Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
Поліщук Олена Іванівна
УДК 616.9:616.34 –.86: 579.842
МІКРОБНА ЕКОСИСТЕМА КИШЕЧНИКА ДІТЕЙ, НОВІ ПІДХОДИ
ДО ЇЇ ОЦІНКИ ТА КОРЕКЦІЇ В СУЧАСНИХ УМОВАХ
03. 00. 07 –мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук
Київ - 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України
Науковий консультант: доктор медичних наук, старший науковий співробітник
Сельнікова Ольга Петрівна,
Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В.Громашевського АМН України, директор
Офіційні опоненти :
доктор біологічних наук, професор Руденко Ада Вікторівна, завідувач лабораторією мікробіології, вірусології та мікології Інституту урології та нефрології АМН України;
доктор медичних наук, професор Кременчуцький Генадій Миколайович, завідувач кафедрою мікробіології, вірусології і імунології Дніпропетровської державної медичної академії;
доктор медичних наук Журило Олександр Анатолійович, завідувач лабораторією мікробіології туберкульозу та неспецифічних захворювань легень Інституту фтизіатрії та пульмонології АМН України.
Провідна установа:
Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра мікробіології та епідеміології
Захист відбудеться " 7 " вересня 2001 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 Національного медичного університету імені О.О.Богомольця за адресою: 03057, м.Київ - 57, пр. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус Національного медичного університету, аудиторія №2.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного Університету імені О.О.Богомольця за адресою: 03057, м.Київ - 57, вул. Зоологічна, 3.
Автореферат розісланий " 7 " серпня 2001 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук, професор О.П.Яворовський
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. В сучасний період комплекс індигенної мікрофлори і її взаємовідносини з організмом хазяїна визначено як екосистему, а стан мікробіоценозу кишечника поряд з імунологічною реактивністю організму - як важливі показники гомеостазу (В.І.Покровський, І.В.Рубцов, 1994; C.Tancerede, 1992; M.J.Hill і співавт.,1990; S.L.Gorbach, 1999). В нашій країні традиційним залишається підхід до визначення порушень складу нормальної мікрофлори кишечника (дисбактеріозу) як клінічного діагнозу (А.І.Парфьонов і співавт.,1998; О.Я.Бабак, І.Є.Кушнір, 1999; Л.І.Ільєнко, 2000). Заперечення подібної практики спонукають деяких дослідників до перегляду патогенетичних аспектів проблеми дисбактеріозів і їх реальних позицій в сучасній медицині (А.В.Чебуркін, 1999; А.Н.Маянский, 2000; О.І.Поліщук, 2000). Потребують подальшого визначення екологічні, клінічні та ятрогенні ситуації, які сприяють порушенню мікрофлори.
Особливо актуальні такі дослідження для новонароджених, у яких процеси природньої колонізації тісно пов'язані з проблемою розвитку госпітальних інфекцій (І.А.Бочков, Н.М.Овчарова, 1991; О.П.Сельнікова, 1992; R.Ducluzean, 1993). Для поліпшення формування мікрофлори новонароджених, попередження їх колонізації госпітальними штамами застосовується спрямована колонізація різними пробіотичними препаратами (Л.І.Чернишова, 1989; R.Bennet і співавт.,1992; M.A.Hall, S.L.Smith,1994), але єдина точка зору щодо їх ефективності відсутня, що і потребує подальшого вивчення. Чисельні дані свідчать про порушення складу мікрофлори кишок при різноманітних захворюваннях дітей (І.Б.Куваєва, К.С.Ладодо, 1991; С.Г.Макарова і співавт., 1997; В.А.Новокшонова і співавт.,1990), однак, трактовка ролі виявлених змін неоднозначна: дисбактеріоз трактується і як першопричина захворювань, і як їх наслідок. Недостатньо з'ясовано зв'язок між хворобами органів дихання, мікробіологічними та імунологічними показниками гомеостазу (Ю.Г.Антипкін і співавт.,1997; І.І.Долгушин і співавт.,1998). Вимагають обгрунтування загальні підходи до використання зростаючої кількості пробіотичних препаратів та продуктів, а також визначення ефективності дії кожного з них (В.В.Смірнов і співавт., 1993; О.А.Журило,1998; Г.М.Кременчуцький і співавт.,1994; R.Fuller, 1994). Особливого значення для населення України набула проблема вивчення впливу на організм радіоактивного забруднення, однак, лише поодинокі роботи присвячені дослідженню впливу інкорпорованих радіонуклідів на стан мікрофлори кишок дітей (В.Д.Отт і співавт.,1997; К.О.Іванов, 1998), а експериментальні доробки взагалі відсутні. Вище наведене надає актуальності проблемі вивчення взаємодії макроорганізму і його нормальної мікрофлори з позицій оцінки патогенетичного зв'язку мікроекологічних порушень з різними патологічними станами дітей та пошуку методів корекції таких порушень. Цим визначається актуальність, мета і завдання даної роботи.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Результати досліджень (1986-1999 років) здійснених за програмами МОЗ України, Державного комітету з науки та техніки ввійшли до тем: "Изучение факторов и механизмов патогенетического действия условно-патогенных энтеробактерий, усовершенствование методов иммунодиагностики, профилактики и антибиотикотерапии вызываемых ими заболеваний " № держреєстрації 0186.005.6928; "Усовершенствование и разработка методов комплексной диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых условно-патогенными энтеробактериями у детей раннего возраста, включая новорожденных " № держреєстрації 01.89.0009733; "Разработать систему мониторинга за ведущими возбудителями внутрибольничных инфекций, методы экспресс-диагностики, специфической профилактики и изыскать новые эффективные дезинфекционные средства для предупреждения возникновения и распространения внутрибольничных инфекций, в первую очередь, через медицинский инструментарий " № держреєстрації UАО1001889Р; "Вивчити розповсюдження різних типів дисбактеріозів і особливостей їх формування у новонароджених і дітей молодшого віку в умовах підвищеного радіаційного фону , запропонувати удосконалені методи і препарати для корекції" № держреєстрації 193V036091; "Створення національної колекції живих культур мікроорганізмів , збудників інфекційних захворювань та музею культур мікробів-антагоністів як основи для розробки еубіотичних лікувально-профілактичних препаратів" № держреєстрації 0194V017361; "Розробити систему діагностики гнійно-септичних інфекцій та прогнозування внутрішньолікарняних інфекцій серед новонароджених і дітей раннього віку" № держреєстрації 0195U011844; "Визначити сучасні тенденції зміни бактерій-збудників гнійно-септичних інфекцій перинатального періоду та розробити комплекс лікувально-профілактичних заходів щодо внутрішньолікарняних інфекцій" № держреєстрації 0198V000768. Фрагменти планованих НДР виконані пошукувачем як виконавцем та відповідальним виконавцем вищеназваних наукових тем.
Мета роботи: На основі вивчення закономірностей формування та стану мікробіоценозів у здорових та хворих дітей різних вікових груп оцінити прогностичне та діагностичне значення порушень кишкової мікрофлори та науково обгрунтувати схеми застосування біологічних препаратів в сучасних умовах.
Завдання дослідження:
1. Визначити стан та закономірності формування кишкових мікробіоценозів новонароджених в сучасний період.
2. Дослідити особливості та надати мікробіологічну характеристику існуючим формам перебування матері і дитини в пологовопомічних закладах.
3. Здійснити мікробіологічне обгрунтування сучасного підходу до грудного вигодовування немовлят.
4. Вивчити біологічні властивості, зокрема антибіотикостійкість, штамів ентеробактерій, які входять до складу кишкових мікробіоценозів.
5. Охарактеризувати стан кишкової мікрофлори у здорових та з обтяженим клінічним анамнезом дітей та оцінити ефективність її корекції біологічними препаратами.
. Порівняти антагоністичні властивості пробіотичних препаратів та визначити схеми їх застосування в клінічній практиці.
. Дослідити в експериментальних умовах вплив довгострокового орального введення радіонуклідів на стан кишкових мікробіоценозів тварин.
Об`єкт дослідження : мікробна екосистема кишечника дітей, сучасні умови проживання, біологічні препарати.
Предмет дослідження : новонароджені, здорові та хворі діти різних вікових груп, штами мікроорганізмів, імунна система, експериментальні тварини, пробіотичні препарати.
Методи дослідження: мікробіологічні –для вивчення мікрофлори кишечника та інших біотопів у дітей різних вікових груп, породіль, об'єктів довкілля стаціонарів, для ідентифікації та вивчення біологічних властивостей виділених штамів мікроорганізмів, для встановлення антагоністичної активності бактерій з пробіотичними властивостями та препаратів на їх основі;
імунологічні –для оцінки стану неспецифічних та специфічних факторів імунітету у обстежених дітей;
експериментальні –для вивчення дії радіонуклідів на організм експериментальних тварин, зокрема на стан їх мікробіоценозів;
епідеміологічні –для оцінки захворюваності новонароджених на гнійно-септичні інфекції;
статистичні –для встановлення достовірності отриманих даних, вірогідності зв'язків між окремими показниками, явищами.
Наукова новизна одержаних результатів Робота відноситься до прикладної мікробіології. В роботі вперше було проведено розширене довготривале порівняльне дослідження кишкової мікрофлори у новонароджених та дітей інших вікових груп з використанням єдиного методичного підходу і критеріїв оцінки.
Одержано нові дані про закономірності формування кишкових мікробіоценозів у новонароджених в різні часові періоди та в залежності від форми перебування матері і дитини в акушерському стаціонарі. Доведено, що навіть тимчасове відокремлення дитини від матері після пологів призводить до формування кишкових мікробіоценозів, які за своїми показниками наближаються до таких за умов роздільного перебування. Найбільш оптимальний перебіг раннього неонатального періоду за мікробіологічними та клінічними показниками мають діти, які знаходяться постійно разом з матір'ю. Сформульовано підхід до оцінки формування мікробіоценозів кишок новонароджених, як чутливого показника епідемічного неблагополуччя в акушерських стаціонарах і складової частини мікробіологічного моніторингу в цих закладах.
Показано, на прикладі облігатних та домінуючих у колонізації видів ентеробактерій, що нормальна кишкова мікрофлора новонароджених є резервуаром детермінант антибіотикостійкості.
Отримано мікробіологічне обгрунтування доцільності широкого застосування в Україні грудного вигодовування за принципами, рекомендованими ВООЗ.
Розроблено схеми використання в пологовопомічних закладах пробіотиків в залежності від епідемічної ситуації в стаціонарі, зосновані на доборі певного препарату в разі спалаху гнійно-септичних інфекцій або при довготривалій циркуляції мікроорганізмів певного виду з ознаками госпітального штаму.
Визначено підхід до оцінки мікрофлори кишечника у дітей різних вікових груп не як до діагностичного критерію для конкретної особи, а як до показника порушення гомеостазу під впливом певних екзо - та ендогенних чинників. Виявлено кореляційний зв'язок між показниками облігатної мікрофлори, які формують колонізаційну резистентність, та показниками неспецифічної імунологічної реактивності.
Вперше показано взаємозамінюючий вплив пробіотичних продуктів і біорегуляторів –адаптогенів на поліпшення кишкової мікрофлори і стан імунітету, як показників гомеостазу макроорганізму.
Вперше в експериментальних умовах встановлено, що довготривале надходження Cs137 в організм тварин впливає на кишкову мікрофлору, найбільш виражені зміни в складі мікробіоценозів визначені після 6 місяців отримання радіонуклідів.
У дітей, які постійно проживають на радіаційно контрольованих територіях, встановлено значні порушення в кількісному та якісному складі кишкових мікробіоценозів і зниження показників фагоцитозу та показана можливість їх корекції пробіотичними продуктами.
Практичне значення одержаних результатів
Введення в пологоводопоміжних закладах постійного мікробіологічного моніторингу, обов'язковими компонентами якого є контроль за становленням мікробіоценозів новонароджених, за епідемічнозначимими об'єктами довкілля, за антибіотикочутливістю штамів мікроорганізмів, що циркулюють в стаціонарі. Дані положення знайшли відображення при розробці Програми клініко-мікробіологічного моніторингу за внутрішньолікарняними інфекціями в акушерських і неонатологічних стаціонарах. Програму розроблено в рамках наукової тематики, вона готова до практичного впровадження.
Для попередження розвитку гнійно-септичних інфекцій і поліпшення перебігу у дітей раннього неонатального періоду запропоновано застосовувати в акушерському стаціонарі тільки форму істинного сумісного перебування матері і дитини.
Ліквідувати практику використання методу розгорнутого бактеріологічного дослідження кишкової мікрофлори з діагностичною метою для конкретної дитини без клінічних проявів кишкових захворювань. Дослідження кишкових мікробіоценозів мають проводитись для мікробіологічної оцінки гомеостазу у одноманітних груп дітей із певною патологією і визначенням необхідності корекції кишкової мікрофлори.
Обгрунтовано покази до включення препаратів на основі пробіотичних мікроорганізмів або біорегуляторів - адаптогенів в комплексні лікувально- профілактичні схеми для дітей з гострими та хронічним захворюваннями дихальних органів та у осіб, які постійно проживають на радіаційно контрольованих територіях.
Впровадження в практику Одержані дані знайшли застосування при виданні методичних рекомендацій - "Эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика бактериальных инфекций у новорожденных", Київ, 1987, МОЗ УРСР; "Методичних рекомендацій щодо санітарно-протиепідемічних заходів в родопомічних закладах", які увійшли до Наказу МОЗ України від 05.01.96 р. № 4; проекту "Інструкції з організації та проведення епідеміологічного нагляду, протиепідемічних заходів при гнійно-септичних інфекціях новонароджених, породіль та роділь", яка знаходиться на етапі затвердження в МОЗ України; інформаційних листів - "Комплексные методы типирования клебсиелл и протеев для оценки и прогнозирования эпидситуации в стационарах", Київ, 1989; "Про поліпшення виходжування новонароджених дітей в акушерських стаціонарах" Київ, 1999 р.
Особистий внесок здобувача Всі результати теоретичних, мікробіологічних, імунологічних, епідеміологічних та експериментальних досліджень отримані особисто автором. Клінічні обстеження дітей здійснені автором спільно із співробітниками кафедр неонатології (зав.кафедрою д.м.н. Є.Є. Шунько) та дитячих інфекційних хвороб та імунології КМАПО ім. П.Л.Шупика (зав.кафедрою д.м.н., проф. Л.І. Чернишова). Імунологічні дослідження, присвячені дослідженню показників специфічного та неспецифічного імунітету здійснені автором спільно із співробітниками лабораторії імунології Інституту педіатрії, акушерства та гінекології ім. П.М.Буйко АМН України (зав. лабораторією д.м.н., проф.В.П.Чернишов). Штами мікроорганізмів та харчові добавки з пробіотичними властивостями отримані нами від к.б.н. Н.Ф.Кігель –зав. лабораторією біотехнології ТІММ УААН. Мікробіологічні дослідження тварин автор здійснював в рамках експерименту, проведеного спільно із співробітниками Інституту експериментальної радіології НЦРМ АМН України та НДІ нейрохірургії ім.А.П.Ромоданова АМН України*.
*Автор висловлює щиру подяку вищеназваним співробітникам за надану консультативну та практичну допомогу при виконанні фрагментів роботи.
Узагальнення та аналіз отриманих результатів, всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор самостійно написав 6 робіт у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України. В іншіх 16 статтях частка автора в загальному об'ємі проведених робіт складала від 60 до 80 %.
Апробація результатів дисертації Результати досліджень були представлені доповідями та стендовими повідомленнями на І Установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства, 1993 р., Міжнародній науковій конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження І.І.Мєчнікова і 100-річчю з дня народження В.М.Жаботинського, 1995 р., Всеросійській науково-практичній конференції до 100-річчя створення МНДІЕМ ім. Г.Н.Габричевського, 1996 р., ХІІІ з'їзді Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім.Д.К.Заболотного, 1996 р., Українських семінарах-нарадах з актуальних проблем епідеміології, діагностики та профілактики інфекційних хвороб, 1997 р. та 2000 р., 22-му Міжнародному Конгресі з мікробної екології та хворобам, 1997 р., 11-й конференції Асоціації дитячих лікарів України "Лікувально-профілактичне харчування та пробіотики в педіатрії", 1998 р., науково-практичних конференціях для педіатрів, акушерів-гінекологів та неонатологів в м.Києві та м.Тернополі, 1999 р., Науково-практичній конференції "Перинатальні інфекції –сучасний погляд на проблему", 1999 р.
Публікації По матеріалах дисертації опубліковано 49 наукових праць, з яких 22 статті в наукових фахових виданнях, визначених ВАК України, двоє методичних рекомендацій, два інформаційні листки.
Обсяг і структура дисертації Роботу викладено на 245 стор. основного тексту, ілюстровано таблицями 53 і рисунками 29. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Бібліографія складається з 514 джерел, серед яких 264 україно- та російськомовних і 250 іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. З метою реалізації поставлених у роботі завдань нами в період 1987-1999 рр. було обстежено 814 дітей. З них 493 становили новонароджені, обстежені при проведенні мікробіологічного моніторингу в акушерських стаціонарах м. Києва (табл.1). В процесі виконання роботи також обстежено 321 дитину, дані про яких представлено в табл. 2.
Об'єкти досліджень: штами мікроорганізмів (більше 3500) різних таксономічних груп, виділені при бактеріологічному дослідженні біологічного матеріалу від дітей і їх матерів, предметів довкілля в акушерських стаціонарах. Матеріалом від обстежуваних осіб були меконій та фекалії, грудне молоко, слиз передніх відділів носу та зіву. Штами молочнокислих бактерій –клінічні ізоляти та культури промислового значення та промисловоперспективні, одержані з колекції ТІММ ААН України з метою їх апробації в якості антагоністів. Досліджено in vitro 34 штами, представлені видами Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophilus, окремі композиції на їх основі, 8 офіцинальних пробіотичних препаратів та 4 пробіотичні харчові продукти розроблені ТІММ ААНУ. Препарат з групи біорегуляторів-адаптогенів "Екстракт ехінацеї пурпурової рідкий", який призначався дітям в дозі з розрахунку 1 крапля на рік життя 2 рази на день протягом 14 днів.
Таблиця 1
Об'єкти та об'єми динамічних бактеріологічних досліджень
в акушерських стаціонарах м. Києва
Об'єкти обстежень Часовий період Кількість обстежень Кількість бактеріологічних досліджень
Аналізи Первинні висіви
Новонароджені діти здорові -1994 рр. 1997-1999 рр. 113 295 3540
Новонароджені діти груп ризику -1991 рр.
Породіллі -1994 рр. 1997-1999 рр. 101 101 505
Предмети довкілля акушерських стаціонарів -1993 рр. 1998-1999 рр. 134 134 804
Всього :
Експериментальні тварини: 66 безпорідних статевозрілих білих щурів - самців масою 200-250 г. Карантин періоду акліматизації, утримання тварин під час експерименту, мікроклімат, температура, вологість, світловий режим, об'єм повітря, тип клітин відповідали загальноприйнятим нормативам утримання тварин відповідно до "Європейської конвенції по захисту хребтових тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях" (Страсбург, 18.03.86), Наказом МОЗ УРСР №32 від 22.02.1988р.
Методи мікробіологічних досліджень. Мікрофлору кишкових випорожнень досліджували за методикою згідно до методичних рекомендацій "Лабораторная диагностика дисбактериозов" (В.О.Знаменський і співавт., 1986). Питомий вміст кожної групи мікроорганізмів виражали кількістю колонієутворюючих одиниць (КУО) в 1г фекалій з розрахунком lg (M±m). В процесі виконання роботи, враховуючи 2-3-х і більше кратність обстеження дітей, проведено 2270 аналізів, здійснено більше 25000 первинних бактеріологічних висівів. Ідентифікацію мікроорганізмів здійснювали за їх ферментативними властивостями на класичних диференційно-діагностичних середовищах та за допомогою комерційних діагностичних систем. При проведенні ідентифікації виділених мікроорганізмів дотримувались класифікації Бергі (1986).
Мікрофлору грудного молока матерів досліджували відповідно до "Методических рекомендаций по бактериологическому контролю грудного молока" (1984). При оцінці масивності мікробного обсімінення проб материнського молока орієнтувалися на критерії, рекомендовані ВООЗ щодо донорського грудного молока (1989,1991).
Таблиця 2
Контингенти обстежених дітей та об'єми бактеріологічних досліджень
Група дітей Вік Місце проживання Кількість осіб Кількість обстежень
Аналізи Первинні висіви
Здорові діти (контрольні групи) -5 міс. 2-6 років 3-6 років М. Киів м. Київ м.Кицмань Чернівецької обл. 10 15 10 15 120 180
Всього :
Хворі на гостру пневмонію -12 міс. м. Київ
Часто- та довго-хворіючі діти -14 років м. Київ
Всього :
Постійні мешканці радіаційно контрольованих територій -11 років Полісський, Макарівський райони Київської обл., Овруцький район Житомирської обл.
Разом :
Експериментальні дослідження. Мікробіологічні дослідження тварин здійснювали в рамках експерименту, проведеного Інститутом експериментальної радіології НЦРМ АМН України та НДІ нейрохірургії ім.А.П.Ромоданова АМН України (Ю.П.Зозуля, Н.А.Атаманюк, В.А.Барабай та співавт., 1998). Для внутрішнього опромінення експериментальних тварин використовували ізотоп Cs137, який вводили з їжею з розрахунку 600 Бк на 1 тварину щодобово протягом одного, шести та дев`яти місяців. Поглинута доза за 1 місяць склала 0,3 сГр, за 6 місяців - 2,1 сГр, за 9 місяців - 3,0 сГр. В дослідній групі, що отримувала радіонукліди протягом 1 місяця експерименту було 10 тварин, 6 місяців - 11 тварин, 9 місяців - 10 тварин. Контролем були 30 інтактних щурів-самців відповідного віку та маси: 10 тварин до початку експерименту, по 5 тварин, які отримували Cs137 протягом одного та дев`яти місяців і 10 тварин - шість місяців. Окрему групу контролю склали 5 тварин, які протягом дев`яти місяців отримували препарат стабільного цезію. У всіх тварин досліджували мікрофлору вмісту товстої кишки з визначенням кількості анаеробних та аеробних мікроорганізмів за Л.Г.Зайцевою і співавт. (1991).
Визначення біологічних властивостей мікроорганізмів. Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків вивчали на середовищі АГВ методом дифузії з використанням комерційних дисків, контролюючи якість середовища та дисків за допомогою еталонних штамів мікроорганізмів - Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 відповідно до рекомендацій ВООЗ (1984). Штами залежно від розміру зон затримки росту культури згідно вимог National Committee of Clinical Laboratiry Standart (NCCLS) відносили до чутливих (S), помірностійких (I) або стійких (резистентних - R) (1994).
Визначення екзогенної антикомплементарної активності здійснювали у відповідності із схемою, запропонованою О.В.Бухаріним і співавт. (1992), використовуючи чaшечний варіант методу. Антилізоцимну активність мікроорганізмів визначали за методикою О.В.Бухаріна і співавт.(1984), використовуючи концентрації лізоциму 1, 5, 7, 10, 15 мкг/мл і індикаторний штам Micrococcus luteus NCTC 2665.
Вивчення антагоністичної активності мікроорганізмів та композицій пробіотичних продуктів, а також офіцинальних препаратів-пробіотиків в умовах in vitro проводили з використанням стандартних методик. Антагоністичну активність визначали по відношенню до патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів з колекції живих культур лабораторії загальної мікробіології ІЕІХ і до клінічних ізолятів, виділених від обстежених осіб.
Імунологічні методи досліджень застосовували при обстеженні дітей. Вивчення популяцій та субпопуляцій лімфоцитів проводили методом двокольорової проточної цитометрії на апараті FACScan (Becton Dickinson,США) з використанням панелі моноклональних антитіл: ОКТ-3 (CD3), Ortho, Anti-Leu 2а (CD8), 3а (CD4), 11 (CD16), 12 (CD19).
Функціональну активність нейтрофилів периферичної крові визначали в реації відновлення нитросинього тетразолію - НСТ-тесті за B.H.Park (1971) в мікромодифікації С.М.Гордієнко (1983) з використанням капілярної крові. Оцінку результатів проводили з урахуванням ступеню активності реакції напівкількісним методом за М.Г.Шубичем, В.Г.Мєдніковим (1978). Для визначення резервних можливостей фагоцитарної системи крові реакцію ставили в двох варіантах - спонтанний і стимульований ліпополісахаридом НСТ-тест з подальшим розрахунком показника фагоцитарного резерву за методикою Є.І Шмельова і співавт. (1979). Кількісний вміст імуноглобулінів класів G, A, M, SigA та С3 компоненту комплементу в сироватці крові, слині проводили методом радіальної імунодифузії за G.Manchini і співавт. (1965) з використанням відповідних антисироваток. Вміст лізоциму в слині визначали також методом радіальної імунодифузії в гелі з використанням сухого порошку культури Micrococcus lysodeiticus за методикою, запропонованою Н.С.Мотавкіною і співавт. (1979).
Методи статистичної обробки результатів Всі отримані кількісні результати досліджень підлягали статистичній обробці методами варіаційної і кореляційної статистики (Ю.И.Иванов, О.Н.Погорелюк, 1990; Г.Ф.Лакин, 1990). Математичні розрахунки, статистичний і кореляційний аналізи також проводились з використанням програми "Statgraphics", яка призначена для обробки результатів медико-біологічних досліджень, та WHONET, призначеної для обробки результатів з антибіотикостійкості мікроорганізмів. Застосовували ПК типу IBM (PENTIUM-II) при використанні програмних продуктів фірми Microsoft.
Результати власних досліджень
Особливості формування мікробіоценозів кишечника новонароджених в сучасний період. Становлення мікрофлори кишок новонароджених за умов роздільного перебування матері і дитини в пологовому будинку. Довготривале –з 1987 по 1999 рр. вивчення процесів становлення кишкової мікрофлори новонароджених дозволило окреслити принаймі два різні в організаційному плані та за часом періоди. Перший з них припадав на 1987-1993 рр., коли майже всі пологові будинки м. Києва працювали за формою роздільного перебування матері і дитини в стаціонарі. Результати дослідження показали, що колонізація здорових новонароджених розпочинається вже з перших годин життя - на 5-7-му годину в 12,8 % випадках кишечник дітей вже колонізований аеробними грампозитивними і грамнегативними мікроорганізмами. До 4-5-го дня відбувалась інтенсивна колонізація грампозитивною флорою, зокрема стафілококами, а на 6-7-му добу життя в аеробній мікрофлорі за частотою та рівнями виділення з кишечнику дітей домінували грамнегативні бактерії. В цей же період біфідобактерії з оптимальних розведень фекалій 10-7 –-11 висівалися лише у 31,7 % здорових новонароджених. Виявлене уповільнення темпів формування біфідофлори, як мікробний показник, відображало негативні тенденції в адаптації новонароджених в ранньому постнатальному періоді, що підтведжувалось і рівнями функціональних можливостей нейтрофільних фагоцитів. Вміст біфідофлори на рівні lg 5-7 мікробних клітин в 1 г фекалій був пов'язаний із вірогідним збільшенням показнику спонтанного НСТ-тесту до 29,2 ± 2,4 % порівняно з 15,6 ± 1,4 % у дітей з достатнім рівнем біфідобактерій. Це призводило до виснаження функціональних можливостей фагоцитів: функціональний резерв у дітей з достатнім рівнем біфідофлори складав 25,0 ± 2,3, а при її недостатності - 11,8 ± 3,4. Встановлено наявність оберненого зв`язку між рівнем біфідофлори та високими показниками колонізації кишечника умовно патогенними ентеробактеріями. В зазначений період досліджень домінуючими колонізуючими новонароджених бактеріями були представники роду Klebsiella. Вони становили 54,4 % всіх виділених штамів серед грамнегативних умовно патогенних мікроорганізмів. Рівні виділення клебсієл з фекалій новонароджених коливалися в межах від lg3-5 (у 8,8 % дітей) до lg 6-8 КУО в 1 г фекалій (у 91,2 % обстежених). Але сам факт висіву на високому рівні умовно патогенних ентеробактерій з фекалій конкретної здорової новонародженої дитини не був передвісником її захворювання. Для визначення походження штамів ентеробактерій колонізуючих новонароджених, були також обстежені їх матері та об`єкти довкілля. При колонізації 30,4 % дітей клебсієлами, їх виділення від матерів становило лише 12,6 % і було приблизно однаковим з часткою позитивних проб з об`єктів довкілля - 12,1 %. Тобто, частота виділення умовно патогенних ентеробактерій з кишечника новонароджених дітей виявилась найбільш чутливим і інформативним показником зростання рівня циркуляції певних видів мікроорганізмів в пологовопомічному стаціонарі. Зазначені показники формування мікрофлори і циркуляції умовно патогенних мікроорганізмів в пологових будинках визначено в результаті проведення постійного мікробіологічного моніторингу за спеціальною програмою, проект якої розроблено нами, а окремі положення увійшли до "Методичних рекомендацій щодо санітарно-протиепідемічних заходів в родопомічних закладах" Наказу МОЗ України від 05.01.1996 р. за № 4.
Вплив сумісного перебування матері і дитини на процес становлення мікробіоценозів новонароджених та рівень ГСІ. Вибірковий аналіз захворюваності новонароджених на гнійно-септичні інфекції (ГСІ) в чотирьох пологових будинках м.Києва показав, що найбільша кількість захворювань припадала на перші 17 днів після виписки дітей додому в задовільному стані, а пік захворюваності припадав на перші п`ять днів. Це свідчило про тісний зв`язок інфікування дитини з її перебуванням в пологовому будинку. Одним із заходів для поліпшення епідемічної ситуації була організація роботи в пологових будинках України за формою сумісного перебування матері і дитини, з чим і пов`язано другий період в наших дослідженнях в 1994-1999 рр. При аналізі захворюваності новонароджених на гнійно-септичні інфекції протягом трьох років (1996-98 рр.) встановлено, що її рівень у дітей при сумісній формі перебування склав 5,7 %, 5,3 % , 6,2 % , а при роздільній формі - 4,8 %, 5,1 % та 9,6 % відповідно. Отже, зміна співвідношення між показниками в останній рік відбулася не за рахунок очікуваного зменшення захворюваності серед дітей при сумісному перебуванні, а за рахунок її збільшення при роздільному. Для структури захворюваності дітей за умов роздільного перебування характерно зростання рівня "простих" (у 1,4 рази), "малих" (у 2 рази), "поєднаних" (у 6 разів) клінічних форм на тлі стабільно високого рівня "великих". При формі сумісного перебування визначено тенденцію до зростання рівнів "великих" форм та вірогідно пов`язаних з ними омфалітів (r = +0,97, p < 0,01). В спроектованих і перебудованих для децентралізованого перебування матері і дитини пологових будинках м.Києва виявлено організаційну особливість в забезпеченні такої форми, яка полягає в тому, що немовлята не відразу із пологового залу переводяться до палати матері в післяпологове відділення, а перебувають у дитячому відділенні протягом деякого часу (у середньому 8-12 годин), що умовно визначено нами як відстрочене сумісне перебування. Співставлення провели з дітьми, які переводилися безпосередньо з пологового залу в палату разом з матір`ю (істинне сумісне перебування) та з дітьми при роздільному перебуванні. У 113 дітей зазначених груп протягом всього неонатального періоду проводили динамічну оцінку формування кишкових мікробіоценозів. Встановлено, що формування кишкової мікрофлори за рядом бактеріологічних показників відбувалося однаково у немовлят, які перебували окремо від матері, та тих, які були переведені до палати після 8-12 годин відпочинку матері. А при істинному сумісному перебуванні відбувалось найбільш швидке становлення біфідофлори поряд із меншими темпами колонізації умовно патогенними мікроорганізмами або за рівнем (як для коагулазонегативних стафілококів - КНС) або за частотою, як для умовно патогенних ентеробактерій, гемолітичних E.coli, асоціацій мікроорганізмів (табл.3).
На 4-5-ту добу життя у дітей з групи істинного сумісного перебування були найвищі темпи росту біфідобактерій, що корелювало з найменшою колонізацією кишок умовно патогенними мікроорганізмами, анаероби переважали над аеробами у співвідношенні (3-10):1, тобто, складалася найоптимальніша модель колонізаційної резистентності. Відокремлення дитини від матері в перші години життя, як і їх роздільне перебування, було пов`язано з уповільненням темпів становлення біфідофлори, зростанням колонізації коагулазонегативними стафілококами до lg7-8 КУО в г, високою частотою виявлення гемолітичних E.coli, умовно патогенних ентеробактерій та асоціацій мікроорганізмів.
Бактеріологічні обстеження дітей віком 1-1,5 місяці показали, що в цей період відбувається вирівнювання складу кишкових мікробіоценозів у дітей всіх груп: кількісно біфідобактерії переважають над аеробами у співвідношенні 10:1 і досягають рівнів lg9- lg9,5. Частота та рівні виявлення умовно патогенних ентеробактерій майже не відрізнялись між собою, незважаючи на вірогідну різницю в цих показниках на день виписки. У новонароджених, які постійно перебували з матір'ю, умовно патогенні ентеробактерії виділено з фекалій у вигляді монокультур, тоді як іншим групам були притаманні асоціації.
В перепрофільованих пологових будинках істинне сумісне перебування організаційно пов`язано із знаходженям в одній палаті 2-3-х пар мати-дитина, однак і за таких умов це сприяло більш швидкому становленню облігатної мікрофлори у дітей і забезпечувало на день виписки переважання анаеробів над аеробами в складі мікрофлори кишок. Різниця між показниками факультативної флори виявилася менш виразною в порівнянні з іншими групами дітей. Встановлено обернені зв`язки між рівнями біфідобактерій та умовно патогенних ентеробактерій (r =-0,19, p< 0,05), асоціаціями умовно патогенних мікроорганізмів (r =-0,34, p< 0,05). Появі асоціацій також запобігали достатні рівні біфідо- і лактофлори (r = -0,48, p< 0,05), тоді як високі рівні тільки лактобактерій істотно не впливали на колонізацію кишок умовно патогенними ентеробактеріями.
Таблиця 3
Частота та динаміка виділення від новонароджених представників кишкової мікрофлори з урахуванням рівнів висіву
П о к а з н и к Частота виділення (%) по групах новонароджених в залежності від форми перебування
Представник Мікрофлори Рівень висіву lgКУО/г Роздільне Відсрочене Сумісне Істине сумісне
день 4-5 день 1 міс. 2 день -5 день 1 міс. день -5 день міс.
< 7 53,3 6,1 ,9 17,6 3,8 ,0
Біфідобактерії 7 46,6 56,3 ,3 ,6 35,3 26,9 ,7 ,6 ,6
9-11 0 37,6 ,7 ,5 47,1 69,2 ,3 ,4 ,3
< 6 26,7 6,3 ,4 11,8 3,8 ,7 ,2
Лактобактерії 6 ,6 43,8 ,7 ,7 14,7 23,1 ,8 ,9
8 26,7 50,0 ,3 ,9 73,5 73,1 ,5 ,9
Кишкові < 6 13,3 ,3 26,4 15,4
Палички -7 ,0 ,0 ,2 23,6 15,4 ,7 ,4 ,5
8 ,7 ,0 ,5 50,0 69,2 ,3 ,6 ,5
з них гемолітичні форми 26,7 ,3 ,0 ,3 5,9 15,4 0 ,2 ,8
УПЕ < 5 0 ,3
6-8 ,3 ,0 ,0 ,4 44,1 ,8 ,8 ,9
КНС -6 0 ,7 ,9 17,7 7,7 ,3 ,3 ,8
7-8 46,7 ,6 20,6 50 ,7 ,8 ,4
Стрептококи -6 6,6 ,3 ,7 ,6 5,9 0 ,3 ,3 ,9
6,6 ,5 ,3 .3 14,7 7,7 ,3 ,3 ,9
Гриби Р. Candida -7 ,7 ,9
За рядом клінічних показників ранній неонатальний період також найбільш оптимально протікав у немовлят, які знаходилися разом з матір'ю з моменту народження. Ми, однак, не маємо на увазі, що всі мікробіологічні і клінічні показники обов`язково взаємопов`язані. Встановлено кореляційні зв'язки між такими клінічними проявами як кишкові розлади, токсична еритема, шкірні прояви алергічного діатезу, малі форми гнійно-септичних інфекцій та такими мікробіологічними показниками як недостатність біфідофлори, високий рівень колонізації кишечника умовно патогенними ентеробактеріями, їх асоціаціями, загальний вміст умовно патогенних мікроорганізмів.
Моніторинг за формуванням кишкових мікробіоценозів новонароджених. В останні роки (1997-1999 рр.) відбулися певні зміни у формуванні кишкових мікробіоценозів новонароджених, які за формою перебування в пологовому стаціонарі знаходилися в тих же умовах, що й діти, обстежені в більш ранній період. По-перше, до (82,4-93,9) % зросла частка дітей, у яких задовільними темпами йшло формування біфідофлори, по-друге, визначені певні тенденції в процесі колонізації умовно патогенними мікроорганізмами. Так, якщо поєднати частоту виділення умовно патогенних ентеробактерій та стафілококів з кишечника новонароджених, в сумі цей показник складає 71-75 % в усі періоди обстеження. Співвідношення грамнегативних до грампозитивних мікроорганізмів до 1993 року становило приблизно 6:1, а в останні роки змінилося на 1:1 –:5. Тобто, серед колонізуючих кишечник умовно патогенних мікроорганізмів визначено домінування коагулазонегативних стафілококів. В сучасний період виявлено тенденцію до збільшення частоти (13,3 - 20,6 %) та рівнів виділення (lg 6,2-7,3 КУО в 1г) стрептококів. В колонізації новонароджених провідна роль в останні роки належить бактеріям роду Enterobacter, які складають до 23,3 % всіх виділених штамів умовно патогенних мікроорганізмів та 81,5 % штамів ентеробактерій, тоді як їх доля серед позитивних проб з об`єктів довкілля стаціонарів не перевищувала 9,1 %. Таким чином, незалежно від мікроекологічної ситуації в акушерському стаціонарі, оптимальний перебіг неонатального періоду у новонароджених забезпечує організація безперервного сумісного перебування однієї пари мати- дитина в палаті.
Мікробіологічна оцінка впливу материнського молока на формування мікробіоценозів кишок новонароджених дітей здійснена при бактеріологічному обстеженні 101 пари мати-дитина. Лише 11,9 % проб грудного молока не містили аеробної мікрофлори. Серед нестерильних проб - 45,5 % мали погіршені бактеріологічні показники за використаними в роботі критеріями. Середній рівень обсімінення молока в нестерильних пробах склав 4,5ґ103 КУО в 1 мл. Найчастіше, в 75,2 % проб молока виявлено коагулазонегативні стафілококи в кількості 4,4 ґ103 КУО в 1 мл. З однаковою частотою зустрічались S.aureus та E.coli (18,8 % і 17,8 % випадків), а їх середній вміст складав відповідно 1,9 ґ103 та 9,4 ґ102 КУО в 1 мл. Бактерії роду Enterobacter виявлені лише в поодиноких пробах грудного молока в кількості 4,8 ґ102 КУО в 1 мл. Не встановлено кореляційних зв'язків між мікробіологічною харатеристикою молока матерів та колонізацією кишечника і кишковими розладами у їх дітей, тобто бактеріальне обсімінення молока матері, принаймі до певних меж, не може бути протипоказанням до грудного вигодовування новонароджених дітей.
Біологічні властивості окремих представників мікрофлори кишок новонароджених. Вивчення загального рівня чутливості до антибіотиків у штамів E.coli - представників облігатної мікрофлори кишок здорових новонароджених, засвідчило наявність антибіотикостійкості до окремих препаратів навіть за відсутності безпосереднього антибіотикового пресингу. E.coli були стійкими до ампіциліну в (80,0 - 86,7) % випадків, а до тетрацикліну –в (81,2 - 92,3) %. До цефалоспоринових антибіотиків різних поколінь стійкими були від 10,5 до 50,0 % штамів ешерихій. Найбільш активними були представники ІІ і ІІІ поколінь - цефтриаксон, цефтазидим та цефоперазон, які затримували ріст 70-80 і більше відсотків досліджених штамів E.coli. Таку ж активність виявили і аміноглікозидні препарати ІІ і ІІІ поколінь. Біля чверті штамів кишкових паличок виявились стійкими до поліміксину та хлорамфеніколу. Найменшу антибіотикостійкість виявлено до фторхінолонових препаратів - від 5,6 % до 23,1 % штамів. Рівні стійкості виділених штамів E.coli до антибактеріальних препаратів не відрізнялись вірогідно в залежності від умов перебування дітей в акушерському стаціонарі. Виділені в цей же період бактерії роду Enterobacter за рівнями стійкості до окремих антибіотиків достовірно не відрізнялись від кишкових паличок, простежено лише тенденцію щодо меншої кількості чутливих штамів ентеробактерів (р > 0,2). А от множинна стійкість до антибактеріальних препаратів була більш притаманна штамам Enterobacter sp. в порівнянні із штамами E.coli. Аналіз профілю антибіотикорезистентності свідчить, що (73,0 - 90,9) % штамів E.coli були стійкими хоча б до одного антибіотика. Три детермінанти стійкості, тобто множинну стійкість до антибактеріальних препаратів, мали 15,6 % штамів. Однак, сполучення маркерів резистентності, як правило, не дублювалося в межах однієї групи. Серед штамів Enterobacter sp. (33,3 - 90,0) % були стійкими одночасно до трьох і більше антибіотиків. Виявлене розмаїття профілів стійкості штамів Enterobacter sp. до використаних у дослідженнях препаратів свідчило, що колонізація новонароджених цими бактеріями в акушерському стаціонарі за певний період спостереження (1997-1998 рр.) відбувалася штамами, які не мали однотипного профілю антибіотикорезистентності і не циркулювали постійно у лікарні. Порівняли чутливість штамів Enterobacter sp. та Klebsiella sp. , виділеними в період їх домінування в пологових будинках (табл. 4). Вірогідну різницю в чутливості бактерій до ряду антибактеріальних препаратів можна пов`язати з рівнями використання певних антибіотиків в медичній практиці. Аналіз профілю антибіотикорезистентності штамів клебсієл свідчив, що 83,9 % з них несли маркери стійкості до 3-8 препаратів. Незважаючи на те, що в порівнянні із штамами ентеробактерів, виділеними в наступні роки, рівні чутливості клебсієл відрізнялись лише за окремими препаратами, виявлено більшу кількість штамів з однотипними сполученнями детермінант стійкості. Все це, з урахуванням тривалої циркуляції клебсієл в обстежених стаціонарах, їх стійкості до гентаміцину в 24,8 % випадків, свідчило про госпітальне походження біля 80 % виділених штамів клебсієл.
Таблиця 4
Порівняння чутливості до антибіотиків штамів Klebsiella sp. та Enterobacter sp.,
виділених від новонароджених в різні часові періоди
Назва антибіотику Кількість чутливих штамів, (М±m) % Вірогідність
Klebsiella sp. Enterobacter sp.
Ампіцилін 5,4 ±± 2,1 21,2 ±± 7,1 р<0,05
Гентаміцин ,0 ±± 4,7 79,6 ±± 5,5 р<0,05
Тобраміцин ,7 ±± 2,3 67,4 ±± 6,9 р<0,05
Цефазолін ,1 ±± 4,5 ,8 ±± 5,6
Цефотаксим ,4 ±± 1,8 69,6 ±± 6,8 р<0,05
Левоміцетин ,5 ±± 2,0 63,2 ±± 6,4 р<0,05
Поліміксин ,3 ±± 4,7 63,4 ±± 7,5 р<0,05
Тетрациклін ,6 ±± 1,8 ,6 ±± 3,6
Визначення антибіотикостійкості штамів мікроорганізмів, виділених при мікробіологічному моніторингу в акушерських стаціонарах, необхідне для прогнозування появи госпітальних штамів та для вивчення розповсюдження детермінант стійкості серед представників нормальних мікробіоценозів.
Результати вивчення антикомплементарної активності (позитивні лише у 2,3 - 8,2 % штамів досліджених ентеробактерій) і антилізоцимної активності (позитивні більшість штамів - 71,0 %) свідчили про те, що дані показники не можна розглядати, принаймі для обстеженого контингенту, як спеціальні маркери персистенції, а розцінювати їх як біологічні властивості штамів, що здійснюють природню колонізацію новонароджених.
Частота і варіанти порушень складу мікробіоценозів кишечника у дітей здорових та з обтяженим клінічним анамнезом. Оцінка стану мікрофлори кишок у клінічно здорових дітей. При обстеженні здорових дітей віком до 1 року та 2-6 років встановлено, що тільки у п`ятої частини дітей (20,7 %) склад мікрофлори кишок відповідав застосованим в нашій роботі критеріям норми. У решти дітей виявлено порушення за 1-4 показниками, які стосувались факультативної аеробної мікрофлори, причому в значній кількості виділено такі "агресивні" грамнегативні умовно патогенні мікроорганізми як протеї та синьогнійні палички, гемолізуючі ешерихії, а також гриби роду Candida. Однак, ретельні динамічні обстеження цих дітей дозволили віднести їх до практично здорових. Отже, вбачалась істотна розбіжність між діагнозом "дисбіоз" в клінічному та мікробіологічному сенсах. Визначальною в підтриманні певної для кожної дитини моделі колонізаційної резистентності була достатність облігатної анаеробної мікрофлори (у 93,1-100 % дітей рівні біфідобактерій lg 9,0-9,1 ± 0,4 в 1 г). Тоді як виділення різноманітної і на досить високому рівні факультативної аеробної флори не пов`язано з клінічними порушеннями, тому визначення цих мікробіологічних показників для кожної конкретної дитини не мало діагностичного значення і не потребувало корекції.
Бактеріологічна характеристика мікрофлори кишечника у немовлят при пневмонії.
Дослідження стану мікробіоценозів кишок у дітей різних вікових груп із захворюваннями органів дихання проводили в зв'язку з тим, що ця патологія надзвичайно актуальна в педіатрії, і при цьому відсутній безпосередній вплив патологічного процесу на кишечник. Встановлено, що 82,2 % дітей до 1-го року з гострими пневмоніями в момент поступлення в стаціонар мали порушення в кількісних та якісних показниках аеробної мікрофлори кишок, а при виписуванні частка таких дітей зменшилася лише до 72,3 %. Найбільші відмінності стосувались асоціацій з трьох і більше видів умовно патогенних мікроорганізмів, які зустрічались у 41,6 % дітей при поступленні проти 18,1 % - при виписуванні (р< 0,01). Частіше це були бактерії родів Enterobacter, Klebsiella в поєднанні з гемолізуючими формами E.coli або з бактеріями роду Proteus, або з дріжджеподібними грибами роду Candida чи стафілококами. В той же час клінічні прояви кишкових розладів мали відповідно лише 39,6 % і 10 % дітей. Зменшення частоти кишкових розладів в процесі лікування відбувалося ефективніше у дітей, які хоча б частково отримували грудне молоко. Отже наявність, навіть в значній кількості умовно патогенних мікроорганізмів або їх асоціацій не було безпосереднім чинником кишкових розладів, а мікробіологічні зміни відображували порушення гомеостазу макроорганізму на фоні основного захворювання. Розрішення патологічного процесу за основним діагнозом сприяло нормалізації мікрофлори, як показника поліпшення загального стану макроорганізму.
Мікроекологічні та імунологічні показники у дітей з рецидивуючими респіраторними інфекціями. При обстеженні часто- та довгохворіючих дітей віком 5-14 років встановлено, що більшість з них мали відхилення у показниках кишкової мікрофлори (згідно до застосованих нами критеріїв), причому найбільше це стосувалося облігатної анаеробної частини мікрофлори. Біфідобактерії виділено з розведень фекалій більше за 10-7 лише від 60 % осіб, частота висіву лактобактерій була трохи вищою, але також не перевищувала 70 %. Представники факультативної мікрофлори - ентеробактери та протеї, виділені, хоча і на рівні lg 6,7 ± 0,5 КУО в 1г, але лише від 28,6 % дітей. Cпівставлення змін рівнів біфідо - і лактофлори з показниками імуного статусу дітей показало наявність оберненого зв`язку між рівнями біфідобактерій та відносною і абсолютною кількістю В-лімфоцитів (% СD19+ r = - 0,268, р<? 0,05; абсолютна кількість СD19+ r = - 0,304, р<? 0,01), активних Т-лімфоцитів ( % HLA-DR+CD3+ r = - 0,287, p <?0,01; абсолютна кількість HLA-DR+CD3+ r = - 0,346, p <? 0,01). Крім того, встановлено прямий зв`язок між рівнем біфідобактерій та стимульованим НСТ-тестом (r = 0,268, p < 0,01). З метою корекції зазначених показників було застосовано препарат з групи біорегуляторів-адаптогенів –настойка коренів ехінацеї пурпурової. В процесі застосування препарату у дітей відзначали позитивну динаміку показників кишкового мікробіоценозу, пов`язану з вірогідним збільшенням кількості біфідофлори, тенденцією до зростання лактобактерій, поліпшенням кількісних показників нормальної кишкової палички, кокової флори. Відзначали також позитивний вплив на ті показники імунітету, які є першим бар`єром захисту організму від патогенів, а, отже, на гомеостаз в цілому (табл.5).
Таблиця 5
Динаміка показників фагоцитозу у часто- та довгохворіючих дітей
при застосуванні біорегулятора-адаптогена (М+m)
Показник Контрольна група Дослідна група Вірогідність
До застосування Після застосування
Фагоцитоз % ,9+2,8 ,2 +2,6 ,4 +3,3 P 1,3-2 < 0,05
Фагоцитарний індекс ,4+0,7 6,9 +0,7 ,1 +0,9 P 1-2 < 0,05
НСТ-тест спонтанний ,7+0,6 ,0 +1,8 ,1 +1,9 P 1,3-2 < 0,05
НСТ-тест стимульований ,8+2,0 ,1 +2,2 ,1 +2,2 P 1,3-2 < 0,05
НСТ-резерв ,1 +1,4 ,1 +1,2 ,0 +1,9 P 1-2,3 < 0,05
Іншій групі часто- та довгохворіючих дітей призначено сухий пробіотичний продукт "Лактовіт", до складу якого входять мікроорганізми L.acidophilus та E.faecium. Виявилося, що застосування цього продукту мало такий же вплив на мікрофлору кишок, що і прийом біорегулятора-адаптогена, тобто, у всіх дітей вірогідно підвищився рівень біфідобактерій з lg 8,7±0,3 до lg 10,1±0,1 (р << 0,01), які виділено від всіх дітей групи. Вірогідним було також збільшення числа дітей, від яких ізольовано лактобактерії. Відповідно до цих змін, зменшились також рівні і частота виділення грампозитивних та грамнегативних умовно патогенних мікроорганізмів.
Отже, за впливом на організм дітей препарат з групи біорегуляторів-адаптогенів та пробіотичний продукт мали рівнозначний ефект у вигляді поліпшення імунологічних і
мікробіологічних показників гомеостазу і клінічного результату у вигляді зникнення ознак хронічної інтоксикації, зниженні частоти епізодів респіраторних інфекцій з 9,3 до 6,2 на рік.
Вивчення впливу внутрішнього опромінення на стан мікробіоценозів макроорганізму. Вивчення порушення мікробіоценозів та імунного статусу у дітей, які проживають на радіаційно контрольованих територіях та обгрунтування шляхів їх корекції. Результати обстеження дітей, проведеного в 1993 р., свідчать про значні зміни показників мікрофлори кишок і їх залежність від території проживання та клінічного стану дітей (табл.6).
У дітей з групи часто- та довгохворіючих порівняно з особами із захворюваннями органів травлення була вірогідно більшою частота виділення умовно патогенних ентеробактерій та S.aureus (р< 0,05), тоді як рівні інших мікробіологічних показників не залежали істотно від клінічного діагнозу. Стан кишкових мікробіоценозів дітей, які проживають в 3-ій зоні радіаційного контролю характеризувався зменшенням частоти та рівнів виділення облігатної анаеробної флори (77,2 % і 58,8 % та lg7,6± 0,2 і lg7,2 ±0,1 відповідно у здорових та хворих обстежених осіб). Причому за рівнем, а особливо за частотою виділення біфідобактерій ці показники були значно меншими в порівнянні з такими у здорових і часто- та довгохворіючих дітей інших регіонів. Характерним було збільшення частки умовно патогенних мікроорганізмів –ентеробактерій, коків та несправжніх грибів, ферментативно неповноцінних E.coli. В той же час, у здорових дітей, які проживають в 4-ій зоні радіаційного контролю, аналогічне зростання рівнів умовно патогенних мікроорганізмів відбувалось при достатньо високих рівнях облігатної флори (lg 8,4 ± 0,4) у більшості дітей - 70,0 %. У 22 обстежених дітей виділено дріжджеподібні гриби
Таблиця 6
Показники кишкового мікробіоценозу у дітей, які проживають на радіаційно контрольованих територіях
Мікроорганізми -тя зона радіаційного контролю -та зона радіаційного контролю Вірогідність
Здорові п=22 різними клінічними діагнозами п=48 Здорові п=20
Кількість мікро організмів в 1 г фекалій M±m Кількість дітей, від яких виділено мікроорганізми Кількість мікро організмів в 1 г фекалій M±m Кількість дітей, від яких виділено мікроорганізми Кількість мікро організмів в 1 г фекалій M±m Кількість дітей, від яких виділено мікроорганізми
абс. % абс. % абс. %
Біфідобактерії ,6±0,2 ,2±8,9 ,2+0,1 ,8+7,1 ,4±0,4 ,0±10,2 Р 5-3<0,05 0,05<Р5-1<0,1
Кишкові палички, в т.ч. з зміненою ферментативною активністю ,0±0,2 7 7 ,8±9,9 31,8±9,9 ,8+0,1 25 ,5±6,9 52,1±7,2 ,1±0,1 11 ,0±6,7 55,0±11,1 Р 5-1,3<0.01 Р 2-4<0,01 Р б-2,4<0,05
УПЕ ,7±0,7 ,7+8,9 ,3±0,3 ,0±6,3 ,9±0,9 ,0+10,7
Стафілококи, в т.ч. S.аигеиs ,1+0,2 1 ,9±10,5 4,5±4,4 ,2±0,3 6 ,2+17,6 12,5+4,8 ,4±0,3 ,0±10,9 Р 5-1,3<0,05
Стрептококи ,4±0,4 ,5±10,6 ,0+0,2 ,0±7,2 ,0±0,3 ,0±10,2 Р 5-1,3<0,05
Мікофлора ,6±0,5 ,7±8,9 ,8±0,2 ,2±6,б ,4±0,3 ,0±11,1 Р 5-1,3<0,02
роду Candida (представлені виключно видом C.albicans) та у шести - плісняві гриби. Такої частоти виділення ми не спостерігали у дітей з неконтрольованих територій. Обстеженим дітям притаманна множинність змін в мікробіоценозі кишечника, у більшості дітей за 3-5 показниками, а в окремих випадках –за 6 та більше, а також відхилення у кількісному та якісному складі мікрофлори зіву. Це можна трактувати як порушення мікробіоценозів данних біотопів і, в цілому, взаємовідносин макроорганізм-мікрофлора. Таке положення підтверджували і результати імунологічних і клінічних обстежень дітей, які постійно мешкають на території 3-ї зони радіаційного контролю, в ході яких у всіх дітей виявлено ознаки хронічної інтоксикації, але не було клінічних проявів кишкових захворювань. Діти обстеженої групи отримали пробіотичний продукт "Старт", розроблений на основі S.thermophilus і B.longum. Застосування протягом трьох тижнів пробіотичного продукту, призвело до значного поліпшення кількісного і якісного складу кишкових мікробіоценозів та показників фагоцитозу і місцевого імунітету у обстежених дітей (табл. 7, 8).
Експериментальне вивчення впливу інкорпорованого Cs-137 на стан кишкових мікробіоценозів дослідних тварин. При проведенні довготривалого експерименту на тваринах було використано 137Cs і обрано дозу 600 Бк (для білих щурів, щодобово протягом 1, 6 та 9 місяців). Протягом всього періоду спостереження не зареєстровано порушень функції травного каналу у тварин або їх загибелі. Однак, при мікробіологічному дослідженні кишкової флори встановлено, що в групі тварин, які отримували препарат Cs137 продовж одного місяця вірогідно
зменшувався порівняно з контрольною групою вміст біфідобактерій (р<<0,01) та лактобактерій (р<<0,02), нормальних кишкових паличок (р<<0,01), стафілококів (р<<0,001), простежувалась тенденція до зменшення кількості стрептококів (р>>0,05). У деяких тварин цієї групи з`явились плісняві гриби та P.aeruginosa (табл. 9).
Таблиця 7
Зміни показників фагоцитозу і місцевого імунітету у дітей, які постійно проживають в 3-й зоні радіаційного контролю при застосуванні пробіотичного продукту
Імунологічний показник Значення показників у дітей, M ± m Вірогідність
Контроль (n=10) Досліджувана група (n=16)
До застосування Після застосування
Фагоцитарна активність, % ,2 ± 2,8 ,5 ± 2,1 ,9 ± 2,9 Р1-2 <0,05
Фагоцитарний індекс ,4 ± 0,7 ,2 ± 0,5 ,0 ± 0,7
Спонтанний НСТ-тест, % ,7 ± 0,6 ,4 ± 1,6 ,6 ± 2,6 Р2-3 = 0,05
Стимульований НСТ-тест, % ,8 ± 2,0 ,9 ± 0,9 ,5 ± 4,3 Р1-2 <0,05
Функціональний резерв ,1 ± 1,4 ,3 ± 1,7 ,0 ± 2,3 Р1-2, 1-3 <0,05
Ig A, г/ л 0,09± 0,03 ,09 ± 0,03 ,08 ± 0,02
Ig G, г/ л ,050±0,01 ,045 ± 0,005 ,048 ± 0,003 Р2-3< 0,05
S Ig A, г / л ,09 ±0,01 0,121 ± 0,02 0,134 ± 0,017
Комплемент С3, г / л ,31 ±0,08 0,264 ± 0,004 0,215 ± 0,004 Р2-3< 0,01
Лізоцим, г / л ,026± 0,007 0,064 ± 0,02 0,027± 0,007 Р2-3< 0,01
Таблиця 8
Зміни кількісних показників мікробіоценозу кишок у дітей при
застосуванні пробіотичного продукту
Мікроорганізми Кількість мікроорганізмів в 1 г фекалій lg М±m Вірогідність
До застосування Після застосування
Біфідобактерії <7,0 ,0 ± 0,0 Р <0,01
Лактобактерії , 1 ± 0,1 ,8 ± 0,2 Р <0,02
Кишкові палички ,0 ± 0,2 ,7 ± 0,2
УПЕ ,1 ± 0,3 ,7 ± 0,3
Стафілококи ,8 ± 0,02 ,8 ± 0,1
Стрептококи ,3 ± 0,1 ,0 ± 0,3
Гриби роду Кандида ,8 ± 0,2 Р <0,01
Плісняві гриби ,8 ± 0,1 ,3 ± 0,2
Таблиця 9
Кількісна та якісна характеристика мікрофлори вмісту товстої кишки дослідних щурів в залежності від тривалості отримання Сs137
Група мікроорганізмів Вміст мікроорганізмів в 1 г фекалій (М+m) в залежності від строків отримання Сs137
Контрольна група n=30 Дослідна група, яка отримувала Сs137
місяць n=10 місяців n=11 місяців n=10
Біфідобактерії ,4+0,3 ,3±0,2 n=8 ,6±0,3 n=6 ,1±0,2 n=7
Лактобактерії ,9+0,4 ,2±0,3 n=9 ,1±0,2 n=8 ,4±0,3 n=8
Кишкова Паличка ,8+0,2 ,8±0,3 n=9 ,3±0,1 n=8 ,3±0,3 n=10
Інші Ентеробактерії ,0+0,8 n=0 ,4±0,2 n=11 ,4±0,9 n=0
Стафілококи ,2+0,1 ,9±0,2 n=6 ,8±0,2 n=11 ,0±0,4 n=9
Стрептококи 7,7+0,5 6,5±0,5 n=8 ,5±0,5 n=9 ,3±0,3 n=7
Гриби р. Кандіда N=0 ,8+0,3 n=3 ,5+0,4 n=4
Плісняві гриби 2,2+0,1 n=2 ,6+0,6 n=2 ,8+0,1 n=9
Інші види 0 ,0+0 n=1 n=0 N=0
Це відповідало періоду максимального зростання радіоактивності тіла білих щурів, яка на 30-й день складала 2728,87 Бк. Через 6 місяців досліду в мікрофлорі кишок відзначали ще більше поглиблення змін. Майже від половини тварин цієї групи виділено гриби роду Candida або плісняві гриби. Характерною ознакою порушень мікробіоценозів була їх множинність, наявність асоціацій умовно патогенних мікроорганізмів. Псля 9 місяців отримання радіонукліду спостерігали деяке поліпшення показників індигенної мікрофлори, які, однак, не досягали значень в контрольній групі тварин, що може свідчити про включення певних компенсаторних механізмів, спрямованих на підтримання гомеостазу мікробних біоценозів. Результати паралельного контролю по довготривалому отриманню стабільного цезію дозволили вважати, що визначені зміни мікробіоценозу кишечника не пов`язані з отриманням цезію як хімічної речовини, а саме з впливом внутрішнього опромінення.
Вивчення антагоністичної активності пробіотичних препаратів та схеми їх застосування з профілактичною метою в акушерських стаціонарах. Вивчення
антагоністичної активності клінічних ізолятів лактобактерій родів Lactobacillus, Streptococcus, Brevibacterium засвідчило, що лише 25,4 % досліджених штамів мали таку активність. Водночас, показано високу активність ряду штамів молочнокислих бактерій, продуктів на їх основі та комерційних пробіотичних препаратів до широкого кола музейних тест-культур та клінічних ізолятів, що спонукало до відпрацювання схем застосування пробіотичних препаратів в пологовопомічних закладах. Одна з них основана на доборі найбільш активного препарата-антагоніста по відношенню до постійно циркулюючого в стаціонарі виду умовно патогенних ентеробактерій (K. pneumoniae) з ознаками госпітального штаму. Результати застосування новонародженим груп ризику комбінації ацидофільної палички та біфідумбактерину або тільки біфідумбактерину, починаючи з пологового залу, показали його успішність в порівнянні з контрольною групою. На момент виписки із стаціонару вони забезпечували високий вміст біфідобактерій в кишечнику (рис.1) і зменшення рівнів та частоти колонізації дітей умовно патогенними бактеріями, порівнюючи з контрольною групою.
Рисунок 1. Частота та рівні виділення з кишечника новонароджених біфідобактерій в динаміці застосування пробіотичних препаратів
Оскільки встановлено, що чутливість до антагоністиної дії пробіотичних препаратів у клінічних ізолятів умовно патогенних мікроорганізмів нижча, порівняно з музейними культурами, запропоновано в разі спалахів гнійно-септичних інфекцій здійснювати добір найбільш активного пробіотика по відношенню до етіологічного чинника. Цю схему апробовано при внутрішньолікарняному спалаху в пологовому будинку, викликаному S.typhimurium, до яких найбільш активними in vitro виявились аципол, колібактерин, лактовіт. В той же час, довгострокове широке емпіричне використання різних пробіотиків на основі молочнокислих бактерій в іншому пологовому будинку, в якому спостерігались високі рівні колонізації новонароджених грамнегативними умовно патогенними бактеріями, зазначено вплив такої схеми використання на мікроекологію стаціонару в цілому. При дослідженні об'єктів довкілля найчастіше стали виділятись грампозитивні мікроорганізми –,4 % позитивних проб (з них 45,8 % коагулазонегативних стафілококів, 6,8 % стрептококів), що майже вдвічі перевищувало частку грамнегативних бактерій - 33,9 %. В 13,6 % позитивних проб виділено дріжджеподібні гриби, представлені видами C.albicans, C. parapsilosis, C.guillermondii, Pichia anomala. Інструментом для здійснення подібих спостережень в акушерських стаціонарах був мікробіологічний моніторинг.
ВИСНОВКИ
1. Обгрунтовано диференційований підхід до прогностичного і діагностичного визначення показників мікробіоценозів у здорових та хворих дітей різних вікових груп та розроблено схеми застосування цим контингентам біологічних препаратів в сучасних умовах.
. Встановлено, що в ранньому постнатальному періоді стан, темпи та формування мікробіоценозів кишечника є відображенням перебігу адаптаційного процесу у новонароджених та чутливим показником епіднеблагополуччя в акушерському стаціонарі. Найважливішим показником фізіологічного становлення мікрофлори кишок у дітей є рівень біфідофлори, взаємопов'язаний з кількісним вмістом умовно патогенних мікроорганізмів та показниками неспецифічного імунітету.
. Для оцінки перебігу неонатального періоду у новонароджених та мікроекологічної ситуації в акушерському стаціонарі необхідним заходом є мікробіологічний моніторинг, який має проводитись за спеціально розробленою програмою, адаптованою для кожного пологовопомічного закладу.
. Виявлено закономірні зміни у видовій структурі умовно патогенних мікроорганізмів, циркулюючих в пологовопомічних закладах в залежності від застосування антибіотичних препаратів. Провідними мікроорганізмами, колонізуючими новонароджених, наприкінці 80-х –напочатку 90-х років були ентеробактерії серед яких домінували бактерії роду Klebsiella (54,4 %), наприкінці 90-х років –грампозитивні умовно патогенні мікроорганізми, переважно коагулазонегативні стафілококи (до 60,0 %), і бактерії роду Enterobacter (до 23,3 %).
5. Вперше обгрунтовано, що організаційна форма "істинного" сумісного перебування матері і дитини в акушерському стаціонарі є найбільш сприятливою для перебігу раннього постнатального періоду новонароджених, а також для формування мікробіоценозів кишечника дітей в ранньому неонатальному періоді, що характеризується швидким становленням біфідо- і лактофлори, низькими рівнями і частотою колонізації умовно патогенними мікроорганізмами та забезпечує стабільність мікрофлори кишок протягом всього неонатального періоду. Короткочасне відокремлення дитини від матері після пологів або розміщення в одній палаті 2-3 пар мати-дитина призводять до змін у формуванні мікрофлори кишечника новонароджених та до розвитку у них клінічних проявів дисадаптації з такою ж частотою, що і при роздільному перебуванні матері і дитини.
. Детермінанти антибіотикостійкості присутні у 15,3 - 90,0 % штамів ентеробактерій, які циркулюють в пологовопомічних закладах та колонізують кишечник новонароджених в сучасний період, навіть за умов відсутності антибіотикового пресингу. Встановлено, що антибіотикочутливість штамів ентеробактенрій зазнавала змін в разі формування госпітального штаму в залежності від часового періоду дослідження, видової належності штамів, рівня застосування антибіотиків в медичній практиці.
. Між рівнями обсімінення молока матерів аеробними мікроорганізмами, станом кишечної мікрофлори та наявністю клінічних проявів у їх дітей не існує взаємного зв'язку, що дозволяє застосування грудного вигодовування за сучасними принципами навіть при середньому вмісті аеробних бактерій 4455,8 ± 729 КУО в 1 мл.
. Розроблено схеми застосування пробіотиків в акушерських стаціонарах, які базуються на застосуванні препаратів, добраних за показниками антагоністичної активності проти визначених домінуючих в стаціонарі мікроорганізмів з ознаками госпітального штаму або збудників гнійно-септичних інфекцій при спалахах.
. Визнано недоцільним проведення з діагностичною метою масових аналізів мікрофлори кишок у клінічно здорових дітей. Дослідження мікрофлори кишечника слід застосовувати, в першу чергу, для груп дітей з певною клінічною патологією для обгрунтування необхідності використання препаратів для корекції мікробіоценозів та включення біологічних препаратів в лікувально-профілактичні схеми.
. Визначено мікробіолого-імунологічні паралелі змін мікрофлори кишечника та імунної системи за показниками, які формують колонізаційну резистентність та неспецифічний імунний захист у дітей із захворюваннями органів дихання, що відображує, в цілому, закономірності порушення гомеостазу макроорганізму. Встановлено, що застосування як препаратів з групи біорегуляторів-адаптогенів, так і пробіотиків однаково ефективне для поліпшення взаємопов'язаних мікробіологічних і імунологічних показників у дітей з захворюваннями органів дихання.
. Виявлено залежність впливу радіаційного фактору на характер порушень кишкових мікробіоценозів, зміни показників неспецифічного та місцевого імунітету у дітей, які постійно проживають на радіаційно контрольованих територіях. Найбільші зміни в складі кишкової мікрофлори встановлено у дітей з соматичними захворюваннями, які мешкають в 3-й зоні радіаційного контролю. Показано високу клініко-мікробіологічну ефективність застосування пробіотичних продуктів для нормалізації показників гомеостазу у цих контингентів дітей.
. Вперше в експерименті на тваринах встановлено вплив догострокового ентерального введення радіонукліду Cs137-хлориду на стан кишкового мікробіоценозу. На моделях безпорідних щурів виявлено залежність змін кишкової мікрофлори від тривалості введення радіонуклідів та загального радіаційного навантаження.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
Впровадити в пологовопомічних закладах систему мікробіологічного моніторингу за програмою, адаптованою для конкретного стаціонару, з обов'язковим проведенням періодичних досліджень становлення мікрофлори кишок здорових новонароджених, антибіотикостійкості виділених при цьому представників аеробної мікрофлори та співставлення за цим показником із штамами, виділеними з об'єктів довкілля.
Для ефективнішого застосування пробіотиків в лікувально-профілактичних схемах здійснювати in vitro добір препаратів за антагоністичною активністю по відношенню до конкретного збудника при спалахах гнійно-септичних інфекцій та при циркуляції в стаціонарах госпітальних штамів.
Включати пробіотики та біорегулятори-адаптогени до лікувально-профілактичних схем часто- та довгохворіючим дітям та дітям, які постійно проживають на радіаційно контрольованих територіях без попереднього дослідження у конкретної дитини стану кишечної мікрофлори.
Розглядати порушення в складі кишечної мікрофлори (дисбактеріози) у дітей з патологічними процесами різної локалізації як суто мікробіологічне поняття, а стан облігатної анаеробної мікрофлори як мікробіологічний показник порушення гомеостазу.
Рекомендувати не проводити масові дослідження мікрофлори кишок у клінічно здорових дітей.
Cписок основних робіт, опублікованих за темою дисертації
У періодичних фахових виданнях, затверджених ВАК України:
1. Клинико-микробиологические наблюдения в специализированных неонатологических отделениях / О.П.Сельникова, Е.Е.Шунько, С.П.Катонина, Е.И.Полищук, Л.В.Авдеева, И.И.Гацко // Мікробіол. журн. –. –Т.58, №6. –С. 50-55.
. Поліщук О.І. Характеристика кишкових мікробіоценозів у немовлят // Українська міжвідомча збірка "Дитячі інфекції". –К., 1998. - №24. –С. 36-41.
3. Полищук Е.И. Препараты-пробиотики в профилактике и лечении нарушений микробиоценозов кишечника // Фармакологічний вісник. –. - №5. –С. 15-18.
. Поліщук О.І. Стан мікробіоценозу кишківника у дітей, що проживають на радіаційно контрольованих територіях // Современные аспекты военной медицины: Сборник научных трудов ГВКГ МО Украины. –Киев, ГВМУ МО Украины. –. –С. 309-311.
5. Поліщук О.І., Гайдай Н.В. Взаємозв'язок мікроекологічних та імунологічних показників у дітей з рецидивуючими респіраторними інфекціями // Педіатрія, акушерство та гінекологія. –. - №6. –С. 15-18.
. Поліщук О.І. Чутливість до антибіотиків грамнегативних бактерій, що колонізують організм новонароджених, які перебували в акушерському стаціонарі // Український хіміотерапевтичний журнал. –. - №1 (1). –С. 49-53.
. Поліщук О.І., Колтукова Н.В. Порівняльна ідентифікація штамів –збудників кандидозів людини за допомогою тест-систем та методом ферментації-асиміляції вуглеводів // Лабораторная диагностика. - 1999. - №2. –С. 32-36.
. Імунний статус та мікробіоценоз кишечника у дітей, які проживають в зоні радіаційного контролю, після застосування функціонального продукту / Л.І.Чернишова, О.І.Поліщук, Н.Ф.Кігель, Л.В.Авдєєва // Імунологія та алергологія. –. - № 1-2. –С. 154-160.
. Авдєєва Л.В., Поліщук О.І., Лукач І.Г. Поширення стійких до гентаміцину бактерій родини Enterobacteriaceae, виділених в родопомічних установах Києва // Український хіміотерапевтичний журнал. –. - №2 (2). –С. 58-61.
. Мікробіоценоз кишечника і імунний статус у дітей з рецидивуючими респіраторними інфекціями після застосування імуномодулюючої терапії / О.І.Поліщук, Н.В.Гайдай, Л.В.Галазюк, Є.В.Вихованець // Українська міжвідомча збірка "Дитячі інфекції". –К., 1999. - №25. –С. 102-109.
. Суліма О.Г., Поліщук О.І., Ткачова Т.М. Клініко-мікробіологічна оцінка впливу материнського молока на стан новонароджених дітей // Медичні перспективи. –. - Т.IV, №2. –С. 54-57.
. Активність цефалоспоринових антибіотиків по відношенню до бактерій родини Enterobacteriaceae / Л.В.Авдєєва, О.І.Поліщук, Є.Є.Шунько, І.Г.Лукач, Л.Б.Швидак // Український хіміотерапевтичний журнал. –. - №3 (3). –С. 39-42.
. Суліма О.Г., Поліщук О.І., Ткачова Т.М. Особливості формування кишкового мікробіоценозу у новонароджених дітей під час перебування в акушерському стаціонарі // Український медичний часопис. –. - №6 (14). –С. 130-134.
14. Полищук Е.И., Колтукова Н.В. Выбор стабилизирующей среды для получения лиофилизированных живых культур возбудителей микозов // Лабораторная диагностика . –. - №4. –С. 29-33.
15. Ідентифікація свіжовиділених штамів –збудників кандидозів людини і пошук ефективних протигрибкових пробіотиків / О.І.Поліщук, Н.В.Колтукова, Л.М.Чернявська, О.М.Рева, І.Б. Сорокулова // Мікробіол. журн. –. –Т.61, №4. –С. 45-53.
16. Колонізація умовно-патогенними мікроорганізмами новонароджених в умовах акушерського стаціонару / О.П.Сельнікова, О.І.Поліщук, Л.В.Авдєєва, Л.М.Чернявська // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім.П.Л.Шупика. –К., 2000. –Випуск 9. –Книга 2. –С. 751-753.
17. Антибіотикорезистентність і фактори персистенції бактерій, виділених в пологових будинках та неонатологічних стаціонарах / О.І.Поліщук, Л.В.Авдєєва, Н.В.Колтукова, І.Г.Лукач, Л.М.Чернявська, Л.В.Опенько // Український хіміотерапевтичний журнал. –. - №1 (5). –С. 30-33.
. Поліщук О.І., Авдєєва Л.В., Ткачова Т.М. Мікробіологічна характеристика кишкових мікробіоценозів немовлят в залежності від умов перебування в акушерському стаціонарі // Українська міжвідомча збірка "Дитячі інфекції". –К., 2000. - №27. –С. 72-77.
. Основні принципи моніторингу за внутрішньолікарняними інфекціями в акушерських стаціонарах / О.П.Сельнікова, О.І.Поліщук, Л.В.Авдєєва, Є.Є.Шунько // Перинатологія та педіатрія. –. - №1. –С. 14-16.
20. Сучасний підхід до профілактики внутрішньолікарняних інфекцій в акушерських і неонатологічних стаціонарах / О.П.Сельнікова, О.І.Поліщук, Л.В.Авдєєва, Є.Є.Шунько // Сучасні інфекції. –. - № 2. –С. 113-116.
21. Поліщук О.І. Вплив інкорпорованих радіонуклідів на стан кишкової мікрофлори експериментальних тварин // Медичні перспективи. –. –Т. 5. –С.26-30.
22. Поліщук О.І. Нові підходи до оцінки кишкових дисбактеріозів у дітей // Лабораторная диагностика. –. - №4. –С. 42-46.
В інших наукових виданнях:
. Полищук Е.И. Формирование микробиоценозов новорожденных // Журнал практического врача. –. - №5. –С. 6-10.
24. Динаміка зміни домінуючих видів умовно-патогенних мікроорганізмів, виділених від новонароджених в неонатологічних стаціонарах / Л.В.Авдєєва, О.І.Поліщук, Є.Є.Шунько, Т.А.Орлова // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. –. - № 7. –С.64. . Сельникова О.П., Чернышова Л.И. Полищук Е.И. Профилактика гнойно- септических осложнений, обусловленных энтеробактериями, у новорожденных в родовспомогательных учреждениях // Вопросы антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфекционной клинике. Материалы Всесоюзного семинара. –Москва, 1987. –С. 159.
. Влияние микробного пейзажа окружающей среды на формирование нормальной микрофлоры новорожденных и пути ее биологической коррекции / О.П.Сельникова, Е.П.Бернасовская, Е.И.Полищук, И.Г.Лукач, С.Р.Резник // Тезисы докладов заседания секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" при ГКНТ СССР. –Киев, 1988. –С. 105.
27. Чувствительность клебсиелл, выделенных от новорожденных и из окружающей среды родовспомогательных учреждений, к аминогликозидным антибиотикам / И.Г.Лукач, Л.В.Авдеева, Е.И.Полищук, О.П.Сельникова // Тезисы докладов заседания секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" при ГКНТ СССР. –Киев, 1988. –С.73.
28. Профилактика развития дисбиозов кишечника у детей в процессе лечения заболеваний внекишечной локализации / О.П.Сельникова, Е.И.Полищук, Л.И. Чернышова, Н.И.Горегляд // Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты. Материалы Всесоюзного семинара. –Москва, 1988. –Ч.11. –С. 296.
29. Экология грамотрицательных бактерий в родовспомогательных учреждениях / О.П.Сельникова, Е.И.Полищук, Л.В.Авдеева, Л.Н.Чернявская, С.В.Комар // Мікробіол. журн. –. –Т. 56, №4. –С.83.
30. Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов новорожденных в зависимости от характера микробной колонизации кишечника / О.П.Костюк, А.В.Волоха, Е.И.Полищук, О.П.Сельникова // Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания. Тезисы докладов международной научной конференции. –Харьков, 1995. –С.168-169.
31. Локальный иммунитет и биоценоз кишечника у детей, проживающих на радиационно контролируемых территориях / Л.И.Чернышова, Г.И.Бондаренко, Е.И.Полищук, О.П.Сельникова, С.В.Комар // Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания. Тезисы докладов международной научной конференции. –Харьков, 1995. –С. 343-344.
32. Полищук Е.И., Сельникова О.П. Возможности регуляции формирования микробиоценозов новорожденных // Дисбактериозы и эубиотики. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции. –Москва, 1996. –С. 30.
33. Клініко-мікробіологічні аспекти гнійно-септичних захворювань новонароджених / О.П.Сельнікова, О.І.Поліщук, Є.Є.Шунько, Л.М.Чернявська, Л.В.Опенько // Актуальні проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та профілактики інфекційних хвороб. ХIII з'їзд Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного. –Київ-Вінниця, 1996. –С. 203-204.
34. Дослідження антагоністичної активності колекційних штамів Bacillus по відношенню до умовно-патогенної мікрофлори / Н.В. Колтукова, О.М. Рева, О.І. Поліщук, І.Б. Сорокулова // Актуальні проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та профілактики інфекційних хвороб. ХIII з'їзд Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного. –Київ-Вінниця, 1996. –С. 263-264.
35. Поліщук О.І., Колтукова Н.В., Чернявська Л.М. Особливості видового складу клінічних ізолятів грибів роду Candida // Актуальні проблеми мікробіології, епідеміології, паразитології та профілактики інфекційних хвороб. ХIII з'їзд Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д.К. Заболотного. –Київ-Вінниця, 1996. –С. 283.
36. Поліщук О.І., Сельнікова О.П. Порушення формування мікробіоценозів новонароджених та можливі шляхи їх корекції // До 100-річчя заснування Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. академіка Л.В. Громашевського. Київ, 1996 - С. 37.
37. Prospects fo Use of the New Lactobacteria-based Product in Treatment and Prevention of Intestinal Infections / D.Kirik, E.Shablovskaya, O.Selnikova, E.Polishuk, I.Pinchuk, N.Kigel // Abstracts of the 1st. World Congress of Pediatric Infectious Diseases.- Covention Center Acapulco, Gro. Mexico, 1996.- P. 40.
38. Polishuk E., Kigel N. New probiotic product and correction of microbiologycal disorders in children. // Biocience and microflora. – 1997. - V. 16, N 2. –P. 29.
39. Порівняльний аналіз клініко-лабораторних показників у дітей, які проживають на територіях з різнем рівнем радіаційного забруднення / Л.І.Чернишова, Г.І.Бондаренко, О.І.Поліщук, Л.В.Галазюк, С.В.Комар, А.П.Волоха //Збірник наукових праць співробітників КМАПО по закінчених та перехідних НДР за 1990-1996 р. –Київ, 1997. –С. 686.
40. Поліщук О.І. Роль умовно патогенних ентеробактерій в колонізації і гнійно-септичних захворюваннях новонароджених //Актуальні питання медичної мікробіології та вірусології. До 100-річчя від дня народження С.С. Дяченка.-Київ, 1998. –С.80-81.
41. Сулима Е.Г., Ткачева Т.Н., Полищук Е.И. Микробиологическая оценка влияния материнского молока на процесс формирования кишечной микрофлоры у новонарожденных // Внутрішньоутробні (вроджені) інфекції новонароджених. Матеріали 1 Конгресу неонатологів України. –Харків, 1998. –С. 92-95.
. Сельникова О.П., Полищук Е.И., Ткачева Т.Н. Влияние режима акушерского стационара на формирование биоценоза кишечника у новорожденных детей // Внутрішньоутробні (вроджені) інфекції новонароджених. Матеріали 1 Конгресу неонатологів України. –Харків, 1998. –С. 95-98.
43. Nosocomial infections in neonatal intensive care unit: a nine-years survey / O.Polishchuk, O. Selnikova, L.Avdeeva, Y.Shunko // 5th International Conference on the Prevention of Infection. –Acropolis, Nice (France), 1998. –P.180.
. Avdeeva L., Polishchuk O., Lukach I. The dynamics of antibiotic sensitivity of microorganisms isoleted from newborns // 5th International Conference on the Prevention of Infection. –Acropolis, Nice (France), 1998. –P.148.
45. Взаємозв'язок нормальної мікрофлори та системи фагоцитозу у дітей / Л.І. Чернишова, О.П.Сельнікова, Є.І.Поліщук, Л.В.Галазюк, Ф.І.Лапій, Н.Ф.Кігель // Труди II-ї конференції Асоціації дитячих лікарів України "Лікувально-профілактичне харчування та пробіотики в педіатрії". –Київ, 1998. –С.131.
46. Avdeeva L., Polishchuk O., Lukach I. The study of ampicillin and carbenicillin resistance of gram-negative bacteria isolated from newborns in Kiev // The Journal of Antimicrobial Chemotherapy – 1999. –Vol. 44, Suppl. A. - P.83-84.
. Суліма О.Г., Поліщук О.І., Ткачова Т.М. Вплив режиму перебування новонароджених в родопомічних закладах на становлення кишкового біоценозу та перебіг раннього неонатального періоду // Матеріали ІІІ науково-практичної конференції дитячих гастроентерологів України. –Одеса, 1999. –С. 203-204.
48. Мікробіологічні аспекти сучасних напрямків профілактики нозокоміальних інфекцій новонароджених / О.П.Сельнікова, О.І.Поліщук, О.Г. Суліма, Т.М.Ткачова // Педіатрія, акушерство та гінекологія. –. №4 –С.25.
49. Суліма О.Г., Ткачова Т.М., Поліщук О.І. Шляхи зниження захворюваності новонароджених на ГСІ // Перинатальні інфекції –сучасний погляд на проблему. Матеріали конференції - Київ, 1999. –С.111-113.
АНОТАЦІЇ
Поліщук О.І. Мікробна екосистема кишечника дітей, нові підходи до її оцінки та корекції в сучасних умовах. Дисертація (рукопис) на здобуття вченого ступеню доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.07 –мікробіологія. Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, Київ, 2001.
Шляхом тривалого моніторингу за формуванням мікробіоценозів кишечника новонароджених встановлено значення стану облігатної мікрофлори для оцінки перебігу раннього адаптаційного періоду у дітей та факультативної флори як показника епіднеблагополуччя в акушерських стаціонарах. Встановлено залежність становлення мікрофлори від форми перебування матері і дитини в пологовому будинку, мікробного обсімінення грудного молока, періоду досліджень. Показано ефективність застосування добраних за антагоністичною активністю пробіотиків при спалахах ВЛІ або циркуляції госпітальних штамів в акушерських закладах. Показано недоцільність досліджень мікрофлори кишок у практично здорових дітей інших вікових груп та використання поняття дисбактеріоз як клінічного діагнозу. У дітей, які проживають на радіаційно контрольованих територіях, або з обтяженим анамнезом, зміни в складі кишечної мікрофлори та імунологічних показників відображують порушення гомеостазу. Цим контингентам рекомендовано включення до лікувально-профілактичних схем пробіотиків та біорегуляторів-адаптогенів. Взаємозв'язок внутрішнього опромінення радіонуклідами і стану мікробіоценозів підтверджено експериментально.
Ключові слова: кишечник, облігатна і факультативна мікрофлора, імунна система, мікробіологічний моніторинг, дисбактеріоз, антибіотикостійкість бактерій, пробіотики, радіонукліди.
Полищук Е.И. Микробная экосистема кишечника детей, новые подходы к ее оценке и коррекции в современных условиях. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук. 03.00.07 - микробиология. Национальный медицинский университет им. А.А.Богомольца, Киев, 2001.
Диссертация посвящена оценке с современных позиций микробной экосистемы кишечника детей разных возрастных групп и разработке подходов коррекции ее нарушений. Многолетние исследования проводили с применением единого методического подхода, но при различных подходах к оценке кишечной микрофлоры у новорожденных и детей старших возрастных групп. Микробиологический мониторинг в акушерских стационарах позволил установить закономерности формирования кишечной микрофлоры. Этот процесс в период наблюдения 1987-93 гг. характеризовался снижением темпов становления бифидобактерий у 68,3 % детей, истощением функциональных возможностей фагоцитов, высоким уровнем колонизации условно патогенными энтеробактериями, что свидетельствовало о напряженном течении раннего адаптационного периода. Ведущая роль среди колонизирующих бактерий принадлежала Klebsiella pneumoniae (54,4 %), около 80 % имели признаки госпитального штамма. Гнойно-септические заболевания новорожденых развивались преимущественно в первые пять суток после выписки из родильного дома, что указывало на тесную связь инфицирования с пребыванием в стационаре. Введение формы совместного пребывания мать-дитя не повлияло существенно на уровень заболеваемости новорожденных. Организационно децентрализованная форма работы роддомов в период 1994-99 гг. преимущественно обеспечивается путем одновременного пребывания в палате 2-3 пар мать-ребенок или кратковременным пребыванием детей в отделении новорожденных для обеспечения отдыха матери после родов. Микробиологические и клинические показатели течения раннего неонатального периода у детей при совместном пребывании при такой организации работы практически не отличались от таких у новорожденных с раздельной формой нахождения в роддоме. Установлено, что только истинное совместное пребывание, связанное с постоянным нахождением матери и ребенка сразу же после родов, обеспечивало оптимальные темпы становления облигатной микрофлоры кишечника у детей, низкие уровни выделения асоциаций условно патогенных микроорганизмов, наименьшую частоту клинических проявлений дисадаптации новорожденных. Зависимость формирования микрофлоры кишечника новорожденных от формы пребывания их в роддоме установлена для раннего неонатального периода, в 1-1,5-месячном возрасте происходило выравнивание микробиологических показателей у детей всех групп. В то же время не даже при наличии в 88,1 % проб грудного молока аэробных микроорганизмов не установлено связи с процессами микробной колонизации кишечника новорожденных и с наличием у них кишечных расстройств. Это позволило рекомендовать грудное вскармливание в соответствии с современными принципами молоком, содержащем в среднем 4455,8 ± 729 КОЕ в 1мл аэробных микроорганизмов.
В конце 90-х годов установлены изменения видового состава доминирущих в колонизации новорожденных условно патогенных бактерий. Ведущее значение приобретают коагулазонегативные стафолококки (60 % случаев), а среди энтеробактерий –Enterobacter sp.( 23,3 %). Среди представителей облигатной и факультативной кишечной флоры выялены детерминанты антибиотикоустойчивости даже при отсутствии антибиотикового прессинга в условиях акушерского стационара. Профили антибиотикоустойчивости штаммов и почти троекратное превышение частоты их выделения от новорожденных по сравнению с объектами окружающей среды, определяют контроль за формированием микрофлоры как показатель эпиднеблагополучия в конкретном стационаре. Показано, что эффективными схемами применения пробиотиков в акушерских стационарах является подбор препаратов по антагонистичесой активности in vitro в отношении этиологических агентов при вспышках внутрибольничных инфекций или длительно циркулирующих в стационаре штаммов.
У клинически здоровых детей различных возрастных групп определяющей в поддержании для каждого ребенка модели колонизационной резистентности была достаточность бифидофлоры (уровни lg 9,0-9,1 ± 0,4 бактерий у 93,1-100 % дітей). Выделение разнообразной и в большом количестве факультативной аэробной флоры не связано с клиническими проявлениями и, таким образом, не имело диагностического значения для конкретного ребенка и не требовало коррекции. Это доказывает нецелесообразность массовых исследований микрофлоры кишечника у клинически здоровых детей и использования понятия "дисбактериоз" в качестве клинического диагноза. У детей с острыми и хроническими заболеваниями дыхательной системы ведущая роль в изменении кишечной микрофлоры принадлежала снижению уровней и частоты выделения бифидо- и лактобактерий. Поэтому изменения в составе облигатной микрофлоры расценивали как микробиологические показатели нарушения гомеостаза. С ними корреляционно связаны изменения неспецифической резистентности макроорганизма (функциональная активность фагоцитов). Данным контингентам обосновано включение биологических препаратов в комплексные лечебно-профилактические схемы. Установлено, что применение как препаратов из группы биорегуляторов-адаптогенов, так и пробиотиков одинаково эффективно для улучшения взаимосвязанных микробиологических и иммунологических показателей при заболеваниях дыхательной системы.
У детей, проживающих на радиационно контролируемых территориях, установлены нарушения кишечных микробиоценозов, изменения показателей неспецифического и местного иммунитета в зависимости от влияния радиационного фактора. Показана высокая эффективность применения пробиотических продуктов для нормализации показателей гомеостаза у этих детей. Взаимосвязь внутреннего облучения радионуклидами Cs-137 и состоянием микрофлоры кишечника подтверждена экпериментально.
Ключевые слова: кишечник, облигатная и факультативная микрофлора, иммунная система, микробиологический мониторинг, дисбактериоз, антибиотикоустойчивость бактерий, пробиотики, радионуклиды.
Polishchuk O.I. Microbial intestinal ecosystem in children, new ways of its appreciation and correction in modern conditions. The manuscript. The dissertation for a doctor's degree in medicine, speciality 03.00.07 - microbiology. Bogomolets National medical university, Kyiv, 2001.
Significance of obligative microflora status in the appreciation of early adaptive period in children and facultative flora like indicator of epidemic troubles in obstetrical clinics have been established by prolonged monitoring. It was evaluated that the forms of mother and child staying in the clinic and bacterial contamination of breast milk have an influence on formation of the microflora. Efficiency of the probiotics selected by their antagonistic activity was demonstrated in nosocomial outbreak and cases of hospital strains circulation in obstetrical institutions was proved. It was also demonstrated that it is inexpedient to investigate intestinal microflora of healthy children and use "disbiosis" like clinical diagnosis. Some changes of the intestinal microflora and immunological signs in children from radioactive supervised territories reflects the homeostasis violations. It was recommended to use probiotics and bioregulators adaptogenes in treatment. Connection between internal radinuclides exposure and conditions of microbiocenosis was proved experimentaly.
Key words: intestin, obligative and facultative microflora, immune system, microbiological monitoring, disbacteriosis, antimicrobial resistance, probiotics, radionuclides.