Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
PAGE 5
ЛЕКЦИЯ 15
Трансгенные животные
Стратегия получения трансгенных животных состоит в следующем.
- клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки;
- инокулированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь, поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно;
- отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках;
- скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию
Наиболее часто в ГИ исследованиях на животных используются мыши. Введение чужеродной ДНК мышам осуществляется следующими способами:
1. С помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента;
2. Микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус);
3. Введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых
клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.
Первый способ достаточно эффективен, но размер вставки небольшой - около 8 тпн., вследствие чего трансген может быть лишен прилегающих регуляторных участков, необходимых для его экспрессии. Кроме того, есть вероятность попадания в клетку животного вируса – помошника, что нежелательно, если эти животные используются в пищу.
Чаще всего используют метод микроинъекций ДНК.
- Вначале увеличивают число яйцеклеток, в которых будет инъецирована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок доноров. Для этого самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя примерно 48 часов - гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется примерно 35 яйцеклеток, вместо обычных 5-10.
- Затем скрещивают этих самок с самцами и самок умерщвляют. Вымывают из яйцеводов оплодотворенные яйцеклетки и вводят в них ДНК путем микроинъекции. Это делается под микроскопом с помощью очень тонких капилляров.
- Далее вводят полученные яйцеклетки в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность, скрещивая с вазэктомированным (кастрированным) самцом. У мышей спаривание это единственный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется, и эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток. Через три недели рождаются мышата.
Для идентификации выделяют ДНК из кончика хвоста и теститруют на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Далее проводят ряд скрещиваний для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий. В целом эффективность этого способа невелика – на 1000 имплантированых яйцеклеток - 30-50 трансгенных мышат.
Рисунок 1-12
Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток
Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на определенной стадии развития (бластоцисты), могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетке зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на той же стадии развития (бластоцисты). Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). Эти клетки легко в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный ген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных. Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекции и ретровирусных векторных систем.
ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущем трансген, культивируют и идентифицируют трансфицированные клетки методом позитивно-негативной селекции. При такой селекции происходит увеличение числа ES-клеток, в которых ДНК встроилась в нужный сайт.
Более простой способ идентификации ES-клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту – мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствующей в геноме мыши. После трансфекции ES– клеток этим вектором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной или синтетической нуклеотидной последовательности интегрированного вектора, а второй (Р2) – участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности – мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет, а при сайт-спейцифической интеграции в результате ПЦР-амплификации образуется фрагмент ДНК известного размера. Таким образом, можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а, пересевая клетки этих пулов – получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.
После идентификации популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатных» матерей. Скрещивая животных – основателей несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей.
РИСУНОК 2-12
Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования синтеза продуктов для медицинских целей.
Клонирование с помощью переноса ядра
Как была получена овечка Долли
Ядро яйцеклетки удалили с помощью микропипетки. Культивировали эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи и индуцировали их переход в фазу Go . Далее осуществляли слияние клеток в Go фазе и яйцеклеток, лишенных ядер и выращивали восстановленные яйцеклетки в культуре или яйцеводе до ранней стадии эмбриогенеза, а затем имплантировали в клетку «суррогатной» матери, где и происходило дальнейшее развитие. Было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе Go – из 29 эмбрионов развился до жизнеспособного плода.
С помощью ГИ можно выводить породы скота, с высокой скоростью роста, с более эффективным усвоением корма, а также получать молоко, в котором содержатся важные для медицины белки. Опыты по трансгенезу направлены, в основном, на превращение молочных желез этих животных в своеобразные биореакторы. Это целесообразно, потому что молоко вырабатывается животными в большом количестве и его можно надаивать без вреда для животного. Были получены трансгенные свиньи, в геноме которых были гены, ответственные за синтез человеческого гемоглобина. Однако пока практическое применение такого гемоглобина для получения заменителя человеческой крови пока невозможно из-за высокой токсичности.
Для использования молочной железы в качестве «биореактора» используют чаще всего коров. Так, например можно получать фактор Кристмаса, который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови. Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК. Этапы трансгеноза:
В эксперименте из 2470 ооцитов были получены два трансгкнных теленка, что указывает на низкую эффективность процесса.
Сейчас получены не только трансгенные коровы, свиньи и овцы, но и трансгенные птицы и рыбы. Годовалый трансгенный лосось весит в 11 раз больше обычного.