Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.

Предоплата всего

Подписываем
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное образовательное
учреждение высшего профессионального
образования
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
А. А. ШЕВЧЕНКО
Л. В. ШЕВЧЕНКО
О.Ю. ЧЕРНЫХ
В.Н. ШЕВКОПЛЯС
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ
КРАСНОДАР
2009
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное образовательное
учреждение высшего профессионального
образования
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Александр Алексеевич Шевченко
Людмила Васильевна Шевченко
Олег Юрьевич Черных
Владимир Николаевич Шевкопляс
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ
Учебное пособие
КРАСНОДАР
2009
ББК 28.48
М 11
При поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
и Департамента науки и образования администрации
Краснодарского края
Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ
БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ. Краснодар: КубГАУ, 2009. 584с.
В руководстве изложены основные общие вопросы и методы
лабораторной диагностики инфекционных болезней животных,
вызываемых бактериями и вирусами.
Для студентов высших учебных заведений факультетов
ветеринарной медицины и биологических специальностей.
РЕЦЕНЗЕНТЫ:
И.А. Болоцкий доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией
Краснодарского НИВИ
Ю.Ф. Мишанин доктор биологических наук, академик РАЕ,
профессор Кубанского государственного технологического
университета.
ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»
350044, Краснодар, ул. Калинина, 13
Общая часть
Особенности морфологии и строения микроорганизмов
Микробы это в основном одноклеточные бесхлорофилльные организмы прокариотического типа. По форме различают шаровидные, палочковидные и извитые микробы (рис. 1).
Рис. 1. Основные формы микроорганизмов (схема):
шаровидные: 1 - стафилококки, 2 - диплококки, 3 - стрептококки, 4 - тетракокки, 5 - сарцины; палочковидные: 6 - бактерии, 7 - стрептобактерии, 8 - бациллы, 9 - стрептобациллы; извитые:
10 - вибрионы, 11 - спириллы, 12 - спирохеты.
Палочковидные, или цилиндрические, формы принято делить на бактерии и бациллы. Бактерии палочковидные формы, не образующие спор (пишут Bact, например Bact. aceti). Бациллы палочковидные формы, образующие споры (пишут Вас, например Вас. subtilis). Бактерии и бациллы бывают разными по форме и размерам. Концы палочек чаще закруглены, но могут быть срезаны под прямым углом (возбудитель сибирской язвы), иногда сужены. У мелких бактерий разница между длиной и шириной невелика; по внешнему виду они напоминают кокки, в связи с чем такие формы получили название коккобактерии (возбудитель бруцеллеза).
Спорообразующие микроорганизмы окрашиваются в основном по Граму положительно. Большинство из них имеют палочковидную форму и лишь Sporosarcina шаровидную.
Среди палочковидных форм, образующих споры, различают бациллы и клостридии. Бациллы, за исключением Вас. anthracis, подвижны. Бациллы аэробы. У бацилл споры не превышают толщины вегетативной клетки. Клостридии анаэробы. Споры толще вегетативной клетки. Такие формы напоминают веретено, ракетку, лимон, барабанную палочку. Клостридии принимают участие во многих процессах в природе. Являются возбудителями анаэробных инфекций. Вызывают аммонификацию белковых веществ, мочевины. Разлагают фосфорорганические соединения. Фиксируют молекулярный азот и др.
Палочки, как и кокки, могут располагаться попарно или цепочкой. При соединении бактерий попарно образуются диплобактерии, при таком же соединении бацилл диплобациллы. Соответственно образуются стрептобактерии и стрептобациллы, если клетки располагаются цепочкой. Тетрад и пакетов палочковидные формы не образуют, так как они делятся в одной плоскости, перпендикулярной продольной оси. Термин «бактерии» применяют для обозначения палочковидных форм, не образующих спор, и это правильно, в то время как многие авторы используют его как собирательное название разных микроорганизмов. Мы считаем, что вместо «бактерии» следует применять слово «микроорганизмы», или кратко «микробы».
Извитые формы микробов определяют не только по длине и диаметру, но и по количеству завитков. Вибрионы напоминают по форме запятую. Спириллы извитые формы, образующие до 3-5 завитков. Спирохеты тонкие длинные извитые формы с множеством завитков. Они занимают промежуточное положение между бактериями и простейшими. Микобактерии палочки с боковыми выростами (возбудители туберкулеза, паратуберкулеза). Коринебактерии напоминают микобактерии, но отличаются от них образующимися на концах утолщениями и включениями зерен в цитоплазме (дифтерийная палочка). Нитчатые бактерии многоклеточные организмы, имеющие форму нити. Миксобактерии скользящие микробы, по форме напоминающие палочки или веретено. Простекобактерии могут быть треугольной или иной формы. У некоторых из них лучевая симметрия. Свое название такие организмы получили по наличию остроконечных выростов простек. Размножаются они делением, или почкованием. Так, у треугольных форм на одной из вершин образуется почка, которая при достижении размеров материнской клетки отделяется. С помощью простек, расположенных на двух других вершинах, происходит улавливание пищи. Простекобактерии обычно неподвижны; подвижные формы образуют круговые движения. Спор не образуют, по Граму не окрашиваются. Растут на картофельной среде (агаре) при температуре 28 °С.
Размеры микробов. Микробы микроскопические организмы. Их размеры определяются в микрометрах (мкм) (10-6 м по системе СИ). Диаметр шаровидных форм 0,7-1,2 мкм; длина палочковидных
1,6-10 мкм, ширина 0,3-1 мкм. Вирусы еще более мелкие существа. Их размеры определяются в нанометрах (1 нм = 10-9 м).
Примерные размеры некоторых микробов, мкм
Микробы |
Длина |
Ширина |
Сибиреязвенная бацилла Картофельная бацилла Ацидофильная бактерия Эшерихии Туберкулезные бактерии Бруцеллы Стафилококки |
4,0-8,0 3,0-10,0 4,0-9,0 1,5-4,0 2,4-4,0 2,0-4,0 0,9 |
1,0-1,5 0,7-1,0 0,6-0,9 0,5-0,8 0,3-0,5 0,3-0,4 0,9 |
Актиномицеты (лучистые грибы) Actinomycetes, одноклеточные грам (+) бактерии. Тело (мицелий) состоит из тонких длинных гиф (нитей), которые бывают прямыми или спиралевидными. На плотных питательных средах актиномицеты образуют субстрат, врастающий в среду и воздушный мицелий. Встречаются палочковидные и кокковидные формы. Строение их аналогично грам (+) бактериям.
Размножаются при помощи спор (конидий), которые при благоприятных условиях прорастают в вегетативные клетки. Отдельные виды синтезируют пигменты: розовый, жёлтый, синий и др. Обитают везде. Играют важную роль в круговороте веществ в природе, образовании почвы и её плодородии, разлагают органические субстраты.
Актиномицеты служат продуцентами антибиотиков, витаминов, аминокислот, ферментов. Большинство их сапрофиты, есть патогенные: возбудитель актиномикоза КРС (Actinomyces bovis).
Микоплазмы (Mycoplasmatales) самые мелкие бактерии, спор не образуют, неподвижны, грам (-), без клеточной стенки, её роль выполняет трёхслойная цитоплазматическая мембрана. В цитоплазме располагаются рибосомы, нуклеоид, стерины. Они полиморфны, отмечают шаровидную, зернистую, нитевидную, кольцевидную формы. Микоплазмы проходят через бактериальные фильтры и растут на сложных средах (Эдварда) не содержащих живые клетки, они занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. На плотных средах растут в виде "яичницы-глазуньи". Встречаются патогенные: М. bovis (КПП КРС, КПП коз и овец, респираторный микоплазмоз птиц), а также сапрофиты.
Риккетсии (Rickettsiae), хламидии (Chlamydia) - облигатные внутриклеточные паразиты, плеоморфные грам (-) бактерии, имеют форму коротких палочек с закруглёнными концами и кокков, размером 0,2-0,6×0,4-2 мкм и более. Клеточная стенка содержит пептидогликан, цитоплазматическая мембрана высоко проницаема. Имеют рибосомы, нуклеоид, размножаются в цитоплазме хозяина поперечным делением, нитевидные формы - дроблением. К патогенным для животных относятся возбудители Ку-лихорадки, гидроперикардита крупного рогатого скота и вызывают хламидиозы у животных и человека.
Вирусы. В 1892 г. русским ботаником Д. И. Ивановским был открыт возбудитель табачной мозаики. Им оказался организм, проходящий через бактериальные фильтры и способный заражать здоровые растения. Ученый назвал возбудителя вирусом, что означает яд. На самом деле это была не инфекционная жидкость, а плотная частица (корпускула), как отмечал Д. И. Ивановский. Ф. Леффлер и П. Фрош случайно обнаружили, что вирус ящура проходит через фильтры С. Китасато. При исследовании фильтрата было обнаружено, что он так же заразителен, как и исходный материал. В дальнейшем Ф. Леффлер и П. Фрош установили, что заразное начало не только обладает контагиозностью, но и способно размножаться. Таким образом, еще в конце прошлого столетия были открыты вирусы растений и животных, что и положило начало науке вирусологии.
По типу нуклеиновой кислоты, а также биологическим, химическим, физическим свойствам и некоторым другим признакам вирусы разделяют на две большие группы: РНК-содержащие и ДНК-содержащие. В настоящее время вирусы животных объединены в 19 семейств, из них 12 содержат РНК-геномные и 7 ДНК-геномные вирусы. Односпиральные РНК содержат геномы вирусов следующих 11 семейств: ретровирусов, парамиксовирусов, ортомиксовирусов, рабдовирусов, тогавирусов, буньявирусов, пикорнавирусов, коронавирусов, аренавирусов, калицивирусов, флавивирусов; двуспиральную РНК семейство реовирусов. Двуспиральные ДНК содержат геномы вирусов 6 семейств: поксвирусов, герпесвирусов, аденовирусов, паповавирусов, иридовирусов, гепаднавирусов; односпиральную ДНК семейство парвовирусов.
В последние годы обнаружены возбудители, вызывающие новые болезни у человека, животных и растений. Наибольшую известность получили вирусы СПИДа ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирусы иммунодефицита обезьян, кошек, крупного рогатого скота и других животных. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота. Болезнь была известна в США еще в
1969 г. Возбудитель - вирус - изолирован от коровы с персистентным лимфоцитозом, прогрессирующей слабостью и истощением.
Кроме того, имеются неклассифицированные возбудители, вызывающие медленные инфекции у человека: куру и др. При таких инфекциях патологоанатомические изменения обнаружены в клетках центральной нервной системы. Клинически болезни проявляются нарушением координации движения и слабоумием.
Прионы - новые агенты инфекционных болезней. Открыты нейробиологом Калифорнийского университета в Сан-Франциско (США) Стэнли Прузинером. В 1982 г. из пораженного мозга был выделен инфекционный белок с молекулярной массой около 30 кДа. Он представляет собой цепочки аминокислот без оболочки и нуклеиновых кислот. По размерам биологический агент меньше вируса. Выделенный белок не вызывал иммунной реакции, не инактивировался при действии средств, разрушающих нуклеиновую кислоту, не обнаружен под электронным микроскопом. Выделенным белком из мозга больных животных не удалось заразить других особей. Оппоненты отмечают, что не исключена возможность существования трудноуловимого вируса. Такой белок был назван при оном (prio protein).
По предположению С. Прузинера, в зависимости от среды обитания белок подвергается генетической мутации, изменяется его стереоструктура. Он приобретает инфекционные свойства, вызывает гибель нейронов, на их месте образуются ячейки, губчатость, и как результат нарушается нервная система, отсюда и название: губчатая энцефалопатия, или губчатый энцефалит. Структурно измененный белок может заражать нервные клетки, медленно разрушать и нарушать их функцию. Гипотеза С. Прузинера окончательно не доказана. Его оппоненты полагают, что в очищенном белке от больных животных мог сохраниться неуловимый вирус.
За изучение болезнетворного агента, вызывающего губчатую энцефалопатию, или «коровье бешенство», у крупного рогатого скота С. Прузинеру в 1997г. была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине.
Дегенеративные изменения мозга при «куру» на Новой Гвинее, болезни Крейцфельда-Якоби у людей, губчатой энцефалопатии у крупного рогатого скота, известной как «коровье бешенство», скрейпи у овец и коз, трансмиссивной энцефалопатии у норок, а также сходные болезни у лосей, оленей и других животных были известны и раньше. Скрейпи описана в Англии еще в XVIII в. Энцефалопатия норок впервые (1947) установлена на звероводческой ферме в США. Таким животным скармливали субпродукты, полученные от овец, больных скрейпи.
В нашей стране медленные инфекции установлены сотрудниками ВИЭВ в 1981-1982гг. В последующее десятилетие проведено более детальное изучение скрейпи у овец. Установлено, что инкубационный период не менее 9 месяцев. Болеют взрослые животные (от 1 до 4 лет). Течение болезни длительное (от 4-6 нед до нескольких месяцев). Клиника болезни: беспокойство, зуд, скрежет зубами, дрожь. Температура тела в пределах нормы. Летальность 100%-ная. Поражается головной, реже спинной мозг дистрофия нервных клеток. Диагноз ставится на основании гистологических и клинико-эпизоотологических данных.
Вироиды (открыты Т. О. Дайнером, 1971) представляют собой молекулы короткой суперспирализованной РНК без белковой оболочки с молекулярной массой 100-130кДа. Вызывают болезни картофеля, цитрусовых, огурцов, томатов, хризантем и других растений.
Примером вирусов, содержащих РНК, могут быть возбудители гриппа, бешенства, стоматита, энцефалита, ящура, саркомы Роуса (Рауса) и т. д. ДНК содержат возбудители натуральной оспы, фаги и др.
Американский ученый У. Стэнли в 1935 г. выделил вирус табачной мозаики в чистом кристаллическом виде. Чтобы получить столовую ложку микроскопических кристаллов вируса, ученому пришлось пропустить через мясорубку тонну пораженных растений.
Характеристика вирусов. Вирусы простейшие объекты живой природы, неклеточные формы жизни, проникают в клетки высокоорганизованных существ, где производят себе подобных. Вирусы очень малы и измеряются в нанометрах (нм). Размеры вирусов определяют по величине пор фильтров, через которые проходит материал, суперцентрифугированием и в электронном микроскопе. Наиболее хорошо изучен вирус табачной мозаики (ВТМ). Он имеет форму шестигранной призмы длиной 300 нм, размер его в поперечнике 15-18 нм, т.е. длина вируса в 20-16,7 раза больше ширины. Внутри зрелого вируса (вириона) находится односпиральная нуклеиновая кислота (РНК), а на поверхности - белковая оболочка (капсид), и все это заключено в мембрану. Капсид состоит из субъединиц, называемых капсомерами. У ВТМ капсомеры располагаются как ступени винтовой лестницы (спиральная симметрия). Содержание белка достигает 95 % (по массе), нуклеиновой кислоты -5%. Несмотря на то, что нуклеиновой кислоты сравнительно немного, в ней заключены основные свойства вируса.
Нуклеиновая кислота в вирусе расположена в виде спирали. Двуспиральное строение соли ДНК было установлено в Кавендишской лаборатории Кембриджского университета в 1953 г. Д. Уотсоном (США) и Ф. Криком (Великобритания). В середине 1974 г. с разницей в две недели опубликованы данные А. Рича (США) и А. Клуга (Великобритания) о трехмерном строении тРНК (фенилаланиновой), которые были получены также на основании рентгеноструктурного анализа.
Рис. 2. Формы и относительные размеры некоторых вирусов:
1 - лейкемии кур; 2 - оспы; 3 - вызывающий бородавки; 4 - кори; 5 - аденовирус;
6 - бешенства; 7 - гриппа; 8 - герпеса; 9 - полиомиелита
Вирусы не растут на искусственных питательных средах, способны размножаться только внутри клеток восприимчивого организма или в культуре тканей. Вне организма живой клетки вирус инертен, в таком состоянии он сохраняется длительное время. Жизнь вируса начинается лишь после проникновения в живую клетку. У него отсутствуют способы размножения, свойственные другим микробам (деление, почкование). В клетке в течение короткого времени производится (репродуцируется) большое количество копий. Для этого клетка мобилизует все свои ресурсы и ферментативный аппарат (полимеразы), после чего погибает.
Следовательно, вирусы это такие биологические образования, у которых отсутствуют клеточное строение и собственный обмен веществ. Они совмещают в себе признаки существа и вещества: неактивны (метаболически) вне живых клеток и в то же время проявляют признаки жизни (репродуцируются) внутри их. Содержат одну нуклеиновую кислоту (РНК или ДНК), где сосредоточена генетическая информация. Обладают наследственностью и изменчивостью, благодаря чему сохраняются в биосфере Земли.
Бактериофагами называют вирусы бактерий. Впервые в 1898г. Н.Ф. Гамалея описал лизис (растворение) бактерий под действием агента, выделенного из этих бактерий. В 1917г. Ф.Д. Эррель из кала больного дизентерией человека выделил фильтрующийся агент, который лизировал культуру возбудителя дизентерии и назвал его бактериофагом (греч. phagos пожирающий), а сам феномен лизиса культуры - бактериофагией. Бактериофаги широко распространены в почве, воде, экскрементах больных и здоровых животных, человека и обнаружены у 100 видов бактерий. Хозяевами бактериофагов являются эшерихии, сальмонеллы, стафилококки, стрептококки, микобактерии, листерии, коринебактерии и др.
Детально изучена структура фагов E. coli, состоит из головки и отростка, по форме напоминает головастиков. Головка фага состоит из оболочки и нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Фаги обладают выраженной специфичностью. По характеру взаимодействия с бактерией фаги бывают вирулентные при проникновении в клетку бактерий размножаются в ней и вызывают лизис, умеренные фаги не вызывают лизиса, а остаются в состоянии лизогении.
По степени специфичности фаги разделяют на 3 группы: 1) полифаги лизируют родственные бактерии; 2) монофаги бактерии одного вида;
3) фаговары только определенные варианты данного вида бактерий. Взаимодействие фага с клеткой протекает в 5 стадий: 1 ст. Адсор6ция фага и закрепление его на бактериальной клетке (стенке), в которой имеются специфические рецепторы. 2 ст. Проникновение ДНК фага через дистальный конец отростка. 3 ст. Биосинтез фаговой нуклеиновой кислоты РНК и белков капсида, которые участвуют в биосинтезе фаговой ДНК.
4 ст. Морфогенез фага формирование зрелых частях фага. 5 ст. Выход фаговых частиц из клетки. Он происходит путем лизиса зараженных бактерий фаговым лизоцимом. При контакте умеренного бактериофага с микробной клеткой последняя не лизируется и становится носителем бактериофага. Это явление называется лизогенией, а бактериальные культуры, обладающие этим свойством, называются лизигенными. Бактериальная культура, образующая один вид фага, является монолизогенной, несколько видов фагов - полилизогенной. Фаг, лизирующий клетку-хозяина, называется умеренным.
Применение. Бактериофаги нашли широкое и разнообразное применение в ветеринарной практике. Применяют их для терапии и профилактики различных инфекционных болезней: гнойные и анаэробные, сальмонеллез, колибактериоз молодняка сельскохозяйственных животных, пуллороз цыплят и др. Высокая специфичность фагов позволяет использовать их для индикации и идентификации бактерий, для фаготипирования. С этой целью используют реакцию нарастания титра фагов, так же применяют для дифференциации бактериальных культур: сибиреязвенных, стафилококковых, рожистых, сальмонеллёзных и др. Биологическая промышленность выпускает в жидком виде коли-гертнерфаг против сальмонеллеза и колибактериоза телят, сибиреязвенные бактериофаги, фаг-ВНИИВВиМ.
Плесневые и другие микромицеты. Микромицеты (микрогрибы) низшие эвкариоты представляют собой большую группу организмов, совмещающих в себе признаки животных и растений. Как и животные, они лишены зеленых пигментов хлорофиллов, с помощью которых осуществляется фотосинтез; содержат цитохромы железосодержащие белки, окисляющиеся и восстанавливающиеся в процессе дыхания. Гетеротрофы в качестве источника углерода используют готовые органические вещества. В клеточных стенках содержат характерный для насекомых хитин. Вместо крахмала накапливают гликоген. В процессе превращения азотистых соединений они образуют мочевину.
Как и растения, обладают способностью к неограниченному верхушечному росту, имеют ригидную клеточную стенку, высшие грибы поперечные перегородки (септы) и др. Для большинства микромицетов характерно наличие грибницы, или мицелия. Низшие грибы имеют одноклеточный мицелий, высшие многоклеточный. Размножаются спорами, почкованием, фрагментами мицелия, а также путем слияния половых клеток гамет.
Многие исследователи считают, что грибы представляют собой самостоятельную группу (царство) организмов. В последнее время на основании генетического анализа мутаций 22 видов ДНК установлено, что грибы ближе к животному миру. В связи с этим определение грибов «как растение без цветов и хлорофилла», возможно, придется заменить определением «животное без гемоглобина».
Микромицеты аэробы, нетребовательны к питательным веществам, растут преимущественно на поверхности различных субстратов, выдерживают низкие температуры встречаются в холодильных камерах и других местах. Они принимают участие в превращении веществ в природе. Являются продуцентами антибиотиков, ферментов, органических кислот и других соединений. Среди них встречаются как сапрофиты, так и паразиты.
Систематика организмов, в том числе и грибов, периодически совершенствуется. В настоящее время большинство микологов считают, что развитие грибов шло разными эволюционными путями, в результате чего сформировались два отдела. У представителей отдела Oomycota, как и у растений, в стенках клеток содержится целлюлоза. Подвижные стадии имеют один или два жгутика. У настоящих грибов (отдел Eumycota) в стенках клеток содержится хитин. Они составляют более 95 % всех грибов и объединены в пять классов: 1) хитридиемицеты (Chytridiomycetes); мицелий слаборазвитый, одноклеточный; подвижные стадии имеют один бичевидный жгутик; 2) зигомицеты (Zygomycetes); мицелий несептированный, хорошо развитый; размножение осуществляется чаще спорангиеспорами (эндоспорами); 3) аскомицеты, или сумчатые грибы (Ascomycetes); мейоспоры (споры полового размножения) образуются внутри специальных клеток сумок, или асков; митоспоры (споры полового размножения) представлены конидиями; 4) базидиомицеты (Basidiomycetes); имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий; митоспоры представлены конидиями; мейоспоры образуются на специальных клетках базидиях; к этому классу относится большинство съедобных грибов макромицетов; 5) дейтеромицеты (Deuteromycetes); размножаются бесполовым путем конидиями; мицелий септированный; они представляют собой «бывшие» аскомицеты, или базидиомицеты, которые в процессе эволюции утратили половые спороношения; многие из дейтеромицетов паразиты животных, растений и человека.
Рассмотрим представителей некоторых классов. Зигомицеты одноклеточные организмы с сильно развитым мицелием, размножаются половым и бесполовым путем: бесполовое размножение происходит с помощью спор, развивающихся на спорангиях; при половом процессе (оогамии) образуются зигоспоры, или ооспоры. Представитель этого класса род мукор (головчатая плесень), которую можно встретить на хлебе, овощах, навозе, а также в сырых помещениях. Рост гриба напоминает двухсуточную культуру на сусле-агаре. Многие мукоровые сбраживают углеводы с образованием спирта и органических кислот, используются в пищевой промышленности.
У мукора (семейство Mucoraceae) от одноклеточного мицелия отходят одноклеточные гифы спорангиеносцы, которые заканчиваются шаровидным утолщением спорангием (плодовым телом). Внутри его находятся эндоспоры, спорангиеспоры. При разрыве спорангия споры выходят во внешнюю среду и, попадая в благоприятные условия, дают начало новой плесени.
Половая стадия размножения у низших грибов начинается с формирования половых клеток, или гамет, которые образуются в дифференцированных клетках гаметангиях. Слияние гамет может происходить как в гаметангиях, так и вне их. Если женская клетка неподвижна, то мужская (антеридия) проникает в оогоний (женский гаметангий) и оплодотворяет ее; если подвижны обе гаметы (обычно у водных грибов), то слияние может происходить вне гаметангиев.
Аскомицеты сумчатые грибы. Представителем этого класса являются дрожжи безмицелиальные, не образующие хлорофилла одноклеточные грибы. Внешне - это довольно крупные (до 10 мкм) овальные или округлые клетки с дифференцированным ядром. В их цитоплазме можно встретить одну-две вакуоли, гликоген, волютин, капли жира, удлиненные тельца митохондрии. Дрожжи широко распространены в природе, встречаются на плодах и листьях многих растений (виноградная лоза, фруктовые деревья).
Почкование наиболее распространенный способ размножения дрожжей характеризуется образованием на поверхности зрелой клетки одного или нескольких бугорков (почек), в которые переходит часть цитоплазмы и ядра. Перетяжка (место сужения) между материнской и дочерней клетками постепенно уменьшается, и затем наступает такой момент, когда дочерняя клетка отделяется и начинает самостоятельную жизнь. На поверхности материнской клетки после отделения почки остается дочерний шрам, который состоит из хитина и представляет собой округлое выпячивание с приподнятым ободком по периферии. Деление у дрожжей происходит так же, как и у других микробов. Клетка (цитоплазма и ядро) делится на две равные части. Посередине клетки от периферии к центру начинает расти клеточная стенка. К концу деления новая клеточная стенка удваивается и расщепляется образуются две дочерние клетки. При половом размножении после слияния (копуляции) двух дрожжевых клеток оболочка между ними растворяется. Оплодотворенное ядро делится 2 или 3 раза, и образуются четыре или восемь аскоспор; такая клетка превращается в аску (сумку) со спорами. Аскоспоры образуются при неблагоприятных условиях (недостатке питательных веществ, обильном поступлении кислорода) и представляют собой клетки с толстыми оболочками, устойчивыми к неблагоприятным факторам среды. После прорастания споры начинают размножаться бесполовым путем.
Среди дрожжей имеются сапрофиты и паразиты. Сапрофиты используют в бродильной промышленности и в животноводстве как источники белка. Паразиты вызывают болезни у животных бластомикозы.
Дейтеромицеты (несовершенные грибы) имеют многоклеточный мицелий, размножаются с помощью оидий и конидий. Половой способ размножения не установлен. Грибы этого класса широко распространены в природе: насчитывается около 25 тыс. видов. К дейтеромицетам относят грибы родов Aspergillus и Penicillium.
Род аспергилл, или леечная плесень (семейство Moniliaceae). Типичным представителем этого рода является гриб Aspergillus niger.
Мицелий септирован разделен перегородками (септами) с отверстиями, благодаря чему осуществляется связь между клетками. Таким образом, тело гриба представляет собой систему трубочек (гиф), по которым передвигается цитоплазма с множеством ядер. От мицелия отходит одноклеточный конидиеносец с утолщением на конце. На головке конидиеносца веерообразно расположены короткие стеригмы, напоминающие шипы, от которых отшнуровываются конидии, или экзоспоры. Конидии расположены радиально и напоминают струйки воды, выходящие из лейки, отсюда второе название гриба. Конидии леечной плесени бывают окрашены в разные цвета, но чаще встречаются черные (Aspergillus niger). Аспергиллы используются для приготовления лимонной, щавелевой и других кислот. Некоторые аспергиллы продуценты антибиотиков (аспергиллин, фумигации, клавацин). Среди аспергилловых грибов имеются возбудители заразных болезней.
Род пеницилл, или кистевик (семейство Moniliaceae). Мицелий и конидиеносцы многоклеточные. В верхней части плодоносящее тело разветвлено в виде кисти, откуда и второе название плесени. Последние сегменты кисти фиалиды (стеригмы) заканчиваются конидиями, или экзоспорами. Пеницилловых грибов в природе много. Они составляют около половины всех плесневых грибов. В больших количествах они находятся в почве, на кормах, молочных продуктах, фруктах, а также в сырых помещениях. Чаще встречается зеленая плесень, реже белая и др. Плесени пенициллиум нотатум и крустозум продуценты антибиотика пенициллина.
Некоторые виды несовершенных грибов вызывают болезни кожи и волос (трихофития, микроспория, парша и др.). Мицелий таких грибов имеет большое количество хламидоспор (концевых или интеркалярных по ходу мицелия), артроспоры (сегменты мицелия) и алейрии (конидии).
Род фузариум (семейство Turberculariaceae) поражает плоды, овощи и злаки. Мицелий гриба бывает разных цветов (белый, розовый, сиреневый). Для этой плесени характерны серповидные конидии и одноклеточные микроконидии. Могут образовываться и хламидоспоры. Грибы рода фузариум ведут сапрофитический и паразитический образ жизни. Поражая растения, они вызывают болезнь фузариоз. Если такие грибы встречаются на перезимовавшем хлебе, они могут вызывать зеараленонтоксикоз (фузариотоксикоз) (народное название «пьяный хлеб»).
Молочная плесень (Endomyces lactis) образует белые бархатистые пленки на поверхности молочных продуктов и квашеных овощей. В результате распада септированного мицелия появляются споры оидии. Это крупные, чаще прямоугольной формы клетки. Развиваясь на молочных продуктах, гриб снижает кислотность, при этом создаются благоприятные условия для развития других микробов, которые и вызывают их порчу.
Цианобактерии (от греч. Kyanos синий) одни из древних фотосинтезирующих прокариот. Полагают, что они появились на заре формирования Земли. По форме это палочки и кокки, располагаются одиночно или цепочками (в виде нитей). В клеточной стенке содержат муреин, в цитоплазме нуклеоид, 70 S-рибосомы и другие органеллы прокариот. Иногда образуют слизистую капсулу. Для них характерны движения скользящего типа. Грамотрицательные.
Цианобактерии вездесущие и многочисленны: встречаются в морях, пресных водоемах, почве. Среди них бывают гелиофилы и криофилы. Они могут расти в экстремальных условиях: ледниках Антарктиды, в заполярной тундре, на скалах, в жарких пустынях, в нейтральных или щелочных водах горячих источников. Термофилы могут жить при температуре выше 70°С.
Цианобактерии осуществляют одновременно оксигенный фотосинтез и фиксацию молекулярного азота. При оксигенном фотосинтезе на свету образуют кислород. Донором электронов при этом является вода. Фиксация молекулярного азота осуществляется в анаэробных условиях, поскольку кислород подавляет действие фермента нитрогеназы. В летние месяцы на поверхности мелких водоемов наблюдается массовый рост микроорганизмов в виде сине-зеленой пленки. При их разложении (гниении) в такой среде создаются условия, благоприятные для развития хемогетеротрофов, в результате чего уменьшается количество растворенного кислорода, а вместе с ним и живых организмов.
Цианобактерии содержат до 70 % белка, образуют биологически активные вещества, ферменты. Поглощая большие количества диоксида углерода (СО2), они предотвращают развитие парникового эффекта на планете.
Симбиоз длительное сожительство, обычно приносящее взаимную пользу. Так, молочно кислые бактерии желудочно-кишечного тракта образуют молочную кислоту, которая сдерживает развитие гнилостной микрофлоры. В рубце жвачных животных обитает огромное количество микробов, которые активно участвуют в процессах пищеварения. Происходит расщепление клетчатки, крахмала, синтезируется бактериальный белок.
Комменсализм форма сожительства, при котором один организм живет за счет другого, не причиняя ему какого либо вреда. К комменсалам относится большинство представителей нормальной микрофлоры, но некоторые из них при снижении резистентности хозяина могут вызвать эндогенную инфекцию.
Паразитизм особый и распространенный тип сожительства, при котором один хозяин (паразит) живет за счет другого (хозяина) и причиняет ему вред, вызывая инфекционную болезнь. Такие микробы называют патогенными (болезнетворными). Входят бактерии, вирусы, грибы, риккетсии, микоплазмы, хламидии. Все микробы паразиты происходят от свободно живущих сапрофитов, которые используют для питания мертвые органические субстраты.
Антагонизм продукты жизнедеятельности одних микробов обуславливают гибель других. Антагонизм выражен у актиномицетов, у споровых бацил (Bac. Brevis, Bac. Subtilis, Bac. Mycoides).
Вирулентность это степень патогенности конкретного микроорганизма. Ее можно измерить. За единицу измерения вирулентности условно приняты летальная и инфицирующая дозы. Минимальная смертельная доза DLM (Dosis letalis minima) это наименьшее количество живых микробов или их токсинов, вызывающее за определенный срок гибель большинства взятых в опыт животных определенного вида. Но поскольку индивидуальная чувствительность животных к патогенному микробу (токсину) различна, то была введена безусловно смертельная доза DCL (Dosis certa letalis), вызывающая гибель 100% зараженных животных. Наиболее точной является средняя летальная доза LD50, т.е. наименьшая доза микробов (токсинов), убивающая половину 50% животных в опыте. Для установления летальной дозы принимают во внимание способ введения возбудителей, массу и возраст подопытных животных и т.д., например: белые мыши 16-18 г., морские свинки 350-400 г., кролики 2 кг. Таким же образом определяют инфицирующую дозу (ID), т.е. количество микробов или токсинов, которые вызывают соответствующую инфекционную болезнь. Высоковирулентные микробы способны вызывать заболевание животного или человека в самых малых дозах. Так 2-3 микобактерии туберкулеза при введении в трахею, вызывают у морской свинки туберкулез со смертельным исходом. Вирулентные штаммы сибиреязвенной бациллы, 1-2 клеток могут вызывать смерть у морской свинки, белой мыши и КРС.
Вирулентность зависит от ряда биологических, физических и химических факторов, воздействующих на микробы. Вирулентность можно повысить или понизить искусственными приемами. Длительное выращивание культур вне организма, на обычных питательных средах, при максимальной температуре, добавление антисептических веществ (щелочь, сулема и т.д.) ослабляют вирулентность (опыт Ценковского получил 1 и 2 вакцины сибирской язвы). Пассирование возбудителей инфекционной болезни через определенный вид животного от зараженного к здоровому. Так возбудитель рожи свиней пассируя через организм кролика, ослабляет вирулентность для свиней, но усиливает ее для кроликов. Вирулентность микроорганизмов связана с токсигенностью и инвазивностью.
Токсигенность (гр. Toxicum яд и лат. Genus происхождение) способность микроба образовывать токсины, которые вредно действуют на макро организм, путем изменения его метаболических функций.
Инвазивность (лат. Invasio нападение, нашествие) способность микроба преодолевать защитные барьеры организма, проникать в органы, ткани и полости, размножаться в них и подавлять защитные силы макро организма. Инвазивные свойства патогенных бактерий обеспечиваются за счет микробных ферментов (гиалуронидаза), капсул и других химических компонентов микробов.
Инфекция (лат. Infectio заражение) это явление, специфической сущностью которого является внедрение и размножение инфекционного агента в макроорганизме с последующим развитием различных форм их взаимодействия от носительства возбудителя до выраженного проявления болезни.
Инфекционный процесс комплекс реакций, возникающих в макроорганизме при инфекции и направленных на обеспечение гомеостаза и равновесия с окружающей средой. Инфекционный процесс включает внедрение, размножение и распространение патогенного микроба организме с одной стороны, и реакцию организма на это действие с другой стороны. Эти реакции выражаются в биохимических, морфологических, функциональных и иммунологических изменениях, направленных на сохранение постоянства внутренней среды организма. Наиболее яркой формой проявления инфекции, инфекционного процесса является инфекционная болезнь, которая обусловлена патологическими процессами, вызванными действием возбудителя и характеризуется отдельной клинической картиной.
Инфекционная болезнь имеет ряд особенностей, отличающих ее от болезней неинфекционного характера.
Особенности инфекционной болезни:
Инфекционная болезнь вызывается определенным специфическим возбудителем.
Заболевший организм сам становится источником возбудителя инфекции, который выделяется из больного организма и заражает здоровых животных, т.е. инфекционной болезни присущи заразность, микробоносительство.
В больном организме происходят процессы образования специфических антител, в результате этого организм после выздаровления становится в большинстве случаев иммунным, т.е. невосприимчивым к повторному заражению тем же возбудителем.
Инфекционный процесс может протекать бессимптомно, скрытно, латентно (скрытая инфекция). Следствием скрытой инфекции может быть иммунизирующая субинфекция состояние, когда патогенные микробы проникают в организм животного в небольших дозах и неоднократно, вызывают иммунобиологические реакции, выработку антител, но сами при этом погибают. У таких животных не выявляют функциональных расстройств, а после убоя не обнаруживают патологических изменений органов и тканей. Инфекция бессимптомная невидимая, инаппаратная, не проявляющаяся. Инфекция дремлющая латентная, не проявляющаяся клинически. Ее определяют с помощью аллергических, иммунобиологических реакций, микробиологических, вирусологических и патоморфологических исследований. Часто бывает при бруцеллезе, туберкулезе, сапе, паратуберкулезе и др.
Инфекционный процесс характеризуется цикличным развитием и включает следующие периоды:
Инкубационный.
Продромальный.
Клинический (разгар болезни).
Выздоровление (реконвалесценция).
Период развития основных клинических признаков (период разгара болезни) проявляются основные характерные для данной инфекционной болезни признаки (при ящуре афты, при бешенстве параличи, при ботулизме расслабление мышц), угнетение, высокая температура, нарушение дыхания, пищеварения и др.
Этот период сменяется периодом выздоровления (реконвалесценции) постепенно восстанавливаются физиологические функции организма. Клиническое выздоровление при многих инфекционных болезнях не совпадает по времени с освобождением организма от возбудителя. После переболевания инфекционным заболеванием, в одних случаях в результате образования иммунитета организм полностью освобождается от возбудителя, в ряде случаев после выздоровления возбудитель длительное время сохраняется в организме животных. Такое состояние называется микробо или вирусоносительством (сальмонелез, пастерелез, туберкулез и др.). Такие животные представляют опасность, как источник возбудителя инфекции. Бывает микробоносительство, которое не связано с предшествующим переболеванием, оно не сопровождается иммунологической перестройкой и выявляется лишь при бактериологическом исследовании. Это состояние закономерно для условно-патогенной микрофлоры, до момента ее активизации. Например, устойчивые животные могут быть носителями сальмонелл, пастерелл, рожи свиней и др. Возможно кратковременное носительство возбудителя, несвойственного животным данного вида, так вирус ИНАН у свиней, вирус умы свиней у собак. Такие животные могут служить источником возбудителя инфекции.
Течение инфекционной болезни может быть молниеносным, острым подострым, хроническим, абортивным, а форма клинического проявления типичной и атипичной. Формы проявления болезни характеризуют по признаку преимущественной локализации патологического процесса (кишечная, легочная и кожная формы сибирской язвы).
Для острого течения болезни, обычно продолжающегося от одного до нескольких дней, характерно бурное проявление типичных клинических признаков. Так могут протекать сибирская язва, ящур, эмкар, бешенство.
Возможно сверхострое (молниеносное) течение, при котором животное погибает через несколько часов, вследствие быстро развивающегося сепсиса или токсинемии (сибирская язва, инфекционная энтеротоксемия и брадзот овец). Типичные клинические признаки в таких случаях не успевают развиться.
При подостром, более продолжительном течении клинические признаки болезни тоже типичны, но выражены слабее. Однако патологоанатомические изменения характерны. При вспышках рожи или классической чумы свиней, например, отмечают как острое, так подострое течение болезни, что объясняется различиями в резистентности животных и вирулентности возбудителя.
При хроническом течении болезнь моет затянуться на месяцы, и даже годы. Клинические признаки слабо выражены, а иногда вообще отсутствуют (при инфекционной анемии лошадей, туберкулезе, бруцеллезе, сапе), что затрудняет диагностику болезни. Такое течение болезнь может принять при снижении вирулентности возбудителя и достаточно высокой резистентности животного.
Не исключаются переходы одного типа болезни в другой. Так, при роже свиней исходом острого или подострого течения болезни может стать хроническая инфекция. Бывают и обострения хронических болезней.
Если комплекс клинических признаков характерен для данной инфекционной болезни, то форму ее проявления характеризуют как типичную. Однако нередки отклонения от типичной картины вследствие легкого переболевания (ангинозная форма сибирской язвы у свиней). Такие формы проявления болезни считают атипичными. В подобных случаях, неполнота клинической картины и стертость клинических признаков затрудняют диагностику. В последние годы случаи атипичного проявления инфекционных болезней (КЧС, ньюкаслской болезни кур, бешенства и многих других) заметно участились. Это связывают с изменениями биологической активности возбудителей, с массовой вакцинопрофилактикой, с широким (зачастую бессимптомным) применением лекарственных средств и особенно антибиотиков.
Не исключается атипичное проявление болезней у истощенных животных в связи с угнетением их иммунобиологической реактивности. Если инфекционный процесс быстро заканчивается выздоровлением животного, то течение болезни называют доброкачественным. Но при сниженной резистентности животного, болезнь может принять злокачественное течение, характеризующееся высокой летальностью. Такую более тяжелую, осложненную форму проявления болезни также следует считать атипичной.
Если типичное развитие болезни внезапно приостанавливается (обрывается) и наступает выздоровление, течение болезни называют абортивным. Абортивно протекающая болезнь кратковременная, проявляется в легкой форме при отсутствии некоторых, нередко основных клинических признаков. Причиной такого течения считают высокую резистентность животного. Известно абортивное течение оспы у грубошерстных овец, когда образующиеся на коже папулы (узелки) быстро исчезают, а общее состояние животных остается удовлетворительным. Абортивное течение мыта у лошадей характеризуется кратковременной лихорадкой и незначительным увеличением лимфоузлов без их нагноения. Если после перенесенной инфекционной болезни и освобождения организма животного от ее возбудителя происходит повторное заражение тем же самым видом (серотипом) патогенного микроба, возникает реинфекция. Основное условие ее развития сохранение восприимчивости к данному возбудителю (отсутствие или недостаточная прочность иммунитета). Возможна и суперинфекция в результате (повторного) заражения, наступившего на фоне уже развившейся инфекции, вызванной тем же видом патогенного микроба. Новое заражение, произошедшее до освобождения организма животного от возбудителя, обычно отягощает болезнь, обостряет ее течение. Возврат инфекционной болезни, повторное появление ее симптомов после клинического выздоровления называют рецидивом. Он возникает как эндогенная реинфекция при снижении резистентности животного и активизация сохранившегося в организме возбудителя перенесенной болезни. Рецидивы свойственны болезням, при которых формируется недостаточно прочный иммунитет. Инфекционный процесс очень часто протекает бессимптомно, скрыто, латентно (бессимптомная или скрытая инфекция). Своеобразной формой скрытой инфекции следует считать иммунизирующую субинфекцию это явление, когда патогенные микробы, неоднократно проникающие в организм животного в малых дозах, вызывает иммунобиологические реакции, выработку специфических антител, но сами при этом погибают. Соответственно животное не становиться источником возбудителя, патоморфологических изменений не выявляют, функциональных расстройств не обнаруживают. Такое состояние могут вызвать возбудители эмфизематозного карбункула, лептоспироза и др. инфекционных болезней.
Для возникновения инфекционной болезни необходимы условия: во-первых, микроб должен быть достаточно вирулентным; во-вторых, необходимо внедрение определенного количества микробов; в-третьих, они должны проникнуть в организм через благоприятные для них ворота инфекции и достигнуть восприимчивых тканей; в-четвертых, организм хозяина должен быть восприимчив к данному возбудителю болезни; в-пятых, необходимы определенные условия среды, при которых происходит взаимодействие между микробом и организмом.
Любая инфекция начинается с прикрепления поверхностных антигенных структур возбудителя к рецепторам клеток хозяина. Способность патогенных микроорганизмов проникать во внутреннюю среду хозяина, преодолевать защитные барьеры, распространяться в организме называют инвазивностью. Эта способность связана с выработкой ферментов (гиалуронидазы, фибринолизина, коллагеназы), нарушающих целостность некоторых тканей и наличием агрессинов веществ, подавляющих фагоцитоз и бактериолиз. Агрессины входят в состав клеточной стенки и капсулы многих патогенных микробов.
Методы лабораторных исследований
В основе серологических исследований лежит специфическая реакция между антигенами и антителами.
Антигены - генетически чужеродные вещества, при введении в организм животного (и человека) вызывают ответную реакцию (антигенное свойство) в виде продуцирования защитных тел - антител, специфических по отношению к антигену. Антигенные вещества представляют собой высокомолекулярные соединения, обладающие определенными свойствами: чужеродностью, антигенностью, иммуногенностью, специфичностью, коллоидной структурой и определенной молекулярной массой. Антигенами могут быть разнообразные вещества белковой природы, а также белки в соединении с липидами и полисахаридами. Антигенными свойствами обладают клетки животного и растительного происхождения, яды животных (змей, скорпионов, пчел и др.) и яды растительного происхождения (рицин, кортин и др.), сложные комплексы, состоящие из полисахаридов, липидов, белков. Антигенными свойствами обладают вирусы, бактерии, микроскопические грибы, простейшие, экзо- и эндотоксины микроорганизмов. Различают антигены корпускулярные, клеточные (бактерии, эритроциты) и растворимые (молекулярно-дисперсные). Антигены поливалентны - имеют несколько детерминантных рецепторов для связи с антителами (антигенная функция) как в организме животного (in vivo), так и вне организма - в пробирке (in vitro). Антигенной функцией обладают не только полноценные антигены, но и неполноценные (гаптены), то есть вещества небелковой природы (полисахариды, липидо-полисахаридный комплекс соматического антигена микробной клетки и др. вещества).
Под антигенностью понимают способность антигена вызывать иммунный ответ. Степень иммунного ответа организма на различный антиген будет неодинакова, то есть на каждый антиген будет вырабатываться неодинаковое количество антител.
Иммуногенность способность создавать иммунитет. Это понятие относится главным образом к вирусным и микробным антигенам, обеспечивающим создание иммунитета к инфекционным болезням. Чтобы быть иммуногенным, антиген должен быть чужеродным в отношении данного реципиента, иметь молекулярную массу не менее 10000. С увеличением молекулярной массы иммуногенность нарастает. Корпускулярные антигены (бактерии, грибы, простейшие, эритроциты) более иммуногенны, чем растворимые, а среди последних большей иммуногенностью обладают высокомолекулярные, например, агрегированные, антигены.
Специфичность особенность строения веществ, по которой антигены отличаются друг от друга. Она определяется антигенной детерминантой, то есть небольшим участком молекулы антигена, который и соединяется с выработанным на него антителом. Число таких участков (группировок) у каждых антигенов различно и определяет число молекул антител, с которыми может соединяться антиген (валентность). От числа детерминант зависит валентность антигена: чем больше молекула, тем выше валентность.
Антигены подразделяют на полноценные и неполноценные. Полноценные антигены вызывают в организме синтез антител или сенсибилизацию (сенсибилизация приобретение организмом специфической повышенной чувствительности к чужеродным веществам,чаще белковой природы, аллергенам) лимфоцитов, и вступают с ними в реакцию как in vivo, так и in vitro. Для полноценных антигенов характерна строгая специфичность, т. е. они вызывают в организме выработку только специфических антител, вступающих в реакцию только с данным антигеном.
Неполноценные антигены, или гаптены представляют собой сложные углеводы, липиды и другие вещества, не способные вызвать образование антител, но вступающие с ними в специфическую реакцию. Добавление к гаптенам небольших количеств белка придает им свойства полноценных антигенов. Белок, который укрупняет молекулу гаптена, получил название «шлеппер» (нем. schlepper проводник). Гаптенами являются и гетерогенные антигены Форсмана, которые были описаны в
1911 г. Форсман показал, что в органах животных разных видов (кошек, собак, лошадей, кур, морских свинок и др.) содержится общий антиген, но отсутствует у человека, обезьян, кроликов, уток и крыс. Это липоидная фракция, которая обладает свойствами гаптена.
Коньюгированные антигены. Этим термином обозначают белки, которые приобрели новую антигенную специфичность благодаря присоединению к ним с помощью химической связи новой химической группировки.
Антигены животного происхождения по специфичности подразделяют на видовые, групповые, органные и стадиоспецифичные.
Видовая специфичность. Животные разных видов имеют антигены, свойственные только данному виду, что используется при определении фальсификации мяса, групп крови путем применения антивидовых сывороток.
Групповая специфичность характеризует антигенные различия животных по полисахаридам эритроцитов, белкам сыворотки крови, поверхностным антигенам ядерных соматических клеток. Антигены, обусловливающие внутривидовые различия индивидуумов или групп особей между собой, называют изоантигенами, например групповые эритроцитарные антигены человека. Органная (тканевая) специфичность характеризуется неодинаковой антигенностью разных органов животного, например, печень, почка, селезенка отличаются между собой антигенами. Стадиоспецифические антигены возникают в процессе эмбриогенеза и характеризуют определенный этап внутриутробного развития животного, его отдельных паренхиматозных органов.
Аутоантигены. В некоторых случаях белки собственных тканей (сердца, печени, почек и др.) при соединении с белком микроорганизмов, токсинами или ферментами бактерий, лекарственными веществами, под влиянием физических факторов (ожог, облучение, обморожение) изменяют свои физико-химические свойства и становятся чужеродными для организма аутоантигенами. На эти антигены организм вырабатывает антитела, возникают аутоиммунные болезни.
Антигены микроорганизмов. Вирусы, бактерии, грибы и их отдельные структуры, экзо- и эндотоксины обладают свойством полноценных антигенов.
Различают общие для родственных видов антигены, которые обозначаются как видовые и групповые, и антигены типоспецифические, свойственные определенному типу (варианту). Так как вирусы сложные антигены, часть которых связана с антигенами наружной оболочки вируса, часть с внутренним нуклеопротеидом, то и противовирусные антитела обладают выраженной гетерогенностью с широким спектром антител.
Антитела это специфические белки иммуноглобулины, которые образуются в организме плазматическими клетками под воздействием антигена и обладающие свойством специфически с ним связываться. Антитела образуются в организме в результате естественного заражения, после введения живых или убитых вакцин, при контакте лимфоидной системы с чужеродными клетками и тканями. Антитела по их функциональным свойствам подразделяются на нейтрализующие, лизирующие и коагулирующие. К нейтрализующим отнесены антитоксины, антиферменты, вируснейтрализующие, антитела лизины; к коагулирующим агглютинины и преципитины лизирующие бактериолизины, гемолизины, выделены комплементсвязывающие антитела.
С учетом функциональной способности антител были названы серологические реакции агглютинации, гемолиза, лизиса преципитации и др. антитела разделены на тепловые (вступают в реакцию при 37°С) и холодовые (креофильные) вступают в реакцию при 4С°. в электрическом поле белки сыворотки крови разделены на альбумины и три глобулиновые фракции: α, β, γ. При электрофорезе установлено, что антитела имеются только в β- и γ-фракциях. При высокоскоростном центрифугировании антитела разделили на две основные группы: 7S (скорость седиментации - осаждения) небольшие молекулы и 19S большие молекулы, причем 7S обнаружены в γ-глобулинах, а 19S в β-глобулинах. Антитела имеют различное количество активных центров в молекуле, это определяет их валентность. Антитела подразделяются на полные и неполные. Полные антитела при взаимодействии с антигеном дают видимые реакции (агглютинации, лизиса, преципитации и др.), неполные антитела после взаимодействия со специфическим антигеном не дают видимого проявления серологических реакций. При введении антигена в организм образуются антитела с различной функциональной активностью (приципитины, агглютинины, лизины и др.). все они идентичны, различно их действие, этих антител не менее 10000.
В соответствии с Международной классификацией антитела называются иммуноглобулинами и обозначаются Ig. Иммуноглобулины - белки с четвертичной структурой, то есть их молекулы построены из нескольких полипептидных цепей. Молекула каждого класса состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух идентичных легких (L) цепей, связанных между собой нековалентными взаимодействиями, дисульфидными мостиками и "хвоста". Легкие цепи являются общими для всех классов и подклассов. Тяжелые цепи имеют характерные особенности строения у каждого класса (подкласса). Легкие цепи подразделены на два типа: К (Kaппa) и (Лямбда). Тяжелые цепи обозначаются греческими буквами: (Гамма), (Мю), (альфа), (дельта), (эпсилон) - соответственно латинскому обозначению того или иного класса иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Hа конце каждой из двух “ветвей” имеются два идентичных антигенсвязывающих участка (в силу этого антитела называют бивалентными), с помощью которых антитела сшивают молекулы антигена в обширную сеть, так как каждая молекула антигена имеет три и более антигенных детерминант. Эффективность реакций связывания и сшивания антигена антителами значительно возрастает благодаря гибкому шарнирному участку в месте соединения обеих "ветвей" с "хвостом".
Антитела выполняют также эффекторные функции, обусловленные структурой Fc-фрагмента, имеющегося на "хвостовых" областях антител различных Н-цепей. Так, у IgG "хвостовая" область связывается со специфическими рецепторами фагоцитирующих клеток, таких как макрофаги или полиморфноядерные лейкоциты, и в результате эти клетки более эффективно поглощают и разрушают внедрившиеся вирусы.
Иммуноглобулины делят на классы, а также на подклассы. Известно 5 классов: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.
Иммуноглобулины это белки построенные из нескольких полипептидных цепей. Молекула каждого класса состоит из 4 полипептидных цепей двух тяжелых и двух легких, которые связанны между собой дисульфидными мостиками. Мелкие цепи (I) общие для всех классов и подклассов. Тяжелые цепи (Н) имеют характерные особенности строения у каждого класса и подкласса. Гетерогенность антител при своей специфичности антитела неоднородны и отличаются друг от друга, они гетерогенны. Существует более 100000 антигенов и к каждому из них синтезируется «свое» специфическое антитело. Антитела реагируют с антигенами благодаря наличию у них определенных структур активных центров. Активный центр представляет собой полость или щель, которая по конфигурации соответствует детерминантной группе антигена. Активный центр, куда входит детерминантная группа должен быть ей комплементарен, без этого не наступит феномен серологической специфичности. Молекулы антител различных классов различают по валентности, т.е. по количеству у них активных центров. Там IgG и IgA бивалентны (обладают двумя активными центрами), IgM поливалентен, может связать 5-10 молекул антигена. Активность связывания антител с антигеном оценивается такими понятиями, как аффинитет и авидность. Аффинитет характеризует степень совпадения (комплементарности) конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты (как ключ входит в замочную скважину). Под авидностью понимают количество (валентность) и расположение активных центров, характеризующие «жадность» связывания с антигеном всей молекулы антитела.
Свойства антител. Специфичность антител это способность антител отличать один антиген от другого. Серологические реакции более специфичны и чувствительны, чем химические. Антитела, за очень редким исключением, реагируют только с теми антигенами, против которых они выработаны и подходят к ним как отпечаток к пальцу. Это так называемая комплементарность антител дополнение к детерминанте антигена.
Аффинность (сродство) активность антител в расчете на активный центр антигена вне зависимости от числа активных центров на молекулу.
Авидитет способность антител связывать антигены. Он зависит от аффинности и числа активных центров антитела. При равной аффинности авидность IgM больше, чем авидность IgG, поскольку IgM функционально пятивалентен, а IgG двухвалентен.
Антитела различных классов иммуноглобулинов обладают различными физическими, химическими, биологическими и антигенными свойствами. Иммуноглобулин М первым появляется после заражения или вакцинации животного, обладает выраженной способностью агглютинировать, преципитировать или лизировать антигены, а также связывать комплемент. Находится в плазме крови, у человека 1,0 г/л, при инфекционных заболеваниях количество его значительно повышается. Иммуноглобулин не участвует в аллергических реакциях, не переходит через плаценту. К классу IgM относят антитела группы крови человека А, В, О.
Иммуноглобулин IgG наиболее изученный класс антител, содержится в сыворотке крови 12 г/л, составляет от 70 до 85 % всех иммуноглобулинов. Ig играет ведущую роль в защите от многих вирусных и бактериальных инфекций (оспа, бешенство, столбняк и др.), обладает выраженным свойствами нейтрализации токсинов.
Иммуноглобулины класса А делят на два вида: сывороточный и секреторный. Сывороточный IgA масса 170000, содержится в сыворотке крови составляет 15-20 % общего количества иммуноглобулинов, не обладает способностью преципитировать растворимые антигены, не связывает комплемент, принимает участие в реакции нейтрализации токсинов, термоустойчив, синтезируется в селезенке, лимфоузлах и в слизистых оболочках и поступает в секреты слюну, слезную жидкость, бронхиальный секрет, молозиво.
Секреторный IgA представляет собой полимер, синтезируется в слизистых оболочках. Биологическая функция в местной защите слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей.
Иммуноглобулин D. Молекулярная масса 10000, 7S. В сыворотке крови человека содержится до 1% от общего количества иммуноглобулинов, является одним из основных иммуноглобулинов, входящих в состав рецепторов В-лимфоцитов; термостабилен, обладает антивирусной активностью, не связывается с тканями.
Иммуноглобулин Е молекулярная масса 19000, 8,5S. Содержится в сыворотке крови 0,25 мг/л, термостабилен, инактивируется при 56°С в течении 1 часа, не связывает комплемента, быстро связывается с клетками тканей. Играет защитную роль при гельминтозах и протозойных заболеваниях, способствует усилению фагоцитарной активности макрофагов и эозинофагов.
Моноклональные антитела. Иммунная система организма вырабатывает специальные антитела на огромном множестве антигенов. В основе этой способности лежит наличие разнообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела одного типа с узкой специфичностью. Общее число клонов у мышей, например, достигает 107-1010 степени. В ответ на данный антиген в реакцию вовлекается множество клонов, что обусловливает высокую гетерогенность получаемых антител. Поэтому при использовании антисывороток для идентификации и количественно определения антигенов большой проблемой является неспецифическое связывание и перекрестная реакция антител. В 1975г. Д. Кохлер и Ц. Мильстейн предложили метод получения гомогенных антител метод гибридом. С его помощью проиводят слияние плазмацитомы (опухолевой клетки, возникшей из антинбелокобразующих клеток) с клетками селезенки иммунизированного животного. Таким образом получают гибридные клетки (гибридомы), способные неограниченно размножаться и синтезировать антитела узкой специфичности (моноклональные антитела).
Моноклональные антитела, получили широкое распростронение при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных и человека. Например, получены такие антитела против возбудителя сибирской язвы, бруцеллеза, листериоза, ящура, бешенства, классической чумы свиней, болезни Ауески и т.д.
Таким образом, самым надежным при диагностике различных инфекционных болезней является использование лабораторных методов исследований.
Методы лабораторной диагностики инфекционных болезней
При лабораторной диагностике инфекционных болезней, вызываемых бактериями, применяются основные методы исследований:
Для диагностики вирусных болезней животных используют различные методы лабораторных исследований. Все методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных делят на три группы:
1. Экспресс-методы.
2. Вирусологические методы.
3. Методы ретроспективной диагностики.
1. Экспресс-методы основаны главным образом на быстром обнаружении в патматериале гемагглютининов в реакции гемагглютинации, вируса или его антигенов с помощью:
2. Серологических тестов: реакций иммунофлуоресценции (РИФ), связывания комплемента (РСК), иммуноферментного анализа (ИФА), диффузионной преципитации в геле (РДП).
3. Световой микроскопии.
4. Электронной микроскопии.
5. Вирусологические методы основаны на изоляции активных форм вирусов из патматериала и их идентификации в серологических реакциях. Вирусологические методы длительны и трудоемки, но дают точный ответ о возбудителе болезни.
Для выделения вируса приготовленной из патматериала суспензией заражают чувствительные объекты, в качестве которых используют восприимчивых и лабораторных животных, куриные эмбрионы, культуры клеток. Выбор чувствительной системы и методы ее заражения зависят от ее чувствительности к выделяемому вирусу и его тропизма.
Идентификация вируса. Она основывается главным образом на реакциях антиген-антитело. В них используются известные специфические диагностические сыворотки, каждая из которых нейтрализует только определенный вирус.
Выбор серологической реакции для окончательной идентификации вируса определяется в основном свойствами самого вируса. При наличии у вируса гемагглютинирующих свойств его идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), если вирус проявил гемадсорбирующие свойства в культуре клеток в РТГАд (реакция торможения гемадсорбции). При отсутствии названных свойств у выделенного вируса его надежно идентифицируют в РН (реакция нейтрализации), РСК (реакция связывания комплемента), РДП (реакция диффузионной преципитации в геле).
Результаты вирусологических исследований считают положительными при наличии клинических проявлений у животных того же вида, от которого был взят исследуемый материал. При экспериментах в куриных эмбрионах или культуре клеток проводится доказательство этиологической роли выделенного вируса. Установление нарастания титра антител к выделенному вирусу в парных сыворотках от животных, послуживших источником получения патологического материала, является доказательством этиологической роли выделенного вируса.
Серологические реакции.
Все серологические реакции основаны на взаимодействии антигенов со специфическими им (гомологичными) антителами.
Реакция нейтрализации (РН) наиболее универсальная высокоспецифичная реакция, поэтому она служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии. Принцип ее состоит в том, что при смешивании вируса с сывороткой, содержащей специфические антитела, вирус теряет инфекционные свойства, то есть возможность репродукции в чувствительных клетках. Смесь вируса и сыворотки испытывают на чувствительной к данному вирусу системе (лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток). Биологическую систему и метод ее заражения подбирают с учетом наилучшего культивирования используемого в реакции вируса.
Реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА) основана на нейтрализации антителами при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) не только его инфекционной, но и гемагглютинирующей активности в результате блокирования рецепторов вирионов, ответственных за гемагглютинацию и образования с ними комплекса антиген + антитело.
Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.
Реакция гемадсорбции и ее задержка (РГАД и РЗГАД). Гемадсорбция соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации.
Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП) (синонимы: реакция гель-преципитации, реакция двойной диффузии в геле) основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов и отсутствии такой способности у комплекса антиген + антитело. Комплекс антиген + антитело образуется при контакте диффундирующих навстречу друг другу гомологичных антигена и антитела. Он осаждается на месте образования в толще геля в виде беловатой полосы преципитации, хорошо заметной на фоне прозрачного геля.
Реакция связывания комплемента (РСК) одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней: ящура, КЛО, АЧЛ, вирусной диареи КРС, аденовирусной инфекции, гриппа. В основе реакции лежит связывание комплемента специфическим комплексом антиген + антитело и выявление этого феномена с помощью индикаторной (гемолитической) системы смеси бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним гемолизина. Если исследуемый антиген гомологичен антителам, то образуется комплекс антиген + антитело и комплемент ими связан. В силу этого лизиса эритроцитов не происходит положительная РСК (эритроциты находятся во взвеси жидкость мутная, красного цвета). Если антиген не гомологичен антителам, комплекс не образуется, свободный комплемент лизирует эритроциты отрицательная РСК (лизис эритроцитов жидкость прозрачная, красного цвета). Между этими двумя крайними результатами может быть задержка гемолиза разной степени выраженности.
Метод флуоресцирующих антител (МФА), или реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Принцип данного метода заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом (коньюгат), сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело обнаруживают под люминисцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Для идентификации вирусспецифического антигена иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.
Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция
Иммунопероксидазная реакция аналогична методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом пероксидазой, и учет результатов реакции проводят не под люминисцентным микроскопом, а под обычным микроскопом.
Иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах.
Методы твердофазного иммуноферментного анализа.
Они основаны на применении антител (антигенов), фиксированных на нерастворимых носителях. В качестве носителей используют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или керамические пробирки или микропанели.
Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты, в том числе и вирусные, в любом материале от больных животных: свежем (ткани, смывы, кровь), высушенном, мороженом и даже частично разложившемся. Метод ДНК-зондов основан на способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот соединяться в двухцепочечные, если они взаимно комплементарны.
Методика ДНК-зондов включает в себя:
1. Получение одноцепочечного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНК-зонда) и его метка радиоактивным фосфором (Р32) или биотином.
2. Выделение из патологического материала нуклеиновых кислот и их денатурация (расплетение двухцепочечных молекул на одноцепочечные в результате кипячения (80о С) или обработки щелочью).
3. Контакт образовавшихся одноцепочечных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55оС, приводящий к образованию двухцепочечных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности
А А Г Ц А Т Г Г Ц Т…………Ц А А А Г Т
|| || ||| ||| || || ||| ||| ||| || ||| || || || ||| ||
Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А………… Г Т Т Т Ц А
4. Удаление всех негибридизированных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот.
5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации ДНК, то есть увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro с помощью фермента термостабильной (выдерживающей многократный нагрев до 90оС) ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3/ - концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать.
ПЦР включает в себя три циклически повторяющихся процесса:
1. Плавление ДНК-матрицы денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании реакционной смеси до 90-100оС.
2. Отжиг праймеров гибридизация (комплементарное связывание) праймера с ДНК-матрицей (55-65оС).
3. Синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы комплементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью ДНК-полимеразы из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (72оС).
Стандартный цикл ПЦР плавление, отжиг, синтез - воспроизводится многократно и в идеале количество амплификонов (амплифицируемый участок) растет в геометрической прогрессии. Весь цикл длится 3-5 минут и может повторяться до 20-40 раз. Теоретически за 30 циклов количество ДНК должно увеличиться в миллиард раз (20 циклов в миллион раз).
Индикацию амплифицированных ДНК производят известными методами: электрофорезом с окрашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно меченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуорометрическим, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот.
Более подробно методы лабораторной диагностики описаны при лабораторных исследованиях инфекционных болезней животных в разделе «Специальная часть».
Отбор, консервирование, транспортировка и хранение
материала для лабораторного исследования
Отбор материала для лабораторного исследования. Правильный отбор материала и его транспортировка в значительной мере определяют успех исследований.
Материал берут с учетом клинических признаков болезни, которые указывают на поражение той или иной системы, патологоанатомической картины при вскрытии (изменения в различных органах печени, легких, кишечнике и т.д.), а также основываясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфекции характерна определенная локализация возбудителя в организме.
Материал для исследования берут прижизненно или посмертно (от павших или убитых с диагностической целью животных). Во всех случаях желательно материал брать от животных, не подвергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2 - 3 ч после смерти нормальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культуры. Чтобы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследуемый материал берут стерильно, с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортировки.
Трупы мелких животных направляют в лабораторию целиком.
Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каждый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспортируют в нативном виде или консервируют одним из способов.
Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, заворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пересыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань.
Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца.
Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в количестве 15-20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы можно отбирать стерильной пастеровской пипеткой с последующим запаиванием ее кончика.
Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскивают стерильным физиологическим раствором, осушают стерильным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, последующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду.
Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного тампона на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении тампона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. При взятии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.
Секрет молочной железы: сосок обмывают водой, обрабатывают этанолом, ополаскивают стерильным физиологическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию секрета, для микробиологического исследования берут последующие порции молока.
Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции.
Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрезки (сегменты) кишечника, перевязанные на концах лигатурами. В остальных случаях интересующие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промывают стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хлорида натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с регионарными лимфатическими узлами.
Фекалии берут стерильными ватными или ватномарлевыми ректальными тампонами, которые вводят на 8-10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирующие смеси. В противном случае нарушается исходное количественное соотношение микробных видов и размножение некоторых бактерий может привести к инактивации искомого возбудителя.
Консервирование, транспортировка и хранение материала. Материал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т.д.), закупоривают.
При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с материалом помещают в герметичный металлический пенал (ящик), который опечатывают.
Транспортировку и хранение материала до исследования проводят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганизма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) помещают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиолоuического раствора или помещают в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3: 1), температура смеси 15 минус 20 °С; 2) равные части сухого льда и этанола, температура смеси около 70 °С.
Для консервирования материала, содержащего энтеробактерии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема.
Глицериновая смесь: глицерин - 500мл, физиологический раствор - 1000мл, рН смеси доводят до 7,8-8,0 добавлением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Смесь стерилизуют дробно, текучим паром.
Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода - 1000мл, дигидрофосфат калия - 0,45г, гидрофосфат калия - 5,34 г. Стерилизуют при 121 °С 20 мин.
Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны составлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервирования фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2-6°С.
В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого материал получен, характер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме того, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико-эпизоотологических данных.
Поступивший в лабораторию неконсервированный материал можно хранить при 4 °С 1-2сут; консервированный в 50%-м растворе глицерина (кусочки органов) несколько недель; для длительного хранения материал замораживают при 15-20 °С.
Кровь для серологических исследований у крупного рогатого скота, овец, лошадей берут из яремной вены в стерильные бактериологические пробирки в количестве 10-15 мл, у свиней из хвостовой, передней краниальной вен или глазного синуса, у птиц из подкрыльцовой вен, у кроликов из краевой ушной вены. Пробирки с кровью необходимо выдержать до формирования сгустка в тепле (1,5-2 ч), затем для отделения от стенок пробирки обвести сгусток стеклянной чистой палочкой или спицей. Для отстаивания сыворотки пробирки с кровью помещают в холодильник при 4-6 °С на 18-20 ч. После ретракции сгустка сыворотку крови переливают в серологические пробирки с резиновыми пробками. При необходимости сыворотку крови консервируют, добавляя в пробирку несколько крупинок борной кислоты, тиомерсал (конечное разведение 1:10000), или замораживают.
Принципиальная схема лабораторного исследования
Диагностика инфекционных болезней включает в себя комплекс исследований: эпизоотологические, клинические, патологоанатомические, микробиологические. При важности каждого из них и ценности именно комплексного подхода микробиологическое исследование особенно важно, поскольку с его помощью либо непосредственно обнаруживают этиологический (причинный) агент болезни, либо косвенными специфическими иммунологическими методами доказывают его присутствие.
Микробиологическое исследование состоит из следующих этапов.
1. Обнаружение возбудителя непосредственно в исследуемом материале без изоляции в виде чистой культуры на питательных средах. На этом этапе применяют разные методы.
Неиммунологические методы включают в себя: а) выявление возбудителя путем микроскопического исследования окрашенных (по Граму и т. д.) мазков-отпечатков из органов и тканей; б) обнаружение при помощи генетических методов (генные зонды, ПЦР) нуклеиновых кислот возбудителя.
Иммунологические методы заключаются в выявлении антигенов возбудителя с помощью различных серологических реакций (РП, РДП, МФА, ИФА, РНГА и т.д.).
Изложенная схема отражает возможные, но не обязательные направления лабораторных исследований. При каждой конкретной инфекции схему исследования определяют особенности биологии возбудителя и инфекционного процесса.
Специальная часть
Лабораторная диагностика стафилококкозов
Возбудителями стафилококкозов животных и человека являются кокковидные, грамположительные, неподвижные, неспорообразующие бактерии, относящиеся к роду Staphylococcus, семейства Мiсrососсасеае. Стафилококки - обитатели кожи, слизистых оболочек. Как транзитные виды могут присутствовать в кишечном тракте. Род Staphylococcus содержит 28 видов. У человека стафилококковые инфекции включают более 100 нозологических форм. Основными возбудителями стафилококкозов с/х животных являются виды S. aureus (два подвида), S. intermedius,
S. hyicus и др.
S. aureus вызывает у многих видов животных местные воспалительные гнойные процессы на коже, фурункулы, абсцессы и т.д.; маститы крупного рогатого скота, овец, свиней, лошадей, коз, кроликов; эндометриты овец, коз, свиней, собак.
К S. aureus наиболее чувствительны цыплята раннего возраста, у взрослых кур обусловливает поражение органов дыхания, суставов.
Подвид S. aureus anaerobicus вызывает у овец казеозный лимфаденит, сходный с псевдотуберкулезным.
S. intermedius наиболее обычен как возбудитель пиодермии собак, кошек, может поражать респираторный тракт, суставы и другие ткани.
S. hyicus вызывает экссудативный дерматит свиней, в основном поражаются поросята до 1,5-месячного возраста. У взрослых свиней может быть причиной метритов, поражений кожи. Иногда этот вид стафилококков изолируют при маститах коров.
S. gallinarum, S. arlettae обитают на коже кур; S. сарrае выделяют из молока коз;
S. equorum выделяют с кожных покровов лошадей, от кошек,
S. delphini - от дельфинов.
Лабораторная диагностика стафилококкозов основана на выделении культур возбудителей световой микроскопией, изучении их свойств с целью доказательства патогенности по изученным показателям и путем биопробы.
Бактериологическое исследование. Для исследовании используют патматериал. Трупы мелких животных и птиц направляют в лабораторию целиком, от трупов крупных животных берут части паренхиматозных органов, кровь из сердца, головной мозг; прижизненно содержимое абсцессов, истечения из шейки матки, синовиальную жидкость из пораженных суставов, молоко от маститных животных, соскобы с пораженных участков кожи. При подозрении на кормовые отравления стафилококковой этиологии направляют пробы корма. Материал берут от животных, не подвергавшихся в последние 10 дней лечению антибактериальными препаратами.
Микроскопическое исследование исходного материала. Из поступившего материала готовят мазки, окрашивают по Граму. Клетки стафилококков сферические, размером 0,5-1,0 мкм, грамположительные, располагаются единично, парами, в виде скоплений неправильной формы, некоторое количество клеток в мазках из тканей может быть фагоцитировано. Клетки вирулентных штаммов S. aureus имеют небольшую капсулу. Клетки S. saprophyticus располагаются в препарате в виде групп неправильной формы, а также тетрадами и пакетами.
Выделение и идентификация культур стафилококков
Культивирование. Подавляющее число стафилококков факультативные анаэробы. Подвид S. aureus anaerobicus в аэробных условиях не растет. С другой стороны, не растут на средах с тиогликолатом
S. arlettae, S. equorum, не растет или слабо растет S. lentus. Температурный оптимум 35-37° С, рН 7,2-7,4. Испытуемый материал обычно высевают на кровяной (овечий) агар, контаминированный на молочно-солевой агар, среду Ваird-Рагkег, плотные среды с добавлением на литр среды 15 мг налидиксовой кислоты и 10 мг колистина сульфата, желточно-солевой агар Чистовича и др. Посевы, за исключением случаев выделения анаэробного подвида S. aureus, инкубируют в аэробных условиях при 37° С в течение 24-48 часов.
Характер роста стафилококков на питательных средах. Приводим культуральные характеристики основных патогенных видов стафилококков и S. saprophyticus. Макроскопически видимые колонии образуются в течение 24 часов инкубирования.
S. aureus на плотных питательных средах формирует круглые, выпуклые, с гладкой, блестящей поверхностью непрозрачные колонии диаметром до 6-7 мм. Может образовывать α- или β-гемолизин. Колонии капсулообразующих штаммов более мелкие. Цвет колоний серый, серо-белый с желто-оранжевым или оранжевым оттенком. Штаммы, выделенные от собак, обычно не пигментированы. Пигментообразование наиболее выражено на средах, содержащих кровь, сыворотку крови, молоко, углеводы. В жидких питательных средах растет с равномерным помутнением, образованием плотного, легко суспендируемого осадка.
S. hyicus и S. intermedius на агаровых средах растут в виде круглых выпуклых, блестящих, непрозрачных колоний, достигающих на селективных средах диаметра 4-7 мм, пигмента не образуют.
S. gallinarum на плотных средах формирует непрозрачные, сухие, плоские, с дольчатыми краями колонии диаметром до 10-15 мм, желтые или непигментированные. Некоторые штаммы на кровяном агаре дают слабый гемолиз.
S. сарrае растет на агаровых средах в виде круглых, слабовыпуклых, непрозрачных, с блестящей поверхностью непигментированных колоний. На кровяном агаре замедленно, через 48 часов и более, образует узкую зону β-гемолиза с широкой зоной частичного обесцвечивания среды.
S. ерidermidis на плотных средах образует круглые, с гладкой, блестящей поверхностью, непрозрачные колонии диаметром 3-6 мм серого или серо-белого цвета. При длительном культивировании липкость колоний возрастает и в центре формируется углубление. Некоторые штаммы образуют небольшое количество гемолизина. При росте в питательном бульоне формируется слизистый осадок.
S. saprophyticus растет на агаровых средах в виде круглых, выпуклых, с гладкой, блестящей поверхностью колоний диаметром до 5-9 мм. Некоторые штаммы образуют желтый или желто-оранжевый пигмент.
При характеристике гемолитической активности стафилококков дифференцируют четыре типа гемолиза: альфа-, бета-, дельта-, гамма.
Идентификация стафилококков на уровне рода. Культуры из подозрительных колоний, после изучения морфологических и тинкториальных свойств клеток, отвивают на простой МПА, выращивают и исследуют у них ряд признаков, позволяющих отличить стафилококки от сходных бактерий: виды родов Мicrococcus, Еnterococcus, Streptococcus. Исследуют способность к ферментации глюкозы в ОФ-тесте, наличие каталазы, оксидазы, коагулазы, чувствительность к бацитрацину.
Ориентируясь на критерии, изложенные в табл.1, к стафилококкам относят штаммы, ферментирующие глюкозу в ОФ-тесте (расщепление в аэробных и анаэробных условиях), образующие каталазу, не обладающие оксидазой, чувствительные к бацитрацину.
Четко выраженная коагулазная активность позволяет культуру стафилококка отнести к группе патогенных без выяснения видовой принадлежности штамма.
Таблица 1 - Дифференциация стафилококков от других
грамположительных кокков
Признаки |
Стафилококки |
Микрококки |
Энтерококки |
Стрептококки |
Ферментация глюкозы (ОФ-тест) |
+ |
- |
+ |
+ |
Каталаза |
+ |
+ |
- |
- |
Оксидаза |
- |
+ |
- |
- |
Коагулаза |
+ |
- |
- |
- |
Чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД/диск) |
- |
+ |
- |
- |
Определение патогенных свойств стафилококков, идентификация на уровне вида. Достаточно подробное изучение патогенных свойств стафилококка позволяет отнести выделенную культуру к одному из трех основных патогенных видов (табл.2). Исследование дополнительных ферментативных, культуральных и прочих свойств дает возможность идентифицировать другие виды стафилококков, достаточно часто выделяемые от животных (табл. 3). О присутствии патогенных свойств у выделенных культур судят, кроме того, по результатам биопроб, позволяющих, в том числе, доказать наличие энтеротоксина. Определение факторов патогенности проводят следующими методами.
Коагулаза. Фермент, вызывающий свертывание плазмы, на фибриноген непосредственно не действует. Для этой цели наиболее подходит цитрированная плазма кролика (1 объем 4%-ного раствора натрия цитрата + 9 объемов крови). При исследовании штаммов, выделенных от определенных видов животных, может быть использована их кровь (свиньи, КРС, собаки).
Цитратную кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут, плазму отсасывают в стерильные пробирки, закрывают пробками, хранят до 3 недель при 4-5° С. При постановке опыта плазму разводят стерильным физиологическим раствором 1:5 и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. Испытуемую культуру выращивают на МПА или МПБ 18-24 часа и вносят две капли бульонной или одну петлю агаровой культуры в пробирки с подготовленной плазмой. Параллельно проводят контроль плазмы без культуры бактерий. Пробирки ставят в термостат (37-38° С). Учет проводят через каждый час в течение 5-6 часов, при комнатной температуре 18 часов. Положительный результат образование сгустка, который при наклоне пробирки удерживается. Стафилококки с выраженной патогенностью свертывают плазму в сроки до 2 часов. Наличие коагулазы наиболее четко коррелирует с патогенностью стафилококка.
Таблица 2 - Свойства основных патогенных видов стафилококков
Признаки |
S. aureus * |
S. intermedius |
S. hyicus |
Коагулаза (плазма кролика) |
+ |
d |
D |
Гемолизин (эритроциты КРС) |
+ |
- |
- |
Гиалуронидаза |
+ |
- |
+ |
Лецитиназа |
+ |
Н.Д. |
Варьирующий признак (чаще +) |
Протеин «А» |
+ |
Варьирующий признак |
+ |
ДНК-аза |
+ |
+ |
+ |
Ферментация маннита аэробно анаэробно |
+ + |
+ - |
- - |
Мальтоза |
+ |
(±) |
- |
Образование пигмента |
+ |
- |
- |
* Анаэробный подвид S. aureus (S. subsp. anaerobicis) образует коагулазу, ДНК-азу, гемолизин, ферментирует мальтозу, не синтезирует пигмент (±) 90% или более штаммов слабо позитивные d 11-89% штаммов позитивные.
Фактор скучивания (Сhumping factог-СF). СF -фактор в отличие от коагулазы действует на фибриноген, что приводит к агрегированию стафилококков. Для выявления СF-фактора на предметном стекле в капле неразведенной цитратной плазмы суспендируют бактериальную массу стафилококков из агаровой культуры при помощи бактериологической петли. В положительных случаях агрегирование наступает в течение 1-2 минут. Контролем служит взвесь стафилококков в физиологическом растворе. Результаты СF-теста хорошо коррелируют с результатами пробирочной пробы на коагулазу.
Фибринолизин (стрептокиназа). Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляшки» на агар с 12 % цитрированной плазмы. Посевы инкубируют при 37 °С 23-24 ч. Положительный результат появление зоны просветления вокруг колонии.
Лецитиназа. Фермент бактерий, расщепляющий лецитин, выявляют путем посева культуры стафилококков на желточный агар. Готовят желточный агар: пептон 20 г, гидрофосфат натрия 2,5 г, натрий 1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния 0,1 мл, глюкоза 1 г, агар 12,5 г, вода дистиллированная 500 мл. Устанавливают рН 7,2-7,4, стерилизуют при 121°С 15 мин, охлаждают до 55 °С, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь разливают в чашки Петри. Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37-38 °С 24-48 ч. Положительный результат появление зоны помутнения вокруг колоний.
Протеин «А». Белковое вещество, которое часто обнаруживают на поверхности клетки S. aureus и S. hyicus, обладает способностью неспецифически связывать Fс-фрагменты молекул JgG. Обнаружение протеина «А» у стафилококков проводят следующим образом. Отмытые центрифугированием эритроциты барана суспензируют в физиологическом растворе, смешивают с гемолизином, разведенным физиологическим раствором. Компоненты выдерживают при 37°С. Эритроциты отмывают ценрифугированием и ресуспендируют в исходном объеме фгоиологического раствора. Каплю суспензии сенсибилизированных эритроцитов смешивают с бактериальной массой стафилококков при помощи бактериологической петли на предметном стекле. За счет протеина «А» стафилококков происходит агглютинация эритроцитов, содержащих на своей поверхности JgG (гемолизин).
Таблица 3 - Биохимические признаки и другие свойства
стафилококов, выделяемых от животных
Гемолизины. Гемолитическую активность исследуют посевом на кровяной агар. Гемолизины стафилококков отличаются биохимическими, антигенными свойствами и литической активностью по отношению к эритроцитам различных видов животных. Известны четыре типа гемолизинов стафилококков (табл. 4).
Конкретный штамм стафилококков может синтезировать один тип гемолизина или несколько в различных комбинациях. При тестировании гемолитической активности у штаммов, особенно от КРС, необходимо учитывать наличие β-гемолизина и целесообразность дополнительного выдерживания посевов после инкубирования также при 4-15° С.
S. aureus, S. intermedius могут синтезировать одновременно α- и β -гемолизин, что приводит к образованию двойной зоны гемолиза: вблизи колонии типа α, далее β.
Таблица 4 - Спектр активности гемолизинов стафилококков
Гиалуронидаза (фактор проникновения). Обнаружение этого фермента у стафилококков практически наиболее легко осуществимо в тесте декапсуляции. Берут штаммы капсулообразующих видов бактерий, имеющих в составе капсулы гиалуроновую кислоту (субстрат для гиалуронидазы): Str. equi, Раsterella multocida (серовар А). На кровяной МПА в чашке Петри крестообразно засевают штрихом Str. equi или Р. multocida (тип А) и под углом 90° аналогично в виде линии культуру испытуемого стафилококка. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24 часов. При наличии гиалуронидазы колонии тест-микроба вблизи штриха стафилококков образуются более мелкие и тусклые за счет разрушения капсулы ферментом, который диффундирует в толщу агара (результат положительный).
ДНК-аза. Нуклеаза обычно выявляется у S. aureus, S. intermedius,
S. hyicus. Исследуемую культуру бактерий засевают на питательный агар с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положительный результат при гидролизе ДНК вокруг выросшей культуры видна светлая зона.
Биопроба. Проводят для выявления патогенных свойств штаммов по летальному эффекту (биопроба на цыплятах), положительной дермонекротической реакции (некротоксин), а также на котятах для обнаружения способности продуцировать энтеротоксин. Известно шесть антигенноразличных энтеротоксинов (А, В, С, D, Е, F).
Дермонекротическая проба. У кролика-альбиноса массой 2-2,5 кг за сутки до опыта на боку выстригают два участка размером 2x2 см. 24-часовую бульонную испытуемую культуру вводят внутрикожно в дозе 0,2 мл на обоих участках. Положительный результат: через 24 часа на месте инъекции появляется гиперемия кожи, через 48 часов - некроз. Наблюдение продолжают 4 суток.
Биопроба на цыплятах. Проводят при изучении штаммов, выделенных от птиц. Суточную бульонную культуру в объеме 0,1 мл вводят во внешний угол глазницы двум 1-2-дневным цыплятам. Наблюдение ведут в течение 5 суток. Положительный результат: гибель цыплят на 3-5 сутки при выделении культуры стафилококков из паренхиматозных органов и костного мозга цыплят.
Обнаружение энтеротоксина в биопробе на котятах. Испытуемую культуру стафилококка засевают на среду для получения стафилококкового энтеротоксина. Культуру стафилококка выращивают на специальной питательной среде (пептон, хлорид кальция, хлорид магния, дигидрофосфат калия, 0,8 % агар-агара, рН 7,2), в атмосфере, содержащей 20 % оксида углерода в течение трех суток. Посевы инкубируют в эксикаторе с 20% СО2, что достигается смешением на дне сосуда (емк. 2000 мл) 2 г двууглекислой соды с 17 мл 10%-ный серной кислоты, после чего крышку эксикатора сразу закрывают. Посевы инкубируют при 37° С 3 суток, ежедневно дополняя вышеописанным способом СО2 в эксикаторе. На 4 сутки содержимое колбы фильтруют через мембранные фильтры № 3 или № 4. Приблизительно 10-15 мл фильтрата смешивают в равной пропорции с теплым молоком и скармливают 4-8-недельным котятам. Положительный результат: через несколько минут котята проявляют беспокойство, через 1-3 часа появляются симптомы гастроэнтерита: понос, рвота. Возможен летальный исход.
В специализированных лабораториях, при наличии соответствующих реактивов, энтеротоксин выявляют серологическими методами. Испытуемый штамм выращивают на подходящей среде, например сердечно-мозговом бульоне, и супернатант исследуют.
Серологически энтеротоксин обнаруживают в РДП или при помощи иммуноферментного метода. Возможно обнаружение токсинообразования следующим способом. К расплавленному и остуженному до 45°С МПА добавляют антитоксическую стафилококковую сыворотку
(S. аureus) до содержания в 1 мл среды 14-15 АЕ. Агар разливают по чашкам Петри и засевают дробно изучаемую культуру для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37° С 24-48 часов. Вокруг колоний токсигенных стафилококков формируются кольца преципитации.
Фаготипирование стафилококков. Проводят для обнаружения источника возбудителя и установления эпизоотологических (эпидемических) связей. Фаготиповая принадлежность является маркером, позволяющим устанавливать идентичность штаммов, даже если другие характеристики подверглись изменениям. Для фаготипирования S. аureus существует международный набор фагов, включающий 21 фаготип, разделенный на 5 фагогрупп (I-V). Для типирования штаммов, выделенных от КРС, предложен свой набор фагов, состоящий из фаготипов 42 Д, 78, 102, 107, 117, 118, 119. Техника фаготипирования сводится к следующему. Исследуемую культуру выращивают на скошенном МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, пересевают в пробирку с 2,5 мл бульона Хоттингера, инкубируют при 37° С 3-4 часа, засевают газоном в чашки Петри на 1,25%-ной МПА (рН 7,2-7,4) с 0,4% глюкозы и 0,02% кальция хлорида. Засеянные чашки подсушивают 30-40 минут в термостате, расчерчивают дно чашки на необходимое количество квадратов и стандартной бактериологической петлей (d=2 мм) в каждый квадратик вносят тот или иной фаг в рабочем титре. Бактериологическую петлю после каждой манипуляции прожигают. Посевы инкубируют 5-6 часов при 37° С или 18-20 часов при 30° С. Штаммы, не лизированные набором фагов, проверяют повторно, используя более концентрированный фаг (х 100). Степень лизиса оценивают по следующей схеме: «+ + + +» полный лизис; «+ + +» наличие в зоне лизиса колоний стафилококка; «+ +» в зоне капли фага обнаруживают более 50 колоний фага;«+» от 20 до 50 колоний фага;
«-» полное отсутствие лизиса.
Штаммы стафилококков чаще лизируются несколькими фагами. В зависимости от спектра фагочувствительности стафилококк относят к какой-либо одной фагогруппе, например I, II и т. д., или к смешанной группе (I и III и т.д.).
Идентификация стафилококков с использованием
СТАФИтеста 16
Набор СТАФИтест 16 предназначен для идентификации широкого ряда стафилококков и родственных грамположительных кокков (Мicrососus, Stomatococcus и др.).
Система представляет собой планшет, содержащий 6 двухрядных вертикальных стрипов с субстратами для определения 16 тестов: уреаза, аргинин, орнитин, бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидонилариламидаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, мальтоза, манноза, глюкоза/новобиоцин. Дополнительно к, планшетным рекомендуются бумажные полоски для определения реакции Фогеса-Проскауэра (ВПтест) и определения цитохромоксидазы (ОКСИтест). Набор содержит 10 пластинок и позволяет провести идентификацию 60 культур.
Методика проведения исследования
Пластинки СТАФИтест 16 (один двухрядный стрип на каждую культуру), рамка с крышкой, физиологический раствор, парафиновое масло, диагностические полоски ВПтест и ОКСИтест, реактивы для тестов: фосфатаза, нитраты, ПИРАтест, Фогеса-Проскауэра (ацетоин), оксидаза, стандарт мутности второй степени по шкале МсFarland.
Выделение культуры и приготовление бактериальной
суспензии. Выделяют чистую культуру с кровяного агара. Окрашивают ее по Граму и проверяют каталазную активность. Для идентификации с помощью данной системы используют культуры грамположительных каталазоположительных кокков. Из чистой 24-часовой культуры готовят в физиологическом растворе бактериальную суспензию мутностью, соответствующей указанному выше стандарту.
Инокуляция и инкубация. Приготовленную суспензию инокулируют по 0,1 мл во все лунки стрипа, кроме лунки А второго ряда (глюкоза/новобиоцин), в которую вносят 0,1 мл разведенной суспензии. Для этого 0,1 мл исходной суспензии вносят в 2,6 мл физиологического раствора и тщательно гомогенизируют. После инокуляции в лунки Н, G и F (тесты уреаза, аргинин, орнитин) добавляют по две капли парафинового масла.
В пробирку с исходной суспензией (примерно 1 мл) помещают диагностическую полоску с ВПтестом. Инокулированную пластинку инкубируют в течение 24 часов, а пробирку с ВПтестом в течение 1,5 часов при температуре 37 °С.
Учет результатов и идентификация
После 1,5 часов инкубации в пробирку с ВПтестом добавляют по три капли реактивов ВПТ1 и ВПТ2, встряхивают и помещают в термостат на 30-40 минут, после чего учитывают результат реакции. После 24 часов инкубации пластинки добавляют по одной капле реактива в следующие лунки первого ряда стрипа: лунка С - реактив на нитраты, лунка В - реактив на фосфатазу, лунка А - реактив РYR. Учитывают результаты всех тестов. При оценке СТАФИтест 16 ориентируются по таблице 17 «Интерпретация реакций», цветной шкале и/или цветовым реакциям контрольных штаммов. Для более четких положительных реакций тестов бета-галактозидаза и бета-глюкуронидаза в лунки Е и D первого ряда стрипа добавляют по 1 капле реактива на фосфатазу. Как дополнительный тест для группы S. sciuri/lentus и S. caseolyticus ставят
ОКСИтест.
Примечание:
При нечеткой работе теста GLN (глюкоза/новобиоцин) для выяснения чувствительности испытуемых штаммов к новобиоцину на контрольные чашки с высевом бактериальных суспензий накладывают диагностические диски с этим антибиотиком.
Таблица 5 - Интерпретация реакций
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
Ряд 1-й |
||||
Н |
Уреаза |
URE |
Красно-фиолетовый, оранжево-красный |
Желтый, бледно-оранжевый |
G |
Аргинин |
АRG |
Красно-фиолетовый, красный |
Желтый, бледно-оранжевый |
F |
Орнитин |
ОRN |
Красно-фиолетовый, красный |
Желтый, бледно-оранжевый |
Е |
Бета-галактозидаза |
ОNP |
Желтый, бледно-желтый |
Бесцветный |
D |
Бета-глюкуронидаза |
GLR |
Желтый, бледно-желтый |
Бесцветный |
С |
Нитраты |
NIT |
Темно-красный, красный |
Бесцветный, слабо-розовый |
В |
Фосфатаза |
РHS |
Красно-фиолетовый |
Бесцветный, слабо-розовый |
А |
Пирролидо-ниламидаза |
РYR |
Красный, бледно-красный |
Желтый, желто-оранжевый |
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
Ряд 2-й |
||||
Н |
Эскулин |
ЕSL |
Черный, темно-коричневый, темно-серый |
Бесцветный, бледно-коричневый, бледно-серый |
G |
Сахароза |
SUC |
Желтый, желто-коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
F |
Трегалоза |
ТRЕ |
Желтый, желто -коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
Е |
Маннитол |
МАN |
Желтый, желто-коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
D |
Ксилоза |
ХYL |
Желтый, желто-коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
С |
Мальтоза |
MLT |
Желтый, желто-коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
В |
Манноза |
МNZ |
Желтый, желто-коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
А |
Глюкоза/ новобиоцин |
GLN |
Желтый, желто-коричневый |
Фиолетовый, коричнево-фиолетовый |
Полоски |
||||
Тест на оксидазу |
окси- тест |
Синий |
Бесцветный |
|
Ацетоин |
ВПтест |
Красный, розовый |
Бесцветный |
Примечание:
В лунки С с отрицательной реакцией на нитраты добавляют осторожно небольшое количество порошка цинка (приблизительно 5 мг) для подтверждения отрицательной реакции; при отрицательной реакции красный цвет появляется в течение 10 минут.
Чтение тестов бета-галактозидазы и бета-глюкуронидазы (ряд 1-й, лунки Е и D) проводят на белом фоне.
Идентификацию проводят с помощью идентификационной таблицы или книги кодов для СТАФИтест 16. При окончательной идентификации учитывают всю дополнительную информацию (микроскопию, характер колоний, наличие пигмента, гемолиз и т. д.).
Питательные среды
Желточно-солевой агар Чистович. К МПА (рН 7,2-7,4) добавляют 10% натрия хлорида, к стерильному расплавленному агару с температурой 45- 50° С добавляют 20% желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида), компоненты перемешивают, среду разливают в чашки Петри.
Молочно-солевой агар Петрович. К МПА (рН 7,2-7,4), содержащему 5-7,5% натрия хлорида, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока, компоненты перемешивают и среду разливают в чашки Петри.
Среда для накопления стафилококкового энтеротоксина. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г пептона, 1 г однозамещенного фосфата калия, 5 г натрия хлорида, 0,1 г кальция хлорида, 0,2 г магния хлорида, 0,8 г агара, устанавливают рН 7,0-7,2, кипятят до расплавления агара, разливают по флаконам, стерилизуют при 116° С в течение 20 минут.
Агар Ваird - Раrkег (желточно-теллурит-глицин-пируватная среда). К 90 мл основной среды с температурой 45° С добавляют 6,3 мл глицинового раствора, 1 мл раствора теллурита натрия, 5 мл эмульсии желтка, компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4° С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 мл 20%-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтрацией, распределяют по поверхности, подсушивают. Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001 N растворе НgС12. Соблюдая правила асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 мл физиологического раствора. Глициновый раствор. Глицин 20 г, дистиллированная вода 100 мл. Стерилизуют при 120° С в течение 15 минут. Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия 1 г, дистиллированной воды 100 мл. Стерилизуют фильтрацией
Среда Чепмен. Пептон 1%, Д-маннит 1%, натрия хлорида
7,5% дрожжевой экстракт 0,25%, двузамещенный фосфорнокислый калий 0,5%, агар-агар 1,5%, устанавливают рН 7,0. Среду стерилизуют при 110° С в течение 1,5 часов, добавляют 10% стерилизованного обезжиренного молока.
Фенилэтаноловый агар. Панкреатический гидролизат казеина
15 г папаиновый гидролизат соевой муки 5 г, NаС1 5 г, фенилэтанол 2,5 г, агар 15 г, дистиллированная вода 1000 мл, рН 7,3, стерилизуют автоклавированием 15 минут при 118° С.
Лабораторная диагностика стрептококкозов
Ранее в род Streptococcus включали пиогенные стрептококки, энтерококки и молочнокислые стрептококки, которые в настоящее время отнесены соответственно в самостоятельные роды Streptococcus, Еnterococcus и Lactococcus. В данном разделе рассматриваются вопросы лабораторной диагностики болезней, вызываемых видами родов Streptococcus и Еnterococcus.
Виды рода Streptococcus имеют клетки сферические или овальные, диаметром 0,5-2 мкм, при росте в жидкой питательной среде клетки парные или в виде цепочек. Клетки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, иногда имеют капсулу. Факультативные анаэробы, каталазоотрицательные, растут в диапазоне температур 25-45° С.
Таблица 6 - Экология и патогенные свойства стрептококков
Вид стрептококка |
Естественная среда обитания |
Вызываемая патология |
S. рneumoniае ' |
Верхние дыхательные пути |
Септицемия, воспаление суставов, при подостром течении пневмония, воспаление кишечника у телят, ягнят, реже у поросят |
S. руoqenes |
Верхние дыхательные пути |
Иногда маститы у коров, лимфангит жеребят |
S. equi sudsp. equi |
Миндалины лошадей |
Лошади - маститы, мыт |
S. equi sudsp . equisimilis |
Вагина и кожа лошадей |
Маститы, эндометриты лошадей |
S. equi zooepidemicus |
Слизистые и кожа свиноматок, овец, кур, вагина и кожа лошадей |
Крупный рогатый скот - маститы и метриты; свиньи септицемия и артриты у 1-3-недельных поросят; ягнята- пневмонии; птица септицемия; лошади - аборты, маститы, пневмонии |
S. agalactiae |
Молочные каналы |
Крупный рогатый скот, овцы, козы - маститы; собаки - септицемия щенков; кошки - маститы |
S. dysagalactiae |
Гениталии и носовая полость крупного рогатого скота, овец |
Крупный рогатый скот - маститы, эндометриты; ягнята - полиартриты |
S. dysagalactiae equisimilis |
Вагина и кожа лошадей |
Лошади - эндометриты, маститы |
S. porcinus |
Слизистые свиней |
Свиньи - лимфадениты поросят |
S. suis mun |
Носовая полость, миндалины свиней |
Свиньи артриты, менингиты, септицемия молодняка |
S. uderis 2 |
Миндалины, вагина, кожа крупного рогатого скота |
Крупный рогатый скот маститы |
S. canis |
Слизистые, генитальный тракт плотоядных |
Плотоядные - септицемия новорожденных, поражения гениталиев, кожи |
S. bovis, S. equines 2 |
Кишечный тракт многих видов животных |
Возбудители оппортунистических инфекционных болезней |
Примечание к таблице 6.1) S. рneumoniае относят к группе «Стрептококки ротовой полости».
2) S. uderis ,2 S. bovis, S. equines 2отнесены к группе «Другие стрептококки». Все остальные стрептококки классифицируют как «Гноеродные стрептококки».
Виды рода Еnterococcus сходны со стрептококками по вышеперечисленным признакам, но температурный диапазон составляет 10-45° С, могут расти при рН 9,6, концентрации NаС 16,5% и желчи 40%, обычно относятся к серологической группе «В».
Патогенные свойства и экология патогенных стрептококков представлены в табл. 6.
Энтерококки (Е. faecalis, E. faecium, E. durans) обитают в кишечном тракте многих видов животных, могут быть причиной оппортунистических инфекций и септицемии у кур, маститов коров, инфекций мочевого тракта у собак, эндокардитов у ягнят и крупного рогатого скота.
Лабораторная диагностика стрептококкозов основана на результатах бактериологического исследования.
Бактериологическое исследование. Для исследования на стрептококковую инфекцию животных в лабораторию направляют кровь сердца, печень, селезенку, головной мозг и трубчатую кость. При пневмониях дополнительно берут кусочки легкого на границе здоровой и пораженной тканей, средостенные лимфатические узлы, при артритах - синовиальную жидкость. Трупы мелких животных доставляют целиком. В случае маститов направляют секрет пораженной доли вымени, эндометритов содержимое влагалища, взятое при помощи стерильных тампонов.
Учитывая малую устойчивость возбудителя материал должен быть доставлен не позднее 6 часов после гибели или убоя животного при условии транспортировки его в термосе со льдом (4-6°С). При более высокой температуре срок доставки материала не должен превышать 2-3 часа.
Микроскопическое исследование исходного материала. Готовят мазки, окрашивают по Граму, при подозрении на наличие капсулообразующих стрептококков препараты окрашивают на капсулы по Романовскому-Гимза, Ольту и др. Мазки из молока можно окрашивать по Граму, используя методы, нивелирующие присутствие жира и белка.
Клетки S. рneumoniае в окрашенных препаратах овальные или сферические, размером 0,5-1,25 мкм, обычно парные, причем соприкасающиеся стороны клеток уплощены, а наружные вытянуты и заострены (ланцетовидный диплококк). Также клетки могут располагаться одиночно, короткими цепочками, окружены капсулой.
Клетки S. equi сферической или овальной формы, размером
0,6-1,0 мкм, располагаются одиночно, парами, короткими цепочками, в мазках из гноя в виде длинных цепочек, имеют капсулу.
Клетки S. agalactiae (S. dysagalactiae) сферические, размером 0,6-
1,2 мкм, чаще располагаются в виде коротких или средней длины цепочек.
Клетки S. руoqenes сферические, размером 0,5-1,0 мкм, в виде коротких или длинных цепочек (в бульоне длинные цепочки). Энтерококки имеют овальную форму, размер 0,6-2,0х0,6-2,5 мкм, располагаются парами или короткими цепочками.
Результаты микроскопического исследования, с учетом полиморфизма бактерий на фоне лекарственной терапии, имеют ориентировочное диагностическое значение.
Выделение и идентификация культур стрептококков
Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Исследуемый материал высевают на кровяной, глюкозо-кровяной агар (кровь барана или крупного рогатого скота), глюкозо-сывороточный МПБ (рН 7,4-7,8). Контаминированный материал засевают на селективные среды: агар с антибиотиками, азидом натрия; образцы молока целесообразно высевать на среду Эдварда для выявления гемолиза и гидролиза эскулина.
Для обнаружения энтерококков используют специальные селективные среды: молочно-полимиксиновая среда Калины, желчно-кровяной агар Беленького и др. Посевы инкубируют при 37-38° С в течение 24-
48 часов.
Характер роста стрептококков на питательных средах. На глюкозо-кровяном агаре стрептококки в основном растут в виде мелких, прозрачных или слегка мутноватых колоний с ровными краями, как правило окруженных зоной гемолиза. Различают α- и β-гемолитические стрептококки.
Гемолиз типа α-: неполный гемолиз, часто с зеленоватым оттенком за счет перехода гемоглобина в метгемоглобин, далее обычно находится узкая зона β -гемолиза.
β -гемолиз - полный гемолиз эритроцитов. Отсутствие разрушения эритроцитов и гемоглобина обозначают как γ-гемолиз. Гемолитическая активность различных видов стрептококков представлена в табл. 7.
Таблица 7 Дифференциация стрептококков по типу гемолиза и
серогрупповой принадлежности
S. pneumoniae на глюкозо-кровяном агаре образует круглые диаметром 0,5-1,5 мкм, полупрозрачные, плоские, с приподнятым центром и краями колонии. Если культивирование проводится в аэробных условиях, обязателен α-гемолиз с зеленоватым оттенком, при анаэробной инкубации β-гемолиз. По внешнему виду колонии похожи на колонии других зеленящих стрептококков. Могут встречаться мукоидные колонии более крупные, с блестяшей поверхностью, слизистой консистенции. В сывороточно-глюкозном бульоне растет с равномерным помутнением среды, с образованием пылевидного осадка.
S. equi на кровяном агаре образует мелкие, слизистые, росинчатые колонии с зоной β-гемолиза, которые при дальнейшей инкубации становятся серо-белыми, непрозрачными. В жидкой питательной среде растет с ее помутнением.
S. aqalactiae на кровяном МПА образует мелкие, сероватые, просвечиваюшиеся колонии с зоной β- или двойной α-гемолиза, часть штаммов не выделяет гемолизин. Для выявления скрытой гемолитической активности применяют САМР-тест. В сывороточно-глюкозном МПБ при росте возбудителя среда остается прозрачной, а формирующие крупинки оседают на дно пробирки. S. dysagalactiae на кровяном агаре образует широкую зону α-гемолиза.
S. pyogenes на кровяном агаре формирует β-гемолитические колонии трех типов: крупные, блестящие, вязкие, в виде капли воды характерны для свежевыделенных капсулообразующих штаммов; серые, матовые, зернистые, с неровным краем характерны для вирулентных штаммов, имеющих М-протеин; мелкие (0,1-0,3 мм), выпуклые, прозрачные обычны для авирулентпых лабораторных штаммов. На сывороточно-глюкозном бульоне растет с просветлением среды и выпадением зернистого
осадка.
S. uberis на кровяном агаре формирует колонии с зоной β-гемолиза или не дает гемолиз, на оптимальной жидкой питательной среде растет с ее равномерным помутнением.
S. equi subsp. zooepidemicus на кровяном агаре образует мелкие колонии с зоной β-гемолиза, неотличимые от колоний S. pyogenes. При посеве материала на среду Эдварда можно установить тип гемолиза стрептококка и способность гидролизовать эскулин. S. agalactiae и S. dysagalactiae не гидролизуют эскулин, поэтому формируют бесцветные колонии. Колонии гидролизующих эскулин стрептококков (S. porcinus, S. bovis,
Е. faecalis, Е. avium и др.) имеют темный цвет.
Использование специальных дифференциально-диагностических сред для выделения энтерококков позволяет подавить рост сопутствующей микрофлоры и ориентироваться при отборе необходимых колоний. На молочном МПА с полимиксином колонии энтерококков округлой формы, с ровными краями, блестящей поверхностью, диаметром 1,5-2 мм, с красноватым оттенком и зоной протеолиза на светло-голубом фоне.
На желчно-цитратном агаре энтерококки образуют колонии розово-красного цвета.
На теллуритовой среде Е. faecalis растет с образованием колоний черного цвета, Е. faecium на данной среде не растет.
Для определения скрытой гемолитической способности стрептококков ставят САМР-тест, который обычно используют для идентификации стрептококков серологической группы В (S. aqalactiae). На кровяной агар бактериологической петлей по диаметру чашки Петри в виде полоски засевают культуру гемолитического штамма S. aureus, дающего широкую зону неполного гемолиза. Отступив иа 1-1,5 мм, перпендикулярно к штриху стафилококка высевают культуры испытуемых стрептококков в виде горизонтальных полосок (3-4 штамма). САМР-позитивные штаммы выделяют диффундирующие метаболиты, которые полностью лизируют клетки эритроцитов в зоне штриха стрептококка, прилегающей к культуре стафилококка, что оценивают как положительный результат. САМР-тест специфичен не только для S. agalactiae этот феномен и может быть обнаружен у стрептококков серогруип и, Е, Р, К, V, G, F.
Идентификация стрептококков и энтерококков на уровне родов
При обнаружении в посевах колоний, сходных с колониями стрептококков, исследуют морфологию и тинкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по Граму. С целью дифференциации от морфологически сходных микрококков и стафилококков проверяют каталазную и оксидазную активность бактерий из подозрительных колоний. Для дальнейшей работы отбирают колонии каталазо- и оксидазоотрицательиых культур, отвивают их на оптимальные питательные среды (глюкозо-сывороточный МПБ, кровяной МПА) и подвергают изучению.
С целью дифференциации видов рода Streptococcus и Enterococcus испытуемые культуры засевают в глюкозо-сывороточный бульон с 40% желчи крупного рогатого скота, 6,5% натрия хлорида, с рН 9,6, а также на бульон обычного состава. Параллельно производят посев на среду Эдварда для выявления гидролиза эскулина. Посевы культивируют при 37-
38° С в течение 24 часов, посевы на обычном бульоне выращивают при 45° С. Считается, что для энтерококков и стрептококков серологической группы D характерны рост при 45° С, устойчивость к 40% желчи и гидролиз эскулина, но есть некоторые исключения.
На среде с рН 9,6 растут все энтерококки, из стрептококков только многие штаммы S. bovis (D).
При 45° С растут все виды энтерококков, не размножаются гноеродные стрептококки, но могут расти стрептококки группы D.
Среда с 40% желчи. Кроме энтерококков на ней могут расти S. bovis, S. porcinus, S. suis, a также S. agalactiae и S. equinus (до 90% штаммов) и многие стрептококки ротовой полости.
Среда с 6,5% натрия хлорида. Растут энтерококки. Могут расти до 90% штаммов S. agalactiae, S. porcinus, из стрептококков ротовой полости S. cricetum, S. sorbinus, среди группы «Другие стрептококки»
S. alactolyticus.
Принимая во внимание указанные исключения, характер роста на питательных средах и происхождение исследуемого материала, можно с достаточной уверенностью по совокупности признаков отнести вьщеленные культуры к стрептококкам или энтерококкам.
Идентификация стрептококков и энтерококков на уровне видов
и серологических групп. После дифференциации стрептококков от стафилококков и микрококков и разделения на группы стрептококки, энтерококки (плюс стрептококки серологической группы D) приступают к их видовой и серогрупповой идентификации.
Видовую идентификацию стрептококков и энтерококков проводят путем изучения ферментативных характеристик (гидролиз эскулина, гиппрата, расщегшение инулина, маннита, раффинозы, салицина, сорбита, лак тозы, трегалозы, реакция ФогесПроскауера), особенностей гемолитической активности (α-, β-гемолиз, САМР-тест), способности к росту на средах с 6,5%о натрия хлорида. При этом может быть использован набор тестов, позволяющий дифференцировать основные патогенные виды стрептококков и энтерококков, вьщеляемых от животных (табл. 8). Либо с учетом видового происхождения материала используют меньшее количество признаков, что дает возможность идентифицировать основные виды стрептококков, выделяемые от данного вида животных.
Вид стрептококка |
Серологическая группа |
Признаки |
|||||||||
Образование кислоты |
Гидролиз |
Рост в средах с 6,5% NaCl |
|||||||||
инулин |
лактоза |
маннит |
раффиноза |
салицин |
сорбит |
трегалоза |
эскулин |
гиппурата |
|||
S. pyogenes |
А |
- |
+ |
V |
- |
+ |
- |
+ |
- |
- |
- |
S. agalactiae |
В |
- |
+ |
- |
- |
(+) |
- |
+ |
- |
+ |
- |
S. dysagalactiae |
С |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
S. dysagalactiae subsp. equisiniillis |
С |
- |
V |
- |
- |
(+) |
- |
+ |
- |
- |
- |
S. equi subsp. equi |
С |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
S. equi subsp.zooepidcmicus |
С |
- |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
S. pneumoniae |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
V |
- |
+ |
(+) |
- |
- |
S. suis mun 1 |
D(R) |
(+) |
+ |
- |
(+) |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
S. suis mun 2 |
D(S) |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
- |
+ |
- |
- |
- |
S. ubеris |
- |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
(+) |
S. bovis |
D |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
V |
+ |
- |
- |
S. quinus |
D |
+ |
- |
V |
+ |
(+) |
- |
V |
+ |
- |
- |
S. porcinus |
E (P, U, V) |
- |
(+) |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
S. canis |
G |
- |
(+) |
- |
- |
+ |
- |
(+) |
V |
- |
- |
E. faecalis |
D |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
V |
+ |
E. avium |
Q |
- |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
V |
(+) |
Таблица 8 - Свойства стрептококков и энтерококков, выделяемых от
животных
В таблицах 8, 9, 10 представлены критерии дифференциации основных видов патогенных стрептококков, вьщеляемых от лошадей, крупного рогатого скота, свиней.
Таблица 9 - Дифференциация основных видов стрептококков,
выделяемых от крупного рогатого скота
Вид стрептококка |
Признаки |
||||||
Тип гемолиза |
CAMP- тecт |
Гидролиз |
Образование кислоты из |
Серологическая группа по Лансфилд |
|||
эскулина |
гиппурата |
сорбита |
маннита |
||||
S. agalactiae S. dysagalacdae |
β α |
+ - |
- - |
+ - |
- - |
- - |
В С |
S. pneumoniae S. equi subsp. zooepidemicus |
α β |
- - |
(+) - |
- - |
- + |
- - |
- С |
Таблица 10 - Дифференциация основных видов стрептококков,
выделяемых от свиней
Вид стрептококка |
Признаки |
|||||
Тип гемолиза |
Образование кислоты из |
Серологическая группа по Лансфилд |
||||
иннулина |
маннита |
сорбита |
салицина |
|||
S. porcinus |
β (+) |
- |
+ |
+ |
+ |
Е, Р,U, V |
S. suis |
β (a) |
+ |
- |
- |
+ |
D, R, S |
S. pneumoniae |
α |
d |
(-) |
- |
- |
Нет |
S. equi subsp. zooepidemicus |
β |
- |
- |
+ |
+ |
С |
Таблица 11 - Дифференциация стрептококков, выделяемых
от лошадей
Вид стрептококка |
Признаки |
||||
Тип гемолиза |
Образование кислоты из |
Серологическая группа по Лансфилд |
|||
лактозы |
сорбита |
трегалозы |
|||
S. equi subsp. equi |
β |
- |
- |
- |
С |
S. equi subsp equisimillis |
β |
- |
+ |
С |
|
S. equi subsp. zooepidemicus |
β |
- |
+ |
- |
С |
Таблица 12 - Дифференциация энтерококков
Признак |
Е.avium |
E.casseliflavus |
E. cecorum |
E. dispur |
E. durans |
E. faecalis |
E. faecium |
E. gallinarum |
E. hirae |
|
Рост при 45° С |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Рост в присутствии 6,5% NaCl |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Тип гемолизина |
α |
н.д |
α |
н.д. |
α. β |
(β) |
(α) |
α, β |
- |
|
Образование H2S |
+ |
- |
н.д |
+ |
- |
н.д |
н.д |
- |
н.д |
|
Гидролиз гиппурата |
d |
- |
- |
d |
d |
(+) |
+ |
+ |
- |
|
Образование кислоты из |
Рамнозы |
+ |
(+) |
- |
н.д |
- |
d |
- |
- |
- |
Сахарозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
d |
+ |
+ |
|
Рафинозы |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
+ |
d |
|
Сорбита |
+ |
- |
- |
- |
- |
(+) |
- |
- |
- |
|
Маннита |
+ |
+ |
- |
- |
(-) |
+ |
(+) |
+ |
- |
При идентификации S. pneumoniae, помимо критериев, изложенных в таблице 8, определяют чувствительность к лизису клеток стрептококка желчью (желчными кислотами) и чувствительность к оптохину.
Для проверки на желчеустойчивость 2-3 мл исследуемой культуры, выращенной на сывороточном бульоне, засевают в 5 мл 10%-ного желчного бульона. Среда становится мутной и ее помещают на час в термостат.
Клетки S. pneumoniae растворяются, среда становится прозрачной, зеленящие стрептококки, сходные по типу колоний и гемолиза, не растворяются в желчи. При получении нечетких результатов пробирки оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов и затем производят окончательный учет. Можно просто положить крупинку сухой желчи на исследуемую колонию. Колонии S. pneumoniae растворяются и исчезают. При наличии натрия таурохолата смешивают равные объемы 10%-ного раствора соли и бульонной культуры, клетки пневмококков растворяются, и смесь становится прозрачной через 10-15 минут.
Чувствителыюсть S. pneumoniae к оптохину (этилгидрокупреин НС1) используют для дифферегщиации от других зеленящих стрептококков. Для этого применяют коммерческие бумажные диски с оптохипом. Испытуемую культуру засевают на кровяной агар, помещают на поверхность среды диски с оптохипом и культивируют 24 часа при 37° С. Как положительный результат расценивают задержку роста от 14 мм и более (при диске 6 мм), что характерно для S. pneumoniae. При отсутствии таких дисков может быть использован следующий метод: исследуемую культуру засевают на глюкозо-кровяной агар с оптохином (1:50 000), инкубируют при 37-38° С в течение 20-24 часов. S. pneumoniae на этой среде не растет.
Для видовой дифференциации энтерококков используют тесты, представленные в таблице 12, а также тест-систему ЕН-coccus test.
Серологическая идентификация стрептококков и энтерококков. В клеточной стенке многих стрептококков присутствует термостабильный полисахаридный антиген «С». В соответствии с его антигенными вариантами по системе Лансфилд стрептококки в РП подразделяют на серологические группы, которые обозначают заглавными буквами латинского алфавита.
Известно более 20 серологических групп стрептококков. Серологическая принадлежность патогенных для животных стрептококков представлена в таблице 6. Некоторые виды стрептококков (S. pneumoniae и др.) не содержат С-полисахарид и не могут быть классифицированы по системе Лансфилд. Иммунные серогрупповые стрептококковые сыворотки производит и высылает по заявкам ВГНКИ ветпрепаратов. За рубежом для этих целей имеются коммерческие препараты, позволяющие устанавливать серогруп-повую принадлежность в пределах серогрупп А, В, С, D, F и G в тесте латекс-агглютинации или серогрупп А, В, С, F и G в реакции коагглютинации на стекле, ИФА, а также выявлять антигены непосредственно в материале.
Определение серогрупповой принадлежности испьггуемой культуры стрептококка в реакции преципитации проводят следующим образом. Стрептококки выращивают в бульоне Хоттингера с 1% глюкозы при 37° С в течение 20 часов. В стеклянные центрифужные пробирки переносят
9 мл выращенной культуры, центрифугируют при 4000 об/мин. 25 минут. Над осадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 0,3-0,4 мм 0,2 N НС1, суспендируют и вьщерживают смесь в кипящей водяной бане
10 минут.
Затем пробирки охлаждают водой, добавляют в каждую пробирку каплю 0,04%-ного спиртового раствора фенолфталеина и затем по каплям добавляют 0,2 N раствор NaOH до приобретения раствором бледно-розовой окраски (кислота нейтрализована). Далее смесь вновь центрифугируют (4000 об/мин., 25 минут), над осадочную жидкость используют как растворимый антиген в РП.
Техника постановки реакции преципитации. Берут от пастеровских пипеток капилляры диаметром 0,5-1,0 мм, опускают капилляр концом в флакон с сывороткой и набирают в него сыворотку на длину капилляра 1-1,5 см. Удаляют избыток сыворотки с кончика капилляра, погружают его в пробирку с антигеном и набирают равное количество антигена. Капилляр переворачивают таким образом, чтобы смесь оказалась в середине капилляра, и закрепляют его вертикально в куске пластилина. Через 5 минут учитывают результат. Положительная реакция: образование хлопьев или резкое помутнение в середине столбика.
Биопроба. Используют для определепия патогенных свойств культур стрептококков, а также для их выделения из контаминированного материала.
Определение патогенности стрептококков проводят на трех белых мышах массой 14-16 г. Для заражения используют только свежевьщеленные 18-20-часовые культуры стрептококков, выращенные на глюкозо-сывороточном бульоне. Культуру в объеме 0,5 мл вводят внутрибрюшиино. Наблюдение ведут в течение 5 суток, при заражении патогенной культурой мьшш погибают в течение 1-2 суток. Из органов павших животных готовят мазки, окрашивают по Граму, на капсулы, микроскопируют. Параллельно производят посевы па глюкозо-кровяной агар и глюкозо-сывороточный бульон.
В соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике стрептококкозов» при диагностике мыта (S. equisubsp. equi) рекомендуется исследуемым материалом (гной, истечение из носовой полости, суспензия из лимфатических узлов и органов) заражать подкожно в область спины двух белых мышей массой 12-15 граммов в дозе 0,1 мл (гной) или 0,5 мл (суспензия тканей). Для выяснения патогенных свойств выделенную бульонную культуру вводят аналогичным способом в объеме 0,1 мл. Наблюдение за животными ведут в течение 10 дней, гибель в положительных случаях наблюдают на 2-7 сутки. Органы и ткани от погибших животных подвергают микроскопическому исследованию и делают высевы на питательные среды. Как положительный результат оценивают гибель хотя бы одной мышки. Для ускоренного выделения
S. pneumoniae из контаминированного материала можно заражать двух белых мышей исходным материалом 0,5 мл взвеси в бульоне. Далее через 6-8 часов из брюшной полости берут стерильным шприцом 1-2 капли жидкости и делают дробный высев на глюкозо-кровяной агар в чашках либо животное убивают в эти же сроки. Посев делают из крови сердца. Из селезенки готовят и микроскопируют мазки-отпечатки.
Идентификация стрептококков и энтерококков на базе планшетных фотометров фирмы «TERMO-Labsystems», «iEMS-Reader» и «Multican-Ascent»
Для идентификации каталазоотрицательных грамположительных кокков фирма «ПЛИВА-Лахема» выпускает две тест-системы: СТРЕПТОтест 16 - для идентификации стрептококков и ЭН-КОККУСтест - для идентификации энтерококков. Для дифференциации этих микроорганизмов используют ПИРАтест - положительный практически у всех клинически значимых энтерококков (из стрептококков этот тест положителен только у S. руоgепеs).
Идентификация стрептококков с использованием
СТРЕПТОтеста 16
СТРЕПТОтест 16 предназначен для определения биохимической активности и идентификации стрептококков по 16 планшетным биохимическим тестам, расположенным в двухрядном вертикальном стрипе: гиппурат, фосфатаза, лейцинаминопептидаза, бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, эскулин, аргинин, уреаза, маннитол, сорбитол, трегалоза, лактоза, раффиноза, инулин, мелибиоза и рибоза. Идентификацию дополняют тестами на диагностических полосках: ПИРАтест для выявления пирролидонилариламидазы и ВПтест для выявления образования ацетоина. Набор содержит 10 пластин и позволяет провести идентификацию 60 культур.
Методика проведения исследования
Пластинки СТРЕПТОтест 16 (один двухрядный стрип на одну культуру), рамка пластинки с крышкой, суспензионная среда для СТРЕПТОтест 16, физиологический раствор, парафиновое масло, реактивы для тестов гиппурат, фосфатаза, диагностические полоски ПИРАтест и ВПтест (ацетоны), реактивы к тестам ПИР и ацетоин, стандарт мутности третьей степени по шкале МсFarland.
Выделение чистой культуры и приготовление бактериальной суспензии. Выделяют чистую культуру на кровяном агаре (с кровью барана). Инкубацию чашек производят в атмосфере с содержанием 5% СО2. Учитывают морфологию культуры, проверяют каталазную активность на предметном стекле с 3% перекисью водорода, гемолитическую активность на кровяном агаре, ставят ПИРАтест. Из чистой 24-часовой культуры стрептококков готовят в физиологическом растворе бактериальную суспензию мутностью, соответствующей указанной выше. Для приготовления суспензии удобно использовать ватные тампоны для снятия колоний с питательной среды.
Инокуляция и инкубация
Подготовленную суспензию после тщательного встряхивания инокулируют по 0,1 мл во все 8 лунок первого ряда стрипа (лунки Н-А, тесты с НIР по URЕ). В ампулу с 1 мл суспензионной среды добавляют 1 мл исходной суспензии, встряхивают и инокулируют разведенную суспензию в 8 лунок второго ряда стрипа (лунки Н-А, тесты с МАN по RIВ). После инокуляции в лунки В и А первого ряда (тесты АRG и URЕ) добавляют по две капли парафинового масла. В пробирку с исходной суспензией (объем 1 мл) помещают полоску с ВПтестом. Пластинку СТРЕПТОтест 16 и пробирку с ВПтестом инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 и 2 часов соответственно.
Учет результатов и идентификация
После 2 часов инкубации в пробирку с ВПтестом добавляют по три капли реактивов ВПТ1 и ВПТ2, пробирку встряхивают и дополнительно инкубируют при 37 °С в течение 30-40 минут, после чего учитывают результат ВПреакции.
После 24 часов инкубации добавляют реактивы в следующие лунки пластинки: ряд 1-й, лунка Н (тест гиппурат) - две капли реактива на гиппурат; лунка G (тест фосфатаза) - одну каплю реактива на фосфатазу. Инкубируют пластинку 5-10 минут при комнатной температуре для лучшего проявления цветовых реакций и учитывают результаты всех тестов. Тест HIР учитывают не позднее 10 минут после добавления реактива, так как по истечении этого времени могут проявиться ложноположительные реакции. Чтение тестов LАР, GLR и GАL проводят на белом фоне.
При оценке СТРЕПТОтеста 16 ориентируются по таблице «Интерпретация реакций», цветной шкале сравнения и/или цветным реакциям контрольных штаммов.
Таблица 13 - Интерпретация реакций
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
Ряд 1-й |
||||
Н |
Гиппурат |
НIР |
Синяя |
Бесцветная, голубоватая |
G |
Фосфатаза |
РНS |
Красно-фиолетовая |
Бесцветная, розоватая |
F |
Лейцинамино-пептидаза |
LАР |
Желтая |
Бесцветный |
Е |
Бета-глюкуронидаза |
GLR |
Желтая |
Бесцветная |
D |
Альфа-галактозидаза |
аGА |
Желтая |
Бесцветная |
С |
Эскулин |
ЕSL |
Черная, темно-коричневая |
Бесцветная, светло-коричневая |
В |
Аргинин |
АRG |
Красно-фиолетовая, красная |
Желтая, светло-оранжевая |
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
А |
Уреаза |
URЕ |
Красная, красно-оранжевая |
Желтая, светло-оранжевая |
Ряд 2-й |
||||
Н |
Маннитол |
МАN |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
С |
Сорбитол |
SОR |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
Р |
Трегалоза |
ТRЕ |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
Е |
Лактоза |
LАС |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
V |
Раффиноза |
RАF |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
С |
Инулин |
INU |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
В |
Мелибиоза |
MLB |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
А |
Рибоза |
RIВ |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
Идентификацию проводят с помощью идентификационной таблицы или книги кодов для СТРЕПТОтеста 16.
При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (микроскопию, характер колоний, наличие пигмента, гемолиз, источник выделения и т. д.).
Идентификация энтерококков с использованием
ЭН-КОККУСтеста
Идентификацию энтерококков производят с использованием микротест-системы ЭН-КОККУСтест, позволяющей идентифицировать клинически значимые виды рода энтерококков при помощи восьми биохимических тестов: аргинин, сорбоза, арабиноза, маннитол, сорбитол, мелибиоза, раффиноза и мелецитоза, размещенных в однорядном восьмилуночном стрипе. Для выявления типичного для рода энтерококков теста - активности пирролидонилариламидазы - предназначен ПИРАтест, поставляемый в форме диагностической полоски.
Методика проведения исследования
Пластинка ЭН-КОККУСтест, рамка пластинки с крышкой, физиологический раствор, парафиновое масло, диагностические полоски и реактив для теста ПИР, стандарт мутности второй степени по шкале МсFarland.
Выделение культуры и приготовление бактериальной
суспензии. Для идентификации используют чистую культуру, выращенную на кровяном агаре с кровью барана. Для первичной изоляции энтерококков из смешанных культур используют селективные среды. Учитывают морфологию, ставят ПИРАтест для подтверждения принадлежности испытуемого изолята к роду энтерококков. Из чистой 24-часовой культуры энтерококков готовят в физиологическом растворе бактериальную суспензию плотностью, соответствующей указанному выше стандарту мутности.
Инокуляция и инкубация
После тщательного встряхивания подготовленную суспензию инокулируют по 0,1 мл во все лунки стрипа, помещенного в рамку пластинки. После инокуляции в лунку Н (тест аргинин) добавляют две капли парафинового масла. Рамку с инокулированными стрипами инкубируют в течение 24 часов при температуре 37 °С.
Учет результатов и идентификация
По окончании инкубации учитывают результаты всех тестов, используя при этом таблицу «Интерпретация реакций», цветную шкалу сравнения и/или цветные реакции контрольных штаммов.
Таблица 14 - Интерпретация реакций
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
Н |
Аргинин |
АRG |
Красно-фиолетовая, красная |
Желтая, светло-оранжевая |
G |
Сорбоза |
SОЕ |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
F |
Арабиноза |
АRА |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
Е |
Маннитол |
МАN |
Желтая, светло-оранжевый |
Красная, оранжево-красная |
D |
Сорбитол |
SOR |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
С |
Мелибиоза |
МLВ |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
В |
Раффиноза |
RАF |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
А |
Мелецитоза |
МLZ |
Желтая, светло-оранжевая |
Красная, оранжево-красная |
Идентификацию проводят с помощью идентификационной таблицы или индекса, находящихся в инструкции к тест-системе. При окончательной идентификации учитывают всю дополнительную информацию (источник выделения, характер колоний, наличие пигмента, подвижность и т. д.).
Питательные среды
Глюкозо-сывороточный бульон. К свежему стерильному МПБ (рН 7,4-7,6) добавляют 10% стерильной инактивированной при 56° С в течение 30 минут сыворотки крови лошади.
Глюкозо-кровяной агар. К расплавленному МПА с температурой 42-45°С добавляют до 1 %-ный стерильный раствор глюкозы и 5-10% дефибринированной крови барана или кролика. Среду разливают в чашки Петри.
Желчный бульон. К МПБ добавляют необходимое количество нативной желчи крупного рогатого скота (10-40%), устанавливают необходимый рН (7,4-7,6), разливают по пробиркам и стерилизуют при 113-115° С в течение 20-30 минут.
Среда Эдварда. В 1000 мл дистилированной воды растворяют 10 г пептона, 10 г сухого мясного экстракта, 1 г эскулина, 5 г натрия хлорида, 0,0013 г кристалвиолета, 0,33 г талия сульфата, 15 г агар-агара; устанавливают рН 7,4; стерилизуют при 115°С 20 минут. К охлажденному до 45°С агару добавляют 5% стерильной крови барана, перемешивают и разливают среду в чашки Петри.
Энтерококковая дифференциально-диагностическая среда. К 1000 мл расплавленного МПА (45-50°С) добавляют 0,1 ТТХ (2,3,5-трифенилтетрозолий хлорид), 12,5 мл 0,01%-ного водного раствора кристалвиолета, 0,1 г налидиксовой кислоты, 20% обезжиренного молока, 1% глюкозы, 5% стерильной дефибринированной крови. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри. ТТХ и палидиксовую кислоту предварительно растворяют в небольшом количестве МПБ.
Желтю-цитратная среда для энтерококков. К 100 мл МПА добавляют 20 мл дрожжевого автолизата, 100 мл желчи, 40 г цитрата натрия. Смесь кипятят на водяной бане, добавляют 0,1 г трифенилтетразалия хлористого и 200 ЕД/мл нолимиксина М. Колонии энтерококков на этой среде розово-красного цвета.
Желчно-кровяной агар Беленького для энтерококков. К 600 мл 3%-ного расплавленного МПА добавляют 400 мл нативной профильтрованной желчи. Стерилизуют при 115° С 30 минут. К охлажденному до 45° С агару добавляют 5% дефибринировашюй крови и разливают по чашкам Петри. На среде растут энтерококки, но не растут гноеродные и оральные стрептококки.
Молочная среда с полимиксином по Калине (для энтерококков). К 85 мл расплавленного МПА (45°С) добавляют 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристалвиолета, 0,5 мл 10%-ного водного раствора 2, 3, 5-ТТХ, 15 мл стерильного обезжиренного молока, 20-40 ЕД/мл нолимиксина М. Среда, разлитая в чашки Петри, пригодна для использования в течение 7-10 дней при условии хранения в холодильнике (4° С). Колонии энтерококков имеют красноватую окраску с зоной протеолиза.
Щелочно-полимиксиновая среда Калины (для энтеркокков). Готовят отдельно три раствора. Раствор 1: 23 мл МПБ, 1 г глюкозы, 0,5 г натрия хлорида, 2 г дрожжевого экстракта. Раствор 2: 25 мл дистиллированной воды, 0,53 г Na2CO3. Раствор3: 25 мл дистиллированной воды, 0,25 г двухосновного фосфата калия.
Смеси стерилизуют раздельно при 112°С 12 минут, затем смешивают, устанавливают рН 10-10,2, добавляют воды до 100 мл, 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего, 200 ЕД/мл полимиксина М.
Кровяной агар с азидом натрия. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 10 г триптозы, 3 г сухого мясного экстракта, 5 г натрия хлорида, 0,2 г азида натрия, 12 г агара; устанавливают рН 7,2, автоклави-руют при 121° С 15 минут. К расплавленному агару (45°) добавляют 5% стерильной крови овцы, перемешивают и разливают в чашки Петри. Азид натрия подавляет рост многих грамотрицательных бактерий.
Селективная среда с антибиотиками для стрептококков. В расплавленную и охлажденную агаровую среду добавляют 7% дефибринироваиной крови барана и антибиотики (на 1000 мл среды): налидиксовой кислоты - 7,5 мг, полимиксина В - 17 000 ЕД, неомицина сульфата - 2,12 мг. Каждый антибиотик предварительно растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды. Готовую среду используют в течение 48 часов при хранении в холодильнике. На среде ингибируется рост стафилококков, синегнойной палочки, энтеробактерий, предотвращается роение протея.
Если после засева материала на поверхность среды положить полоски фильтровальной бумажки (диски), пропитанные бацитрацином (10 ЕД), то можно дифференцировать стрептококки серогруппы А (чувствительные к бацитрацину) от
β-гемолитических стрептококков других групп, устойчивых к бацитрацину.
Агар с ацетатом таллия для энтерококков. Ацетат таллия - 1 г, пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 10 г, глюкоза - 10 г, агар - 13 г, дистиллированная вода - 1000 мл, рН 6. Стерилизуют 15 минут при 118° С, охлаждают и добавляют 10 мл 1%-ного стерилизованного фильтрованием солянокислого трифенилтетразолия.
Лабораторная диагностика энтеробактерий
Представители семейства Enterobacteriaceae являются грамотрицательными, аэробными или факультативно анаэробными палочками. Подвижные за счет перетрихиальных жгутиков, реже неподвижные. Большинство видов хорошо растет при 37° С, однако некоторые виды лучше растут при 25-30° С. D-глюкозу и другие углеводы ферментируют с образованием кислоты, а многие виды, кроме того, и газа. Оксидазоотрицательные, каталазоположительные, редуцируют нитраты в нитриты. Распространены повсеместно. Встречаются на растениях, у животных (от червей и насекомых до млекопитающих) и человека. Присутствуют в почве, воде и даже в воздухе. Они существуют как симбионты, сапрофиты или паразиты. По патогенности для человека, животных и растений весьма разнообразны. Отдельные роды (напр., Erwinia и др.) известны как фитопатогены, причиняющие урон злакам и картофелю, другие (напр., Serratia) распространены в воде, являются фитопатогенами, обитают у насекомых, способны вызывать спорадические инфекции холоднокровных, домашних, диких животных и человека. Многие роды имеют медицинское значение, вызывая желудочно-кишечные болезни, являясь причиной оппортунистических инфекций.
В ветеринарии на первое место выступают роды Escherichia,
Salmonella и Yersinia. Кроме того, определенное значение имеют роды Klebsiella, Morganella, Proteus. Эти микроорганизмы вызывают желудочно-кишечные болезни и могут быть возбудителями различных внекишечных инфекций, таких, как бактериемия, менингит, инфекции мочевыводящих путей, дыхательных путей, раневые инфекции и др.
Лабораторная диагностика включает: отбор материала для исследований и транспортировку проб; выявление методом световой микроскопии, выделение чистой культуры возбудителя посевом на питательные среды, идентификацию энтеробактерий по морфологическим, тинкториальным, культуральным серологическим и патогеннымсвойствам; дифференциацию родов энтеробактерий.
Для прижизненной диагностики используют фекалии, кровь, мочу, молоко. Посмертно в лабораторию направляют трупы мелких животных и птиц целиком, трубчатую кость, долю печени с желчным пузырем, селезенку, почку, брыжеечные лимфоузлы, отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой (упаковывается отдельно от остального материала), легкие. При абортах с подозрением сальмонеллезной их этиологии (отмечают у конематок и овцематок) для бактериологической диагностики направляют абортированный плод или плодовые оболочки, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей, желудок плода, его паренхиматозные органы.
Сбор фекалий осуществляют в стерильную посуду сразу после дефекации. Можно собирать материал непосредственно из прямой кишки с помощью ректальных ватных или ватномарлевых тампонов, укрепленных на деревянной палочке или проволочной петле. Посев фекалий желательно осуществлять непосредственно после их сбора или в пределах 2-3 часов после сбора. Если это невозможно, материал консервируют хранением при температуре 2-6° С или глицериновой смесью.
Лучшие результаты для получения гемокультуры дает посев крови, взятой в самом начале болезни, однако при отрицательных результатах целесообразен повторный посев крови в течение всего периода лихорадки. В отдельных случаях для посева на гемокультуру можно использовать сгустки крови, направляемой для серологических исследований.
Другой материал отбирают общепринятыми способами. Во всех случаях его берут от животных, не подвергавшихся в последние 10 дней лечению антибактериальными препаратами.
Выделение и первичная идентификация культур энтеробактерий
При наличии паренхиматозных органов или целых трупов (плодов) из исходного материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Энтеробактерий представляют собой грамотрицательные, прямые палочки длинной 1,0-3,0 мкм и диаметром 0,3-0,6 мкм. Располагаются одиночно, реже попарно. Для некоторых характерно наличие капсулы или микрокапсулы. Спор не образуют.
При наличии иного материала исследования начинают с посева на питательные среды. Рекомендуемые плотные и жидкие питательные среды для выделения энтеробактерий в зависимости от исследуемого материала и предполагаемого возбудителя приведены в таблице 15.
Для посева проб материалов, обычно содержащих разнообразную микрофлору (фекалии, околоплодная жидкость и др.), наиболее целесообразно применять высокоселективные среды (висмут-сульфит агар, агар Плоскирева). Для проб, обычно не содержащих или содержащих незначительное количество микроорганизмов (кровь, паренхиматозные органы и др.), слабоселективные дифференциальные среды (агары Левина, Эндо). Однако, учитывая возможность выделения из фекалий и другого материала в качестве возбудителей не только патогенных, но и условно-патогенных энтеробактерий, которые могут сильно подавляться на высокоселективных средах, оптимальным является одновременное применение тех и других сред. При исследовании проб, в которых концентрация возбудителя, скорее всего, низка, целесообразно использовать среды накопления. Фекалии перед посевом на плотные среды суспендируют в стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10. При взятии материала ректальным тампоном его погружают в среду обогащения (накопления). Пробирки с посевами помещают в термостат, а по окончании инкубации (12-18 час) делают высевы на плотные селективные среды.
Цитратную кровь засевают в жидкие среды накопления в соотношении 1:10. Для посева сгустков крови после их асептического «обведения» и отсасывания сыворотки сгусток растирают в пробирке стеклянной палочкой и вносят в среду накопления в соотношении 1:10. После посева крови или сгустков крови и инкубации в термостате (12-18 час) ежедневно в течение
3 дней делают высев на плотные среды. При отрицательных результатах высевы повторяют еще на 6-е и 10-е сутки.
Мочу после центрифугирования или без него засевают в среды накопления двойной концентрации в соотношении 1:1.
Посев другого материала осуществляют общепринятыми в бактериологии методами. Посевы инкубируют при температуре 37° С на плотных питательных средах в течение 18-24 часов (48 часов на висмут-сульфит агаре), в средах обогащения максимальный срок инкубации посевов не должен превышать 18 часов (кроме крови). Посевы для выделения иерсиний инкубируют при 25-26° С. Чашки с посевами на эти микроорганизмы просматривают через 18-20 часов и повторно на вторые сутки термостатирования.
Характеристика колоний энтеробактерий на плотных селективно-дифференциальных средах представлена в таблице 13. Более подробная характеристика колоний энтеробактерий определенных родов изложена в соответствующих разделах.
Колонии, полученные на селективно-дифференциальных средах и характерные для энтеробактерий, отсевают на питательные среды для полу чения чистых культур, которые используют для родовой дифференциации энтеробактерий.
Таблица 15 - Питательные среды, рекомендуемые для первичного
выделения энтеробактерий
Исследуемый материал |
Энтеробактерии, которые могут содержаться в исследуемом материале |
Плотные (селективные) среды |
Жидкие (среды накопления) |
||||||||||||||
Плоскирева |
Висмут-сульфит агар |
Левина |
Эндо |
Мак-Копки |
Минка |
Магниевая |
Селенитовая |
Мюллера или Кауфмана |
Киллиана |
Рапопорт |
Глюкозный бульон |
Буферная (Юшенко) |
К-1 |
П-1 |
ЭТ-1 |
||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
Фекалии, отрезок тонкого кишечника |
Salmonella Escherichia Klebsiella Yersinia Proteus Serratia Morganella |
+ ++
+ ++ |
+ |
++++ ++ |
+ + + + + + |
+ + + + + + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
||
Кровь |
Salmonella Escherichia Klebsiella Yersinia |
++++ |
+ + + + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|||||||||
Моча |
Salmonella Escherichia Klebsiella Proteus Yersinia |
++++ |
+ |
+++ + |
+ + + + |
+ + + + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
||
Паренхиматозные органы, трупы, плоды |
Salmonella Escherichia Klebsiella Proteus Yersinia |
++++ |
+ |
++ + + |
+ + + + |
+ + + + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
||
Легкие |
Salmoella Escherichia |
+ + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
||||||
Молоко |
Salmonella Escherichia Klebsiella Serratia |
++++ |
+ |
++++ |
+ + + + |
++++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Таблица 16 Характеристика колоний энтеробактерий на
плотных дифференциальных средах
Среда |
Дифференцирующие компоненты |
Индикатор |
Цвет колоний в зависимости от |
|||
ферментации углеводов |
образование |
|||||
+ |
- |
+ |
- |
|||
Плоскирева |
Лактоза |
Нейтральный красный |
Розовый, красный |
Бесцветный |
||
Висмут-сульфат |
Глюкоза, сульфит висмута |
Сульфат железа |
Черный, зеленый |
Бесцветный |
||
Левина |
Лактоза |
Эозин, метиленовый синий |
Темно-синий, черный с металлическим блеском |
Бесцветный |
||
Эндо |
Лактоза |
Основной фуксин |
Красный с металлическим блеском |
Бесцветный |
||
Мак-конки |
Лактоза |
Нейтральный красный |
Розовый, красный |
Бесцветный |
Дифференциация некоторых родов энтеробактерий
При дифференциации родов энтеробактерий ключевое значение имеет изучение биохимических и физиологических свойств, являющихся генетически более стабильными (табл. 15). Кроме сред Гисса с соответствующими индикаторами и реактивами, для идентификации энтеробактерий могут быть использованы различные диагностические системы, позволяющие сократить и упростить исследования. Так, системы индикаторные бумажные (СИБ), представляющие собой диски или полоски хроматографической бумаги с необходимыми субстратами и индикаторами, а также диски из фотопленки с желатином, выпускаются в виде двух наборов (изготовитель предприятие по производству бактерийных препаратов Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии). Набор «А» (малый) предназначен для межродовой дифференциации энтеробактерий по 9 основным биохимическим свойствам: утилизации цитрата натрия, малоната натрия, ферментации лактозы, наличию (β-галактозидазы, фенилаланиндезаминазы, уреазы, лизиндекарбоксилазы, образование индола, сероводорода (табл. 16).
Системы мультимикротестов для идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, выпускаемые НПО «Алерген» (г. Ставрополь), включают два набора. Набор ММТ Е1 позволяет определить 12 ключевых ферментативных свойств энтеробактерий: образование сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, утилизацию цитрата натрия, малоната натрия, маннита, сахарозы, лактозы, сорбита. Набор ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми свойствами служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие аргининдегидролазы, бетта-галактозидазы, нитратредуктазы, утилизация инозита, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы.
После изучения биохимических и физиологических свойств культур заключительным этапом анализа является серологическая идентификация. Антигены и антигенная структура сальмонелл, эшерихий, отчасти протея и клебсиелл изучены достаточно глубоко. Менее известна антигенная структура иерсиний.
Из числа известных антигенов энтеробактерий значение для серологической идентификации имеют три: О-, К- и Н-антигены.
О-антиген (соматический) расположен в клеточной стенке бактерий. Он представляет собой липополисахаридо-протеиновый комплекс. Липид связан с токсигенностью, протеин обусловливает иммуногенность, полисахарид является компонентом, определяющим антигенную специфичность.
Таблица 17 - Основные дифференцирующие признаки некоторых
родов и видов семейства Enterobacteriaceae
Признаки |
Escherichia |
Salmonella |
Yersinia |
Klebsiella pneumonia |
Mor-ganella |
Proteus |
Serratia marces- cens |
Hafnia |
Образование индола |
+ |
- |
Р |
- |
+ |
P |
- |
- |
Проба с метиленовым красным |
+ |
+ |
+ |
X |
+ |
+ |
X |
X |
Реакция Фогес-Проскауера |
- |
- |
- |
+ |
- |
P |
+ |
X |
Цитрат |
- |
+ |
- |
+ |
- |
P |
+ |
- |
Образование H2S |
- |
+ |
- |
- |
- |
P |
- |
- |
Гидролиз мочевины |
- |
- |
Р |
+ |
+ |
+ |
X |
- |
Лизиндекарбоксилаза |
+ |
+ |
Р |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
Фенилаланиндезаминаза |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
Орнитиндекарбоксилаза |
X |
+ |
Р |
- |
+ |
P |
+ |
+ |
Подвижность |
+ |
+ |
+* |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
Образование кислоты из: |
||||||||
лактозы |
+ |
- |
Р |
+ |
- |
- |
- |
- |
маннита |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
Обозначения: «-» 010% штаммов положительные; «х» признак варьирует у различных штаммов; «+» штаммов положительные; «р» признак различен в разных видах рода; «+*» подвижны при температуре ниже 30° С.
О-антиген устойчив к физико-химическим воздействиям. Выдерживает нагревание при 120° С в течение 2-2,5 часов, сохраняя основные антигенные свойства. На него не оказывают действия спирт, 0,5%-ный раствор формалина, нормальный раствор хлористоводородной кислоты
(N HC1) и некоторые другие химические вещества.
Полноценный О-антиген характерен для S-форм (гладких) бактерий. Появление S => R мутаций затрудняет серологическую идентификацию энтеробактерий, а иногда делает ее невозможной.
К-антигены (оболочечные) являются кислыми полисахаридами. Расположены более поверхностно, чем О-антигены, вследствие чего иногда полностью их экранируют. Последнее может явиться причиной инагтлютинабельности живых К+ (плюс) бактерий в О-сыворотках (например, эшерихий).
К-антигены серологически обособлены и не дают перекрестных реакций. Они менее устойчивы к воздействиям различных факторов и являются неоднородными в этом отношении. В зависимости от свойств, устойчивос ти к химическим факторам и термоустойчивости К-антигены обозначают как А-, В-, L-, М- и Vi-антигены.
Н-антигены (жгутиковые) имеют белковую природу (флагеллин). Энтеробактерии являются перитрихами (жгутики расположены по всей поверхности клетки). В ряде случаев Н-антигены могут иметь фазовые вариации. Н-антигены термолабильны. Обработка 0,5-1%-ным раствором формалина не влияет на антигенные свойства Н-антигенов.
Характерные для каждого рода особенности О-, К- и Н-антигенов и антигенная структура бактерий представлены в соответствующих разделах. На основании данных об антигенной структуре энтеробактерий проводят их серологическую идентификацию.
Таблица 18 - Определение рода энтеробактерий по тестам СИБ
Тест или субстрат |
Роды энтеробактерий |
|||||||||
Escher ichia |
Edvard siela |
Citro-bacter |
Salmonella |
Schig-ella |
Klebsiella |
Entero-bacter |
Hafnia |
Serratia |
Proteus |
|
Лактоза |
+/х |
- |
+/- |
P |
P |
P |
+ |
- |
- |
- |
Р-галактозидаза |
+ |
- |
+ |
P |
P |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
Цитрат натрия |
- |
- |
+ |
+ |
- |
P |
+ |
+ |
+ |
P |
Малонат натрия |
- |
- |
P |
P |
- |
P |
+ |
P |
- |
- |
Мочевина |
- |
- |
+ |
- |
- |
P |
P |
- |
- |
P |
Фенил аланин |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
Лизин |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
P |
P |
+ |
+ |
P |
Н2S и подвижность |
- +/- |
+ + |
P + |
+ + |
- - |
- - |
- + |
- + |
- + |
P + |
Индол |
+ |
+ |
P |
+ |
P |
P |
- |
- |
- |
P |
Обозначения: «+» положительная реакция; «-» отрицательная реакция; «х» реакция с запозданием и не всегда положительная; «Р» реакция различна у разных видов рода; «р» реакция различна у разных штаммов или сероваров.
Идентификация микроорганизмов семейства Еnterobacteriасеае на
базе планшетных фотометров фирмы «TERMO-Labsystems»,
«iEMS-Reader» и «Multican-Ascent»
Идентификацию микроорганизмов семейства Еnterobacteriасеае производят с использованием микротест-систем:
• ММТ-Е1 и ММТ-Е2
• ЭНТЕРОтест 24
• ЭНТЕРОтест 16
• ЭНТЕРО-Рапид 24
• ЭНТЕРО-Скрин
и диагностических полосок:
• КОЛИтест
• САЛМтест
Применение систем мультимикротестов ММТ-Е1 и ММТ-Е2
Системы мультимикротестов ММТ-Е1 и ММТ-Е2 предназначены для определения биохимической активности и последующей идентификации наиболее распространенных представителей семейства энтеробактерий и дифференциации их от некоторых бактерий из семейства вибрионов в течение 18-24 часов. Они представляют собой целиковые 96-луночные планшеты. Каждый планшет предназначен для проведения идентификациии восьми культур.
ММТ-Е1 позволяет определить двенадцать ключевых тестов: образование сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фенил аланиндезаминазы, утилизация цитрата натрия, малоната натрия, маннитола, сахарозы, лактозы и сорбитола.
ММТ-Е2 позволяет определить двенадцать дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с перечисленными ключевыми тестами служат для видовой идентификации энтеробак-терий: наличие аргининдегидролазы, бета-галактозидазы, нитратре-дуктазы; утилизация инозитола, дульцитола, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонитола, раффинозы, салицина, глюкозы.
Методика проведения исследования
Дополнительно к планшетам ММТ-Е1 и Е2 необходимы стерильная дистиллированная вода, реактивы для тестов: фенилаланин, индол, нитраты, стерильное вазелиновое масло и отечественный стандарт мутности на 10 единиц.
Выделение культуры и приготовление бактериальной
суспензии. Используют чистую культуру грамотрицательных палочек со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глюкозы (О/F-тест) на среде Хью-Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциации энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположительных культур. Готовят суспензию в стерильной свежеприготовленной дистиллированной воде (при хранении рН воды снижается, что может повлиять на результаты биохимических реакций). Конечная мутность суспензии должна соответствовать указанному выше стандарту.
Инокуляция планшетов и их инкубация
Приготовленную суспензию инокулируют по 0,15 мл в каждую лунку соответствующих горизонтальных рядов планшетов. После инокуляции в лунки №1,3, 4, 5, 7 (тесты: сероводород, лизин, индол, орнитин, уреаза соответственно) планшета ММТ-Е1 и в лунку № 1 (аргинин) планшета ММТ-Е2 добавляют по две капли вазелинового масла. Планшеты инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 35-37 °С.
Учет результатов и идентификация
По окончании инкубации добавляют реактивы в следующие лунки: ММТ-Е1 - № 4 - две капли реактива на индол, № 10 - одну каплю реактива на фенилаланин; ММТ-Е2 - № 12 - реактивы на нитраты: одну каплю раствора соляной кислоты и затем одну каплю раствора риванола.
Учитывают результаты планшетных тестов визуально с помощью таблицы «Интерпретация реакций» и заносят их в бланки (учет результатов теста на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3-5 часов и через 18-24 часа, так как у некоторых штаммов желтое окрашивание к конечному сроку инкубации исчезает).
Таблица 19 - Интерпретация реакций
№ п/п |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
ММТ-Е1 |
||||
1 |
Образование сероводорода |
Н2S |
Черная, темно-серая |
Бесцветная, светло-серая |
2 |
Утилизация маннитола |
МАН |
Желтая, оранжевая |
Красная |
3 |
Наличие лизиндекарбоксилазы |
ЛИЗ |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, зеленая |
4 |
Образование индола |
ИНД |
Розовая, розовато-коричневая |
Бесцветная |
5 |
Наличие орнитин-декарбоксилазы |
ОРН |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, зеленая |
6 |
Утилизация цитрата натрия |
ЦИТ |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, зеленая |
7 |
Наличие уреазы |
УРЕ |
Малиновая, розовая |
Желтая |
8 |
Утилизация мало-ната натрия |
МАЛ |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, зеленая |
9 |
Утилизация сахарозы |
САХ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
Тест п/п |
Результат (цветовая реакция) |
|||
Код |
Положительный |
Отрицательный |
||
10 |
Наличие дезаминазы фенилаланина |
ФЕН |
Зеленая, темно-зеленая |
Желтая |
11 |
Утилизация лактозы |
ЛАК |
Желтая, оранжевая |
Красная |
12 |
Утилизация сорбитола |
СОР |
Желтая, оранжевая |
Красная |
ММТ-Е2 |
||||
1 |
Наличие аргининдегидролазы |
АРГ |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, зеленая |
2 |
Наличие бета-галактозидазы |
ГАЛ |
Желтая |
Бесцветная |
3 |
Утилизация инозитола |
ИНО |
Желтая, оранжевая |
Красная |
4 |
Утилизация дульцитола |
ДУЛ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
5 |
Утилизация арабинозы |
АРА |
Желтая, оранжевая |
Красная |
6 |
Утилизация рамнозы |
РАМ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
7 |
Утилизация мальтозы |
МАТ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
8 |
Утилизация адонитола |
АДО |
Желтая, оранжевая |
Красная |
9 |
Утилизация раффинозы |
РАФ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
10 |
Утилизация салицина |
САЛ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
11 |
Утилизация глюкозы |
ГЛЮ |
Желтая, оранжевая |
Красная |
12 |
Наличие нитратредуктазы |
НИТ |
Темно-бордовая, бордовая |
Желтая, оранжевая |
Идентификацию проводят с помощью таблиц «Биохимическая характеристика энтеробактерий» с учетом данных микроскопии, характера роста, О/F-теста, оксидазной активности, подвижности, наличию пигмента, источника изоляции и др.
Применение микротест-систем ЭНТЕРОтест 24
ЭНТЕРОтест 24 предназначен для определения биохимической активности и идентификации наиболее важных для патологии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий и дифференциации их от некоторых представителей семейства вибрионов в течение 18-24 часов. Система представляет собой стриппированный планшет, содержащий четыре трехрядных вертикальных стрипа для определения 24 биохимических тестов: индол, сероводород, лизин, орнитин, уреаза, аргинин, цитрат Симмонса, малонат натрия, фе-нилаланин, бета-галактозидаза, инозитол, адонитол, целлобиоза, сахароза, трегалоза, маннитол, ацетоин (реакция Фогеса-Проскауэ-ра), эскулин, рамноза, сорбитол, мелибиоза, раффиноза, дульцитол, глюкоза. Набор ЭНТЕРОтест 24 содержит 10 пластинок и позволяет провести идентификацию 40 культур.
Методика проведения исследования
ЭНТЕРОтест 24 - на каждую исследуемую культуру один трехрядный стрип, рамка для ЭНТЕРОтест 24, стерильный физиологический раствор (рН 6,5-7,2), диагностические полоски ОКСИ-тест, реактивы для тестов индол, фенилаланин, ацетоин, оксидаза, парафиновое масло и стандарт мутности первой степени по шкале МсFarland.
Выделение культуры и приготовление бактериальной суспензии. Используют чистую культуру грамотрицательных бактерий со среды Эндо, агара МасСоnkеу или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глюкозы (О/F-тест) на среде Хью-Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциации энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположительных культур. Готовят суспензию в физиологическом растворе мутностью, соответствующей стандарту, указанному выше.
Инокуляция и инкубация
Приготовленную суспензию инокулируют по 0,1 мл во все 24 лунки соответствующего стрипа. После инокуляции в лунки Н, G, F, Е, D и С первого ряда стрипа (тесты: индол, сероводород, лизин, орнитин, уреаза, аргинин соответственно) добавляют по две капли парафинового масла. Инкубируют инокулированную пластинку в термостате в течение 18-24 часов при температуре 35-37 °С.
Учет результатов и идентификация
По окончании инкубации добавляют реактивы в следующие лунки: ряд 1-й, лунка Н (тест индол) - две капли реактива на индол; ряд 3-й, лунка Н (тест ацетоин) - по одной капле реактива ВПТ 1 и ВПТ 2. Пластинку дополнительно инкубируют 30 минут при температуре 35-37 °С. Через 30 минут в лунку Н второго ряда стрипа (тест фенилаланин) добавляют одну каплю реактива на фенилаланин и немедленно учитывают результат этого теста, так как цвет положительной реакции может исчезнуть через 2 минуты. Учитывают результаты всех тестов и заносят их в бланк.
При оценке ЭНТЕРОтест 24 ориентируются по таблице «Интерпретация реакций», цветной шкале и/или по цветным реакциям контрольных штаммов.
Таблица 20 - Интерпретация реакций
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
Ряд 1-й |
||||
Н |
Индол |
IND |
Красная, розовая |
Желтоватая |
G |
Сероводород |
Н2S |
Черная, темно-серая |
Бесцветная, светло-серая |
F |
Лизин |
LYS |
Синяя, сине-зеленая |
Зеленая, желто-зеленая |
Е |
Орнитин |
ORN |
Синяя, сине-зеленая |
Зеленая, желто-зеленая |
D |
Уреаза |
URЕ |
Красная, оранжево-красная |
Желтая, бледно-оранжевая |
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
С |
Аргинин |
АRG |
Синяя, сине-фиолетовая |
Зеленая, зелено-синяя |
В |
Цитрат Симмонса |
SСI |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, желто-зеленая |
А |
Малонат |
МАL |
Синяя, сине-зеленая |
Желтая, желто-зеленая |
Ряд 2-й |
||||
Н |
Фенил ала-нил |
РНЕ |
Темно-зеленая, зеленая |
Желтая, желто-коричневая |
G |
Бета-галак-тозидаза |
ONP |
Желтая, бледно-желтая |
Бесцветная |
F |
Инозитол |
INО |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
Е |
Адонитол |
АDО |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
D |
Целлобиоза |
СЕL |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
С |
Сахароза |
SUC |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
B |
Трегалоза |
ТRЕ |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
А |
Маннитол |
МАN |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
Ряд 3-й |
||||
Н |
Ацетоин |
VРТ |
Красная, розовая |
Бесцветная, бледно-розовая |
G |
Эскулин |
ЕSL |
Черная, темно-коричневая |
Бесцветная, светло-коричневая |
F |
Сорбитол |
SOR |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
Е |
Рамноза |
RНА |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
D |
Мелибиоза |
МLВ |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
Колонка |
Тест |
Код |
Результат (цветовая реакция) |
|
Положительный |
Отрицательный |
|||
С |
Раффиноза |
RАF |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
В |
Дульцит |
DUL |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
Л |
Глюкоза |
GLU |
Желтая, желто-зеленая |
Зеленая |
Идентификацию проводят с помощью идентификационной таблицы или книги кодов для ЭНТЕРОтест 24. При окончательной идентификации учитывают всю дополнительную информацию: микроскопию, О/F-тест, оксидазную активность, характер колоний, наличие пигмента, подвижность, источник выделения и т. д.
Использование диагностических полосок САЛМтест и КОЛИтест для ускоренной предварительной идентификации сальмонелл и
кишечной палочки
Диагностические полоски САЛМтест предназначены для обнаружения сальмонелл при скрининговых исследованиях в санитарной микробиологии, пищевой промышленности, а также в клиническом материале и т. д. Диагностика основана на выявлении типичного для рода сальмонелл признака - активности С8-эстеразы. Высокая чувствительность теста по отношении к роду сальмонелл вместе с несложным выполнением и скоростью, с которой получают результаты реакции, позволяют применять САЛМтест для предварительной идентификации сальмонелл. Одна упаковка диагностических полосок позволяет провести 50 определений.
Принцип действия
С8-эстераза гидролизует 4-метилумбеллиферрил каприлат, содержащийся в индикаторной зоне полоски. Освобожденный 4-ме-тилумбеллиферрон под источником УФ-излучения дает синюю флюоресценцию, регистрируемую как положительная реакция.
Методика постановки САЛМтеста
- Используют 24-часовую культуру, подозрительную на сальмонеллы со среды Эндо, агара с бриллиантовым зеленым, МасСоnkеу агара, агара с эозин-метиленовым синим (примечание: для обнаружения присутствия сальмонелл неподходящими являются среды, предназначенные для обнаружения продукции сероводорода - черный преципитат затрудняет учет реакции на диагностической полоске).
- Добавляют на зону индикации полоски приблизительно 10 мкл реактива для САЛМтест.
- При помощи инокуляционной петли втирают испытуемую культуру в зону полоски; в случае роста чистой культуры (или же достаточно друг от друга изолированных колоний на агаровой среде) можно бактериальный рост снимать с поверхности агара непосредственно зоной полоски.
- Полоску инкубируют 10-15 минут при комнатной температуре.
- Параллельно ставят отрицательный контроль: добавляют реактив на зону полоски и инкубируют без нанесения бактериальной культуры.
- По истечении указанного времени учитывают реакции под УФ-лампой с длиной волны приблизительно 360 нм. Считывание реакций необходимо выполнять в темноте, лучше всего в специальной установке, предназначенной для оценки флюоресценции (например шкаф Гансена), положительная реакция проявляется возникновением синей флюоресценции в индикаторной зоне полоски.
- Штаммы с положительной реакцией подтверждают дальнейшей идентификацией, например при помощи набора ЭНТЕРО-Скрин (время инкубации 4 часа).
Питательные среды
Консервирующие смеси используют при отсутствии необходимых условий и сред для посева в течение 3-4 ч с момента взятия материала. Обычно объем консервирующей смеси должен составлять 2/3 от объема материала, взятого для исследования.
Глицериновая смесь. Смешивают 1000 см3 изотонического раствора хлорида натрия и 500 см3 глицерина, затем добавляют 20%-ный раствор натрия фосфорнокислого (Na2HP04) в таком количестве, чтобы рН смеси соответствовал 7,8-8,0. Смесь стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.
Фосфатная буферная смесь. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 0,45 г калия фосфата однозамещенного (КН2НР04) и 5,34 г натрия фосфата двузамещенного (Na2HP04). Стерилизуют 30 мин при 121° С.
Боратно-буфериый раствор. Смешивают 57 г кристаллической буры, 84 г борной кислоты, 99 г натрия хлорида. Затем 20 г полученной смеси растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют 10 мин при 121° С.
Среды обогащения
Желчный бульон. Применяют в качестве среды обогащения для сальмонелл, выделяемых из крови или материалов, не содержащих или содержащих в незначительных количествах другие виды бактерий.
Желчь крупного рогатого скота наливают в колбу и нагревают 1 ч текучим паром. После отстаивания фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. К 800 см3 МПБ добавляют 200 см3 желчи, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.
Среда Мюллера. Используют для накопления сальмонелл.
К 4,5 г простерилизованного сухим жаром химически чистого мела (СаС03) добавляют 90 см3 МПБ или бульона Хоттингера и стерилизуют 30 мин при 121 ° С. Перед посевом к бульону асептически добавляют
2 см3 раствора Люголя (калия иодид 25 г, йод кристаллический 20 г, вода дистиллированная до 100 см3) и 10 см3 раствора натрия тиосульфата (натрия тиосульфат 50 г, вода дистиллированная до 100 см3). Смесь перемешивают и разливают по пробиркам.
Среда Кауфмана. Используют для накопления сальмонелл.
К 100 см3 стерильной среды Мюллера асептически добавляют 5 см3 стерильной желчи (желчь стерилизуют дробно, текучим паром 3 дня подряд по 20 мин) и 5 см3 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам. Не стерилизуют.
Среда Киллиана. Используют для накопления сальмонелл.
К 100 см3 стерильного МПБ или бульона Хоттингера (рН 6,7-6,9) непосредственно перед применением добавляют 1 см3 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого.
Селенитовая среда. Используют для накопления сальмонелл. Для приготовления используют два раствора. Раствор 1. К 950 см3 раствора фосфатов (натрия гидрофосфат безводный 7 г, натрия дигидрофосфат безводный 3 г) на дистиллированной воде добавляют 5 г пептона и 4 г лактозы. Разливают во флаконы по 50 см3 и стерилизуют текучим паром
2 дня подряд по 30 мин или 30 мин при 112° С. При приготовлении раствора количественное соотношение фосфатов подтитровывают так, чтобы при добавлении пептона и натрия селенита готовая среда имела рН 6,9-7,1. Раствор хранят при 4-10° С 1-2 мес.
Раствор 2. В 40 см3 стерильной дистиллированной воды растворяют
4 г натрия гидроселенита (NaHSe03). Раствор готовят непосредственно перед приготовлением среды.
В каждый флакон с 50 см3 раствора 1 асептически добавляют 2 см3 раствора 2, перемешивают и разливают по пробиркам.
Магниевая среда. Используют для накопления сальмонелл. Для приготовления используют два раствора. Раствор 1. К 890 см3 дистиллированной воды добавляют 4,2 г пептона, 7,15 г натрия хлорида, 1,43 г калия дигидрофосфата (KH2PO4 и 9 см3 дрожжевого автолизата.
Раствор 2. В 90 см3 дистиллированной воды растворяют 35,7 г магния хлорида (MgCl2 х 6Н20). Растворы смешивают и добавляют 0,9 см3 0,5%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С.
Среда Минка. Используют для накопления эшерихий, обладающих адгезивными антигенами. Раствор 1 (фосфатный буферный раствор рН 7,5). Берут 1,36 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КН,Р04), 10,1г натрия фосфорнокислого двузамещенного (Na2HP04 x 7Н20) и растворяют в дистиллированной воде до конечного объема 1000 см3. Стерилизуют
30 мин при 115° С.
Раствор 2. 10 г магния сульфата (MgS04 x 7Н20), 1 г марганца хлорида (МnС12 х 4Н20), 0,135 г железа хлорного (FeCl3 x 6Н20) и 0,4 г кальция хлорида (СаС12 х Н20) растворяют в дистиллированной воде до конечного объема 1000 см3. Стерилизуют 30 мин при 115° С.
Раствор 3. 5 см3 гидролизата лактальбумина (или ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата) растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Раствор 4. 5 г глюкозы растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Раствор 5. 26 г агара «Дифко» растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Стерилизуют 30 мин при 115° С.
Приготовленные растворы асептически соединяют в следующем соотношении: раствор 1-500 см3; раствор 2-1 см3; раствор 3-20 см3; раствор 4-20 см3; раствор 5-460 см3 при 50° С.
Среда Ющенко-Дунаева. Используют для накопления иерсиний. В 990 см3 дистиллированной воды растворяют 8,5 г натрия хлорида, добавляют 3 см31/15 М раствора натрия гидрофосфата (Na2HP04 x 12Н20) и 7 см3 1/15 М раствора калия дигидрофосфата (КН2Р04). Устанавливают рН 7,2, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют 10 мин при 116° С или 30 мин текучим паром.
Среда ЭТ-1. Используют для накопления сальмонелл. К 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6) добавляют 2 г глюкозы и 2 см3 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Смесь кипятят на водяной бане 15-20 мин, добавляют 25 000 ЕД полимиксина и асептически разливают по пробиркам.
Для приготовления 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты 0,5 г розоловой кислоты растворяют в 10 см3 спирта-ректификата, после чего добавляют 90 см3 дистиллированной воды.
Среда П-1. Используют для накопления протеев. В 1000 см3 стерильного бульона Хоттингера растворяют 1 г манита, 5 г желчных солей по Олькеницкому, 0,8 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 20 см3 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета. Кипятят в водяной бане 15-20 мин. Добавляют 10 см3 50%-ного водного раствора мочевины и 1 000 000 ЕД полимиксина. Асептически разливают по пробиркам.
Для приготовления желчных солей по Олькеницкому к 1000 см3 бычьей или свиной желчи добавляют 40 г натрия гидроокиси и автоклавируют 3 ч при 1,5 атм. Добавляют 100 см3 20%-ного раствора бария хлорида (ВаС12 х 2Н20), автоклавируют 1 ч при 100° С и оставляют на
12-18 ч при комнатной температуре. Над осадочную жидкость сливают, фильтруют и добавляют 20%-ный раствор соляной кислоты (до кислой реакции), оставляют на 12-16 ч при комнатной температуре. После этого сливают, промывают водой и добавляют 40%-ный раствор натрия гидроокиси (до щелочной реакции). Полученный раствор солей высушивают при 115° С.
Среда К-1. Используют как селективную и для накопления клебсиелл. В 1000 см3 стерильной дистиллированной воды растворяют 5 г натрия хлорида, 0,2 г магния сульфата (MgS04 x 7Н20), 2 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 2 г калия гидрофосфата (К2НР04), 2 г раффинозы, 2 см3
1,6%-ного щелочного раствора бромтимолового синего, 20 см3
0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета. Кипятят 15-20 мин на водяной бане, добавляют 4 см3 50%-ного раствора мочевины и асептически разливают по пробиркам.
Для приготовления 1,6%-ного щелочного раствора бромтимолового синего в 80 см3 дистиллированной воды растворяют 1,6 г бромтимолового синего, 20 см3 0,25 Н раствора натрия гидроокиси.
Среда Эндо. Селективная среда для энтеробактерий. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара, основного фуксина, натрия сульфата, натрия фосфата, лактозы. Для посевов используют свежеприготовленную среду. В 100 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г сухой среды, кипятят при постоянном перемешивании 2-3 мин и разливают по чашкам Петри. Для предотвращения образования большого количества конденсата среду после кипячения охлаждают до 50° С. Готовая среда имеет розовый цвет. Колонии лактозоположительных бактерий красные, лактозоотрицательных бесцветные или слегка розоватые.
Среда Левина. Селективная среда для энтеробактерий. К 100 см3 расплавленного и охлажденного до 60-70° С 2%-ного агара Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 2 см3 0,5%-ного водного раствора ме-тиленового синего (подогретого на водяной бане до 60-70° С), 1,5 см3 2%-ного раствора эозина, 2 г лактозы и 0,2 г калия фосфорнокислого двуосновного (КН2Р04). Перемешивают, разливают по чашкам Петри и подсушивают. Перед добавлением в среду раствора красителей стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Готовая среда имеет фиолетовый цвет. Колонии эшерихий синего или черного цвета, сальмонелл бесцветные или розовые, протея оранжевые, с измененным цветом среды вокруг колонии.
Агар Мак-Конки (таурохолевыйагар). Селективная среда для энтеробактерий. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 20 г пептона,
5 г натрия хлорида, 2,5 г натрия таурохолата, 10 г лактозы, 0,1 г нейтрального красного, 20 г агара. Смесь стерилизуют 20 мин при 121° С.
Агар Плоскирева. Селективная среда для сальмонелл. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара с желчными солями, натрия цитрата, натрия тиосульфата, натрия фосфата, лактозы, нейтрального красного, бриллиантового зеленого, соды кальцинированной, йода, натрия хлорида. Готовая среда прозрачная или розовато-желтого цвета. Лактозоположительные штаммы сальмонелл образуют колониии красного цвета, лак-тозоотрицательные штаммы бесцветные.
Висмут-сульфит агар. Селективная среда для сальмонелл. Выпускается в сухом виде. Состоит из агара, гидролизата рыбы, глюкозы, висмута цитрата, натрия сульфита, соли Мора, натрия фосфата, бри-лиантового зеленого. Готовая среда имеет зеленоватую окраску. Штаммы сальмонелл, продуцирующие сероводород, образуют черные колони с прокрашиванием агара под колонией в черный цвет. Штаммы сальмонелл, не продуцирующие сероводород, образуют бесцветные или зеленовато-коричневые колонии.
Среда Рапопорта. Селективная среда для сальмонелл. Состав: МПБ или бульон Хоттингера 900 см3, желчь бычья 100 см3, глюкоза
20 г, индикатор Андреде 10 см3. Ингредиенты смешивают, разливают по 50 см3 во флаконы с поплавками. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Среда Ворфеля-Фергюсона. Используют для лучшего образования капсулы у клебсиелл. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г натрия хлорида, 1 г калия сульфата (K2S04), 0,25 г магния сульфата (Mg S04 x 7H20), 20 г сахарозы, 88 см3 дрожжевого экстракта (или 2 г сухого дрожжевого экстракта), фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 121° С.
Бульон с 0,2% глюкозы. Используют для лучшего образования капсулы у клебсиелл. Берут 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,2-7,4). В небольшом его объеме, нагретом до 40-50° С, растворяют 2 г глюкозы и смешивают с оставшимся бульоном. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С.
Дифференциально-диагностические среды
Среда Штерна. Используют для дифференциации сальмонелл. К 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 см310%-ного насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 см310%-ного водного раствора натрия сульфита (Na2S04) и 10 см3 глицерина. Разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 112° С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к S. typhimurium, которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиолетовый оттенок.
Среда Биттера. Используют для дифференциации сальмонелл. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г натрия цитрата, 5 г натрия хлорида, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112° С или текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, способным ферментировать рамнозу или арабинозу (S. typhimurium), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-ного спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску.
Среда для посева по Свену-Гарду. Используют для выявления у сальмонелл специфической фазы жгутикового антигена. К 1000 см3 МПБ или бульона Хоттингера добавляют 8 г агара и растворяют путем кипячения на водяной бане. Устанавливают рН 7,2-7,4, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 121° С.
Среды с аминокислотами. Используют для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие аминокислоты лизин, орнитин, аргинин. В 600 см3 дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 см3 в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все че тыре колбы вносят по 0,6 см3 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезоло-вого пурпурного или бромтимолового синего и по 5 см3 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробирки по 2-3 см3 и стерилизуют 30 мин при 110° С.
Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в контрольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 сут. При положительной реакции среды с аминокислотами приобретают фиолетовую или синюю (в зависимости от индикатора) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску.
Состав 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный 1,6 г, спирт этиловый 96° 100 см3.
Состав 0,1%-ного спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный 0,1 г, спирт этиловый 96° 100 см3.
Среды, содержащие органические кислоты. Используют для дифференциации сальмонелл по их способности расщеплять органические кислоты (тартраты, мукаты, натрия цитрат). В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, добавляют 8,5 см3 0,1 Н раствора натрия гидроокиси, 12 см3 0,25%-ного водного раствора бромтимолового синего, 10 г D-тартрата (или одну из следующих кислот: 5 г L-тартрата, 5 г мезотартрата, 10 г муката, 10 г натрия цитрата). Устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки и стерилизуют 20 мин при 112° С. Готовая среда синезеленого цвета. При положительной реакции в процессе инкубации среда с культурой приобретает зелено-желтую окраску.
Для получения более четких результатов в конце срока инкубации в пробирки с сомнительной или отрицательной реакцией добавляют несколько капель насыщенного раствора ацетата свинца, в результате при отрицательной реакции выпадает обильный осадок (до 2/3 объема среды), при положительной выпавший осадок незначителен.
Среда с триптофаном. Используют для определения у бактерий наличия триптофандезаминазы. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г DL-триптофана. Устанавливают рН 6,7-6,9. Для определения способности бактерий к дезаминированию триптофана испытуемую агаровую культуру бактериологической петлей вносят в пробирку с 0,5 см3 раствора триптофана и инкубируют 30 мин при 37° С, после чего вносят
1 каплю 10%-ного водного раствора железа хлористого трехвалентного (FeCl3). При положительной реакции среда приобретает темно-красную окраску, при отрицательной желтую.
Среда с калием цианидом. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,225 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 5,64 г натрия гидрофосфата (Na,HP04). Устанавливают рН 7,6, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 112° С. После стерилизации быстро охлаждают. Среду этого состава используют в качестве контрольной. Непосредственно перед применением к 100 см3 среды асептически добавляют 1,5 см3 свежеприготовленного 0,5%-ного водного раствора калия цианида (KCN), разливают по пробиркам и закрывают корковыми пробками.
Пробу считают положительной, если через 24-48 ч после посева культуры в среде заметно помутнение или опалесценция. При отрицательном результате среда остается абсолютно прозрачной, в то время как в контрольной пробирке заметно помутнение.
Среда Клиглер. Используют для определения образования сероводорода. В 1000 см3 МПБ растворяют при кипячении 20 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,4 г натрия сульфида, 0,08 г натрия тиосульфата, 20 г агара. Устанавливают рН 7,8, затем снова кипятят, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют 0,5 г железа сернокислого, растворенного в небольшом количестве воды, 10 г лактозы, 1 г глюкозы и 12 см3 0,2%-ного раствора фенолрота в 50%-ном спирте. Среду разливают по 6-7 см3 в пробирки и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среда имеет оранжево-красную окраску. При образовании сероводорода среда окрашивается в черный цвет.
Среда Кларка. Используется для постановки реакции Фогес-Проскауэра и пробы с метиловым красным для определения окисления глюкозы с образованием 2-кетоглюконата. В 100 см3 дистиллированной воды растворяют 0,5 г калия гидрофосфата (К2НР04), 0,7 г пептона, 0,5 г глюкозы. Кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при
111° С.
Реакцией Фогес-Проскауэра выявляют промежуточный продукт расщепления глюкозы ацетилметилкарбинол (ацетоин). Для этого испытуемую культуру выращивают на среде Кларка 4-5 дней в 2 пробирках. Одну пробирку культивируют при 25° С, другую при 37° С. Из обеих пробирок по 1 см3 культуры переносят в другие пробирки и добавляют 0,6 см3 5%-ного спиртового раствора а-нафтола, смесь перемешивают. Затем добавляют 0,2 см3.40%-ного водного раствора КОН. Тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч.
Учет реакции проводят через 15 и 60 мин. Положительная реакция вишневое окрашивание среды.
Тестом с метиловым красным устанавливают снижение рН среды при расщеплении глюкозы до 4,4-6,0. Раствор метилового красного готовят добавлением к 0,1 г метилрота 300 см3 95%-ного этанола. После растворения красителя добавляют 200 см3 дистиллированной воды.
Для постановки теста в пробирку с 5 см3 среды Кларка вносят петлю испытуемой культуры и инкубируют 2-5 сут при 25° С. Затем добавляют 5-6 капель реактива метиловый красный и следят за изменением окраски. При положительном результате (рН 4,0-6,0) среда приобретает красный цвет. При отрицательном результате (рН 6,0-7,0) среда приобретает желтый цвет.
Среда с мочевиной по Кристенсену. Используют для определения способности бактерий к гидролизу мочевины (уреазная активность) с образованием аммиака и углекислоты. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 5 г натрия хлорида, 2 г калия дигидрофосфата (КН2Р04), 20 г агара. Смесь стерилизуют 20 мин при 115° С. Затем вносят 1 г глюкозы и 6 см3 0,2%-ного раствора фенилрота, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50° С и асептически добавляют 100 см3 20%-ного водного раствора мочевины, стерилизованного фильтрацией. Среду разливают по пробиркам и скашивают.
Испытуемую культуру засевают на поверхность скошенного агара и культивируют 1-4 сут. Положительный результат (защелачивание среды) красно-малиновое окрашивание среды.
Среда Симмонса. Используют для определения способности бактерий утилизировать цитрат как единственный источник углерода. Состав: агар 20 г, NaCl 5 г, MgS04 х 7Н20 0,2 г, К2НР04 1 г, NH4 х Н2Р04 1 г, C6H50?Na3 х 5Н20 3 г, бромтимоловый синий 0,08 г, вода дистиллированная 1000 см3.
В дистиллированной воде растворяют агар. Соли растворяют отдельно в небольшом объеме воды и затем смешивают с агаром, до объема 1000 см3. Устанавливают рН 7,2, добавляют 40 см3 0,2%-ного водного раствора бромтимолового синего. Среду перемешивают, разливают в пробирки по 5-7 см3 и стерилизуют 15 мин при 121° С. После автоклавирования агар скашивают.
Испытуемую культуру засевают на поверхность агара и инкубируют. При положительном результате отмечают рост культуры на среде и изменение ее цвета с оливкового на синий.
Среда с алгинатом натрия. Используют для определения способности бактерий утилизировать натрия алгинат как единственный источник углерода. Состав среды аналогичен составу среды Симмонса, но вместо натрия цитрата вносится 2,5 г натрия алгината. Положительным считают изменение цвета среды. Микроорганизмы, не обладающие способностью усваивать натрия алгинат, на данной среде не растут.
Среды Гисса. Используют для изучения способности ферментации углеводов с образованием кислоты и газов. Состав: пептон 10 г, натрия хлорид 5 г, вода дистиллированная 1000 см3, 0,1%-ный индикатор Андреде, углевод 0,5% (адонит, глицерин, сорбит, дульцит, целлобиоза, раффиноза, трегалоза, салицин, арабиноза, мальтоза, рамноза, ксилоза) или 1,0% (глюкоза, лактоза, маннит, сахароза).
В дистиллированной воде растворяют навески пептона, натрия хлорида, добавляют индикатор, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,1-7,2 и стерилизуют 15 мин при 111 ° С. Затем добавляют углевод. Приготовленную среду разливают по пробиркам и стерилизуют
15 мин при 110° С.
Среда для выявления фенилаланиндезаминазы. Состав: сухой дрожжевой экстракт3 г, натрий хлористый 5 г, L-фенилалапин 1 г, Na2HP04 1 г, агар 12 г, вода дистиллированная 1000 см3. Смешивают воду и дрожжевой экстракт, нагревают, добавляют компоненты и кипятят до расплавления агара, рН среды 7,0-7,2. Горячую среду фильтруют, разливают в пробирки по 2-3 см3 и стерилизуют 30 мин при 112° С. Среду скашивают.
Испытуемую культуру засевают штрихом по поверхности агара и через сутки инкубации добавляют на поверхность культуры несколько капель 10%-ного водного раствора железа хлорида (FeCl3). При дезаминировании фенилаланина среда окрашивается в зеленый цвет, при отрицательном результате сохраняется желтое окрашивание.
Среда для выявления β-галактозидазы. В 100 см3 расплавленного и охлажденного до 40-45° С МПА асептически добавляют 20 см3 1%-ного водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. Среду разливают по пробиркам.
Испытуемую культуру засевают уколом петлей до дна пробирки. Посевы инкубируют 24 ч при 37° С.
При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет одним из конечных продуктов гидролиза О-нитрофенил-β-D-галактопиранозида О-нитрофенолом.
Среды для выявления лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы и чргининдегидролазы. Состав: мясная вода 400 см3, пептон 5 г, глюкоза 1 г, вода дистиллированная 600 см3, 0,1%-ный спиртовой раствор крезолового красного 5 см3, 1,6%-ный спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного 0,6 см3, L-лизин (или орнитин, или аргинин) 10 г.
Мясную воду, пептон, глюкозу и дистиллированную воду смешивают, устанавливают рН 6,0-6,1. Вносят аминокислоту, кипятят 8-10 мин, добавляют индикатор и разливают в агглютинационные пробирки по
3 см3. Стерилизуют 30 мин при 110° С. Цвет среды розовый.
Испытуемую культуру засевают в среды с аминокислотами (опыт) и среду безаминокислоты (контроль). Во все пробирки вносят стерильное вазелиновое иасло до получения слоя в 4-5 мм. Пробирки инкубируют 4 дня при 37° С.
При положительной реакции (защелачивание среды) наблюдается синee окрашивание в опытных пробирках и желтое в контрольной.
Среда для определения пиразинамидазной активности у Y.enterocolitica. Состав: трипсинизированный соевый агар 30 г, дрожжевой экстракт сухой 3 г, пиразинкарбоксиамид 1 г, трисмалат буфер 0,2 М, рН 6,0-1000 см3.
Составные части среды смешивают и подогревают на водяной бане до их растворения. Разливают по 5 см3 в пробирки, стерилизуют 30 мин при 112° С и скашивают.
Среда для определения калъцийзависимости роста у Y. Enterocolitica. В качестве питательной основы используют коммерческую среду для определения чувствительности бактерий к антибиотикам (агар АГВ).
К стерильному расплавленному и охлажденному до 50° С агару добавляют (из расчета на 100 см3) 8 см3 0,25 М стерильного натрия щавелевокислого, среду тщательно перемешивают и вносят 4 см3 0,5 М стерильного раствора магния хлорида. Готовую среду разливают по чашкам Петри.
Определение индолообразования. Испытуемую культуру выращивают в пробирке с бульоном Хоттингера. В пробирку с культурой вносят 2-3 капли эфира, тщательно ее встряхивают, оставляют в покое до отстаивания на поверхности среды слоя эфира. Осторожно добавляют
0,5 см3 реактива Эрлиха, выдерживают 5 мин и учитывают результат. При наличии индолообразования слой эфира приобретает розово-красный цвет.
Для приготовления реактива Эрлиха в 95 см3 96%-ного этанола растворяют 1 г парадиметиламинобензальдегида и добавляют 20 см3 концентрированной хлористоводородной кислоты (НС1).
Лабораторная диагностика колибактериоза
Род Escherichia в настоящее время объединяет 6 видов бактерий. Практически важное для ветеринарии значение имеет один вид Е. coli. Естественным местом обитания Е. coli является толстый отдел кишечника человека, млекопитающих животных, птиц, многих пресмыкающихся, рыб и насекомых. С испражнениями эшерихии попадают во внешнюю среду (почва, вода, пищевые продукты и др.), где могут сохраняться в течение нескольких месяцев.
Являясь представителями резидентной (постоянной) микрофлоры кишечника, эшерихии у здоровых животных старше 20-30, дневного возраста не превышают 1-2% от общей численности бактерий кишечника. Из-за особенностей становления кишечной микрофлоры у новорожденных животных первых дней жизни и до 2-3, недельного возраста число эшерихии может достиать 50% и более. Если среди них преобладают энтеропатогенные, токсигенные варианты, а животные имеют недостаточную иммунную защиту (что часто бывает у молодняка), то развиваются кишечные инфекции эшерихиозной этиологии: колибактериоз телят, поросят, ягнят, кроликов, собак, птиц; у поросят отечная форма. Транслокация эшерихий из кишечника в кровяное русло является причиной развития у разных животных септицемии, у свиноматок симптомокомплекса ММА (метрит-мастит-агалактия), у коров и других животных мастита, может стать причиной воспаления слизистых оболочек урогенитального, респираторного тракта, осложнять раневые инфекции и т.д.
Колибактериоз (эшерихиоз) остропротекающая инфекционная болезнь молодняка животных всех видов, включая птиц. Протекает в септической или энтеритной (колидиарея) формах, у поросят-отъемышей еще и в форме энтеротоксемии (отечная форма), у птиц в виде септицемии, реже в виде сальпингита и колигранулематоза. Возбудителем болезни являются энтеропатогенные эшерихий вида E. coli.
Бактериологическое исследование
Для исследования используют свежие трупы мелких животных и птиц целиком, трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, сердце, перевязанное лигатурой у аорты, брыжеечные лимфоузлы, отрезок тонкого кишечника, перевязанный с двух сторон. При направлении трупов целиком в лаборатории, помимо указанного материала, исследуют еще и головной мозг.
Для прижизненной диагностики в лабораторию могут направляться фекалии, кровь.
Микроскопическое исследование исходного материала
Из поступившего материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Эшерихий являются мелкими (1,0-3,0х0,3-
0,6 мкм) прямыми палочками. Грамотрицательные.
Выделение и идентификация культур патогенных эшерихий
Культивирование. Эшерихий факультативные анаэробы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 37- 38° С, рН среды 7,0-7,2, хорошо растут на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах.
Исследуемый материал высевают на плотные селективно-дифференциальные среды Эндо, или Левина, или Мак-Конки и среду с сорбитом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов. По истечении этого срока посевы просматривают и отбирают 10 колоний (5, выросших после посева фекалий или соскобов со слизистой кишечника, и 5 - из других органов, в т.ч. брыжеечных лимфатических узлов), типичных для эшерихий, которые пересевают в МПБ, на МПА и среду Минка (при наличии колоний слизистой консистенции, т.е. тянущихся за петлей, их обязательно отсевают на среду Минка) в чашках, разделенных карандашом для стекла на 10 секторов (каждую колонию на 2 среды в отдельный пронумерованный сектор). При подозрении или целенаправленном исследовании на отечную болезнь поросят (энтеротоксемию) дополнительно пересевают несколько колоний на кровяной агар в чашке, разделенной на соответствующее количество секторов. С чашек с культурами на среде с сорбитом отсевают 3-4 колонии S-формы серовато-белого цвета в пробирки со скошенным МПА. Культуры, выделенные от птиц, на МПА и среду Минка не пересевают. Их высевают в специальные питательные среды для изучения биохимических свойств.
Характер роста эшерихий на питательных средах. На плотных питательных средах эшерихий образуют круглые с гладкой, вьшуклои поверхностью, ровным краем, диаметром 2-4 мм колонии. На МПА колонии полупрозрачные, сероватого цвета. На средах Эндо, Левина и Мак-Конки за счет ферментации лактозы и закисления среды приобретают цвет индикаторов: на среде Эндо - красные, малиново-красные с металлическим блеском или без него; на среде Левина темно-синие, фиолетовые, черные с металлическим блеском или без него; на среде Мак-Конки розовые, красные (отдельные штаммы эшерихий могут не ферментировать лактозу и формировать на перечисленных средах бесцветные колонии). На среде с сорбитом эшерихий серогруппы О157 (варианты О157:Н7 и О157:Н), вызывающие диарею животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, образуют серовато-белые колонии S-формы. Колонии эшерихий других серогрупп красно-малинового цвета. Колонии штаммов, образующих гемолизин, на кровяном агаре окружены зоной гемолиза. В МПБ рост эшерихий проявляется в виде равномерного помутнения среды с образованием легко разбивающегося осадка.
Обнаруженные на данном этапе исследований эшерихий с гемолитическими свойствами, выделенные от поросят-отъемышей с признаками отечной болезни (из содержимого тонкого отдела их кишечника и (или) брыжеечных лимфатических узлов), относят к возбудителю отечной болезни (энтеротоксемии) поросят.
Морфология клеток эшерихий в культуре. В мазках, приготовленных из культур, эшерихий обнаруживают в виде грамотрицательных, мелких (1,0-3,0x0,3-0,6 мкм) прямых палочек с закругленными концами. В поле зрения микроскопа располагаются одиночно, реже попарно. Спор не образуют. Некоторые (штаммы серо групп 08, 09, 020, 0101) образуют капсулу или микрокапсулу. Большинство подвижно за счет перетрихиальных жгутиков, но встречаются и неподвижные.
Идентификация эшерихий по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для эшерихий культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами окончательно относят к роду Escherichia и виду E.coli на основании изучения их ферментативных свойств. Ориентируясь на критерии к E.coli относят штаммы, образующие индол, не образующие H2S, дающие положительную реакцию с метиловым-красным (среда окрашивается в розово-красный цвет) и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра (среда окрашивается в желтый цвет), не растущие на среде Симмонса, не расщепляющие мочевину, образующие лизиндекарбоксилазу. Большая часть эшерихий образует орнитиндекарбоксилазу, ферментирует манит. Все (за редким исключением) сбраживают лактозу.
На данном этапе исследований диагноз на колибактериоз считают установленным в том случае, если выделены чистые культуры Е. coli не менее чем из двух ниже указанных органов и тканей: селезенки, крови, крови сердца, костного мозга, головного мозга свежего трупа животного без изучения патогенных свойств штаммов и установления их серогрупповой принадлежности. В остальных случаях устанавливают патогенность выделенных культур.
Серологическая идентификация. Важнейшую информацию о патогенных свойствах эшерихий получают при определении их антигенной структуры. Клетки эшерихий содержат три вида антигенов: О соматический; К оболочечный и Н жгутиковый.
О-антиген термостабилен (выдерживает нагревание при 100° С в течение 2,5 часов). Является липополисахаридо-протеиновым комплексом, неоднороден, и на его основе эшерихий делят на группы (более 160
О-групп).
К-антигены поверхностные, оболочечные (кислые полисахариды, редко протеины). По своим свойствам их подразделяют на три типа:
L-антиген термолабильный, инактивируется при 100° С в течение часа;
В-антиген в этих же условиях теряет агглютинабелыюсть; А-антиген термостабильный, инактивируется при 120° С в течение 2,5 часов, имеется у слизистых капсулообразующих эшерихий О-групп 08,09,020,0101;
Н-антиген термолабильный, инактивируется при 60° С в течение 1 часа, протеин, располагается в фимбриях (пилях), пронизывающих клеточную стенку, поэтому в последнее время его чаще называют фимбриальным антигеном.
К-антигены покрывают О-антиген и делают клетки эшерихий иннаглютинабельными в гомологичных О-сыворотках. Они обладают адгезивными свойствами, т.е. с их помощью бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам кишечника. Адгезивные антигены являются фактором патогенности, который изучается у чистых культур E.coli в первую очередь.
Н-антиген жгутиковый, состоит из протеина, термолабилен, имеет несколько десятков разновидностей, определяемых в РА. Для диагностики существенного значения не имеет. Сочетание О-, К- и Н-антигенов характеризует серологический вариант (серовар) эшерихий.
Ведущая роль в развитии колибактериоза принадлежит эшерихиям с адгезивными антигенами К88, К99, F41, F18, 987Р, А20 и др. Наличие этих адгезинов можно выявить в реакции агглютинации на стекле или в ELISA-тесте с соответствующими антисыворотками. В нашей стране наиболее распространенным методом выявления адгезивных антигенов у эшерихий является РА. Для этой цели промышленностью выпускается набор агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий. Этот набор включает моновалентные агглютинирующие сыворотки к антигенам К88, К99, F41, 987Р, А20 и поливалентную агглютинирующую сыворотку, представляющую собой смесь моновалентных сывороток в равных объемах. Сыворотки выпускаются в сухом виде во флаконах по 0,5 см3, что обеспечивает сохранение их специфической активности на срок не менее 5-ти лет.
Постановка РА. В ампулу (флакон) с сухой сывороткой добавляют растворитель (дистиллированная вода или физиологический раствор) до первоначального объема сыворотки (0,5 см3), затем растворителем разводят поливалентную сыворотку в соотношении 1:2, а моновалентные 1:10 (рабочий титр). Разведенные сыворотки хранят в пробирках (флаконах) под резиновой пробкой при температуре 4-10° С до 3 месяцев. По внешнему виду разведенные сыворотки должны представлять собой прозрачную или слегка опалесцирующую бледно-розовую жидкость. Мутные сыворотки, проросшие плесенью или другими микроорганизмами, с обильным осадком к употреблению непригодны.
Для выявления антигенов К88, 987Р и А20 используют культуры эшерихий, выращенные на МПА или агаре Хоттингера, для обнаружения антигенов К99 и F41 на среде Минка. В обоих случаях посевы инкубируют при 37-38° С в течение 20-24 часов.
Культуры эшерихий, выделенные от птиц, для выявления адгезивных антигенов не используют. Выросшие культуры исследуют в РА на стекле вначале с поливалентной, а затем (в случае положительной реакции) с моновалентными сыворотками. С этой целью каплю поливалентной сыворотки наносят на предметное стекло, бактериологической петлей берут испытуемую культуру и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают в течение одной минуты при легком покачивании стекла при температуре от 18 до 28° С. Контролем служит испытуемая культура, смешанная с каплей физиологического раствора (рН 7,2 -7,4) и с каплей нормальной кроличьей сыворотки, разведенной 1:10 (для исключения самоагглютинации культуры).
Положительная реакция характеризуется склеиванием микробных клеток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным просветлением сыворотки при отсутствии агглютинации в контроле.
Эшерихии, давшие положительную реакцию агглютинации с одной из сывороток, считают возбудителем колибактериоза (колидиареи).
Наличие адгезивных антигенов у энтеропатогенных эшерихии (ЕРЕС) имеет определенную связь с хозяевами этих возбудителей и
О-серогруппами (табл. 21).
Культуры эшерихии на скошенном МПА, полученные после пересева серовато-белых колоний со среды с сорбитом (не ферментирующие этот многоатомный спирт), исследуют с агглютинирующей коли-сывороткой О157 в РА на стекле. Реакцию ставят с живыми культурами. Для исключения самоагглютинации бактериальных клеток культуру исследуют с 0,85%-ным раствором натрия хлорида. При отсутствии агглютинации в контроле и ее наличии на стекле с коли-сывороткой О157 исследуемые эшерихии относят к возбудителю колибактериоза.
Таблица 21 - Распространение адгезивных антигенов у ЕРЕС в
зависимости от хозяина и О-серогрупп
Адгезивные антигены |
Хозяин |
Главные О-группы, носители антигенов |
К-88 |
Поросята |
08,0141,0147,0149,0157 |
987Р |
Поросята |
09,020,0141 |
К99 |
Поросята, телята, ягнята |
08, 09, 020, 0101 |
F41 |
Телята |
09, 101 |
18 |
Поросята |
н.д. |
А20 |
Телята, ягнята |
н.д. |
Со штаммами, давшими отрицательную реакцию агглютинации, а также со штаммами выделенными от птиц, проводят дальнейшие диагностические исследования. При этом определяют их О-групповую принадлежность в РА с поливалентными и моновалентными агглютинирующими О-коли-сыворотками или изучают их патогенность в биопробе на белых мышах (штаммы, выделенные от млекопитающих) или цыплятах (штаммы, выделенные от птиц).
Серогрупповая принадлежность эшерихии определяется в реакции агглютинации на стекле и в пробирочной реакции агглютинации. Для этого выпускаются наборы агглютинирующих О-коли-сывороток, включающие моновалентные сыворотки к О-антигенам 30 основных серогрупп ЕРЕС, и четыре поливалентные, каждая к О-антигенам 6-8 серогрупп. Агглютинирующие О-коли-сыворотки выпускают во флаконах в жидком виде. Пригодные к использованию сыворотки представляют собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета.
Ход определения. 1. Испытуемый штамм выращивают на МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, смывают физиологическим раствором, переносят в стерильные пробирки, прогревают в течение часа в водяной бане при температуре 100° С для разрушения поверхностных термолабильных L- и В-антигенов или автоклавируют при температуре 120° С в течение 2-2,5 часов для разрушения термостабильного А-антигена. Если во взвеси бактерий после кипячения или автоклавирования образуются хлопья или зернистость (R-форма), то ее не используют для реакции. Прогретую взвесь бактерий центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 20 минут, надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в качестве антигена для постановки реакции на стекле. Оставшуюся часть антигена разводят стерильным физиологическим раствором по оптическому стандарту мутности до концентрации 500 млн. микробных клеток в 1см3 и используют для постановки пробирочной реакции агглютинации.
2. На предметное стекло наносят по одной капле каждой из четырех поливалентных сывороток. В каждую из них бактериологической петлей вносят осажденную центрифугированием культуру и хорошо перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре, учитывают ее в течение 3 минут. Положительная реакция характеризуется образованием мелкозернистого аг-глютината и полным или частичным просветлением жидкости. При отрицательном результате антиген остается в капле сыворотки в виде равномерной взвеси.
3. Каждый антиген, агглютинирующийся одной из поливалентных сывороток, исследуют в реакции агглютинации на стекле с моновалентными, разведенными 1:10, сыворотками, входящими в состав данной поливалентной сыворотки, а затем в пробирочной реакции агглютинации с каждой сывороткой, давшей положительную реакцию на стекле.
4. Пробирочную РА ставят в обычных серологических или бактериологических пробирках в объеме 1 мл.
Сыворотку разводят стерильным физиологическим раствором от 1:25 до титра, указанного на этикетке. Для приготовления исходного разведения к 2,4 см3 физиологического раствора добавляют 0,1 см3 сыворотки. Во все другие пробирки разливают по 0,5 см3 физиологического раствора. Из исходного разведения 0,5 см3 смеси переносят во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. Каждое разведение готовят отдельной пипеткой. Содержимое каждой пробирки смешивают. Из первой пробирки удаляют 1,5 см3, из последней 0,5 см3 антигена, имеющего концентрацию
500 млн. микробных тел в 1 см3.
Одновременно ставят контроли:
а) антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглютинации);
б) сыворотка в разведении 1:25 без антигена (для исключения флокуляции).
Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают 16-18 часов при температуре 37° С и 6-8 часов при комнатной температуре.
5. Положительная реакция характеризуется просветлением жидкости и образованием на дне пробирки осадка в форме раскрытого зонтика, который при встряхивании распадается на мелкие хлопья или комочки.
Реакцию считают отрицательной, когда на дне пробирки образуется осадок в виде пуговки (диска), который при встряхивании разбивается в равномерную взвесь. Аналогичный результат должен быть в контрольных пробирках.
6. В том случае, когда поливалентные О-коли-сыворотки не агглютинируют в РА на стекле, антиген, прогретый при температуре 100° С, и суспензию из исследуемых бактерий автоклавируют при температуре 120° С в течение 2 -2,5 часов.
Полученный антиген исследуют в пробирочной РА с сыворотками серогрупп 08, 09, 020 и 0101.
7. Исследуемый штамм относят к той О-группе, с сывороткой которой он вступает в реакцию до титра или не ниже половины титра сыворотки.
Определение серогрупповой принадлежности эшерихий имеет важное диагностическое значение, поскольку по морфологическим, ферментативным и культуральным свойствам патогенные и непатогенные разновидности эшерихий не отличаются друг от друга. В то же время установлено, что из более чем 160 О-серогрупп известных в настоящее время эшерихий лишь около 40 являются основными возбудителями колибактериоза (эшерихиоза) у животных и птиц (табл. 22). Отнесение изучаемого штамма к одной из этих серогрупп дает основание для постановки диагноза на колибактериоз.
е) Определение патогенных свойств E.coli. Патогенность изучаемых штаммов эшерихий может быть установлена в биопробе на белых мышах или цыплятах. Для этого испытуемый штамм выращивают на МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, смывают стерильным физиологическим раствором, готовят суспензию концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1см3 по оптическому стандарту мутности и вводят внутрибрюшинно по 0,5 см3 трем белым мышам массой 14-16 г или трем цыплятам 3-
4-недельного возраста (при исследовании материала от птиц). Наблюдение за зараженными животными проводят в течение трех суток. В случае гибели двух и более зара женных мышей или цыплят выделенный штамм признают патогенным и считают возбудителем инфекции.
Таблица 22 - Основные серогруппы эшерихий, патогенные для животных
Виды животных и патология |
Основные серогруппы ЕРЕС |
1. Крупный рогатый скот: |
|
сепсис у телят |
078, 08, 09, 015, 055, 086, Ol 15, 0117, 041, Ol 19 |
диарея у телят |
08,09,020,0101 |
мастит у коров |
09, 08, 06, 02, 021, 081, 086 |
2. Свиньи: диарея у поросят |
08, 09, О20, 045, О101, 0138, 0139, 0141, 0147, 0149,0157 |
энтеротоксемия у поросят |
0138,0139,0140,0141 |
3. Овцы: |
|
сепсис у ягнят |
078, 015, О20, 035, 075, Ol 14, 0115, 0119, 0125, 0137, |
диарея у ягнят |
09,08,0101 |
4. Собаки: энтериты |
04, 025, 042 |
5. Кролики: диарея |
085, 02, 0101, 06, 018, 0128, 055, 044 |
6. Лошади: из репродуктивных органов |
018,02,06,0147,0141 |
7. Птица: септицемия цыплят, сальпингит кур-несушек, колигранулематоз |
01, 02, 078, 015, О101, 0115, 041 |
Постановка биопробы завершает общепринятую схему бактериологического исследования материала на колибактериоз (эшерихиоз). При необходимости могут быть проведены исследования токсигенных свойств изучаемых штаммов.
Одним из факторов вирулентности эшерихий является продуцируемый ими экзотоксин. Экзотоксины E.coli относят к энтеротоксинам, а штаммы, их продуцирующие, к энтеротоксигенным E.coli (ETEC). Выявление ЕТЕС позволяет установить диагноз на колибактериоз при бактериологическом исследовании материала. Кроме того, наличие энтеротоксигенных штаммов необходимо учитывать при конструировании вакцин против колибактериоза.
ЕТЕС продуцируют два типа энтеротоксинов: термостабильный (ТС) и термолабильный (ТЛ), отличающиеся друг от друга по молекулярной массе, структурной организации, иммуногенности и механизму действия.
Синтез ТЛ-токсина детерминирован конъюгативной (передающейся другим, в т.ч. и непатогенным, бактериям) плазмидой. Он секретируется во внешнюю среду, окружающую бактерию, адсорбируется на ворсинках эпителиальных клеток тонкого кишечника, где стимулирует аденинлатциклазу. Последняя вызывает увеличение концентрации аденозин-монофосфата, который ведет к гиперсекреции воды и хлоридов в просвет кишечника и угнетению резорбции натрия. Просвет кишки переполняется жидкостью, развиваются усиленная перистальтика кишечника и диарея. Молекулярная масса ТЛ-токсина 24000 Д, он является пептидом и обладает антигенными свойствами. Разрушается при 60° С в течение 30 минут, инактивируется в среде с рН 4,0 -5,0 и под воздействием проназы.
ТС-токсин также находится под генетическим контролем гетерогенной группы конъюгативных Ent-плазмид. Адсорбируясь на клетках эпителия тонкого отдела кишечника, он вызывает гиперсекрецию воды и электролитов, путем активации гуанилатциклазы. Молекулярная масса ТС-токсина колеблется от 1000 до 10 000 Д, он является гаптеном и не обладает антигенной активностью. Сохраняет биологическую активность при температуре 65° С в течение 15 мин., при 100° С - 2 мин. Полностью разрушается при кипячении в течение 30 мин. Устойчив к действию трипсина, проназы, протеиназы, дезоксирибонуклеазы. Имеется две разновидности термостабильного энтеротоксина: ТСа и ТСв.
Синтез энтеротоксинов у Е. coli не связан с их серогрупповой принадлежностью. Так, ЕТЕС-возбудители колибактериоза телят могут принадлежать к серогруппам 08, 09, О20, 026, О101 и другим, колибактериоза поросят к 08, 045, 0141, 0149, 0149, 0139 и 0157.
Энтеротоксигенные E.coli возбудители колибактериоза новорожденных телят, ягнят и козлят, синтезируют в основном ТСа энтеротоксин (среди них такие штаммы встречаются в 86,4 - 100% случаев), редко ТЛ-энтеротоксин (0 - 9,1%).
Кроме того, ЕТЕС выделяются при колибактериозе поросят и жеребят, при отечной форме у поросят, редко выделяются от щенков.
Данные о корреляции у штаммов Е. coli между адгезивными антигенами, энтеротоксигенностыо и хозяевами представлены в табл. 18.
Под влиянием антибактериального или антиадгезивного иммунитета или специфических сывороток ЕТЕС теряют способность к адгезии и не проявляют энтеротоксичности. То же происходит с энтеротоксигенными Е. coli при утрате ими плазмид, детерминирующих адгезивные антигены.
Таблица 23 - Взаимозависимость между адгезинами,
энтеротоксинами и хозяевами
Тип адгезинов |
Главные хозяева штаммов |
Продуцируемые энтеротоксины |
||
ТС |
ТЛ |
ТСиТЛ |
||
К 88 |
Поросята |
+ |
+ |
+ |
К 99 |
Телята, ягнята |
+ |
- |
- |
987 Р |
Поросята |
+ |
- |
- |
F41 |
Телята |
+ |
- |
- |
Поскольку, как отмечалось выше, в большинстве случаев корреляция между энтеротоксигенностыо штаммов эшерихий и их серогрупповой принадлежностью отсутствует, проводить диагностику заболеваний, вызванных ЕТЕС с помощью обнаружения у них О- или К-антигенов, нецелесообразно. Для этой цели необходимо выявлять либо адгезины, либо непосредственно энтеротоксины.
Определение энтеротоксигенных свойств Е. coli проводят на изолированных петлях тонкого кишечника кролика или морской свинки. Метод основан на феномене расширения кишечной петли за счет скопления в ее просвете жидкости, что и является показателем токсигенной активности испытуемых штаммов.
При использовании кроликов (классическая модель) отбирают клинически здоровых животных массой 2,0-2,5 кг, выдерживают их на голодной диете со свободным доступом к воде в течение 36-48 часов, после чего оперируют под эфирным наркозом с фиксацией в спинном положении. Общепринятыми хирургическими методами осуществляется лапаротомия, тонкий кишечник извлекается на стерильную салфетку и орошается физиологическим раствором через каждые 5-7 минут операции. На кишечник накладывают шелковые лигатуры так, чтобы образовалось 8-12 сегментов по 10 см с промежутками между ними в 3-5 см. В опытные сегменты вводят испытуемый материал в объеме 2 см3 (суспензия испытуемого штамма эшерихий в физиологическом растворе концентрацией
1 млрд. микробных клеток в 1 мл. Культуру выращивают на плотных средах в течение 16-24 часов. В контрольные сегменты вводят по 2 см3 стерильного физиологического раствора. Петли кишечника вправляют в брюшную полость, брюшину с брюшными мышцами зашивают непрерывным швом. Через 16-18 часов кроликов усыпляют. Извлекают кишечник, из каждого опытного сегмента жидкость переносят в мерный цилиндр. Индекс дилатации определяют соотношением объема скопившейся жидкости в сегменте к длине этого сегмента. Энтеротоксигенными считают штаммы, дающие индекс дилатации 1 и более.
При использовании морских свинок тест выполняется аналогичным образом. При этом отбирают животных массой 250-500 г. Лигатуры накладывают на тощую кишку так, чтобы образовались сегменты длиной 1,0-1,5 см. Исследуемый материал вводят в объеме 0,1см3. Энтеротоксигенными признают штаммы, дающие индекс дилатации 0,5 и более.
Для обнаружения ТЛ-энтеротоксина в настоящее время используют тест отека лап белых мышей, кожную пробу на кроликах, реакцию агрегации тромбоцитов, реакцию отсутствия прилипания лейкоцитов в вате, реакцию латекс-агглютинации, РИД по Манчини и др. ТС-энтеротоксин выявляют в анальной пробе на 15-дневных мышатах-сосунах или в пробе на 15-дневных куриных эмбрионах.
Патогенные эшерихии сероваров О157:Н7 и О157:Н-, вызывающие диарею животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, бактерии, образующие адгезивный антиген F 18 и вызывающие отечную форму колибактериоза поросят, продуцируют вероцитотоксин.
Лабораторная диагностика сальмонеллезов
Сальмонеллезы группа инфекционных бактериальных болезней, преимущественно молодняка сельскохозяйственных животных, в том числе и птиц, промысловых и мелких домашних животных.
У животных сальмонеллезы могут проявляться в виде трех основных форм: первичные, вторичные и бактерионосительство.
Первичные сальмонеллезы при остром течении характеризуются лихорадкой, явлениями септицемии, токсикоза и поражением кишечника, а при хроническом воспалением легких. У взрослых животных (кобыл, овец и реже у коров) могут наблюдаться аборты.
Вторичные сальмонеллезы осложняют течение основного заболевания (чума свиней, пастереллез и др.), при этом характерные для сальмонеллезов признаки обычно слабо выражены или отсутствуют.
Бактерионосительство сальмонелл характеризуется тем, что животные, будучи внешне здоровыми, выделяют бактерии во внешнюю среду с фекалиями и мочой. У таких животных возбудителя обнаруживают главным образом в печени (в желчи, в слизистой желчного пузыря, в лимфатических узлах печени), в мезентериальных лимфатических узлах, в содержимом слепой кишки.
У человека сальмонеллез протекает в виде пищевых токсикоинфекций (острых кишечных инфекций).
Возбудители сальмонеллезов относятся к роду Salmonella семейства Еnterobacteriaceae. В настоящее время все сальмонеллы разделяют на два вида. Вид S. bongori содержит менее 10 очень редких сероваров. Все остальные 2500 сероваров выделены внутри вида S. choleraesuis, который по фенотипическим и генетическим критериям разделен на 6 подвидов:
S. choleraesuis subsp. arizonae; S. choleraesuis subsp. choleraesuis;
S. choleraesuis subsp. diarizonae; S. choleraesuis subsp. houtenae;
S. choleraesuis subsp. indica и S. choleraesuis subsp. salamae. Все серовары внутри подвида choleraesuis имеют названия, тогда как в других подвидах серовары (за исключением некоторых в подвидах salamae и houtenae) не имеют названий.
Диагностическим лабораториям рекомендовано для имеющих названия сероваров бактерий рода Salmonella использовать эти названия, а не имеющие названий серовары обозначать с помощью антигенной формулы и указанием подвида. Лабораторная диагностика сальмонеллеза основана на результатах бактериологического и серологического исследований.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.
Бактериологическое исследование
Для посмертной диагностики в лабораторию направляют свежий труп мелких животных, в том числе и птиц, целиком, от трупов крупных животных трубчатую кость, долю печени с желчным пузырем, почку, селезенку, брыжеечные лимфоузлы, пораженные участки легких, слепую кишку с содержимым; в случае аборта свежий плод.
Для прижизненной диагностики в лабораторию направляют фекалии, носовую слизь, истечения из родовых путей.
Для получения гемокультуры на 1-4-й день болезни (не позже, т.к. период бактериемии при сальмонеллезах короткий) от животных может быть взята кровь, а для серологического исследования по РА сыворотка крови. От птиц берут кровь для постановки кровекапельной реакции агглютинации или кровекапельной реакции непрямой гемагглютинации для диагностики пуллороза-тифа.
Микроскопическое исследование исходного материала. Из поступившего материала готовят мазки, окрашивают по Граму. Сальмонеллы являются грамотрицательными, мелкими палочками с закругленными концами, от 1 до 4 мкм длиной и 0,5-0,8 мкм шириной. Не образуют спор и капсул.
Для люминесцентной микроскопии готовят мазки-отпечатки из патологического материала и обрабатывают их в соответствии с «Наставлением по применению комплексной и групповых сальмонеллезных флуоресцирующих сывороток» (для прямого метода иммунофлюоресценции).
Выделение и идентификация культур сальмонелл. Сальмонеллы факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы; обладают и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура культивирования 37° С, рН среды 7,2-7,4, хорошо растут на обычных питательных средах.
Исследуемый материал высевают на обычные МПА и МПБ, на плотные селективные среды, а в ряде случаев (главным образом при исследовании фекалий и при получении гемокультуры) в среды накопления. Из селективных наиболее часто используют среды Плоскирева, Эндо, Левина, висмут-сульфит агар, а из сред накопления Мюллера, Кауфмана, Киллиана.
Для получения гемокультуры кровь засевают в пробирку с 20%-ным желчным МПБ. Засеянные чашки Петри и пробирки инкубируют 18-
20 часов при 37° С. После этого просматривают посевы на плотных средах в чашках Петри и отбирают подозрительные колонии, наряду с этим делают высевы с жидких сред накопления на плотные селективные среды, которые инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов.
Характер роста сальмонелл на питательных средах. В МПБ сальмонеллы дают рост в виде равномерного помутнения среды, на МПА образуют небольшие, диаметром 2-4 мм, гладкие выпуклые прозрачные или серо-голубоватые колонии с ровными краями. Некоторые серовары
(S. abortus equi, S. abortus ovis, S. typhisuis) образуют более мелкие колонии диаметром около 1 мм. На среде Эндо колонии сальмонелл слегка розовые, прозрачные, на средах Плоскирева и Мак-Конки бесцветные, но выглядят более плотными и мутноватыми, чем на МПА. На агаре Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных колоний, иногда с фиолетовым оттенком. На висмут-сульфит агаре почти все сальмонеллы образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание участка среды под колонией в черный цвет. Отдельные немногочисленные серовары составляют исключение, и на висмут-сульфит агаре образуют светлые или светло-зеленоватые колонии.
Морфология клеток сальмонелл в культуре. В мазках, приготовленных с питательных сред, сальмонеллы обнаруживают в виде грамотрицательных, мелких палочек с закругленными концами, от 1 до 4 мкм длиной и 0,5-0,8 мкм шириной. В мазках располагаются одиночно, беспорядочно, иногда попарно. Не образуют спор и капсул. Обладают, как правило, выраженной подвижностью за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Некоторые серовары (S. gallinarum-pullorum) всегда неподвижны, могут встречаться неподвижные мутанты и среди других сероваров.
Идентификация сальмонелл по ферментативным признакам. Чистые культуры бактерий с характерными для сальмонелл культуральными свойствами с целью установления родовой принадлежности засевают в дифференциально-диагностические среды для определения ферментативных свойств.
К роду Salmonella относят бактерии: оксидазоотрицательные; катала-зоположительные; не образующие индол; дающие отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра (желтое окрашивание среды); положительную пробу с метиловым красным (среда окрашивается в розово-красный цвет); способные расти на среде Симмонса с цитратом; лизин- и орнитиндекарбоксилазо-положительные; образующие H2S; не сбраживающие лактозу, сахарозу; не расщепляющие мочевину; не разжижающие желатину. По аргининдегидрогеназе, способности расти в присутствии KCN и использованию малона-та сальмонеллы различаются. Как правило, сбраживаемые ими углеводы включают L-арабинозу, D-ксилозу, мальтозу,
D-маннитол, D-маннозу, L-рамнозу, D-сорбитол, трегалозу и глюкозу.
Частота выявления позитивных реакций при изучении некоторых биохимических характеристик сальмонелл представлена в таблице 24.
Таблица 24 - Биохимические свойства рода Salmonella
Признаки |
% позитивных реакций |
Ферментация глюкозы |
100% |
Образование газа на среде с глюкозой |
91,9% |
H2S |
91,6% |
Индол |
1,1% |
Арабиноза |
89,2% |
Сорбит |
94,1% |
Дульцит |
86,5% |
Маннит |
99,7% |
Рост на среде Симмонса |
80,1% |
На основании биохимических характеристик возможна не только родовая идентификация сальмонелл, но и определение их видовой и подвидовой принадлежности.
Наибольшее значение для ветеринарии имеют сальмонеллы подвидов choleraesuis и arizonae, объединяющие более 80% всех сальмонелл.
Таблица 25 - Дифференциация видов и подвидов бактерий рода
Salmonella,первоначальные источники их выделения
Тесты |
Вид |
Подвиды вида S. choleraesuis |
|||||
S. bongori |
Cholerae-suis |
Salamae |
Ari-zonae |
Diari- zonae |
Houtenae |
Indica |
|
b-галактозидаза (ONPG-тест) |
+ |
- |
(-) |
+ |
+ |
- |
+/- |
Образование кислоты из: лактозы |
- |
- |
- |
(-) |
(+) |
- |
(-) |
дульцита |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
+/- |
муката |
+ |
+ |
+ |
+ |
+/- |
- |
+ |
галактоуроната |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
Н.Д. |
Утилизация мальтозы |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
d-тартрата |
- |
+ |
+/- |
- |
(-) |
+/- |
+ |
Гидролиз желатины |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
Первоначальные источники выделения: теплокровные животные; |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
Н.Д. |
холоднокровные и объекты внешней среды |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
Н.Д. |
Примечания: Данные по подвиду Indica приведены по Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (1994). Обозначения: «-» 0-10% штаммов положительные; «(-)» 11-25% штаммов положительные; «+/-» 26-75% штаммов положительные; «(+)» 76-89% штаммов положительные; «+» 90-100% штаммов положительные.
Учитывая возможность отклонений отдельных из перечисленных признаков, следует отметить, что биохимическая идентификация сальмонелл является лишь первым этапом работы в этом направлении. Окончательную идентификацию выделенных штаммов осуществляют с учетом последующего изучения их антигенной структуры.
Серологическая идентификация сальмонелл. Сальмонеллы имеют сложное антигенное строение. Основными антигенами, имеющими значение для идентификации сальмонелл на уровне рода, опре деления их видовой, серогрупповой и серовариантной принадлежности, являются соматический или О-антиген и жгутиковый или Н-антиген.
О-антиген расположен на поверхности бактериальной клетки и представляет собой термостабильный (не разрушается при кипячении в течение 2 часов) фосфолипидо-полисахаридный комплекс. Он не однороден и содержит различные антигенные факторы (дидезоксигексозы, или иначе по-лиозиды) на концах полисахаридных цепей, что обуславливает специфичность О-антигена в серологических реакциях.
В соответствии с содержанием тех или иных О-антигенов сальмонеллы делят на серологические группы, обозначаемые заглавными буквами латинского алфавита. Отдельные антигенные факторы О-антигена обозначаются арабскими цифрами. Некоторые антигенные факторы
О-антигена (далее просто О-антигены) называют главными О-антигенами, т.к. они встречаются только в одной из групп сальмонелл и именно они определяют групповую принадлежность бактерий. Другие О-антигены называют малыми, т.к. они встречаются в нескольких или даже многих группах сальмонелл и, следовательно, не могут определять их групповую принадлежность. В настоящее время выделено более 50 О-групп сальмонелл.
Одним из компонентов О-антигена является Vi-антиген полимер N-ацетиламино-гексуроновой кислоты. Он обнаруживается у отдельных се-роваров сальмонелл (S. dublin, S. paratyphi и др.) и некоторых других бактерий семейства энтеробактерий (Escherichia, Citrobacter). Vi-антиген затрудняет серологическую идентификацию сальмонелл в РА, т.к. препятствует агглютинации бактерий в О-сыворотках.
Vi-антиген термолабилен. Он полностью разрушается при кипячении в течение 10 минут, частично инактивируется при нагревании при 60° С в течение часа и под действием фенола, чувствителен к действию соляной кислоты и этанола. Наиболее полное его развитие у соответствующих се-роваров происходит при температуре 37° С.
Жгутиковые или Н-антигены сальмонелл могут существовать в двух, выявляемых в серологических реакциях, фазах: первой и второй (или «специфической» и «неспецифической»).
Антигенные факторы 1-й фазы обозначаются прописными буквами латинского алфавита, антигены 2-й фазы - арабскими цифрами или прописными буквами латинского алфавита с арабскими цифрами. Сальмонеллы, у которых Н-антиген представлен двумя фазами, называются двухфазными, а имеющие антигенные факторы 1-й фазы-монофазными.
Помимо перечисленных основных антигенов, у сальмонелл обнаружены и другие антигены. Среди них М-антиген (слизистый). Он выявляется у некоторых слизистых штаммов сальмонелл сероваров S. choleraesuis, S. dublin, S. anatum и др. М-антиген кислый полисахарид. Он нерастворим в воде, разрушается под действием кислоты и этанола, обладает слабыми антигенными свойствами.
У ряда сероваров сальмонелл (S. typhimurium, S. choleraesuis,
S. stanley, S. anatum и др.) показано наличие белково-полисахаридного комплекса, отнесенного к К-антигену. Он устойчив к действию кислоты, этанола и обладает выраженными антигенными свойствами.
У сальмонелл имеется несколько видов антигенных вариаций, знание которых необходимо для получения однородных результатов идентификации и правильной их интерпретации.
Н-О-вариации переход из жгутиковой НО-формы в безжгутиковую О-форму. Встречается редко, но такой переход почти всегда необратим. Некоторые серовары сальмонелл (S. gallinarum-pullorum) существуют только в О-форме.
S-R-вариации переход от гладких S-форм к шероховатым
R-формам, сопровождающийся качественными и количественными изменениями О-антигена.
О-вариации количественные изменения О-антигена. Наиболее часто изменениям подвергаются О-антигены 1,6, и 12. Этот тип вариаций антигенов связывают с фаговой конверсией сальмонелл.
V-W-вариации (или Vi-вариации) количественные изменения
Vi-антигена, влияющие на агглютинабельность культур, содержащих этот антиген (V-форма О инагглютинабельна из-за большого количества Vi-антигена, W-форма не содержит Vi-антиген и агглютинируется
О-сыворотками, VW форма является промежуточной, т.е. содержит
Vi-антиген, но является О-агглютинабельной).
Н-вариации качественные изменения жгутиковых антигенов, в результате чего отдельные антигенные комплексы, входящие в 1-ю и 2-ю фазы, могут присутствовать или отсутствовать.
При идентификации сальмонелл следует помнить и то, что они могут иметь общие антигены не только в пределах их отдельных О-групп, но и с представителями других родов семейства энтеробактерий (Escherichia, Shigella, Klebsiella, Citrobacter). Несмотря на мозаичность и вариабельность антигенной структуры сальмонелл, при их серологической идентификации во внимание принимаются лишь два основных антигена (О и Н). Этот принцип положен в основу диагностической антигенной схемы Кауфмана-Уайта. В этой схеме, в соответствии со структурой О-антигенов, сальмонеллы распределены по О-группам с различным числом сероваров, расположенных в пределах этих О-групп в алфавитном порядке в соответствии с обозначением их Н-антигенов 1-й фазы. Фактически схема Кауфмана-Уайта представляет собой каталог антигенов сальмонелл, имеющих первостепенную диагностическую ценность. Краткая схема Кауфмана-Уайта, касающаяся антигенной структуры групп сальмонелл, в которые входят патогенные сероварианты бактерий, представлена в таблице 26.
Таблица 26 - Антигенная структура групп сальмонелл, в которые
входят патогенные для животных сероварианты
(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 1994)
Серовар |
Соматический антиген |
Жгутиковый антиген (Н) |
|
(О) |
фаза 1 |
фаза 2 |
|
Группа А (О2) |
|||
S. paratyphi A |
1,2, 12 |
а |
(1,5) |
S. kiel |
1,2, 12 |
g,р |
- |
Группа В (О4) |
|||
S. kisangani |
1,4, (5), 12 |
а |
1,2 |
S. hessarek |
4,12,27 |
а |
1,5 |
S. fulica |
4,(5), 12 |
а |
1,5 |
S. arechavaleta |
4,(5), 12 |
а |
1,7 |
S. bispebjerg |
1,4,(5), 12 |
а |
e, n, x |
S. abortusequi |
4,12 |
- |
e, n, x |
S. tinda |
1,4, 12,27 |
а |
e, n, Z15 |
S. paratyphi В |
1,4,(5), 12 |
b |
1,2 |
S. Java |
1,4,(5), 12 |
b |
(1,2) |
S. limete |
1,4, 12,27 |
b |
1,5 |
S. сanada |
4,12 |
b |
1,6 |
S. uppsala |
4, 12, 27 |
b |
1,7 |
S. sofia |
1,4, 12,27 |
b |
(e, n, x) |
S. abony |
1,4,(5), 12,27 |
b |
e, n, x |
S. abortusbovis |
1,4, 12,27 |
b |
e, n, x |
S. wagenia |
1,4, 12,27 |
b |
e, n, Zis |
S. schleissheim |
4, 12, 27 |
b |
- |
S. wien |
1,4,12,27 |
b |
1, w |
S. legem |
1,4, 12,27 |
с |
1,5 |
S. abortusovis |
4,12 |
с |
1,6 |
S. altendort |
4, 12, 27 |
с |
1,7 |
S. bury |
4, 12, 27 |
с |
Z6 |
S. stanley |
1,4,(5), 12,27 |
d |
1,2 |
S. schwarzengrund |
1,4, 12,27 |
d |
1,7 |
S. duisburg |
1,4, 12,27 |
d |
e, n, Z15 |
S. salinatis |
4,12 |
d, e, h |
d, e, n, Z15 |
S. saintpaul |
1,4,(5), 12 |
e, h |
1,2 |
S. reading |
1,4,(5), 12 |
e, h |
1,5 |
S. kaapstad |
4,12 |
e, h |
1,7 |
S. сhester |
1,4,(5), 12 |
e, h |
с, n, х |
S. san-diego |
4,(5), 12 |
e,h |
e, n, z15 |
S. derby |
1,4,(5), 12 |
f,g |
(1,2) |
S. agona |
1,4, 12 |
f, g, s |
- |
S. essen |
4,12 |
g, m |
- |
S. caledon |
1,4, 12,27 |
g, m, (s), t |
e, n, x |
S. hato |
4,(5), 12 |
g, m, s |
- |
S. сalifornia |
4, 12 |
g, m, t |
- |
S. kingston |
1,4, (5), 12,27 |
g, s, t |
(1,2) |
S. budapest |
1,4,12,27 |
g,t |
- |
S. banana |
4,(5), 12 |
m, t |
1,5 |
S. typhimurium |
1,4, (5), 12 |
i |
1,2 |
S. lagos |
1,4,(5), 12 |
i |
1,5 |
S. agama |
4, 12 |
i |
1,6 |
S. gloucester |
1,4,12,27 |
i |
1, w |
S. texas |
4, (5), 12 |
к |
e, n, zh |
S. fyris |
4,5, 12 |
l,v |
1,2 |
S. azteca |
4,(5), 12,27 |
1, v |
1,5 |
S. bredency |
1,4,12,27 |
1, v |
1,7 |
S. kimuenza |
1,4, 12,27 |
1, v |
e, n, x |
S. brandenburg |
1,4,12 |
1, v |
1, n, zI5 |
S. togo |
4,12 |
1, w |
1,6 |
S. vora |
1,4, 12,27 |
e, z]3, z28 |
1, П, Zl5 |
S. kunduchi |
1,4,(5), 12, 27 |
e, z13, z28 |
1,2 |
S. heidelberg |
1,4,(5), 12 |
r |
1,2 |
S. bradford |
4, 12, 27 |
r |
1,5 |
S. remo |
1,4,12,27 |
r |
1,7 |
S. southampton |
1,4, 12,27 |
r |
Z6 |
S. africana |
4, 12 |
r, i |
1, w |
S. coeln |
4,(5), 12 |
У |
1,2 |
S. teddington |
1,4,12,27 |
У |
1,7 |
S. ball |
1,4,(5), 12, 27 |
У |
e, n, x |
S. jos |
1,4,12,27 |
У |
e, n, Z15 |
S. shubra |
4,(5), 12 |
z |
1,2 |
S. kiambu |
4,12 |
z |
1,5 |
S. indiana |
1,4,12 |
z |
1,7 |
S. preston |
1,4,12 |
z |
1, w |
S. entebbe |
1,4, 12,27 |
z |
26 |
S. nordenham |
1,4, 12,27 |
z |
e, n, x |
S. Stanleyville |
1,4,(5), 12,27 |
Z4, Z23 |
(1,2) |
S. kalamu |
4,12 |
Z4, Z24 |
(1,5) |
S. haifa |
1,4,(5), 12 |
Z1o |
1,2 |
S. ituri |
1,4,12 |
Z1o |
1,5 |
S. fortune |
1,4, 12,27 |
Z1o |
Z6 |
S. brancaster |
1,4,12,27 |
Z29 |
- |
Группа C1(О6, 7) |
|||
S. san-juan |
6,7 |
a |
1,5 |
S. austin |
6,7 |
a |
1,7 |
S. denver |
6,7 |
a |
e, n, Z15 |
S. brazzaville |
6,7 |
b |
1,2 |
S. edinburg |
6,7 |
b |
1,5 |
S. georgia |
6,7 |
b |
e, n, Z15 |
S. leopoldville |
6,7 |
b |
Z6 |
S. paratyphi С |
6, 7(vi) |
с |
1,5 |
S. choleraesuis |
6,7 |
(с) |
1,5 |
S. typhisuis |
6,7 |
с |
1,5 |
S. birkenhead |
6,7 |
с |
1,6 |
S. isangi |
6,7 |
d |
1,5 |
S. araersfoort |
6,7 |
d |
e, n, x |
S. gombe |
6,7 |
d |
e, n, Z15 |
S. livingstone |
6,7 |
d |
1, w |
S. larochelle |
6,7 |
e,h |
1,2 |
S. lomita |
6,7 |
e, h |
1,5 |
S. norwich |
6,7 |
e,h |
1,6 |
S. braenderup |
6,7 |
e,h |
e, n, zis |
S. montevideo |
6,7 |
g, m, (p), s |
(1,2,7) |
S. menston |
6,7 |
g, s, t |
(1,6) |
S. haelsingborg |
6,7 |
m, p, t, (u) |
- |
S. oranienburg |
6,7 |
m, t |
- |
S. norton |
6,7 |
i |
1, w |
S. thompson |
6,7 |
к |
1,5 |
S. daytona |
6,7 |
к |
1,6 |
S. Singapore |
6,7 |
к |
e, n, x |
S. concord |
6,7 |
1, v |
1,2 |
S. irumu |
6,7 |
l,v |
1,5 |
S. bonn |
6,7 |
1, v |
e, n, x |
S. potsdam |
6,7 |
1, v |
e, n, Z15 |
S. сolorado |
6,7 |
1, w |
1,5 |
S. nessziona |
6,7 |
1, Zu |
1,5 |
S. kcnya |
6,7 |
1, Z13 |
e, n, x |
S. virchow |
6,7 |
r |
1,2 |
S. infantis |
6,7 |
r |
1,5 |
S. nigeria |
6,7 |
r |
1,6 |
S. colindalc |
6,7 |
r |
1,7 |
S. papuana |
6,7 |
r |
e, n, z15 |
S. richmond |
6,7 |
У |
1,2 |
S. bareilly |
6,7 |
У |
1,5 |
S. gatow |
6,7 |
У |
1,7 |
S. mikawasima |
6,7 |
У |
e, n, z15 |
S. tosamanga |
6,7 |
z |
1,5 |
S. eaquatoria |
6,7 |
Z4, Z23 |
e, n, z15 |
S. inganda |
6,7 |
Z l0 |
1,5 |
S. eschwciler |
6,7 |
Zl0 |
1,6 |
S. djugu |
6,7 |
Zl0 |
e, n, x |
S.tennessee |
6,7 |
Z29 |
- |
S. arizonae |
6,7 |
- |
1,6 |
Группа C2(06, 8) |
|||
S. curacao |
6,8 |
a |
1,6 |
S. nordufer |
6,8 |
a |
1,7 |
S. narashino |
6,8 |
a |
e, n, x |
S. nagoya |
6,8 |
b |
1,5 |
S. gatuni |
6,8 |
b |
e, n, x |
S. banalia |
6,8 |
b |
Z6 |
S. wingrove |
6,8 |
с |
1,2 |
S. Utah |
6,8 |
с |
1,5 |
S. bronx |
6,8 |
с |
1,6 |
S. belem |
6,8 |
с |
e, n, x |
S. mucnchen |
6,8 |
d |
1,2 |
S. manhattan |
6,8 |
d |
1,5 |
S. stcrrenbos |
6,8 |
d |
e, n, x |
S. herston |
6,8 |
d |
e, n, Z15 |
S. ncwport |
6,8 |
e, h |
1,2 |
S. kottbus |
6,8 |
e, h |
1,5 |
S. tshiongwe |
6,8 |
e,h |
e, n, z,5 |
S. sandow |
6,8 |
f,g |
e, n, Z15 |
S.chincol |
6,8 |
g, m, s |
(e, n, x) |
S. baragwanath |
6,8 |
m, t |
1,5 |
S. germiston |
6,8 |
m, t |
e, n, x |
S. lindenburg |
6,8 |
i |
1,2 |
S. takoradi |
6,8 |
i |
1,5 |
S. bonariensis |
6,8 |
i |
e, n, x |
S. aba |
6,8 |
i |
e, n, z15 |
S. blockley |
6,8 |
к |
1,5 |
S. charlottenburg |
6,8 |
к |
e, n, Z15 |
S. litchfield |
6,8 |
1, v |
1,2 |
S.loanda |
6,8 |
1, v |
1,5 |
S. manchester |
6,8 |
1, v |
1,7 |
S. edmonton |
6,8 |
1, v |
e, n, Z15 |
S. fayed |
6,8 |
1, w |
1,2 |
S. bovismorbificans |
6,8 |
r |
1,5 |
S. hidalgo |
6,8 |
r |
e, n, Z15 |
S. tananarive |
6,8 |
У |
1,5 |
S. praha |
6,8 |
У |
e, n, zis |
S. kuru |
6,8 |
z |
1, w |
S. chailey |
6,8 |
Z4, Z23 |
e, n, z15 |
S. duesseldorf |
6,8 |
Z4, Z24 |
- |
S. tallahassee |
6,8 |
Z4, Z32 |
- |
S. mapo |
6,8 |
Zl0 |
1,5 |
S. hadar |
6,8 |
Zl0 |
e, n, x |
S. glostrup |
6,8 |
Zl0 |
e, n, z15 |
Группа С3 (08) |
|||
S. shipley |
8,20 |
b |
e, n, z15 |
S. Virginia |
8 |
d |
1,2 |
S. labadi |
8,20 |
d |
Z6 |
S. emek |
8,20 |
g, m, s |
- |
S. kentucky |
8,20 |
i |
Z6 |
S. amherstiana |
8 |
1, v |
1,6 |
S. hindmarsh |
8,20 |
r |
1,5 |
S. altona |
8,20 |
r,(i) |
Z6 |
S. alagbon |
8 |
У |
1,7 |
S. corvallis |
8,20 |
Z4, Z23 |
(Z6) |
S. albany |
8,20 |
Z4, Z24 |
- |
S. molade |
8,20 |
Zl0 |
Z6 |
S. tamale |
8,20 |
Z29 |
(e, n, z15) |
Группа С4 (О6, 7,14) |
|||
S. kaduna |
6, 7, 14 |
с |
(c, n, z15) |
S. eimsbuettcl |
6,7, 14 |
d |
1, w |
S. gclsenkirchen |
6, 7, 14 |
1, v |
Z6 |
Группа D1 (09,12) |
|||
S. sendai |
1,9, 12 |
a |
1,5 |
S. miami |
1,9, 12 |
a |
1,5 |
S. onarimon |
1,9, 12 |
b |
1,2 |
S. frintrop |
1,9, 12 |
b |
1,5 |
S. alabama |
9, 12 |
с |
c, n, Z15 |
S. typhi |
9, 12, (vi) |
d |
- |
S. ndolo |
9, 12 |
d |
1,5 |
S. eastbourne |
1,9, 12 |
e, h |
1,5 |
S. berta |
1,9, 12 |
f,g,t |
- |
S. entcritidis |
1,9, 12 |
g, m |
(1,7) |
S. blcgdam |
1,9, 12 |
g, m, q |
- |
S. dublin |
1,9, 12, (vi) |
g,P |
- |
S. rostock |
1,9, 12 |
g,P, " |
- |
S. moscow |
9, 12 |
g, q |
- |
S. pcnsacola |
1,9, 12 |
m, t |
- |
S. seremban |
9, 12 |
i |
1,5 |
S. claibornei |
1,9, 12 |
к |
1,5 |
S. mcndoza |
1,9, 12 |
1, v |
1,2 |
S. panama |
1,9, 12 |
1, v |
1,5 |
S. kapemba |
9,12 |
1, v |
1,7 |
S. daressalaam |
1,9,12 |
1, w |
e, n, x |
S. javiana . |
1,9, 12 |
1, Z28 |
1,5 |
S. Jamaica |
9, 12 |
r |
1,5 |
S. lawndale |
1,9, 12 |
Z |
1,5 |
S. angola |
1,9, 12 |
Z |
Z6 |
S. wangata |
1,9, 12 |
Z4, Z23 |
(1,7) |
S. portland |
9, 12 |
Zl0 |
1,5 |
S. gallinarum (pullorum) |
1,9, 12 |
- |
- |
Группа D2 (09,46) |
|||
S. baildon |
9, 46 |
a |
e, n, x |
S. wcrnigerode |
9, 46 |
f,g |
- |
S. adabraka |
3, 10 |
Z4, Z23 |
1,7 |
S. okerara |
3, 10 |
Zl0 |
1,2 |
S. lexington |
3, 10 |
Z l0 |
1,5 |
S. coquilhatville |
3, 10 |
Z l0 |
1,7 |
S. kristianstad |
3, 10 |
Z l0 |
e, n, Z15 |
Примечание: в скобки взяты антигенные фазы, имеющиеся непостоянно.
Для серологической идентификации с целью окончательного установления родовой принадлежности и определения сероварианта используют чистые культуры бактерий, отнесенные по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам к роду сальмонелл. Для этих целей биопромышленностью выпускаются наборы сывороток сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих для экспресс-идентификации сальмонелл в РА на стекле. Эти наборы позволяют определить родовую и серовариантную принадлежность 33 групп сальмонелл, наиболее часто выделяемых от животных, из продуктов животного происхождения и объектов внешней среды.
Таблица 27 - Состав наборов сывороток сальмонеллезных
О-комплексных и монорецепторных О- и Н-агглютинирующих для идентификации сальмонелл в РА на стекле
Набор № 1 |
Набор № 2 |
|||
Номер О- комплекепых сывороток |
Реценторный состав комплексных сывороток |
Монорецепторные сыворотки |
||
О |
Н |
|||
I фаза |
II фаза |
|||
1 |
4,7,8,9,10,15,19 |
6 |
i m |
e, n, x |
2 |
4,11,16,17,18,21,28 |
14 |
c t |
2 |
3 |
7,11,30,35,38,39,40 |
46 |
r р |
5 |
4 |
8,16,30,41,42,43,44 |
34 |
e h |
6 |
5 |
9,17,35,41,45,47,48 |
20 |
l v |
(1,2,5,6) |
6 |
10,18,38,42,45,50,52 |
d |
||
7 |
15,21,39,43,47,50,53 |
b |
||
8 |
19,23,40,44,48,52,53 |
g |
Сыворотки выпускают двумя наборами. В набор № 1 входят О-комплексные сыворотки № 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. В набор № 2 входят О- и Н-монорецепторные сыворотки.
Таблица 28 - Серогрупповая принадлежность сальмонелл по
результатам РА
Агглютинируется комплексными сыворотками |
Содержит О-антиген |
Относится к серогруппе |
1 и 2 |
04 |
В |
1 и 3 |
07 |
С1 или С4 |
1 и 4 |
08 |
С2или Сз |
1 и 5 |
09 |
D1 или D2 |
1 и б |
010 |
Е, |
1 и 7 |
015 |
Е2 или Е3 |
1и 8 |
019 |
Е4 |
2 и 3 |
011 |
F |
2 и 4 |
016 |
I |
2 и 5 |
017 |
J |
2 и 6 |
018 |
К |
2 и 7 |
021 |
L |
2 и 8 |
028 |
М |
3 и 4 |
030 |
N |
3 и 5 |
035 |
О |
3 и 6 |
038 |
Р |
3 и 7 |
039 |
Q |
3 и 8 |
040 |
R |
4 и 5 |
041 |
S |
4 и 6 |
042 |
Т |
4 и 7 |
043 |
U |
4 и 8 |
044 |
V |
5 и 6 |
045 |
W |
5 и 7 |
047 |
X |
5 и 8 |
048 |
Y |
6 и 7 |
050 |
Z |
6 и 8 |
052 |
52 |
7 и 8 |
053 |
53 |
в популяции особей с преимущественным содержанием какой-либо одной фазы, с отсутствием 1-й фазы Н-антигена (S. choleraesuis v. Kunzendorfw др.) или полным отсутствием Н-антигена (S. gallinarum-pulloruin). Для выявления искомой фазы Н-антигена используют феномен роения по Гарду. В чашки Петри разливают 0,8-1%-ный МПА или агар Хоттингера. Застывший агар подсушивают в течение 15-20 мин в термостате при 37° С. В центр чашки Петри на агар наносят 1-2 капли сыворотки, соответствующей выявленной фазе Н-антигена. После того как сыворотка впитается в агар, на то же место петлей наносят испытуемую культуру (18-часового роста на скошенном агаре) на площадь диаметром 3-4 мм. Чашки инкубируют при 37° С в течение 18-20 часов.
Таблица 29 - Дифференциация сальмонелл серогрупп
С1 от С4; С2 от С3; D1 от D2; E2 от Е3
Дифференцируемые |
Реакция с сывороткой |
Результат |
Серогрупповая принадлежность |
С1 и С4 |
014 |
- |
С1 |
+ |
С4 |
||
С2 и С3 |
06 |
- |
С3 |
+ |
С2 |
||
020 |
- |
С2 |
|
+ |
С3 |
||
D1 и D2 |
046 |
- |
D1 |
+ |
D2 |
||
Е2 и Е3 |
034 |
- |
Е2 |
+ |
Е3 |
Данный прием приводит к тому, что распространение бактерий, богатых Н-антигеном выявленной фазы, будет угнетено соответствующей сывороткой, в то время как особи бактерий, содержащие преимущественно другую фазу, будут распространяться на поверхности неплотного агара, образуя макроколонию. С края такой макроколонии берут культуру и испытывают ее в реакции агглютинации на стекле с соответствующими моно-рецепторными Н-сыворотками.
Для выявления искомой фазы Н-антигена можно использовать также U-образную трубочку Хайна, заполненную полужидким (0,2-
0,4%-ным) агаром, смешанным с Н-сывороткой к антигену подавляемой фазы или без сыворотки. Во втором случае культуру засевают в одно колено трубочки, при этом наличие роста в противоположном (от посева) колене трубочки будет обусловлено подвижными особями.
В некоторых случаях для точного определения сероварианта необходимо обязательное определение дополнительных биохимических свойств выделенной культуры в связи с тем, что отдельные из сероваров имеют идентичную антигенную структуру и различаются только по ферментативным свойствам (табл. 30).
Таблица 30 - Характеристика биохимических и серологических
свойств некоторых сальмонелл
Серовар |
Антигенная структура |
Биохимические свойства |
S. paratyphi В |
1,4,5,12:b:l,2 |
Ацетат - |
S. java |
l,4,5,12:b:l,2 |
D-тартрат - |
Ацетат + |
||
D-тартрат + |
||
S. choleraesuis |
6,7:c:l,5 |
Арабиноза - |
Трегалоза - |
||
D-тартрат + |
||
S. typhisuis |
6,7:c:l,5 |
Арабиноза + |
Трегалоза + |
||
D-тартрат - |
||
S. mission |
6,7:d:l,5 |
Инозит - |
S. isagni |
6,7:d:l,5 |
Инозит + |
S. enteritidis var. jena |
1,9,12: gm:- |
Глицерин (бульон Штерна) + |
S. enteritidis var. ratin |
1,9,12: gm:- |
Глицерин (бульон Штерна) - |
S. gallinarum |
1,9,12:-:- |
Орнитин- |
Дульцит + |
||
Глюкоза (газ) - |
||
S. pullorum |
1,9,12: -: - |
Орнитин + |
Дульцит - |
||
Глюкоза (газ) - |
Сероварианты сальмонелл, наиболее часто выделяемые от различных животных и из продуктов животного происхождения, приведены в таблице 31.
Выявление сальмонелл прямым методом иммунофлуоресценции. Выявление в патологическом материале и в мясе сальмонелл, входящих в серологические группы В, С1 С2, D1 и Е1, возможно прямым методом иммунофлуюоресценции с помощью комплексной и групповых сальмонеллезных флуоресцирующих сывороток.
Комплексная сыворотка предназначена для выявления сальмонелл, входящих в любую из серогрупп В, С1 С2, Dl или Е1. Групповые адсорбированные сыворотки используют для определения принадлежности обнаруженных сальмонелл к одной из указанных групп.
Из типичных для сальмонелл колоний, выращенных на плотных средах, либо непосредственно из патологического материала или мяса готовят мазки (мазки-отпечатки) на тщательно обезжиренных предметных стеклах с таким расчетом, чтобы в поле зрения микроскопа было около 100 клеток.
Таблица 31 - Сальмонеллы, наиболее часто выделяемые от
животных и из продуктов животного происхождения
Виды животных |
Сероварианты сальмонелл |
Крупный рогатый скот |
S. dublin, S. typhimurium, S. abortus bovis, S. enteritidis S. enteritidis |
Свиньи |
S. choleraesuis, S. typhisuis, S. typhimurium, S. enteritidis, S. dublin, S. brandenburg, S. oranienburg, S. muenster |
Мелкий рогатый скот |
S. abortus ovis, S. typhimurium, S. paratyphi A, S. dublin |
Лошади |
S. abortus equi, S. typhimurium, S. dublin |
Птицы |
S. gallinarum, S. pullorum, S. typhimurium |
Дикие теплокровные животные, в т.ч.: грызуны; рептилии |
S. typhimurium, S. enteritidis S. arizonae |
Продукты животного происхождения |
S. typhimurium, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum, S. choleraesuis, S. derby, S. infantis, S. agona, S. panama, S. enteritidis, S. heidelberg |
Мазки фиксируют метиловым спиртом (5 мин) или этиловым спиртом (15 мин) и высушивают.
Сухие препараты помещают строго горизонтально на мостики во влажной камере (чашка Петри) для предупреждения высыхания сыворотки.
Сухие сыворотки в ампулах разводят стерильным физиологическим раствором рН 7,4 до указанного на этикетке первоначального объема, а затем дополнительно до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы.
На каждый мазок наносят 2 капли подготовленной таким образом сыворотки и распределяют ее по всей поверхности мазка. Окрашивание препарата осуществляют 15-20 минут при комнатной температуре или в термостате при 37° С. Для лучшего окрашивания препараты каждые 5-
7 минут слегка покачивают.
Препараты промывают физиологическим раствором рН 7,4 в течение 5 минут, заменяя раствор за это время 4-5 раз. Отмытые препараты дополнительно отмывают дистиллированной водой и подсушивают.
После этого на мазок наносят небольшую каплю смеси, состоящей из 9 частей глицерина и одной части 0,2 М фосфатного буфера рН 8,0 и накрывают покровным стеклом. Для иммерсии используют не флуоресцирующее масло или его заменитель, приготовленный из чистого диметилфталата (100 мл) и нафталина сублимированного (1,75 г) или тимола чистого (5 г). Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом при увеличении 5x90 и силе тока 4,1 А.
Окрашенные флуоресцирующей сывороткой сальмонеллы имеют светящийся периферический контур (ободок). Это характерное свечение контура визуально оценивается в крестах: (++++) сияющее зеленовато-желтое свечение; (+++) яркое желтовато-зеленоватое свечение; (++) умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение отчетливо заметного контура; (+) слабое беловатое свечение различимого контура; (-) клетки в виде сероватых теней, контур отсутствует или слабо заметен на отдельных участках периферии клеток.
Положительным результатом считается свечение типичных для сальмонелл форм, оцениваемое не ниже чем в два креста, при условии, что в контрольных препаратах, окрашенных рабочим разведением гетерологичной сыворотки, оно оценивается отрицательно. Собственное бесконтурное свечение некоторых бактерий всегда оценивается отрицательно, хотя оно иногда хорошо выражено.
Для проведения исследования патологического материала и мяса готовят несколько комплектов отпечатков на стекле. После фиксирования один комплект отпечатков окрашивают комплексной флуоресцирующей сальмонеллезной сывороткой и проводят флуоресцентную микроскопию.
Если сальмонеллы будут обнаружены хотя бы в одном из препаратов, устанавливают их принадлежность к той или иной группе. С этой целью окрашивают другие комплекты препаратов, используя раздельно, и прежде всего те О-сыворотки, которые соответствуют сальмонеллам, наиболее часто выявляемым у животных данного вида
Выявление сальмонелл серогрупп В, C1, С2, Д, Е экспрессным методом в реакции коагглютинации. С этой целью используют набор сальмонеллезных диагностикумов серогрупп В, С1, С2, Д, Е для реакции коагглютинации.
Для постановки реакции исследуемый материал подращивают в жидкой питательной среде (селенитовый бульон, МПБ) в течение 12-18 часов при 37° С. После подращивания культуральную среду (2-3 см3) прогревают в водяной бане при 100° С в течение 30 мин, при необходимости центрифугируют или фильтруют, чтобы получить прозрачный раствор. Приготовленный таким образом материал можно хранить при 4-6° С не более 7-10 суток, в замороженном состоянии неограниченное время.
Сухие диагностикумы разводят дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке.
На предметное стекло, размеченное на сектора, наносят 6 отдельных капель исследуемой пробы, затем в первые 5 капель добавляют по 1 капле соответствующего диагностикума, а в последнюю 1 каплю несенсиби-лизированного стафилококка (1%-ная взвесь стафилококка Cowan 1 для отрицательного контроля, который ставится с каждой пробой исследуемого материала). Кроме того, контролем служат: капля каждого диагностикума, смешанная с каплей фосфатно-солевого буфера или физиологического раствора (контроль диагностикумов на гомогенность) на отдельном стекле (ставится один раз в день постановки реакции); капля диагностикума с каплей гомологичного антигена, прилагаемого к набору (положительный контроль) на отдельном стекле (ставится по мере необходимости).
Капли перемешивают осторожным покачиванием стекла, не допуская их слияния, стекло помещают во влажную камеру на 30 мин при комнатной температуре.
Результат реакции коагглютинации учитывают через 30 мин при просмотре стекол над вогнутым зеркалом, регистрируя появление агтлютинации стафилококков.
Положительной реакцией считается появление хлопьев агглютинированных стафилококков в одной из капель с каким-либо диагностикумом при сохранении гомогенности контрольных капель и наличии положительных реакций диагностикумов с гомологичными антигенами.
Интенсивность агглютинации оценивают в крестах:
«++++» все стафилококки склеены и легко скатываются к краю капли при наклоне стекла, жидкость просветлена;
«+++» склеена большая часть стафилококков, частичное просветление жидкости;
«++» на фоне слабого просветления жидкости четко виден агглютинат; «+» мелкие легкие хлопья, жидкость остается непросветленной;
«-» признаков агглютинации нет, взвесь стафилококков гомогенна, сходна с отрицательным контролем.