формированию метаболической дисфункции и структурной реорганизации печени, наиболее точно отражающей патогенетические механизмы развития заболеваний печени у людей, с минимальной смертностью животных.
Для этого в способе моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс, путем скармливания экспериментальным животным гепатопатогенного корма, согласно изобретению в течение 6 месяцев ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела.
При этом по истечении 30 суток от начала вскармливания у животных диагностируется сформировавшийся стеатоз печени, по истечении 90 суток диагностируют явно выраженный стеатогепатит, а по истечении 180 суток от начала вскармливания определяют сформировавшийся фиброз печени.
Общими с прототипом признаками являются следующие:
- скармливание экспериментальным животным гепатопатогенного корма (гиперхолестериновый рацион).
Отличительными признаками являются следующие:
- в течение 6 месяцев ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела.
При использовании изобретения увеличивается холестериновая суточная нагрузка (до 10% от общего состава рациона), оказывается дополнительное воздействие животным жиром в виде топленого говяжьего сала (до 20% от общего состава рациона), увеличивается срок воздействия алиментарной гиперкалорийной нагрузки, отмечается стабильная прибавка в весе у крыс в течение всего периода эксперимента. Помимо структурной реорганизации печени предложенный способ моделирования НАСГ сопровождается многими метаболическими нарушениями (дислипидемия, гипергликемия, окислительный стресс), являющимися основополагающими патогенетическими факторами, индуцирующими заболевания печени. За 90-180 суток формируется стеатогепатит, переходящий в фиброз печени. Изобретение дает возможность изучения стадийности формирования неалкогольной жировой болезни печени.
Проведенные патентные исследования и анализ научной медицинской информации, отражающие методологию создания экспериментальных моделей жировой болезни печени с сопутствующими метаболическими нарушениями, не выявили технологий моделирования НАСГ на экспериментальных животных, содержащих всю совокупность существенных признаков заявленного изобретения. Таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна». Заявляемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине и биологии согласно своему назначению, и на этом основании оно соответствует критерию «промышленная применимость».
Сделать вывод о том, что заявляемое изобретение для специалиста явным образом не следует из уровня техники, позволяет тот факт, что до настоящего времени проблемы профилактики, лечения и механизма развития заболеваний печени неинфекционного генеза окончательно не решены. Предложенное решение не является простой модификацией известных способов, оно дает неожиданно высокий результат и 100%-ную воспроизводимость у подопытных животных. Предлагаемый способ моделирования НАСГ не сложен в техническом воспроизведении и создает условия для проведения совершенно оригинальных и имеющих огромное практическое значение для медицины и биологии работ по выяснению патогенетических механизмов формирования жировой болезни печени и причин, способствующих запуску процессов фиброгенеза и развития цирроза. Изобретение дает возможность проследить все стадии развития этого заболевания, вплоть до цирроза печени. На этом основании можно заключить, что заявляемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
На чертеже представлено гистологическое строение ткани печени крыс в зависимости от длительности гепатогенной нагрузки:
а - контрольная группа;
гистологический срез окрашен гематоксилином и эозином. ×400.
б - опытная группа 1 (30 суток гепатогенной нагрузки);
гистологический срез окрашен гематоксилином и эозином. ×400.
в - опытная группа 2 (90 суток гепатогенной нагрузки);
гистологический срез окрашен гематоксилином и эозином. ×400.
г - опытна группа 3 (180 суток гепатогенной нагрузки);
гистологический срез окрашен пикрофуксином по Ван-Гизону. ×400.
Для создания модели неалкогольного стеатогепатита использовались белые крысы линии Вистар, выведенные в питомнике РАМН «Столбовая». Для воспроизведения экспериментальной модели использованы половозрелые особи мужского пола, средней массой 180,5±10,6 г. При разработке модели отрабатывалось воспроизведение нескольких аналогичных экспериментальных состояний, все варианты модификаций воспроизводимых моделей анализировались на основании гистологических исследований ткани печени. Отобраны были те модели, при воспроизведении которых достигались стойкие структурные нарушения печени, сопровождающиеся жировой инфильтрацией, образованием некроза печени, при отсутствии смертности экспериментальных животных.
Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита осуществляют следующим образом. Животные в течение 180 суток (6 месяцев) находятся на специальной гиперкалорийной гепатогенной диете, насыщенной животными жирами (табл.1).
Таблица 1
Суточный рацион крыс (г/100г массы животного)
Ингредиенты Экспериментальный рацион Общевиварный рацион
Говяжье сало 4,25 0,5
Холестерин 0,43 -
Подсолнечное масло 0,5 0,5
Смесь зерновая 5 5
Хлеб пшеничный (сухари) 2 20
Крупа овсяная 1,3 1,3
Мясо говяжье второй категории 2 2
Творог обезжиренный 0,8 0,8
Морковь 3,3 3,3
Зелень 3,3 3,3
Дрожжи пивные 0,05 0,05
Соль поваренная 0,1 0,1
В диету включен холестерин (10% от общего состава рациона), как один из факторов, активизирующих липидные нарушения, процессы жировой инфильтрации печени, структурную дезинтеграцию гепатоцитов. Среди патогететически ориентированных факторов базовой являлась жировая нагрузка топленым говяжьим салом (20% от общего состава рациона), увеличивающим общий калораж рациона гепатогенной диеты. То есть в модели неалкогольного стеатогепатита инициируются механизмы, характеризующиеся ожирением, дислипидемией, стеатозом печени.
Для обоснования заявленного изобретения в лаборатории биомедицинских исследований НИИ Медицинской климатологии и восстановительного лечения (г.Владивосток) были проведены экспериментальные работы на крысах линии Вистар.
Для исследования выделялось 4 группы крыс:
контрольная группа - интактные крысы, содержащиеся на стандартном рационе вивария (10 голов);
опытная группа 1 - крысы, содержащиеся на экспериментальном гиперкалорийном рационе в течение 30 суток (10 голов);
опытная группа 2 - крысы, содержащиеся на экспериментальном гиперкалорийном рационе в течение 90 суток (10 голов);
опытная группа 3 - крысы, содержащиеся на экспериментальном гиперкалорийном рационе в течение 180 суток (10 голов).
Животные ежедневно осматривались, учитывалась поедаемость корма. За время опыта не было случаев падежа и заболеваний животных. Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609 EEC [10]. Оценивались биометрические показатели: вес крысы, индекс Кетле, относительная и абсолютная масса печени, висцерального жира. Состояние системы «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» (ПОЛ-АОЗ) характеризовали по интегральному показателю антиоксидантной активности (АОА) в плазме крови, содержанию глутатиона, активности ферментов глутатионового звена (глутатионредуктаза - ГР, глутатионпероксидаза - ГП) в печени и каталазы в крови, количеству образовавшихся продуктов липопероксидации в крови и печени (гидроперекиси липидов (ГЛ), диеновые коньюгаты (ДК), малоновый диальдегид (МДА). Уровень липидов, глюкозы и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови исследовали с помощью биохимического анализатора FP-901 (Финляндия) с помощью наборов фирмы «Ольвекс» (Россия). Определяли уровень общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП), результаты выражали в ммоль/л. Холестерин липопротеидов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) определяли расчетным методом по формулам Фридвальда. Индекс атерогенности (ИА) рассчитывали по формуле ОХС-ХС ЛПВП/ХС ЛПВП [3]. Для проведения гистологического исследования ткани печени небольшие фрагменты центральной части правой доли органа фиксировались в 10%-ном растворе нейтрального формалина, приготовленного на 0,07М фосфатном буфере (рН=6,98). Обезвоживание тканей проводили в этиловом спирте возрастающей концентрации и заливали в парапласт. Далее с помощью микротома (МЗП-01 «ТЕХНОМ») готовили срезы исследуемых органов толщиной 7 мкм. Для гистологических исследований срезы тканей печени окрашивали гематоксилин-эозином по Романовскому, пикрофуксином по Ван-Гизону на выявление коллагеновых волокон [8]. Препараты исследовали при помощи микроскопа фирмы «Carl Zeiss» (Германия) (ув. об.×10, ×40 и ×90).
Данные, полученные в результате исследований, приведены в графических и табличных материалах.
Весоростовые параметры крыс с ДЛП представлены в таблице 2. У всех крыс опытных групп по сравнению с интактной группой выявлено увеличение массы тела, индекса Кетле, двукратное повышение относительной и абсолютной массы висцеральной жировой ткани и печени.
Таблица 2
Весоростовые параметры крыс при моделировании НАСГ, М±m
Показатели Контрольная группа, n=10 Сроки воздействия экспериментальным рационом
30 дней (опытная 1), n=10 90 дней (опытная 2),
n=10 180 дней (опытная 3),
n=10
Вес крысы до эксперимента, г 168,0±4,1 174±5,6 178,5±8,5 180±28
Вес крысы после окончания эксперимента, г 250,0±8,9 324,5±8,7*** 361,4±12,2* 471,2±67,9**
Прирост массы тела, г 82±4,2 151,5±11,3*** 182,8±6,1*** 280,2±65,7***
Рост крысы, см 19,4±0,1 20,1±0,5 20,8±0,2 26,3±0,3*
Индекс Кетле, у.е. 6,7±0,2 8,0±0,1** 8,3±0,2** 8,4±1,2**
Абсолютная масса печени, г 8,16±0,23 16,75±0,64*** 16,2±1,0*** 27,9±4,1***
Относительная масса печени, % 3,2±0,05 5,1±0,02*** 4,5±0,6* 5,9±0,8**
Абсолютная масса висцерального жира, г 5,91±0,68 15,71±0,96*** 13,2±0,2*** 12,5±3,4***
Относительная масса висцерального жира, % 2,3±0,01 4,8±0,1*** 2,8±0,1** 2,6±0,6***
Примечание здесь и далее: (*) - статистическая значимость различий относительно контрольной группы: * - р<0,05; ** - р<0,01; ***-p<0,001.
Изучение показателей липидного обмена показало, что у крыс под влиянием гепатогенного рациона на 30-е сутки формировалась алиментарная дислипидемия, проявляющаяся повышением уровня ОХС, ТГ, ХС ЛПОНП в сыворотке крови (табл.3). При этом ХС ЛПВП снижался более чем в 2 раза, а индекс атерогенности увеличился на порядок (р<0,001). Через 90 суток алиментарной нагрузки концентрация ОХС в крови выровнялась с таковым показателем у контрольных крыс, уровни ТГ и ХС ЛПОНП достоверно снизились более чем в 2 раза. Воздействие гиперкалорийного рациона в течение 180 суток вызывало прогрессирование гиперлипидемии. По сравнению с показателями контрольной группы отмечено достоверное повышение ОХС в крови и индекса атерогенности. Полученные результаты характеризуют динамику нарушений липидного обмена на всех этапах эксперимента. Обнаруженные при этом низкие значения ХС ЛПОНП у крыс 2-й и 3-й опытных групп являются одним из критериев метаболических нарушений в печени и развития стеатогепатита. Формирование НАСГ сопровождалось развитием гипергликимии, доказательством чего явилось повышение уровня глюкозы в крови во всех опытных группах крыс.
Таблица 3
Биохимические показатели крови крыс при моделировании НАСГ, М±m
Показатели, ммоль/л Контрольная группа,
n=10 Сроки воздействия экспериментальным рационом
30 дней (опытная 1), n=10 90 дней (опытная 2),
n=10 180 дней (опытная 3),
n=10
ОХС 1,57±0,04 3,34±0,04*** 1,68±0,08 2,04±0,17*
ТГ 1,12±0,04 1,95±0,06*** 0,51±0,05*** 1,17±0,08
ХС ЛПВП 0,67±0,04 0,26±0,02*** 0,50±0,08 0,5±0,15
ХСЛПНП 0,7±0,16 0,84±0,196 0,96±0,12 0,9±0,06
ХС ЛПОНП 0,65±0,19 1,14±0,29* 0,23±0,02** 0,20±0,03***
ИА, у.е. 1,43±0,15 11,87±1,55*** 2,46±0,35 7,4±0,8***
Глюкоза, ммоль/л 5,4±0,1 8,7±0,2*** 7,2±0,1*** 12,0±0,3***
АЛТ 52,2±3,5 108,9±3,5*** 42,4±1,1* 172±12***
ACT 118,6±6,1 243,1±9,1*** 130,8±14,4 165,6±2,5***
ЛДГ 936±133 1799,1±176,8** 730±92 1285±56,1***
АСТ/АЛТ, у.е. 2,26±0,10 2,23±0,09 3,08±0,09* 0,96±0,07***
Морфофункциональное состояние печени крыс опытных групп оценивали по активности в сыворотке крови ферментов - АЛТ, ACT, ЛДГ (табл.3). У животных, содержавшихся на экспериментальном рационе, наблюдалось повышение активности ферментов печени (р<0,001), что свидетельствовало о повреждении целостности клеток печени, развитию цитолитического синдрома. Интерпретация выявленных изменений говорит о формировании заболеваний печени [1, 2]. Причем снижение соотношения АСТ/АЛТ (коэффициент де Ритиса) на 180 день эксперимента свидетельствует о хроническом течении патологического процесса.
Таблица 4
Показатели системы ПОЛ-АОЗ в крови и печени крыс при моделировании НАСГ
Показатели Контрольная группа, n=10 Сроки воздействия экспериментальным рационом
30 дней (опытная 1),
n=10 90 дней (опытная 2),
n=10 180 дней (опытная 3), n=10
В крови
АОА, % 22,7±0,6 24,64±2,2 40,8±2,02*** 21,6±3,6
МДА, нмоль/г.Hb 4,6±0,3 5,31±0,31* 8,12±0,2** 9,1±0,2***
ГПЛ, у.е. 0,66±0,07 0,19±0,04*** 0,81±0,12 1,27±0,24*
Каталаза, % 86,5±1,1 44,3±1,4*** 80,8±2,2 44,66±9,76*
В печени
ДК, нмоль/мг липидов 1,07±0,17 9,34±0,23** 1,14±0,13 0,63±0,07***
ГПЛ, ед.опт.пл./г ткани 0,4±0,05 0,97±0,05 0,31±0,03*** 0,88±0,02***
МДА, нмоль/мг белка 2,07±0,06 4,66±0,15** 4,67±0,09** 6,22±0,90***
ГЛ, мкг/мг белка 8,03±0,12 4,96±0,11** 4,5±0,17** 3,1±0,17***
ГР, нмоль НАДФН/мин/мг белка 1,64±0,10 1,12±0,04** 1,55±0,11 1,01±0,04***
ГП, нмоль ГЛ /мин/мг белка 0,91±0,02 0,75±0,09 0,12±0,01*** 0,14±0,01***
Формирование модели НАСГ сопровождалось развитием окислительного стресса в клеточных и тканевых субстратах, как одного из главного этиопатогенетического фактора индуцирующего заболевания печени [1, 9]. Установлено накопление малонового диальдегида в крови и печени в опытных группах крыс (табл.4). На последней стадии формирования НАСГ, когда в печени выявлялись участки с фиброзом, отмечалось двукратное повышение уровня гидроперекисей липидов в крови и печени. При этом активность антиоксидантных ферментов снижалась на порядок. Отмечалось падение активности ГР в 3 раза (р<0,001), ГП в 4,4 раза. Обуславливающим фактором дезактивации этих ферментов стало снижение содержания восстановленного глутатиона в печени крыс опытной группы 4, уровень которого был в 2 раза (р<0,01) ниже, чем у контрольной группы животных. Выявленные изменения характеризуют развитие окислительного стресса в организме животных на всех этапах развития НАСГ.
Динамику формирования метаболических нарушений и гистологическое строение ткани печени оценивали на 30-е, 90-е и 180-е сутки воздействия на крыс экспериментальным рационом. Доказательством развития модели неалкогольного стеатогепатита у животных служило исследование гистологических срезов ткани печени, окрашенных гематоксилин-эозином по Романовскому и пикрофуксином по Ван-Гизону на выявление коллагена.
Через 30 дней от начала воздействия на животных гиперкалорийным гепатогенным рационом анализ гистологических препаратов ткани печени у крыс выявил стеатоз печени (фиг.1-б). В подтверждение чего явилось нарушение балочной структуры печеночных долек, гипертрофия гепатоцитов, мелкокапельная и крупнокапельная жировая инфильтрация, сужение просветов синусоидных капилляров.
Через 90 суток у крыс, находящихся на экспериментальном рационе, в печени развивался стеатогепатит, характеризующийся фокальными участками некроза с лимфомакрофагальными элементами, жировой дистрофией гепатоцитов. Видны участки со смешанным типом стеатоза и некротизированными гепатоцитами (фиг.1-в).
На 180 сутки воздействия на крыс гепатогенным рационом гистоструктура печени подверглась значительным изменениям, выразившимся в увеличении площади некротизированных участков (10-15% от общей площади исследуемых участков печени), окруженных лимфомакрофагальным инфильтратом, нарушении балочного строения долек печени (фиг.1-г). Гепатоциты не образовывали трабекул, располагались беспорядочно, синусоиды не прослеживались. Было отмечено расширение крупных портальных трактов за счет разрастания стромы и заполнения ее воспалительным инфильтратом. Некоторые портальные тракты были с некротическими изменениями сосудов. Стенки таких сосудов слабо различались, в некоторых случаях были нарушены. Выявлялась деструкция желчных протоков, сопровождаемая большими очагами воспалительного инфильтрата. На препаратах, окрашенных по Ван-Гизону, в препортальной зоне четко обнаруживались коллагеновые волокна, что является прямым доказательством сформировавшегося фиброза печени.
Таким образом, удалось получить модель неалкогольного стеатогепатита, характеризующуюся ожирением, нарушением структурной организации, некрозом ткани, формированием фиброза печени. Разработанная модель неалкогольного стеатогепатита позволяет также изучать стадийность развития жировой болезни печени, характеризующейся формированием 3-х стадий - стеатоза, стеатогепатита и фиброза. Развитие модели НАСГ учитывает большинство клинически значимых факторов повреждения печени, наиболее часто встречающиеся в патогенезе НАСГ.
Известно, что алиментарный фактор является одним из главных этиопатогенетических индукторов формирования дисметаболических нарушений в печени, триггерным механизмом развития стеатоза печени и неалкогольного стеатогепатита [1, 2, 4, 9]. По данным литературы формирование цирроза печени из НАСГ наблюдается у 7-16% взрослых пациентов, в 60-80% случаев цирроз печени явился результатом наличия у человека патогенетических факторов прогрессирования НАСГ: гиперлипидемии, избыточной массы тела, инсулинорезистентности [4]. Нарушение липидного обмена, отложение избыточного количества легкоокисляемого жира в печени активируют процессы перекисного окисления липидов, усугубляют структурно-функциональную дезорганизацию печени, становятся независимыми патогенетическими звеньями в общей цепочке механизмов формирования заболеваний гепатобилиарной системы [1, 2, 9]. Продукты липопероксидации способны повреждать мембраны гепатоцитов, активировать звездчатые клетки печени с развитием воспаления и фиброза. Гиперактивация процессов пероксидации липидов сопровождается значительным изменением состава и степени окисленности мембранных фосфолипидов, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности клеточных мембран, функционирования рецепторного аппарата, снижению толерантоности к глюкозе, развитию гипергликемии, гиперферментемии. В предложенном способе моделирования НАСГ были инициированы основные патогенетические триггерные механизмы, запускающие процессы фиброгенеза. Таким образом, полученные данные свидетельствует об идентичности экспериментально вызванных патогенетических изменений предложенной модели НАСГ описанным в литературе механизмам.
Результаты исследования свидетельствуют о несомненной экономической привлекательности использования данной модели. В первую очередь модель НАСГ может позиционироваться в области хронических экспериментов для оценки степени нарушения функционального состояния гепатобилиарной системы и поиска эффективных фармакотерапевтических гепатопротекторных средств, т.к. у животных структурные нарушения в печени и жировая инфильтрация сохраняются в течение 5-ти месяцев. Кроме этого создание модели проводится при отсутствии смертности животных, а также используется наиболее доступный биологический вид - крысы, что является важным и соответствует поставленной цели. Создание такой модели делает возможным проведение экспериментов, постановка которых в клинике является практически неосуществимой. Новая модель НАСГ может быть использована для проведения поиска и испытания действия вновь синтезированных или полученных из естественных источников гепатопротекторных препаратов.
Таким образом, проведенные исследования позволили получить новую экспериментальную модель неалкогольного стеатогепатита, в основе которой лежит комплексное сочетание патологических факторов, инициирующих каскад повреждений в печени, приводящих к развитию стойких морфофункциональных нарушений органа. Предложенная модель проста в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода экспериментальных животных.
Техническим результатом изобретения является повышение воспроизводимости, упрощение способа и приближение к клиническому течению данной патологии печени.
Предлагаемый способ моделирования позволяет в большей мере приблизиться к клиническому течению патологического процесса в печени.
Предлагаемым способом моделирования воспроизводится надежная модель стеатогепатита, что подтвержено морфологическим анализом печени, гистохимическими и биохимическими показателями. Кроме того, способ обеспечивает возможность изучения развития стеатогепатита в динамике.
Список литературы
1. Буеверова Е.Л., Драпкина О.М., Ивашкин В.Т. Атерогенная дислипидемия и печень // Рос.мед. вести. 2008. 1:17-23.
2. Григорьев П.Я. Жировой гепатоз (жировая инфильтрация печени): диагностика, лечение и профилактика // Рус.мед. журн. 2002. 1:30-31.
3. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов, липопротеидов и его нарушения. СПб.: Питер Ком, 1999. 512.
4. Лазебник Л.Б., Зеленогородская Л.А., Морозов И.А. и др. Клинико-морфологические изменения печени при атерогенной дислипидемии и при лечении статинами // Терапевт. арх. 2003. 5:8-12.
5. Пат. Ru 94026117. Способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих. Бояринов Г.А., Смирнов В.П., Кауров Я.В. и др., опубл. 27.08.1996.
6. Пат. Ru 2188457. Способ моделирования токсической гепатопатии. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Волкова Е.С. и др., опубл. 27.08.2002.
7. Пат. Ru 2197018. Способ моделирования цирроза печени. Мышкин В.А., Ибатуллина Р.Б., Савлуков А.И. и др., опубл.20.01.2003.
8. Пирс Э. Гистохимия. М.: Изд-во иностр.литературы, 1962. 967.
9. Chitturi S., Farrell G.C. Etiopathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis // Semin. Liver. Dis. 2001. 21: 27-41.
10. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for exsperimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe, 1986:51.
11. Fan J. Effect of low-calorie diet on steatohepatitis in rats with obesity and hyperlipidemia // World J. of Gastroenterology. 2003. 9(9): 2045-2049.
Формула изобретения
1. Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс путем скармливания экспериментальным животным гепатопатогенного корма, отличающийся тем, что в течение 6 месяцев ежесуточно с кормом животным вводят 4,25 г топленого говяжьего сала и 0,43 г порошкового холестерина из расчета на 100 г массы тела.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что по истечении 30 суток от начала вскармливания определяют сформировавшуюся модель стеатоза печени.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что по истечении 90 суток от начала вскармливания определяют сформировавшуюся модель стеатогепатита.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что по истечении 180 суток от начала вскармливания определяют сформировавшуюся модель фиброза печени.