реферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Работа добавлена на сайт samzan.net:

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

КОВАЛЕНКО EMMA ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 577.1+579.8

ПОЗАКЛІТИННІ ЛЕКТИНИ БАКТЕРІЙ РОДУ Bacillus

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів

Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Hауковий консультант: член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, заслужений діяч науки України Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, заступник директора по науці, завідувач відділом фізіології промислових мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Луцик Максим Дмитрович, Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник

доктор біологічних наук, професор Руденко Ада Віктopівнa, Інcтитут урології тa нефрології АМН Укpaїни, зaвідувaч лабораторією мікробіології та вірусології

доктор біологічних наук, професор

Радавський Юрій Леонідович,

Інcтитут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

зaвідувaч відділом структури та функції білків та пептидів

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист відбудеться “ 26 ” травня 1999 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченоі ради Д 26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 252143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Автореферат розісланий “ 22 ” квітня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Останнім часом підвищений інтерес вчених ви-кликають вуглеводзв’язуючі білки – лектини, які відіграють провідну роль у процесах біологічного впізнавання, знаходяться в будь-якій біологічній системі та мають широкий спектр біологічної активності. Вони забезпечують внутрі- та міжклітинні взаємодії, виявляють мітогенні й протипухлинні властивості, виступають імуномодуляторами і тригерами, широко використовуються в різних галузях хімії, біології та медицини. Поглиблене вивчення лектинів необхідне як для пізнання регуляторних механізмів, які відбуваються в живій природі, так і для використання цих поліфункціональних речовин як ефективних медичних засобів. Сфери застосування лектинів часто обмежуються доступністю та вартістю джерел виділення; великим є також дефіцит лектинів з рідкісною вуглеводною специфічністю, а саме: до фукози, сіалових та уронових кислот, олігосахаридів, тощо; тому пошук та використання нетрадиційних джерел одержання препаратів лектинів з унікальною специфічністю є вельми необхідним.

Серед лектинів різного походження найменш вивченими є мікробні, й більшою мірою – бактерійні лектини. Серед цієї групи найбільш дослідженими є лектини, які знаходяться на поверхні клітини і беруть безпосередню участь у процесах адгезії та формування мікробних асоціацій (Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., 1989; Buchanan T.M., Pearce W.A., 1976; Kameyama N., Oishi K., 1983; Sharon N. 1984; Wadstrцm T., 1983). Позаклітинна локалізація виявляється у невеликої кількості бактерій, в основному, в патогенних штамів, для яких ці метаболіти є факторами вірулентності при різноманітних патологічних процесах та мають токсичні властивості (Draper R.K. et al., 1978; Dufrйne Y.F. et al., 1996; Kameyama K. et al., 1987; Richards R.L. et al., 1979; Wadsdrцm T., 1989). Дані щодо лектинів caпрофітних бактерій практично відсутні, тому ця група лектинів становить надзвичайно багатий матеріал для досліджень.

У зв’язку з цим, дослідження, спрямовані на поглиблений пошук позаклітинних лектинів серед зовсім не вивченої у цьому плані групи мікроорганізмів – спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus, одержання лектинів зі специфічністю, що рідко зустрічається, визначення їхніх властивостей та аспектів застосування, стають актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно планів наукових досліджень Інституту мікробіології і вірусологіі НАН України (ІМВ), а також галузевими і державними науково-технічними програмами: “Програма боротьби зі СНІДом”, “Імунопрофілактика населення на 1993-2000 роки”, “Здоров’я людини”, “Захист генофонду, та імунної системи населення України”, “Біотехнологія”.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи: встановити фізіологічні особливості спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus – cинтетиків позаклітинних лектинів, виділити та очистити лектини зі специфічністю, що рідко зустрічається, визначити їхні гемаглютинуючі, фізико-хімічні та медико-біологічні властивості та можливі сфери застосування.

Виходячи з мети роботи, було сформульовано такі основні задачі:

1. Провести поглиблений пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед представників роду Bacillus, виділених із різних екологічних ніш.

2. Вивчити особливості біосинтезу позаклітинних лектинів у процесі росту бактерій.

3. Розробити методи виділення та очищення позаклітинних сіалоспецифічних лектинів.

4. Визначити їх вуглеводзв’язуючі та фізико-хімічні властивості.

5. Установити тонку вуглеводну специфічність лектинів бацил.

6. Виявити стійкість лектинів бацил до різних факторів зовнішнього середовища.

7. Дослідити медико-біологічні властивості позаклітинних лектинів Bacillus: гостру токсичність, протипухлинну активність, дію на імуногенез, імунну відповідь макроорганізму та інтерфероногенез.

Наукова новизна роботи. При виконанні експериментальних досліджень одержано нові результати, на основі яких було вперше:

– проведено розширений пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus і встановлено їхню здатність синтезувати та виділяти у середовище росту лектини з унікальною специфічністю до сіалових та уронових кислот;

– виявлено особливості біосинтезу позаклітинних сіалоспецифічних лектинів сапрофітними бактеріями, показано вплив на цей процес різних факторів зовнішнього середовища; встановлено залежність процесу лектиноутворення від умов росту при періодичному і безперервному культивуванні; здійснено спрямований біосинтез цих метаболітів;

– одержано очищені препарати сіалоспецифічних лектинів, вивчено їхні властивості та показано, що представники роду Bacillus продукують два позаклітинні лектини, які відрізняються між собою за гемаглютинуючими, вуглеводзв’язуючими та фізико-хімічними властивостями;

– визначено тонку вуглеводну специфічність позаклітинних лектинів бацил у відношенні різних типів сіалових кислот, їх ацетильованих форм та зв’язків з термінальними вуглеводами;

– установлено здатність позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus чинити диференційовану та імуностимулюючу дію на окремі етапи імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, здійснювати вибірковий протипухлинний ефект та індукувати утворення гама-інтерферону.

Положення і висновки дисертаційної роботи утворюють новий напрям у мікробіології: вивчення фізико-хімічних властивостей та біологічної активності позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій та визначення сфер їх використання в різних галузях біології та медицини.

Практичне значення роботи. Дані щодо лектинпродукуючої здатності спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus мають значення для вирішення таких завдань сучасної мікробіології, як: визначення здатності сапрофітних бактерій утворювати сіалоспецифічні лектини, зв’язок цієї властивості з функціонуванням цих мікроорганізмів у природних умовах і використаннях її як додаткової ідентифікаційної ознаки при розробці сучасної таксономії бацил.

Встановлення особливостей утворення позаклітинних бактерійних лектинів дозволяє проводити спрямований біосинтез цих біополімерів.

Розроблена технологія одержання препаратів позаклітинних сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій з різними критеріями очищення та ступенем спорідненості до специфічних вуглеводів для різноманітних напрямків використання цих біологічно активних речовин.

Унікальна специфічність очищених лектинів бацил до різних типів сіалових кислот, їх О-ацетильованих форм та зв’язків з термінальними вуглеводами дозволяє використовувати ці речовини як високочутливі і специфічні аналітичні та діагностичні реагенти, які конкурують за тонкою вуглеводною специфічністю з моноклональними антитілами.

3а результатами проведених медико-біологічних досліджень створено умови для конструювання на основі сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій принципово нових медикаментозних препаратів направленої дії як імуномодулюючих і протипухлинних засобів.

Розроблено: Лабораторний регламент на отримання позаклітинного сіалоспецифічного лектину (штамм B.subtilis 668 ІМВ) для потреб біології, медицини та ветеринарної медицини та Технічні умови на виробництво g-інтерферонів свиней і великої рогатої худоби, в яких як індуктор інтерфероногенезу використовується бактерійний лектин.

Особистий внесок пошукача. Автору належить ідея поглибленого вивчення позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій для розуміння фізіологічних особливостей утворення цих біополімерів і проведення керованого процесу їхнього біосинтезу, а також з метою пошуку нових біологічно активних речовин, які внаслідок своїх різноманітних біоефекторних властивостей можуть знайти практичне застосування в різних галузях біології та медицини. Ця ідея знайшла eкcпepимeнтальне підтвердження в дисертаційній роботі. Автором розроблено і здійснено комплекс різнопланових досліджень експериментальної частини роботи, проведено аналіз і теоретичну обробку отриманого фактичного матеріалу, зроблено висновки та узагальнення, сформульовано наукові положення, які є значними досягненнями в лектинології. Основний експериментальний матеріал одержано автором особисто та разом із співробітниками дослідницької групи під керівництвом дисертанта (інж. І кат. К.І. Гетьман, к.б.н. І.А. Симоненко). В окремих дослідах брали участь науковці ІМВ: к.б.н. В.А. В’юницька і к.б.н. В.Є. Козирицька (пошук продуцентів позаклітинних лектинів бацил і стрептоміцетів, відпо-відно). чл.-кор. НАНУ, д.б.н., проф. І.Г. Скрипаль (розробка методу воденьзв’язуючої та гідрофобної хроматографії), к.б.н. С.К. Воцелко (визначення молекулярно-масових характеристик), акад. АТНУ, д.б.н., проф. Я.Г. Кішко (вивчення інтерфероногенної активності лектинів). Одержання сіалоспецифічних лектинів методом гідрофобної хроматографії виконано спільно з к.б.н. Л.С. Жигіс в Інституті біоорганічної хімії РАН, Москва; дослідження медико-біологічних властивостей лектинів проведено за участю д.м.н., проф. Н.І. Шарикіної та к.б.н. І.Г. Кудрявцевої (Інститут фармакологіі та токсикологіі АМНУ).

Апробація роботи. Основні положення дисертаціі та наукові результати доповідались на VII з’їзді Всесоюзного мікробіологічного товариства (Алма-Ата, 1985), 10th Congress of the Hungarian society of microbiology (Szeged, Hungary, 1987), I Pеспубліканської конференції “Изучение и применение лектинов” (Таллін-Тарту, 1988), VII і VIII з’їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989; Одеса, 1993), VII International Congress of Virology (Berlin, 1990), Всесоюзної конференції “Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов” (Москва, 1990). Науково-практичної конференції “Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней” (Харьков, 1993); 10th (Tartu, Estony,1989), 15th (Szeged, Hungary, 1993) та 17th (Wьrzburg, Germany, 1997) International Lectin Conferences; 2nd International Conference “AIDS, Cancer and Human Retroviruses” (St. Petersburg, Russia, 1997), а також конференціях, семінарах і засіданнях вченої ради ІМВ.

Публікації. 3а матеріалами дисертації опубліковано 65 наукових робіт, у тому числі: 1 монографія, 20 робіт (8 з них у зарубіжних виданнях), 35 тезах вітчизняних та зарубіжних конференцій, 8 авторських свідоцтв і патентів на винаходи (на 3 із них одержано позитивні рішення) і 1 раціоналізаторська пропозиція. Розроблена технічна документація: “Лабораторный регламент на производство внеклеточного сиалоспецифичного лектина микроорганизма Bacillus subtilis штамм 668 ИМB” і Технічні умови: “Гамма-бовиферон” і “Гамма-суиферон”.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація виконана в одному томі і містить вступ, огляд літератури (3 розділи), матеріали і методи досліджень, результати експериментальних досліджень (5 розділів), обговорення результатів і висновки, список літератури (311 джерел) та дoдаток. Робота викладена на 292 сторінках, ілюстрована 53 таблицями та 41 рисунком.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктом досліджень були спороутворюючі аеробні бактерії роду Bacillus: В.subtilis 316М – штам селекційований в ІМВ і депонований в Центральному музеї промислових культур мікроорганізмів за № ЦМИ 2466; дві культури B.mucilaginosus spp. – одержані з Інституту мінеральних ресурсів (Сімферополь) та Всесоюзного інституту сільськогосподарської мікробіології (Санкт-Петербург); 306 культур бацил – з музею відділу антибіотиків ІМВ; штам B.subtilis 668 ІMB депонований в Депозитарії ІMВ за № В-7014.

Культивування бактерій здійснювали періодичним способом на качалках (n-160 об/хв) в колбах Ерленмейера з об’ємом 100 мл та безперервним засобом у ферментерах типу “Анкум” (робочий об'єм 3 л, витрата повітря на аерацію 0,5 л/л/хв). Вихідними були: середовище 25 для B.subtilis 316М (Васківнюк В.Т. та інші, 1977); вирощування B.mucilaginosus spp. проводили на середовищі зі складом, г/л: глюкоза – 0,9; MgSO4·7H2O – 1,3; Na2HPO4 – 0,7; KNO3 – 0,9; FeCl3 – 0,05; інші штами бацил вирощували на середовищі Гаузе (Коваленко Э.А. и др., 1987). Дослідні середовища містили один з оптимальних для накопичення лектинів вуглевод: середовище 25 – мальтозу, галактозу та рамнозу. середовище Гаузе – галактозу, лактозу, фруктозу і ксилозу. Культури вирощували при 30, 37 та 42°С.

Бактерійні клітини відділяли центрифугуванням при 5000-6000 g на протязі 20 хв. Культуральний фільтрат використовували для одержання лектинів, а клітини – для визначення кількості біомаси ваговим методом і розрахунку значень питомої швидкості росту і питомої швидкості утворення лектинів (Перт, 1987).

Препарати лектинів одержували з культурального фільтрату осаджуванням етанолом (2 об’ємами), ацетоном (2 об’ємами) або висолюванням сірчанокислим амонієм у градієнті насичення від 0 до 80 %.

Для очищення лектинів використовували різні методи: афінну хроматографію на муцин-сефарозі 4В у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР), рН 7,3; лектин-афінну хроматографію на конканавалін А-глюкозил-сфероні в ЗФР з наступною елюцією a-метил-D-глюкозидом в концентрації від 10 до 100 мМ; іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ – целюлозі у фосфатному буфері, рН 8,0; гель-хроматографію на сефадексі G-50 в ЗФР та сефарозах CL-6В, 6В і 4В в трис-НСІ буфері з 0,1М NaСІ, рH 8,2; воденьзв’язуючу і гідрофобну хроматографію на гелях типу “ТSК Gel Toyoреrl” марки HW-40; HW-55 і HW-60 в трис-НСІ буфері, рН 8,0; ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі в градієнті рН 2,0-9,5.

Гемаглютинуючі властивості лектинів перевіряли на нативних і оброблених ферментами різних типів еритроцитах: кроля, миші, гвінейської свинки і людини. Наявність гемаглютинуючої (ГАА) або лектинової (ЛА) активності визначали реакцією гемаглютиції (РГА) і виражали як титр-1 РГА або lg2 титра-1РГА; питому лектинову активність (ЛАпит) – як титр-1 PГA на 1 мг білка в 1 мл (ГАО) культуральної рідини/препарату (Луцик М.Д. та ін., 1980). Вуглеводзв’язуючу здатність досліджували реакцією інгібування гемаглютинації, для чого використовували 73 вуглевода та вуглеводвмісних полімера.

Для виявлення стійкості лектинів до різних факторів зовнішнього середовища ставили РГА з трипсинизованими та обробленими глутаровим альдегідом еритроцитами кроля в різних буферних системах при рН від 2,8 до 10,0 в присутності або відсутності ЕДТА і Са2+; при визначенні термостабільності лектини інкубували на водяній бані при температурі від 40 до 100°С на протязі 5-20 хв.

Кількість білків визначали з використанням реактиву Фоліна (Lowry O.H. et al., 1951), методом Bradford M.M. (1976) або безпосередньо на електрофотометрі СФ-26 при 280 нм; вміст амінокислот вивчали на аналізаторі амінокислот КLА.

3агальні вуглеводи досліджували реакцією з фенолом і сірчаною кислотою (Dubois M. et al., 1956); якісний моносахаридний склад аналізували методом газорідинної хроматографії на хроматографі “Сrom-5” (Albershein P. et al., 1976).

Загальну протеолітичну активність визначали з використанням казеїну як субстрату (Бондарчук А.А., Ажицкий Г.Ю., 1982).

Молекулярну масу лектинів вивчали методами гель-фільтрації на сефарозі 6В (Andrews P., 1965) і методом ультрацентрифугування. Гідродинамічні характеристики лектинів аналізували за методом швидкісної седиментації на аналітичних центрифугах МОМ-31~70В та Spinko E; молекулярно-масовий розподіл проводили на препаративних ультрацентрифугах AC-601, K-32 і “Вес” L-6 (Boцелко С.К. и др., 1992).

Електрофоретичний розподіл лектинів проводили за методом диск-електрофорезу в 10 %-ному поліакріламідному гелі на приладі “Reanal” в присутності 0,1 % додецилсульфату натрію.

Для визначення гострої токсичності лектинів використовували експрес-метод Прозоровського В.Б. (1978), протипухлинної активності – рекомендації Онкологічного центру АМН Росії, імунотропних властивостей – схему експериментів, запропонованих Петровим Р.В. і Хаїтовим Р.М. (1972, 1974, 1976).

Інтерфероногенні властивості лектинів вивчали in vitro на спленоцитах миш, свиней та великої рогатої худоби; в дослідах in viro лектини вводили мишам внутрішньом’язово; тип інтерферону визначали за його чутливістю до температури та кислотостійкості (Kirhner H. et al., 1982)

Статистичну обробку експериментального матеріалу проводили за параметричними критеріями нормального розподілу варіант (Вознесенский В.Л., 1969; Урбах В.Ю.,1975); статистичні показники: середнє арифметичне, середня квадратична похибка, стандартна похибка та довірчий інтервал при рівнянні значимості 0,05 наведено в таблицях і враховано при виконанні рисунків.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Механізм біосинтезу позаклітинних лектинів Bacillus

Пошук продуцентів позаклітинних лектинів. При постійному розширенні сфер застосування лектинів потреба в цих речовинах незмінно зростає, і пошук нових нетрадиційних джерел сировини та одержання препаратів з різноманітною специфічністю і біологічною активністю є вельми актуальними задачами. Нами був проведений попередній пошук позаклітинних лектинів серед різних груп мікроорганізмів: стрептоміцетів (Валагурова Е.В. и др., 1994), молочно-кислих, коріне- і нокардіоподібних бактерій, дріжджів та бацил (Подгорский В.С. и др., 1992), всього було досліджено біля 750 культур. Найбільша кількість лектинсинтезуючих культур була виявлена в останній групі бактерій. Поглиблений пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед 309 бактерійних культур, які належать до 15 видів бацил, ізольованих із різних екологічних ніш, дозволили виявити біля 30 % штамів, здатних синтезувати ці речовини (табл. 1, 2).

Таблиця 1

Синтез позаклітинних лектинів Bacillus

Вид	Кількість штамів
	вивчених	лектинпродукуючих
B.subtilis	223	65
В.licheniformis	25	7
B.cereus	19	5
B.pumilus	13	1
B.firmus	8	2
B.polymyxa	6	3
B.megaterium	5	2
B.mucilaginosus	2	2
B.coagulans	2	1
B.thuringiensis	1	1
B.brevis	1	0
B.laterosporus	1	0
B.macerans	1	0
B.mesentericus Flage	1	0
B.sphaericus	1	0
ВСЬОГО	309	89

Таблиця 2

Здатність до продукування позаклітинних лектинів спороутворюючими
аеробними бактеріями, ізольованими з різних eкoлогічниx ніш

Джерело виділення	К-ть досліджених штамів	Активність
		Гемолітична	Гемаглютинуюча
		К-ть штамів	Титр–1	К-ть штамів	Титр–1 РГА
Організм людини: а. шлунково-кишковий тракт б. кров	21 5	13 3	8-32 8-32	3 0	2-4 0
Організм тварин (шлунково-кишковий тракт): а. сільськогосподарських б. лабораторних	65 16	19 0	2-256 0	10 0	2-4 0
Грунт	43	10	8-256	1	2
Лікувальні грязі	109	39	8-256	16	2
Гусінь шовкопряду	17	2	16-32	2	16
Філоплана яблуні	14	1	8-16	0	0
Музейні культури	19	2	4-8	0	0
ВСЬОГО:	309	89		32

У більшій мірі були досліджені штами Bacillus subtilis, які значно частіше, ніж всі останні, виділялись із шлунково-кишкового тракту людини і тварин та інших джерел; біля третини з них були продуцентами позаклітинних лектинів. Серед інших видів лектинпродукуючі культури були виявлені в B.licheniformis, B.cereus, B.polymyxa, B.megaterium, B.mucilaginosus, B.coagulans, B.firmus, B.pumilus. В окремих штамах, які належать до видів, що рідко зустрічаються, ця здатність поки не була визначена. Найбільш активними були штами, ізольовані від людей (63 %), сільськогосподарських тварин (29 %), лікувальних грязей (36 %) і грунту (20 %). Лектинова активність була виявлена саме у тих видів Bacillus, які входять до складу мікробіоценозу людини і тварин, а також сімбіотичних асоціацій грунту, що може свідчити про можливу роль позаклітинних лектинів у ряді функцій мікроорганізмів, які обумовлюються нормальною мікрофлорою: доставці поживних речовин, нейтралізації токсинів, захисту від патогенів тощо.

Для подальших досліджень були відібрані найбільш активні сапрофітні культури бацил, які супроводжують людину та тварин на протязі всього життя, і організм адаптований не тільки до цілісних клітин, але й до їх метаболітів, одними з яких є позаклітинні лектини, чия нешкідливість для людини і тварин є їхньою природною властивістю.

Динаміка утворення позаклітинних лектинів. У літературі є достатньо даних щодо вуглеводзв’язуючих властивостей позаклітинних лектинів бактерій, зустрічаються відомості щодо їх фізико-хімічних характеристик, але вивченню фізіологічних особливостей утворення лектинів присвячені одиничні дослідження (Коваленко Э.А., 1990; Подгорский В.С. и др., 1992). Вивчення цих процесів надзвичайно важливе для розуміння ролі позаклітинних лектинів у метаболізмі бактерій.

При вивченні фізіологічних особливостей росту сапрофітних штамів бацил і біосинтезу ними позаклітинних лектинів було встановлено, що динаміка проявлення лектинової активності та її рівень і тривалість були індивідуальними для кожного штаму (рис. 1). Для деяких культур на протязі такого ж часу вирощування була встановлена здатність до утворювання двох рівнів підвищення та зниження лектинової активності в культуральній рідині (рис. 1, 2.Б). Перший, максимальний екстремум активності, був відмічений у фазі гальмування росту клітин (наприкінці лог-фази); другий, менш активний – у фазі відмирання клітин (рис. 2).

Рис. 1. Динаміка виявлення лектинової активності в культуральній рідині представників Bacillus на середовищі Гаузе; культури: 1 – B.polymyxa 102 КДУ, 2 – B.subtilis 668 ІМВ, 3 – B.subtilis 684 ІМВ, 4 – B.cereus, 5 – B.subtilis 605 ІМВ, 6 – B.subtilis 685 ІМВ.

Рис. 2. Динаміка виявлення лектинової (ГАА) і протеолітичної (ПА) активностей в культуральній рідині B.subtilis 316М з автолізатом із хлібопекарних (А) або пивних (Б) дріжджів: 1 – біомасса (АСБ), 2 – ГАА, 3 – ПА.

Зниження лектинової активності в ранній стаціонарній фазі росту, можливо, пояснюєються зв’язуванням позаклітинних лектинів вуглеводних рецепторів їхніх власних клітин, що підтверджується мікроскопічними дослідженнями культур, через те що саме в цей період відмічається агрегація клітин в результаті аглютинації, яка визвана присутністю лектинів у середовищі росту. Повторне підвищення лектинової активності в культуральній рідині спричинено не активною секрецією лектинів, а виходом у середовище внутріклітинних лектинів за рахунок автоліза клітин і процесу спроутворення, який проходить у цей час росту культур.

Достовірно встановлений нами факт максимального синтезу позаклітинних лектинів бацил саме наприкінці лог-фази росту клітин свідчить про те, що ці метаболіти слід розглядати як вторинні, у зв’язку з чим подальша робота потребувала рішення таких завдань, як: проведення регуляції процесу лектиноутворювання, одержання активних препаратів лектинів бацил, вивчення їх властивостей і можливостей застосування.

Вплив температури культивування на біосинтез лектинів. На здатність бактерійних культур до синтезу вторинних метаболітів, у тому числі й лектинів, суттєво впливають різні фактори зовнішнього середовища і насамперед температура вирощування (Old D.C. et al., 1985). При культивуванні досліджуваних штамів бацил при 30, 37 та 42°С було встановлено, що температура чинить індивідуальний ефект на їх лектинсинтезуючу здатність і у всіх випадках залежно від температури змінюється кількісний вміст лектинів у середовищі росту. Оптимальною температурою для росту продуцентів і біосинтезу ними позаклітинних лектинів є температура 37°С, при якій відмічається двофазний характер накопичення лектинової активності в культуральній рідині.

Залежність лектинпродукуючої здатності бактерій від компонентів поживного середовища. При дослідженні динаміки утворювання позаклітинних лектинів бацил було встановлено, що процес лектинутворення тісно пов’язаний з ростом культур та їх функцією. У зв’язку з цим компоненти поживного середовища, які активно впливають на ріст бактерій, можуть чинити дію і на синтез лектинів.

Використання різних біостимуляторів, наприклад у випадку B.subtilis 316М, заміна автолізату з хлібопекарних дріждів на автолізат з пивних дріжджів дозволяє інтенсифікувати життєдіяльність бактерій (швидкість росту, АСБ), виявити другий екстремум активності і значно скоротити час виходу лектинів у середовище росту, що є дуже важливим для суттєвого здешевлення процесу одержання лектинів (рис. 2).

Нами встановлено, що для біосинтезу позаклітинних лектинів надзвичайно важливі концентрація і співвідношення джерел вуглецю та азоту в середовищі. Так, при вирощуванні B.mucilaginosus sp. на середовищі з глюкозою (джерело вуглецю) і КNО3 (джерело азоту) у співвідношенні 1:1 спостерігається утворення лектинів вільної і зв’язаної форм, яке закінчується до кінця першої доби (рис. 3). При культивуванні цього ж штаму на середовищах із підвищеним вмістом глюкози відзначається певна періодичність накопичення лектинів на протязі 12 діб! Такого явища до цього часу не було зареєстровано у жодних мікроорганізмів, але одержані результати свідчить про те, що процес лектинутворення може бути керованим.

Рис. 3. Біосинтез лектинів B.mucilaginosus sp.; лектинова активність: 1 – на клітинах, 2 – в культуральній рідині; 3– біомаса (АСБ); співвідношення азоту і вуглеводу в середовищі = 1:1; температура вирощування 28-30°С.

При вивченні впливу різних вуглеводів на лектинову активність культуральної рідини продуцентів встановлено, що вона постійно визначається тільки при наявності у середовищі глюкози, галактози, а також їх дисахаридів: лактози і в меншій мірі мальтози. Інші досліджувані вуглеводи мали індивідуальну дію на цей процес, а рафіноза його інгібувала (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив джерел вуглецю на утворення
позаклітинних лектинів представниками Bacillus

Вуглеводи

Штами

B.subtilis

B.cereus

B.polymyxa
102 КДУ

	316 M	605 ІМВ	668 ІМВ	684 ІМВ	685 ІМВ
глюкоза	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+ + +	+	+ + +	+ + + +
галактоза	+ + +	+ + +	+ + + +	+ + + +	+ + +	+ + + +	+ + + +
фруктоза	–	+ + +	–	–	–	+ + + +	–
рамноза	+ + +	–	–	–	–	–	+
манноза	–	–	–	–	–	+	–
ксилоза	+	-	-	-	-	-	+ + + +
арабіноза	+ +	-	-	-	-	-	+
сахароза	–	+	+	+	+	+	–
лактоза	–	+ + + +	+ + + +	+ + + +	+	+ + + +	+ + + +
мальтоза	+ + +	+	+	+	+	+ +	+ +
раффіноза	–	–	–	–	–	–	–

Примітка: “+” – наявність, “–” – відсутність гемаглютинуючої активності; підкреслені вуглеводи (тут і надалі) – основне джерело вуглеводу в контрольних середовищах для кожного штаму.

Виявлення двох екстремумів активності в культуральній рідині бацил поставило питання щодо можливості продукування ними двох лектинів у різні фази росту, яке можна було вирішити тільки при порівнянні їх вуглеводзв’язуючих властивостей. Використання більш, ніж 70 моно-, ди- і трисахаридів для реакції інгібування гемаглютинації показало, що для всіх лектинів, незалежно від фази росту та присутності того чи іншого вуглеводу у середовищі, характерна спорідненість до N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот, фруктозо-1,6-дифосфату, обох аміносахарів. Здатність досліджуваних лектинів зв’язувати деякі інші сахара (D-галактуронову, фосфоглюконову та глюкозо-6-фосфорну кислоти) була індивідуальною для кожної культури (табл. 4).

Таблиця 4

Мінімальні дози вуглеводів, які інгібують реакцію гемаглютинації лектинів,
синтезованих Bacillus у фазі затримання росту на середовищах з різними вуглеводами

Штами

Вуглеводи в середовищі

Мінімальні інгибуючі концентрації вуглеводів (мМ)

D-
галактозамін

D-
глюкозамін

D-галактуронова к-та

D-глюкуронова к-та

Фосфоглю-конова к-та

Глюкозо-6-фосфорна
к-та

N-ацетилней-рамінова к-та

Фруктозо

-1,6-дифосфат

B.subtilis 316 М

Мальтоза

глюкоза

галактоза

рамноза

18,7

9,4

75,0

–

9,4

2,3

75,0

–

3,7

7,5

3,7

7,5

–

7,5

3,7

–

4,7

2,3

–

4,7

B.subtilis 605 ИМВ

Глюкоза

галактоза

лактоза

фруктоза

150,0

75,0

–

37,5

75,0

150,0

–

3,7

30,0

–

37,5

75,0

–

150,0

37,5

75,0

37,5

7,5

–

9,4

18,7

9,4

18,7

B.subtilis 668 ИМВ

Глюкоза

галактоза

лактоза

9,4

18,7

9,4

–

1,9

0,9

3,7

1,9

18,7

9,4

1,9

0,9

3,7

18,7

2,3

9,4

B.subtilis 684 ИМВ

Глюкоза

галактоза

лактоза

9,4

4,7

18,7

1,2

4,7

–

1,9

37,5

3,7

37,5

18,7

9,4

7,5

2,3

1,2

2,3

B.subtilis 685 ИМВ

Глюкоза

галактоза

лактоза

9,4

75,0

2,3

9,4

–

1,9

3,7

37,5

150,0

18,7

9,4

18,7

15,0

1,2

2,3

B.cereus

Глюкоза

галактоза

лактоза

фруктоза

150,0

–

18,7

–

30,0

–

15,0

9,4

4,7

9,4

B.polymyxa 102 КГУ

Глюкоза

галактоза

лактоза

ксилоза

150,0

75,0

–

150,0

37,5

18,7

150,0

75,0

3,7

1,9

7,5

3,7

1,9

7,5

3,7

–

7,5

1,9

3,7

0,6

0,3

1,2

0,6

углеводзв’язуючі властивості лектинів, що продукуються як на ранніх, так і пізніх стадіях розвитку культур, проявлялись до однієї й тієї ж групи вуглеводів і були ідентичними. Різниця полягала тільки в інгібуючих дозах специфічних вуглеводів, до яких лектини І-го екстремуму активності проявляли більш високий ступінь спорідненості, ніж лектини ІІ-го екстремуму активності. Максимальна чутливість до вуглеводів була виявлена у лектинів, синтезованих на середовищах з максимальним індуктором їх синтезу; тобто синтез лектинів зростає, стає більш спрямованим, а їх вуглеводзв’язуючі властивості проявляються чіткіше.

У доступній нам літературі ми таких відомостей не знайшли. На нашу думку, різницю в ступені спорідненості до вуглеводів лектинів, синтезованих бактеріями на середовищах з різними джерелами вуглецю, можна пояснити утворенням різних ізоформ лектинів.

Дія рН середовища на утворення лектинів. При вивченні впливу рН середовища на продукування лектинів були використані вуглеводи, які здійснювали максимальний стимулюючий вплив на синтез позаклітинних лектинів бацилами; початкові значення рН середовищ коливались в межах від 5,0 до 8,0; результати цих досліджень подані на pиc. 4. Як правило, оптимальним для процесу лектиноутворення було рН середовища, яке є найкращим для росту клітин; однак закисленням середовища до рН 5,0 або залуженням його до рН 8,0 з одночасним внесенням індукуючого цей процес вуглеводу можна також підвищити рівень лектинів конкретно для кожного продуцента.

Характер росту і лектиноутворення в умовах періодичного і безперервного культивування бактеріій. Порівняльне вивчення питомої швидкості росту бактерій і утворення ними лектинів від початку культивування до фази відмирання дозволило встановити, що у всіх випадках стадія росту бактерій випереджає стадію синтезу лектинів (рис. 5). При заміні основного джерела вуглеводу в середовищі на вуглевод, який максимально індукує синтез лектинів, відмічено збіль-шення питомої швидкості росту бактерій і в більшій мірі – питомої швидкості синтезу лектинів.

Найвища лектинова активність культуральної рідини була відзначена у фазі затримання росту бактерій, що стало основою для використання методу хемостатного культивування в широкому розподілі розбавлення середовищ. Безперервне культивування при підібраних умовах дозволило підвищити гемаглютинуючу активність в середовищі в 4-16 разів і зменшити їхню здатність до біосинтезу інших біологічно активних речовин (наприклад, протеїназ В.subtilis 316М).

Одержані результати свідчать про можливу ефективну фізіологічну регуляцію метаболізму позаклітинних лектинів бацил та проведення процесу спрямованого біосинтезу цих метаболітів.

Рис. 4. Вплив рН середовища на утворення позаклітинних лектинів Bacillus; культури: A – B.subtilis 605 ІМВ, Б – B.subtilis 684 ІМВ, В – B.subtilis 685 ІМВ, Г – B.cereus,
Д – B.subtilis 316 M, E – B.subtilis 668 ІМВ, Ж – B.polymyxa 102 КДУ; вуглеводи в середовищі: 1 – глюкоза, 2 – галактоза, 3 – лактоза, 4 – фруктоза, 5 – мальтоза,
6 – рамноза, 7 – ксилоза.

Рис. 5. Питома швидкість росту бактерій – mх (1) і питома швидкість накопичення лектинів – mр (2)) B.subtilis 668 ІМВ на середовищі Гаузе з глюкозою (А) та середовищі Гаузе з галактозою (Б).

Таким чином, встановлена здатність бактерій роду Bacillus синтезувати позаклітинні лектини зі специфічністю до сіалових і уронових кислот, вивчення фізіологічних особливостей росту бактерій дозволило виявити три факти: індиві-дуальність процесу лектиноутворення для кожної культури, обмеженість у часі проявлення лектинової активності в культуральній рідині, а також наявність у ній двох екстремумів активності; найбільш висока лектинова активність відмічена в стадії затримання росту бактерїй; стадія росту бактерій випереджає стадію синтезу лектинів; на лектинсинтезуючі властивості бацил впливають різні фактори зовнішнього середовища: температура та час вирощування, склад і рН поживного середовища, наявність у ньому певного вуглеводу й біостимуляторів; підбір оптимальних умов культивування бактерій дозволили здійснити керований синтез позаклітинних лектинів.

Одержання позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus

Виділення лектинів з культуральноі рідини. В літературі є відомості щодо майже 70 бактерійних лектинів (Коваленко Э.А., 1990; Подгорский B.C. и др., 1992), однак більшість із них не одержано в очищеному стані і не вивчено. Труднощі пов’язані з надзвичайною лабільністю молекул цих біополімерів, що проявляєються у великій втраті активності та вуглеводної специфічності, в більшій мірі до сіалових кислот, на різних етапах очищення. У зв’язку з цим одним із головних завдань був підбір і розробка методів одержання позаклітиних сіалоспецифічних лектинів бацил.

На першому етапі – виділенні лектинів із культуральної рідини – були апробовані у порівняльному аспекті загальні методи білкової хімії: висолювання сульфатом амонію та осаджування спиртом й ацетоном. Сумарні препарати лектинів з найвищими показниками за активністю, ступенем очищення, виходом за активністю і спорідненістю до N-ацетилнейрамінової кислоти були одержані при висолюванні сульфатом амонію. За результатами очищення були відібрані три най-більш активні лектини, які надалі будемо називати за номерами штамів: лектин 316, лектин 668 та лектин 102.

Очищення сіалоспецифічних лектинів. При підборі методів очищення сіалоспецифічних лектинів бацил були використані різні види хроматографії, гель-фільтрації та ізоелектрофокусування.

Використання методів афінної хроматографії на муцин-сефарозі та лектин-афінної хроматографії на конканавалін-А-глюкозил-сфероні не дали очікуваних результатів, однак дозволили одержати інформацію щодо дуже високого ступеня спорідненості досліджуваних лектинів до сіалових кислот та про наявність двох позаклітинних лектинів 668 і 102, які мають часткові відмінності в хімічній структурі їх молекул; один із них являє собою N-acпарагінзв’язаний глікопротеїн. При хроматографії на інших носіях відмічено значні втрати активності лектинів і повна відсутність їх спорідненості до N-ацетилнейрамінової кислоти.

Позитивні результати були отримані при використанні методів гель-фільтрації на різних типах сефароз (CL 6В, 6В та 4В) із наступною рехроматографією на цих же носіях, послідовної водень-зв’язуючої і гідрофобної хроматографії на TSK гелях та ізоелектрофокусування в системі борат поліольних носіїв. При використанні цих методів булі одержані один лектин 316 (рис. 6) і два лектини або їх п’ять ізоформ лектинів 668 та 102 (рис. 7, 8).

Рис. 6. Рехроматографія лектину B.subtilis 316М на сефарозі 4В: 1 – білок,
2 – гемаглютинуюча активність, 3 – вуглеводи.

Рис. 7. Воденьзв’язуюча (А) і гідрофобна (Б) хроматографія лектинів B.polymyxa 102 КДУ (аналогічні дані одержано для В.subtilis 668 ІМВ) 1 – білок; 2 – гемаглютинуюча активність.

Рис. 8. Рехроматографія на сефарозі CL-6В (А) та ізоелектрофокусування (Б) лектину В.subtilis 668 ІМВ: 1 – білок, 2 – гемаглютинуюча активність, 3 – вуглеводи, 4 – градієнт рН.

Очищені препарати лектинів чітко розподілялись на дві групи: перша – лектини 316, 668-1 та 102-1 з дуже високою питомою активністю (до 422813 ГАО), ступенем очищення 216,1-237,8 разів, виходом за активністю 64,0-81,9 % і за білком до 0,84 %; для другої групи лектинів (668-2 та 102-2) відмічено нижчі показники очищення, однак чіткий розподіл лектинів свідчить про ефективність застосованих методів.

Для очищених препаратів лектинів характерна різниця в ступені спорідненості до специфічних вуглеводів. Для лектину 316 відмічена здатність реагувати в більшій мірі з фруктозо-1,6-дифосфатом та N-ацетилнейраміновою кислотою (мінімальні інгібуючі РГА дози вуглеводів 0,6 мМ та 0,9 мМ, відповідно). Лектини 668-1 та 102-1 виявляли спорідненість до N-ацетилнейрамінової кислоти (0,5 мМ та 0,9 мМ, відповідно), D-глюкуронової кислоти (0,9 мМ), фруктозо-1,6-дифосфату (2,3 мМ та 0,3 мМ, відповідно), обох аміносахарів (18,7 мМ). Лектин 102-1 реагував також з D-галактуроновою кислотою (0,9 М). Лектини другої групи відрізнялись від лектинів першої групи більш вузькою вуглеводною специфічністю; лектин 668-2 мав здатність до впізнавання тільки N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот (0,9 мМ), а лектин 102-2 через свою чутливість тільки до D-глюкуронової кислоти (0,9 мМ) відноситься до моноспецифічних лектинів, що зустрічається вкрай рідко.

Отже, при порівняльному використанні для очищення сіалоспецифічних лектинів різних методів нами підібрані декілька найбільш результативних, які вперше використовуються для цієї мети, а саме: гель-фільтрація на різних типах сефароз, хроматографія на TSK гелях та ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі, що дозволяє одержувати нативні препарати лектинів та їх ізоформи з різними, більшістю, високими показниками очищення і великою спорідненістю до сіалових і уронових кислот. Розроблені схеми очищення включають усього два етапи: висолювання звільненого від клітин культурального фільтрату сульфатом амонію та хроматографію на TSK гелях; для одержання ізоформ лектинів додається третій етап: рехроматографія або ізоелектрофокусуванння. Очищені препарати сіалоспецифічних лектинів бацил високоактивні і відповідають світовим стандартам таких біополімерів.

Характеристика позаклітинних лектинів Bacillus

Xімічний склад лектинів бацил. Вивчення хімічного складу ізольованих лектинів бацил показало, що всі вони є глікопротеїнами, які містять у своєму складі 53,7-76,0 % білка та від 4,9 % до 11,5 % вуглеводів (табл. 5). Відмічено різницю за вмістом білка в різних препаратах: у лектинах 668-1 та 102-1 кількість білка була в 1,3-1,4 рази більша, ніж у лектинах 668-2 та 102-2.

Таблиця 5

Хімічний склад позаклітинних лектинів Bacillus

Лектини	Вміст, % до сухої ваги
	Білок	Вуглеводи
B.subtilis 316 M	55,0±12,0	11,5±1,5
B.subtilis 668 ІМВ: лектин 1 лектин 2	76,0±13,0 53,7±14,3	5,1±0,1 5,3±0,2
B.polymyxa 102 КДУ: лектин 1 лектин 2	75,5±1,2 56,5±6,5	4,9±0,3 5,4±0,5

За амінокислотним складом та кількісним вмістом амінокислот дocліджувані лeктини подібні до інших бактерійних лектинів і сіалоспецифічних лектинів, ізольованих з різних джерел. В їхньому складі визначена значна кількість дикарбонових кислот (аспарагіну та глютаміну) й валіну, і повністю відсутні сірковмісні амі-нокислоти; вміст інших амінокислот коливається в середніх значеннях. Відмічена подібність за кількісним вмістом певних амінокислот у лектинів першої і другої групи; лектини 662-2 та 102-2 відрізняються від лектинів першої групи підвищеною кількістю треоніна та серина.

При дослідженні моносахаридного складу встановлено, що лектини обох груп містять переважну кількість глюкози та галактози і відрізняються між собою за вмістом манози та арабінози (перша група лектинів) і рамнози та рибози (друга група лектинів).

Якісний та кількісний вміст амінокислот і моносахаридів у лектинах 316, 668-1 та 102-1 характерний для типу N-глікозидного зв’язку в молекулі глікопротеїнів, в яких білкова частина зв’язується з вуглеводною через аспарагін, а в лектинах 668-2 та 102-2 свідчить про наявність в їх молекулах О-глікозидного типу зв’язку через серин і треонін. Це узгоджується з результатами, одержаними при зв’язуванні досліджуваних лектинів з конканавалін-А-глюкозил-сфероном, а також при очищенні на TSK гелях.

Фізико-хімічні властивості лектинів бацил. Вивчення фізико-хімічних характеристик очищених до гомогенного стану препаратів позаклітинних лектинів показало, що лектини першої групи мають молекулярну масу порядку 19-26 кДа, а другої – значно (в 3 рази) меншу. За даними гель-фільтрації на сефарозі молекулярні маси всіх лектинів були на порядок більші, що пов’язано, можливо, з тенденцією очищених препаратів до агрегації з утворенням значних комплексів лектинів, що ясно видно на фотографії (рис. 9).

Рис. 9. Очищені лектини бактерій роду Bacillus

(електронна мікроскопія x30000 разів)

Порівняльні дані, одержані при використанні різних методів очищення, вивчення вуглеводзв’язуючих, фізико-хімічних властивостей свідчать про те, що B.subtilis 316М синтезує один позаклітинний лектин, який становить собою N-аспарагінзв’язаний, глюкозо/манозовмісний глікопротеїн, а дві інші культури (B.subtilis 668 ІMB та B.polymyxa 102 КДУ) мають здатність до утворення двох позаклітинних лектинів, один із яких є також N-аспарагінзв’язаним глікопротеїном, а другий відноситься до О-серин/треонінзв’язаних глікoпpoтeїнів.

Резумуючи результати вивчення фізико-хімічних властивостей позаклітинних лектинів Bacillus, слід відзначити, що вони становлять собою глікопротеїни, які відрізняються за вмістом білків, вуглеводів, амінокислот і моносахаридів, що може свідчити про відмінності в структурній організації їхніх молекул, ці біополімери мають різні молекулярні маси і в очищеному стані можуть утворювати крупномолекулярні агрегати.

Гемаглютинуючі властивості позаклітинних лектинів Bacillus

Взаємодія лектинів бацил з різними типами еритроцитів та глікоконьюгатами. Нами вперше виявлена здатність сапрофітних бактерій синтезувати позаклітинні лектини та їх специфічність до сіалових кислот. Порівняльна характеристика ступеня спорідненості до незаміщених сіалових кислот найбільш відомих сіалоспецифічних лектинів показала, що лектини бацил є найбільш чутливими до цих моносахаридів (табл. 6). За своїми характеристиками сіалоспецифічні лектини бацил відповідають світовим стандартам сіалоспецифічних лектинів, виділених з інших джерел, а за деякими (активністю, ступенем спорідненості до сіалових кислот, тощо) – перевищують їх.

Таблиця 6

Порівняльна характеристика сіалоспецифічних лектинів
(мінімальні інгібуючі концентрації сіалових кислот в мМ)

Сіалові кислоти	Achatina fulica*	Cancer antennarius*	Lobster*	H.granu-lomanus*	E.coli*	Bacillus
						subtilis	polymyxa
						316 M	668 ІМВ	102 КГУ
N-ацетил-нейрамінова	1,9	8,3	50,0	12,5	9,7	0,9	0,5	0,9
N-гліколил-нейрамінова	–	8,3	–	25,0	н/в	0,7	н/в	н/в

Примітка: “—” – відсутність інгібування, н/в – не визначали, * – цит за Mandal C., 1990.

Визначення тонкої вуглеводної специфічності досліджуваних лектинів до природних сіало- та сіаловмісних глікоконьюгатів, які мали у своєму складі різні типи, форми та кількість сіалових кислот, дозволило встановити, що всі вони взаємодіють тільки з тими з них, щo містять у своєму складі обидва типи сіалових кислот (муцином підщелепної залози бика та фетуїном) або -ізомером N-ацетилнейрамінової кислоти в О-ацетильованій формі, які мають 2,3-, a2,6- та в меншій мірі 2,8-зв’язки: фібриногеном, імуноглобуліном і коломіновою кислотою (табл. 7). Найвищу спорідненість лектини бацил виявляли до муцину підщелепної залози бика, що містить найбільшу кількість обох типів сіалових кислот, в яких термінальна нейрамінова кислота зв’язана з галактозою 2,6-зв’язком. Цим і можна пояснити велику міцність комплексу муцин-лектин при пропусканні розчинів лектинів через муцин-сефарозу.

Для підтвердження одержаних результатів проведено дослідження аглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів бацил у відповідності до еритроцитів різних видів тварин, які відрізняються вмістом відмінних типів сіалових кислот й наявністю їхніх заміщених форм. Виявилось, що позаклітинні лектини бацил взаємодіють тільки з еритроцитами кроля та миші, в яких сіалові кислоти представлені в більшій мірі N-гліколилнейраміновою кислотою та О-заміщеною формою N-ацетилнейрамінової кислоти. Відсутність аглютинації еритроцитів усіх груп крові людини зрозуміла, через те що в еритроцитах людини немає N-гліколилнейрамінової кислоти, а є переважно N-ацетилнейрамінова кислота в незаміщеній формі.

3aлeжнicть гeмaглютинуючoї активності лектинів від факторів зовнішнього середовища. Вивчення гемаглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів бацил продемонструвало, що вони мають ряд особливостей, які суттєво відрізняють їх від інших бактерійних лектинів. Насамперед, лектини бацил стійкі в широкому діапазоні рН: від 4,8 до 9,1. Вони є Са2+ – незалежними біополімерами, нечутливими до дії детергентів, зокрема ЕДТА, (табл. 8). Це свідчить, можливо, про те, що йони металів не є структурними елементами лектинів, необхідними для їх зв’язуючих властивостей. Для інших бактерійних та сіалоспецифічних лектинів така залежність встановлена й виявлено, що в присутності йонів Са2+ та ЕДТА відбувається їхня повна або часткова інактивація (Mandal C., 1990).

Таблиця 7

Спорідненість позаклітинних лектинів Bacillus до природних глікоконьюгатів

Інгібітори

Мінімальні інгібуючі РГА
концентрації вуглеводів, мМ

Лектини

316

668-1

668-2

102-1

102-2

I. Вуглеводи:
Neu5Ac
Neu5Ac2СH3
Neu5Ac2CH3
2-3 Sia Lac
2-6 Sia Lac

0,9

2,5

0,5

0,2

0,9

0,5

1,9

0,4

0,05

0,5

0,9

0,1

0,02

0,9

0,5

2,5

0,5

0,1

1,9

0,9

2,5

0,9

0,2

II. Глікоконьюгати, що містять два типа сіалових кислот:
Муцин підщелепної залози бика
Фетуїн

0,78

1,56

0,19

0,39

3,12

0,39

3,12

0,78

3,12

III. Глікоконьюгати, що містять N-ацетилнейрамінову кислоту в О-ацетильованій формі:
Фібриноген
Імуноглобулін
Коломінова кислота

6,25

12,50

3,12

12,50

3,12-6,25

3,12

12,50

6,25

1,56

12,50

3,12

6,25

12,50

IV. Глікоконьюгати, що містять N-ацетилнейрамінову кислоту в N-ацетильованій формі:
Муцин слизової кишечника свині
Овомукоїд
Тиреоглобулін

–

V. Асіалоконьюгати:
Карбоксиметил--овомуцин
Овальбумін
Трансферин
Овотрансферин

–

Примітка: “—” – відсутність РГА.

Таблиця 8

Аглютинація кролячих еритроцитів лектинами Bacillus
у присутності Са2+ і ЕДТА (титр–1 РГА)

Лектини	Буфер без Са2+ і ЕДТА (контроль)	Буфер з 30 мМ Са2+	Буфер, що містить ЕДТА, %
			0,2	0,4
316	512-1024	1024	1024	512-1024
668	32768-65536	65536	32768-65536	32768-65536
102	32768-136072	65536	136072	65536

Одна з важливих характеристик досліджуваних лектинів – це їхня термостабільність. Прогрівання 1 %-них розчинів лектинів при 80°С протягом майже 5 год. не змінює їхні аглютинуючі властивості, у той час як інші лектини рідко витримують прогрівання вище, ніж 50°С (Atkinson H.M., Trust T.I., 1980; Dehazya P., Coles R.S., 1982; Huang J. et al., 1988).

Стабільність бацилярних лектинів при зберіганні. Необхідною умовою при роботі з препаратами лектинів є збереження їхніх головних характеристик: активності та вуглеводної специфічності при довгому зберіганні. Дослідження різних способів зберігання позаклітинних лектинів бацил дало можливість установити, що ці речовини у ліофілізованому стані можуть зберігатися роками без особливих втрат активності та специфічності.

Одержані дані щодо гемаглютинуючих властивостей позаклітинних лектинів Bacillus свідчать про те, що ці біополімери мають дуже вузьку вуглеводну специфічність та високий ступінь впізнавання точно певних структур і можуть успішно конкурувати з моноклональними антитілами як аналітичні й діагностичні реагенти. Лектини бацил стійкі до впливу різних факторів зовнішнього середовища (температури, рН, хелатуючих агентів, тривалого зберігання), що є важливі-шою відмінністю від інших бактерійних лектинів і визначає їхні переваги при одержанні та використанні.

Біологічна активність позаклітинних лектинів Bacillus

Гостра токсичність лектинів бацил. Науковий і практичний інтерес до бактерійних лектинів зумовлений їхньою постійною дією на організм макроорганізмів і можливістю регуляції імунологічної реактивності організму за допомогою цих фізіологічно активних речовин. Лектини сапрофітних бактерій можуть стати перспективними медикаментозними препаратами. Визначення одного з головних фармакологічних індексів медикаментозних препаратів – гострої токсичності на двох видах тварин при різних шляхах введення показала, що досліджувані лектини бацил відносяться до помірних та малотоксичних речовин (табл. 9).

Таблиця 9

Середньосмертельні дози лектинів Bacillus за різними шляхами введення

Шляхи введення

LD50, мг/кг

	Лектин 316	Лектин 668	Лектин 102
Миші
Внутрішньом’язовий	не визначали	68 (46-101)	294 (210-318)
Підшкірний	не визначали	71 (59-84)	248 (195-301)
Внутрішньочеревний	564 (490-640)	89 (75-106)	200 (154-246)
Внутрішньовенний	не визначали	37 (26-54)	не визначали
Пацюки
Внутрішньочеревний	150 (137-163)	71 (62-80)	60 (52-68)
Внутрішньовенний	не визначали	52 (45-59)	не визначали

Примітка: тут и далі досліджували сумарні препарати лектинів 668 и 102.

Протипухлинна активність лектинів бацил. Проведене вивчення протипухлинної активності позаклітинних лектинів Bacillus у відношенні штамів пухлин різного генезу дозволило одержати різні результати (рис. 10). Найбільш активну та стабільну протипухлинну дію у відношенні гальмування росту пухлин виявляв лектин 668 (позитивний ефект на 4-х з 5-ти експериментальних пухлин). Близьким до нього за протипухлинним ефектом був лектин 102 (гальмування росту 3-х пухлин). Дія лектина 316 була неоднозначною: цей лектин мав вагомий протипухлинний ефект на одному штамі пухлини, а на двох – стимулював їх ріст. Такі неоднозначні результати цілком пояснюються; відомо, що при трансформації нормальної клітини в пухлинну в складі компонентів поверхні клітини відбувається ряд кількісних та якісних змін: збільшується кількість сіалових кислот, змі-нюється їхній якісний склад, зв’язки з субтермінальним вуглеводом (Глузман Д.Ф. и др., 1989). Досліджувані лектини, які мають тонкі відмінності в пізнаванні різних типів і структур сіалових кислот, можливо, спочатку розпізнають певні компоненти поверхні клітини, а потім чинять імунотропну дію, характерну для кожного лектину, в протипухлинний ефект. Одержані дані відкривають нові сторони фармакологічної дії позаклітинних сіалоспецифічних лектинів Bacillus та дозволяють розглядати їх як вельми перспективні протипухлинні засоби, можливо, у сполученні з іншими терапевтичними препаратами.

Вплив лектинів бацил на окремі ланцюги імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму. Вивчення впливу позаклітинних лектинів бацил на окремі рівні імуногенезу від початкових етапів (функціонального стану поліпотентної стовбурової клітини кісткового мозку) до функціонування системи імунітету (диференційованої оцінки специфічних реакцій Т- і В- лімфоцитів та їх кооперативної взаємодії в імунній відповіді) дозволило встановити, що всі досліджувані лектини бацил мають виражений та диференційований імуностимулюючий ефект (рис. 10). На ранні етапи імуногенезу (міграцію і проліферацію стовбурової клітини кісткового мозку) найбільшу дію чинить лектин 102 (+44,6-51 %); міграція та функціональна активність Т- і В-лімфоцитів (середні етапи) приблизно однакова при дії всіх трьох лектинів з деякою перевагою для лектину 668 (22,2-35,7 %); однак, вплив лектину 316 на кооперативну взаємодію імунокомпетентних клітин (пізні етапи) значно вища, ніж в інших досліджуваних лектинів (61,4 %).

Імунна відповідь спленоцитів у більшій мірі зростає під впливом лектину 668 (33,0 %), а функціональна активність В-лімфоцитів кісткового мозку значно вища після обробки лектинами 102 і 316 (62,5 та 72,6 % відповідно). Найбільшу дію на В-лімфоцити чинить лектин 668, на Т-клітини – лектин 102. Виявлення вираженого та вибіркового впливу позаклітинних лектинів бацил на різні етапи імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, встановлення можливості селективно модулювати T- і В- системи лімфоцитів має безперечний інтерес з точки зору керованої імунодепресії та імуностимуляції.

Інтерфероногенна активність лектинів бацил. Інтерфероногенні властивості виявлені у вірусів, бактерій та їхніх активних компонентів – ліпополісахаридів (Liener I.E., 1986). Добре вивченими і широко використовуваними у лабораторній практиці є також рослинні лектини: ФГА та КонА (Луцик М.Д. и др., 1981). Аналіз інтерфероніндукуючої здатності позаклітинних лектинів бацил in vivo та in vitro продемонстрував, що всі три лектини є індукторами утворення -інтерферону, однак найбільш високий ефект мав лектин 668 (рис. 10). Його інтерфероногенна дія була однаковою з дією стандартних комерційних препаратів рослинних лектинів, а у випадку застосування “праймінгу” перевищувала її. Здатність до індукції синтезу -інтерферону лектину 102 була близькою до подібної лектину 668, а для лектину 316 – незначною. Одержані результати свідчать про те, що позаклітинні лектини бацил є сильними індукторами синтезу природного -інтерферону; відсутність токсичних та алергічних ефектів дозволяє рекомендувати лектин 668 для широкого використання.

Подібні медико-біологічні властивості лектинів 668 та 102 пояснюються великою схожістю цих лектинів за фізико-хімічними та гемаглютинуючими характеристиками. Лектин 316 відрізняється від них багатьма властивостями і не є винятком у відношенні його біологічної активності.

Одержання активних препаратів сіалоспецифічних лектинів сапрофітних бактерій, вивчення їхніх гемаглютинуючих і фізико-хімічних властивостей та біоло-гічної активності дозволило визначити такі можливі аспекти їх використання. Насамперед, надзвичайна, на наш погляд, тонка вуглеводна специфічність дозволяє застосовувати позаклітинні лектини бацил як цінні аналітичні реагенти та діагностичні препарати, що не поступаються за своєю чутливістю моноклональним антитілам. Медико-біологічні властивості цих біополімерів свідчать про перспективність їхнього використання як протипухлинних та імуномодулюючих лікарських засобів, індукторів синтезу g-інтерферону, а також для конструювання лікарських препаратів на базі бактерійних лектинів (вакцин, молекулярних асоціацій, тощо).

ВИСНОВКИ

1. Проведено широкий пошук продуцентів позаклітинних лектинів серед представників спороутворюючих аеробних бактерій роду Bacillus та виявлено їхню здатність синтезувати та виділяти в середовище росту лектини зі специфічністю, що рідко зустрічається, до сіалових і уронових кислот.

2. Особливостями утворення позаклітинних лектинів сапрофітних культур бацил у процесі їхнього росту є: наявність двох періодів виявлення лектинової активності в динаміці росту бактерій, максимальне продукування лектинів у фазі затримання росту, відокремленість ростових та лектинсинтезуючих процесів. Визначено оптимальні умови утворення позаклітинних лектинів (температура і час вирощування, склад та рН середовища, наявність у ньому біостимуляторів і конкретних вуглеводів), що дозволяє здійснити керований синтез цих біополімерів.

3. Підібрано методи виділення та очищення позаклітинних сіалоспецифічних лектинів бактерій із використанням хроматографії на TSK гелях, гель-фільтрації на різних типах сефароз та ізоелектрофокусування в борат-поліольній системі, які дозволяють одержувати препарати лектинів та їхні ізоформи з високими показниками за активністю, очищенням та ступенем спорідненості до специфічних вуглеводів.

4. У сапрофітних бактерій установлено здатність до продукування двох позаклітинних лектинів, що відрізняються між собою за хімічним складом їхніх молекул, фізико-хімічними характеристиками, активністю та вуглеводзв’язуючими властивостями:

– лектини першої групи відносяться до N-аспарагінзв’язаних глікопротеїнів з вираженими гідрофільними властивостями, молекулярною масою 19-26 кДа, високою гемаглютинуючою активністю та ступенем спорідненості до обох типів сіалових та уронових кислот, а також до фруктозо- 1,6-дифосфату; для першої групи лектинів установлено наявність трьох ізоформ;

– лектини другої групи становлять собою О-серин-треонінзв’язані глікопротеїни, котрі виявляють великі гідрофобні властивості з молекулярною масою 7,7-10,0 кДА, більш низькою активністю і вузькою вуглеводною специфічністю до N-ацетилнейрамінової та D-глюкуронової кислот, лектини цієї групи існують у двох ізоформах.

5. Позаклітинні лектини Bacillus є термостабільними, стійкими до дії рН та детергентів, Ca+2 – нeзалежними глікополімерами, які зберігають свою активність при тривалому зберіганні, здатними у чистому вигляді утворювати великі агрегати з молекулярною масою 77-260 кДА.

6. Досліджувані лектини розпізнають тонкі відмінності в структурі сіалових кислот та їхніх зв’язках із термінальними вуглеводами; найбільшу спорідненість лектини бацил виявляють до глікоконьюгатів, які містять N-гліколил- та N-ацетилнейрамінові кислоти або -ізомер О-ацетильованої форми N-ацетилнейрамінової кислоти з 2,3- та 2,6- зв’язками.

7. Позаклітинні лектини бацил відносяться до помірно й малотоксичних речовин та мають виражені імунотропні властивості: диференційовано стимулюють ведучі ланцюги імуногенезу та імунну відповідь макроорганізму, виявляють вибірковий стимулюючий ефект у відношенні Т- і В-лімфоцитів, чинять селективну протипухлинну дію, виступають індукторами утворення -інтерферону в різних біологічних системах.

8. Розроблено лабораторний регламент на отримання позаклітинного сіалоспецифічного лектину (штам B.subtilis 668 1MB), де описуються особливості проведення технологічного процесу і характеристика готового продукту для використання його як імунотропної речовини, індуктора -інтерферону та хіміко-аналітичного реагенту. Одержані практичні результати за здатністю лектину B.subtilis 668 ІМВ індукувати синтез -інтерферону увійшли як складова частина в ТУ по виробництву -інтерферонів свиней та великої рогатої худоби.

9. Позаклітинні сіалоспецифічні лектини сапрофітних бактерій можуть використовуватись у таких напрямках:

– як високочутливі та специфічні аналітичні реагенти (для виділення, очищення, вивчення сіалоспецифічних глікополімерів) та діагностикумів (при пухлинах різного генезу);

– як медикаментозні препарати направленої дії на різні етапи імуногенезу, імунну відповідь макроорганізму, Т- і В-системи імунітету;

– для одержання -інтерферонів;

– для профілактики та лікування інфекційних захворювань, злоякісних утворювань та імунодефіцитних станів різної етиології;

– для конструювання на основі бактерійних лектинів принципово нових терапевтичних препаратів.

Перелік основних праць, опублікованих за темою дисертації

1. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. – К.: Наукова думка, 1992. – 203 с.

2. Коваленко Э.А. Внеклеточные лектины бактерий (обзор) //Микробиол. ж. – 1990. – Т. 52, № 3. – С.92-99.

3. Коваленко Э.А. Аминокислотный и моносахаридный состав внеклеточных сиалоспецифичных лектинов бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. – 1997. – Т. 59, № 5. – С. 3-6.

4. Коваленко Э.А. Углеводная специфичность внеклеточных лектинов бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. – 1997. – Т. 59, № 5. – С. 7-13.

5. Коваленко Э.А. Ферменты, обладающие лектиновыми свойствами //Микробиол. ж. – 1984. – Т. 46, № 2. – С. 65-66.

6. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Влияние факторов внешней среды на биосинтез лектинов Bacillus mesentericus //Микробиол. ж. – 1998. – Т. 50, № 2. – С. 12-16.

7. Коваленко Э.А., Колтукова Н.В., Стрельчина Т.В., Подгорский В.С. Использование крахмалсодержащих сред для культивирования Bacillus mesentericus //Прикладная биохимия и микробиология. – 1988. – Т. 24, № 6. – С. 784-788.

8. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Вьюницкая В.А. Влияние условий культивирования на продуцирование лектинов некоторыми представителями бактерий рода Bacillus //Микробиол. ж. – 1989. – Т. 51, № 5. – С.30-34.

9. Косенко Л.В., Коваленко Э.А. Республиканская конференция “Изучение и применение лектинов” //Микробиол. ж. – 1989. – Т. 51, № 5. – С. 108-110.

10. Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Вьюницкая В.А. Бактерии рода Bacillus – продуценты внеклеточных лектинов //Ученые записки Тартуского ун-та, 869. – 1989. – Т. 1. – С. 72-80.

11. Симоненко И.А., Коваленко Э.А., Подгорский В.С. Лектинпродуцирующая способность Bacillus mesentericus //Ученые записки Тартуского ун-та, 869. – 1989. – Т. 1. – С. 118-123.

12. Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Физиологические аспекты регуляции биосинтеза лектинов бактериями рода Bacillus // Ученые записки Тартуского ун-та, 869. – 1989. – Т. 2. – С. 122-126.

13. Коцоурек Я., Франц Г., Этцлер М., Чакрабарти Р., Джильбоа-Гарбер Н., Коваленко Э.А., Косенко Л.В., Лахтин В.М. Лектины и аспекты их изучения (дискуссия). //Микробиол. ж. – 1990. – Т 52, № 1. – С. 84-90.

14. Косенко Л.В., Коваленко Э.А. II-я Международная конференция по лектинам (ИНТЕРЛЕК-II) //Микробиол. ж. – 1990. – Т. 52, №3. – С. 102-105.

15. Скрипаль И.Г., Малиновская Л.П., Токовенко И.П., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Гидрофобная и водород-связывающая хроматография лектинов // Микробиол. ж. – 1992. – Т. 54, №2. – С. 59-65.

16. Zhigis L.S., Ivanov A.E., Rapoport E.M., Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P. Purification of sialic acid binding protein from saprophytic bacteria by hydrophobic-interaction chromatography on butyl-toyoperl and polymer-coated porous glass //Biotechnology Technique. – 1993 (Sept.) – Vol. 7, № 9. – P. 667-670.

17. Валагурова Е.В., Козырицкая В.Е., Шеремет Л.К., Коваленко Э.А. Способность коллекционных культур стрептомицетов образовывать внеклеточные лектины // Микробиол. ж. – 1994. – Т. 56, №4. – С. 11-15.

18. Kishko Ya.G., Kovalenko E.A. New technology on production of animal gamma-interferons //J. Interferon & Cytokine Research. – 1995. – Vol. 15, Suppl. 1. – P. S84.

19. Rapoport E.M., Ivanov A.E., Zhigis L.S., Kovalenko E.A., Getman E.I., Zubov V.P. Purification of lectin ву hydrophobic – interation and size-exlusion chromatography. //IJBS – 1996. – Vol. 2 (1). – P.17-24.

20. Kishko Ya.G., Vasilenko M.I., Podgorsky V.S.,Kovalenko E.A. Lectin of Bacillus subtilis sp. as overinducer of g-interferonogenesis //Микробиол. ж. – 1997. – Т. 59, № 6. – С. 20-26.

21. Kishko Ya.G., Vasilenko M.I., Podgorsky V.S., Kovalenko E.A. Influence of Bacillus subtilis sp. lectin on functional activity on phagocytes //Мікробіол. ж. – 1998. – Т. 60, № 1. – С. 36-42.

22. Ас. СССР SU № 1622397 А1. МКИ С12 Р 19/04. Способ получения бакте-риального лектина, специфичного к сиаловым кислотам /Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А., Лахтин В.М. Заявлено 01.08.88. Опубл. 12.01.91. Бюл. № 3 – 2 с.

23. Ас. СССР SU № 1756357 А1. МКИ С12 Р 19/00. Способ определения молекулярно-массового распределения биологически активных веществ /Воцелко С.К., Иутинская Г.А., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Заявлено 23.12.88. Опубл. 23.08.92. Бюл. № 31 – 14 с.

24. Ас. СССР № 4936807/1341712. МКИ С12 Р 19/04 Способ получения бактериального внеклеточного лектина /Кудря В.А., Симоненко И.А., Захарова И.Я., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Заявлено 15.01.90. Положительное решение 29.09.92.

25. Ас. СССР SU № 1701322. МКИ 5А 61К 45/2. Индуктор g-интерферона /Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И., Лазоренко Л.В., Симоненко И.А. Заявлено 12.05.91. Опубл. в Бюл. № 48, 1992. – 10 с.

26. Патент України UA № 1791. МКІ 5С 12Р 19/04 Засіб одержання бактерійного лектину, специфічного до сіалових кислот /Підгорський В.С., Коваленко Е.О., Симоненко І.А., Лахтін В.М. Заявлено 10.08.91. Опубл. 20.10.93. Бюл. № 3 – 2 с.

27. Патент України UA № 8276 А. Спосіб виготовлення гама-інтерферону та пристрій для його здійснення /Кішко Я.Г., Іваненко В.К., Думанський В.Д., Коваленко Е.О., Лазоренко Л.В., Селезньов О.В. Заявлено 23.03.94. Опубл. 29.03.96. Бюл. № 1 – 5 с.

28. Патент України № В 4602486/4 (4506). МКІ С12 Р 1/00. Штам Bacillus subtilis – продуцент позаклітинного сіалоспецифічного лектину /В’юницька В.О., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Заявлено 30.06.94. Позитивне рішення 5.03.97.

29. Патент України № 98052626. Індуктор синтезу гама-інтерферону /Підгорський В.С., Кішко Я.Г., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Заявлено 20.05.98. Позитивне рішення 5.11.98.

30. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Гетьман Е.И. Лабораторный регламент на производство сиалоспецифичного лектина микроорганизма Bacillus subtilis штамм 668 ИМБ. /Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины. – 1993. – 21 с.

31. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Гамма-бовиферон /ТУ №15 –9.1/17. – 1992. – 17 с.

32. Кишко Я.Г., Иваненко В.К., Подгорский В.С., Коваленко Э.А. Гамма-суиферон /ТУ №16 –9.1/15. – 1992. – 17 с.

Коваленко Е.О. Позаклітинні лектини бактерій роду Bacillus. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено поглибленому вивченню позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій. У дисертації розроблено новий напрямок в мікробіології, що грунтується на концепції пошуку і застосування в різних галузях біології та медицини принципово нових нешкідливих медикаментозних засобів природного походження.

Проведено розширений скринінг продуцентів позаклітинних лектинів серед бактерій роду Bacillus і встановлена їхня здатність до синтезу лектинів з унікальною специфічністю до сіалових і уронових кислот. Виявлено фізіологічні особливості росту продуцентів і утворення ними позаклітинних лектинів; здійснено спрямований біо-синтез цих метаболітів. Розроблено технологію одержання препаратів та ізоформ бактерійних сіалоспецифічних лектинів. Вивчено їх вуглеводзв’язуючі, гемаглютинуючі, фізико-хімічні та медико-біологічні властивості. Запропоновано можливі сфери застосування цих біополімерів як цінних хіміко-аналітичних та діагностичних реагентів, індукторів g-інтерфероногенезу, імунотропних та протипухлинних засобів. Створено наукові основи для конструювання на базі позаклітинних лектинів сапрофітних бактерій терапевтичних препаратів направленої дії.

Ключові слова: лектини, бактерії, синтез, одержання, вуглеводна специфічність, властивості, застосування.

Коваленко Э.А. Внеклеточные лектины бактерий рода Bacillus. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация представляет собой научную работу, положения и выводы которой создают новое направление в микробиологии: углубленное изучение внеклеточных лектинов сапрофитных бактерий с целью поиска и использования в различных областях биологии и медицины принципиально новых безвредных медикаментозных препаратов природного происхождения.

Проведен расширенный поиск продуцентов внеклеточных лектинов среди представителей спорообразующих аэробных бактерий рода Bacillus, выделенных из различных экологических ниш, и выявлена их способность синтезировать и выделять в среду роста лектины с редко встречающейся специфичностью к сиаловым и уроновым кислотам.

Установлены физиологические особенности роста бацилл и образования ими внеклеточных лектинов: индувидуальность процесса лектинообразования для каждой культуры, ограниченность во времени проявления лектиновой активности в культуральной жидкости, наличие в ней двух периодов активности, максимальное продуцирование лектинов в фазе замедления роста бактерий и разобщенность во времени ростовых и синтетических процессов. Показано, что на лектинсинтезирующие свойства бацилл оказывают значительное влияние характеристики роста бактерий, а также различные факторы внешней среды: температура и время выращивания, состав и рН среды, наличие в ней биостимуляторов и конкретных углеводов. Подбор условий выращивания позволил значительно повысить лектинпродуцирующую способность каждой культуры и осуществить направленный синтез внеклеточных лектинов бактериями.

При сравнительном использовании для очистки сиалоспецифичных лектинов различных методов подобрано несколько, впервые применяемых для этой цели: гель-фильтрацию на сефарозах, хроматографию на TSK гелях и изоэлектрофокусирование в борат-полиольной системе. Эти методы позволили получить препараты лектинов и их изоформы с высокими критериями очистки и сродства к специфичным углеводам; по своим характеристикам очищенные препараты лектинов бацилл соответствуют (а по некоторым – превышают) мировые стандарты сиалоспецифичных лектинов.

Показано, что сапрофитные культуры бацилл способны синтезировать два внеклеточных лектина, которые отличаются между собой по активности, углеводсвязывающим свойствам, химическому составу и физико-химическим характеристикам. Они представляют собой термостабильные, Са2+ – независимые гликопротеины с мМ от 7,7 до 26 кДа, устойчивые к действию рН, детергентов и длительному хранению, способные в очищенном состоянии образовывать крупно-молекулярные агрегаты с мМ до 260 кДа.

Использование более 70-ти моно-, ди- и трисахаридов и природных гликополимеров позволило установить, что исследуемые лектины обладают узкой углеводной специфичностью и проявляют чувствительность только к сиаловым и уроновым кислотам, фруктозо-1,6-дифосфату и обоим аминосахарам. Наибольшее сродство лектины бацилл проявляют к N-гликолилнейраминовой и N-ацетилнейраминовой кислотам и гликоконьюгатам, в которых содержатся оба типа сиаловых кислот или a-изомер О-ацетилированной формы N-ацетилнейраминовой кислоты, связанной с субтерминальным углеводом a2,3-, a2,6- и в меньшей мере a2,8- связями. Высокая степень узнавания строго определенных структур дает возможность утверждать, что внеклеточные лектины бацилл могут с успехом конкурировать с моноклональными антителами (например, при диагностике различных опухолей).

Исследуемые лектины относятся к умеренно и малотоксичным веществам и проявляют выраженные иммунотропные свойства: оказывают значительный противоопухолевый эффект, индивидуальный в отношении опухолей различного генеза, дифференцированно стимулируют отдельные этапы иммуногенеза и иммунного ответа макроорганизма, Т- и В- системы лимфоцитов, являются индукторами синтеза g-интерферона.

Результаты исследований внеклеточных лектинов сапрофитных культур свидетельствуют о том, что эти биополимеры могут быть использованы в качестве высокочувствительных аналитических и диагностических реагентов и эффективных лечебно-профилактических препаратов при иммунодефицитах различной этиологии, в т.ч. инфекционных заболеваний и злокачественных новообразований. Созданы научные основы для конструирования принципиально новых терапевтических препаратов направленного действия с использованием внеклеточных лектинов сапрофитных бактерий.

Ключевые слова: лектины, бактерии, синтез, получение, углеводная специфичность, свойства, применение.

Kovalenko E.A. Extracellular lectins of Bacillus genus bacteria. – Manuscript.

Thesis for a doctor’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology. – The Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation represents the study of saprophytic bacteria extracellular lectins. A new direction in the microbiology is elaborated and based on the concept of the research and application of the principal new nontoxic natural medical preparations in different regions of biology and medicine.

Broadened screening of extracellular lectin producers are conducted among Bacillus genus bacteria, their ability for synthesis of the lectins with unique specificity to sialic and uronic acids was established. There were shown the physiological peculiarity of the growth and formation extracellular lectins; the direct biosynthesis of these metabolites was realized. The technology of the obtaining of bacterial sialospecific lectin preparations has been developed. Carbohydrate-binding haemagglutinating, physico-chemical and medical-biological properties has been determined. The possible sphere of these biopolymers application as the valuable chemical-analytical and diagnostic reagents, so as inductors of the g-interferonogenesis, immunotropic and antitumoral means were offered. The scientific grounds are created for the construction of the new direct action therapeutic preparations on the basis of the saprophytic bacteria extracellular lectins.

Key words: lectins, bacteria, synthesis, obtaining, carbohydrate specifity, properties, application.

1. .1 Растровые рисунки Под компьютерной графикой обычно понимают процессы подготовки преобразования хранен
2. Тема- Біосфера її межі склад і властивості Мета- ознайомити студентів із поняттям біосфера вказати на ос
3. Были они бедныепребедные
4. 1Образование Древнерусского государства
5. Региональная экономика и управление Развитие экономических учений
6. Тема лекции- Атеросклероз АТС 2 часа I.
7. Современный танец
8. Лекция 2 ЛОГИКА ПРЕДИКАТОВ 2
9. Работа комбинированной автоматической системы управления
10. на тему- Внутриутробное развитие плода Выполнила- Студентка 4 курса 41Фб Демирджи А
11. Сталин как полководец (по мемуарам современников)
12. ; 2 ; 3; 4 Докво-2
13. Теоретические основы формирования молодежной политики [3] 1
14. Work study meet our friends nd reltives tke prt in sport nd music competitions
15. темами і компонентами на різних обчислювальних платформах а також взаємодії з користувачами в стилі зручно
16. Курсовая работа- Пересмотр по вновь открывшимся обстоятельствам решений и определений суда, вступивших в законную силу
17. экономических условий
18. КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА по дисциплине МЕСТНЫЕ НАЛОГИ Вариант 7 студента
19. Проблема чистого искусства в романе О Уайльда Портрет Дориана Грея
20. это прикладное направление медицинской науки связанное с разработкой и применением на практике методов ди

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе