У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

Фиксация препарата- 1

Работа добавлена на сайт samzan.net: 2015-07-10

Поможем написать учебную работу

Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Предоплата всего

от 25%

Подписываем

договор

Выберите тип работы:

Скидка 25% при заказе до 6.4.2025

Протокол последовательного иммуномечения (коннексин/СД38)

для клеточных мазков

1. Фиксация препарата:

1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина или в парах 10% формалина (рН=7,4);

1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 10 минут при комнатной температуре (или 18 часов в холодильнике);

1.3. удалить остатки формалина с препарата;

1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут (если в парах, то достаточно 1 смены);

2. Постфиксация (пермеабилизация) препарата:

2.1. поместить препарат в охлажденную смесь этанола и уксусной кислоты (2:1);

2.2. инкубировать препарат 5 минут в морозильнике (-20оС);

2.3. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут.

3. Блокирование сывороткой:

3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;

3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;

3.3. осторожно слить раствор со среза.

4. Добавление первичных мышиных антител к коннексину-45:

4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-

                 1:250) в PBS с 1% WGS ;

4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной

      камере;

4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

5. Добавление вторичных антимышиных антител (в темноте):

5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:100-

                  1:200) в PBS с 1% WGS;

5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во

                  влажной камере в темноте;

5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

6. Добавление PhE-меченых анти-СD38 антител (в темноте) :

6.1. нанести 15 мкл антител в рабочем разведении (1:50) в PBS с 1% WGS;

6.2. инкубировать при +37оС 1 час во влажной камере в темноте;

6.3. промыть 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

7. Микроскопия:

7.1. нанести монтирующую жидкость (15 мкл, глицерин и PBS 1:1);

7.2. накрыть покровным стеклом;

7.3. микроскопия (подсчет не менее 10 полей зрения, учитывать внутриклеточную локализацию антигена).


Протокол последовательного иммуномечения (коннексин/СД38)

для замороженных срезов

1. Фиксация препарата:

1.1. поместить препарат в 1% раствор формалина или в парах 10% формалина (рН=7,4);

1.2. инкубировать препарат в растворе формалина 10 минут при комнатной температуре (или 18 часов в холодильнике);

1.3. удалить остатки формалина с препарата;

1.4. промыть препарат 2-мя сменами PBS по 5 минут (если в парах, то достаточно 1 смены);

2. Постфиксация (пермеабилизация) препарата:

2.1 постфиксация 0,1 % Тритоном Х-100 (по 15 мкл на срез), комнатная температура, 20 минут.

2.2 промывка PBS (2 смены по 5 минут).

3. Блокирование сывороткой:

3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;

3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;

3.3. осторожно слить раствор со среза.

4. Добавление первичных мышиных антител к коннексину-45:

4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-

                 1:250) в PBS с 1% WGS ;

4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной

      камере;

4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

5. Добавление вторичных антимышиных антител (в темноте):

5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:100-

                  1:200) в PBS с 1% WGS;

5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во

                  влажной камере в темноте;

5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

6. Добавление PhE-меченых анти-СD38 антител (в темноте) :

6.1. нанести 15 мкл антител в рабочем разведении (1:50) в PBS с 1% WGS;

6.2. инкубировать при +37оС 1 час во влажной камере в темноте;

6.3. промыть 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

7. Микроскопия:

7.1. нанести монтирующую жидкость (15 мкл, глицерин и PBS 1:1);

7.2. накрыть покровным стеклом;

7.3. микроскопия (подсчет не менее 10 полей зрения, учитывать внутриклеточную локализацию антигена).


Протокол последовательного иммуномечения (коннексин/СД38)

для парафиновых срезов

1. Депарафинизация среза:

1.1. 3 смены ксилола по 5 минут;

1.2. 2 смены абсолютного этанола по 5 минут;

1.3. 1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты;

1.4. 1 смена PBS по 5 минут.

2. Предобработка среза (демаскирование АГ):

2.1. на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20 мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS);

2.2. инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере;

2.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

3. Блокирование сывороткой:

3.1. на срез нанести 15 мкл 10% раствора WGS (whole goat serum) в PBS;

3.2. инкубировать срез 20-30 минут при +37оС во влажной камере;

3.3. осторожно слить раствор со среза.

4. Добавление первичных мышиных антител к коннексину-45:

4.1. на срез нанести 15 мкл первичных антител в рабочем разведении (1:50-

                 1:250) в PBS с 1% WGS ;

4.2. инкубировать срез при +37оС 1 час (или в холодильнике до 18 часов) во влажной

      камере;

4.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

5. Добавление вторичных антимышиных антител (в темноте):

5.1. на срез нанести 15 мкл вторичных антител в рабочем разведении (1:100-

                  1:200) в PBS с 1% WGS;

5.2. инкубировать срез при +37оС 30 минут (или в холодильнике 30 минут) во

                  влажной камере в темноте;

5.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

6. Добавление PhE-меченых анти-СD38 антител (в темноте) :

6.1. нанести 15 мкл антител в рабочем разведении (1:50) в PBS с 1% WGS;

6.2. инкубировать при +37оС 1 час во влажной камере в темноте;

6.3. промыть 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

7. Микроскопия:

7.1. нанести монтирующую жидкость (15 мкл, глицерин и PBS 1:1);

7.2. накрыть покровным стеклом;

7.3. микроскопия (подсчет не менее 10 полей зрения, учитывать внутриклеточную локализацию антигена).




1. тематическая статистика- учеб
2. примыслов характеризует московскую политику до конца XIV в
3. тема адаптации Стресс неспецифическая общая реакция организма на физическое или психологиче
4. в зажиме методика расчета параметров БВР сравнительная характеристика отбойки на зажатую среду
5. Искусство психологического консультирования
6. Эволюция мира
7. Малые предприятия
8. Исследование сопротивления различных веществ Содержание
9. Башкирский государственный аграрный университет Очное обучение ВЕДОМОСТЬ УЧЕТА РЕЙТИНГОВЫХ БАЛЛОВ СТ
10. Реферат- Белорусская кухня