Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ
Тишкін Сергій Михайлович
УДК 612.13:612.273.2
Механізми і фармакологічна корекція порушень скорочувальної активності судин, ІНДУКОВАНИХ іонізуючИМ g-ВИПРОМІНЮВАННЯМ
14.03.05 - фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеню
доктора біологічних наук
КИЇВ-2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фармакології та токсикології АМН України
Науковий консультант: доктор медичних наук,
Соловйов Анатолій Іванович
Інститут фармакології та токсикології АМН України
головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук Левицький Євген Леонідович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології
доктор медичних наук, професор, академік НАН і АМН України
Мойбенко Олексій Олексійович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу експериментальної кардіології
доктор біологічних наук Зима Валентин Леонідович, Національний університет ім. Т.Г. Шевченка, професор кафедри біофізики
Провідна установа:
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра фармакології, МОЗ України, м. Київ.
Захист відбудеться “_22__” ________01_________ 2003 р. о _13_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради – Д 26.550.01 у Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Е.Потьє, 14).
Автореферат розіслано “__18_” ______12______ 2002 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої вченої ради
Д 26.550.01, кандидат біологічних наук І.В. Данова
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Велику кількість серцево-судинних розладів пов'язують із порушеннями ендотеліальної функції кровоносних судин. Відомо, наприклад, що при гіпертензії, гіперхолестеринемії, ішемії/гіпоксії дилататорні реакції на стимуляцію ендотелію зменшені, і це пов'язано в першу чергу з порушенням механізмів, що визначають виділення й утилізацію оксиду азоту [Jayakody R.L. et al., 1985; Lusher T.F., Vanhoute P.M., 1986; Verbeuren T.J. et al., 1990; Soloviev A.I. et al., 1993; Giordano E. et al., 1999]. Внаслідок цього виникає схильність судинної стінки до скорочення або її надлишкова чутливість до вазоконстрикторних впливів, які у ряді випадків спроможні призвести до розвитку довгострокового і стійкого скорочення гладеньких м'язів судин (вазоспазму), що є підгрунтям для цілої низки захворювань серцево-судинної системи, таких як гіпертонічна хвороба, інфаркт міокарду, порушення мозкового кровообігу.
Останнім часом з'явилися експериментальні дані, які переконливо свідчать, що порушення ендотеліальної функції судинної стінки, а також зміни її чутливості до біологічно активних речовин спостерігаються також при впливі іонізуючого опромінення [Qi F. et al., 1998; Beckman J.A. et al., 2001]. Дані клінічних і експериментальних досліджень указують на те, що іонізуюча радіація викликає суттєві зміни вазомоторної активності, яка супроводжується вираженими порушеннями реактивності судин до різноманітних фармакологічних агентів. Проте, головним чином, ці дослідження стосуються вивчення загальних гемодинамічних або морфологічних показників. Результати цих експериментів є досить суперечливими, а картина участі судин у розвитку променевого ураження організму залишається не до кінця з"ясованою [Воробьев В.И., Степанов Р.П., 1985]. Морфологічними дослідженнями встановлено, що ендотелій є достатньо радіочутливою структурою, проте питання про кореляцію радіаційних ушкоджень ендотеліоцитів і скоротливої активності судинної стінки залишається дотепер відкритим.
Дані медичної статистики свідчать, що судинні розлади займають чільне місце в переліку хвороб, пов'язаних із Чорнобильськими подіями [Бебешко В.Г. та ін., 1995, 1996; Хомазюк І.М., 1991-1997; Смирнова И.П. и др., 1991; Симонова Л.Н. та ін., 1995; Горбась И.М. и др., 1995; Зубовський Г.А. та ін., 1999]. Найбільш серйозні з них, що призводять до зниження працездатності і якості життя – гіпертонічна хвороба та ішемічна хвороба серця - займають більш ніж 80% від загальної кількості серцево-судинних захворювань. У структурі смертності постраждалих серцево-судинні патології становлять 55-60%. Загальновизнано, що однією із головних мішеней дії іонізуючої радіації на організм є кровоносні судини. Клітинні механізми індукованих радіацією серцево-судинних уражень дотепер не встановлені, але дані сучасних досліджень усе більш вказують на те, що чинники ендотеліального походження відіграють значну роль у формуванні патологічних станів при дії іонізуючої радіації. Насьогодні ці питання ще малодосліджені, що зумовлює актуальність подальшого вивчення клітинних механізмів розвитку індукованих радіацією судинних патологій, пов'язаних з порушеннями як синтезуючої, так і екскреторної функцій ендотелію кровоносних судин.
Клінічні спостереження вказують на те, що проблема лікування пацієнтів після радіаційного впливу значно ускладнена зниженням ефективності дії багатьох серцево-судинних препаратів. Медична практика постчорнобильского періоду засвідчує, що терапевтичні донори NO, загальновживані для лікування судинних розладів, виявляють невисоку ефективність при лікуванні пацієнтів, що зазнали іонізуючого опромінення. Така ситуація перешкоджає ефективній терапії стенокардії, інфаркту міокарда, гіпертонічної хвороби й інших серцево-судинних патологій у значного контингенту населення. Ця обставина і визначає актуальність вивчення механізмів зменшення ефективності терапевтичних донорів оксиду азоту після променевого впливу і визначення можливостей її фармакологічної корекції. Крім того, є реальні підстави вважати, що радіація може змінювати реактивність гладеньких м'язів судин й до інших біологічно активних речовин. Це робить вивчення змін судинної реактивності при дії радіації життєво необхідним.
Встановлено, що фосфатидилхолінові ліпосоми можуть відновлювати ендотеліальну функцію судинної стінки при деяких судинних патологічних станах у модельних експериментах [Soloviev A.I. et al., 1993]. Було продемонстровано, що ліпосоми виявляють антиоксидантні і мембранотропні властивості [Стефа- нов А.В. и др., 1990]. Ці дані визначили новий напрямок для досліджень можливості фармакологічного відновлення ендотеліальної функції кровоносних судин після оксидативного стресу, викликаного іонізуючою радіацією.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертаційної роботи затверджено на засіданні вченої ради Інституту фармакології та токсикології АМН України. Вона є частиною досліджень, в яких автор дисертації був відповідальним виконавцем та співвиконавцем наведених нижче програм та тем. Тема НДР: "Исследовать изменения сократительных и электрофизиологических свойств сердечной мышцы и коронарных сосудов, биохимические и ультраструктурные особенности сарколеммы при хронической коронарной недостаточности и определить возможности фармакологической коррекции выявленных нарушений", 1985-1988 рр. Тема НДР: "Исследование механизмов действия некоторых антиангинальных препаратов на сосудистую систему в условиях ионизирующей радиации", держреєстраційний № 5/174 (Державний фонд фундаментальних досліджень, 1992-1993 р.). Тема НДР: "Нестохастичні ефекти низьких рівнів іонізуючої радіації: дослідження механізмів розвитку патологічних змін серцево-судинної системі та шлунково-кишкового тракту для розробки шляхів корекції виявлених порушень", держреєстраційний № 0193 U0323340 (Українська державна програма мінімізації наслідків Чорнобильської катастрофи (1993-1995 рр.)).Тема НДР: "Изучение действия факторов эндотелиального происхождения на сократительную активность гладких мышц сосудов", держреєстраційний № 0195U010052, 1995-1997 рр. Тема НДР: "Сравнительное изучение эффективности вазодилататорных препаратов (доноров оксида азота) на сократительную активность кровеносных сосудов в условиях нормальной и пониженной оксигенации" держреєстраційний № 0197U004797, 1997-1999 рр. Тема НДР: " Changes in vasorelaxant activity of therapeutic nitric oxide donors after whole body irradiation and its relevance to the Chornobyl disaster”, № 055168/z/98/z, (Wellcome Trust, 1999-2001). Тема НДР: " Роль факторів ендотеліального походження (оксиду азоту, гіперполяризуючого фактору, пероксинітриту) у формуванні вазоспастичних станів в умовах нормальної та зниженої оксигенації", держреєстраційний № 0100U000303, 2000-2002 рр.
Мета роботи полягала у визначенні характеру та механізмів порушень скорочувальної активності судин при дії іонізуючого випромінювання для обгрунтування коригуючих заходів фармакологічного спрямування.
Завдання дослідження: 1. Визначити основні закономірності впливу іонізуючої радіації на констрикторні і дилататорні властивості грудної аорти і сонної артерії кролів;
2. Провести порівняльне дослідження пошкоджуючої дії різних джерел випромінювання (джерела 137Cs і 60Co) у різні пострадіаційні терміни;
3. Визначити дію іонізуючої радіації на складові компоненти ендотелій-залежного розслаблення судин;
4. Визначити вплив радіації на процес індукованого звільнення дилататорних ендотелій-залежних чинників;
5. Визначити ефективність терапевтичних донорів оксиду азоту при дії іонізуючого випромінення;
6. Дослідити процес відновлення чутливості судин до NO-донорів протягом пострадіаційного періоду;
7. Визначити можливість фармакологічної корекції індукованих радіацією порушень реактивності судинної стінки за допомогою фосфатидилхолінових ліпосом і a-токоферолу.
Об'єкт дослідження: порушення скорочувальної активності кровоносних судин тварин, що зазнали іонізуючого опромінення, та експериментальне обгрунтування методів фармакологічної корекції виявлених змін.
Предмет досліджень: судини експериментальних тварин (кролів, щурів).
Методи дослідження: фармакологічні, фізіологічні, електрофізіологічні, хемілюмінесцентні, статистичні.
Наукова новизна роботи: Вперше показано, що іонізуюча радіація викликає дозо-залежне пригнічення ендотелій-залежних реакцій і збільшення чутливості судинної стінки до констрикторних впливів. Встановлено, що ступінь зміни реактивності судинної стінки залежить від виду судин, дози опромінення, природи джерела випромінювання і тривалості пострадіаційного періоду. Показано, що пригнічення дилататорної спроможності ендотелію корелює із збільшенням рівня вільно-радикальних процесів у плазмі крові і судинній стінці для широкого діапазону доз іонізуючого опромінення.
Вперше показано, що пригнічення дилататорної функції ендотелію виникає внаслідок пригнічення NO-залежного компоненту розслаблення, що пов'язаний з ендотеліальною NO-синтазою. Встановлено, що компонент розслаблення, що зв'язаний з ендотелій-залежним гіперполяризуючим чинником, у меншому ступені піддається впливу іонізуючої радіації і майже цілком визначає ендотелій-залежне розслаблення судин опромінених тварин.
Вперше встановлено, що незважаючи на пригнічення NO-залежної компоненти розслаблення при дії іонізуючої радіації, звільнення дилататорних чинників при стимуляції ендотелію опромінених судин не зменшується. Показано, що чутливість до оксиду азоту стінки судин підвищується після опромінення і не залежить від наявності ендотелію, тоді як чутливість до NO здорової судини підвищується при видаленні ендотелію.
Вперше встановлено, що дилататорна ефективність терапевтичних донорів оксиду азоту зменшується після іонізуючого опромінення, причому ступінь пригнічення дилататорної спроможності збільшується пропорційно експозиційній дозі. Показано, що ступінь пригнічення розслаблюючої ефективності різний для різних нітровазодилататорів.
Встановлено, що застосування a-токоферолу суттєво послаблює індуковані радіацією зміни реактивності судинної стінки і перешкоджає пригніченню NO-залежної компоненти ендотелій-залежного розслаблення.
Вперше показано, що введення фосфатидилхолінових ліпосом відразу після опромінення перешкоджає розвитку радіаційних змін реактивності судинної стінки.
Позитивний відновлюючий ефект при застосуванні ліпосом спостерігається як для ендотелій-залежних вазодилататорів, так і для нітросполук.
Встановлено, що профілактичне застосування фосфатидилхолінових ліпосом малоефективне, а їх ефективність виявляється лише в лікувальному режимі застосування.
Безпосередній вплив ліпосом на опромінені судини в умовах in vitro призводить до відновлення пригніченої радіацією NO-залежної компоненти ендотелій–залежного розслаблення, але не впливає на пригнічену чутливість судинної стінки до донорів оксиду азоту.
Практичне значення роботи: Результати проведених досліджень розкривають нові прояви пошкоджуючої дії іонізуючої радіації щодо кровоносних судин, які проявляються в суттєвому порушенні судинної реактивності до вазоактивних речовин. Встановлено основні закономірності розвитку цих порушень, що проявляються у появі схильності уражених судин до вазоконстрикції й ослаблення дилататорних властивостей судинної стінки. Отримані характеристики радіаційного впливу на вазодилататорну активність низки терапевтичних донорів оксиду азоту дозволять уточнити умови й ефективність їхнього застосування в умовах підвищеного радіаційного фону та оцінити доцільність використання нітровазодилататорів для пацієнтів, що зазнали опромінення.
Встановлені механізми ендотеліальної дисфункції і визначення ступеня радіочутливості різних компонент ендотелій-залежного розслаблення дозволять здійснити цілеспрямований пошук фармакологічних агентів, спроможних відновлювати або компенсувати ушкоджені радіацією ланки ендотеліального контролю судинного тонусу.
Запропоновано нову схему виникнення судинної дисфункції після опромінення, що включає як складові частини вільнорадикальні процеси, порушення ендотеліальної функції і зміни транспортних (дифузійних) властивостей ендотелію, а також процеси ушкодження м'язової компоненти судинної стінки. Передбачається, що цей механізм носить універсальний характер, притаманний, імовірно, не лише радіаційним, але і багатьом іншим судинним патологічним станам.
Для відновлення порушеної після променевого впливу ендотеліальної функції кровоносних судин запропоновано застосовувати фосфатидилхолінові ліпосоми (препарат "Ліпін", випускається в Україні). Одержано патент на винахід №50582. Встановлено позитивну протекторну дію вітаміну E при його застосуванні безпосередньо після променевого впливу.
Виявлена одна з особливостей дії фосфатидилхолінових ліпосом, - відновлення функціональної дилататорної активності ендотелію, що може визначити новий напрямок пошуку фармакологічних засобів для лікування пригніченої ендотеліальної функції при судинних патологіях різного походження. Отримані дані формують передумови для створення нового класу фармакологічних засобів, що взаємодіють із судинним ендотелієм і покращують або відновлюють його цілісність та безперервність - ендотеліотропних засобів.
Результати роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах фармакології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, Одеського державного медичного університету, Вінницького державного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Луганського державного медичного університету, Львівського державного медичного університету ім. Д. Галицького, Національної фармацевтичної академії України, Української медичної стоматологічної академії, м. Полтава.
Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи особисто розроблено програму наукових досліджень, самостійно здійснено дослідження, аналіз та узагальнення отриманого експериментального матеріалу, підготовка первинних даних для обробки ПЕОМ, порівняльний статистичний аналіз, дисперсійний та кореляційний аналізи на ПЕОМ, сформульовано основні положення та висновки роботи. Частину матеріалу було отримано під час спільних експериментів у лабораторії експериментальної кардіології Українського науково-дослідного інституту кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска МОЗ України (завідувач – д. мед. н., проф. В.В. Братусь, матеріал по гіперхолестеринемії), відділі нервово-м'язової фізіології інституту фізіології ім О.О. Богомольця (керівник – д. мед. н., акад. М.Ф. Шуба, дані відносно дії апаміну та нітросполук на гладенькі м'язи), у співавторстві з к.б.н. Г.І. Плющ, з якими автор має спільні публікації.
Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались та обговорювались: на III съезде кардиологов УССР (Черновцы, 1988); 5th International symposium “Physiology and pharmacology of smooth muscle” (Varna, 1988); Всесоюзном симпозиуме патофизиологов (Кишинев, 1989); IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Москва, 1989); Пленуме правления Украинского научного кардиологического общества “Нарушение ритма сердца и проводимости” (Запорожье, 1990); Украинской научно-практической конференции, УНЦРМ (Киев, 1992); Х научной конференции “Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях” (Санкт - Петербург, 1992); 2nd International Symposium "Endothelium - Derived Vasoactive Factors" (Basel. Switzerland. 1992); II Радиобиологическом съезде(Киев, 1993); IV съезде кардиологов Украины (15-17 сентября, Днепропетровск, 1993); Першому національному з"ізді фармакологів України "Сучасні проблеми фармакології" (Полтава, вересень 1995); 3-ем Симпозиуме ІДіагностика та профілактика негативних наслідків радіаціїІ (Київ, 16-17 грудня 1997 р); Конференции "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1998); XV з"їзді Українського фізіологічного товариства (Одеса, 1998); V Российском национальном конгрессе ''Человек и лекарство'' (Москва, 1998); Second Workshop of Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor (Abbaye des Vaux de Cernay. France, 1998); Конференции "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1999); III національному конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000); First International Conference "Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide" (Hyatt Regency Hotel. San Francisco. USA. 2000); Third Workshop on Endothelium-Derived Hyperpolarizing Factor. (Abbaye des Vaux de Cernay. France.-2000); Науково-практичної конференції "Експериментальна радіобіологія" (до 15-ї річниці Чорнобильскої катастрофи) (24-25 квітня 2001р, Київ); Международном симпозиуме "Функциональная роль монооксида азота и пуринов" (Минск, 2001); 2nd European Meeting on Vascular Biology and Medicine (Germany, September 27-29, 2001); II Національному з"ізді фармакологів України "Фармакологія 2001 – крок у майбутнє" (1-4 жовтня 2001 р. Дніпропетровськ); II Международной конференции "Микроциркуляция и ее возрастные изменения" (22-24 мая 2002 г. Киев); Науково-практичної конференції "Експериментальна радіобіологія" (21-22 травня 2002 р. Київ).
Публікації: За матеріалами досліджень опубліковано 50 наукових робот: 25 статей, із них 4 в зарубіжних виданнях та 21 у наукових фахових журналах, 24 тези конференцій, симпозіумів та з'їздів, одержано 1 патент на винахід і отримано позитивне рішення про видачу 1 патенту на винахід.
Структура та об'єм роботи. Дисертаційна робота викладена на 240 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, восьми розділів, що містять матеріали і методи, результати власних досліджень, обговорення результатів, висновків, списку використаних джерел, який містить 423 джерела, в тому числі 298 англомовних публікацій. Робота ілюстрована 4 таблицями, 42 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Предметом досліджень були кільцеві сегменти грудної аорти та сонної артерії кролів породи "Шиншила", кільцеві сегменти грудної аорти щурів лінії Wistar і спонтанно гіпертензивних щурів. В експериментах із гіпоксичними розчинами були використані кільцеві сегменти проксимальної частини епікардіальних коронарних артерій, що виділені із серця дорослих свиней.
Умови опромінення тварин. Експериментальні тварини піддавалися загальному, одноразовому зовнішньому g-опроміненню з використанням джерел "Ігур" (137Cs) і "ТГТ Рокус-М", Росія (60Co). Потужність дози при опроміненні кролів від джерела "Ігур" (137Cs) складала 0,307 Гр/хв, а при опроміненні джерелом "Рокус" (60Co) вона знаходилась у межах 0,80-0,845 Гр/хв для кролів і 0,833-1,0 Гр/хв для щурів у залежності від стану джерела на момент опромінення. Тварини опромінювались у дозах 1, 2 і 4 Гр при використанні джерела 137Cs і 2, 4 і 6 Гр при використанні 60Co. Гострий експеримент проводився на 7-9-й і 30-35-й дні після опромінення.
Реєстрація скоротливої активності. Реєстрація скоротливої активності м'язових сегментів здійснювалася в ізометричному режимі за допомогою датчиків напруги, у якості яких використовувались механотрони 6МХ1С, або перетворювачі type DY1 (Ugo Basile, Italy), чи спеціально сконструйовані калібровані датчики напруги ємнісного типу. Запис скорочення здійснювався за допомогою самописців моделей Н3031-4 або model 202, Cole-Parmer Instrument Company, USA.
Відпрепаровані судини розміщувались у робочій камері між стаціонарним гачком і штоком датчика напруги, де витримувались до початку експерименту не менш ніж 1 год під навантаженням 20-30 мН для грудної аорти кролів, 10-15 мН для сонної артерії кролів, 10-12 мН для аорти щурів і 30-40 мН для коронарних артерій свині. Перфузія препаратів здійснювалась термостатованим (36-37 oС) стандартним розчином Кребсу зі швидкістю 1 мл/хв. Під час перфузії розчином Кребсу кільцевих сегментів судин проводилась періодична (4-5 разів) їх стимуляція хлористим калієм у концентрації 60 ммоль до одержання стабільних скорочувальних відповідей. Гіперкалієвий розчин готувався заміщенням NaCl еквімолярною кількістю KCl, що дозволяло уникнути зміни осмотичності розчину.
Деендотелізація судин проводилась або шляхом механічної руйнації ендотелію, або хімічно при інкубації м'язових препаратів протягом 8-10 хв у розчині, що містив сапонін у концентрації 0.1 мг/мл. Якість видалення ендотелію оцінювалась по ступеню пригнічення реакцій на ацетилхолін для судин кролів і щурів, а також на А-23187 для коронарних артерій свині.
Дослідження дилататорних реакцій проводилося на фоні попереднього скорочення ГМК коронарних артерій свині і судин щурів та кролів хлористим калієм (60 ммоль/л) і фенілефрином (10-5 моль/л), відповідно. Даний рівень тонусу приймався за вихідний (100%) і всі судинні реакції вимірювались щодо цього рівня. Опромінення тварин не впливало на максимальну величину скорочення на фенілефрин, тому процедура нормування дилататорних реакцій вважалася правомірною. Для того, щоб виключити участь простацикліну в ендотелій-залежному розслабленні на АХ, усі експерименти (крім спеціально обговорених випадків) були проведені на фоні індометацину (5Ч10-6 моль/л).
Електрофізіологічні методи досліджень. Кільцеві сегменти аорти виверталися ендотелієм назовні і закріплювалися на двох горизонтальних гачках із нержавіючої сталі в робочій камері, що постійно перфузувалась розчином Кребсу при температурі 37 оС. Скляні мікроелектроди заповнювались розчином хлористого калію (3 моль/л) і мали опір у діапазоні 60-80 МОм. Введення мікроелектродів здійснювалось з інтимальної сторони судинного сегменту за допомогою мікроманіпулятора М-360-90 (Newport, USA) з устроєм мікроподачі Model ESA-CSA (Newport, USA). Для реєстрації трансмембранного потенціалу використовувався мікроелектродний підсилювач MZ-4 (Nihon Kohden, Japan), сигнал із якого надходив на аналого-цифровий перетворювач Digidata 1200 (Axon Instruments, USA). Накопичення й обробка даних здійснювались за допомогою програми Axoscope 7.0 (Axon Instruments, USA). Введення АХ проводилось через 2-3 хв після одержання стабільного мембранного потенціалу. Потім препарат відмивали і додавали досліджувані блокатори ендотелій-залежного розслаблення, які діяли протягом 30-35 хв, після чого здійснювалося повторне введення мікроелектроду в клітину і реєстрація реакції на АХ.
Хемілюмінесцентні методи досліджень. Безпосередньо приготована сироватка крові (1 мл), або 25 мг подрібненої стінки судини в 1 мл фізіологічного розчину, поміщались у кювету хемілюмінометра ХЛМ 1Ц-01 і реєструвалось спонтанне світіння протягом 5 хв. Потім у кювету додавали 0,5 мл 3%-ного розчину пероксиду водню і знову записували хемілюмінограму протягом того ж відрізку часу. Рівень максимального піка світіння (Imax) свідчив про кількість вільних радикалів, що утворилися з органічних і неорганічних гідропероксидів. Рівень мінімального піка (Imin) давав можливість оцінювати вміст радикалів, що залишились у середовищі. Характер динаміки зниження інтенсивності світіння дозволяв оцінити активність усього процесу зв'язування вільних радикалів, т.с. рівень антиоксидантного захисту.
Приготування розчину оксиду азоту. Вихідний розчин оксиду азоту готувався розчиненням газоподібного NO у попередньо підготовленій бідистильованій деіонізованій воді. Процедура підготовки води полягала в повному витісненні із води кисню шляхом пропускання через неї протягом 2 год газоподібного аргону. Концентрація NO у базовому насиченому розчині складала 3,3 ммоль при 0 оС і 1,91 ммоль при кімнатній температурі (20 оС). Для визначення концентрації вільного NO використовувався амперометричний вимірювач NO (ISO-NO, World Precision Instruments, Inc.). Виміри проводились за допомогою датчика ISO-NOP діаметром 2мм. За звичай чутливість електроду складала 1пА=0,78 нмоль NO. Власний шум і ''дрейф'' електрода були близько 10 пА, а мінімальна концентрація NO складала 10-8 моль/л.
Методика "донор - детектор". Для реєстрації стимульованої секреції дилататорних чинників із ендотелію досліджуваних судин застосовувалася методика "донор - детектор" у конфігурації типу "сендвич". У якості донора використовувались сегменти грудної аорти контрольних і опромінених кролів (шириною 3 мм). Препарати закріплювались у робочій камері між двома вертикальними гачками з нержавіючої сталі діаметром 1,2 мм при початковій напрузі 30-35 мН. Один із гачків був закріплений стаціонарно на дні робочої камери, а другий з'єднувався зі штоком тензометричного датчика. Критерієм цілісності і функціональної повноцінності ендотелію судинних препаратів була наявність стабільних реакцій на ацетилхолін 10-5 моль/л. Попереднє скорочення донора проводилось за допомогою фенілефрину в концентрації 10-5 моль/л.
У якості детектора використовувалися сегменти сонної артерії здорових кролів (шириною 1-1,5 мм). Судинні препарати виверталися ендотелієм назовні і закріплювались при початковій напрузі 10-15 мН між двома вертикальними гачками з нержавіючої сталі діаметром 0,5 мм, один із яких був прикріплений до штоку ємнісного тензометричного перетворювача, а другий приєднувався до системи розтягу препарата. Вся система детектора монтувалась на мікроманіпуляторі MD4R (World Precision Instruments, Inc. USA), що дозволяло переміщувати препарат-детектор у будь-яке необхідне положення. Спочатку детектор розташовувався в окремій ванночці з розчином Кребсу при температурі 37 оС, у якій проводились всі необхідні процедури підготовки і кондиціонування. Потім проводилась хімічна деендотелізація судин за допомогою сапоніну в концентрації 0,1 мг/мл протягом 8-10 хв. Якість видалення ендотелію оцінювалась за ступенем пригнічення реакцій на ацетилхолін і появі при його дії констрикторних реакцій. Деендотелізований детектор за допомогою маніпулятора переносився в камеру з донором і при контролі мікроскопом поміщався усередину донорського судинного сегменту. У такій конфігурації додавання АХ у робочу камеру викликало розслаблення як донора, так і детектора. Ступінь розслаблення детектора приймався за міру кількості дилататорних чинників , що виділилися з ендотелію.
Експериментальна гіперхолестеринемія. Аліментарну гіперхолестеринемію (ГХЕ) відтворювали у кролів шляхом їх утримання на атерогенній дієті із розрахунку 0,2 г холестерину на 1 кг маси тіла на добу протягом всього експериментального періоду. Загальний рівень холестерину в крові визначали за допомогою автоаналізатора Technicon-AA-II (USA). Його величина складала 1,74±0,25, 9,05±0,60 і 17,21±2,5 ммоль/л у контролі і через 1 і 2 місяці ГХЕ відповідно. Опромінення тварин здійснювалось за 1 год до першого введення холестерину.
Методи досліджень у гіпоксичних умовах. Зниження оксигенації здійснювалось пропусканням через тестовий розчин Кребсу газоподібного азоту. Вже на 3-ей хв деоксигенації напруга розчиненого кисню знижувалась з 140-145 до 3-5 мм рт. ст., після чого концентрація О2 у розчині стабілізувалась і подальших змін не спостерігалось. Крім того, тестова камера з м'язовими препаратами постійно знаходилась в атмосфері азоту, що також перешкоджало зміні напруги розчиненого кисню протягом досліду за рахунок обміну з атмосферним О2. Напруга рО2 контролювалась протягом експерименту за допомогою полярографа ISO-O2 (World Precision Instruments, Inc. USA).
Гіпертензивні тварини. Досліди проводились на щурах із генетично детермінованою гіпертензією (300-350 г). Величина середнього артеріального тиску цих тварин складала 183±15 мм рт. ст. (83±8 мм рт. ст. у інтактних щурів). Вимір тиску здійснювався в хвостових артеріях за допомогою вимірювального комплексу Sphygmomanoneter S-2 (HSE, Germany).
Статистична обробка даних. Всі наведені дані подані у вигляді середнього арифметичного ± помилка середнього арифметичного. Залежності доза-ефект і значення максимальних величин реакцій при різноманітних впливах порівнювались за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і наступних посттестів із використанням методу Бонферроні для множинних порівнянь і методу Тьюкі. Величини ЕД50 і амплітуд максимального розслаблення для залежностей доза-ефект були отримані із апроксимації експериментальних даних кривою Хілла, що була побудована за методом найменших квадратів. Порівняння отриманих величин проводилось за методом Стьюдента для непарних вимірів. У експериментах із NO-донорами для порівняння даних для тварин контрольної і опроміненої груп також користувались t-тестом Стьюдента. Розходження вважались статистично достовірними, якщо величина р була менше 0,05. Усі розрахунки проводили з використанням програм Origin 6.1 (OriginLab Corporation, USA) і EXEL 5.0 (Microsoft, USA) на персональному комп'ютері IBM HP Vectra Pentium.
Речовини і фармакологічні препарати. У експериментах використовувався розчин Кребсу наступного складу (у ммоль): NaCl 133; KCl 4.7; NaHCO3 16.3; NaH2PO4 1.38; CaCl2 2.7; MgCl2 1.1; глюкоза 7.77, р 7.3. У розчинах із підвищеним вмістом К+ замість NaCl додавали еквімолярну кількість KСl. рН 7.3 доводився титруванням розчину за допомогою HCl або NaOH.
В експериментах використовувались такі препарати: фенілефрин, ацетилхоліну гідрохлорид, нітропрусид натрію, SIN-1, нітрит натрію, Nw-нітро-L-аргінін, апамін, харибдотоксин та індометацин фірми Sigma (St. Louis, USA), нітрогліцерин фірми Bio-Therabel (Brussels, Belgium), A23187 фірми Calbiochem-Behring (La Jolla, USA), ліпін фірми Біолек (Харків).
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження впливу іонізуючої радіації на констрикторні властивості судинної стінки. Величини фенілефринового скорочення грудної аорти і сонної артерії не змінювались при дії іонізуючої радіації аж до дози 4 Гр і 6 Гр при використанні джерела 137Cs і 60Co відповідно. На відміну від фенілефрину, при дослідженні скоротливих реакцій на інші вазоконстриктори була виявлена тенденція до їхнього збільшення в судинах опромінених тварин (рис. 1). Були вивчені скоротливі ефекти норадреналіну (НА), і гіперкалієвого розчину (KCl). Вже на 7-9-й день після опромінення джерелом 137Cs у дозі 2 Гр у грудній аорті і сонній артерії спостерігалось вірогідне збільшення скоротливих реакцій як на НА, так і на KCl. При використанні джерела 60Со також спостерігалась тенденція до збіль-
Рис. 1. Зміни реактивності грудної аорти кроля на 9-у добу після опромінення тварин джерелами 137Cs і 60Со у дозі 4 Гр. НА, АХ и НГ – норадреналін, ацетилхолін і нітрогліцерин, концентрація усіх речовин 10-5 моль/л, KCl – хлористий калій (60 ммоль/л).
шення констрикторних відповідей, але статистичний аналіз не виявив вірогідної зміни скорочувальних реакцій.
Таким чином, судини опромінених тварин набувають виражену схильність до підвищеної констрикції, причому ступінь цього підвищення збільшується зі збільшенням дози опромінення. У грудній аорті ці зміни проявляються сильніше в порівнянні із сонною артерією. Пошкоджуюча здатність джерела 137Cs щодо збільшення чутливості судин до вазоконстрикторів вище в порівнянні з джерелом 60Co при рівних дозах опромінення.
Вплив іонізуючої радіації на дилататорні властивості судинної стінки. Було досліджено декілька дилататорних агентів, що мають різні механізми дії: 1. Ацетилхолін (АХ) - ендотелій–залежний вазодилататор; 2. Нітрогліцерин (НГ) - ендотелій–незалежний вазодилататор; 3. Ізопреналін - b-адреноміметик; 4. А-23187 - кальцієвий іонофор, що викликає розслаблення при взаємодії з мембранами ендотеліоцитів та утворення в них селективних пор, що сприяють входу в ендотеліоцит іонів Са++ з наступним виділенням ендотелієм вазоактивних субстанцій.
Опромінення тварин джерелом 137Cs у дозі 4 Гр уже на 7 –9-й день призвело до істотного пригнічення (більш ніж на 50%) дилататорних реакцій на ацетилхолін, нітрогліцерин і А-23187 як у грудній аорті, так і в сонній артерії (рис. 1). Реакція на ізопреналін вірогідно не змінювалась в обох типах судин. Дилататорні ефекти використаних вазодилататорів у більшому ступені ослаблені у грудній аорті в порівнянні із сонною артерією. Такі ж закономірності встановлені і для судин тварин, опромінених джерелом 60Co, хоча ступінь пригнічення дилататорних реакцій був дещо меншим (30-40%) у порівнянні з джерелом 137Cs. У цих умовах також не спостерігалося достовірної зміни величин розслаблення обох
Рис. 2. Реакції грудної аорти здорових і опромінених (137Cs, 9-й день після опромінення) кролів при дії ацетилхоліну (АХ) і кальцієвого іонофору А-23187. А - залежності концентрація-ефект для АХ, Еm = 54,0±3,0 і 39,6±3,4 %, pЕД50 = 6,63±0,10 і 7,09±0,16 для здорових і опромінених судин відповідно. Суцільні лінії - логістична апроксимація. Б - залежності доза радіації-ефект для АХ (10-5 моль/л) і А-23187 (10-6 моль/л). Розслаблення виражене у відсотках щодо скорочення на фенілефрин 10-5 моль/л; * - p<0,05, n = 15-17.
типів судин на ізопреналін. Зі збільшенням дози опромінення дилататорні реакції судин на А-23187 зменшувалися в тому ж ступені, що й ефекти АХ (рис. 2). Залежності доза опромінення-ефект для АХ і для А-23187 у даному діапазоні доз з високим ступенем точності описувалися лінійним рівнянням, причому нахили ліній регресії були однакові для обох вазодилататорів (близько 14% на 1 Гр). Факт однакового пригнічення рецептор-залежних і незалежних дилататорних реакцій, що мають загальний кінцевий ланцюг - виділення з ендотелію вазоактивних субстанцій - дозволяє зробити висновок, що радіаційний вплив не призводить до
істотних ушкоджень холінорецепторного апарату ендотеліальних клітин кровоносних судин.
Дія іонізуючої радіації викликала достовірне зменшення максимальної величини розслаблення на АХ, а також приводила до зміщення залежності доза-ефект вліво в область менших концентрацій АХ (рис. 2). Наявність зміщення кривих вліво дозволяє зробити висновок про те, що в результаті радіаційного впливу поряд з пригніченням максимального ефекту АХ, відбувається збільшення чутливості судинної стінки до цього вазодилататора.
Таким чином, дія іонізуючої радіації призводить до пригнічення дилататорних реакцій, у яких посередником є ендотелій і продукти його секреції. Радіація несуттєво впливає на дилататорні реакції, опосередковані адренорецепторною взаємодією. І, нарешті, в опромінених судинах у значній мірі пригнічені реакції, що опосередковані оксидом азоту.
Порівняльне дослідження впливу іонізуючої радіації на різні судини. Іонізуюча радіація викликає однонаправлені зміни реактивності як грудної аорти, так і сонної артерії. Ці зміни проявляються в підвищенні реактивності судинної стінки до констрикторних агентів і зменшенні її до дилататорних впливів. Проте зменшення ефективності вазодилататорів відбувається в різному ступені для різних судин. Ступінь пригнічення реакції розслаблення на ацетилхолін пропорційний дозі опромінення і з високою точністю описується лінійним рівнянням як для грудної аорти, так і для сонної артерії. Проте нахил цієї залежності вірогідно вищий для препаратів грудної аорти в порівнянні із сонною артерією (14,7±1,3 і 8,5±1,6 %/Гр відповідно, p<0,05, n=12-16). Цей факт указує на те, що ендотелій-залежні реакції більш чутливі до дії радіації в грудній аорті, що припускає більший ступінь ушкодження ендотелію цих судин. Зі збільшенням дози опромінення падає здібність іонофору А-23187 щодо ендотелій-залежного розслаблення, причому величина пригнічення корелює з величиною зменшення ефектів ацетилхоліну для обох типів судин. Проте відносне пригнічення реакцій на А23187 також більше в грудній аорті в порівнянні із сонною артерією (14,8±1.0 і 9,9±1.6 %/Гр відповідно, p<0,05, n=12-16).
Розслаблення судинної стінки у відповідь на b-стимуляцію ізопреналіном, що здійснює свій вплив без посередництва ендотелію і за рахунок прямої взаємодії з гладеньком'язовими клітинами, у меншому ступені підпадає під дію іонізуючої радіації в обох типах судин, ніж ендотелій-залежне розслаблення. Достовірного зменшення величин реакцій на ізопреналін не спостерігалось аж до дози 4 Гр (137Cs) як у грудній аорті, так і в сонній артерії.
Реакції на нітрогліцерин, який також є ендотелій-незалежним вазодилататором, істотно пригнічуються при дії іонізуючої радіації, причому ступінь пригнічення зростає зі збільшенням дози опромінення в обох типах судин. Проте нахил залежностей величин максимальних реакцій на нітрогліцерин від дози іонізуючої радіації вірогідно не відрізняється для грудної аорти і сонної артерії (15,7±4,5 і 8,7±3,7 %/Гр відповідно, p>0,05, n=12-16), що може свідчити про однаковий вплив іонізуючої радіації на процеси, які викликають розслаблення ГМК різних судин під дією NO і не пов'язані з ендотелієм.
Таким чином, іонізуюча радіація може по різному ушкоджувати різні судини однієї тварини. Грудна аорта більш чутлива до дії радіації, у порівнянні з сонною артерією. Ця різниця в першу чергу стосується ендотелій-залежних впливів, тоді як реактивність судин до ендотелій-незалежних вазодилататорів або не піддається впливу іонізуючої радіації (b-адреноміметики), або страждає в однаковій мірі в обох судинах (нітросполуки).
Опромінення різними джерелами іонізуючої радіації. Встановлено, що опромінення тварин різними джерелами призводить до кількісно різних результатів, хоча якісна спрямованість радіаційних ефектів однакова для 137Cs і 60Co. У обох випадках спостерігається посилення констрикторних і ослаблення дилататорних реакцій, проте ступінь зміни реактивності істотно різна. При опроміненні тварин джерелом 137Cs спостерігалася значно більш виражена зміна судинних реакцій на всі вивчені сполуки в порівнянні з опроміненням від джерела 60Co. На прикладі ендотелій-залежного розслаблення на ацетилхолін була вивчена порівняльна ефективність ушкоджуючої дії обох джерел іонізуючої радіації. Нахил залежностей доза іонізуючої радіації - ефект ацетилхоліну істотно і вірогідно вище для 137Cs у порівнянні з 60Co (14,7±2.1 і 7,98±1.1 %/Гр відповідно, p<0,05, n=12-16). Це означає, що опромінення джерелом 137Cs викликає в 1,5-2 рази більший пошкоджуючий ефект у порівнянні з 60Co при рівних дозах. Приблизно рівні і добре виражені ефекти зміни реактивності судин виявлялися при дозі опромінення 4 Гр для 137Cs і 6 Гр для 60Co. Саме при цих дозах іонізуючої радіації була проведена більшість експериментів. 137Cs і 60Co є джерелами g-випромінювання, проте енергії квантів цих джерел істотно відрізняються (660 кеВ і 1,21 МеВ відповідно). В даний час вважається, що незважаючи на значні відмінності енергій квантів, біологічна ефективність обох видів випромінювань однакова, а коефіцієнт біологічної ефективності дорівнює одиниці для обох джерел випромінювання. Проте проведені дослідження призводять до висновку про необхідність уточнення коефіцієнтів ОБЕ навіть у рамках випромінювань одного виду. Очевидно, необхідно з більшою обережністю ставитися до оцінки біологічної ефективності випромінювань різних джерел навіть однакової природи, але з різними енергіями квантів.
Таким чином, опромінення тварин джерелом 137Cs викликає більш виражений пошкоджуючий вплив на кровоносні судини і призводить до суттєвих змін судинної реактивності в порівнянні з джерелом 60Co. Рівні пошкоджуючі ефекти досягаються при дозах 4 Гр і 6 Гр для 137Cs і 60Co відповідно.
Скорочувальні властивості судинної стінки на різних пострадіаційних термінах. Отримані дані свідчать, що через 7-9 днів після одноразового загального опромінення спостерігається істотне пригнічення чутливості судинної стінки як до ендотелій-залежних, так і до ендотелій-незалежних вазодилататорів. Таке пригнічення не реєструється при вивченні судинних сегментів, узятих у тварин через 2 год після опромінення аж до доз 8 Гр (джерело 137Cs). Експерименти, проведені на 30-35 день після опромінення, показали, що подальший розвиток ушкоджень реактивності судинної стінки залежить у першу чергу від типу судини. У грудній аорті спостерігалося прогресуюче пригнічення відповіді на АХ у порівнянні з ранніми пострадіаційними строками, тоді як у сонній артерії не було зареєстровано подальшого зменшення цих реакцій, але і не спостерігалося їхнього відновлення. Пригнічення реакцій на нітрогліцерин після опромінення 137Cs у дозі 4 Гр також посилювалося і на 30-й день їхня величина ще більш зменшувалась у порівнянні зі значеннями, характерними для 7-9 дня. При опроміненні джерелом 137Cs у менших дозах (2 Гр), ефект прогресування не спостерігався і ступінь зменшення реакцій на АХ була однаковою на 9-у і 30-у добу. Реакції на нітрогліцерин у цих умовах також не змінювалися протягом дослідженого пострадіаційного періоду і не виявляли тенденції як до відновлення, так і до подальшого пригнічення. При опроміненні тварин джерелом 60Co спостерігалася дещо інша картина. Хоча реакції на АХ залишалися зменшеними на 30-й день після опромінення і не було виявлено достовірних відмінностей середніх величин АХ-індукованого розслаблення у порівнянні з 9-м днем, для частини судинних препаратів була виявлена тенденція до відновлення відповідей на АХ. На відміну від ендотелій-залежних реакцій, відповіді на нітрогліцерин відновлювались в значно більшому ступені. Хоча середні величини дилататорних реакцій на нітрогліцерин залишалися нижче контрольних, статистична обробка не виявила достовірних відмінностей їхніх значень від реакцій здорових судин.
Таким чином, можливість відновлення (репарації) пригнічених після опромінення дилататорних реакцій із часом залежить, очевидно, принаймні від трьох чинників: тип судини, вид іонізуючої радіації і доза іонізуючої радіації. Існує, очевидно, гранична доза опромінення, перевищення якої призводить до розвитку самопідтримуючих процесів, які посилюють пригнічення ендотелій-залежних реакцій із перебігом часу.
Таким чином, отримані дані свідчать, що іонізуюча радіація дуже змінює судинну реактивність. Характерними наслідками й особливостями дії іонізуючої радіації є: 1. Збільшення констрикторних реакцій судинної стінки у відповідь на впливи рецепторного і нерецепторного типу. 2. Ослаблення дилататорних реакцій судинної стінки як при ендотелій-залежних, так і при ендотелій-незалежних впливах. 3. Наявність пропорційної залежності між ступенем змін судинної реактивності і дозою іонізуючої радіації. 4. Залежність ступеня пошкодження іонізуючою радіацією від типу судин і від природи джерела g-випромінювання. 5. Можливість пострадіаційного відновлення судинної реактивності і її залежність від типу судин, природи джерела g-випромінювання й експозиційної дози радіації. 6. Більш висока спроможність до пострадіаційного відновлення ендотелій-незалежних механізмів вазодилатації у порівнянні з ендотелій-опосередкованими дилататорними механізмами.
Вільнорадикальні процеси у судинній стінці і плазмі крові після опромінення. Досліджувався характер зміни реактивності судинної стінки в різноманітні строки (7-9-й і 30-35-й дні) після однократного зовнішнього опромінення (137Cs, 2 і 4 Гр) паралельно з визначенням інтенсивності протікання вільнорадикальних процесів у тканині судин і плазмі крові. Про активність вільнорадикальних процесів судили за інтенсивністю спонтанної (СХЛ) та індукованої (ІХЛ) хемілюмінесценції в плазмі крові й у тканині стінки грудної аорти.
У судинній стінці спостерігалось різке наростання інтенсивності вільнорадикальних процесів, що проявлялось у суттєвому зростанні інтенсивності СХЛ, яка збільшувалась на 7-9-й день після опромінення, але практично нормалізувалась до 30-35-го дня при обох дозах іонізуючої радіації. При цьому спостерігалась виражена тенденція до відновлення також і параметрів ІХЛ, які були значно порушені у порівнянні з контролем до 7-го дня пострадіаційного строку.
У плазмі крові на 7-9-у добу після опромінення в дозах 2 і 4 Гр інтенсивність СХЛ була також вірогідно підвищена. На 30-35-у добу після опромінення показники СХЛ у сироватці крові нормалізувались при обох дозах опромінення. Однак на відміну від судинної стінки, у плазмі крові на 30-35-у добу спостерігалось подальше наростання змін параметрів ІХЛ - збільшувалась загальна світлосума, підвищувався мінімальний рівень світіння.
Отримані дані свідчать про те, що процес вільнорадикального окислення в крові, запущений радіаційним впливом, не припиняється протягом як мінімум 35 днів, тоді як у судинній стінці цей процес нормалізується до кінця терміну спостереження. Наявність кореляції між змінами реактивності судинної стінки і станом вільнорадикальних процесів дозволяє припустити провідну роль цих процесів як одного із факторів порушень скорочувальної активності судин.
Вплив іонізуючої радіації на ефективність донорів NO. Були досліджені широко відомі нітропрепарати: нітрогліцерин (НГ), нітропрусид натрію (НП) і нітрит натрію (НН), що відносяться до лікарських засобів і виявляють дилататорну дію на кровоносні судини за рахунок прямої стимуляції гладеньком'язових клітин судинної стінки. Проте механізми звільнення молекули оксиду азоту з цих сполук істотно відрізняються один від одного. НГ відноситься до непрямих донорів NO і потребує для виділення цієї молекули наявності мембранозв'язаних ферментів, що містять тіолові групи. НП вважається прямим донором NO, спроможним звільняти цю молекулу у водному розчині і, нарешті, НН утворює NO при конверсії NO2.
Встановлено, що ці препарати мають різну ефективність розслаблюючої дії на судинну стінку і величини їх максимальних ефектів істотно різняться (НП:НГ:НН – 1,2:1,0:0,4 для обох типів судин). Незважаючи на це, чутливість судинної стінки, мірою якої є концентрація, що викликає половинний ефект, однакова для всіх трьох препаратів у межах достовірності 95% (5.44±0.15, 5.61±0.11, 5.80±0.24 для НП:НГ:НН, p>0,05, n=10-16).
Вже на 7-й день після одноразового зовнішнього опромінення спостерігалося дозо-залежне пригнічення дилататорних реакцій судинної стінки грудної аорти у відповідь на дію всіх вивчених нітросполук. При дозі 1 Гр спостерігалась тенденція до зміни реактивності судинної стінки для усіх вивчених сполук, а при дозах 2 і 4 Гр зміни судинної реактивності збільшувались і набували достовірного характеру. На рис. 3А наведені залежності концентрація-ефект для НГ при різних дозах опромінення.
Зі збільшенням дози опромінення спостерігалось прогресуюче пригнічення максимальної дилататорної відповіді на ці нітровазодилататори. Крім того іонізуюча радіація призводила до достовірного зменшення ЕД50 (рЕД50 для НГ і НП – 6,15±0,20 і 6,63±0,33 в опромінених судинах, p<0,05 у порівняні з контролем, n=10-16). Необхідно зазначити, що аналогічне зміщення кривих доза-ефект після опромінення спостерігалось і для ендотелій-залежної реакції на ацетилхолін. Можливо, збільшення чутливості м'язових клітин судинної стінки до NO (у термінах зміни ЕД50) є характерною ознакою ушкоджень судинної реактивності, яка викликана дією іонізуючої радіації.
Ступінь зменшення дилататорних реакцій нітропрепаратів був приблизно пропорційним дозі іонізуючого опромінення (рис 3Б). Для НГ і НП спрямованість ефекту після опромінення залишалась незмінною, тоді як приблизно в половині дослідів НН викликав двофазну відповідь: розслаблення судинної стінки з'являлось після початкового скорочення, а в деяких випадках (особливо при дозі 4 Гр) спостерігалось збочення нормальної реакції і замість розслаблення виникало скорочення.
Ступінь радіаційного пригнічення дилататорної відповіді судинної стінки була різною для різних препаратів і зменшувалася у послідовності: НН-НГ-НП. Найбільше змінювалася дія НН. Зменшення реакції на НГ було майже таким, як для А-23187, а реакції на НП пригнічувались у найменшому ступені.
Таким чином, уже на ранніх строках після одноразового іонізуючого опромінення ефективність дії нітропрепаратів зменшується аж до збочення спрямованості дії, причому ці зміни носять характер тенденції при “малих” дозах (1 Гр) і набувають істотної вираженості при великих дозах (2 і 4 Гр).
Дія іонізуючої радіації на складові компоненти ендотелій-залежного розслаблення судин. Ендотелій–залежне розслаблення головним чином визначається трьома одночасно діючими факторами - оксидом азоту, простацикліном і ендотелій-залежним гіперполяризуючим фактором (ЕЗГФ), природа якого насьогодні остаточно не встановлена. Для визначення ступеня зміни кожної із цих ендотелій-залежних компонент і їх внеску в пригнічення інтегральної відповіді судинної стінки на АХ були використані селективні блокатори кожного з цих механізмів. Синтез простацикліну блокувався індометацином (5Ч10-6 моль/л). Його дія не призводила до достовірної зміни величини розслаблення, викликаного АХ (10-5 моль/л) як у судинах здорових, так і опромінених тварин. Додавання у робочу камеру із судинними препаратами Nw-нітро-L-аргініну (L-NA), синтетичного блокатора NO-синтази в концентрації 10-5-3Ч10-4 моль/л, призводило до скорочення м'язових смужок, причому цей ефект був цілком ендотелій-залежним (рис. 4А).
Рис. 4. Скорочувальні ефекти блокаторів NO-синтази (NOS) і калієвих каналів, зареєстровані на препаратах грудної аорти здорових і опромінених кролів. А - максимальні величини констрикторних ефектів, що виникають при дії Nw-нітро-L-аргініну (L-NA, 10-5 моль/л) і сапоніну (0,1 мг/мл); Е+ і Е- - судини з інтактним ендотелієм і денудовані судини; Б - реакції на ацетилхолін (10-5 моль/л) після застосування блокаторів протягом 30 хв; Ар - апамін (10-7 моль/л), Сх - харибдотоксин (10-7 моль/л). * - p<0,05.
Приблизно таке ж скорочення препаратів здорових судин викликала руйнація ендотелію сапоніном. Описані ефекти були повністю відсутні в судинних препаратах опромінених тварин. Отримані дані змушують припустити, що ендотелій здорових судин має виражену здібність до постійного базального синтезу NO, дія якого підтримує судинну стінку в стані деякого вихідного розслаблення. Усунення цього фонового звільнення NO при блокаді NO-синтази або при руйнації ендотелію призводить до скорочення судини. Відсутність цих ефектів у судинах опромінених тварин вказує на те, що дія іонізуючої радіації пригнічує базальну секрецію NO.
На 9-й день після опромінення максимальна величина реакції на АХ аорти опромінених кролів була значно знижена (рис. 4Б). Дія L-NA (3Ч10-4 моль/л) призводила до зменшення викликаного АХ розслаблення судин здорових тварин приблизно вдвічі, що свідчить про значний вклад NO у процес ендотелій-залежного розслаблення. На відміну від здорових судин, реакції на АХ судин опромінених тварин вірогідно не змінювались при дії L-NA. Ці дані також свідчать про серйозне ушкодження NO-залежної компоненти ендотелій-залежного розслаблення при дії іонізуючої радіації. Для визначення внеску ендотелій-залежного гіперполяризуючого фактору в АХ-індуковане розслаблення судин і ступеню його модифікації іонізуючою радіацією були використані блокатори калієвих каналів харибдотоксин (10-8 моль/л) і апамін (10-6 моль/л), спільна дія яких викликає блокування ЕЗГФ-індукованого розслаблення багатьох судин (Mombouli & Vanhoutte, 1997). В присутності цих блокаторів викликане АХ розслаблення зменшувалось приблизно на 50% у здорових судинах, і повністю зникало у судинах опромінених тварин. Додаткове внесення 300 мкмоль L-NA призводило до усунення викликаного АХ розслаблення також і у здорових судинах.
Таким чином, при дослідженні внеску NO-залежної і ЕЗГФ компонент в інтегральне ендотелій-залежне розслаблення здорових і опромінених судин було встановлено, що при опроміненні значною мірою страждає NO-залежна компонента ендотелій-залежного розслаблення, тоді як ЕЗГФ-компонента мало піддається ушкоджуючому впливу іонізуючої радіації.
Дія іонізуючої радіації на ендотелій-залежну гіперполяризацію м'язових клітин судин. Для того, щоб кількісно оцінити величину гіперполяризації, що супроводжує розслаблення гладеньком'язових клітин грудної аорти кролів, викликане АХ, були проведені електрофізіологічні експерименти з використанням мікроелектродної техніки. Було встановлено, що потенціал спокою ГМК не змінювався після опромінення тварин у дозі 6 Гр джерелом 60Co (62,4±3,8 мВ, n=12 і 63,6±4,8 мВ, n=10, p>0.05 для здорових і опромінених судин відповідно). При дії АХ на судинні препарати здорових тварин виникала транзиторна гиперполяризація мембрани ГМК тривалістю близько 3-х хв і амплітудою 18,3±2,3 мВ (n=8). Дія L-NA зменшувала пікову амплітуду цієї гіперполяризації до величин порядку 10 мВ (рис. 5А). Наявність пригнічення АХ-индукованої гіперполяризації змушує припустити, що принаймні частина відповіді на АХ обумовлена дією NO, що виділяється ендотеліем. Крім того, у ГМК грудної аорти добре виражена і
Рис. 5. Вплив Nw-нітро-L-аргініну (L-NA, 3Ч10-4 моль/л) на гиперполяризацію, викликану дією ацетилхоліну (АХ, 10-5 моль/л) на гладеньком'язові клітини грудної аорти контрольних і опромінених кролів (джерело 60Co, 6 Гр). А - експериментальні записи, контрольні тварини. Б – максимальна величина гіперполяризації; * - p<0,05, n = 6-8.
інша, L-NA-резистентна компонента реакції гіперполяризації. Спільна дія L-NA, харибдотоксину (10-8 моль/л) і апаміну (10-6 моль/л) на судинні препарати здорових тварин призводила до повного зникнення гіперполяризації, викликаної ацетилхоліном, і зміни потенціалу в цих умовах не спостерігалося. На відміну від здорових судин, гиперполяризація, викликана АХ у ГМК судин опромінених тварин була нечутливою до впливу L-NA (рис. 5Б), проте зникала при додаванні в розчин харибдотоксину і апаміну. Таким чином, отримані дані підтверджують висновок про пригнічення іонізуючою радіацією головним чином NO-залежної компоненти ендотелій-залежних реакцій судинної стінки. ЕЗГФ-індукована гиперполяризація, а, отже, і ЕЗГФ-активоване розслаблення не змінюються під впливом опромінення.
Чутливість до екзогенного оксиду азоту судинної стінки здорових і опромінених тварин. Екзогенний NO викликав тривале дозо-залежне розслаблення судинних препаратів у діапазоні концентрацій 10-9 - 10-4 моль/л (час напівспаду реакції близько 3-х хв), а час досягнення максимального ефекту був значно меншим у порівнянні з донорами NO (21,4±2,9 с, n=12, 60,0±5,4 с, n=14 і 52,3±3,9 с, n=12 для NO, НГ і НП відповідно). Чутливість до екзогенного NO судин здорових тварин залежала від наявності ендотелію, збільшуючись при його руйнації. При механічній руйнації ендотелію здорових судин максимальна реакція на NO вірогідно зростала (66,4±3,6%, n=12 і 78,6±4,5%, n=10, p<0.05). Вплив іонізуючої радіації призводив до втрати залежності реакції на NO від наявності ендотелію, а максимальна величина ефекту при усуненні ендотелію не змінювалась (76,5±4,9%, n=10 і 73,2± 5,5% n=11, p>0.05 для судин із інтактним і видаленим ендотелієм відповідно). Слід зазначити, що величини розслаблення на екзогенний NO приблизно співпадали для опромінених судин і здорових судин із зруйнованим ендотелієм.
Рис. 6. Реакції розслаблення на ацетилхолін (10-5 моль/л) сегментів грудної аорти і сонної артерії контрольних і опромінених (60Co, 6 Гр, 9-й день після опромінення) кролів у системі "донор-детектор". Донор - сегменти грудної аорти здорових і опромінених кролів; Детектор - сегмент сонної артерії здорових кролів, той самий для здорового й опроміненого донора; ФХЛ – фосфатидилхолінові ліпосоми; * - p<0.05, n=10.
Таким чином, ендотелій судин є структурою, що контролює чутливість ГМК судин до екзогенного оксиду азота. Його наявність дещо послаблює ефективність дії NO і зменшує чутливість до нього м'язових клітин судинної стінки. Опромінення тварин призводить до втрати цих контролюючих властивостей і ендотелій перестає впливати на ефекти екзогенного NO.
Донор-детектор. Секреція дилататорних чинників при стимуляції ендотелію досліджувалася в системі "донор-детектор", коли детектором був сегмент сонної артерії здорового кроля з вилученим ендотелієм, а донорами були сегменти грудної аорти здорових і опромінених тварин. Оскільки звільнений від ендотелію детектор, розташований поблизу донора, не розслаблюється при дії ацетилхоліну, ступінь його розслаблення відображає кількість дилататорних агентів, що виділяються при дії АХ із стінки судини-донора. Встановлено, що при дії АХ індуковане розслаблення детектора вірогідно вище при використанні в якості донора опроміненої судини в порівнянні зі здоровою (рис.6), хоча власне розслаблення препаратів-донорів опромінених тварин значно зменшено у порівнянні зі здоровими судинами. Ці дані приводять до парадоксального висновку про збільшення секреції ендотелій-залежних дилататорних чинників ендотелієм опромінених судин при одночасному пригніченні величини розслаблення.
Фармакологічна корекція індукованих радіацією порушень реактивності кровоносних судин за допомогою фосфатидилхолінових ліпосом. Введення тваринам ФХЛ здійснювалось за трьома експериментальними протоколами. Суспензію ліпосом уводили кролям внутрішньочеревинно (30 мг/кг) за такою схемою: перша група - за 1 год до опромінення; друга група - через 1 год після опромінення; третя група - через 1 год після опромінення і потім через кожні 7 днів протягом 35 діб. Умови опромінення були однаковими для всіх трьох груп - використовувалося загальне зовнішнє однократне опромінення в дозі 6 Гр від джерела 60Co. Оцінка змін скоротливих властивостей судинної стінки проводилась для 3-х вазодилататорів: АХ - ендотелій-залежного дилататора, НГ - ензим-залежного дилататора і SIN-1 - "прямого" донора NO, що неферментативно звільнює молекулу NO у водному розчині.
Рис. 7. Максимальні ефекти ацетилхоліну (АХ), нітрогліцерину (НГ) і SIN-1 на грудній аорті контрольних і опромінених кролів (60Co, 6 Гр, 9-й день після опромінення). Колонки зліва направо: 1 - контроль; 2 - опромінення; 3 - введення тваринам фосфатидилхолінових ліпосом (ФХЛ) за 1 год до опромінення; 4 - судини опромінених тварин, у розчин Кребсу додавались ФХЛ 100 мкг/мл; 5 - введення тваринам ФХЛ через 1 год після опромінення. Усі речовини використані в концентрації 10-5 моль/л. * - p<0.05, n=14-17.
При додаванні ФХЛ у концентрації 100 мкг/мл у робочу камеру з кільцевими сегментами грудної аорти здорових тварин не спостерігалося достовірних змін реакцій на АХ, НГ і SIN-1. Судини опромінених тварин, на відміну від здорових, виявляли високу чутливість до ФХЛ. Вже через 15 хв дії ФХЛ величина реакції на АХ істотно збільшувалась і її значення наближались до величини розслаблення на АХ судин здорових тварин (рис. 7). Проте реакції на донори NO не тільки не відновлювались, але і дещо зменшувались при дії ліпосом. Ці факти змушують припустити, що ФХЛ призводять до відновлення тільки ендотелій-залежних дилататорних ефектів, і не відновлюють зменшену ефективність дії донорів NO.
При дослідженні судин тварин 1-Ї групи було встановлено, що введення ФХЛ до опромінення не вплинуло на ступінь зміни реактивності судинної стінки до досліджуваних вазодилататорів. Усі дилататорні реакції в судинах цих тварин зменшувались такою ж мірою, що й у судинах опромінених тварин без застосування ФХЛ (рис. 7).
Дія ФХЛ на судинні сегменти тварин 1-ї групи в умовах in vitro викликала такі ж ефекти відновлення реактивності судинної стінки, як і у судинах контрольних опромінених кролів. Величина розслаблення на АХ швидко і вірогідно збільшувалась і досягала значень, характерних для здорових судин. Величини реакцій на НГ і SIN-1 не збільшувались, більш того, спостерігалась тенденція до зменшення цих реакцій. Це означає, що уведення ФХЛ тваринам до опромінення не призводить до захисту судинної стінки від пошкоджуючих радіаційних впливів.
Інша ситуація спостерігалась для судин тварин 2-ї групи, яким ФХЛ уводились через 1 год після опромінення. Виявилось, що на 9-й день пострадіаційного періоду в судинах цих тварин спостерігалось практично повне відновлення ендотелій-залежного розслаблення на АХ (рис. 7). Величина АХ розслаблення цих судин не відрізнялась від відповідних контрольних значень для здорових судин і була значно більше величини розслаблення судин просто опромінених кролів. Суттєво відновлювались також реакції на НГ і SIN-1.
Таким чином, уведення ФХЛ тваринам відразу після опромінення призводить до вираженого захисного антирадіаційного ефекту. У ранні пострадіаційні терміни навіть однократне застосування ліпосом перешкоджає розвитку порушень як дилататорної спроможності ендотелію (реакції на АХ), так і здатності судинної стінки реагувати на донори NO, хоча й у дещо меншому ступені.
Реакції судин тварин 3-ї групи при курсовому введенні ФХЛ за дилататорними характеристиками практично не відрізнялись від судин тварин 2-ї групи, яким ФХЛ вводилися одноразово через 1 год після опромінення. Гострий експеримент у 3-й групі проводився на 35-й день після опромінення (таким чином, протягом цього терміну було проведено 5 ін'єкцій ФХЛ: через 1 год і на 7, 14, 21 і 28 день після опромінення). Отримані дані аналогічні результатам, одержаним при дослідженні судин тварин 2-ї групи. Спостерігався виражений захисний ефект ФХЛ: реакції на АХ, НГ і SIN-1 по величинам майже відповідали нормальним (статистичний аналіз не виявив достовірних розходжень), хоча їх середні значення були дещо нижче в порівнянні з судинами здорових тварин. Дія ФХЛ на судинні сегменти тварин 3-ї групи і здорових тварин в умовах in vitro також майже не відрізнялась, хоча, як і у всіх попередніх випадках, реакція на АХ виявляла тенденцію до збільшення.
Таким чином, при курсовому уведенні ФХЛ через 35 днів після опромінення досягалась стабілізація дилататорної спроможності судин, що свідчить про виражену захисну дію ФХЛ від ушкоджуючих судинну стінку радіаційних впливів.
Застосування антиоксидантних препаратів. Відомо, що ФХЛ виявляють антиоксидантні властивості і спроможні взаємодіяти з вільними радикалами [Пожаров В.П. и др., 1990]. Наявність таких властивостей дозволяє зробити припущення про зв'язок захисного антирадіаційного впливу ФХЛ з антиоксидантними механізмами. Для перевірки цього припущення були проведені порівняльні дослідження дії ФХЛ та інших антиоксидантів в умовах як in vitro, так і in vivo.
Групі опромінених кролів (умови опромінення ті ж, що і при використанні ФХЛ - загальне однократне зовнішнє опромінення в дозі 6 Гр джерелом 60Co) через одну годину після опромінення перорально вводився a-токоферол у дозі 50 мг/кг. Гострий експеримент, як і у випадку використання ФХЛ, проводився на 9-й день після опромінення. Основну увагу в цій серії експериментів приділяли вивченню ендотелій-залежних дилататорних властивостей судинної стінки. Встановлено, що реакції на АХ судин опромінених тварин, що одержали a-токоферол, не відрізнялись від аналогічних реакцій судин здорових кролів, тоді як відповіді на АХ судин опромінених тварин без лікування були пригнічені більш ніж на 50% (рис. 8). Блокада NO-синтази за допомогою Nw-нітро-L-аргініну призводила до майже однакового зменшення реакцій на АХ судин як здорових кролів, так і тварин, яким уводили a-токоферол. У той же час величина реакції на АХ судин опромінених кролів вірогідно не змінювалась. Важливо відзначити, що після блокади NO-синтази реакції на АХ судин здорових, опромінених і пролікованих a-токоферолом тварин мали приблизно однакову величину і не відрізнялися вірогідно між собою. Отримані дані змушують припустити, що результатом дії a-токоферолу є стабілізація NO-залежної компоненти інтегрального ендотелій-залежного розслаблення судинної стінки опромінених тварин. В судинах тварин без введення антиоксиданту після впливу іонізуючої радіації ця компонента зменшується аж до повного зникнення.
Рис. 8. Вплив a-токоферолу на реакції ацетилхоліну (10-5 моль/л) на грудній аорті кролів при опроміненні тварин у дозі 6 Гр (джерело 60Co, 9-й день після опромінення). a-Токоферол уводився перорально, одноразово, через 1 год після опромінення в дозі 50 мг/кг; L-NA - Nw-нітро-L-аргінін (3Ч10-4 моль/л), АХ - ацетилхолін, Ток - a-токоферол. * - p<0.05, n=14-17.
Встановлений факт однакової стабілізуючої дії ФХЛ і a-токоферолу в умовах in vivo змусив припустити, що подібні ефекти можуть проявлятись і в умовах in vitro. Оскільки ФХЛ відновлювали пригнічену радіацією пов'язану з ендотелієм дилататорну спроможність судинної стінки, можна очікувати такого ж ефекту при використанні інших антиоксидантів. Ми досліджували дію на судинні сегменти опромінених тварин антиоксидантів СОД (30 од/мл), вітаміну С (3Ч10-3 моль/л) і глютатиону (3Ч10-3 моль/л). Результати досліджень показали, що в умовах in vitro жодна із досліджуваних сполук не збільшувала амплітуду розсла-
блення на АХ у судинах опромінених тварин. При дії цих сполук реакція на АХ судин здорових тварин також не змінювалась.
Таким чином, застосування як a-токоферолу, так і ФХЛ відразу після опромінення призводило до значного зм'якшення радіаційного впливу на дилататорну спроможність судинної стінки, що наштовхує на думку про те, що захисна дія ФХЛ можливо пов'язана з їх антиоксидантними властивостями, проте експерименти in vitro змушують припустити, що поряд із згаданими, існують ще й інші механізми що відновлюють ендотелій-залежне розслаблення при дії ФХЛ. ФХЛ, очевидно, не є профілактичним засобом при радіаційному впливі, але їх застосування відразу після опромінення дозволяє значно зменшити вплив іонізуючої радіації на судинну реактивність. Безпосередня дія ФХЛ на судини опромінених тварин призводить до істотного збільшення ефективності ендогенного NO, причому цей ефект очевидно також не пов'язаний з антиоксидантными властивостями ФХЛ.
Судинна дисфункція при опроміненні в умовах гіперхолестеринемії. При розвитку експериментального атеросклерозу у судинах кроля виникають порушення реактивності судинної стінки, дуже схожі з порушеннями, що виникають при дії іонізуючої радіації. Через 30 діб після початку холестеринової дієти не спостерігалось достовірних змін судинної реактивності. На 60-у добу відзначалась тенденція до підвищення констрикторних відповідей на НА і КСl і ослаблення дилататорних реакцій на АХ і НГ. Чіткі зміни судинної реактивності спостерігалися на 4-й місяць ГХЕ. У цей термін вміст холестерину в крові збільшувався у 32 рази у порівнянні з контролем, а збільшення констрикторних і пригнічення дилататорних відповідей набували достовірного характеру. Ще більш виражені зміни спостерігались на 8-й місяць ГХЕ.
Опромінення тварин джерелом 60Со в дозі 2 Гр не викликало достовірних змін реактивності судинної стінки до вивчених вазоконстрикторів і вазодилататорів, хоча відзначалась тенденція до посилення констрикторних і ослаблення дилататорних відповідей. При застосуванні опромінення тварин і подальшої холестеринової дієти зміни реактивності кровоносних судин аж до 60-ї доби не тільки не посилювались, але навіть були дещо меншими у порівнянні із судинами тільки опромінених тварин. Відзначалась тенденція до стабілізації скорочувальних характеристик судинної стінки в цих умовах. Таким чином, опромінення джерелом 60Со не приводило до потенціювання змін судинної реактивності, викликаних підвищеним рівнем холестерину в крові (в 8 разів у порівнянні з нормою). Більш того, при розвитку ГХЕ спостерігалась тенденція до поліпшення скоротливого стану судинної стінки, ушкодженої радіаційним впливом.
Такі ж, але істотно більш виражені результати були отримані при використанні для опромінення в дозі 2 Гр джерела 137Cs. На 30-у добу після радіаційного впливу спостерігалось значне і достовірне зменшення дилататорних реакцій, викликаних дією АХ і НГ, а також достовірне збільшення скоротливих відповідей
Рис. 9. Скорочувальні реакції грудної аорти кролів у контролі, через 1 місяць після опромінення (137Cs, 2 Гр) і через 1 місяць експериментальної гіперхолестеринемії у поєднанні з опроміненням (137Cs, 2 Гр). А - реакції на норадреналін (10-5 моль/л) і KCl (60 ммоль); Б - реакції на ацетилхолін (10-5 моль/л) і нітрогліцерин (10-5 моль/л); Величини реакцій подані у відсотках від максимального скорочення на фенилефрін (10-5 моль/л); * - p<0,05; n=20-24.
на НА і КСl. На 30-у добу після опромінення судини тварин, що знаходилися на холестериновій дієті, також демонстрували вірогідно знижену в порівнянні з контролем спроможність до розслаблення під дією АХ і НГ (рис. 9), однак у цих умовах відмічалась тенденція до нормалізації цих реакцій. На відміну від дилататорних ефектів, констрикторні реакції на НА і КСl не відрізнялися від відповідних реакцій здорових судин.
Таким чином, підвищення вмісту холестерину в крові експериментальних тварин не призводить до посилення ушкоджуючої дії іонізуючої радіації на скоротливу активність судинної стінки, більш того, у цих умовах спостерігається позитивний вплив холестерину на розвиток змін судинної реактивності. Цей ефект особливо виражений по відношенню до констрикторних реакцій.
Судинна дисфункція при гіпертензії. Було встановлено, що у тварин з артеріальною гіпертензією та у опромінених тварин порушення реактивності судинної стінки дуже схожі. Чутливість до АХ судин щурів із генетично детермінованою гіпертензією знижена, як і у випадку радіаційного впливу. При блокаді NO-синтази в судинах здорових тварин спостерігалося достовірне підвищення судинного тонусу (рис. 10А). Таке ж скорочення виникало в процесі руйнації ендотелію сапоніном. Ці реакції були ендотелій-залежними і зникали в судинах із видаленим ендотелієм. Подібні ефекти не спостерігались у судинах спонтанно гіпертензівних щурів (СГЩ) і тонус судин не змінювався при дії L-NA або сапоніну. Розслаблення судин здорових щурів на АХ значно зменшувалось при дії L-NA і не змінювалось в судинах СГЩ (рис. 10Б). Таким чином, дія іонізуючої радіації і розвиток артеріальної гіпертензії призводять до однакових наслідків стосовно змін скоротливих властивостей судин. У обох випадках спостерігається пригнічення NO-залежної компоненти інтегрального ендотелій-залежного розслаблення, а визначальну роль в ендотеліальному дилататорному контролі починає відігравати ЕЗГФ-компонента.
Рис. 10. Скорочувальні ефекти блокаторів NO-синтази (NOS) і сапоніну, зареєстровані на препаратах аорти здорових і спонтанно гипертензивних щурів. А - величини констрикторних ефектів, що виникають при дії Nw-нітро-L-аргініну (10-5 моль/л) і сапоніну (0,1 мг/мл). Е+ і Е- - судини з інтактним ендотелієм і денудовані судини; Б - реакція на ацетилхолін (10-5 моль/л) після застосування L-NА протягом 30 хв; L-NA - Nw-нітро-L-аргінін (10-5 моль/л); * - p<0,05. n = 18-20.
На 9-й день після опромінення в дозі 5 Гр (джерело 60Co) у щурів реєструвалося підвищення артеріального тиску до 187±17 мм рт. ст. (контрольні значення 124± 9 мм рт. ст., n=6, р<0,05). Підвищений тиск зберігався протягом тривалого часу і навіть через 6 місяців після опромінення його величина залишалась вірогідно вищою у порівнянні зі здоровими тваринами (148±8 мм рт. ст., n=6, р<0,05), хоча і спостерігалась тенденція до нормалізації.
Аналогічний прояв наслідків променевого впливу зареєстровано також у людей. У 1998 р. була обстежена група добровольців ліквідаторів аварії на Чорнобильськвй АЕС із 15 чоловік у віці 42-45 років, що у 1986 р. одержали різні дози іонізуючого опромінення при роботах поблизу зруйнованого реактора. Групою порівняння були 15 здорових чоловіків того ж середнього віку, що мешкають у незабруднених областях України, які не брали участь у радіаційно-небезпечних роботах. Встановлено, що в групі ліквідаторів значення середнього артеріального тиску були вищими, ніж у групі здорових добровольців (156±8 і 132±6 мм. рт. ст. відповідно). Важливо відзначити, що при цьому реакція судин на нітрогліцерин, зареєстрована реографічним методом, у опромінених пацієнтів була знижена в порівнянні зі здоровими.
Таким чином, при артеріальної гіпертензії і після променевого впливу спостерігаються подібні зміни реактивності судин. Очевидно, одним із найважливіших проявів цих патологічних станів є ослаблення дилататорного ендотеліального контролю судинного тонусу за рахунок пригнічення NO-компоненти ендотелій-залежних реакцій.
Реактивність судин в умовах гіпоксії. Гіпертонічні стани часто супроводжуються явищем ішемії і недостатнього постачання кисню до тканин, у тому числі і судинним, тому уявлялось цікавим виявити, які зміни скорочувальних властивостей судинної стінки супроводжують гіпоксичні стани, а також визначити можливі загальні риси порушень судинної реактивності при дії радіації і гіпоксії.
На коронарних артеріях свині був досліджений вплив дефіциту кисню на ефективність розслаблюючої дії донорів NO. Ці судини були обрані як об'єкт дослідженьк виходячи з особливостей їх реакції на зниження вмісту кисню, оскільки його дефіцит призводив до скорочення судинних сегментів, а не до розслаблення, яке може вносити суттєві похибки при реєстрації реакцій на дилататорні сполуки. У якості нітровазодилататорів були використані НП, SIN-1, НГ, а також розчин газоподібного NO. Для всіх чотирьох сполук установлені дві характерні риси впливу гіпоксії: збільшення максимального розслаблення і зміщення кривих концентрація-ефект у бік менших концентрацій (рис. 11), аналогічний зміщенню подібних кривих в опромінених судинах кролів. Ці ефекти були ендотелій-залежними і виявлялись тільки при наявності інтактного ендотелію. Дія L-NA призводила до скорочення судинних препаратів на 30,2±6,3% (n=12). Приблизно таке ж скорочення викликали зниження вмісту кисню у фізіологічному розчині і руйнація ендотелію за допомогою сапоніну (28,5±5,6%, n=15 і 31,8±5,3% n=9 відповідно). Це означає, що при нормальних умовах у судинній стінці з інтактним ендотелієм існує значний базальний рівень NO. Як підтвердження цього припущення виявилось, що реакції на донори NO на фоні блокади NO-синтази за допомогою L-NA також збільшувались, причому приблизно в тому ж ступені, що і при дії гіпоксії.
Рис. 11. Залежності доза - ефект для екзогенного оксиду азоту і нітрогліцерину, зареєстровані на коронарних артеріях свині. Суцільні криві - лінії регресії (рівняння Хілла). А - оксид азоту, Ем=61,5±2,6 і 90,1±5,3, p<0,05, рЕД50 = 6,19±0,10 і 6,86±0,19, p<0,05, для контролю і гіпоксії; Б - нітрогліцерин, Ем=21,9±2,1 і 46,3±4,2, p<0,05, рЕД50=5,75±0,19 і 6,51±0,23, p<0,05, для контролю і гіпоксії. Реакції нормовані щодо скорочення на KCl (60 ммоль/л). n = 18-20.
Отримані результати дозволяють зробити висновок, що судини в гіпоксічних умовах і опромінені судини виявляють ряд подібних змін скоротливої активності. В обох випадках установлене зростання величин максимального розслаблення на екзогенний NO і зареєстроване підвищення чутливості судинної стінки для всіх досліджених донорів NO, причому цей ефект пов'язаний з ендотеліальною NO-синтазой. Проте, якщо при радіаційному впливі максимальні ефекти донорів NO зменшувались, дефіцит кисню призводив до їх достовірного збільшення.
Обговорення результатів. Таким чином встановлено, що дія іонізуючої радіації призводить до зміни реактивності судинної стінки, що виражається в збільшенні констрикторних і погіршенні дилататорних відповідей. Подібні зміни зареєстровані при експериментальному атеросклерозі у кролів, у судинах СГЩ, а також при діабеті [McNelli P.G. et al., 1994], старінні [Koga T. et al., 1989] і гіпоксії [Giordano E. et al., 1999]. Однаковість проявів судинної дисфункції при різних патологічних процесах наводить на думку про схожість механізмів, що викликають її розвиток. Експерименти з блокаторами ЕЗГФ і NO-синтази показали, що при дії радіації страждає NO- і не змінюється ЕЗГФ-компонент ендотелій-залежного розслаблення. Подібне селективне пригнічення NO-компоненту описано для судин СГЩ, при розвитку ГХЕ [Verbeuren T.J. et al., 1990], діабеті [Wallance P. et al., 1992], старінні [Taddei S. et al., 1995]. Це може бути наслідком: а) втрати спроможності ендотелію до синтезу/секреції NO; б) втрати чутливості ГМК до NO; в) порушення транспорту NO від ендотелію до ГМК; г) інактивації NO у субендотеліальному шарі. Дві останні можливості можна охарактеризувати, як порушення біодоступності NO для ГМК судинної стінки. У дослідах із системою "донор-детектор", а також при вимірі кількості NO,що виділяється, іншими методами [Soloviev A.I. et al., 2001], встановлено, що секреторна спроможність ендотелію судин опромінених тварин принаймні не знижена. Аналогічне парадоксальне збільшення секреції NO на фоні пригніченої дилататорної реакції описано для судин СГЩ [Cahill P.A. et al., 2001, Soloviev A.I. et al., 1999] і кролів при розвитку ГХЕ [Verbeuren T.J. et al., 1990]. Оцінка чутливості судинної стінки до екзогенного NO показала, що величина реакцій на NO опромінених судин вище у порівнянні зі здоровими. Сукупність встановлених фактів дозволяє зробити припущення, що в розвитку судинної дисфункції основну роль відіграє зменшення біодоступності NO, що секретується ендотелієм. Імовірно, при розвитку судинної патології виникають якісь процеси, що перешкоджають вільній дифузії NO до клітин-мішеней. Такими процесами можуть бути, наприклад, потовщення інтимального шару судинної стінки, підвищення рівню вільнорадикальних процесів у цьому шарі, збільшення проникності ендотелію. Потовщення або ущільнення базальної мембрани зареєстровано при морфологічних дослідженнях опромінених судин [Beckman J.A. et al., 2001], судин СГЩ [Lindop G.B.M., 1995] і при ГХЕ [Талаева Т.В. и др., 1990]. Активація ПОЛ встановлена при променевому впливі і при багатьох інших патологічних процесах. Постпроменевому збільшенню проникності ендотелію приділяється вирішальна роль, як первинного чинника патологічних змін судинної стінки [Воробьев В.И., Степанов Р.П., 1985]. Останній феномен призводить, можливо, до утворення "витікання" NO через ендотелій у просвіт судини і відповідного ослаблення дилататорних реакцій судинної стінки. Зменшення за тією ж схемою (або будь-яким іншим способом) базального рівню NO у субендотеліальному просторі повинно призвести до посилення ефективності дії екзогенних донорів NO. Цей ефект добре відомий, як феномен збільшення реакцій, наприклад, на нітрогліцерин після руйнації ендотелію здорової судини. Він яскраво виявляється в коронарних артеріях свині, коли при інактивації NO-синтази гіпоксією або Nw-нітро-L-аргініном вірогідно зростають дилататорні ефекти як екзогенного NO, так і його донорів. Проте в опромінених судинах цього не спостерігається, що є свідченням існування інших механізмів пригнічення реактивності судин до донорів NO при дії радіації.
Створюється враження, що для нормалізації скорочувальних процесів у кровоносних судинах достатньо відновити нормальну проникність ендотелію й усунути зайві вільні радикали, принаймні, у субендотеліальному просторі. Фосфатидилхоліновим ліпосомам притаманні необхідні властивості: вони мають виражену антиоксидантну активністьі, мембранотропну дію, спроможні усувати скорочувальну дисфункцію в судинах СГЩ. Дія ФХЛ в умовах in vitro призводила до практично повного відновлення ендотелій-залежного розслаблення опромінених судин. При цьому виявився несподіваний феномен – пригнічені реакції на донори NO не тільки не відновлялись, але і виявлялася тенденція до ще більшого їх зменшення. Сукупність цих даних дозволяє припустити, що головний механізм дії ФХЛ (принаймні в умовах in vitro) полягає у відновленні нормальних дифузійних властивостей (функціональної цілісності) судинного ендотелію і зменшенні (або скоріше нормалізації) його проникності, у результаті чого зменшується витікання NO у просвіток судини і збільшуються ендотелій-залежні реакції. Залишається неясним, чи вносить якийсь внесок у процес відновлення реактивності антиоксидантна дія ліпосом. Швидше за все, даний аспект дії ФХЛ не має істотного значення для описаного процесу. Підтвердженням цього є результати експериментів із СОД, аскорбіновою кислотою і глютатіоном. Проте він стає вирішальним при використанні ФХЛ в умовах in vivo. Введення ФХЛ відразу після опромінення, тобто в розпал активації вільнорадикальних процесів, викликало позитивний "протекторний" ефект на судинну реактивність. Аналогічну дію виявляв a-токоферол при використанні за тією ж тимчасовою схемою. Крім того, зареєстроване парадоксальне поліпшення скорочувальних властивостей судинної стінки опромінених тварин при підвищенні рівню холестерину в крові, незважаючи на серйозне погіршення біохімічних показників крові, що також можна приписати антиоксидантній дії холестерину.
Таким чином, ФХЛ є ефективним засобом для відновлення нормальної скорочувальної функції кровоносних судин після радіаційного впливу. Їхня дія спрямована, по-перше, на зниження підвищеного рівня вільнорадикальних процесів і, по-друге, на стабілізацію дифузійних властивостей ендотелію. Спроможність ФХЛ відновлювати бар'єрні властивості ендотелію для оксиду азоту змушує віднести їх до цілком нового класу - ендотеліотропних лікарських засобів.
ВИСНОВКИ
1. У роботі наведено нове рішення проблеми щодо порушень скорочувальної активності судин радіаційного генезу, з'ясовані механізми виникнення ендотеліальної дисфункції, обґрунтовані шляхи і конкретні підходи для розробки нових фармакологічних засобів для лікування судинних патологій, викликаних дією іонізуючої радіації.
2. Зовнішнє одноразове загальне опромінення кролів іонізуючою g-радіацією викликає вірогідне довготривале (до 35 діб) пригнічення ендотелій-залежного розслаблення аорти і сонних артерій (до 50%), яке посилюється зі збільшенням експозиційної дози у діапазоні 1 – 6 Гр. Цей ефект не пов'язаний з ушкодженням холінорецепторного апарату ендотеліоцитів, про що свідчить пригнічення реакцій на кальцієвий іонофор А23187. Він також не обумовлений пригніченням дилататорної функції міоцитів, оскільки величина реакції на екзогенний NO достовірно збільшується в 1,2 рази у судинах опромінених тварин. Констрикторні реакції судин на норадреналін і хлористий калій вірогідно збільшуються (до 30%) після опромінення в усі строки дослідження.
3. Ступінь зменшення дилататорних реакцій аорти і сонних артерій залежить від природи джерела g-випромінювання, дози опромінення і тривалості пострадіаційного періоду. Однакові за вираженістю пошкоджуючі ефекти джерел 137Cs і 60Со спостерігаються при дозах Д(60Со) = 1,5 Д(137Cs).
4. Дія іонізуючої радіації призводить до пригнічення дилататорних судинних реакцій на донори NO пропорційно експозиційній дозі на 9-у добу після опромінення. Ступінь пригнічення зменшується у ряду NaNO2 > нітрогліцерин > нітропрусид натрію у співвідношенні 21:15:11 % на 1 Гр в судинах опромінених тварин.
5. При дії блокатора NO-синтази Nw-нітро-L-аргініну (3Ч10-4 моль/л) в умовах in vitro ендотелій-залежні реакції судин опромінених тварин не змінюються, тоді як реакції судин інтактних кролів вірогідно зменшуються (до 50%), що є доказом пригнічення під дією радіації NO-залежної компоненти ендотелій-залежного інтегрального розслаблення.
6. При блокаді калієвих каналів (з якими пов'язана дія ендотелій-залежного гіперполяризуючого фактору) апаміном (10-6 моль/л) і харибдотоксином (10-8 моль/л) ендотелій-індуковане розслаблення судин інтактних кролів вірогідно зменшується (до 50%), тоді як розслаблення судин опромінених кролів не реєструється. Це є свідченням того, що у судинах опромінених тварин розслаблення при стимуляції ендотелію цілком визначається ендотелій-залежним гіперполяризуючим фактором.
7. Пригнічення NO-залежної компоненти розслаблення у судинах опромінених кролів не супроводжується зменшенням секреції з ендотелію дилататорних чинників при його стимуляції, (експерименти з системою “донор-детектор”), та зменшенням чутливості до екзогенного NO гладеньком'язових клітин судин, що свідчить про порушення під дією радіації механізмів передачі NO до м'язових клітин.
8. При дії фосфатидилхолінових ліпосом у концентрації 100 мкг/мл на судинні препарати аорти опромінених кролів в умовах in vitro спостерігається відновлення ендотелій-залежних реакцій, тоді як реакції на донори NO залишаються зменшеними. Антиоксиданти аскорбінова кислота (3Ч10-3 моль/л), супероксиддисмутаза (30 од/мл) і глютатіон (10-3 моль/л) в умовах in vitro не відновлюють реакцій на ацетилхолін і донори NO (нітрогліцерин, нітропрусид натрію, SIN-1).
9. Одноразове внутрішньоочеревинне введення фосфатидилхолінових ліпосом кролям у дозі 30 мг/кг через 1 год після опромінення перешкоджає пригніченню ендотелій-залежного розслаблення і дилататорних ефектів донорів NO (спостереження на 9-у добу після опромінення). Одноразове пероральне застосування a-токоферолу в дозі 50 мг/кг через 1 год після опромінення також перешкоджає пригніченню ендотелій-залежного розслаблення на 9-у добу після опромінення. Курсове лікувальне внутрішньоочеревинне введення фосфатидилхолінових ліпосом у дозі 30 мг/кг/тиждень перешкоджає пригніченню реакцій на ацетилхолін і донори NO (спостереження на 35-у добу після опромінення). Профілактичне застосування ліпосом не запобігає пригніченню реакцій на ацетилхолін і донори NO.
10. Виявлені після радіаційного впливу прояви ендотеліальної дисфункції судин можуть супроводжувати і інші патологічні процеси. Вони реєструються у судинах щурів з генетично детермінованою гіпертензією, у судинах кролів в умовах експериментальної гіперхолестеринемії, у судинах свиней при моделюванні гіпоксії і носять, імовірно, універсальний характер.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. Із сімейства нітровазодилататорів в умовах опроміненого організму більш ефективні прямі донори оксиду азоту (такі як SIN-1 і нітропрусид натрію) у порівнянні з непрямими донорами NO (нітрогліцерин, нітрит натрію).
2. При лікуванні судинної недостатності кровообігу в умовах іонізуючого опромінення фармакологічні препарати, спрямовані на стимуляцію судинного ендотелію, доцільно застосовувати на фоні попереднього введення фосфатидилхолінових ліпосом, що підвищують їх ефективність.
3. На ранніх строках після опромінення для пом'якшення наслідків радіаційного впливу на судинну систему доцільно використовувати a-токоферол або фосфатидилхолінові ліпосоми. Профілактичне застосування ліпосом неефективне.
4. При розробці нових фармакологічних засобів для лікування радіаційних ушкоджень кровоносних судин доцільно віддавати перевагу сполукам, яким одночасно притаманні антиоксидантні властивості та здатність відновлювати функціональну цілісність судинного ендотелію.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Байдан Л.В., Тишкин С.М Влияние апамина на синаптическую передачу и тормозящий эффект АТФ и норадреналина в гладкомышечных клетках ободочной кишки // Физиол. журн. – 1983. – Т.29, №2. - С.181-185.
2. Baidan L.V., Tishkin S.M., Shuba M.F. Possible mechanism of adrenergic and nonadrenergic inhibition in intestinal smooth muscle cells // Pflugers Arch. – 1985. – Vol.403. - P.429-432.
3. Байдан Л.В., Тишкин С.М., Шуба М.Ф. Действие нитроглицерина и нитропруссида натрия на ГМК кишечника // Физиол. журн. СССР – 1987.- Т.73, №11.- С.1569-1572.
4. Тараненко В.М., Талаева Т.В., Тишкин С.М., Братусь В.В. Влияние гиперхолестеринемии на электрические и сократительные свойства сосудистой стенки // Бюл. экспер. биол. медицины. - 1989. - №10.- С.400-401.
5. Тишкин С.М., Тараненко В.М., Талаева Т.В., Сергиенко О.В., Братусь В.В. Функциональное состояние и адренореактивность миокарда при экспериментальном атеросклерозе // Патологическая физиол. и экспер. терапия. – 1990. - №5. - С.15-17
6. Тараненко В.М., Талаева Т.В., Тишкин С.М., Исаечкина И.М., Братусь В.В. Эффективность защиты сосудистой стенки от атеросклеротического поражения различными кальциевыми антагонистами // Патологическая физиол. и экспер. терапия. – 1991. - №1. - С.5-7.
7. Тараненко В.М., Тишкин С.М. Установка для сравнительной оценки сократительной активности различных участков сосудистой стенки // Физиол. журн. СССР – 1991. - Т.74, №2. - С.132-135.
8. Тараненко В.М., Тишкин С.М., Руднев М.И. Изменения реактивности сосудистой стенки под влиянием ионизирующего облучения // Докл. АН СССР – 1992. - Т.322, №3. - С.600-603.
9. Талаєва Т.В., Тараненко В.М., Тишкин С.М., Ісаєчкіна І.М., Сергієнко О.В., Третяк І.В., Братусь В.В. Ангіопротекторна ефективність поєднаного використання хлористого магнію та антиоксідантів в умовах тривалої гіперхолестеринемії // Фізіол. журн. АН України – 1993. - Т.39, №1. - С.102-106.
10. Тишкін С.М., Тараненко В.М., Руднєв М.І., Воронков Г.С., Плющ Г.І., Ісаєчкіна І.М., Попова Л.М., Братусь В.В. Активація вільнорадикальних процесів як фактор порушення скорочувальної активності судинної стінкі під дією іонізуючої радіації // Фізіол. журн. АН України – 1993. - Т.39, №2-3. - С.23-29.
11. Братусь В.В., Тишкин С.М., Тараненко В.М., Плющ Г.И., Руднев М.И. Свободнорадикальное повреждение тканей как динамический процесс // Докл. РАН - 1993. - Т.333, №6. - С.792-794.
12. Тишкін С.М. Дія деяких антиангінальних препаратів на кровоносні судини при комбінованому впливі гіперхолестеринемії та іонізуючої радіації // Діагностика та профілактика негативних наслідків радіації. – Київ: НЦРМ - 1997, с.252-255.
13. Тишкін С.М. Вплив іонізуючої радіації на дію деяких антиангінальних препаратів // Ліки - 1998. - №2. - С.62-65.
14. Моссе І.В., Тишкін С.М., Соловйов А.І. Порівняльна характеристика ефективності дії NO-донорів на коронарні артерії свині в нормі та при гипоксії // Ліки - 1998. - №5.- С.9-12.
15. Моссе И.В., Тишкин С.М., Соловьев А.И. Роль монооксида азота в формировании эндотелий-зависимых реакций в различных сосудах // Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности. - Минск: Полибиг. - 1998. - С.136-138.
16. Soloviev A., Tishkin S., Parshikov A., Stefanov A., Mosse I. Depression of Endothelium-dependent Relaxation Despite Normal Release of Nitric Oxide in the Aorta of Spontaneously Hypertensive Rats: Possible Role of Protein Kinase C // Endothelium-dependent hyperpolarizations. – Amsterdam: Harwood Academic Publichers. - 1999. - P.289-296.
17. Тишкин С.М. Роль оксида азота в развитии гипоксических и индуцированных радиацией изменений реактивности кровеносных сосудов // Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. - Минск: Полибиг. - 1999. - С.214-215.
18. Моссе І.В., Тишкін С.М., Соловйов А.І. Вивчення змін реактивності до донорів оксиду азоту коронарних артерій свині при гіпоксії // Ліки - 2000. - №3-4. - С.27-30
19. Soloviev A.I., Tishkin S.М., Parshikov A.V., Mosse I., Stefanov A., Gurney A., Osipenko O. The EDHF-dependent but not the NO-dependent component of the acetylcholine-induced relaxation of the rabbit aorta resistant to ionized radiation // EDHF - 2000.- London and New York: Taylor & Francis. – 2001. - P.400-410.
20. Соловьев А.И., Тишкин С.М., Паршиков А.В., Иванова И.В., Гарни А.М. Ослабление дилататорной функции эндогенного оксида азота при развитии индуцированных радиацией нарушений эндотелий-зависимых сосудистых реакций // Функциональная роль монооксида азота и пуринов.- Минск: Бизнесофсет. - 2001. - С.161-163.
21. Тишкин С.М. Восстановление индуцированных радиацией изменений эндотелий-зависимых реакций аорты кроликов при помощи фосфатидилхолиновых липосом // Функциональная роль монооксида азота и пуринов.- Минск: Бизнесофсет. - 2001. - С.178-181.
22. Соловьев А.И., Тишкин С.М., Паршиков А.В., Иванова И.В., Гарни А.М., Стефанов А.В. Механизмы развития эндотелиальной дисфункции при действии ионизирующей радиации: роль оксида азота и эндотелий-зависимого гиперполяризующего фактора. // Материалы II Международной конференции "Микроциркуляция и ее возрастные изменения". – Киев: ІПЦ "Алкон". – 2002. - С.284-286.
23. Соловйов А.І., Тишкін С.М., Хромов О.С., Стефанов О.В. Зміна скорочувальної функції судин при артеріальної гіпертензії різного генезу та її корекція за допомогою фосфатидилхолінових ліпосом // Фізіол. журн. АН України – 2002. - Т.48,№6. - С.10-16.
24. Тишкін С.М. Корекція a-токоферолом ендотеліальної дисфункції, викликаної дією іонізуючої радіації у грудній аорті кролів // Медична хімія – 2002. - Т.4,№4. - С.52-54.
25. Soloviev, A.I., Stefanov, A.V., Tishkin, S.M., Khromov A.S., Parshikov A.V., Ivanova I.V., Gurney A.M. Saline containing phosphatidylcholine liposomes possess the ability to restore endothelial function damaged resulting from g-irradiation // J. Physiol. Pharmacol. - 2002. – Vol.53, №4. – P.701-712.
26. Патент №50582, Україна, "Спосіб лікування радіаційних ушкоджень кровоносних судин в експерименті", заявл. 15.02.2002, опубл. 15.10.2002, Бюл. №10.
27. Рішення про видачу деклараційного патенту на винахід №2002021276 "Спосіб лікування артеріальної гіпертензії в експеріменті", заявл. 21.05.2002, затв. 10.10.2002.
28. Tishkin S.M., Taranenko V.M., Rudnev M.I. The effect of ionizing radiation on endothelium - dependent relaxation of vascular wall // 2nd Intern. Symp. on endothelium - Derived Vasoactive Factors. – Basel (Switzerland). – 1992. - №401. - P.214.
29. Soloviev A., Tishkin S., Parshikov A., Mosse I., Goncharov T., Garney A. Mechanisms of Endothelial Dysfunction after Whole-Body Ionized Irradiation Relationship Between Changes in Smooth Muscle Sensitivity to Nitric Oxide and its Release by Endothelial Cells // Nitric Oxide. - 2000. - Vol.4. - P.236.
30. Soloviev A., Stefanov A., Tishkin S., Parshikov A., Mosse I., Goncharov E., Osipenko J. and Gurney A. Mechanisms of endothelium dysfunction after ionized irradiation and its prevention by a-tocopherol // J. Physiol. - 2001.- Vol.531P. - P.8P.
АНОТАЦІЯ
Тишкін С.М. Механізми і фармакологічна корекція порушень скорочувальної активності судин, індукованих іонізуючим g-випромінюванням. - Рукопис
Дисертація на здобуття наукового ученого ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2003.
Дисертація присвячена дослідженню механізмів змін судинної реактивності, що індуковані іонізуючою радіацією, і визначенню можливостей їх фармакологічної корекції. Показано, що опромінення викликає дозо-залежне пригнічення ендотелій-залежних дилататорних і збільшення констрикторних реакцій. Зменшення дилататорної спроможності ендотелію пов'язане з ослабленням NO-залежної компоненти розслаблення, проте звільнення дилататорних чинників з ендотелію опромінених судин при його стимуляції не зменшується. Компонента, що пов'язана з гіперполяризуючим ендотелій-залежним фактором, резистентна до дії радіації і визначає ендотелій-залежне розслаблення в судинах опромінених тварин. Дилататорна ефективність донорів оксиду азота зменшується в опромінених судинах, причому ступінь пригнічення дилататорної спроможності збільшується пропорційно експозиційній дозі і є різним для різних нітровазодилататорів.
Введення фосфатидилхолінових ліпосом (ФХЛ) після опромінення перешкоджає розвитку змін судинної реактивності як для ендотелій-залежних вазодилататорів, так і для нітросполук. Застосування ФХЛ до опромінення малоефективно. Застосування a-токоферолу також перешкоджає пригніченню NO-залежної компоненти розслаблення. Передбачається, що ФХЛ відновлюють бар'єрні властивості ендотелію і нормалізують дифузійні шляхи для NO. ФХЛ є представником нового класу лікарських засобів, яким одночасно притаманні антиоксидантна активність і ендотеліотропні властивості.
Ключові слова: ендотелій, іонізуюча радіація, оксид азоту, ендотелій-залежний гіперполяризуючий фактор, донори NO, фосфатидилхолінові ліпосоми.
АННОТАЦИЯ
Тишкин С.М. Механизмы и фармакологическая коррекция нарушений сократительной активности сосудов, индуцированных ионизирующим g-излучением - Рукопись
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 14.03.05 – фармакология.- Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2003.
Диссертация имеет экспериментальный характер и посвящена исследованию механизмов изменений реактивности сосудистой стенки при воздействии ионизирующей радиации и определению возможностей их фармакологической коррекции. В условиях эксперимента показано, что ионизирующая радиация вызывает дозо-зависимое угнетение эндотелий–зависимых реакций и увеличение чувствительности сосудистой стенки к констрикторным воздействиям. Установлено, что степень изменения реактивности сосудистой стенки зависит от вида сосуда, дозы облучения, природы g-излучения и длительности пострадиационного периода. Показано, что подавление дилататорной способности эндотелия коррелирует с увеличением уровня свободно–радикальных процессов в плазме крови и сосудистой стенке в широком диапазоне доз ионизирующего облучения. Подавление дилататорной способности эндотелия связано с ослаблением действия связанной с NO-синтазой NO–зависимой компоненты расслабления, тогда как компонента расслабления, связанная с действием эндотелий-зависимого гиперполяризующего фактора в меньшей степени подвержена действию ионизирующей радиации и почти полностью определяет эндотелий-зависимое расслабление в сосудах облученных животных. Несмотря на подавление NO-зависимой компоненты расслабления, освобождение дилататорных факторов из эндотелия облученных сосудов при его стимуляции не уменьшается.
Впервые установлено, что дилататорная эффективность доноров оксида азота уменьшается после ионизирующего облучения, причем величина подавления дилататорной способности увеличивается пропорционально экспозиционной дозе. Степени подавления эффективности действия разных нитровазодилататоров отличаются. При умеренных дозах облучения чувствительность сосудистой стенки к донорам оксида азота восстанавливается с течением времени, тогда как подавленная дилататорная способность эндотелия не восстанавливается и может даже прогрессировать при больших дозах.
Применение a-токоферола в значительной степени ослабляет индуцированные радиацией изменения реактивности сосудистой стенки и препятствует угнетению NO-зависимой компоненты эндотелий-зависимого расслабления. Установлено, что введение фосфатидилхолиновых липосом сразу после облучения препятствует развитию радиационных изменений реактивности сосудистой стенки, причем положительный эффект наблюдается как для эндотелий-зависимых вазодилататоров, так и для нитросоединений. Применение фосфатидилхолиновых липосом до облучения малоэффективно. Действие липосом в условиях in vitro приводит к восстановлению подавленной радиацией NO–зависимой компоненты эндотелий–зависимого расслабления, но при этом уменьшенная чувствительность сосудистой стенки к донорам оксида азота не восстанавливается. Антиоксидантные препараты СОД, витамин С и глютатион не вызывают положительного влияния на дилататорную способность сосудистой стенки в этих условиях.
Предполагается, что изменения реактивности сосудистой стенки при радиационном воздействии обусловлено уменьшением биодоступности секретируемого эндотелием оксида азота вследствие индуцированных радиацией свободнорадикальных процессов и нарушения нормальных диффузионных путей эндогенного NO. Фосфатидилхолиновые липосомы, по-видимому, восстанавливают барьерные свойства эндотелия и нормализуют диффузионные пути для NO, восстанавливая при этом NO–зависимую компоненту эндотелий-зависимого расслабления. Фосфатидилхолиновые липосомы являются представителем нового класса лекарственных средств, обладающих одновременно антиоксидантной активностью и эндотелиотропным действием.
Ключевые слова: эндотелий, ионизирующая радиация, оксид азота, эндотелий-зависимый гиперполяризующий фактор, доноры NO, фосфатидилхолиновые липосомы.
SUMMARY
Tishkin S.M. Mechanisms and pharmacological correction of g-radiation induced impairment of the vascular contractile activity. - Manuscript.
The thesis for competition of scientific degree of doctor's of biological sciences by specialty 14.03.05 – pharmacology. – Institute of pharmacology and toxicology, Academy of medical sciences of Ukraine, Kyiv, 2003.
The thesis is dedicated to study the mechanisms of ionizing radiation-induced impairment of the vascular reactivity and to define the pharmacological interventions could prevent vascular damage. Experiments were designed to determine the mechanisms of vascular endothelial dysfunction in rabbits subjected to whole-body irradiation with gamma rays from a cobalt60 or cesium137 sources. A significant impairment of endothelium-dependent vascular relaxation was evident at 2 Gy and increased in magnitude at higher radiation doses. In healthy vessels, the main mediators of the endothelium-dependent relaxation were NO (inhibited by L-Nw-nitroarginine - L-NA) and endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF, inhibited by the combined application of charybdotoxin and apamin). In contrast, the ACh-induced relaxation of vessels from irradiated animals was insensitive to L-NA and abolished by charybdotoxin plus apamin, indicating loss of NO-mediated relaxation. The results imply that radiation selectively impairs the NO-dependent pathway while the EDHF pathway is resistant to irradiation and able to maintain endothelium-dependent relaxations at a reduced level. Endothelium-independent responses to the NO-donors glyceryl trinitrate, sodium nitroprusside and 3-morpholino-sydnonimine (SIN-1) were suppressed over a similar radiation dose range. NO-dependent component of relaxation was restored when animals were treated with the antioxidant a-tocopherol acetate shortly after irradiation. The protective action of phosphatidylcholine liposomes (PCL) on endothelial function was demonstrated. The liposomes, being injected intraperitoneally (30 mg/kg) 1 hour after radiation impact, promote normalization of both endothelium-dependent vascular responses and responses to NO-donors. In contrast, PCL, were without protective effect when injected to the rabbits at the same dose 1 hour before irradiation. It appears that PCL due to its ability to normalize NO-dependent vascular tone control mechanisms might be worthwhile therapeutic approach in case of ionizing irradiation.
Key words: endothelium, ionizing irradiation, nitric oxide (NO), EDHF, NO-donors, phosphatidylcholine liposomes.