Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
21
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
УДК 626.2:577.121:591.3:577.118
АНТИОКСИДАНТНА СИСТЕМА МІКРООРГАНІЗМІВ РУБЦЯ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ І РОЛЬ МІНЕРАЛЬНИХ ЕЛЕМЕНТІВ У ЇЇ РЕГУЛЯЦІЇ
03.00.04 —біохімія
А в т о р е ф е р а т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів — 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.
|
Науковий керівник — |
доктор біологічних наук, професор Сологуб Леонід Ілліч, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії обміну речовин |
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Янович Вадим Георгійович
Інститут біології тварин УААН,
головний науковий співробітник лабораторії
живлення великої рогатої худоби
доктор біологічних наук, професор
Столяр Оксана Борисівна
професор кафедри хімії
Захист відбудеться « 19 » червня 2008 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.
Автореферат розісланий « 17 » травня 2008 р.
Актуальність теми. Ефективність використання поживних речовин корму і продуктивність жуйних тварин, у тому числі великої рогатої худоби, залежить від життєдіяльності мікроорганізмів рубця. Вони у процесах росту використовують продукти розщеплення складних вуглеводів, протеїну і ліпідів корму. За рахунок білка мікроорганізмів (бактерій, інфузорій, грибів), маса яких у рубці великої рогатої худоби досягає 6–7 кг, 50–90 % забезпечується потреба в амінокислотах (Stewart C. S., Bryant M. P., 1988; Mackie R. I., White B. A., 1990; Янович В. Г., Сологуб Л. І., 2000). У процесі росту мікроорганізми рубця використовують як джерело енергії утворювані від розщеплення вуглеводів (крохмалю, целюлози, геміцелюлози, пектину) цукри, з яких у результаті ферментації утворюються коротколанцюгові жирні кислоти, за рахунок котрих забезпечується 60–70 % потреби великої рогатої худоби в енергії (Martin S. A., Russell J. B., 1988; Baldwin R. L., Donavan K. C., 1998; Янович В. Г., Сологуб Л. І., 2000).
В останні роки встановлено, що в процесі метаболізму у клітинах деяких мікроорганізмів рубця утворюються активні форми кисню (АФК) (Образцова А. Я. зі співавторами, 1984; Shima S. et al., 1999, 2001; Brioukhanov A. et al., 2000; Holovska K. et al., 2002), котрі негативно впливають на їх життєдіяльність. Утворення АФК у клітині відбувається шляхом ланцюгової реакції, яка розпочинається утворенням супероксидного аніону (О2), і завершується утворенням гідропероксиду водню (Н2О2). При наявності іонів металів з змінною валентністю, таких як залізо або мідь, пероксид водню може утворювати одну з найбільш реакційних і токсичних форм кисню — гідроксильний радикал ОH¯ ( Rosen et al.,1995).
Захист клітин від деструктивної дії АФК забезпечують антиоксидантні ферменти: супероксиддисмутаза, глутатіонпероксидаза, каталаза (Fulghum R. S., Wortington J. M., 1984; Jennet E. E. et al., 1999; Weydert C. et al., 2003). На активність антиоксидантної системи в організмі вищих тварин впливають деякі вітаміни (А, Е, С) і каротиноїди (Halliwel B. еt аl., 1989; Stadtman T., 1990; Снітинський В. В., Антоняк Г. Л., 1994; Sies Н., 1997), а також мікроелементи. Окремі з них входять до складу антиоксидантних ферментів. Зокрема, у структурі супероксиддисмутази виявлено Mn (ІІ) (Keele B. B. et al., 1970), Fe (ІІІ) (Yost F. J. et al., 1973; Tannich F. et al., 1973), Ni (ІІ) (Youn et al., 1996); Cu (ІІ)+ Zn (ІІ) (McCord J. M., Fridovich I., 1969), завдяки чому вони здатні впливати на активність цього ферменту.
У клітинах деяких мікроорганізмів виявлені антиоксидантні ферменти — супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіонпероксидаза (Hassan Н. М., Fridovich. І., 1978; Fulghum R. S., Wortington J. M., 1984), що свідчить про функціонування у них механізмів антиоксидантного захисту. Проте даних щодо наявності антиоксидантних ферментів у мікроорганізмів (бактерій і інфузорій) рубця жуйних тварин, а також впливу на їх активність мікроелементів у літературі мало, а в Україні розробляються вперше.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом теми лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН «Дослідити механізми впливу деяких макро- і мікроелементів на метаболізм в організмі жуйних тварин, ріст популяції симбіотичних мікроорганізмів у передшлунках, з продуктивність тварини–господаря та внести корективи у мінеральне живлення молодняку великої рогатої худоби», (шифр 01.01., №, ДР 0101U003434,), де дисертант досліджував in vitro кількість продуктів ПОЛ і активність антиоксидантних ферментів у бактерій і інфузорій рубця телят та впливу на них добавок до інкубаційного середовища вітаміну Е, селену та деяких мікроелементів.
Мета і завдання досліджень. Метою дисертаційної роботи було з’ясувати стан системи антиоксидантного захисту (рівень активності антиоксидантних ферментів, продуктів перекисного окиснення ліпідів у бактерій і інфузорій, виділених з вмісту рубця телят 6-місячного віку та впливу на них добавок до їх інкубаційного середовища вітаміну Е, селену, деяких модуляторів, макро- і мікроелементів.
У завдання дисертаційної роботи входили дослідження:
1) вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) (гідропероксидів ліпідів, малонового діальдегіду) і активності антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази) у змішаній популяції бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби в умовах in vitro;
2) впливу вітаміну Е і селеніту натрію на кількість продуктів ПОЛ і активність антиоксидантних ферментів у змішаній популяції бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби in vitro;
3) впливу макроелементів сірки (Na2S і Na2SO4) і мікроелементів хрому (CrCl3 і Na2CrO4) , нікелю (NiCl2), марганцю (MnCl2), селену ( Na2SeO3), цинку (ZnCl2), заліза (FeCl3) при додаванні їх до інкубаційного середовища на вміст названих вище продуктів ПОЛ і активність антиоксидантних ферментів у клітинах бактерій і інфузорій;
4) впливу добавок вітаміну Е, селену, деяких мікроелементів на життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби — вміст загального білка, білка бактерій і інфузорій, аміаку, ЛЖК, протеолітичну, целюлолітичну, амілолітичну активності в інкубаційному середовищі;
5) впливу деяких модуляторів (перекис водню, азид натрію, гемін) та мікроелементів (Cu2+, Zn2+, Fe2+, Ni2+, Mn2+, SeO32–-, CrO42–-, Cd2+) на активність супероксиддисмутази і каталази у бактерій і інфузорій рубця;
6) властивостей каталази бактерій рубця та впливу на її активність ряду мікроелементів (цинку, нікелю, заліза, хрому, селену, кадмію) в умовах in vitro.
Об’єкт досліджень: система антиоксидантного захисту змішаної популяції бактерій і інфузорій вмісту рубця великої рогатої худоби, вплив на її активність вітаміну Е, селену, деяких модуляторів, макро–і мікроелементів за умов in vitro.
Предмет досліджень: мікрофлора рубця, рівень продуктів ПОЛ і ферменти антиоксидантного захисту бактерій і інфузорій рубця телят, продукти їх життєздатності у середовищі рубця за умов інкубації in vitro.
Методи досліджень: мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні, хірургічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено високий вміст продуктів ПОЛ та високу активність антиоксидантної системи їх захисту (супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази) у клітинах змішаної популяції бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби.
Встановлено інгібуючий вплив на перекисне окиснення ліпідів і стимулювальний вплив на активність антиоксидантної системи в клітинах бактерій та інфузорій при додаванні до інкубаційного середовища вітаміну Е і селену. Доведено також, що внесення в інкубаційне середовище S (ІІ), Cr (ІІІ), Zn (ІІ), Ni (ІІ), Fe (ІІІ) і Mn (ІІ) проявляє інгібуючий, а добавка S (VІ) і Cr (VІ) — стимулювальний вплив на перекисне окиснення в клітинах бактерій. При додаванні до інкубаційного середовища вказаних мінеральних елементів зміни продуктів ПОЛ у клітинах інфузорій були менш вираженими, ніж у бактерій.
При додаванні до інкубаційного середовища S (VI) і Cr (VI), а також солей цинку, нікелю, заліза і марганцю, активність супероксиддисмутази у клітинах бактерій і інфузорій вірогідно зростала. Внесення в інкубаційне середовище Cr (III), солей цинку і марганцю призводить до підвищення активності каталази, а додавання S (II) — до зниження активності цього ферменту в клітинах бактерій і інфузорій. Внесення S (II), цинку і заліза підвищує активність глутатіонпероксидази у клітинах бактерій, а S (VI), цинку, нікелю, марганцю — у клітинах інфузорій.
У змішаній фракції мікроорганізмів рубця виявлено й очищено каталазу. Встановлено активуючий вплив на активність цього ферменту добавки до субстрату цинку, нікелю, заліза, хрому та інгібуючий вплив —кадмію, селену, цистеїну й азиду натрію.
Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень вперше показали наявність у мікроорганізмів рубця —бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби антиоксидантної системи їх захисту від токсичної дії кисню. Виявлено зміни в активності антиоксидантних ферментів у бактерій і інфузорій у процесі 24-годинної інкубації та вплив на їх рівень і життєздатність добавок до середовища деяких вітамінів і мінеральних речовин.
Одержані дані можуть бути використані при розробці складу БМВД як добавку до раціону з метою попередження шкідливої дії АФК на бактерії й інфузорії рубця телят у ранньому віці.
Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто брав участь у підборі піддослідних тварин, у накладанні на рубець фістул, у відборі зразків вмісту та його фракціонуванні та у проведенні в них в лабораторних умовах передбачених програмою біохімічних досліджень. Освоїв і використав у дослідах сучасні методи визначення рівня продуктів ПОЛ, ферментів антиоксидантного захисту, впливу на життєдіяльність бактерій і інфузорій добавок до інкубаційного середовища антиоксидантних сполук — вітаміну Е та деяких мікроелементів. Підібрано і опрацьовано з напрямку досліджень наукові повідомлення. Концепцію дисертаційної роботи, аналіз і обговорення результатів досліджень проведено за участю наукового керівника, головного наукового співробітника лабораторії обміну речовин Інституту
|
Сологуба Л. І. |
біології тварин УААН, доктора біологічних наук, професора
Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на VШ Українському біохімічному з’їзді, м.Чернівці, 1-3.10.2002; на конференції пам’яті професора І.В.Шостаківської, Львівський державний університет ім. І.Франка, 2002; на конференції "Стан та розвиток агро-промислового виробництва в межах Європейського регіону Верхній Прут", 8-10.10.2003; на ІX Українському біохімічному з’їзді, м. Харків, 24-27 жовтня 2006; на координаційній конференції, м. Чернігів, 3-7. 10. 2007; на щорічних науково–практичних конференціях молодих вчених Інституту біології тварин УААН, 2003-2007; на звітних сесіях науковців Інституту біології тварин УААН, 2003-2007 роки.
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 11 наукових статей, з них 5 у фахових виданнях та 3 тези у матеріалах конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали, методи, результати досліджень, аналіз і узагальнення їх результатів, висновки та список використаних наукових джерел. Дисертацію викладено на 158 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 27 рисунками (12 сторінок) та 20 цифровими таблицями (16 сторінок). Список літератури включає 306 найменувань, із них 254 іноземних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді висвітлено і проаналізовано наявні в літературі дані про кількісний склад і класифікацію мікроорганізмів рубця жуйних, їх участь у процесах травлення і перетворення поживних речовин корму. Розглянуто біохімічні механізми системи антиоксидантного захисту в організмі вищих тварин і клітинах мікроорганізмів. Наведено поодинокі наукові повідомлення про утворення активних форм кисню в рубці та про наявність у клітинах мікроорганізмів середовища рубця антиоксидантних ферментів.
МатеріалИ і методи досліджень
Досліди виконано у 2003–рр. на бичках-аналогах чорно-рябої породи 6-місячного віку в дослідному господарстві «Чишки» Інституту біології тварин УААН, яким наклали на рубець хірургічним шляхом фістули. Зразки вмісту рубця від піддослідних тварин брали через фістули з рубця через 2 години після ранкової їх годівлі, фільтрували через 4 шари марлі і шляхом диференційного центрифугування розділяли на фракції бактерій і інфузорій, які використовували в лабораторних дослідженнях. Виконано шість серій досліджень.
Серія 1. Вплив α-токоферолу і Se на перекисні процеси й анти-оксидантний статус бактерій і інфузорій рубця телят. Зразки фракцій мікроорганізмів вмісту рубця переносили в інкубаційні посудини з буферною сумішшю (200 мл / л), яка містила (г / л): K2HPO4 —,0; KH2PO4 — 4,0; NaCl —,52; MgSO4 —,070; CaCl2 — 0,035; NaHCO3 — 5,9; цистеїн хлориду — 0,174. Після змішування 50 мл цієї суміші вносили в 120 мілілітрові пляшки і додавали в кожну окремо і разом 1,0 мг α —токоферолу, Na2SeO3 (1 мМ). Джерелом азоту в середовищі служила сечовина (30 мМ), джерелом енергії — глюкоза (30 мМ). Пляшки закривали корками, продували СО2 і інкубували протягом 24 годин при температурі 38 С. Контролем служили зразки, в які не додавалися досліджувані сполуки. Після закінчення інкубації відбирали зразки рідини і газу для досліджень.
У зразках рідини після інкубації визначали вміст гідропероксидів ліпідів (ГПЛ) (Мирончик В. В., 1982; Коробейникова С. Н., 1989), малонового діальдегіду (МДА) (Тимирбулатов Р. А., Селезнева Е. И. , 1981), а також активність супероксиддисмутази (КФ 1.15.1.1.) (Дубинина Е. Е., 1988), каталази (КФ 1.11.І.6) (Королюк М. А. зі співавт., 1988), глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) (Моин В. М., 1986), глутатіонредуктази (ГР) (Коробейникова С. Н., 1989) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г––ФД) (Чевари С. зі співавт., 1991).
Серія 2. Вплив мінеральних елементів на перекисне окиснення ліпідів і активність антиоксидантних ферментів у бактерій і інфузорій рубця телят. Матеріал для досліджень обробляли як у попередній серії досліджень. До інкубаційного середовища додавали окремо Na2S, Na2SO4, Na2CrO4, CrCl3, ZnCl2, NiCl2, MnCl2, FeCl3, CoCl2, CaCl2 (по 10 мМ). Контролем служили зразки, в які не додавалися досліджувані солі мінеральних речовин. Після інкубації у зразках визначали вміст продуктів ПОЛ та ферментів антиоксидантного захисту за методиками, наведеними у попередній серії досліджень.
Серія 3. Вплив вітаміну Е, селену, деяких мікроелементів на життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби.
Первинну обробку матеріалу проводили як у попередніх серіях дослід–жень. У зразках бактерій і інфузорій визначали вміст білка мікроорганізмів (Lowry O.H. et. al., 1951), аміаку (Курилов Н.В., Радченкова Т.А, 1970), загальну кількість летких жирних кислот і окремо ацетату, пропіонату і бутирату після хроматографічного розділення (Кроткова А.П., Митин Н.И., 1957) та молочної кислоти (Barker J.B., Summerson W.H., 1941), а також протеолітичну (Аитов А.Ю., Газдаров В.М.., 1978), целюлолітичну і амілолітичну (Кротова А.П., Митин Н.И.,1957) активності. У зразках газової фракції визначали кількість СН4 на газовому хроматорафі.
Серія 4. Вплив деяких модуляторів на активність супероксид-дисмутази і каталази мікроорганізмів рубця телят. Рідину рубця інкубували за описаним вище способом. Визначали вплив добавок до інкубаційного середовища геміну як активатора каталази (30 мкМ), азиду натрію як інгібітора каталази (1 мкМ), перексиду водню як інгібітора СОД, іонів Mn2+, Zn2+, Ni2+ як компонентів пероксиду, а також мікроелементів Fe3+, Cu2+, Cd2+, Cr3+ (по 1 мМ) на активність СОД (Дубинина Е. Е., 1988) і каталази (Королюк М.А. зі співавт., 1988).
Серія 5. Властивості каталази бактерій рубця телят. Для очищення каталази використовували 5 г маси бактеріальної фракції, яку суспензували в 10 мл 50 мM розчину калій фосфату (рН 7,0), руйнували на ультразвуковому дезінтеграторі УП-1 (Selmi) і центрифугували при температурі 4 ºС протягом 30-ти хв. при 2 тис. об/хв. Надосадову рідину солюбілізували 0,1% розчином тритону Х-100 і наносили на колонку (1,5х40 см), наповнену сорбентом Toyopearl HB-55 і зрівноважену 0,025 М тріс-HCl буфером рН 7,0. Елюцію білків проводили цим же буфером. Дальшу очистку каталази проводили на заповненій іонообмінником DEAE-Toyopearl 650 M колонці. У відібраних фракціях визначали активність каталази. В одержаних шляхом іонообмінної хроматографії зразках основної фракції каталази (каталаза 1) визначали активність ферменту при додаванні до інкубату різних її модуляторів: геміну, азиду натрію, пероксиду водню, Mn2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Ni2+, Sе2+, Cr3+, Cd2+. З метою дослідження впливу іонів водню на активність каталази інкубацію проводили з використанням буферних розчинів: у кислій зоні рН (1–) — 0,05М натрій ацетатного, а у нейтральній і лужній зонах рН (7–) — 0,05 М тріс–НСl буферів.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив α-токоферолу і Se на перекисні процеси й антиоксидантний статус бактерій і інфузорій рубця телят в умовах in vitro. Проведені дослідження показали, що клітини бактерій і інфузорій містять продукти ПОЛ, а також ферменти антиоксидантного захисту — супероксиддисмутазу, глутатіонпероксидазу, каталазу (табл. 1). Кількість гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду в клітинах інфузорій значно більша, ніж у клітинах бактерій (р<0,02 i р<0,001 відповідно). Активність супероксиддисмутази у клітинах бактерій і інфузорій приблизно однакова, а активність каталази у перших вірогідно вища (р<0,01). При цьому активність ферментів глутатіонової системи — глутатіонпероксидази і глутатіон-редуктази, а також глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, які забезпечують відновлення глутатіону, в клітинах бактерій набагато нижча у порівнянні з їх активністю в клітинах інфузорій (р<0,01 і р<0,001).
Одержані дані свідчать про те, що в інфузорій глутатіонова система антиоксидантного захисту набагато активніша, ніж у бактерій. У останніх, навпаки, активніша каталаза. Разом з тим рівень активності ферменту, який забезпечує відновлення глутатіону — глутатіонредуктази, а також глюкоз-6-фосфатдегідрогенази, яка продукує NADPH, у клітинах інфузорій значно вищий, ніж у клітинах бактерій.
Вміст гідропероксидів ліпідів у змішаній популяціях бактерій і інфузорій при додаванні до інкубаційного середовища α-токоферолу зменшувався на 40-50 %; рівень малонового діальдегіду у інфузорій знижувався на 28 % (р<0,01), а у бактерій –на 72 % (р<0,001). Активність супероксиддисмутази і каталази при додаванні до інкубаційного середовища вітаміну Е у бактерій зростала відповідно на 25 % (р<0,01) і на 22 % (р<0,05). У інфузорій активність СОД зростала на 37 % (р<0,01), а каталази —на 16 % (р<0,05). З ферментів глутатіонової системи антиоксидантного захисту вірогідні зміни під впливом вітаміну Е виявлені лише в активності глутатіонредуктази, причому у інфузорій її зростання було помітнішим –на 72 % (р<0,001).
Доведено також, що у обох груп мікроорганізмів під впливом селену різко знижується вміст гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду (р<0,001), причому у бактерій воно було вираженішим. При внесенні в інкубаційне середовище селену активність СОД у бактерій і у інфузорій вірогідно зросла відповідно на 30 (р<0,01) і на 22 % (р<0,001). Активність каталази у клітинах бактерій і інфузорій при цьому суттєво не змінювалась.
Вплив селену в поєднанні з вітаміном Е на активність СОД був дещо іншим. Активність СОД у бактерій помітно підвищувалась після внесення у середовище селеніту натрію разом з α–токоферил ацетатом (р<0,001). У інфузорій вона зростала як після додавання до нього селеніту натрію (р<0,05), так і у поєднанні його з вітаміном Е (р<0,01).
Таблиця 1
Вплив селену та вітаміну Е на вміст продуктів ПОЛ і активність антиоксидантних ферментів у клітинах мікроорганізмів рубця (M±m, n=3)
|
Показники |
Контроль |
Селен |
Селен + вітамін Е |
|
Бактерії |
|||
|
ГП ліпідів, Ех1000 |
±11 |
±10*** |
±9*** |
|
МДА, мМ/л |
,8±0,1 |
,9±0,1*** |
,9±0,1*** |
|
СОД, у.о./мг білка |
±2 |
±3** |
±4*** |
|
Каталаза, у.о./мг білка |
±95 |
±98 |
±78** |
|
ГП, нМ GSH/мг.хв. |
1,9±0,1 |
,0±0,1*** |
,5±0,2*** |
|
ГР. нМ NADPH/мг.хв |
,9±0,1 |
,2±0,2*** |
,9±0,1*** |
|
Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа |
,1±1,8 |
,8±0,9 |
,4±1,2 |
|
Інфузорії |
|||
|
ГП ліпідів, Ех1000 |
±15 |
±10*** |
±14*** |
|
МДА, мМ/л |
,6±0,1 |
,7±0,2** |
,7±0,1*** |
|
СОД, у.о./мг білка |
±4 |
±3* |
±3** |
|
Каталаза, у.о./мг білка |
±65 |
±62* |
±59 |
|
ГП, нМ GSH/мг.хв. |
8,5±0,2 |
,5±0,4*** |
,9±0,5*** |
|
ГР. нМ NADPH/мг.хв |
,4±0,1 |
,7±0,2*** |
,3±0,4*** |
|
Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа |
,8±2,2 |
,5±3,9 |
,3±2,5 |
Примітка. У цій та наступних таблицях вірогідність різниць у порівнянні з контролем становить: *р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001.
Встановлено також суттєвий вплив селену на активність глутатіон–пероксидази і глутатіонредуктази в клітинах як бактерій, так і інфузорій. При цьому активність першої у бактерій підвищилась більше ніж в 1,5 раза (р<0,01). Поряд з цим у всіх варіантах досліду активність глутатіонпероксидази в інфузорій була в декілька разів більша, ніж у бактерій. Активність глутатіонредуктази в бактерій під впливом селену зростала на 33 %, а у інфузорій — на 58 % (р<0,001).
Отже, одержані при виконанні цієї серії досліджень результати cвідчать про те, що в клітинах мікроорганізмів рубця функціонує антиоксидантна система. У бактерій основна частина утвореного в супероксиддисмутазній реакції пероксиду водню знешкоджується каталазою, тоді як у клітинах інфузорій активніше функціонує глутатіонова система антиоксидантного захисту. Вітамін Е і селен активують окремі ланки антиоксидантної системи в клітинах мікроорганізмів рубця in vitro.
Вплив мінеральних елементів на перекисні процеси й активність антиоксидантних ферментів у клітинах бактерій і інфузорій рубця телят. Додавання мінеральних елементів проявляє різносторонній вплив як на перекисне окиснення ліпідів, так і на активність антиоксидантних ферментів у бактерій й інфузорій. Цей вплив значною мірою, залежить від ступеня їх окисненості. Так, додавання до інкубаційного середовища аніонів сульфату чи хромату (табл. 2) веде до збільшення кількості гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду в клітинах бактерій (р<0,05–0,001), тоді як після додавання S (II) або Cr (III) вміст продуктів ПОЛ у клітинах мікроорганізмів зменшується (р<0,01–0,001).
Внесення до рідини рубця сполук цинку, нікелю, заліза і марганцю знижувало кількість гідроперокcидів ліпідів і малонового діальдегіду у клітинах бактерій (р<0,01–,001), а добавка Co (II) і Ca (II) суттєво не впли- вала на їх концентрацію.
Дещо інший вплив на вміст гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду проявляють вказані сполуки сірки і у клітинах інфузорій. Додавання до субстрату сульфату підвищувало, а хромату — знижувало вміст обох продуктів ПОЛ. Подібне до бактерій зниження у показниках ПОЛ виявлено в інкубаційному середовищі інфузорій при додаванні до нього S (II), Cr (III) та Mn (II).
Відсутність впливу на продукти ПОЛ у клітинах інфузорій виявлено при додаванні до середовища рубця сполук заліза, кобальту, кальцію і цинку.
З цих даних випливає, що бактерії й інфузорії не однаково реагують на дію мінеральних елементів. Про це свідчить вірогідне зменшення концентрації гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду в клітинах бактерій при додаванні до інкубаційного середовища солей сірки і заліза, а також цинку, нікелю, марганцю (р<0,01). У клітинах інфузорій таке зменшення відсутнє.
Отже, з одержаних in vitro результатів випливає, що ряд досліджуваних мінеральних елементів (цинк, нікель, залізо, марганець) здатні інгібувати процеси перекисного окиснення ліпідів у клітинах бактерій і менше впливати на них у клітинах інфузорій рубця. Виявлений нами інгібуючий вплив вказаних мікроелементів на перекисне окиснення ліпідів у клітинах мікроорганізмів можна частково пояснити їх активуючим впливом на активність антиоксидантних ферментів. Про це свідчить вірогідно вища активність у клітинах бактерій і інфузорій вмісту рубця ферментів супероксиддисмутази і каталази при додаванні до них вказаних мінеральних елементів (табл. 2).
Модулююча дія більшості досліджуваних мінеральних елементів залежить від ступеня їх окиснення. Зокрема, додавання до середовища сірки (VI) підвищує активність, а додавання сірки (II) знижує активність СОД у бактерій і інфузорій рубця. Подібний, залежний від валентності, вплив на активність СОД виявлено при додаванні до cередовища Cr (VI) і Cr (III).
Таблиця 2
Вміст продуктів ПОЛ і активність антиоксидантних ферментів у клітинах бактерій та інфузорій рубця при додаванні до інкубаційного середовища різних мінеральних елементів
(M±m, n=3)
|
Мінеральні елементи |
Гідропероксиди ліпідів, Е х 1000 |
Малоновий діальдегід, мМ/л |
Супероксид-дисмутаза у.о./мг білка |
Каталаза у.о./мг білка |
|
Бактерії |
||||
|
Контроль |
385±11 |
2,8±0,1 |
47±2 |
2540±95 |
|
Na2SO4 |
436±10* |
3,6±0,2* |
68±3*** |
2637±88 |
|
Na2S |
302±15** |
1,9±0,1*** |
33±2** |
2115±94* |
|
CrCl3 |
301±8*** |
1,9±0,1*** |
28±2*** |
2869±98* |
|
Na2CrO4 |
425±8* |
3,4±0,1* |
62±4* |
2628±93 |
|
ZnCl2 |
293±13** |
2,0±0,2** |
59±3* |
3251±134** |
|
NiCl2 |
302±12** |
2,2±0,1** |
65±3* |
2642±88 |
|
FeCl3 |
305±10** |
2,0±0,1*** |
58±2** |
2920±73* |
|
MnCl2 |
300±9** |
2,2±0,1** |
69±3*** |
3295±81** |
|
CoCl2 |
379±15 |
2,5±0,1 |
48±2 |
2504±62 |
|
CaCl2 |
364±12 |
2,9±0,2 |
46±2 |
2652±124 |
|
Інфузорії |
||||
|
Контроль |
528±15 |
3,6±0,1 |
55±4 |
1852±65 |
|
Na2SO4 |
596±13** |
4,7±0,2** |
78±4** |
1976±73 |
|
Na2S |
435±18** |
3,0±0,2* |
40±3* |
1094±34*** |
|
CrCl3 |
364±18*** |
3,6±0,1 |
37±3** |
2430±50** |
|
Na2CrO4 |
364±14*** |
2,0±0,2*** |
64±2 |
1703±48 |
|
ZnCl2 |
492±18 |
4,0±0,2 |
68±4* |
2969±93*** |
|
NiCl2 |
472±16* |
3,9±0,2 |
76±3* |
1543±38** |
|
FeCl3 |
502±15 |
3,0±0,3 |
62±3 |
1927±59 |
|
MnCl2 |
465±12*** |
2,4±0,1*** |
73±3** |
1715±62 |
|
CoCl2 |
517±19 |
3,2±0,1* |
58±4 |
1775±68 |
|
CaCl2 |
542±12 |
4,1±0,2* |
60±3 |
1694±55 |
Активність каталази у бактерій зростала при додаванні до інкубаційного середовища Zn (II), Cr (III), Fe (III), Mn (II), (р<0,05–0,01) та в інфузорій при додаванні Zn (II). Активність каталази у бактерій і інфузорій знижувалась при додаванні до інкубаційного середовища S (II), (р<0,05), а в інфузорій — також Ni (II), (р<0,01). Отже, одержані результати свідчать про неоднаковий вплив дослід–жуваних мінеральних елементів на активність СОД і каталази у бактерій і інфузорій, що можна пояснити відмінностями у їх впливі на окремі ланки їх антиоксидантного захисту.
Становить також зацікавлення наявність обернених зв’язків між змінами у концентрації продуктів ПОЛ і активністю супероксиддисмутази і каталази у бактерій. Зокрема, під впливом цинку, нікелю, заліза, марганцю кількість гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду в них знижувалась, а активність СОД і каталази, навпаки, зростала. При додаванні до інкубаційного середовища S (VI) і Cr (VI) концентрація продуктів ПОЛ і активність СОД у клітинах бактерій зростали, а після внесення S (II) і Cr (III) кількість їх знижувалась (табл. 2). Що стосується інфузорій, то вказані закономірності щодо змін у кількості продуктів ПОЛ і в активності антиоксидантних ферментів у них не виявлено.
Вірогідне підвищення активності глутатіонпероксидази у клітинах бактерій спостерігалося лише при додаванні в інкубаційне середовище S (II), Cr (III), Zn (II) і Fe (III). Дія досліджуваних мінеральних елементів на активність глутатіон-пероксидази у бактерій виражена менше, ніж в інфузорій. Вірогідні різниці в активності глутатіонредуктази виявлені при додаванні до інкубаційного середовища S (II) і S (VI) та Cr (III) і Cr (VI), (р<0,05). Додавання до інкубаційного середовища інших досліджуваних мінеральних елементів суттєво не вплинуло на активність цих ферментів у бактерій.
Що стосується каталази, то вона у бактерій і інфузорій активується іонами Zn (II) і Cr (III), тоді як S (II), навпаки, її інгібує. Аніони S (VI) і Cr (VI) не проявляють помітного впливу на активність каталази у мікроорганізмів рубця. Іони заліза активують каталазу у бактерій і дещо менше в інфузорій, що свідчить про гемову природу цього ферменту. Марганець також активує каталазу в клітинах бактерій, тоді як у клітинах інфузорій вплив цього мікроелемента на її активність відсутній. Виходячи з цього, можна підсумувати, що у бактерій існують гемові біфункціональні і негемові монофункціональні марганець-залежні каталази. В інфузорій останні відсутні.
Властивості каталази бактерій рубця. Відомо, що розклад пероксиду водню, який утворюється у супероксиддисмутазній реакції, до кисню і води в еукаріотичних організмів каталізується двома альтернативними ферментами — каталазою і глутатіонпероксидазою. Глутатіонова система антиоксидантного захисту в мікроорганізмів виражена слабко (Smith J., Shrift A., 1979), а центральне положення у розщепленні Н2O2, що утворюється в результаті відновлення супероксидного радикалу, займає каталаза.
Проведені дослідження показали, що при гельфільтрації центрифугатів клітин бактеріальної фракції рідини рубця виявлено два основних піки каталазної активності серед білків з молекулярною масою близько 200 кДа і 250–300 кДа (рис. 1).
Згідно даних літератури (Shima S., et al., 1999, 2001), молекулярна маса основної форми каталази архебактерій, у тому числі Mеthanosarcina barkeri, становить приблизно 200 кДа. Вона складається з 4-х субодиниць з молекулярною масою близько 54 кДа, що збігається з другим піком активності ферменту.
Рис. 1. Профіль елюції каталази і білків бактеріальної фракції рубця бичків (елюція стандартних білків):
Фракції: № 4 –піруваткіназа (400 кДа), № 12 –лактатдегідрогеназа (150 кДа), № 16 –гексокіназа (90 кДа), № 22 –альбумін крові бика (60 кДа), № 28 –РНКаза (40 кДа), № 34 –інгібітор трипсину із сої (21 кДа), № 40 –інсулін (6 кДа)
Що стосується першого виявленого піку активності каталази серед білків з дещо більшою молекулярною масою (близько 300 кДа), то, правдоподібно, вона властива еубактеріям (Loewen P.C., 2000). У зв’язку з цим наша дальша увага була скерована на вивчення властивостей першого із цих ферментів — каталази архебактерій з молекулярною масою близько 200 кДа.
На рис. 2 представлені результати її дальшої очистки шляхом іонообмінної хроматографії. Встановлено, що каталаза виявляється у двох фракціях, які елюються 0,2 і 0,4 М розчинами NaCl (каталаза 1 і каталаза 2 відповідно).
0,2 М NaCl ,4 М NaCl
Рис.2. Профіль елюції каталази на іонообміннику DEAE Toyopearl 650M. На лінії абсцис відмічені оптимальні концентрації елюції ізоформ ферменту розчином NaCl ( при 0,2М NaCl –каталаза 1, при 0,4 М NaCl –.каталаза 2).
Аналіз результатів очистки показує, що після гельфільтрації вихід ферменту становив 85 %, а після іонообмінної хроматографії при збільшенні активності каталази на одиницю білка у 28 разів кількість ферментного білка зменшилась до 42 % (табл. 3).
|
Фракція |
Білок, мг |
Активність, у.о. |
Специфічна активність, у.о./мг білка |
Очистка, разів |
Вихід ферменту, % |
|
До очистки |
|||||
|
Висолювання % (NH4)2SO4 |
194 |
,55 |
,14 |
||
|
Гель фільтрація |
,95 |
||||
|
Іонообмінна хроматографія |
Показано, що очищена каталаза 1 активується перекисом водню й інгібується азидом натрію. Активаторами каталази є також Zn2+, Ni2+, Fe3+, Fe2+, SO42–, CrO42–, а інгібіторами — Сd2+, SeO32–, цистеїн.
ВИСНОВКИ
Вивчено особливості перекисного окиснення ліпідів та ферментної ланки антиоксидантного захисту в клітинах бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби та роль вітаміну Е та ряду макро- і мікроелементів у її регуляції, проведено часткову очистку каталази з клітин бактерій і досліджено роль деяких мінеральних елементів у регуляції її активності.
1. У клітинах бактерій і інфузорій вмісту рубця великої рогатої худоби виявлені продукти ПОЛ (гідропероксиди ліпідів, малоновий діальдегід) і антиоксидантні ферменти (супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпер-оксидази), рівень яких залежить від вмісту в інкубаційному середовищі вітаміну Е, макро- і мікроелементів.
2. Під впливом вітаміну Е і селену окремо і у їх поєднанні у середовищі бактерій і інфузорій рубця під час інкубації вірогідно зменшується вміст гідропероксидів ліпідів, малонового діальдегіду) і підвищується активність антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутази, каталази) (р<0,05).
3. Додавання до інкубаційного середовища вітаміну Е (0,5 і 1,0 мг) або селену у вигляді селеніту натрію (1,0 мг) позитивно впливає на їх життєдіяльність. Зростає маса інфузорій (р<0,01), підвищується інтенсивність аміакоутворення (р<0,01) і пропіоновокислого бродіння (р<0,05).
. При інкубації фракції бактерій, у середовище якої додавали S (II) і Cr (III), а також солі цинку, нікелю, заліза і марганцю вміст гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду у них вірогідно зменшується (р<0,01), а при додаванні S (VI) і Cr (VI) збільшується (р<0,05). Зміни вмісту продуктів ПОЛ у клітинах –при додаванні до середовища вказаних мінеральних елементів виражені меншою мірою.
5. Після внесення в інкубаційне середовище S (VI) і Cr (VI), а також солей цинку, нікелю, заліза і марганцю у клітинах бактерій і інфузорій вірогідно підвищується активність супероксиддисмутази (р<0,05–,001), а при додаванні Cr (III), солей цинку і марганцю –активність каталази (р<0,05–,01). Під впливом S (II) активність обох ферментів у клітинах цих мікроорганізмів знижується (р<0,05 –,01).
. При додаванні до інкубаційного середовища S (II), Cr (III), цинку і заліза вірогідно підвищується активність глутатіонпероксидази в клітинах бактерій (р<0,05), а при додаванні S (II) і S (VI), Cr (III), Fe (III) і Mn (II) –у клітинах інфузорій (р<0,001).
7. Вірогідні зміни в життєдіяльності бактерій і інфузорій, в інтенсивності і напрямку ферментативних процесів виявлені при додаванні до інкубаційного середовища S (II) і S (VI), Cr (III), Zn (II), Ni (II). Маса бактерій і інфузорій в інкубаційному середовищі зростала (р<0,05–,01), а кількість аміаку зменшувалась (р<0,05). Вплив добавок заліза, марганцю і кобальту на ці процеси був менш вираженим.
. Шляхом висолювання сульфатом амонію, гельфільтрацією і іонообмінною хроматографією проведено часткову (у 28 разів) очистку каталази бактеріальної фракції мікроорганізмів рубця. Встановлено активуючий вплив на активність цього ферменту добавок Zn2+, Ni2+, Fe3+ і Cr3+ та інгібуючий вплив Cd2+, Se4+, цистеїну і азиду натрію.
1. Волторністий А. В. Вплив мінеральних елементів на антиоксидантну систему захисту і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця бичків // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин, Львів. —. — В. 5, №. 1–. —С. 173–. (Дисертантом опубліковані результати експериментальних досліджень по визначенню впливу деяких мінеральних елементів на активність антиоксидантних ферментів і рівень продуктів життєдіяльності мікроорганізмів рубця in vitro).
2. Волторністий А. В., Сологуб Л. І. Особливості регуляції каталазної активності у мікроорганізмів рубця телят // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тваврин і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. —Львів, 2006. —В. 7. № 3, 4. —С. 16-19. (Дисертантом проведено дослідження каталазної активності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби та впливу на її рівень деяких модуляторів і мікроелементів).
3. Вплив деяких мікроелементів на життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят / О. М. Стефанишин, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, А. Д. Гуфрій, Є. О. Дзень, А. В. Волторністий, Р. О. Федяков // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. —Львів, 2006. —В. 7, № 1–, —С. 196–. (Дисертант провів дослідження впливу деяких мікроелементів на продукти життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби in vitro).
4. Вплив акцепторів водню на перекисні процеси і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби в дослідах in vitro / А. В. Волторністий, С. М. Мелікян, І. В. Лучка, Р. О. Федяков, М. Г. Герасимів, Л. І. Сологуб // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. —Львів, 2005. —В. 6, № 2. —С. 24–. (Дисертант дослідив особливості рівня перекисних процесів і життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби).
5. Сологуб Л. І., Антонюк Г. Л., Волторністий А. В. Актуальні проблеми екології рубця жуйних тварин // Журнал агробіології та екології. —. —В. 1, №1–. —С. 57–. (Дисертант провів дослідження антиоксидантної системи захисту мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби –бактерій і інфузорій in vitro).
6. Вплив вітаміну Е і селеніту натрію на перекисні процеси та антиоксидантний захист в рубці телят / А. В. Волторністий, Л. І. Сологуб, Г. Л. Антоняк, М. Г. Герасимів, О. М. Стадник // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. —. —В. 5, № 3. —С. 97–. (Дисертант провів дослідження рівня гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду та антиоксидантних ферментів у бактерій і інфузорій в інкубаційному середовищі за умов внесення до нього вітаміну Е і селену).
7. Каталаза бактерій рубця великої рогатої худоби / А. В. Волторністий, Г. О. Богданов, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, Р. О. Федяков // Біологія тварин. — 2004. —Т. 6, № 1–. —С. 339–. (Дисертант дослідив каталазну активність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби та впливу на її рівень деяких модуляторів).
8. Рівень травних процесів в рубці телят залежно від типу годівлі / А. В. Волторністий, М. Г. Герасимів, Є. О. Дзень, Р. О. Федяков, Л. І. Сологуб // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. —. —В. 25, Ч. 1. — С. 73–. (Дисертанту належить розробка програми досліджень, організація досліду, забезпечення різного рівня живлення піддослідних тварин, взяття проб вмісту рубця та визначення у ньому активності травних ферментів).
9. Вплив вітаміну Е і селену на ферментативні процеси в рубці телят в дослідах in vitro / А. В. Волторністий, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, О. М. Стадник // Біологія тварин. —. —Т. 5, № 1–. —С. 128–. (Дисертантом проведено визначення активності антиоксидантних ферментів — аспартатамінотрансферази, каталази, глутатіонпероксидази і глутатіонредуктази та впливу на їх активність добавок вітаміну Е і селену в умовах in vitro).
10. Супероксиддисмутаза і каталаза у вмісті рубця великої рогатої худоби / А. В. Волторністий, М. Г. Герасимів, Л. І. Сологуб, Р. О. Федяков, О. М. Стадник // Вісник Львівського Університету, Сер. біологічна. —. —В. 34. —С. 65-69. (Дисертант провів визначення активності антиоксидантних ферментів захисту в мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби in vitro).
11. Вплив різних акцепторів водню і нікелю на життєдіяльність змішаної популяції мікроорганізмів рубця бичків в умовах in vitro / Н. З. Огородник, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, Д. М. Копачук, А. В. Волторністий // Біологія тварин. —. —Т. 3, №1. —С. 105–. (Дисертанту належить участь у відборі біологічного матеріалу —вмісту рубця у виконанні досліджень в умовах in vitro та впливу до інкубаційного середовища акцепторів водню і нікелю).
12. Каталаза мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби / А. Волторністий, Г. Богданов, Л. Сологуб, М. Герасимів, Р. Федяков // 1 Конференція «Стан та розвиток агропромислового виробництва в межах Європейського регіону Верхній Прут». Чернівці, —. —С. 78–. (Дисертантом досліджено каталазну активність мікроорганізмів рубця бугайців та впливу на її рівень деяких модуляторів).
13. Some regulatory aspects of methanogenesis in the rumen of cattle / L.I. Solohub, R.O. Fediakov, M.G. Herasymiv, A.V. Voltornisty, I.V. Luchka // Annales Universitatis Marie Curie-Sklodowska. Sectio DDD, Pharmacia. —Lubin, 2002. —Vol.15, №5. —P.295–. (Дисертант провів експериментальні дослідження визначення аміаку, мікробної маси та статистичну обробку. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написанні статті).
14. До питання регуляції метаногенезу в рубці жуйних тварин / Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, А. В. Волторністий, Р. О. Федяков // Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду // Український біохімічний журнал. —2002. —Т. 74, № 4а. — С. 103–104. (Дисертант провів спільні дослідження процесу метаногенезу в вмісті рубця великої рогатої худоби в умовах in vitro).
Волторністий А. В. Антиоксидантна система мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби та роль мінеральних елементів у її регуляції. Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 — біохімія, Інститут біології тварин УААН, Львів, 2008.
Дисертаційна робота присвячена біохімічному дослідженню особ–ливостей перекисних процесів та ферментної ланки антиоксидантного захисту в клітинах бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби та з’ясуванню ролі вітаміну Е і ряду макро- і мікроелементів у регуляції активності антиоксидантних ферментів.
У клітинах бактерій і інфузорій рубця великої рогатої худоби виявлено продукти ПОЛ (гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду) й антиоксидантні ферменти супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази), котрі запобігають розвитку оксидаційного стресу в мікроорганізмів рубця. У бактерій більш активна каталаза, тоді як у клітинах інфузорій — глутатіонпероксидаза.
При додаванні до середовища вітаміну Е і селену окремо, а також разом з вітаміном Е у клітинах бактерій та інфузорій у процесі інкубації вірогідно зменшується вміст продуктів ПОЛ (гідропероксидів ліпідів, малонового діальдегіду) і підвищується активність антиоксидантних ферментів (супероксиддисмутази, каталази).
При інкубації змішаної фракції мікроорганізмів рубця, у середовище якого додавали S (II) і Cr (III), а також солі цинку, нікелю, заліза і марганцю, вміст гідропероксидів ліпідів і малонового діальдегіду в клітинах бактерій вірогідно зменшується, а при додаванні S (VI) і Cr (VI) — збільшується. Зміни вмісту продуктів ПОЛ у клітинах інфузорій при додаванні до середовища вказаних мінеральних елементів виражені меншою мірою.
При додаванні до інкубаційного середовища S (VI) і Cr (VI), а також солей цинку, нікелю, заліза і марганцю у клітинах бактерій та інфузорій вірогідно підвищується активність супероксиддисмутази, а при додаванні Cr (III), солей цинку і марганцю — активність каталази. Під впливом S (II) активність обох ферментів у клітинах цих мікроорганізмів вірогідно знижується.
Проведена часткова очистка каталази (у 28 разів) з бактеріальної фракції рубця; встановлено активуючий вплив на активність ферменту Zn2+, Ni2+, Fe3+, Fe2+ і Cr3+ та інгубуючий вплив Cd2+, Se4+, цистеїну й азиду натрію.
Ключові слова: біохімія, телята, рубець, бактерії, інфузорії, СОД, каталаза, глутатіонпероксидаза, глутатіонредуктаза, мінеральні елементи.
Волторнистый А. В. Антиоксидантная система микроорганизмов рубца крупного рогатого скота и роль минеральных элементов в ее регуляции. —Рукопис.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 — биохимия. Институт биологии животных УААН, Львов, 2008.
Диссертация посвящена изучению антиоксидантной системы у микроорганизмов рубца крупного рогатого скота. Установлено, что бактерии и инфузории рубца крупного рогатого скота содержат продукты ПОЛ, владеют высокой активностью антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы). Показана роль витамина Е и селена, а также ряда минеральных элементов в регуляции активности антиоксидантной системы защиты у микроорганизмов рубца.
Отмечено ингибирующее влияние добавок к инкубационной среде витамина Е и селена на процессы перекисного окисления липидов. Количество гидрогенпероксидов под влиянием a-токоферилацетата уменьшалось у бактерий и инфузорий на 40–50 %, а малонового диальдегида —соответственно на 72 и 28 %. Количество продуктов ПОЛ под влияем добавок к среде селена имело тенден цию к существенному снижению (р<0,001). При этом оно было более выраженным у бактерий.
Добавка к инкубационной среде витамина Е и селена оказывала стимулирующее влияние на активность антиоксидантной системы в клетках бактерий и инфузорий. Активность СОД и каталазы при внесении в инкубационную среду витамина Е увеличивалась у бактерий соответственно на 25 и 22 %. У инфузорий активность СОД увеличивалась на 37 %, а каталазы –на 16 %. После добавки к среде селена активность СОД у бактерий и инфузорий увеличилась соответственно на 30 и 22 % (р<0,01–,001). Активность каталазы при этом существенно не менялась. Отмечено также более выраженное повышение активности СОД у бактерий после совместного внесения в среду селенита натрия и витамина А (р<0,001).
Из ферментов глутатионовой системы защиты у бактерий и инфузорий выявлены глутатионпероксидаза и глутатионредуктаза. Под влиянием добавок к среде витамина Е отмечено повышение активности глутатионпероксидазы. Увеличение активности этого фермента было более выраженным у инфузорий (172 %). Внесение селена увеличивало активность глутатионпероксидазы в среде бактерий на 33 %, а у инфузорий –на 59 % (р<001).
Установлено также разностороннее влияние исследуемых минеральных элементов на перекисное окисление и антиоксидантную систему у бактерий и инфузорий рубца. В частности, добавка к среде S (II) и Cr(III), цинка, никеля, железа и марганца проявляло ингибирущее влияние, а добавка S (VI) и Cr (VI) стимулировала процессы перекисного окисления в клетках бактерий рубца в условиях in vitro.
Показано, что внесение в инкубационную среду S (VI) и Cr (VI), а также солей цинка, никеля, железа и марганца повышало активность супероксиддисмутазы в клетнах бактерий и инфузории. Добавка в среду Cr (III), солей цинка и марганца повышало активность каталазы, а S (II) — снижало активность обоих ферментов в клетках бактерий и инфузорий. Установлено также, что S (II), цинк и железо повышало активность глутатионпероксидазы в клетках бактерий, а S (VI), цинка, никеля, марганца — в клетках инфузорий.
Проведена частичная очистка каталазы (в 28 раз) бактериальной фракции содержимого рубца. Установлено активирующее влияние на активность фермента Zn2+, Ni2+, Fe3+, Fe2+ и Cr3+ и ингибирующее влияние Cd2+, Se4+, цистеина и азида натрия.
Ключевые слова: биохимия, телята, рубец, бактерии, инфузории, СОД, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, минеральные элементы.
Voltornistyj A. V. The antioxidant system of cattle rumen microorganisms and the role of mineral elements in its regulation. — Manuscript.
The dissertation for a scientific degree of Candidate of Biological Sciences in speciality 03.00.04 — biochemistry. Institute of Animal Biology of the Ukrainian Academy of Agrarian Sciences, Lviv, 2008.
The dissertation is devoted to studying of antioxidant system of cattle rumen microorganisms. For the first time it was established, that bacteria and protozoa of cattle rumen contained the products of lipid peroxidative oxidation and possessed enough high activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase). The role of vitamin A and selenium, and also of some mineral elements in regulation of rumen microorganisms antioxidant defense system was shown. In particular, it was noted the inhibitory influence of addition to the incubatory medium of vitamin E and selenium on processes of lipid peroxidative peroxidation and their stimulatory influence on antioxidant system activity in bacteria and protozoa cells.
Versatile influence of mineral elements on peroxidative oxidation and antioxidant system in rumen bacteria and protozoa was established. In particular, the addition to medium of S(II)- and Cr (III), Zn, Ni, Fe and Mn revealed the inhibitory influence, and the addition of S(VI) and Cr (VI) stimulated the processes of lipid peroxidatve oxidation in cells of rumen contents in conditions in vitro.
It was shown also, that the addition of S (VI), Cr (VI), Zn, Ni, Fe or Mn to the incubatory medium raised the superoxide dismutase activity in the bacteria and protozoa cells. The introduction in the medium of Cr (III), Zn and Mn increased the catalase activity, while S (II) reduced the activity both of enzymes in cells of bacteria and protozoa. It was established also, that sulfur (II) , zinc and iron increased the activity of glutathione peroxidase in the cells of bacteria, and sulfur (VI), zinc, nickel, manganese — in cells of protozoa.
The partial purification of catalase (in 28 times) from bacterial fraction of rumen contents was carried out. The activating influence of Zn, Ni, Fe (III), Fe (II), Cr (III); and inhibiting influence of Cd, Se (IV), cysteine and sodium azide on enzyme activity was established.
Key words: calves, rumen, bacteria, protozoa, superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, mineral elements.