Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
1. Требования микроорганизмов к питательным веществам
Культивирование микроорганизмов – это один из основных приемов в микробиологии. Для роста и развития микроорганизмов в природе и в лабораторных условиях необходимо наличие питательных веществ для энергетических и конструктивных реакций. Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Выращивание и поддержание микробных культур в лаборатории основано на моделировании естественных условий обитания данного организма в лаборатории, а также на знании особенностей обмена веществ.
Основными биогенными элементами являются углерод, азот, фосфор, кислород, водород, сера. Это компоненты белков, углеводов и жиров, а также нуклеиновых кислот. Эти элементы требуются в значительных количествах (г/л) и поэтому их называют макроэлементами. К макроэлементам также относятся ионы калия, магния, натрия, кальция и железа. Они выполняют в клетке разнообразные функции. Например, К+ необходим для активности большого числа ферментов и в частности ферментов белкового синтеза. Са2+ определяет устойчивость бактериальных эндоспор к нагреванию. Mg2+ стабилизирует рибосомы, многие ферменты и клеточные мембраны. Fe2+ и Fe3+ являются частью цитохромов и кофакторами электронпереносящих белков.
Микроэлементы, необходимые в микромолярных количествах, - это ионы таких металлов, как хром, кобальт, медь, молибден, марганец, никель, селен, вольфрам, ванадий, цинк, обычно входящие в состав ферментов и кофакторов. Например, Со2+ является компонентом витамина В12, Cu2+ входит в состав цитохромоксидазы и купредоксинов, Mn2+ активирует ферменты, катализирующие перенос фосфатных групп, Мо2+ входит в состав нитрогеназы и нитратредуктазы, Ni2+ является компонентом уреазы, гидрогеназы, кофактора F430, Zn2+ входит в состав карбоангидразы, ДНК- и РНК-полимераз и т.д. Необходимые для микроорганизмов количества микроэлементов содержатся в обычной водопроводной воде. При работе на дистиллированной воде микроэлементы добавляют специально в виде растворов их минеральных солей. Некоторые группы микроорганизмов проявляют специфические потребности. Так, диатомовые водоросли, включающие в свои клеточные стенки значительные количества соединений кремния, требуют добавления их в среду в высокой концентрации.
Биогенные элементы должны присутствовать в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Как правило, ионы металлов, сера, фосфор и микроэлементы добавляют в среду в виде минеральных солей. Минеральная основа среды (минеральный фон) практически одинакова для большинства микроорганизмов.
Источники углерода и азота в среде могут быть как неорганическими соединениями (СО2, N2, карбонаты, нитриты, нитраты, аммонийные соли), так и органическими веществами разной степени сложности и окисленности (сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, олигосахариды, пептиды и т.д.). Если микроорганизму требуется набор источников углерода или азота, и тогда применяют различные экстракты и гидролизаты смеси белков и полисахаридов неопределенного состава (сусло, гидролизат молочного белка, пептон и др.).
У некоторых микроорганизмов спектр потребляемых органических веществ очень широк (например, у Pseudomonas, Actinomyces), у других – достаточно узок (например, у облигатных метилотрофов). В то же время, можно найти микроорганизмы, способные использовать сложные неприродные соединения типа пластиков, красителей, пестицидов. У некоторых микроорганизмов потребности в питании так сложны, что они растут только внутри живого организма (например, внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии).
Как правило, лабораторные среды содержат питательные вещества в более высоких концентрациях, чем это присуще природным местообитаниям. Для разных микроорганизмов границы значений физико-химических факторов, в которых может происходить рост, существенно отличаются. Поэтому важным условием успешного культивирования является поддержание оптимальных значений таких параметров, как рН, температура, освещенность, аэрация и т.д.
2. Типы сред и способы культивирования микроорганизмов
Разнообразные питательные среды, используемые в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, подразделяются по составу, физическому состоянию и назначению.
По составу среды делятся на натуральные и синтетические. Синтетические среды применяют для изучения обмена веществ у микроорганизмов. Они имеют определенный химический состав с точным указанием концентрации каждого соединения. Натуральные среды применяют для накопления биомассы микроорганизмов и широко используют для первичного выделения из естественных субстратов, поскольку их состав позволяет удовлетворить питательные потребности многих групп микроорганизмов. В них содержатся богатые различными органическими веществами продукты животного или растительного происхождения, имеющие сложный и непостоянный состав. Часто натуральные среды готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и солодового сусла. МПБ – это прокипяченный экстракт мясного фарша с добавлением пептона и поваренной соли. Он богат азотсодержащими органическими соединениями, но обеднен углеводами. Солодовое сусло, напротив, содержит преимущественно углеводы. Его получают путем настаивания размолотого солода в водопроводной воде при постепенном нагревании. Солодом называют пророщенные и высушенные зерна ячменя. В процессе приготовления сусла происходит гидролиз крахмала ячменя и экстракция сахаров в воду. В зависимости от партии зерна концентрация сахаров в сусле может быть разной. Ее выражают в градусах Баллинга (оБ), что примерно соответствуют процентному содержанию сахаров в растворе. Сусло с разной концентрацией сахаров применяют для выращивания разных групп микроорганизмов.
Жидкие среды представляют собой растворы или суспензии ингредиентов в воде. В качестве сыпучих сред применяют наборы длительно хранящихся сухих компонентов, которые перед работой растворяют или смачивают водой. Это могут быть зерно, отруби, твердые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. В настоящее время получили широкое распространение порошкообразные синтетические и натуральные среды. Для получения твердых сред в жидкую основу добавляют уплотняющие агенты. Наиболее известными отвердителями являются желатин, агар и силикагель. Желатин – это белок из соединительной ткани животных, образующий гель при 25оС. Неудобство его применения заключается в том, что температура роста многих микроорганизмов выше, чем температура плавления желатина. Наличие протеолитических ферментов у многих микроорганизмов приводит к расщеплению и разжижению желатина. Более удобен как уплотнитель сложный полисахарид агар, получаемый из морских бурых водорослей, так как большинство микроорганизмов не использует его для питания. Агар может многократно плавиться при 100оС и застывать при 45оС. Добавлением 2% агара в жидкую основу получают широко применяемые мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА) и бульон-сусло-агар (БСА). В качестве твердой основы для синтетических сред часто используют неорганическое соединение кремния силикагель.
По назначению среды подразделяются на универсальные, элективные и индикаторные. Универсальные среды используют для накопления микробных клеток и первоначального выявления видового разнообразия микроорганизмов в смешанных популяциях. Они позволяют поддерживать рост значительного числа микроорганизмов. В то же время следует помнить, что не существует одной среды, универсальной для всех микробных культур. Элективные среды используют для получения накопительных культур как первого этапа при выделении чистой культуры из природных местообитаний. Создание условий, благоприятных для определенной группы микроорганизмов (элективных условий), приводит к преобладанию в смешанной популяции желаемых микроорганизмов. Рост и размножение других микроорганизмов в этих условиях не значительны. Для быстрого выявления определенных групп микроорганизмов или особенностей их метаболизма применяют индикаторные среды, содержащие вещество-индикатор, реагирующий изменением цвета на проявление какого-либо свойства организма. Индикаторные среды наиболее часто используют в санитарной и медицинской микробиологии.
3. Способы культивирования микроорганизмов
Особенности роста микроорганизма (культуральные свойства) иногда служат одним из критериев при определении его систематического положения. Микробные клетки в зависимости от условий могут расти в виде суспензии, микроколоний или обрастаний в жидких средах и образовывать колонии, штрихи или газон на твердых средах. Глубинные колонии формируются в толще агаризованных сред в виде чечевичек, тонких пленок или пучков ваты. Из-за выделения газов микроорганизмами при глубинном росте могут наблюдаться разрывы агаризованной среды. Поверхностные колонии отличаются большим разнообразием формы, размера, цвета, профиля. Колония может быть прозрачной, плотной, мягкой, хрупкой, врастать в агар, сниматься целиком в виде пленки, тянуться за петлей и т.д. Ее поверхность может быть блестящей или матовой, гладкой или шероховатой, иметь различные выпуклости, исчерченность и т.д. Различия в форме края и структуре колоний можно увидеть при малом увеличении микроскопа. Морфология колоний может значительно изменяться в зависимости от состава среды, возраста культуры и температуры культивирования. При посеве штрихом (прямой линией по агару) рост бывает обильный или скудный, сплошной или в виде цепочек очень мелких колоний, перистый, древовидный с различной формой края. При развитии культуры в жидких средах развитие микроорганизма может приводить к окрашиванию среды и появлению запаха, образованию пены и пузырьков, появлению помутнения, пленки на поверхности среды или осадка на дне сосуда.
Различают два основных способа культивирования микроорганизмов – периодическое и непрерывное. При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза – это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата. В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших – 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается.
Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками. Простейшая схема организации протока представлена на рис. 45. Подача свежей среды и удаление части суспензии (проток) происходит с той же скоростью, с какой растет культура. В этом случае устанавливается динамическое равновесие.
Некоторые микроорганизмы способны к пребыванию в особом физиологическом состоянии, при котором живые клетки не дают колоний на пригодных для них лабораторных средах, но под микроскопом наблюдаются как живые. Такое некультивируемое состояние (некультивируемая форма) присуще ряду микроорганизмов в природных местообитаниях, например, возбудителям сальмонеллеза и холеры, находящимся вне организма человека. Механизм перехода в некультивируемую форму и обратно не изучен, но есть данные о том, что этот процесс запрограммирован в геноме микроорганизмов и запускается недостатком питательных веществ в природных эконишах. В природных образцах такие микроорганизмы изучают путем прямого наблюдения и с помощью методов молекулярного анализа состава нуклеиновых кислот образца.
4. Смешанные и чистые культуры микроорганизмов. Накопительные культуры. Способы получения чистых культур
Из-за малых размеров микроорганизмов работа в лаборатории проводится не с одной особью, а с популяцией организмов, или культурой. Культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного вида, носит название чистой культуры. Если число видов два или больше, то говорят о смешанной культуре. Для определения систематического положения, физиолого-биохимических свойств и особенностей развития микроорганизмов необходимо получить чистую культуру. Для этого клетки данного вида нужно отделить от клеток других видов и впоследствии исключить возможность попадания посторонних микроорганизмов. При выделении чистой культуры из природных местообитаний, где микроорганизмы в большинстве случаев растут в виде смешанных популяций, на первом этапе обычно пользуются предложенным С.Н.Виноградским методом получения накопительных культур, в которых преобладают организмы определенной группы. Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы. Для этого нужно учитывать физиолого-биохимические особенности выделяемой культуры. Избирательного подавления роста определенных групп микроорганизмов можно достичь внесением в среду антибиотиков. Преобладать будет та группа микроорганизмов, для которой созданные исследователем условия культивирования наиболее приемлемы. Другие организмы, также присутствующие в пробе, в этих условиях не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом. Например, для получения накопительной культуры азотфиксирующих микроорганизмов следует приготовить среду без связанных форм азота. Для замедления развития грамположительных бактерий можно добавить пенициллин, а мицелиальных грибов - нистатин или гризеофульвин. Для накопления спорообразующих микробов часто используют кратковременное прогревание пробы при высокой температуре (10 мин при 80оС), когда вегетативные клетки погибают, а эндоспоры сохраняют свою жизнеспособность. Необходимо учитывать, что элективные условия – не всегда наилучшие (оптимальные) для роста выделяемой группы, однако сопутствующие микроорганизмы переносят их еще хуже. О получении накопительной культуры судят по характерной микроскопической картине, внешним изменениям среды, появлению определенных продуктов метаболизма. Чистую культуру в дальнейшем можно получить из единичной клетки или из отдельной колонии. Клетку извлекают микропипеткой или микропетлей под микроскопическим контролем и переносят в сосуд со средой. Другим способом является изготовление серии препаратов «висячая капля» из сильно разведенной суспензии. Препараты просматривают под микроскопом и выбирают те, где присутствует одна клетка. Затем их помещают во влажную камеру и микроскопируют вновь через сутки. Капли, в которых произошло размножение клеток, переносят в питательную среду. Чаще используют метод выделения чистой культуры из отдельной колонии, разработанный в лаборатории Р.Коха. Каплю накопительной культуры или ее разведения распределяют по поверхности или в глубине твердой питательной среды, добиваясь разобщения отдельных клеток. Каждая такая клетка впоследствии размножается, образуя колонию из клеток одного вида. Ее снимают петлей и переносят в сосуд с питательной средой. Признаком чистоты культуры является однородность колоний при пересевах и морфологическая однородность клеток при просмотре микроскопических препаратов.
Требования к питательным средам:
1. Питательные среды должны содержать универсальные источники углерода, азота.
2. Они должны являться источником витаминов и минералов.
3. В средах рН должно поддерживаться на постоянном уровне, что обеспечивается наличием в питательных средах буферных систем.
4. Питательная среда должна быть стерильной.
5. Питательная среда должна быть прозрачной.
6. В ней должна быть оптимальная концентрация кислорода и углекислого газа.
1. По консистенции. По консистенции все питательные среды делят на жидкие, полужидкие и плотные. Для жидких питательных сред основой является мясная вода, гидролизаты белков, либо естественные продукты (кровь, молоко). Среды приобретают плотную консистенцию за счет добавления в них агара. В полужидкие среды также добавляют агар, но его значительно меньше, чем в плотных питательных средах.
2. По происхождению. По происхождению все среды делят на искусственные и естественные. Основу искусственных питательных сред составляют пептоны, а естественные представлены молоком, кровью, могут включать кусочки фруктов и т.д.
3. По назначению. По назначению все среды делят на универсальные, дифференциально-диагностические, селективные и специальные. На универсальных питательных средах хорошо растут все бактерии (точнее большинство). Примером универсальных питательных сред являются мясо-пептонный бульйон и мясо-пептонный агар. Дифференциально-диагностические среды позволяют отличать один вид бактерий от другого вида по их ферментативной активности или культуральным свойствам. Дифференциально-диагностическими являются среды Гиса, Кларка, Эндо, Плоскирева. Селективные среды позволяют отбирать определенные виды бактерий, так как содержат вещества угнетающие рост остальных бактерий, но при этом способствующие росту данного вида бактерий. Селективные среды называют также элективными, избирательными или обогатительными. Примером селективных сред являются 1% пептонная вода и среда Мюллера. Специальные среды предназначены для роста бактерий, которые не растут на универсальных питательных средах. Примером специальных сред являются среда Мак-Коя-Чепина (для возбудителя туляремии), среда Левенштайна –Йенсена (для микобактерии туберкулеза), кровяной мясо-пептонный агар (для стрептококков).
По характеру дыхания все микробы делятся на аэробы и анаэробы. Аэробы для своего существования нуждаются в кислороде. Процесс дыхания у них протекает по типу окислительной реакции. Анаэробы растут и размножаются в условиях, исключающих доступ кислорода воздуха. Молекулярный кислород оказывает на них токсическое действие. Необходимую для существования энергию анаэробы получают путем расщепления органических и неорганических соединений, входящих в состав питательной среды. Между крайними группами облигатных, т. е. строгих аэробов и анаэробов, имеются микроорганизмы, способные менять аэробный тип дыхания на анаэробный в зависимости от среды обитания. Такие микроорганизмы получили название факультативных, т. е. условных, анаэробов. К их числу относится преобладающее большинство патогенных микроорганизмов. Для выращивания анаэробов необходимо создать определенные условия, сущность которых заключается в удалении молекулярного кислорода из питательной среды и пространстве, окружающего эти культуры.
Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворенного кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10—20 мин. При кипячении из среды вытесняется воздух и, следовательно, удаляется кислород.
Свежепрокипяченную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лед или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха, и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым или парафиновым маслом (толщина слоя 1—1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глютатиои. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов. На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта—Тароцци (рец. 113), широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные Среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые адсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха. Для создания бескислородных условий используют ф и-зические, химические и биологические факторы. Физические способы культивирования анаэробов.
1. Способ Виньяля—В е и о н а. Берут 4—5 пробирок с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40—45 °С сахарным агаром (рец. 114). В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний засеянную среду в количестве, соответствующем объему внесенного материала, переносят из 1-й пробирки во 2-го, из 2-й в 3-ю. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. Чтобы предупредить застывание питательной среды в момент насасывания ее в пипетки, кончик их, пока он не обломан, погружают на 3—5 мин в стерильную воду температуры 45—50°С. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2—3 сут в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микроба, находящуюся в агаре, извлекают петлей и пересевают в свежую питательную среду.
2. Выращивание анаэробов в условиях вакуума. Вакуумные условия для выращивания анаэробов создают в анаэростате или эксикаторе. Исследуемый материал или культуру микробов засевают в пробирки с жидкой средой или в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы помещают в анаэростат, затем присоединяют его к насосу и выкачивают воздух. Степень разреженности воздуха определяют по показаниям вакуумметра. Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды. Химические методы выращивания анаэробов (метод Ари-стовского).
Материал, исследуемый на наличие анаэробов, засевают на среду в чашки Петри и помещают их в эксикатор, на дно которого кладут химический поглотитель кислорода: гидросульфит натрия или пирогаллол. В расширенную часть сосуда устанавливают на подставке чашки с посевами. Прибор помещают в термостат при температуре 37 °С на 24—48 ч. Биологический метод выращивания анаэробов (по Форт-неру). В чашку Петри наливают толстым слоем 5% кровяной агар с 1—2% глюкозы. Посередине чашки в питательной среде вырезают стерильным скальпелем канавку шириной 1—1,5 см, которая делит питательную среду на две половины. Одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом, другую половину—культурой аэробов: чудесной палочкой (Serratia marcescens) или кишечной палочкой (Е. coli).
Перед посевом чашки подсушивают в термостате, чтобы аэробы вместе с капельками влаги - не могли попасть на другую сторону чашки. Засеянные чашки закрывают, а свободное пространство между дном и крышкой заклеивают лейкопластырем, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. В термостате чашки устанавливают вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов. Анаэростат для культивирования анаэробов. Анаэростат — прибор для выращивания микробов в анаэробных условиях — представляет собой толстостенный металлический •цилиндр с герметически привинчивающейся крышкой, на которой имеются вакуумметр и два крана для присоединения к •вакуум-насосу.
Физиология и принципы культивирования микроорганизмов.
Метаболизм микроорганизмов.
Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих- анаболизм и катаболизм. Анаболизм- синтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм- энергетический обмен, связан с окислительно- восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) — осмотрофы, или в виде отдельных частиц- фаготрофы.
Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: -пассивная диффузия— по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;
— облегченная диффузия— по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз;
— активный транспорт- против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;
— транслокация (перенос групп) — против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.
Основные химические элементы- органогены, необходимые для синтеза органичеких соединений- углерод, азот, водород, кислород.
В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза- например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно- восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические- органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания , витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.
Дыхание микроорганизмов.
Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание- биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О2), при анаэробном- связанный кислород ( -NO3 , =SO4, =SO3).
Примеры.
О2
Аэробное дыхание донор водорода H2O
Анаэробное дыхание
нитратное окисление NO3
(факультативные анаэробы) донор водорода N2
сульфатное окисление SO4
(облигатные анаэробы) донор водорода H2S
По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.
1.Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.
2.Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO2, например до 10- процентной концентрации.
3.Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода — т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.
4.Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.
Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).
В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H2O2— перекись водорода, -О2 — свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восстановительного потенциала (rH2).
Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.
1.Физический- откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N2— 85%, CO2— 10%, H2— 5%).
2.Химический- применяют химические поглотители кислорода.
3.Биологический- совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).
4.Смешанный- используют несколько разных подходов.
Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов- очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно- восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.
Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов- предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий- анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.
Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.
1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.
2.Оптимальные температура, рН, rH2, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.
Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.
По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.
1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.
2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).
3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.
Краткая характеристика питательных сред.
По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.
Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны— продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.
По назначению среды разделяют на ряд групп:
— универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);
— специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);
— дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);
— селективные (элективные) — для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.
По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.
Рост и размножение микроорганизмов.
Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:
— лаг- фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);
— экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);
— стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);
— стадия гибели — уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH2, концентрации ионов и других условий культивирования).
Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.
Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе- это хемостатные (непрерывные) культуры.
Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.
Чистая культура— популяция одного вида микроорганизмов.
Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн.др).
Основным оборудованием микробиологической лаборатории являются термостат, сушильный шкаф, автоклав и весы.
Термостат — прибор для поддержания постоянства температуры — применяют для выращивания культур микроорганизмов. Он представляет собой шкаф (рис. 14), в котором поддерживается в течение длительного времени определенная температура.
Сушильный шкаф (рис. 15) используют для стерилизации сухим жаром посуды, инвентаря и т. д. Стерилизуемый материал предварительно заворачивают в бумагу и помещают в шкаф так, чтобы он не касался стенок. Стерилизацию проводят при температуре 160 °С в течение 2 ч. Простерилизованный материал вынимают после отключения и охлаждения шкафа
Аппарат Коха применяют для стерилизации питательных сред. Он представляет собой металлический цилиндр с плоским дном и конусообразной крышкой, которая имеет отверстие для выхода пара. Аппарат покрыт теплоизолирующим материалом. Сосуды с питательными средами ставят на подставку, находящуюся внутри аппарата.
Автоклав (рис. 16) используют для стерилизации посуды и питательных сред паром под давлением. Это герметичный котел с двойными металлическими стенками и крышкой. Он снабжен манометром, предохранительными клапанами и краном для спуска воды и пара. Применяют для стерилизации питательных сред под давлением 0,5—1,0 МПа в течение 20—30 мин.
Весы в лаборатории необходимо иметь технические и аналитические. Технические имеют точность до 0,01 г; аналитические — до 0,001 г.
Кроме того используют центрифуги и мешалки, рН-метры для определения кислотности полуфабрикатов, аппарат Коха и др. К посуде, используемой в микробиологической лаборатории, относятся пробирки, мерные цилиндры, колбы, чашки Петри и пр.
Чашки Петри (рис. 17) применяют для выращивания культуры микроорганизмов на плотных питательных средах.
При помощи пипеток проводят пересев жидких культур микроорганизмов.
Приспособления в микробиологической лаборатории следующие: бактериологические петли и препарировальные иглы (рис. 18), шпатели, пипетки, штативы для пипеток и пробирок, карандаш по стеклу, набор ершей для мытья посуды.
Рис. 18. Бактериологическая петля и препарировальная игла
пробирки и колбы используют для хранения питательных сред и выращивания культур микроорганизмов. Бродильные трубки используют для определения активности брожения по газообразованию. Чашки Петри применяют для выращивания культур микроорганизмов на плотных питательных средах. Бактериологические иглы и петли используют для проведения посевов микроорганизмов, шпатели — для размазывания жидких культур на поверхности плотной питательной среды. Пилетки необходимы для пересева жидких культур микроорганизмов. Чашки Петри, пипетки, шпатели, пробирки, колбы заворачивают в бумагу, закладывают в сушильный шкаф, не касаясь стенок, и стерилизуют при температуре 160 °С в течение 2 ч. Петли и иглы стерилизуют, прокаливая их над пламенем.
Для культивирования бактерий используют питательные среды, к которым предъявляется ряд требований.
1. Питательность. Бактерии должны содержать все необходимые питательные вещества.
2. Изотоничность. Бактерии должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления, определенную концентрацию хлорида натрия.
3. Оптимальный рН (кислотность) среды. Кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий; для большинства бактерий составляет 7,2–7,6.
4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.
5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).
6. Стерильность (чтобы не было других бактерий).
Классификация питательных сред
1. По происхождению:
1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);
2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);
3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот, углеводов и т. д.).
2. По составу:
1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон, агар Хоттингера и др.;
2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточный агар, желточно-солевой агар, среда Китта—Тароцци, среда Вильсона—Блера и др.
3. По консистенции:
1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);
2) полужидкие (0,15—0,7 % агар-агара);
3) жидкие (не содержат агар-агара).
4. По назначению:
1) общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар);
2) специального назначения:
а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (щелочной бульон, 1 %-ная пептонная вода, желточно-солевой агар, казеиново-угольный агар и др.);
б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среда Эндо, Левина, Гиса, Плоскирева и др.);
в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида, т. е. обогащение ими исследуемого материала (селенитовый бульон).
Для получения чистой культуры необходимо владеть методами выделения чистых культур.
Методы выделения чистых культур.
1. Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды (метод штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твердой питательной среды шпателем, метод Дригальского).
2. Использование элективных питательных сред.
3. Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий (среды обогащения).
Чистую культуру получают в виде колоний – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде, представляющее собой, как правило, потомство одной клетки.
Выделение чистых культур бактерий.
Выделение отдельных видов микроорганизмов и получение чистой культуры является основой всей бактериологической работы. Чистой культурой микроорганизма называют популяцию, состоящую из особей одного вида. При выделении чистых культур из исследуемого материала, содержащего смесь микробов, используют методы, подразделяющиеся на две основные группы:
1. Методы, основанные на принципе механического разделения микробов.
2. Методы, основанные на биологических особенностях самих микроорганизмов.
Методы механического разделения микроорганизмов (методы разбавления).
1) Метод Пастера. Из исследуемого посевного материала делается ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: капля посевного материала вносится в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так до 8-10 колб или пробирок, которые термостатируют при оптимальной температуре. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться. В жидких средах микроорганизмы растут диффузно, т.е. легко распространяются по всей толще среды, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время этот метод не применяется, а используется только для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед его посевом на плотную питательную среду.
2) Метод Коха. 3-4 пробирки с МПЖ расплавляют в водяной бане при 40-45°С. Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным МПЖ, равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями, каплю разведенного материала из первой пробирки переносят во вторую, из второй в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри. МПЖ должен равномерно покрыть дно чашки. После того как желатин застынет, чашки ставят, чашки ставят крышкой вверх в термостат при температуре 20-22°С. Вместо МПЖ в настоящее время используют МПА. Каждая попавшая в желатин или агар микробная клетка размножается только в том месте, куда была внесена вначале, и образует видимое невооруженным глазом скопление микроорганизмов - колонию, которую отсеивают на МПБ или скошенный МПА для получения чистой культуры.
3) Метод Дригальского (метод фракционного посева). Этот метод основан на механическом разобщении микробных клеток друг от друга на поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь в том месте, куда она попала, начнет размножаться и через 1-2 дня образует колонию. Используют несколько чашек Петри (чаще 3) с залитой в них плотной питательной средой (МПА). На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью стеклянного шпателя
бактериологической петли каплю растирают по всей поверхности агара после чего этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются друг от друга. После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала или номер анализа посева и номер чашки, фамилия студента Из изолированных колоний выделяют чистую культуру.
4) Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материал через специальные мелкопористые фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется, главным образом, для очистки вирусов от бактерий.
Методы выделения культур, основанные на биологических особенностях микроорганизмов.
1) Метод нагревания исследуемого материала. Применяется для выделения чистых культур споровых форм микробов (гнилостных, масляно-кислых бактерий и др.). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при температуре 75-85°С в течение 20-30 мин. Вегетативные клетки погибают, а споры микробов остаются живыми и при последующих высевах на плотную питательную среду прорастают, образуя колонии.
2) Метод Шукевича заключается в точкообразном посеве исследуемого материала в конденсационную воду скошенного агара (у основания скоса). При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются на агар. Для получения чистой культуры производят отсев выросших микробов из верхней части пробирки. Метод используется для выделения очень подвижной палочки Proteus vulgaris.
3) Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется для изоляции микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Некоторые химические вещества (красители, кислоты и антибиотики) угнетают одни и не оказывают влияния на рост других микроорганизмов. Так небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микробов и не влияют на развитие грамотрицательных; 5-10 % растворы кислот (серной, хлористоводородной) и щелочей быстро убивают большинство микроорганизмов, а микобактерии туберкулеза выживают в растворах такой концентрации и после посева на питательные среды дают рост.
4) Метод обогащения применяют для выделения чистых культур различных микроорганизмов (например, сальмонелл). Для этого производят посев исследуемого материала на питательные среды, способствующие росту определенного микроба. Такие среды называются элективными, например среды Кауфмана, Мюлера для выделения сальмонелл из сильно загрязненного материала. В состав этих сред входят химические вещества, подавляющие рост посторонней микрофлоры и не препятствующие росту сальмонелл. Для молочнокислых бактерий средой обогащения является
обезжиренное молоко, развиваясь в котором они образуют молочную кислоту, подавляющие посторонние микроорганизмы.
5) Биологический метод выделения чистой культуры применяется для изоляции патогенных микроорганизмов из исследуемого материала, загрязненного большим количеством сапрофитных бактерий. Предполагая в исследуемом материале наличие определенного возбудителя, заражают этим материалом (вводят внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно) лабораторное животное, которое наиболее восприимчиво к данному виду патогенного микроба. Для выделения возбудителя сибирский язвы и
стафилококки чаще используют белых мышей; лептоспироза - золотистых хомяков; анаэробных инфекции-кроликов. Если в исследуемом материале содержится подозреваемый возбудитель, то лабораторное животное заболевает и погибает. Труп павшего животного вскрывают и, соблюдая требования асептики, производят посевы из внутренних органов на питательные среды, где вырастает чистая культура только патогенного микроба, так как клетки сапрофитных микроорганизмов, находящиеся вместе с ним, отмирают в организме лабораторного животного под влиянием его защитных факторов (антител, фагоцитов).
2. Изучение морфологических и культуральных свойств.
1) Изучение морфологических свойств микроорганизмов.
Изолировав чистую культуру микроорганизма, необходимо определить ее видовую принадлежность. Для этого проводят изучение целого ряда свойств выделенных животных (морфологических, культуральных, биохимических). Для идентификации организмов изучают также антигенные свойства. При установлении вида патогенных бактерий обязательно определяют патогенность на лабораторных животных. Совокупность всех свойств, признаков, особенностей микроорганизмов называют биологическими свойствами.
Морфологические свойства изучают путем микроскопии окрашенных препаратов, приготовленных из исследуемых молодых культур, выделенных на плотных или жидких питательных средах. Молодыми культурами для большинства мезофильных микробов считают 1-2-суточные, выращенные при температуре 37°С, а выращенные культуры при 20°С исследуют не позже 2 суток. При описании морфологических свойств необходимо отметить состав питательной среды, температуру роста микроба и возраст культуры. При этом отмечается форма микробных клеток наличие, характер их расположения, размер, наличие спор (их расположение), капсул, наличие инволюционных форм, а также тинкториальные свойства т.е. способность микроорганизмов окрашиваться анилиновыми красителями и по методу Грама.
При изучении морфологических свойств параллельно определяют и чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков определяют наличие жгутиков путем исследования подвижности микробов в препаратах висячая
или раздавленная капля, а также путем посева культуры в полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по линии укола).
Характеристика препарата:
1. Чистота культуры: чистая
2 Форма микробных клеток: кокки
3. Величина бактерий: мелкие
4. Характер расположения: кокки, стафилококки
5. Тинкториальные свойства (окраска по Граму): положительная
6. Наличие спор: нет
2) Изучение культуральных свойств микроорганизмов.
Этот этап представляет собой изучение особенностей их роста на плотных, полужидких и жидких средах при определенных условиях.
Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описан формы, величины, прозрачности, цвета, поверхности, рельефа, консистенции краев и структуры колоний, образованных на МПА, также изучают характер роста по линии укола при посеве в столбик МПЖ. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые учитывают при идентификации.
Характеристика колонии на плотной среде (МПЖ):
1. Форма колонии: круглая с фестончатым краем
2. Диаметр колонии: 2-3 мм
3. Цвет колонии: бело-желтый
4. Рельеф: плоско-выпуклый
5. Поверхность колонии: гладкая
6. Характер краев: фестончатые, с небольшими неровностями
7. Структура колонии: гомогенная
8. Консистенция: кашеобразная
9. Блеск: присутствует
10. Прозрачность: полупрозрачная
Характеристика в жидкой среде (МПБ):
1. Степень помутнения: слабое
2. Наличие пленки на поверхности: тонкая, нежная
3. Наличие пристеночного кольца: слабо выражено
4. Наличие осадка: хлопьевидный
5. Цвет среды: желтый.
3.Изучение биохимических свойств.
У микроорганизмов разных видов в пределах рода есть общие (родовые) и специфические для отдельных видов ферменты. В связи с тем, что каждый вид микробов характеризуется важнейшим этапом идентификации микроорганизмов.
О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизма воздействовать на известный субстрат. Присутствие фермента выявляют по изменению физического состояния субстрата (разжижению желатина), закислению питательной среды (среды Гисса с углеводами). Образованию определенных продуктов метаболизма (индол, аммиак, сероводород) и т.д.
Ферментативная активность микробов чрезвычайно разнообразна. Она зависит от характера и количества ферментов, которые микробная клетка продуцирует и выделяет во внешнюю среду.
При изучении ферментативной активности микробов наибольшее значение придают определению сахаролитических, протеолитических, липолитических и окислительно-восстановительных ферментов, активирующих соответственно расщепление углеводов, белков липидов и редуцирующих некоторые органические красители.
Выявление сахаролитической активности. Сахаролитическую активность изучают по образованию микроорганизмами экзоферментов карбогидраз (глюкозидаз), по интенсивности образования органических кислот и ароматических веществ. Сахаролитическая способность микробов определяется по ферментативному расщеплению моносахаридов, полисахаридов, многоатомных условно именуемых «сахарами» на альдегиды, органические кислоты и газообразные продукты (углекислый газ, метан, водород). Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и вода.
Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахара используют специальные дифференциально-диагностические среды жидкие, полужидкие и плотные питательные среды. При отсутствии у микробов какого-либо фермента углеводы не расщепляются, индикатор остается в обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется. Если под действием ферментов микробов углевод сбраживается, о образуется органическая кислота, которая вступает в реакцию с веществами, обесцвечивающими индикатор (со щелочью или розоловой кислотой) и нейтрализует их. В результате этого происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание среды в розово-малиновый (с индикатором Андреде) или голубой (с индикатором «ВР») цвет.
Для выявления сахаролитических ферментов исследуемую культуру засеивают в среду Гисса, которая содержит 5 моноуглеводов: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу. Сахара и спирты, используемые для сред Гисса, должны быть химически чистыми.
Результат: Цвет среды изменился, значит есть фермент, под действием которого расщепляется углевод - рН среды меняется, а индикатор изменяет свой цвет.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Изучение протеолитических свойств микробов.
Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, альбумозы, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада белка (индол, сероводород, аммиак и др.)
Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засеивают в питательную среду, содержащий тот или иной белок (МПЖ, молоко, свернутую кровяную сыворотку).
Протеолитическая активность микробов на желатине определяется по разжижению столбика желатина под действием фермента желатиназы разжижение желатина может быть послойное, воронкообразное, в виде чулка.
В молоке микробы, выделяющие протеолитические ферменты, через несколько дней вызывают свертывание и пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается отделением молочной сыворотки, растворением сгустка казеина под действием фермента казеиназы и выпадением осадка.
Для идентификации видов существенное значение имеет выявление способности микробов гидролизовать белок до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, аммиака.
Индол (орто-бензопирил) образуется при расщеплении ферментом триптофаназой сложной гетероциклической аминокислоты триптофана.
Источниками образования сероводорода могут быть различные соединения среды: органические (цистеин, цистин, метионин) и неорганические (сульфиты, сульфаты, тиосульфата). Для определения образования сероводорода делают посев в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещают кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то образуется сульфид свинца, в результате чего появляется темно-бурое окрашивание фильтровальной бумажки.
Присутствие аммиака определяют по изменению цвета красной лакмусовой бумажки (синеет), а также при помощи реактива Несслера.
Результат: Сделав посев в МПБ, дополнительно поместив под пробирку кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца, наблюдается выделение сероводорода, а вследствие этого наблюдается потемнение бумажки, т.е. сероводород является продуктом жизнедеятельности этих микроорганизмов.
4. Определение видов бактерий
Выполнив посев и изучив морфологические, культуральные и биохимические свойства данного вида микроорганизмов, проанализировав их, я сделал вывод, что наиболее подходят под описание кокки рода Staphilococcus, вида Saprophyticus.
Характеристика вида
Кокки, располагаются группами в форме виноградной грозди, грамположительные, каталазоположительные, факультативные анаэробы, хорошо размножаются на простых питательных средах и быстро размножаются на средах с большой концентрацией NaCI (ЖСА), образуя на плотных питательных средах семества с белым, желтым или золотистым пигментом. Обладают хорошо выраженными протеолитическими свойствами: разжижают желатин, свертывают и пептонизируют молоко, вызывают гемолиз, выделяют аммиак, сероводород.