Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
СКРИПНИК НАТАЛІЯ ВЯЧЕСЛАВІВНА
УДК 612.82/83;591.4:591.481;611.018;591.8;577.25
УЧАСТЬ ІНТЕРНЕЙРОНІВ ГІПОКАМПУ В ЕПІЛЕПТОГЕНЕЗІ
ФЛС-/--МУТАНТНИХ МИШЕЙ
03.00.11 –цитологія, гістологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ –
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
ДЗЕРЖИНСЬКИЙ Микола Едуардович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач кафедри цитології, гістології та біології розвитку
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
КВІТНИЦЬКА-РИЖОВА Тетяна Юріївна,
Інститут геронтології АМН України,
завідувач лабораторії морфології і цитології
доктор медичних наук
ГРАБОВИЙ Олександр Миколайович,
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця
доцент кафедри гістології, цитології та ембріології
Провідна установа: Національний аграрний університет
Кабінету Міністрів України, м.Київ
Захист дисертації відбудеться “14” жовтня 2002 р. о 12. год. на засіданні
спеціалізованої Вченої ради Д 26.001.38 при Київському національному
університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03022, Київ, проспект
академіка Глушкова, 2, біологічний факультет Київського національного
університету імені Тараса Шевченка, ауд.215.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул.Володимирська, 64, біологічний факультет,
Спецрада Д 26.001.38.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського
національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:
, м.Київ, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “5”вересня 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Т.Л. Давидовська.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Скронева епілепсія є найбільш поширеною формою епілепсії людини, етіологія якої, не дивлячись на роки досліджень, залишається не до кінця зрозумілою. Головною нейрофізіологічною особливістю її розвитку, як прийнято вважати, є феномен виникнення епілептичного вогнища у структурах скроневої долі головного мозку (в тому числі в гіпокампо-мигдалевидному комплексі), що асоціюється із складними (фокальними) припадками, здатними спричинювати виникнення вторинних генералізованих припадків та рухливих конвульсій (French et al., 1993; Glaser, 1993; Spenser et al., 1994; Mathern et al., 1995), які не тільки повторюються, але й стають більш частими (Hopkins et al., 1995), не піддаючись терапевтичному впливові антиконвульсантів. І в цих випадках хірургічна резекція гіпокампу та щільно пов’язаних з ним лімбічних структур, таких як мигдалина та енторінальний кортекс, стає єдиним можливим засобом впливу на хронічну невиліковну епілепсію (Spenser et al., 1994; Engel et al., 1993; Noachtar et al., 1996). Це призводить до того, що приблизно дві третини хворих на скроневу епілепсію втрачаюь один, а в деяких випадках і обидва, гіпокампа (Meldrum et al., 1992), структури, що крім всього іншого, вважається ключовою в процесі формування пам’яті.
За результатами численних досліджень ключова роль в процесі генерації епілептичної активності при скроневій епілепсії у людини відводиться гіпокампу, в якому, за даними аутопсійних аналізів, виявляється суттєвий рівень дегенерації в нейронних популяціях з втратою пірамідних нейронів зон СА1, СА3 та інтернейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини. Це, як вважають деякі автори, передує виникненню епілептичних судом, і, в більшості випадків, сприяє як їх генеруванню, так і поширенню (Sloviter, 1994), що супроводжується аномальною реорганізацією аксонної мережі гранулярних клітин зубчатої звивини (De Lanerolle et al., 1989; Sutula et al., 1989; Houser et al., 1990). Але реальна послідовність патологічних змін, клітинний механізм їх виникнення та поширення, їх причнно-наслідкові з’язки залишаються незрозумілими.
Етичні та експериментальні обмеження у вивченні скроневої епілепсії у людини роблять необхідним залучення до дослідницької практики техніки моделювання епілептичного стану на тваринах. Саме такі моделі скроневої епілепсії на щурах з використанням хеміоконвульсантів дозволили відтворити сьогодні більшість клінічних та нейропатологічних ознак людської скроневої епілепсії (Babb et al., 1991; Swartzkroin, 1993; McNamara, 1994; Скрипник, 2001). Так, було з’ясовано, що епілепична активність, індукована, наприклад, ін’єкціюванням каїнової кислоти, спричинює втрату інтернейронів шару поліморфних клітин (Mathern et al., 1995; Buckmaster et al., 1997), втрату соматостатин-вмісних (Robbins et al., 1991; Buckmaster et al., 1997) та парвалбумін-вмісних клітин (Sloviter, 1991) в шарі поліморфних клітин зубчатої звивини гіпокампу. Нервові ж ланцюги, що залишилися в гіпокампі, реорганізуються (Babb et al., 1991; Sutula, 1993; Franck et al., 1995; Sutula et al., 1998), і саме ця реорганізація, як вважається, і є основою для розвитку хронічного епілептичного стану.
Але існуючі прийоми моделювання скроневої епілепсії на тваринах, не дивлячись на їх досить широке застосування, також мають певні обмеження. З одного боку, інтенсивний епілептогенний вплив спричинює високу смертність експериментальних тварин, а з іншого, при зменшенні епілептогенного тиску, низький процент тварин дійсно проявляє спонтанні хронічні мотоконвульсії, клінічні та нейропатологічні ознаки людської скроневої епілепсії. Більш того, хоча згадані моделі епілепсії і сходяться у визначенні епіцентру епілептичної трансформації гіпокампу в популяції інтернейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини, їх автори по-різному інтерпретують причинно-наслідкові зв’язки самого процесу епілептогенезу. Крім того, чинник епілептогенезу, що є пусковим при подібному моделюванні, в природніх умовах може бути лише проміжною ланкою. Створення оптимальних моделей, які б не тільки відтворювали нейрофізіологічну картину скроневої епілепсії людини, але й за умови індукціювання епілептогенезу чітко вказували б на його ключові чинники, має як науковий, так і практичний інтерес. В цьому відношенні використання технології трансгенної мутації, що дозволяє селективно елімінувати певні гени, відкриває додаткову можливість визначити роль мутаційної мішені в епілептогенезі, прослідкувати функціонування гена в умовах нормальної фізіології та в процесі розвитку, даючи при цьому повне уявлення при функціональну спрямованість продукту його експресії.
Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження було з’ясувати характер, послідовність та стартові чинники епілептогенних змін в ключовій для скроневої епілепсії популяції інтернейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини гіпокампу трансгенних мишей з видаленим геном фосфоінозитид-специфічної фосфоліпази С класу 1 (ФЛС1-/-), визначити локалізацію фосфоінозитид-специфічної фосфоліпази С класу 1 (ФЛС1) в нейронах гіпокампу в нормі та характер функціональних порушень, спричинених її вилученням з системи внутрішньоклітинної сигналізації.
Для цього були визначені такі завдання:
1. Проаналізувати прояви скроневої епілепсії ФЛС1-/--мутантних мишей та морфофізіологічні зміни їх мозку, пов’язані з розвитком хвороби.
. З’ясувати закономірності поширення ФЛС1 в нейронних популяціях гіпокампу в нормі.
. Визначити рівень, характер та можливий механізм нейронної дегенерації в гіпокампі ФЛС1-/--мишей, та її роль в епілептогенезі.
. Визначити характер епілептогенних змін нейротрансмітерного профілю нейронів (ФЛС1-вмісних та ФЛС1-невмісних) зубчатої звивини гіпокампу та їх роль в розвитку патології.
. З’ясувати характер змін в проекціюванні кошикових клітин та гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей з посиленням епілептичної активності та вплив репроекціювання на стан збуджувально-гальмівного балансу в нейронній мережі зубчатої звивини епілептично трансформованого гіпокампу.
. Виявити характер змін експресії нейротропного фактору BDNF (brain-derived neurotrophic factor), їх вплив на нейроактивний профіль нейронних популяцій зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей та роль в регуляції збуджувально-гальмівного балансу в зубчатій звивині епілептичного гіпокампу.
. Визначити закономірності впливу епілептичної активності на стан нейрогенезу гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей та роль можливих змін нейрогенеза в розвитку скроневої епілепсії.
8. Виявити можливий функціональний зв’язок між вилученням ФЛС1 з системи клітинної сигналізації нейронів та функціональними змінами в нейронних популяціях зубчатої звивини гіпокампу.
Об’єкт дослідження: закономірності епілептогенної трансформації гіпокампу ФЛС1-/--мишей та роль ФЛС1 в процесах клітинної взаємодії.
Предмет дослідження: Нейротрансмітерний профіль нейронних популяцій гіпокампу в нормі та динаміка його змін в процесі розвитку скроневої епілепсії ФЛС1-/--мишей, роль нейротрофічного фактору BDNF та процесу реорганізації нейронної мережі зубчатої звивини в регуляції збуджувально-гальмівного балансу в системі епілептичного гіпокампу, а також взаємозалежність нейрогенеза гранулярних клітин зубчатої звивини та процеса епілептогенезу.
Методи дослідження: в роботі застосовані такі методи дослідження: гістологічні (для аналізу морфології епілептичного гіпокампу), імуногістохімічний (для визначення характеру змін нейротрансмітерного профілю гіпокампу в процесі епілептогенеза ФЛС1-/--мишей), метод подвійної імуногістохімічної детекції (для визначення характеру змін ГАМК (-аміномасляна кислота)-ергічної нейронної мережі в процесі розвитку патології), гістохімічний (для аналізу характера ремоделювання нейронної мережі гранулярних клітин зубчатої звивини епілептичного гіпокампу), метод штучного введення 5-бромо-2/-діоксиуридину (БрдУ) з його наступним імуногістохімічним визначенням (для аналізу стану нейрогенеза гранулярних клітин зубчатої звивини), метод генетичної гібридізації in situ (для визначення рівня та характеру апоптозної дегенерації нейронів зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей з посиленням епілептичної активності).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що ФЛС1-/--мутантна форма мишей є генетичною моделлю скроневої епілепсії людини. Підтверджено положення про те, що нетривалі та нечасті епілептичні припадки не викликають відчутних морфофізіологічних змін мозку. Вперше із застосуванням імуногістохімічної детекції визначена детальна локалізація ФЛС1 в нейронних популяціях гіпокампу. Підтверджене положення про те, що руйнування нервових клітин не є обов’язковим елементом індукції епілептогенезу. Вперше широко проаналізований характер послідовних епілептично індукованих змін нейротрансмітерного профілю гіпокампу (з використанням імуногістохімічної детекції соматостатину, нейропептиду Y, ГАМК, кальбіндину D28k, протеїну р53, BDNF) та їх роль в процесі розвитку скроневої епілепсії у ФЛС1-/--мишей. Вперше показано вплив нетривалих та нечастих епілептичних припадків на проростання моховитих волокон в зону молекулярного шару зубчатої звивини, що зазнала втрат синаптичного вводу з боку інтернейронів шару гранулярних клітин, та на зміну синаптичних мішеней моховитих волокон в зоні пірамід поля СА3. Підтверджене припущення про можливість формування атипово репроекційованими у внутрішню зону молекулярного шару моховитими волокнами синаптичних контактів з численними гранулярними клітинами та з відчутно посиленою, під тиском епілептичної активності, аксонною мережею ГАМК-ергічних кошикових клітин. Вперше проаналізована роль BDNF в регуляції збуджувально-гальмівного балансу в зубчатій звивині епілептичного гіпокампу ФЛС1-/--мишей. Підтверджене положення про позитивний вплив посилення збудження в нейронній мережі зубчатої звивини на рівень проліферативної активності попередників гранулярних клітин та вперше показано позитивний вплив такого посилення на міграцію, рівень виживання та інкорпорування новоутворених гранулярних клітин у функціонуючу мережу зубчатої звивини. Вперше проаналізований можливий механізм ремісії скроневої епілепсії. Підтверджене припущення про можливе спряження активації ФЛС1, як ланки в процесі клітинної сигналізації, та процесу нейросекреції.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведеного дослідження мають, перш за все, теоретичне значення, оскільки детально характеризують вплив епілептично індукованого посилення збудження в нейронній мережі гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу на функціональні зміни в його нейронних популяціях разом з чітким визначенням їх послідовності, взаємозв’язку та взаємозалежності та демонструють роль окремих нейромедіаторних груп в формуванні епілептичного стану. Аналіз реорганізаційних змін нейронної мережі зубчатої звивини, виявлення нових мішеней репроекційованих моховитих волокон та наступних нейрохімічних змін в системі зубчатої звивини висвітлює, крім того, принцип активації компенсаторного механізму відновлення порушеного в ході епілептогенезу збуджувально-гальмівного балансу. Більш того, результати даної роботи дають детальний аналіз впливу спонтанної епілептичної активності на характер нейрогенеза гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу та, характеризуючи мутацію з вилученим геном ФЛС1, як експериментальну модель скроневої епілепсії людини, дозволяють зробити висновок про участь ФЛС1 в процесах нейросекреції. Результати цих досліджень можуть слугувати також теоретичною основою для розробки стратегії моделювання скроневої епілепсії на тваринах та розробки практичних засобів впливу на хронічну скроневу епілепсію людини. Матеріали даної дисертації використані в спецкурсах “Гістофізіологія центральної нервової системи”та “Імуногістохімія та інші інші методи, засновані на афінності”, що розроблені на кафедрі цитології, гістології та біології розвитку біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно було проведено підбір та опрацювання наукової літератури, розробку стратегії експериментальних досліджень епілептогених змін в гіпокампі. Дисертанту належить практичне проведення досліджень та модифікація застосованих в роботі методів імуногістохімічного аналізу, подвійного імуногістохімічного забарвлення, техніки визначення проліферативно активних клітин, а також статистична обробка та аналіз отриманих результатів та написання роботи.
Створення генетичної конструкції трансгенної мутації з вилученим геном ФЛС1, контрольне генотипування, відеомоніториниг та нейрофізіологічне визначення характеру судомної активності мутантних мишей було проведено др.Кім Д.С. (Похангський університет науки та технології, м.Поханг, Республіка Корея). Інтерпретація наукових результатів та формулювання ряду висновків проводились за сприяння проф., д.б.н., д.м.н. Шина Х.-С. (Похангський університет науки та технології, м.Поханг, Республіка Корея) та спільно з науковим керівником, завідувачем кафедри цитології, гістології та біології розвитку, д.б.н., проф. Дзержинським М.Е.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідались на науковій конференції Похангського університету науки та технології (м.Поханг (Республіка Корея) 16-17 грудня 1997), та науковому семінарі кафедри цитології, гістології та біології розвитку біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Публікації. За матеіалами дисертації опубліковано 9 статей в наукових журналах та збірниках наукових праць, рекомендованих ВАК України.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з переліку умовних скорочень, вступу, 10 розділів (з яких 1 розділ присвячений огляду літератури, 1–викладу матеріалів та методів досліджень і 8–опису результатів досліджень та їх обговоренню), висновків та списку використаних джерел. Робота викладена на 236 сторінках; ілюстрована 7 таблицями і 58 рисунками. Список літератури включає 493 джерела.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження
Робота проводилась на трансгенних мишах з видаленим геном фосфоінозитид-специфічної фосфоліпази С класу 1, які за результатами попередніх досліджень (Kim et al.,1997) виявляли спонтанну судомну активність, починаючи з 21 дня постнатального онтогенезу (Р21). Ввжаючи цю дату критичною в генезі судомної активності, було відібрано три базові групи мишей (що знаходилися під відеонаглядом, починаючи з Р10): Р15 (відсутність епілептичної картини), Р35 (5 епілептичних нападів), Р45 (10 епілептичних нападів). Поведінка, характер та частота нападів реєиструвалися на відеоплівку за допомогою MTI 65 Intensified Target камери. Напади визначалися за певними ознаками, а саме: втрата контролю над координацією тіла, тоніко- клонічні рухи та тонічна екстензія всього тіла. Як контроль використовували мишей лінії С57ВL/6J.
Новонароджені мишенята, після визначення їх генотипу, маркувалися та утримувалися разом з матір’ю при 12-годинному світловому дні, постійній температурі 23оС та відносній вологості 60%, без обмежень у пересуванні та їжі. На P1 та P5, а потім кожен другий день визначали вагу тіла тварин (контроль- n=24, ФЛС1-/-- n=20) до Р25, а також у віці 10 тижнів (контроль- n=10, ФЛС1-/-- n=10).
Для виявлення можливих епілептично індукованих відхилень у формуванні мозку тварин, після інтраперитоніальної анестезії авертином (1,25% розчином трибромоетаноламілового спирту; 0,02 мл/г ваги тіла) та транскардіальної перфузії 10% формаліном мозок контрольних та дослідних мишей видаляли та проводили морфофізіологічний аналіз різних зон мозку, в тому числі гіпокампу, характер його розвитку, розташування, розмір та цілісність гіпокампних полів. Виявлення можливого руйнування клітин проводили на серійних фронтальних та сагітальних гістологічних зрізах мозку товщиною 5мкм (матеріал заливали у Paroplast (Oxford, Велика Британія) із застосуванням забарвлення гематоксиліном Бьомера та еозином.
Для визначення цілісності нейронних популяцій гіпокампу було застосовано забарвлення толуїдиновим синім вібратомних фронтальних зрізів (товщиною 50мкм) мозку контрольних тварин груп Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10) та ФЛС1-/--мутантних мишей груп Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10). Підрахування кількості клітин в популяції інтернейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини гіпокампу проводили у 8 послідовних зрізах (загальний обсяг 400 мкм) гіпокампу кожної тварини.
Для виявлення можливої дегенерації шляхом апоптозу в нейронних популяціях епілептичного гіпокампа мозок контрольних тварин груп Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10) та дослідних мишей груп Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10) після їх анестезії та транскардіальної перфузії (розтин мутантних тварин проводили через 2 години після останнього судомного нападу) заливали у Paroplast (Oxford, Велика Британія) за загальноприйнятою методикою. Серійні мікротомні зрізи товщиною 5мкм використовували для подальшої імуногістохімічної детекції протеїну р53 (поліклональні антитіла, 1: 500; Novocastra, Велика Британія) та визначення рівня апоптозу із залученням TUNEL-техніки (метод маркування утворених в результаті апоптозної дегенерації вільних 3’-ОН-кінців ДНК з використанням техніки in situ та наступним гістохімічним виявленням мічених нуклеотидів; ApopTagIn Situ Apoptosis Detection Kit; Intergen, Велика Британія). Візуалізацію антигену проводили використовуючи АВС-систему (Novostatin Super ABC kit, Novocastra, Велика Британія) та 3,3’-діамінобендизин (DAB substrate kit for peroxidase, Vector, США) для р53 та АЕС (3-аміно-9-етилкарбазол; DAКО, США) для TUNEL-визначення. Після стандартної процедури зневоднення матеріал замикали у Permaunt (Fisher Scientific, США) та проводили мікроскопічний аналіз.
З метою визначення характеру локалізації ФЛС1 в нервових клітинах нормального гіпокампу та підтвердження факту повного генетичного вилучення гена ФЛС1 була застосована імуногістохімічна детекція ФЛС1 (поліклональні антитіла проти ФЛС1; 1:200, POSTECH, Республіка Корея), а для виявлення сталості популяції пірамід гіпокампних полів СА1-СА2, нейронів stratum oriens, stratum radiatum та stratum lacunosum moleculare, а також гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу та аналізу епілоптогенних змін в ній- імуногістохімічне визначення кальбіндіну D28k (моноклональні анти-кальбіндин D28k антитіла; 1:3000, Sigma, США). Для визначення стану інгібіторної мережі інтернейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини та характеру, ступеня та послідовності епілептично індукованих змін в їх популяції була використана імуногістохімічна детекція характерних для них нейротрасмітерів та нейромодуляторів: ГАМК (поліклональні анти-ГАМК антитіла; 1:3000, Sigma, США), нейропептида Y (поліклональні анти-нейропептид Y антитіла; 1:3000, Sigma, США) та соматостатину (поліклональні анти- соматостатін антитіла; 1:500, DAKO, США). Визначення проводили на вібратомних зрізах гіпокампу мутантних (Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10)) та контрольних мишей (Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10)) із використанням системи біотин-авідину (Novostain Super ABC Reagent, Novocastra, Велика Британія) та 3,3’- діамінобендизину (DAB substrat kit for peroxidase, Vector, США) для візуалізації антигену.
З метою виявлення епілептогенних змін в проекціюванні гранулярних нейронів зубчатої звивини гіпокампу (мутантних мишей (Р15 (n=10), Р35 (n=10), Р45 (n=10) та контрольних (Р15 (n=10), Р35 (n=8), Р45 (n=7)) була застосована техніка гістохімічної детекції Zn у терміналях моховитих волокон, а для з’ясування характеру галудження та проекціювання аксонів ГАМК-ергічних нейронів зубчатої звивини гіпокампу (а саме, кошикових клітин)- техніка подвійного імуногістохімічного виявлення ГАМК та комплексу нейрофіламентних протеїнів (поліклональні анти-ГАМК (1:3000, Sigma, США) та моноклональні проти- комплексу нейрофіламентних протеїнів (1:50, Zymed, США) антитіла, АВС система (Large volume LSAB universal kit, peroxidase, DAKO, США), 3,3’- діамінобендизин (DAB substrat kit for peroxidase, Vector, США)).
Для виявлення епілептогенних змін рівня BDNF в нейронах гіпокампу застосовували імуногістохімічну детекцію BDNF-протеїну (поліклональні анти-BDNF антитіла; 1:100; Promega, США) в гіпокампі контрольних (Р15 (n=8), P35 (n=8), P45 (n=9)) та мутантних (Р15 (n=9), P35 (n=9), P45 (n=9); перфузія 24 год після останнього судомного нападу) мишей. Визначення проводили на мікротомних зрізах товщиною 5мкм із застосуванням АВС-системи (Novostatin Super ABC kit, Novocastra, Велика Британія) та 3,3’-діамінобендизину (DAB substrate kit for peroxidase, Vector, США) для візуалізації антигену.
Для аналізу епілептогенних змін рівня постнатального нейрогенезу в зубчатій звивині гіпокампу мишей була застосована техніка імуногістохімічного визначення БрдУ, аналогу тимідина, що встроюється на його місце в генетичний матеріал під час синтезу ДНК у S фазі мітотичного циклу. Для визначення змін рівня проліферативної активності ФЛС1-/-- (Р15, (n=9), Р35 (n=9), Р45 (n=9) та контрольних (Р15 (n=9), P35 (n=9), P45 (n=9)) мишей ін’єкціювали БрдУ (24 год після останнього епілептичного нападу у мутантних тварин; інтраперітоніально; 50мг/кг ваги тіла; Sigma, США) та перфузіювали 2 години потому. Для аналізу впливу судомної активності на виживання, диференціацію та інтеграцію новоутворених гранулярних клітин у вже сформовану нейронну мережу зубчатої звивини гіпокампу контрольних та ФЛС1-/--мишей Р20 ін’єкціювали БрдУ (50мг/кг ваги тіла; Sigma, США; кожні 2год протягом 6-годинного періоду) та перфузіювали 2год (n=10), 7 (n=10), 15 (n=10) та 25 (n=10) днів після останньої ін’єкції. Визначення БрдУ-імунореактивних клітин у зубчатій звивині гіпокампу мишей всіх груп проводили за АВС протоколом, використовуючи антитіла проти БрдУ (мишачі моноклональні; 1:200; Dako, США), Novostatin Super ABC kit (Novocastra, Велика Британія) та 3,3’-діамінобендизин (DAB substrate kit for peroxidase; Vector, США). Підрахування БрдУ-імунореактивних клітин на межі шару поліморфних клітин та внутрішньої зони шару гранулярних клітин (верхнє та нижнє леза) в гіпокампі тварин всіх груп проводили у 9 вібратомних зрізах (загальний обсяг 450 мкм, невеликі за розміром БрдУ-імунореактивні ядра (ядра гліальних попередників) та видовжені (ендотеліоподібні) при аналізі не враховувались).
Аналіз гістологічного матеріалу проводили з використанням світлового мікроскопу Olimpus, модель BX50 при збільшенні 40, 200, 400, 1000 (імерсійна система), а фотографування- використовуючи 35мм автоматичну фотомікрографічну систему РМ20 (Olimpus, Японія) та плівку Kodak (ISO 100/21о).
Статистичну обробку результатів досліджень проводили методами варіаційної статистики за допомогою програми STATISTICA 6.0 for Windows. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними значеннями вимірюваних параметрів оцінювали за t критерієм Ст’юдента, вірогідною, при цьому, вважали різницю між показниками при Р0,05.
Результати досліджень та їх обговорення
Проведений аналіз фенотипових ознак епілептогенезу ФЛС1-/--трансгененної мутаційної форми мишей виявив у них клінічні прояви, подібні до скроневої епілепсії людини (McNamara, 1994; Spenser et al., 1994; Mathern, 1995; Скрипник, 2001), а саме, латентний період розвитку (до Р21), клінічні ознаки епілептичної припадкової активності тоніко-клонічного судомно генералізованого характеру (Скрипник та інш., 2002), посилення частоти припадків з розвитком патології (в середньому, 1 епілептичний припадок на 2,8 днів у період Р21-Р35, та 1 на 1 день у період Р35-Р45) та у 23% тварин, що пережили критичний період посилення епілептичної активності (3-5 тиждень постнатального онтогенезу, коли спостерігається суттєве зростання рівня смертності), довільну ремісію. Виявлені закономірності виникнення та посилення епілептичної активності в групі ФЛС1-/--мутантних мишей слугують на користь точки зору на скроневу епілепсію, як на прогресивний синдром (Glaser 1993). Крім того, було з’ясовано, що зростання рівня смертності в групі мутантних тварин корелює з посиленням частоти припадків, більш того, смерті передувало (та було її ймовірною причиною) формування епілептичного статусу.
Проведені фізіологічні спостереження в групах дослідних тварин виявили відставання у рості ФЛС1-/--мишей, особливо відчутне в період з Р9 по Р21 (рис.1).
Рис. 1. Динаміка зростання ваги тіла у контрольних та мутантних мишей в перший місяць постнатального розвитку. Різниця між контрольними та мутантними
групами вірогідна починаючи з Р8 при Р0,05.
Визначене відставання мало тенденцію до зменшення на 45 день постнатального онтогенезу. Тварини ж, що пережили період посиленої епілептичної активності, зберігали тенденцію до нормалізації росту тіла, та на 10 тиждень розвитку за його вагою практично не відрізнялися від контролю. Початок нормалізації процесу росту мутантних тварин співпадає із часом, коли за клінічними проявами епілептогенезу визначається початок ремісії. Можливою причиною порушення процесу нормального росту тіла можуть бути патологічні відхилення у функціонуванні наднирникової залози (де в нормі виявлений високий рівень експресії ФЛС1 (Kim et al., 1997), порушення синтезу або секреції корикостероїдів (що потребує додаткових досліджень).
Морфологічний аналіз мозку мутантних мишей, що проводився протягом періоду виникнення та посилення судомних нападів, відхилень від норми не виявив. Відносно незначний проміжок часу від моменту виникнення спонтанної епілептичної активності (Р21) до початку розвитку ремісії (Р45) та відносно незначна загальна кількість виявлених судом, на нашу думку, можуть слугувати фізіологічною основою відсутності морфофізіологічних відхилень у розвитку мозку у ФЛС1-/--мишей. Подібне заключення базується на клінічних дослідженнях скроневої епілепсії у людини, показавших, що лише тривалий характер розвитку епілепсії викликає відчутні морфофізіологічні зміни головного мозку (Meldrum et al., 1995).
За результатами імуногістохімічного визначення ФЛС1 була виявлена в гіпокампі нормальних мишей найінтенсивніше в сомі моховитих клітин шару поліморфних клітин зубчатої звивини гіпокампу та пірамідних нейронах полів СА1-СА3 (рис.2) та менш інтенсивно в гранулярних клітинах зубчатої звивини та моховитих волокнах, що співпадає з результатом наведеної в літературі детекції мРНК ФЛС1 (Lee et al., 1995).
Рис.2. Мікрофотографії шару поліморфних клітин (А), пірамід СА1 (В) та СА3 (С) гіпокампу контрольних мишей. Імуногістохімічне визначення ФЛС1 ( 400).
Відсутність ФЛС1-позитивного імуносигналу в гіпокампі (як і в мозку вцілому) мутантних мишей вказує на повну відсутність продукту експресії гена ФЛС1 та підтверджує чистоту генетичного видалення самого гена. Порівняно з контролем ФЛС1-імунореактивні клітини в гіпокампі мутантних мишей ані якісних, ані кількісних змін не зазнали, що вказує на відсутність дегенеративних процесів, пов’язаних з безпосереднім вилученням фосфоліпази з системи клітинної сигналізації.
За даними літератури, чисельність загиблих нейронів та вираженість наступного гліозу, а також інші епілептогенні зміни мозку, що визначаються морфологічно, часто не корелюють з кількістю та характером судом (McNamara, 1994). Але, не дивлячись на це, саме на подібних морфологічних ознаках судом часто грунтують висновки про інтенсивність епіепсії. На підставі отриманих нами даних аналізу клінічної картини епілептогенезу та проведеного морфологічного дослідження епілептичного гіпокампу ФЛС1-/--мутантних мишей можна дійти висновку, що загибель нервових клітин не є обов’язковим елементом індукції розвитку скроневої епілепсії. Початок судомної активності визначався в групі Р21 мутантних тварин, в нейронних популяціях гіпокампу яких ані якісних, ані кількісних змін гістологічною технікою забарвлення гематоксиліном та еозином виявлено не було, так же, як і в групі Р35 та Р45 ФЛС1-/--мишей, які демонстрували відчутне посилення судомної активності. Статистично достовірне зниження чисельності, і лише в групі нейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей групи Р45, дозволило виявити суттєве збільшення загального обсягу матеріалу, що аналізувався
(забарвлення толуїдиновим синім вібратомних зрізів (рис. 3).
Рис. 3. Динаміка середнього числа інтернейронів шару поліморфних клітин зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мутантних мишей з посиленням судомної активності в постнатальному онтогенезі. -різниця між контрольними та мутантними групами вірогідна при Р0,05.
Більш того, порівняльний аналіз з контролем дозволив ідентифікувати втрачені клітини як мультиполярні клітини популяції інтернейронів шару поліморфних клітин, за виключенням моховитих клітин, що підтверджує відсутність дегенеративного процесу у ФЛС1-вмісних нейронах.
Імуногістохімічно в гіпокампі ФЛС1-/--мишей групи Р45 було виявлено суттєве зростання рівня протеїну р53 в нервових клітинах на межі шарів поліморфних та гранулярних клітин, в групі гранулярних клітин та у відносно невеликих за розміром інтернейронах шару поліморфних клітин зубчатої звивини, розташованих в безпосередній близькості до шару гранулярних клітин. Зростання рівня р53 в групі нейронів шару поліморфних клітин (яких, за розмірами та формою клітин, можна віднести до групи інтернейронів веретеноподібного та мультиполярного морфологічного профілю) свідчить про наявність руйнування шляхом апоптозу (що було підтверджено забарвленням толуїдиновим синім і детекцією TUNEL-позитивних клітин). Тоді як гранулярні клітини лише частково зазнають апоптозної дегенерації (підтвердженої TUNEL-технікою), а в більшості випадків, слід думати,- репаративної реконструкції: в нормі низький рівень р53, суттєво зростаючий у відповідь на руйнування ДНК, призводить до зупинки переходу клітини у фазу реплікації ДНК, що надає можливість самій ДНК репарувати, і лише при відсутності подібної можливості він індукує апоптоз (Oltvai et al., 1993; Osborne et al., 1994). Але можливо, що індукована посиленням рівня протеїну р53 репарація відбувається не у функціонуючих, зрілих гранулярних клітинах, а в їх новоутворених попередниках, чий нейрогенез може індукуватися зростаючою епілептичною активністю. І якщо в нормі новоутворені гранулярні клітини гинуть шляхом апоптозу (Bengzon et al., 1997) невдовзі після диференціації (Young et al., 1999), то, цілком можливо, що теж саме посилення збудження в нейронах, що викликало зростання рівня нейрогенезу, спричинило посилення експресії р53 в новоутворених гранулярних клітинах (або лише в їх частині) та перевело течію подій у русло репаративної реконструкції, а не апоптозного руйнування. Аналогічне заключення можна зробити і стосовно TUNEL-позитивних гранулярних клітин, переважна більшість з яких розташовувалась поблизу субгранулярної зони: ними можуть бути не лише зрілі апоптозні гранулярні клітини, але й їх недиференційовані попередники. Крім них позитивний сигнал виявили, також, інтернейрони шару поліморфних клітин. Загальний кількісний показник TUNEL-позитивних клітин становив 11,11 0,4 (р0,05), з них 67,6% - це клітини шару поліморфних клітин, а 32,4% - гранулярні клітини. Крім того, виявлення р53-протеїну в ядрах імунопозитивних клітин підтвердило можливість транслокації цього білку в ядрo (Martinez et al., 1997), а застосування р53-імуногістодетекції та TUNEL-техніки показало, що апоптозне руйнування в зубчатій звивині епілептично трансформованого гіпокампу відбувається р53-залежним шляхом, що слугує на користь необхідності переглянути традиційну точку зору, що загибель клітин, викликану судомною активністю, слід розглядати лише в контексті шкідливої дії збудження, яке спричинює дегенерацію шляхом некрозу (Bengzon et al., 1997; Maciejewski et al., 2002; Lockey et al., 2002).
Імуногістохімічне визначення кальбіндін-D28k-імунореактивних клітин, підтвердило сталість як популяції гранулярних клітин зубчатої звивини, так і групи кальбіндін D28k-імунореактивних пірамід гіпокампних полів СА1-СА2 та нейронів зони stratum oriens, stratum radiatum, stratum lacunosum moleculare, навіть при посиленні епілептичної активності в групах Р35 та Р45 ФЛС1-/--мутантних мишей (Скрипник, 2000), що не протерічить даним, наведеним в літературі (Sloviter et al., 1991). Отримані результати, змушують думати, що характер епілептичної активності ФЛС1-/--мишей не викликає змін рівня кальційзв’язувального білку в нейронних популяціях гіпокампу, з одного боку, а з іншого, той факт, що кальбіндін D28k-імунореактивні клітини виявились стійкими до деструктивного впливу глутамат-індукованої нейротоксичності, підтверджує можливість протекторної ролі самого протеїну (Sloviter et al., 1991).
Проведене імуногістохімічне визначення класичних нейропротеїнів та нейромедіаторів (участь яких у формуванні епілептичного стану при скроневій епілепсії є фактом добре відомим), а саме, соматостатину, нейропептиду Y та ГАМК в контролі та в групі Р15 ФЛС1-/--мишей, виявило їх типове для норми (Schwarzer et al., 1995; Mott et al., 1997) поширення та рівень вмісту в нейронних популяціях як гіпокампу, безпосередньо, так і мозку, вцілому. Тоді як посилення збудження в епілептично трансформованій нейронній мережі гіпокампу у ФЛС1-/--мишей групи Р35 спричинило зниження рівня синтезу соматостатину в групі мультиполярних інтернейронів шару поліморфних клітин (Дзержинський та інш., 1999; Скрипник, 2000; Скрипник та інш., 2002), що підтверджує відносно низький поріг активації соматостатин-вмісних інтернейронів гіпокампу (Gruber et al., 1994) та їх високу чутливість до тривалого епілептогенного впливу, а подальше посилення призвело, врешті-решт, до руйнування самих клітин. При цьому, було з’ясовано, що “вразливі” клітини містять також нейропептид Y, рівень вмісту якого в групі Р35 від контрольного не відрізнявся, тоді як при посиленні епілептичної активності саме група нейропептид Y-імунореактивних нейронів шару поліморфних клітин кількісно зменшилась, що не протерічить наведеним в літературі фактам “надчутливості” нейропептид Y-вмісних інтернейронів гіпокампу до впливу тривалої стимуляції перфорантного шляху та ін’єкціювання каїнової кислоти (Sperk et al., 1992) Популяція ГАМК-ергічних клітин протягом всього періоду визначення ані якісних, ані кількісних змін не зазнала (Дзержинський та інш., 1999; Скрипник, 2000; Скрипник та інш., 2002), не дивлячись на те, що саме вона (і моховиті клітини шару поліморфних клітин, і кошикові клітини, і пірамідні нейрони СА1-СА3) отримувала при зростанні епілептичної активності посилений збуджувальний ввод з боку гранулярних клітин зубчатої звивини (Gruber et al., 1993). Подібний факт говорить не тільки про стійкість популяції ГАМК-ергічних нейронів до посилення збуджувального вводу, але й є свідченням того, що в генезі епілепсії у ФЛС1-/--мишей ГАМК-ергічна інгібіторна мережа не зазнає руйнування. Виявлене же посилення рівня ГАМК у сомі моховитих кліти є, скоріш за все, результатом порушення процесів нейросекреції, спричиненого генетичним вилученням ФЛС1 з системи внутрішньоклітинного реагування нервової клітини на зовнішній сигнал. Таким чином, саме нейропептид Y- та соматостатин-вмісні (але не ГАМК-ергічні) інтернейрони шару поліморфних клітин зубчатої звивини зазнають апоптозної дегенерації при посиленні збуджувальної активності в гіпокампі ФЛС1-/--мишей групи Р45, і саме в цих нейронах, попередньо, знизився під впливом зростаючої епілептичної активності рівень соматостатину (Дзержинський та інш., 1999; Скрипник, 2000; Скрипник та інш., 2002). Біохімічна дестабілізація соматостатин/нейропептид Y- вмісних клітин, викликана епілептичними нападами, поступово призводить до їх загибелі. Це узгоджується з гіпотезою, що певні протеїни, синтез яких індукується судомною активністю, регулюють біохімічні та/або морфологічні зміни, перш за все, в соматостатин-вмісних нейронах шару поліморфних клітин зубчатої звивини (Dragunow et al., 1992), а ГАМК-ергічні нейрони вивляють стійкість до посилення збуджувального вводу (Buckmaster et al., 1997).
Виявлене посилення нейропептид Y-імунореактивності в аксонних проекціях гранулярних клітин в зоні їх галуження у шарі поліморфних клітин та в зоні їх термінальних закінчень в гіпокампному полі СА3 (рис.4) є свідченням атипового посилення синтезу нейропротеїну в самих гранулярних клітинах, синтезу, що, регулюється нейротроптим фактором BDNF (Gall, 1993; Croll, 1994), посилення синтезу якого виявлено саме в гранулярних нейронах (Скрипник, 2002). Враховуючи той факт, що виявляється подібне посилення тільки при відчутному зростанні епілептичної активності, його можна вважати результатом активації компенсаторних механізмів стабілізації збуджувально-гальмівного балансу в системі гіпокампу. Зростання рівня нейропептид Y, виявлене також в гіпокампі ФЛС1-/--мишей групи Р45, у внутрішній зоні молекулярного шару зубчатої звивини
Рис.4. Мікрофотографії гіпокампу контрольної та мутантної мишей. Імуногістохімічне визначення нейропептиду Y. А- шар поліморфних клітин, контроль, Р45 (200), В- шар поліморфних клітин, ФЛС1-/-, Р45, (200), С- молекулярний шар, ФЛС1-/-, Р45 (400), D- зона СА3 зубчатої звивини, ФЛС1-/-, Р45 (400).
(рис.4,С), є свідченням аберантного проекціювання моховитих волокон в цю зону (Schwarzer et al., 1995; Sperk et al., 1996; Lurton et al., 1997; Vezzani et al., 1999) (що повністю узгоджується з існуючою точкою зору про переважне проростання моховитих волокон в зону руйнування нервових закінчень (Cavazos et al., 1991)). Виявлення імуносигналу у дистальних зонах аксонних проекцій гранулярних клітин (рис.4,D) говорить також про наявність процесу акумулювання протеїну в термінальних зонах моховитих волокон, можливою причиною якого може бути порушення процесу нейросекреції, спричинене вилученням ФЛС1 з системи внутрішньоклітинної сигналізації.
Крім зазначених вище змін в епілептично трансформованому гіпокампі мутантних мишей посилення епілептичної активності (що було підтверджено гістохімічним визначенням Zn в терміналях моховитих волокон) спричинює в його зубчатій звивині атипове проростання моховитих волокон як у внутрішню зону молекулярного шару (Скрипник та інш., 2002) (рис.5,А,В), так і в зону базальних дендритів пірамідних нейронів гіпокампного поля СА3 (подібна зміна мішеней моховитих волокон спостерігається при посиленні збуджувального вводу в систему гранулярних клітин зубчатої звивини (Okazaki et al., 1999; Ikegava, 1999; Скрипник, 2001)).
Рис.5. Мікрофотографії гіпокампу контрольної та мутантної мишей Гістохімічне визначення проростання моховитих волокон в гіпокампі ФЛС1-/--мишей (В, Р45), контроль- А, Р45; 40. Імуногістохімічна детекція BDNF в зубчатій звивині гіпокампу контрольних (С, Р35) та ФЛС1-/-- (D, Р35) мишей; 200.
Враховуючи можливість синаптичного контактування гранулярних клітин через аксонні колатералі моховитих волокон, що проростають, з іншими гранулярними клітинами, розташованими на певній відстані, можна заключити, що подібний феномен проростання сприяє посиленню чутливості згаданих клітин до спалахів судомної активності та синхронізації збудження в цьому регіоні.
Мішені проростаючих у молекулярний шар зубчатої звивини моховитих волокон знаходяться в зоні, що зазнала втрати синаптичних контактів із зруйнованими під тиском зростаючої епілептичної активності соматостатин- та/ або нейропептид Y-вмісними інтернейронами шару поліморфних клітин (Дзержинський та інш., 1999; Скрипник, 2000). Враховуючи, до того ж, виявлений факт розширення зони аксонної інтервенції кошикових клітин (що визначалось імугістохімічною детекцією ГАМК та комплексу нейрофіламентних протеїнів) у середню та зовнішні зони молекулярного шару зубчатої звивини гіпокампу (при посиленні епілептичної активності і після руйнування клітин в нейронній системі інгібіторного контролю рівня збудження в гранулярних клітинах), можна дійти висновку, що епілептично зумовлена морфологічна реорганізація нейронної мережі в зубчатій звивині, пов’язана з епілептогенезом ФЛС1-/-, не обмежується реорганізацією лише її глутаматергічної збуджувальної частини. Посилення ГАМК-ергічного вводу в критичній зоні епілептогенного ремоделювання (що спостерігається і при індукованому каїновою кислотою епілептогенезі (Freund et al., 1996)) є свідченням стимуляції її інгібіторної ланки. На користь цього висновку слугує і той факт, що дендрити згаданих ГАМК-ергічних кошикових клітин, як виявилось, з високою ймовірністю, можуть формувати синаптичні контакти з рекурентними аксонними колатералями гранулярних клітин, що підтверджується наведеними в літературі даними про реорганізацію ГАМК-ергічної системи в зубчатій звивині при інтрагіпокампному ін’єкціюванні каїнової кислоти (Mathern et al., 1995) та при штучному пошкодженні енторінального кортексу (Froscher et al., 1997). Таким чином, спричинена епілептично-індукованим руйнуванням в нейронних популяціях синаптична реорганізація в гіпокампі ФЛС1-/--мишей може бути залученою до формування як рекурентних збуджувальних ланцюгів, що викликає розбалансування у збуджувальних та гальмуючих процесах, так і до структурної реорганізації системи інгібіторного синаптичного контролю. Останнє підводить структурну основу під феномен відновлення рекурентної інгібіції (шляхом переважної іннервації інгібіторних нейронів), що, ймовірно, і спричинює у ФЛС1-/--мишей, які пережили критичний період епілептичної активності, відновлення нормального фізіологічного стану.
Проведене імуногістохімічне визначення рівня BDNF-протеїну в гіпокампі дослідних тварин показало, що нейронний перікарион клітин гіпокампу не акумулює ендогенний BDNF шляхом ретроградного транспорту, як це має місце з нейронами інших зон мозку (Conner et al., 1992; Скрипник, 2002). Виявлене в групі мутантних мишей Р45 посилення рівня BDNF-протеїну в зоні моховитих волокон, їх кошикоподібних сплетеннях навкруги гранулярних клітин зубчатої звивини та в зоні проростання моховитих волокон в молекулярний шар (рис.5,С,D) є результатом посилення збуджувального вводу в систему зубчатої звивини. Підвищення концентрації Са+ в нейронах головного мозку запускає, зокрема, процес посилення синтезу BDNF (Rudge et al., 1998), і зв’язуючою ланкою, при цьому, між зростанням концентрації внутрішньоклітинного Са+ та підвищенням рівня BDNF як в пре- так і в постсинаптичних сайтах може слугувати CREB, фактор транскрипції, що фосфорилюється Са+/ кальмодулін-залежною кіназою та зв’язує промотор 3 (та/ або 1), стимулюючи синтез BDNF (Bito et al., 1996). А враховуючи можливу не лише постсинаптичну дію нейротрофіну (BDNF зв’язує trkB-рецептори (Bova et al., 1998; Oliff et al., 1998) та запускає каскад trkB- MАP кіназа- синапсин, що завершується фосфорилюванням тирозинового залишку протеїну (можливо, синапсину І (Jovanic et al., 2000)), залученого до постсинаптичної регуляції вивільнення глутамату (Katoh- Semba et al., 2001)) але й пресинаптичну (BDNF здатний посилювати глутаматергічну синаптичну трансмісію в пресинаптичному локусі шляхом ІР-опосередкованого збільшення концентрації Са+ (Lauterborn et al., 2000)), подібне збільшення рівня BDNF, за нашою думкою, призводить до зростання рівня вивільнення глутамату та посилення його інтервенції в цьому регіоні.
Аналіз рівня проліферативної активності в зубчатій звивині епілептичного гіпокампу підтвердив його суттєве посилення в зоні, що зазнала значної втрати ігібіторних інтеренейронів, зоні шару поліморфних клітин (Скрипник та інш., 2002) (рис.6).
Рис. 6. Рівень проліферативної активності в ЗЗ гіпокампу контрольних та ФЛС1-/--мутантних мишей. - різниця між контролем та дослідними групами вірогідна при Р0,05.
Але зростання кількості проліферативно активних клітин виявляється вже при відносно незначній епілептичній активності і до виявленого епілептично індукованого руйнування клітин в ШПК ЗЗ (Скрипник та інш., 2002). Це говорить про можливість індукції мітотичної активності в зазначеній зоні посиленням збуджувального вводу, який не викликає при цьому суттєвої загибелі клітин. Можливим чинником зростання рівня проліферативної активності попередників гранулярних клітин в субгранулярній зоні може бути епілептично індуковане зростання рівня BDNF-протеїну як в шарі поліморфних клітин, так і в шарі гранулярних клітин, а значить посилення інгібуючого впливу на активність NMDA- рецепторів: BDNF-спричинене блокування NMDA-залежних відповідей в зоні гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу, в нормі, інгібує проліферативну активність попередників гранулярних клітин (Gould et al., 1997). Враховуючи, до того ж, той факт, що попередники гранулярних клітин в субгранулярній зоні здатні формувати синаптичні контакти, можна вважати, що судомна активність здатна індукціювати нейрогенез і шляхом прямої синаптичної активації. Загибель же клітин може виступати як додатковий індуктор мітотичної активності попередників гранулярних клітин, працюючи незалежно або узгоджено з судомною активністю (Скрипник та інш., 2002).
Більшість з новоутворених гранулярних нейронів мігрує в шар гранулярних клітин, набуваючи морфологічних ознак гранулярних клітин, що диференціюються. Тривала ж судомна активність порушує процес їх міграції, викликаючи посилення дисперсії дозріваючих гранулярних клітин, їх очевидний зсув до шару поліморфних клітин та у внутрішню зону молекулярного шару, що сприяє зростанню судомної активності. Але, при цьому, рекурентні судомні напади сприяють і виживанню новоутворених гранулярних клітин, що диференціюються, та посилюють їх інтеграційну спроможність, що, в очевидь, є свідченням компенсаторної спроби запобігти поширенню епілептичної деформації в гіпокампі. Таким чином, можна вважати, що посилення проліферативної активності попередників гранулярних клітин є компенсаторною відповіддю на посилення збуджувального вводу в нейронній мережі зубчатої звивини, і її зростання позитивно корелює з посиленням спонтанних рекурентних судом. Компенсаторний характер носить і епілептично індуковане зростання рівня виживання новоутворених гранулярних клітин та їх інкорпораційна спроможність.
Підводячи підсумок, зазначимо, що епілепсія, як правило, асоціюється з судомними нападами, що спричинюються втратою інгібіторного контролю в певних зонах мозку, або надмірним зростанням збуджувального вводу в них (McNamara, 1994). Результати проведених нами досліджень свідчать, що при скроневій епілепсії однією з критичних точок, зміни в якій ініціюють процес епілептогенеза, може бути популяція моховитих клітин шару поліморфних клітин зубчатої звивини (Дзержинський та інш.1999). Саме функціональна неспроможність моховитих клітин, їх виключення з мережі нейротрансмітерного контролю активності гранулярних клітин є першерпричиною, що запускає каскад епілептогенних змін. Більш того, отримані нами дані імуногістохімічного визначення характеру локалізації ГАМК в кошикових клітинах, а BDNF та нейропептид Y в гранулярних клітинах зубчатої звивини епілептичного гіпокампу, дають підставу заключити, що ФЛС1, що слугувала мішенню генетичного видалення, залучена до процесу нейросекреції.
ВИСНОВКИ
. Трансгенні миші з видаленим геном ФЛС1 є моделлю скроневої епілепсії людини, що відтворює її клінічні ознаки. Характер виникнення та закономірності посилення частоти припадків підтверджують точку зору на скроневу епілепсію, як на прогресивний синдром.
. Нетривалі та нечасті епілептичні припадки не викликають морфофізіологічних змін головного мозку.
. Імуногістохімічно показано, що ФЛС1 локалізована в моховитих клітинах шару поліморфних клітин, гранулярних клітинах зубчатої звивини та пірамідних нейронах полів СА1-СА3 гіпокампу нормальних мишей.
. Посилення збудження в системі зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей спричинює загибель нейронів шару поліморфних клітин шляхом апоптозу та індукує нейрогенез гранулярних клітин зубчатої звивини.
Загибель нервових клітин зубчатої звивини гіпокампу не є обов’язковим чинником розвитку скроневої епілепсії.
. Підтверджена можливість протекторної ролі кальційзв’язувального протеїну кальбіндину D28k по відношенню до надмірного збуджувального вводу в системі зубчатої звивини та стійкість ГАМК-ергічних нейронів гіпокампу до деструктивного впливу глутамат-індукованої нейротоксичності.
. Підтверджено припущеня щодо посиленої чутливості соматостатин- та нейропептид Y-вмістних нейронів шару поліморфних клітин до посилення збуджувального вводу в нейронній мережі зубчатої звивини гіпокампу.
. Посилення епілептичної активності спричинює атипове репроекціювання моховитих волокон в зону базальних дендритів пірамідних нейронів поля СА3 та у внутрішню зону молекулярного шару, викликаючи, в останньому випадку, формування синаптичних контактів, через аксонні колатералі з багатьма гранулярними клітинами, посилюючи чутливість останніх до спалахів судомної активності та синхронізуючи збудження в них.
Проростання моховитих волокон відбувається в зону молекулярного шару зубчатої звивини, що зазнала втрати синаптичних контактів із зруйнованими соматостатин- та нейропептид Y-вмісними інтернейронами шару поліморфних клітин зубчатої звивини.
Підтверджена можливість формування репроекційованими моховитими волокнами синаптичних контактів з посиленою аксонною мережею ГАМК-ергічних кошикових клітин та ймовірність активації компенсаторного механізму, що може лежати в основі довільної ремісії.
. Підтверджена ймовірність участі епілептично індукованого посилення синтезу BDNF в гранулярних клітинах зубчатої звивини в зростанні збудження в них та показана можливість участі BDNF в механізмах ремісії шляхом блокування NMDA-залежних відповідей та зняття гальмівного блоку проліферативної активності попередників гранулярних клітин в субгранулярній зоні зубчатої звивини гіпокампу.
. Фосфоінозитид-специфічна ліпаза С класу 1 залучена до спряження зовнішньоклітинного сигналу з процесом нейросекреції.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
. Дзержинський М.Е., Гарматіна С.М., Скрипник Н.В. Нейрохімічні зміни в гіпокампі у ФЛС-/- мутантних мишей // Наук. вісн. нац. аграрн. ун- ту.- 1999.- Вип.16.- С.51-54.
. Скрипник Н.В. Імуногістохімічні зміни інтернейронів поліморфного шару гіпокампу при порушенні сигнального зв’язку між мускариновими ацетілхоліновими рецепторами та фосфоліпазою С1 // Вісн. Київ. нац. ун- ту ім. Тараса Шевченка, Біологія.- 2000.- Вип. 31.- C.51-53.
. Скрипник Н.В. Стан імунореактивності популяції кальбіндин-D28k-вмісних клітин гіпокампу у мишей, що слугують для моделювання епілепсії // Вісн. Київ. нац. ун- ту ім. Тараса Шевченка, Біологія.- 2000.- Вип. 32.- C.65-67.
. Скрипник Н.В., Гарматіна С.М. Вплив просторового тренінгу на виживання незрілих гранулярних клітин зубчатої звивини гіпокампу у дорослих мишей // Вісн. Київ. нац. ун- ту ім. Тараса Шевченка, Біологія.- 2001.- Вип.34.- С.62-64.
. Скрипник Н.В., Дзержинський М.Е., Гарматіна С.М. Структурне ремоделювання нейронної мережі в зубчатій звивині епілептично трансформованого гіпокампу // Нейрофізіологія.- 2001.- Т.33, №6.- С.425-430.
. Скрипник Н.В. Вплив судомної активності на нейрогенез та реорганізацію нейронної мережі в зубчатій звивині гіпокампу дорослих мишей // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології.- 2001.- Вип.7, №39.- С.199-206.
7. Скрипник Н.В., Дзержинський М.Е., Гарматіна С.М. Вплив судомної активності на стан постнатального нейрогенезу в гіпокампі дорослих мишей // Проблеми регуляції фізіологічних функцій.- 2002.- Вип.8.- С.58-62.
8. Скрипник Н.В. Роль BDNF в формуванні нейротрансмітерного фенотипу зубчатої звивини епілептично трансформованого гіпокампу // Віс. Київ. нац. ун- ту ім. Тараса Шевченка, Біологія.- 2002.- Вип.36.- С.78-83.
9. Скрипник Н.В., Дзержинський М.Е., Гарматіна С.М. Аналіз нейрогенеза в гіпокампі мишей у постнатальному онтогенезі // Вісн. Київ. нац. ун- ту ім. Тараса Шевченка, Біологія.- 2002.- Вип.37.- С.149-152.
АНОТАЦІЯ
Скрипник Н.В. Участь інтернейронів гіпокампу в епілептогенезі ФЛС1-/--мутантних мишей.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.11- цитологія, гістологія.- Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.
Вивчалися закономірності епілептогенної трансформації гіпокампу мутантних мишей з вилученим геном фосфоінозитид-специфічної фосфоліпази С класу 1 (ФЛС1-/-) та роль останньої в процесах клітинної взаємодії.
Показано, що ФЛС1-/--мутантна форма мишей є генетичною моделлю скроневої епілепсії людини, а сама ФЛС1 в нормі локалізована в моховитих клітинах шару поліморфних клітин, гранулярних клітинах зубчатої звивини та пірамідних нейронах полів СА1-СА3 гіпокампу. Встановлено, що посилення збудження в системі зубчатої звивини гіпокампу ФЛС1-/--мишей спричинює загибель нейронів шару поліморфних клітин шляхом апоптозу та індукує нейрогенез гранулярних клітин зубчатої звивини, при цьому загибель нервових клітин не є обов’язковим чинником епілептогенезу. Виявлено закономірності епілептогенних змін нейротрансмітерного профілю нейронів зубчатої звивини гіпокампу та їх роль в генезі скроневої епілепсії та характер епілептично індукованого репроекціювання моховитих волокон в зону базальних дендритів пірамід СА3 та у внутрішню зону молекулярного шару (що викликає, в останньому випадку, формування синаптичних контактів, через аксонні колатералі, з багатьма гранулярними клітинами та посилює чутливість останніх до спалахів судомної активності шляхом синхронізації збудження в них). Показано роль епілептично індукованого посилення синтезу BDNF в гранулярних клітинах зубчатої звивини в зростанні збудження в них та участь BDNF в ремісії шляхом блокування NMDA-залежних відповідей та зняття гальмівного блоку проліферативної активності попередників гранулярних клітин в субгранулярній зоні зубчатої звивини гіпокампу. Підтверджено припущення про можливе спряження активації ФЛС1, як ланки в процесі клітинної сигналізації, та процесу нейросекреції.
Ключові слова: епілепсія, гіпокамп, фосфоінозитид-специфічна фосфоліпаза С класу 1, апоптоз, нейротрансмітери, моховиті волокна, BDNF, нейрогенез.
АННОТАЦИЯ
Скрипник Н.В. Участие интернейронов гиппокампа в епилептогенезе ФЛС1-/--мутантных мышей.- Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11- цитология, гистология.- Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.
Изучались закономерности эпилептогенной трансформации гиппокампа мутантных мышей с удалённым геном фосфоинозитид-специфической фосфолипазы С класса 1 (ФЛС1-/-), а также роль последней в процессах клеточного взаимодействия.
Показано, что ФЛС1-/--мутантная форма мышей является генетической моделью височной эпилепсии человека, повторяющей ёё основные клинические проявления, а именно, клинические признаки эпилептической припадковой активности тоноко-клонического генерализованого характера, усиление частоты припадков с развитием болезни, и, у 23% животных, что пережили критический период усиления эпилептической активности (3-5 неделя постнатального онтогенеза, когда наблюдалось существенное возростание уровня смертности), произвольную ремиссию. Имуногистохимически выявлена локализация в норме ФЛС1 в мшистых клетках зубчатой извилины и пирамидах полей СА1-СА3 гиппокампа. Установлено, что усиление возбуждения в системе зубчатой извилины ФЛС1-/--мышей вызывает гибель нейронов слоя полиморфных клеток путём апоптоза и индуцирует нейрогенез гранулярных клеток зубчатой извилины, при этом гибель клеток не является обязательным индуктором эпилептогенеза. Подтверждена возможность протекторной роли кальцийсвязывающего протеина кальбиндина D28k в отношении усиленного возбудительного ввода в системе зубчатой извилины и устойчивость ГАМК-эргических нейронов гиппокампа к деструктивному влиянию глутамат-индуцированной нейротоксичности, а также предположение, относительно эпилептогенной индукции синтеза протеинов, регулирущих биохимические изменения, в первую очередь, в соматостатин-содержащих нейронах гиппокампа, и феномен повышенной чувствительности соматостати- и нейропептид Y-содержащих нейронов слоя полиморфных клеток в отношении усиленного возбудительного ввода в нейронную сеть зубчатой извилины гиппокампа. Выявлено, что усиление эпилептической активности вызывает проростание мшистых волокон в зону базальных дендритов пирамид СА3 и во внутреннюю зону молекулярного слоя, формируя, в последнем случае, синаптические контакты (через аксонные коллатерали) с многочисленной группой гранулярных нейронов, синхронизируя возбуждение и усиливая их чувствительность к всплескам эпилептической активности. Подтверждена возможность формирования “проросшими” мшистыми волокнами синаптических контактов с усиленной нейронной сетью ГАМК-эргических корзинчатых клеток и вероятность участия епилептически индуцированного усиления синтеза BDNF в гранулярных клетках зубчатой извилины в процессах ремиссии путём блокирования NMDA-зависимых ответов и снятия бокады пролиферативной активности предшественников гранулярных клеток в субгранулярной зоне гиппокампа. Подтверджено предположение о возможном сопряжении активации ФЛС1, как звена в процессе клеточной сигнализации, и процесса нейросекреции.
Ключевые слова: эпилепсия, гиппокамп, фосфоинозитид-специфичная фосфолипаза С класса 1, апоптоз, нейротрансмиттеры, мшистые волокна, BDNF, нейрогенез.
SUMMARY
Skrypnyk N.V. Participation of the hippocampus interneurons in the epileptogenesis of PLC1-/--mutant mice.- Manuscript.
Thesis for the scientific degree of the candidate of sciences in biology on the speciality 03.00.11- histology, cytology.- Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.
The principles of the epileptogenic transformation of the hippocampus of mutant mice with genetically eliminated gene of phosphoinositide specific phospholipase C of 1 class (PLC1-/-) as well as the role of the later in the processes of the intercellular interaction were investigated.
It was demonstrated that the PLC1-/--mutant form of mice can serve as a genetic model of the human temporal lobe epilepsy, while the PLC1 is itself localized in the mossy cells of the polymorphic layer, granular cells of dentate gyrus and pyramidal fields CA1-CA3 of normal hippocampus. It was estimated that an increase in the excitation in the system of the dentate gyrus of PLC1-/--mutant mice hippocampus cause the death of interneurons of the polymorphic cell layer by the apoptosis and induce the neurogenesis of dentate gyrus granular cells, while the death of the neuron cells is not an obligatory ground of epileptogenesis. Regularities in the epileptogenic changes of the neutransmitting profile of the dentate gyrus neurons in hippocampus and their role in the temporal lobe epilepsy genesis and character of epilepsy induced reprojection of mossy fibers into the zone of basal dendrites of CA3 pyramids and into the internal zone of molecular layer (which cause, in the last case, the formation of synaptic contacts by the axon collaterals with the number of granular cells and increase their sensitivity to seizure activity by the synchronization of excitation in them) were determined. The role of epilepsy induced increase in the synthesis of BDNF in the dentate gyrus granular cells in the increase of excitation in them and participation of BDNF in the mechanisms of the remission by the blockade of the NMDA-dependent responses and the breaking blockade of granular cell precursors’ proliferative activity lifting in the subgranular zone of the hippocampus were demonstrated. An assumption on the possible link between the PLC1 activation as a step in the process of the cell signaling and the process of neurosecretion was confirmed.
Key words: epilepsy, hippocampus, phosphoinositide specific phospholipase C of 1 class, apoptosis, neurotransmitters, mossy fibers, BDNF, neurogenesis.