Общие принципы спектроскопии Спектральные методы анализа основаны на использовании явления испускания.html
Работа добавлена на сайт samzan.net:
Изучение спектральных свойств оксигемоглобина
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: построить спектр поглощения раствора оксигемоглобина, охарактеризовать его спектральные свойства.
Ход работы:
- Выделить оксигемоглобин из эритроцитов крови.
Кровь с антикоагулянтом (гепарин) смешивают с изотоническим раствором хлорида натрия (0,85 %) в соотношении ≈ 1:1. Эту смесь центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 6000 об/мин на центрифуге МРW-340. Надосадочную жидкость, содержащую плазму и тонкий слой лейкоцитов, удаляют пипеткой Пастера. Осадок смешивают с 0,85 % NaCl и вновь центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин. Эту операцию повторяют дважды. К полученному осадку эритроцитов добавляют дистиллированную воду. Мембраны эритроцитов осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит в основном раствор оксигемоглобина, который разбавляют дистиллированной водой до требуемой концентрации, при этом оптическая плотность в полосе Соре должна быть равна ≈ 0,8 – 0,9 ед., т.к. при D > 1 резко возрастает погрешность измерения, а при меньших значениях D414 будет сложно зарегистрировать другие полосы поглощения гембелка.
Концентрацию оксигемоглобина [НbО2] в моль/л определяют спектрофотометрическим способом, применяя для расчета формулу:
[НвО2] = (1,64D576 + 0,64D560 + 0,72D540)/10-4, (3.11)
где D576, D560 и D540 _- величины оптической плотности раствора оксигемоглобина соответственно при 576, 560 и 540 нм.
В работе используют растворы оксигемоглобина с концентрациями 5·10-4 – 5·10-5 моль/л.
2. Измерить оптическую плотность раствора оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 - 2 нм.
3. Построить спектр поглощения раствора нативного оксигемоглобина.
4. Сделать выводы: охарактеризовать спектральные свойства оксигемоглобина; используя литературные данные, объяснить, какими электронными переходами обусловлены данные максимумы.
Лабораторная работа 3.3
Влияние температуры и УФ-света на спектральные
свойства оксигемоглобина
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), термостат, установка для УФ-облучения, пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: исследовать спектральные свойства термо- и фотомодифицированных растворов оксигемоглобина человека.
Ход работы:
1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).
2. А. Полученный раствор инкубировать при температуре 45 оС в течение 20 мин.
Б. Полученный раствор (3 мл) облучить УФ-светом через светофильтр УФС-1 (240 – 390 нм) в дозе 1500 Дж/м2.
3. Измерить оптическую плотность модифицированного (по варианту А или Б) раствора оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.
4. Построить спектр поглощения раствора модифицированного оксигемоглобина, сравнить полученные данные со спектром поглощения нативного гембелка, взятого в той же концентрации (контрольный раствор).
5. Сделать выводы о влиянии данных физических факторов (температуры и УФ-света) на структурные свойства гембелка.
Лабораторная работа 3.4
Исследование вклада активных форм кислорода
в процесс фотомодификации оксигемоглобина
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), D-маннит, установка для УФ-облучения, пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: исследовать вклад ОН·-радикалов в фотоиндуцированные изменения структуры оксигемоглобина.
Ход работы:
1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).
2. Приготовить раствор D-маннита (5,4·10-4 моль/л). D-маннит, как и другие спирты (третичный бутанол, этанол и др.) является активным перехватчиком ОН·-радикалов, образующихся при действии УФ-света.
3. Смешать полученные растворы в объемном соотношении 1:1. Контрольный раствор оксигемоглобина развести дистиллированной водой в той же пропорции.
4. Полученные растворы (3 мл) облучить УФ-светом через светофильтр УФС-1 (240 – 390 нм) в дозе 1500 Дж/м2 .
5. Измерить оптическую плотность полученных растворов оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.
6. Построить спектры поглощения растворов УФ-модифицированного и нативного оксигемоглобина.
7. Сравнив полученные спектры поглощения, сделать вывод о вкладе гидроксильных радикалов в фотоиндуцированные изменения структуры оксигемоглобина.
Лабораторная работа 3.5
Исследование спектральных характеристик растворов оксигемоглобина в присутствии активных форм кислорода
Материалы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, центрифуга MPW-340, весы для уравновешивания центрифужных пробирок, кровь человека или животного (с антикоагулянтом), 0,85 % NaCl, фосфатный буфер (0,01 моль/л, рН 7,4), пероксид водорода, сульфат железа (II), пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Цель работы: исследовать влияние Н2О2 и ОН·-радикалов на спектральные свойства растворов оксигемоглобина.
Ход работы:
1. Приготовить буферный раствор оксигемоглобина человека (3 - 5·10-4 моль/л) (см. работу № 1 «Изучение спектральных свойств оксигемоглобина»).
2. Приготовить реактив Фентона (2·10-4 моль/л Н2О2 и 1·10-5 моль/л FeSО4). Реактив Фентона является источником ОН·-радикалов, образующихся в реакции:
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH·.
Гидроксильный радикал является сильнейшим окислителем, он вызывает повреждения молекул белков и нуклеиновых кислот, индуцирует пероксидное окисление липидов, приводит к разрыву СН-связей. Это является причиной сильного мутагенного, канцерогенного и цитотоксического действия данного радикала.
3. А. Смешать раствор оксигемоглобина и реактив Фентона в объемном соотношении 1:1.
Б. Смешать раствор оксигемоглобина и Н2О2 (2·10-4 моль/л) в объемном соотношении 1:1.
Контрольный раствор оксигемоглобина развести дистиллированной водой в той же пропорции.
4. Измерить оптическую плотность полученных растворов оксигемоглобина в диапазоне длин волн от 220 до 750 нм. Измерения производят через 5 нм, в области максимумов – через 1 -2 нм.
5. Построить спектры поглощения растворов модифицированного и нативного оксигемоглобина.
6. Сравнив полученные спектры поглощения, сделать вывод о вкладе гидроксильных радикалов и Н2О2 в изменения спектральных свойств (и структуры) оксигемоглобина.
Контрольные вопросы
1. Что собой представляет система электронных энергетических уровней молекулы?
2. Какие электронные переходы возможны в молекуле?
3. Какие типы электронных переходов обусловливают спектр поглощения в видимой и ультрафиолетовой (УФ) областях спектра?
4. Какие характеристики используют для описания способности целого объекта поглощать свет?
5. Сформулируйте закон Бугера-Ламберта-Бэра. При каких условиях он выполняется?
6. Что собой представляет молярный коэффициент экстинкции? Каков его физический смысл?
7. Что такое спектр поглощения?
8. В каком интервале должны быть величины оптической плотности, чтобы воспроизводимость результатов была не ниже 5%?
9. В каком случае используют метод дифференциальной спектрофотометрии? В чем его преимущества?
10. В чем сущность метода производной спектрофотометрии? Какую информацию можно получить, используя этот метод?
9. Опишите спектральные свойства простых (однокомпонентных) и сложных белков.
10. Какие активные формы кислорода вы знаете? Опишите их физико-химические свойства и биологическую роль.
Рекомендуемая литература
1. Артюхов В.Г. Биофизика: учеб. пособие / В.Г.Артюхов, Т.А.Ковалева, В.П.Шмелев. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. – 336 с.
2. Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем: учеб. пособие / В.Г.Артюхов, О.В.Путинцева. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1996. – 240 с.
3. Аналитическая химия. Физические и физико-химические методы анализа: учебник для вузов / А.Ф.Жуков [и др.]. - М.: Химия, 2001. – 496 с.
4. Булатов М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа / М.И.Булатов, И.П.Калинкин. - Л.: Химия, 1986. – 432 с.
2. Subject Pssport hndling Generl Issue Dte Revision Purpose Rdisson BLU provides guests with courteous effici
3. Согласованно Утверждаю През
4. Согласовано Утверждаю ЦК неф
5. Реферат Георг Зиммель
6. Введение в философию http---philosophy
7. Жизнь человека ~ страдание выход ~ в достижении нирваны относятся к философской системе-Буддизм Звезд
8. Тема- Влияние температуры окружающей среды температуры масла и изоляции на работоспособность трансфо
9. тематические методы исследования динамических систем
10. Разработка технологического процесса капитального ремонта пути
11. Контрольная работа- Задержание подозреваемого
12. Ааа как жарко сколько можно Мне уже совсем плохо С ума же сойти можно Успокойся уже Ехать ещё долго
13. Тема Дата СтудентГр
14. Эталон К Утверждаю Столяров И
15. Методы сжатия цифровой информации
16. кращих олігархії влади небагатьох багатих демократії влади народу всіх дорослих і вільних членів
17. Новое поколение XXI века
18. экономическая статистика использует метод массового статистического наблюдения Абсолютное
19. реферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата педагогічних наук Київ 2004
20. Макроэкономические закономерности