Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Изучение спектральных свойств оксигемоглобина
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: построить спектр поглощения раствора оксигемоглобина, охарактеризовать его спектральные свойства.
Ход работы:
Кровь с антикоагулянтом (гепарин) смешивают с изотоническим раствором хлорида натрия (0,85 %) в соотношении ≈ 1:1. Эту смесь центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 6000 об/мин на центрифуге МРW-340. Надосадочную жидкость, содержащую плазму и тонкий слой лейкоцитов, удаляют пипеткой Пастера. Осадок смешивают с 0,85 % NaCl и вновь центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин. Эту операцию повторяют дважды. К полученному осадку эритроцитов добавляют дистиллированную воду. Мембраны эритроцитов осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит в основном раствор оксигемоглобина, который разбавляют дистиллированной водой до требуемой концентрации, при этом оптическая плотность в полосе Соре должна быть равна ≈ 0,8 – 0,9 ед., т.к. при D > 1 резко возрастает погрешность измерения, а при меньших значениях D414 будет сложно зарегистрировать другие полосы поглощения гембелка.
Концентрацию оксигемоглобина [НbО2] в моль/л определяют спектрофотометрическим способом, применяя для расчета формулу:
[НвО2] = (1,64D576 + 0,64D560 + 0,72D540)/10-4, (3.11)
где D576, D560 и D540 _- величины оптической плотности раствора оксигемоглобина соответственно при 576, 560 и 540 нм.
В работе используют растворы оксигемоглобина с концентрациями 5·10-4 – 5·10-5 моль/л.
2. Измерить оптическую плотность раствора оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 - 2 нм.
3. Построить спектр поглощения раствора нативного оксигемоглобина.
4. Сделать выводы: охарактеризовать спектральные свойства оксигемоглобина; используя литературные данные, объяснить, какими электронными переходами обусловлены данные максимумы.
Лабораторная работа 3.3
Влияние температуры и УФ-света на спектральные
свойства оксигемоглобина
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), термостат, установка для УФ-облучения, пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: исследовать спектральные свойства термо- и фотомодифицированных растворов оксигемоглобина человека.
Ход работы:
1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).
2. А. Полученный раствор инкубировать при температуре 45 оС в течение 20 мин.
Б. Полученный раствор (3 мл) облучить УФ-светом через светофильтр УФС-1 (240 – 390 нм) в дозе 1500 Дж/м2.
3. Измерить оптическую плотность модифицированного (по варианту А или Б) раствора оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.
4. Построить спектр поглощения раствора модифицированного оксигемоглобина, сравнить полученные данные со спектром поглощения нативного гембелка, взятого в той же концентрации (контрольный раствор).
5. Сделать выводы о влиянии данных физических факторов (температуры и УФ-света) на структурные свойства гембелка.
Лабораторная работа 3.4
Исследование вклада активных форм кислорода
в процесс фотомодификации оксигемоглобина
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), D-маннит, установка для УФ-облучения, пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: исследовать вклад ОН·-радикалов в фотоиндуцированные изменения структуры оксигемоглобина.
Ход работы:
1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).
2. Приготовить раствор D-маннита (5,4·10-4 моль/л). D-маннит, как и другие спирты (третичный бутанол, этанол и др.) является активным перехватчиком ОН·-радикалов, образующихся при действии УФ-света.
3. Смешать полученные растворы в объемном соотношении 1:1. Контрольный раствор оксигемоглобина развести дистиллированной водой в той же пропорции.
4. Полученные растворы (3 мл) облучить УФ-светом через светофильтр УФС-1 (240 – 390 нм) в дозе 1500 Дж/м2 .
5. Измерить оптическую плотность полученных растворов оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.
6. Построить спектры поглощения растворов УФ-модифицированного и нативного оксигемоглобина.
7. Сравнив полученные спектры поглощения, сделать вывод о вкладе гидроксильных радикалов в фотоиндуцированные изменения структуры оксигемоглобина.
Лабораторная работа 3.5
Исследование спектральных характеристик растворов оксигемоглобина в присутствии активных форм кислорода
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пероксид водорода, сульфат железа (II), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: исследовать влияние Н2О2 и ОН·-радикалов на спектральные свойства растворов оксигемоглобина.
Ход работы:
1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).
2. Приготовить реактив Фентона (2·10-4 моль/л Н2О2 и 1·10-5 моль/л FeSО4). Реактив Фентона является источником ОН·-радикалов, образующихся в реакции:
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH·.
Гидроксильный радикал является сильнейшим окислителем, он вызывает повреждения молекул белков и нуклеиновых кислот, индуцирует пероксидное окисление липидов, приводит к разрыву СН-связей. Это является причиной сильного мутагенного, канцерогенного и цитотоксического действия данного радикала.
3. А. Смешать раствор оксигемоглобина и реактив Фентона в объемном соотношении 1:1.
Б. Смешать раствор оксигемоглобина и Н2О2 (2·10-4 моль/л) в объемном соотношении 1:1.
Контрольный раствор оксигемоглобина развести дистиллированной водой в той же пропорции.
4. Измерить оптическую плотность полученных растворов оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.
5. Построить спектры поглощения растворов модифицированного и нативного оксигемоглобина.
6. Сравнив полученные спектры поглощения, сделать вывод о вкладе гидроксильных радикалов и Н2О2 в изменения спектральных свойств (и структуры) оксигемоглобина.
Контрольные вопросы
1. Что собой представляет система электронных энергетических уровней молекулы?
2. Какие электронные переходы возможны в молекуле?
3. Какие типы электронных переходов обусловливают спектр поглощения в видимой и ультрафиолетовой (УФ) областях спектра?
4. Какие характеристики используют для описания способности целого объекта поглощать свет?
5. Сформулируйте закон Бугера-Ламберта-Бэра. При каких условиях он выполняется?
6. Что собой представляет молярный коэффициент экстинкции? Каков его физический смысл?
7. Что такое спектр поглощения?
8. В каком интервале должны быть величины оптической плотности, чтобы воспроизводимость результатов была не ниже 5%?
9. В каком случае используют метод дифференциальной спектрофотометрии? В чем его преимущества?
10. В чем сущность метода производной спектрофотометрии? Какую информацию можно получить, используя этот метод?
9. Опишите спектральные свойства простых (однокомпонентных) и сложных белков.
10. Какие активные формы кислорода вы знаете? Опишите их физико-химические свойства и биологическую роль.
Рекомендуемая литература
1. Артюхов В.Г. Биофизика: учеб. пособие / В.Г.Артюхов, Т.А.Ковалева, В.П.Шмелев. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. – 336 с.
2. Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем: учеб. пособие / В.Г.Артюхов, О.В.Путинцева. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1996. – 240 с.
3. Аналитическая химия. Физические и физико-химические методы анализа: учебник для вузов / А.Ф.Жуков [и др.]. - М.: Химия, 2001. – 496 с.
4. Булатов М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа / М.И.Булатов, И.П.Калинкин. - Л.: Химия, 1986. – 432 с.